Исследование экспрессии апоптоз-специфических генов семейства BCL-2 и системы FAS/FASL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека

Обухова, Варвара Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование экспрессии апоптоз-специфических генов семейства BCL-2 и системы FAS/FASL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование экспрессии апоптоз-специфических генов семейства BCL-2 и системы FAS/FASL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека"

На правахрукописи

ОБУХОВА ВАРВАРА ВЛАДИМИРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ АПОПТОЗ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА BCL-2 И СИСТЕМЫ FAS/FASL ПРИ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ЖЕЛУДКА И ТОЛСТОЙ КИШКИ

ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена на кафедре биохимии Московской Медицинской академии им. И. М. Сеченова

Научные руководители: чл.-корр. РАМН, доктор химических наук,

профессор СЕ. СЕВЕРИН

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Н.Н. БЕЛУШКИНА

доктор биологических наук, профессор С.С. ШИШКИН доктор биологических наук, доцент А.М. РУБЦОВ

Ведущая организация: ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Защита состоится «Л5~» 2004 года в /3 часов на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33 стр. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33.

Автореферат разослан << »

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия во многих странах мира, в том числе в России, отмечается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями органов пищеварения, а также увеличение смертности от этих заболеваний. Наиболее часто опухолевые заболевания выявляются в пожилом возрасте (60 лет и старше), однако, все чаще подобный диагноз ставят в более молодом возрасте (40-50 лет). Неудовлетворительное состояние онкологической помощи населению в Российской Федерации привело к росту числа лиц с IV стадией заболевания и увеличению уровня летальности на 1-ом году с момента установления диагноза. Около 80% злокачественных новообразований органов пищеварения приходится на рак желудка, поджелудочной железы и толстой кишки. Таким образом, острота проблемы рака желудка и толстой кишки не снижается на протяжении многих лет. Прогресс в борьбе со злокачественными новообразованиями напрямую зависит от понимания механизмов развития опухолей и их ранней диагностики [Аксель Е.М., 2001; Гарькавцева Р.Ф., 2001; Воробьев Г.И., 1998; Орлова Л.П., 1998].

В основе развития опухоли лежит накопление онкотрансформированных клеток либо за счет увеличения их образования, либо за счет снижения уровня клеточной гибели, т.е. опухолевый рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом [Branet F., 1996; Simonian P.L., 1996]. Эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) относятся к быстроделящимся клеткам, поэтому большинство работ в этой области было сосредоточено на изучении пролиферативной активности опухолей ЖКТ. Однако в последние годы становится все более очевидным, что в развитии злокачественных новообразований ЖКТ важную роль играет нарушение регуляции апоптоза [Potten C.S., 1997].

Апоптоз или программированная клеточная гибель (ПКГ) - общебиологический механизм, ответственный за поддержание постоянства численности клеток организма и элиминацию дефектных или поврежденных клеток. На настоящий момент выделяют два пути реализации программы клеточной гибели. Это рецептор-опосредованный путь апоптоза, который запускается посредством активации рецептора клеточной поверхности, такого как Fas, при связывании с физиологическим лигандом, FasL. Другой путь ПКГ развивается при попадании клетки в неблагоприятные условия. Это митохондриальный путь апоптоза, важную роль в регуляции которого играют белки семейства Вс1-2. Следует отметить, что в ряде случаев ПКГ является результатом комбинированного действия двух путей: с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондрий [Rudner J., 2001].

В связи с вышеперечисленным целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение экспрессии ключевых генов, белковые продукты которых опосредуют индукцию апоптоза, а также выявление мутаций апоптоз-специфических генов при новообразованиях желудка и толстой кишки человека.

При этом были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать содержание белков семейства Вс1-2 в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки человека.

2. Выявить мутации в гене Вах при некою] Ь^у¿jp SlfJfii'iWXyЛ0Еека'

СПетср

• оэ toa

БИБЛИОТЕКА ¡ 1

3. Исследовать содержание белков системы Fas/FasL в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки, а также в лейкоцитах периферической крови больных.

4. Установить закономерности изменения содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека.

Научная новизна. Впервые при иммуногистохимическом исследовании содержания белков в ткани проведена одновременная оценка двух параметров: количества клеток, экспрессирующих исследуемые белки, и уровня данного белка в клетке. Показано, что в дальнейших исследованиях можно опираться на один из этих двух параметров. Определено содержание белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL в нетрансформированных и опухолевых клетках при новообразованиях желудка и толстой кишки человека.

При исследовании содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки выявлено статистически значимое увеличение уровня этих белков в опухолевых клетках по сравнению с нетрансформированными (р = 0,03). Установлены положительные корреляционные зависимости между количеством клеток, экспрессирующих исследованные белки, и уровнем белков как в нетрансформированных клетках (для Bcl-2, Bax, Fas и FasL), так и в опухолевых клетках (для Вс1-2, Вах).

Впервые обнаружено, что метастазирование в регионарные лимфатические узлы коррелирует с низким уровнем Fas-рецептора в опухолевой ткани, который, в свою очередь, связан с низким уровнем растворимого Fas (sFas) в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки человека.

Научно-практическая значимость работы.. Исследование имеет большое научно-практическое значение, так как в ходе работы проведено комплексное исследование нарушений регуляции рецептор-опосредованного и митохондриального пути апоитоза при новообразованиях желудка и толстой кишки человека. Установление механизмов блокирования процесса апоптоза в дальнейшем позволит установить причины нарушений и, следовательно, пути устранения последних при опухолевых заболеваниях.

Сделано предположение, что определение уровня sFas в сыворотке периферической крови может стать лабораторным тестом определения наличия метастазов при новообразованиях желудка и толстой кишки, а возможно и их ранней диагностики. Полученные данные позволяют провести дополнительные исследования на предмет создания лабораторного теста.

Обнаружена тесная корреляция (г = 0,91; р < 0,0001) между уровнем исследованных белков и количеством клеток, экспрессирующих данные белки, что свидетельствует о взаимозаменяемости этих двух параметров при оценке результатов иммуногистохимического исследования содержания белков в ткани.

прогресс клинической медицины» (апрель 2001 и январь 2004, Москва), на международной конференции «Scanning probe microscopy» (март 2002 и март 2003, Нижний Новгород), на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (июнь 2002, Москва), а также неоднократно обсуждалась на научно-практических конференциях кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова и лабораторий НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова 3 декабря 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, 2 работы приняты в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитированной литературы, включающий 227 источников (21 отечественный, 206 зарубежных). Работа иллюстрирована 32 рисунками и б таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследованных больных. Группу исследования составили 49 больных онкологическими заболеваниями желудка и толстой кишки, из которых у 29 диагностирован рак желудка и у 20 - рак толстой кишки. Возраст больных колебался от 28 до 82 лет и в среднем составил 60,4±1,7. Гистологическая классификация опухолей проведена в соответствии с рекомендациями ВОЗ: опухоли подразделены на эпителиальные и неэпителиальные. Среди эпителиальных опухолей выделены высоко-, умеренно-, низко дифференцированные аденокарциномы и недифференцированные раки (табл. 1). В качестве объекта исследования использовали венозную периферическую кровь, операционный материал опухолей желудка и толстой кишки, а также фрагменты нетрансформированной ткани, полученные из зоны резекции. В качестве контроля использовали кровь 45 здоровых доноров, а также нетрансформированную ткань желудка и толстой кишки.

Характеристика клеточных линий. В данной работе использовались следующие перевиваемые клеточные линии опухолей человека различной локализации: SKOV3 (аденокарцинома яичника), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), Colo 320HSR, SW837 и Сасо-2 (аденокарциномы толстой кишки), HuTu 80 (аденокарцинома тонкой кишки), СЕМ и Jurkat (Т-клеточный лейкоз), Raji и Namalva (лимфома Беркитта), МК и 35 (В-клеточные линии), IM9 и U266BL (клеточные линии миеломы), полученные из банка клеток Московского научно-исследовательского института медицинской экологии.

Таблица 1

Гистологическая классификация опухолей желудка и толстой кишки

Количество больных с опухолями

Гистологический тип опухоли. желудка толстой кишки

всего в т.ч. с всего в т.ч. с

метастазами метастазами

о Высокодифференцированная 3 1 7 1

аденокарцинома

Л S Умереннодифференцированная 6 6 10 3

5 И аденокарцинома

к С ¡- о Низкодифференцированная 7 3 2 1

S с аденокарцинома

ft Недифференцированный рак 11 6 1 0

Неэнителиальные опухоли 2 0 — —

Определение содержания белков Вс1-2, Вах и FasL в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка с помощью иммуноблоттинга [Москалева Е.Ю., 2003]. Навеску ткани гомогенизировали при 0°С в течение 30 мин. в 5 объемах охлажденного буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 8,0; 0,15 М NaCl; 0,1% додецилсульфат натрия (SDS); 100 мкг/мл фенилметансульфонилфторида; 1% NP-40; 0,5% натрия дезоксихолат и ингибиторы протеаз и фосфатаз. Концентрацию белка в пробе определяли по Лоури. Общий белок лизата ткани (100 мкг) разделяли с помощью электрофореза в 12% SDS-полиакриламидном геле (ПААГ) и переносили на поливинилидендифторидную мембрану «Immobilon-P» («Millipore», США). Мембрану инкубировали в блокирующем буфере, содержащем 5% обезжиренного сухого молока в TBS-T буфере (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 0,15 мМ NaCl; 0,05% твин-20), затем в том же буфере с первичными моноклональными антителами к FasL или поликлональными антителами к Вс1-2 и Вах белкам человека («PharMingen», США) в разведении 1:1000. Тщательно промыв мембрану TBS-T, ее далее инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена. Результат визуализировали с помощью хемилюминесцентной системы детекции и рентгеновской пленки BioMaxLight («Kodak», США).

Иммуногистохимическое определение содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки проводили на серийных парафиновых срезах ткани с помощью непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода [Charalambous G. К., 2000; Shilkaitis A., 2000; Misao J., 1996]. Перед окрашиванием срезы депарафинировали, регидратировали, подавляли эндогенную пероксидазную активность и демаскировали антигены. Для детекции белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL срезы инкубировали с первичными моноклональными антителами к Fas и FasL и поликлональными антителами к Вс1-2 и Вах белкам человека в разведении 1:500. Локализацию первичных антител определяли с помощью стрептавидин-биотин-пероксидазной системы визуализации Kit LSAB («DAKO», США), используя в качестве хромогена диаминобензидин. Фоновое доокрашивание проводили

гематоксилином. Для получения отрицательного контроля первичные антитела исключали из протокола. Оценку содержания белков-антигенов проводили полуколичественным методом, подсчитывая по 50 эпителиальных клеток в 6 рандомизированных полях зрения при увеличении х400. В случае недифференцированного рака подсчет клеток проводили в области, ограниченной квадратом 1 мм2, в 2 рандомизированных полях зрения. Содержание белков в ткани охарактеризовано двумя параметрами: количеством клеток, экспрессирующих белок, то есть процентным содержанием антиген-экспрессирующих клеток, и уровнем белка в клетке. Для определения уровня антигена использовали следующую шкалу оценки отложений продукта иммуногистохимической реакции в баллах: 0 - окрашивание отсутствует, 0,5 - минимальное, 1 — слабое, 2 - умеренное, 3 — выраженное и 4 — резко выраженное окрашивание. Уровень антигена оценивали по величине соответствующих средних гистохимических коэффициентов (СГК), рассчитанных по формуле СГК= Цбалл * количество клеток)/общее количество клеток и выраженных в условных единицах (усл.ед.).

Выделение геномной ДНК из цельной периферической крови и культур клеточных линий проводили по методу Lindblom [Lindblom В., 1988].

Выделение геномной ДНК из Трансформированных и атипических клеток желудка и толстой кишки проводили стандартным гуанидинтиоцианатным методом [Федоров НА, 1996].

Амплификация исследуемого участка гена Вах с помощью полимеразном цепной реакции (ПЦР). Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% твин-20, 2,1 мМ MgCb, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (по 0,16 мМ каждого), 50 нг геномной ДНК человека, по 5 пмоль каждого из праймеров, 1 ед. акт Taq-полимеразы. Для проведения ПЦР использовали следующий температурный режим: 94*С - 3 мин.; 94*С - 30 сек., 60*С - 30 сек., 72*С - 45 сек., 29 циклов; 72*С - 5 мин.

Скрининг мутаций в октадезоксигуанозиновой последовательности З экзона гена Вах с помощью анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ПЦР. Конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ПЦР выявляли по стандартной методике [Oto M., 1993; Ulvik А., 1995; Yagi O.K., 1998] с использованием электрофореза в 20% ПААГ. Продукты ПЦР смешивали с деионизованным формамидом в соотношении 1:1 и денатурировали при 95'С, после чего быстро охлаждали в ледяной бане и немедленно вносили в ПААГ. После электрофореза гель подвергали окрашиванию нитратом серебра.

Подтверждение мутаций путем автоматического секвенирования продукта

ПЦР [Чемерис А.В., 1999]. Продукт терминирующей реакции очищали согласно протоколу Quantum Prep™ Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns («Bio-Rad», США). Секвенирование проводили на приборе ABI Prism 310 Genetic Analyser («Applied Biosystems», США), согласно инструкциям производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01.

Выделение мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов из периферической крови осуществляли при центрифугировании в градиенте

плотаости фиколл-урографин; гранулоциты очищали от примеси эритроцитов с помощью осмотического шока [Ferrante A., 1978].

Оценка уровня экспрессии Fas и FasL мононуклеарными и полиморфноядерными лейкоцитами с помощью проточного цитофлуориметра • • после непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания [Мохиль-Дейн А. X., 2003]. Выделенные мононуклеарные и полиморфноядерные лейкоциты инкубировали с мышиными моноклональными антителами к Fas и FasL белкам человека, разведенными в соотношении 1:100 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 0,1% азид натрия. Далее клетки инкубировали с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, меченными флуоресцеинизотиоцианатом и разведенными 1:100 в ФСБ, содержащем 0,5% желатин и 0,1% азид натрия. Содержание белков Fas и FasL анализировали на проточном цитофлуориметре Epics XL («Beckman Coulter», Швейцария) при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны эмиссии 525 нм. Подсчет процента флуоресцирующих клеток осуществляли, анализируя не менее 10000 клеток в каждом образце.

Определение уровня sFas в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка. и толстой кишки и здоровых доноров методом иммуноферментного анализа [Proussakova O.V., 2003]. На планшете сорбировали первые моноклональные антитела к sFas (клон 2F3, «Биоарсснал», Россия). После однократной промывки ФСБ, содержащим 0,05% твин-20, во все лунки вносили 1% бычий сывороточный альбумин и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Затем вносили образцы сывороток периферической крови в разведении 1:5 и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. После чего проводили инкубацию с раствором вторых антител к sFas (клон 10F10, «Биоарсенал», Россия), меченных пероксидазой хрена. Далее добавляли перекись водорода и орто-фенилендиамин в цитратном буфере (рН 5,3) и выдерживали пробы в течение 8-10 мин. при комнатной температуре. Для прекращения ферментативной реакции вносили 10%-ный раствор серной кислоты и немедленно проводили спектрофотометрическое определение поглощения при длине волны 492 нм («Titertek Multiskan», США). Результаты оценивали на основании калибровочной кривой.

Статистическую - обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента с помощью компьютерной программы «Microcal Origin 5,0». Результаты представлены в виде средних значений ± ошибка среднего. Достоверность различия двух средних оценивали с помощью теста OneWay ANOVA. Уровень значимости менее 0,05 рассматривали как статистически значимый (вероятность (р) более 95%). Взаимосвязь оцениваемых параметров охарактеризована коэффициентом корреляции (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование нарушений регуляции митохондриального пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки

Первая часть работы посвящена исследованию нарушений митохондриального пути апоптоза, важную роль в регуляции которого играют белки семейства Вс1-2. К белкам семейства Вс1-2 относятся как индукторы апоптоза (такие, как Вах), так и ингибиторы (такие, как Вс1-2).

1.1. Исследование содержания белков Вс1-2 и Вах в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка методом иммуноблоттинга

При исследовании содержания белков Вс1-2 и Вах с помощью иммуноблоттинга (п=б) установлено, что в опухолевой ткани желудка изменяется содержание обоих белков по сравнению с нетрансформированной тканью (рис. 1). В половине случаев уровень Вс1-2 уменьшается (2, 3, 5 больные), а в половине - увеличивается (1, 4, 6 больные). Уровень Вах увеличивается или остается примерно таким же. Однако методом иммуноблоттинга не представляется возможным определить, какими именно клетками синтезируются исследуемые белки. В связи с этим дальнейшее изучение содержания белков в ткани проводили иммуногистохимически.

Рис. 1. Исследование содержания белков Вс1-2 (А) и Вах (Б) в нетрансформированной (II) и опухолевой (О) ткани желудка методом иммуноблоттинга.

1.2. Иммуногистохимическое исследование содержания белков Вс1-2 и Вах в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки

При окрашивании срезов ткани из зоны резекции гематоксилином и эозином установлено, что у всех больных имеются признаки воспалительных изменений в ткани желудка и толстой кишки, т.е. гастрит или колит. По литературным данным, в нормальном эпителии и при воспалении в ткани кишки определяются одинаковое содержание белков Fas, Bcl-2 и Вах [Iimura M., 2000]. В связи с этим мы решили, что нетрансформированная ткань желудка и толстой кишки с признаками воспаления может служить контролем при исследовании уровня апоптоз-специфических белков в опухолевой ткани. При иммуногистохимическом окрашивании парафиновых срезов нетрансформированной и опухолевой тканей желудка и толстой кишки нами проведена полуколичественная оценка интенсивности отложений продукта иммуногистохимической реакции непосредственно в эпителиальных клетках исследуемых тканей, а также определено процентное содержание клеток, экспрессирующих данные белки. Наблюдаемое окрашивание от бледно-желтого до

темно-коричневого свидетельствовало о специфическом связывании антител с исследуемыми белками-антигенами. Интенсивность окрашивания непосредственно связана с уровнем антигена: чем более темное окрашивание выявляется, тем больше уровень антигена, и наоборот. Учитывая, что в опухолевой ткани желудка и толстой кишки нами выявлены одинаковые тенденции в изменении содержания белков семейства Вс1-2 и системы Раз/РазЬ, мы сочли возможным объединить больных с новообразованиями желудка и толстой кишки в одну группу.

1.2.1. Увеличение уровня Вс1-2 в атипических клетках желудка и толстой китттки

Распределение белка Вс1-2 в различных тканях рассматривается в соответствии с его ролью в предотвращении аиоптоза: Вс1-2 определяется в пролиферирующих тканях с долгоживущими клетками-предшественниками и в тканях, представленных постмитотическими клетками с расширенным временем жизни, таких как ткань мозга [ЛзсМГ А. Р., 1999]. Общепринятым считается, что антиапоптотический белок Вс1-2 повышает резистентность опухолевых клеток к действию факторов, в норме индуцирующих апоптоз [8гшуаз &, 2000; 8ош У., 1999].

В настоящей работе при иммуногистохимическом исследовании содержания Вс1-2 в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (п = 11) показано, что Вс1-2 синтезируется подавляющим большинством клеток на достаточно высоком уровне (табл. 2, рис. 2). Наблюдается статистически значимое увеличение уровня Вс1-2 в атипических клетках по сравнению с ^трансформированными (р = 0,04): экспрессия Вс1-2 клетками опухолевой ткани увеличивается примерно в 1,5 раза. Полученные результаты согласуются с выводами ЛуИап А. и соавт. [ЛуИап А, 1994] и Кошайзц К. И соавт. [Котами К., 1996].

Следует отметить, что в группе высокодифференцированных опухолей желудка и толстой кишки наблюдается незначительное снижение уровня Вс1-2 в 1,2 раза, а в группе умеренно-, низкодифференцированных аденокарцином и недифференцированных раков - увеличение в 3,4 раза. Таким образом, при высокодифференцированных аденокарциномах наблюдается уменьшение уровня Вс1-2, что может отражать увеличение уровня апоптоза и, следовательно, более доброкачественное течение опухолевого процесса; при низкодифференцированных и недифференцированных опухолях желудка и толстой кишки обнаружено увеличение уровня Вс1-2, что может свидетельствовать о снижении уровня апоптоза и более злокачественном течении заболевания. Увеличение уровня Вс1-2, по-видимому, является одним из механизмов ингибирования апоптоза в опухолевых клетках желудка и толстой кишки человека.

Таблица 2

Результаты иммуногистохимического исследования содержания • • белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL в нетрансформированной и опухолевой

ткани желудка и толстой кишки

Антиген ^трансформированная ткань Опухолевая ткань

Уровень антигена, СПС, усл.ед. Процентное содержание антиген-положительных клеток г Р° Уровень антигена, СПС, усл.ед. Процентное содержание антиген-положительных клеток г Р

Вс1-2 1,48±0,27 83,9±8,8 0,91 0,00075 2,20+0,19* 98,2±1,0 0,70 0,002

Вах 1,53±0,26 .. 86,5±6,6 0.88 0,002 2,23±0,14* 97,7±1,1 0,71 0,01

Рае 0,70±0,13 75,3±9,1 0,83 0,005 0,77±0,17 79,3+7,8 0,57 0,09

БаяЬ 1,32±0,25 91,1±7,8 0,86 0,006 2,22±0,20* 99,7±0,4* 0,10 0,78

* Различия показателей между нетрансформированной и опухолевой тканью достоверны, рр<0,05

г и р - характеристики корреляционных зависимостей процентного содержания антиген-положительных клеток и уровня антигена в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка итолстойкишки

122. Увеличение уровня Вах в атипических клетках желудка и толстой кишки Как известно, белок Вах относится к проапоптотическим членам семейства Вс1-2, и в норме повышение его уровня в некоторых типах клеток является достаточным условием для вступления клеток в апоптоз. При иммуногистохимическом исследовании содержания Вах в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (п = 11) показано, что Вах синтезируется подавляющим большинством клеток на достаточно высоком уровне (табл. .2, рис. 2). Причем определяется статистически значимое увеличение уровня Вах в атипических клетках по сравнению с ^трансформированными (р = 0,02): экспрессия Вах клетками опухолевой ткани увеличивается примерно в 1,5 раза. Установлены следующие закономерности в изменении количества Вах-положительных клеток и уровня Вах в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной:

3,00

Вс1-2 Вах Газ РазЬ

А,

Вс1-2 Вах Раз РязЬ

□ нетрансформированная ткань ■ опухолевая ткань ¡3 неметастазирующие опухоли Р метастазирующие опухоли

Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки. А. Уровень белков, СГК, усл.ед.; Б. Процентное содержание клеток, экспрессирующих исследуемые белки.

* Различия показателей между нетрансформированной и опухолевой тканью достоверны, р<0,05

** Различия показателей между неметастазирущими и метастазирующими опухолями достоверны, р<0,05

*** Различия показателей между пеметастазирущими и метастазирующими опухолями достоверны, р<0,01

Положительная статистически значимая корреляция между числом Вах-положительных клеток в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (г = 0,95; р < 0,0001): чем больше клеток экспрессирует Вах в нетрансформированной ткани, тем больше таких клеток в опухолевой ткани (рис. ЗА);

Положительная статистически значимая корреляция между уровнем Вах в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (г = 0,91; р < 0,0007): чем больше уровень Вах в нетрансформированных клетках, тем больше уровень Вах в атипических клетках (рис. ЗБ).

Рис 3. Закономерности изменения количества Вах-положительных клеток (А) и уровня Вах (Б) в опухолевой ткани желудка и толстой кишки по сравнению с нетрансформированной.

Таким образом, при иммуногистохимическом исследовании содержания Вах показано увеличение уровня Вах в опухолевой ткани желудка и толстой кишки по сравнению с нетрансформированной. Однако, в ряде случаев, определяющее значение имеет не уровень белка в клетке, а его способность выполнять свою функцию. В связи с этим следующих этап работы посвящен выявлению мутаций в гене Вах.

1.3. Мутации гена Вах — одна из возможных причин утраты проапоптотической активности Вах

Для выявления мутаций использовали прием совмещения ПЦР и анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных продуктов ПЦР (SSCP). При последовательной постановке серии ПЦР/SSCP с образцами геномной ДНК, выделенными из образцов периферической крови, нетрансформированной и опухолевой тканей, взятых от больных с новообразованиями желудка и толстой кишки обнаружены изменения картины электрофоретического разделения

продуктов SSCP у 5 из 25 больных, что составляет 20% (рис. 4). Причем, у I и II больных положение полос SSCP в опухолевой ткани схожи, что дает возможность предположить одинаковые изменения в первичной последовательности ДНК. У больных I - IV выявлены изменения картины электрофоретического разделения продуктов SSCP только в опухолевой ткани, а амллифицируемый участок ДНК, выделенной из нетрансформированной ткани и периферической крови, оставался интактным. Полученные данные свидетельствуют о соматической мутации в гене. Вах. У больного V обнаружены изменения положения полос SSCP как в опухолевой ткани, так и в периферической крови. У данного больного диагностирована низкодифференцированная аденокарцинома желудка с метастазами. По-видимому, методом анализа. ПЦР с использованием полиморфизма конформаций одноцепочечных продуктов ПЦР удалось определить метастатические клетки, находящиеся в кровеносном русле.

123 123 I. II.

Рис. 4. Результаты предварительного скрининга мутации в октадезоксигуаиозиновой последовательности 3 экзопа гена Вах с помощью ПЦР/88СР у больных- с новообразованиями желудка и толстой кишки.

Электрофореграмма продуктов ПЦР/ЗБСР; 20% полиакриламидный гель (29:1), окрашенный нитратом серебра: дорожка 1 — периферическая кровь, 2 -(Атрансформированная ткань, 3 — опухолевая ткань.

Кроме опухолей желудка и толстой кишки, на наличие мутаций исследованы клеточные линии различных новообразований человека. В клеточных линиях опухолей кишки мутаций не выявлено. В клетках SKOV3 (аденокарцинома яичника), СЕМ (Т-клеточный лейкоз), Ш9 (миелома) выявлены изменения в исследуемом участке гена Вах (рис. 5). Для подтверждения мутаций и установления их природы проводили автоматическое секвенирование продукта ПЦР и выявили, что клетки SKOV3 несут гетерозиготную мутацию: в одном аллеле определяется делеция 1 остатка гуаниловой кислоты, во втором — вставка 1 остатка гуаниловой кислоты. Т.е. клеточная линия SKOV3 имеет генотип G7/G9, в отличие от нативного гена Вах G8/G8. Таким образом, в обоих аллелях наблюдаются мутации со сдвигом рамки считывания, что ведет к синтезу белка со случайной последовательностью, по-видимому, лишенного биологической активности, что, в свою очередь, будет приводить к ингибированию апоптоза и онкотрансформации клетки.

12 3 123 123 III. IV. V.

Рис. 5. Результаты предварительного скрининга мутаций в октадезоксигуанозиновой

последовательности 3 экзона гена Вах с помощью ПЦР/SSCP в клеточных линиях различных новообразований человека. Электрофореграмма продуктов ПЦР/SSCP; 20% полиакриламидный гель (29:1), окрашенный нитратом серебра: дорожка 1 - мутация отсутствует; наличие мутации в исследуемой области гена Box в клетках SKOV3 (2), СЕМ (3), 1М9 (4).

2. Исследование нарушений регуляции • рецептор-опосредованного пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки

Вторая часть работы посвящена исследованию содержания белков системы Fas/FasL, которые играют важную роль в рецептор-опосредованном пути апоптоза. Fas - рецептор клеточной поверхности, который при взаимодействии с FasL цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) передает сигнал гибели в клетку, чувствительную к индукции апоптоза. Описаны растворимые формы рецептора и лиганда, которые взаимодействуют с мембранно-связанными лигандом и рецептором, соответственно, и ингибируют передачу апоптотического сигнала в клетку [Барышников А.Ю., 2002; Pinkoski M. J., 2000].

2.1. Экспрессия Fas при новообразованиях желудка и толстой кишки

Fas экспрессируется как эпителиальными клетками желудка и толстой кишки, так и лейкоцитами периферической крови [Барышников А.Ю., 2002; Pinkoski M. J., 2000], поэтому объектом исследования уровня Fas стала нетрансформированная и опухолевая ткань желудка и тонкой кишки, а также лейкоциты периферической крови.

2.1.1. Снижение уровня Fas в атипических клетках желудка и толстой кишки

Fas - рецептор клеточной поверхности, который при взаимодействии с физиологическим лигандом, FasL, передает сигнал гибели в клетку, чувствительную к индукции апоптоза. По литературным данным, нормальные клетки эпителия толстой кишки экспрессируют Fas и чувствительны к FasL-индуцированному апоптозу. Большинство клеточных линий опухолей толстой кишки резистентны к индукции апоптоза через систему взаимодействий Fas/FasL, хотя и экспрессируют Fas-рецептор [Yoong K.F., 1999; O'Connell J., 2000].

В данной работе при иммуногистохимическом исследовании содержания Fas в нетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (п = 11) показано, что Fas синтезируется меньшим количеством клеток по сравнению с Bcl-2, Вах, FasL на низком уровне (табл. 2). Статистически значимых различий в уровне Fas между клетками нетрансформированной и опухолевой ткани не выявлено. Однако обнаружены достоверные изменения уровня Fas в клетках метастазирующих опухолей по сравнению с нетрансформированной тканью (р=0,04) и клетками неметастазирующих опухолей (р=0,04): при опухолях с метастазами определяется более низкий уровень Fas, чем в нетрансформированной ткани примерно в 2 раза и в

VKM»

i,.

1. 2. 3. 4.

3 раза ниже, чем при опухолях без метастазов (табл. 2, рис. 2). Также выявлены достоверные различия в количестве Fas-положительных клеток у больных с метастазирующими опухолями по сравнению с больными без метастазов (р=0,009): у больных с метастазирующими опухолями не только снижается уровень Fas, но и уменьшается количество Fas-положительных клеток примерно в 1,6 раз. Полученные результаты согласуются с данными Yoong и соавт. [Yoong K.F., 1999], которые установили, что в метастазирующих опухолях имеет место утрата антигена, т.е. злокачественная трансформация ведет к снижению физиологического уровня Fas. К этому же выводу пришли Osaki и соавт. [Osaki M, 2001], которые показали, что уровень Fas коррелирует с более высоким апоптотическим индексом и более доброкачественным течением заболевания.

Таким образом, снижение уровня Fas в опухолевых клетках ведет к неспособности ЦТЛ индуцировать апоптоз онкотрансформированной клетки через систему взаимодействий Fas/FasL. Можно полагать, что этот факт играет важную роль в метастазировании опухолей желудка и толстой кишки.

2.1.2. Снижение уровня sFas в сыворотке периферической крови у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки

При исследовании уровня sFas в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки с помощью иммуноферментного анализа обнаружено, что у обследованных больных (п=12) уровень sFas в сыворотке периферической крови достоверно ниже, чем в сыворотке крови нормальных доноров, р=0,0009 (табл. 3). При опухолях желудка уровень sFas уменьшается примерно в 1,6 раза по сравнению с контрольной группой. При анализе уровня sFas у больных с опухолями толстой кишки (п=7) выявлено, что средний уровень sFas в сыворотке периферической крови больных статистически не отличается от такового в группе больных с опухолями желудка (табл. 3). Следует отметить, что у одного из 7 исследованных больных с высокодифференцированной аденокарциномой ободочной кишки уровень sFas составил 1,5 нг/мл, что соответствует норме; у другого больного с низкодифференцированной аденокарциномой сигмовидной кишки - 2,9 нг/мл, что в 1,7 раз больше, чем в норме. Вероятно, у второго больного увеличение уровня sFas вносит вклад в блокирование FasL-индуцированного апоптоза путем связывания с Fas-рецептором.

Необходимо отметить, что снижение сывороточного уровня sFas при новообразованиях желудка и толстой кишки коррелирует со снижением уровня Fas в клетках опухолевой ткани (г = 0,77): чем меньше уровень Fas в опухолевых клетках, тем ниже уровень sFas в сыворотке периферической крови, и наоборот (рис. 6). sFas - результат альтернативного сплайсинга мРНК Fas. To есть снижение синтеза как мембранно-связанной, так и растворимой форм Fas-рецептора подтверждают данные Butler и соавт. [Butler L.M., 1998] о том, что снижение экспрессии вплоть до полного отсутствия транскрипции гена Fas является результатом эпигенетического механизма молчания гена.

Таблица 3

Результаты исследования уровня эБаэ в сыворотке периферической крови здоровых доноров и больных с опухолями желудка и толстой кишки методом иммуноферментного анализа_

Группа наблюдений Уровень sFas в сыворотке периферической крови, нг/мл

Здоровые доноры, п=38 1,65+0,05

Больные с опухолями, 11=12, в т.ч. желудка, п=5 толстой кишки, п=7 1,18+0,16** 1,02±0,04** 1,31 ±0,28*

* Различия между показателями в группе здоровых доноров и больных с новообразованиями желудка и толстой кишки достоверны, р<0,05

** Различия между показателями в группе здоровых доноров и больных с новообразованиями желудка и толстой кишки достоверны, р<0,001

Примерно у 25% больных раком толстой кишки имеются метастазы в печень на время диагноза, у других 25% метастазы в печень развиваются в течение 2 лет [Yoong K.F., 1999]. Установлена прямая зависимость между частотой поражения регионарных лимфатических узлов и риском метастатического поражения отдаленных органов [Воробьев Г.И., 1998]. По нашим данным метастазирование в регионарные лимфатические узлы коррелирует с низким уровнем Fas в опухолевой ткани, который, в свою очередь, связан с низким уровнем sFas в сыворотке периферической крови. Таким образом, сделано предположение, что определение уровня sFas в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки может стать лабораторным тестом определения наличия метастазов, а возможно и их ранней диагностики. А так как у 60-80% больных с впервые установленным диагнозом определяется III-IV стадия заболевания [Орлова Л.П., 1998], то выявление метастазирующих опухолей на дооиерационном этапе является важной задачей.

Рис. 6. Положительная статистически значимая корреляция между уровнем sFas в сыворотке периферической крови и уровнем Fas в опухолевых клетках больных с новообразованиями желудка и толстой кишки.

2.1.3. Снижение экспрессии Fas мононуклеарными и полимофрноядерными лейкоцитами периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки

При исследовании уровня Fas в лейкоцитах периферической крови у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки выявлена тенденция к снижению уровня Fas. У 4 из 6 больных (67%) экспрессия Fas мононуклеарными лейкоцитами периферической крови снижается на 60,6%, в 5 из 7 случаев (71%) уровень экспрессии Fas полиморфноядерными лейкоцитами периферической крови уменьшается на 66,1%. Возможно, снижение уровня Fas в лейкоцитах периферической крови отражает адаптацию лейкоцитов у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки к FasL-индуцированному апоптозу со стороны опухолевых клеток. То есть уменьшение уровня Fas отражает снижение уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови при новообразованиях желудка и толстой кишки. 2.2. Экспрессия FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки FasL экспрессируется как эпителиальными клетками кишки, так и лимфоцитами периферической крови [Барышников А.Ю., 2002; Pinkoski M. J., 2000], поэтому объектом исследования уровня FasL стала нетрансформированная и опухолевая ткань желудка и тонкой кишки, а также лейкоциты периферической крови.

2.2.1. Увеличение уровня FasL в атипических клетках желудка и толстой кишки Клетки, несущие FasL, способны индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих Fas-рецептор и чувствительных к FasL-индуцированному апоптозу. При иммуногистохимическом исследовании содержания FasL в нетрансформированной ткани из зоны резекции и опухолевой ткани желудка и толстой кишки (п=11) наблюдалось среднее и сильное окрашивание, обнаруживающие присутствие FasL в исследованных образцах. Показано, что FasL синтезируется подавляющим большинством клеток желудка и толстой кишки (табл. 2). Надо отметить, что количество клеток, экспрессирующих FasL, в опухолевой ткани достоверно больше, чем в нетрансформированной (р = 0,03). Увеличение уровня FasL в опухолевой ткани, по сравнению с нетрансформированной, является статистически значимым (р = 0,01): содержание FasL в опухолевой ткани увеличивается примерно в 1,7 раза. Выявлена положительная статистически значимая корреляция между уровнем FasL в нетрансформированной и опухолевой ткани (г = 0,75; р = 0,03): чем выше уровень FasL в нетрансформированных клетках, тем выше уровень FasL в атипических клетках (рис. 7).

Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что некоторые типы опухолей экспрессируют FasL и обладают способностью убивать Fas-экспрессирующие лимфоциты, что способствует «ускользанию» опухолевых клеток от иммунного распознавания [Yoong K.F., 1999; Барышников А.Ю., 2002; Bennett M.W., 1999]. Активированные лимфоциты накапливаются в строме на периферии опухоли и не проникают в опухолевую ткань. В отсутствии Fas-несущих опухолевых клеток-мишеней, FasL-экспрессирующие лимфоциты взаимодействуют с другими Fas-несущими клетками, включая лимфоциты или гепатоциты. Можно предположить, что увеличение содержания FasL в опухолевой ткани вносит

существенный вклад в патогенез злокачественного перерождения тканей желудка и толстой кишки посредством индукции апоптоза ЦТЛ, способствуя «ускользанию» онкотрансформированной клетки от иммунного надзора, а также метастатической колонизации печени.

Рис. 7. Положительная корреляционная зависимость между уровнем FasL в иетрансформированной и опухолевой ткани желудка и толстой кишки.

2.2.2. Увеличение уровня sFasL в опухолевой ткани желудка

С помощью иммуноблоттинга нами показано, что в опухолевой ткани желудка определяется sFasL, в отличие от нетрансформированной ткани желудка (рис. 8). sFasL - результат расщепления металлопротеиназами. Возможно, повреждение ткани вследствие иммунных и воспалительных реакций ведет к увеличению активности металлопротеиназы и образованию sFasL. Превращение цитотоксического мембранно-связанного FasL в его защитную растворимую форму представляет важный регуляторный механизм, с помощью которого чувствительные ткани защищают себя от чрезмерного иммунного ответа. Это также используется опухолевыми клетками для ингибирования противоопухолевого иммунного ответа ^т^й M. J., 2000]. Таким образом, появление sFasL при опухолях желудка является одним из механизмов «ускользания» опухолей от иммунного ответа и представляет собой фактор риска прогрессии заболевания.

■'г'Л

40 кД (мембранно-связанный ГибЬ) 26 кД (растворимый ЕавЬ)

..„¿«¿•а.**.*

1. 2.

Рис. 8. Исследование уровня РябЬ в нетрансформированной (1) и опухолевой (2) тканях желудка методом иммуноблоттинга.

2.2.3. Увеличение экспрессии FasL мононуклеарными лейкоцитами периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки

В ответ на опухолевую трансформацию клетки в организме наблюдается размножение определенного клона лимфоцитов, что сопровождается увеличением уровня экспрессии FasL Т-клетками, то есть наблюдается активация ЦТЛ, которая в норме должна вести к гибели аномальной клетки [Pinkoski M. J., 2000]. При исследовании уровня FasL в лимфоцитах периферической крови методом проточной цитофлуориметрии после непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания нами выявлена тенденция к увеличению уровня FasL: в 5 из 6 случаев (83,3%) наблюдается повышение уровня FasL в среднем на 200%. Это свидетельствует о наличии в крови больных ЦТЛ, активированных в отношении аномальных клеток. Однако по литературным данным [Bennett M.W., 1999; O'Connell J., 2000; Shiraki К., 1997], большинство опухолевых клеток относительно резистентно к FasL-индуцированному апоптозу вследствие различных приобретенных дефектов сигнального пути реализуемого через систему взаимодействий Fas/FasL. В частности, в нашей работе, как было отмечено выше, показано снижение уровня Fas-рецептора и увеличение уровня FasL атипическими клетками желудка и толстой кишки, а также образование sFasL.

3. Общие тенденции изменения содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки

Для всех исследованных антигенов выявлена положительная статистически значимая корреляция между процентным содержанием антиген-экспрессирущих клеток и уровнем антигена как в нетрансформированных, так и опухолевых клетках желудка и толстой кишки (г = 0,91; р < 0,0001): другими словами, в опухолевой ткани увеличивается как количество антиген-положительных клеток, так и уровень антигенов (табл. 2). Таким образом, можно сделать вывод о тесной корреляции между уровнем антигена и процентным содержанием антиген-экспрессирующих клеток. Наличие такой тесной корреляции между двумя обсуждаемыми параметрами подтверждает достоверность обоих методов оценки результатов иммуногистохимического исследования содержания антигенов и их взаимозаменяемость и альтернативность, а не взаимоисключение и конкурентность. Об этом, безусловно, свидетельствует широкое распространение обоих методов в современных патоморфологических исследованиях [Bukholm I.K., 2000; Gobe G., 2002] и др.

ВЫВОДЫ

1. В опухолевой ткани желудка и толстой кишки обнаружено увеличение уровня антиапоптотического белка Вс1-2 в 1,5 раза и проапоптотического белка Вах в 1,5 раза по сравнению с нетрансформированной тканью.

2. Выявлены соматические мутации в гене Вах у 20% больных с новообразованиями желудка и толстой кишки, а также в клеточных линиях SKOV3, IM9 и СЕМ. Показано, что клеточная линия SKOV3 имеет генотип G7/G9 в отличие от нативного гена Вах G8/G8.

3. Обнаружено уменьшение количества Fas-положительных клеток в метастазирующих опухолях желудка и толстой кишки по сравнению с неметастазирующими опухолями в 1,6 раза, а также снижение уровня Fas в клетках метастазирующих опухолей по сравнению с клетками нетрансформированной ткани в 2 раза и неметастазирующих опухолей в 3 раза.

4. Показано, что снижение уровня Fas в опухолевой ткани коррелирует со снижением уровня sFas в сыворотке периферической крови больных с новообразованиями желудка и толстой кишки.

5. При новообразованиях желудка и толстой кишки установлено увеличение количества FasL-положительных клеток в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной, а также повышение уровня FasL в опухолевых клетках по сравнению с нетрансформированными и образование sFasL.

6. Обнаружена тесная корреляция (г = 0,91; р < 0,0001) между уровнем исследованных белков и количеством клеток, экспрессирующих данные белки, что свидетельствует о взаимозависимости этих двух параметров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белушкина Н.Н., Зыкова Е.С., Обухова В.В., Зыкова О.Н., Лесничук С.А., Силуянова С.Н., Харнас С.С., Самохвалов А.В., Северин СЕ. Обнаружение мутаций в проапототическом гене Вах у больных с опухолями желудка с помощью полимеразной цепной реакции // Цитология. - 2001. - №4. - с. 321

2. Белушкина Н.Н., Зыкова Е.С., Обухова В.В., Зыкова О.Н., Лесничук С.А., Силуянова С.Н., Харнас С.С., Самохвалов А.В., Северин СЕ. Детекция мутаций в ироапоптотическом гене Вах методом ПЦР/SSCP // Сборник трудов симпозиума (Научно-практический симпозиум «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины»). — М, 2002. — с. 47-52

3. Dedkov V.G., Obukhova V.V., Belushkina N.N., Efimov A.E. Scanning probe study of human blood mitochondria immersed in sucrose buffer solution on mica substrate // Physics of low-dimensional structures. - 2002. - Vol. 5/6. - P. 75-78

4. Мохиль-Дейн А. X., Белушкина Н. Н., Петрова У. Н., Обухова В. В., Замаева Н. Ю., Северин С. Е., Северин Е. С. Исследование уровня апоптоза и экспрессии Fas и Fas-L в лейкоцитах периферической крови у детей, больных системной красной волчанкой // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2003.-№.2.-с. 28-33

5. Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Обухова В.В., Белушкина Н.Н., Посыпанова ГА, Харнас СС, Самохвалов В.А., Северин Е.С, Катлинский А.В., Пальцев М.А. Регуляция чувствительности опухолевых клеток с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к гену BCL-2 // Молекулярная медицина. - 2003. - №. 1. — с. 45-51

6. Обухова В.В., Белушкина Н.Н., Макарова О.В., Дмитриева Е.В., Замаева Н.Ю., Харнас С.С., Самохвалов А.В., Белецкий И.П., Жукова А.А., Телегина Е.С, Северин С.Е., Северин Е.С. Система Fas/FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки // Молекулярная медицина. - 2004. - №. 2. - с. 44-49

7. Обухова В.В. Оценка устойчивости иммортализованных культур опухолей кишечника человека к противоопухолевым препаратам // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Материалы Ш Российской конференции молодых ученых России с международным участием. - М., 2004. - с. 173-174

8. Дедков В.Г., Обухова В.В. , Душкин И. В. Исследование локализации и концентрации апоптотических белков Вах и Вс1-2 в клетках аденокарциномы молочной железы MCF-7, стимулированных к апоптозу, методами сканирующей зондовой микроскопии // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Материалы Ш Российской конференции молодых ученых России с международным участием. - М., 2004. - с. 171-172

9. Dedkov V. G., Obukhova V. V., Belushkina N. N.. Morozova G. I., Efimov A. E., Dushkin I.V. The application of SNOM in investigations of mitochondria colored by fluorescent probes and marks // Scanning probe Microscopy - 2003. International workshop. - Nizhny Novgorod, 2003. - P. 306

Принято к исполнению 23/04/2004 Исполнено 23/04/2004

Заказ № 156 Тираж: 150 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ro

И- 73 0 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Обухова, Варвара Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Апоптоз как общебиологический процесс

1.2. Белки семейства Вс1

1.3. Новообразования желудка и толстой кишки

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Исследование нарушений регуляции внешнего пути апоптоза при 60 новообразованиях желудка и толстой кишки

3.1.1.1. Экспрессия Fas ^трансформированными и атипическими клетками 60 желудка и толстой кишки

3.1.1.2. Уровень sFas в сыворотке периферической крови больных с 64 новообразованиями желудка и толстой кишки

3.1.1.3. Экспрессия Fas мононуклеарными и полиморфноядерными лейкоцитами 655 периферической крови

3.1.2. Экспрессия FasL при новообразованиях желудка и толстой кишки

3.1.2.1. Экспрессия FasL ^трансформированными и атипическими клетками 65 желудка и толстой кишки

3.1.2.2. Экспрессия sFasL при опухолях желудка

3.1.2.3. Экспрессия FasL мононуклеарными лейкоцитами периферической крови 67 больных с новообразованиями желудка и толстой кишки

3.2. Исследование нарушений регуляции внутреннего пути апоптоза при 69 новообразованиях желудка и толстой кишки

3.2.1. Исследование уровня белков Вс1-2 и Вах с помощью иммуноблоттинга

3.2.2. Иммуногистохимическое исследование уровня белков семейства Bcl-2: Вс1-2, 69 Вах и Вс1-Х

3.2.3. Выявление мутаций в октадезоксигуанозиновой последовательности 3 экзона 78 гена Вах

3.2.4. Локализация белков Вс1-2 и Вах до и после индукции апоптоза

3.1.1. Экспрессия Fas при новообразованиях желудка и толстой кишки

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Нарушения регуляции внешнего пути апоптоза при новообразованях 95 желудка и толстой кишки

4.1.1. Изменения системы Fas/FasL со стороны опухолевой ткани желудка и 95 толстой кишки

4.1.1.1. Снижение экспрессии Fas атипическими клетками желудка и толстой 95 кишки

4.1.1.2. Снижение уровня sFas в сыворотке периферической крови у больных с 96 новообразованиями желудка и толстой кишки

4.1.1.3. Увеличение экспрессии FasL атипическими клетками желудка и толстой 97 кишки

4.1.1.4. Увеличение уровня sFasL в опухолевой ткани желудка

4.1.2. Изменения системы Fas/FasL со стороны лейкоцитов периферической крови 100 больных с новообразованями желудка и толстой кишки

4.1.2.1. Увеличение экспрессии FasL мононуклеарными лейкоцитами 100 периферической крови больных с новообразованями желудка и толстой кишки

4.1.2.2. Уменьшение экспрессии Fas мононуклеарными и полимофрноядерными 100 лейкоцитами периферической крови больных с новообразованями желудка и толстой кишки

4.2. Нарушения регуляции внутреннего пути апоптоза при новообразованях 103 желудка и толстой кишки

4.2.1. Увеличение экспрессии Вс1-2 атипическими клетками желудка и толстой 103 кишки

4.2.2. Увеличение экспрессии Вс1-Х атипическими клетками желудка и толстой 104 кишки

4.2.3. Увеличение экспрессии Вах атипическими клетками желудка и толстой 105 кишки

4.2.4. Мутации гена Вах - одна из возможных причин утраты проапоптотической 106 активности Вах

4.2.5. Общие тенденции изменения экспрессии апоптоз-специфических генов 108 системы Fas/FasL и семейства Вс1-2 при новообразованиях желудка и толстой кишки

4.3. Применение сканирующей зондовой микроскопии в молекулярной 114 биологии

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование экспрессии апоптоз-специфических генов семейства BCL-2 и системы FAS/FASL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека"

В основе развития опухоли лежит накопление онкотрансформированных клеток либо за счет увеличения их образования, либо за счет снижения уровня клеточной гибели, т.е. опухолевый рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом [Branet F., 1996; Simonian P.L., 1996]. Эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) относятся к быстроделящимся клеткам, поэтому большинство работ в этой области было сосредоточено на изучении пролифсративной активности опухолей ЖКТ. Однако в последние годы становится все более очевидным, что в развитии злокачественных новообразований ЖКТ важную роль играет нарушение регуляции апоптоза [159].

При этом были поставлены следующие задачи исследования:

2. Выявить мутации в гене Вах при некоторых новообразованиях человека.

При исследовании содержания белков семейства Вс1-2 и системы Fas/FasL у больных с новообразованиями желудка и толстой кишки выявлено статистически значимое увеличение уровня этих белков в опухолевых клетках по сравнению с нетрансформированными (р = 0,03). Установлены положительные корреляционные зависимости между количеством клеток, экспрессирующих исследованные белки, и уровнем белков как в нетрансформированных клетках (для Bcl-2, Вах, Fas и FasL), так и в опухолевых клетках (для Вс1-2, Вах).

Научно-практическая значимость работы. Исследование имеет большое научно-практическое значение, так как в ходе работы проведено комплексное исследование нарушений регуляции рецептор-опосредованного и митохондриального пути апоптоза при новообразованиях желудка и толстой кишки человека. Установление механизмов блокирования процесса апоптоза в дальнейшем позволит установить причины нарушений и, следовательно, пути устранения последних при опухолевых заболеваниях.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на научной сессии факультета подготовки научных и научно-педагогических кадров ММА им. И.М. Сеченова (май 2000, Москва), на Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000, Санкт-Петербург), на II и III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (апрель 2001 и январь 2004, Москва), на международной конференции «Scanning probe microscopy» (март 2002 и март 2003, Нижний Новгород), на Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (июнь 2002, Москва), а также неоднократно обсуждалась на научно-практических конференциях кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова и лабораторий НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова 3 декабря 2003 г.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Обухова, Варвара Владимировна

ВЫВОДЫ

5. При новообразованиях желудка и толстой кишки установлено увеличение количества FasL- положительных клеток в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной, а также повышение уровня FasL в опухолевых клетках по сравнению с нетрансформированными и образование sFasL.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Обухова, Варвара Владимировна, Москва

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников H.H., Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и при патологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999.- №3.- С.3-17

2. Аксель Е.М., Казубская Т.П., Белев Н.Ф. и др. Генетика рака желудочно-кишечного тракта. 2001. - №4.-Т. 3.-С. 141-145

3. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал УССР, 2002. - 320 с.

4. Белушкина Н. Н., Хасан Хамад А., Северин С. Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998. - №4.-С. 15-24

5. Воробьев Г.И., Одарюк Т.С., Шелыгин Ю.А. Диагностика и лечение рака толстой кишки//Русский медицинский журнал. 1998.-том 6.-№ 19.-е. 1244-1256

6. Гарькавцева Р.Ф., Давыдов М.И., Ушакова Т.И. и др. Злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта: основные статистические показатели и тенденции // Современная онкология. 2001. - №4. - Т. 3. — С. 151153

7. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997. -287 с.

8. Зыкова Е.С. Разработка универсальной системы ДНК-диагностики, основанной на ПЦР, и ее использование для обнаружения мутаций LEIDEN у больных венозными тромбозами (диссертация), 1998

9. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). М.: Медицина, 2001. -192 с.

10. Методы биологических исследований (липидный и энергетический обмен). Под редакцией проф. Прохоровой М.И. // Ленинград. Издательство Ленинградского университета. (1982), стр. 29-33; стр. 207-212

11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./ Под ред. С Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 с.

12. Москалева Е.Ю., Сладкова Л.В., Обухова В.В. и др. Регуляция чувствительности опухолевых клеток с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к гену Bcl-2 II Молекулярная медицина. 2003. - №. 1.-е. 45-51

13. Орлова Л.П. Клиническое значение ультрасонограффии в диагностике рака толстой кишки // Русский медицинский журнал. 1998. - том 6. - № 19. - с. 12581263

14. Практическая химия белка: Пер. с англ./ Под ред. А. Дарбле. М.: Мир, 1989. - 623 с.

15. Программированная клеточная гибель, под ред. Новикова B.C., С-Пб.: "Наука", 1996.

16. Северин С.Е. Биохимия и медицина новые подходы и достижения. - М.: Русский врач, 1998.-96с.

17. Смирнов А.Б. Заболеваемость раком желудка. http://www.sci.aha.ru/ATL/ra531.htm. -1998

18. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразиая цепная реакция (ПЦР). Методическое пособие для начинающих/Принципы и практические рекомендации для ее постановки с целью детекции микроорганизмов. - 1996.- 33 с.

19. Хайкин М.С., Володин А.П., Трояновский A.M., Эдельман B.C. Сканирующие туннельные микроскопы. // Приборы и техника эксперимента. 1987. - № 4. - с. 231-232

20. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. М.: Наука, 1999. -429 с.

21. Ackermann Е. J., Taylor J. К., Narayana R. et al. The role of antiapoptotic Bcl-2 family members in endothelial apoptosis elucidated with antisense oligonucleotides // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 16. - P. 11245-11252

22. Adrain C., Creagh E. M., Martin S. J. Apoptosis-associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2 // The EMBO journal.- 2001. Vol. 20. - N. 23. - P. 6627-6636

23. Antonsson B. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion // Cell Tissue Res. 2001. - Vol. 306. - N. 3. - P. 347-361

24. Antonsson В., Montessuit S., Sanchez B. et al. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells // The journal of biological chemistry.-2001.-Vol. 276.-N. 15-P. 11615-11623

25. Apte S.S., Mattei M.G. and Olsen B.R. Mapping of the human Bax gene to chromosome 19ql3.3 ql3.4 and isolation of a novel alternatively spliced transcript, Bax delta // Genomics. - 1995. - Vol. 26. - P. 592-594

26. Aschoff A. P., Ott U., Funfstuck R. ct al. Colocalisation of Bax and Bcl-2 in small intestine and kidney biobsies with different degrees of DNA fragmentation // Cell Tissue Res. 1999. - Vol. 296. - P. 351-357

27. Asoh S„ Nishimaki K., Nanbu-Wakao R. et al. A tracc amount of the human pro-apoptotic factor Bax induces bacterial death accompanied by damage of DNA // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. - N. 18. - P. 11384-11391

28. Ayhan A., Yasui W., Yokozaki H. et al. Loss of heterozygosity at the Bcl-2 gene locus and expression of Bcl-2 in human gastric and colorectal carcinomas // Jpn. J. Cancer research. 1994. - Vol. 85. - N. 6. - P. 584-591

29. Bardelli A. HGF receptor associates with the anti-apoptotic protein Bag-1 and prevents cell death //The EMBO journal. 1996. - Vol. 15. - P. 6205-6212

30. Basanez G., Nechushtan A., Drozhinin O. et al. Bax, but not Bcl-XL, decreases the lifetime of planar phospholipid bilayer membranes at subnanomolar concentrations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - N. 10. - P. 5492-5497

31. Basanez G., Zhang J., Chau B. N. et al. Pro-apoptotic cleavage products of Bcl-XL form cytochrome c-conducting pores in pure lipid membranes // The journal of biological chemistry. 2001. - Vol. 276. - P. 31083-31091

32. Bello D.B., Valentini M.A., Zunino F. et al. Cleavage of Bcl-2 in oxidant- and cisplatin-induced apoptosis of human melanoma cells // Oncogene. 2001. - Vol. 20. - N. 33. - P. 4591-4595

33. Bennett M.W., O'Connell J., Houston A. et al. Fas ligand upregulation is an early event in colonic carcinogenesis // J. Clin. Pathol. 2001. - Vol. 54. - N. 8. - P. 598-604

34. Bennett M.W., O'connell J., O'sullivan G.C. et al. Expression of Fas ligand by human gastric adenocarcinomas: a potential mechanism of immune escape in stomach cancer // Gut. 1999. - Vol. 44. - N. 2. - P. 156-162

35. Bosari S., Moneghini L., Graziani D. et al. bcl-2 oncoprotein in colorectal hyperplastic polyps, adenomas, and adenocarcinomas // Hum. Pathol. 1995. - Vol. 26. - N. 5. - P. 534-540

36. Brady H.J.M., Gil-Gomez G. Molecules in focus Bax. The pro-apoptotic Bcl-2 family member, Bax //The international journal of boichemistry and cell biology. 1998. - Vol. 30. - P. 6407-650

37. Branet F., Brousset P., Krajevski S. Expression of the cell death inducing gene Bax in carcinomas developed from the follicular cells of the thyroid gland // Journal of clinical endocrinology and metabolism. 1996. - Vol. 81. - N. 7. - P. P2726-P2730

38. Bukholm I.K., Nesland J. M. Protein expression of p53, p21 (WAF1/CIP1), Bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas // Virchows Arch. 2000. - Vol. 436. -P. 224-228

39. Butler L.M., Hewett P.J., Butler W.J. et al. Down-regulation of Fas gene expression in colon cancer is not a result of allelic loss or gene rearrangement // Br. J. Cancer. 1998. - Vol. 77. - N. 9. - P. 1454-1459

40. Chandra D., Liu J.-W., Tang D. G. Early Mitochondrial activation and cytochrome c up-regulation during apoptosis // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. -N. 52. - P. 50842-50854

41. Chang B. S., Minn A. J., Muchmore S.W. et al. Identification of a novel regulatory domain in Bcl-XL and Bcl-2 // The EMBO journal. 1997. - Vol. 16. - N. 5. - P. 968977

42. Chao D. T., Korsmeyer S. J. Bcl-2 family: regulators of cell death // Annu. Rev. Immunol. 1998. - Vol. 16. - P. 395-419

43. Charalambous G. K., Gomatos I. P., Konstadoulakis M. M. et al. Protein expression of Bax, Bcl-2, and p53 in patients with non-Hodgkin's gastric lymphoma: prognostic significance // World j. Surg. 2000. - Vol. 24. - P. 608-614

44. Cheng S.C., Luo D., Xie Y. Taxol induced Bcl-2 protein phosphorylation in human hepatocellular carcinoma QGY-7703 cell line // Cell Biol. Int. 2001. - Vol. 25. - N. 3. -P. 261-265

45. Chinnaiyan A.M., O'Rourke K., Lane B.R., Dixit V.M. Interaction of Ced-4 with Ced-3 and Ced-9: a molecular frame for cell death // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 1122-1126

46. Choi K.C., Kang S.K., Tai C.J. et al. Estradiol up-regulates antiapoptotic Bcl-2 messenger ribonucleic acid and protein in tumorigenic ovarian surface epithelium cells // Endocrinology. 2001. - Vol.142. - N. 6. - P. 2351-2360

47. Clem R. J., Cheng E. H.-Y., Karp C. L. et al. Modulation of cell death by Bcl-XL through caspase interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - N. 2. - P. 554-559

48. Dedkov V.G., Obukhova V.V., Belushkina N.N., Efimov A.E. // Physics of Low-Dimentional Stractures. 2002. - Vol. 5. - N. 6. - P. 75-78

49. Dewson G., Cohen G.M., Wardlaw A.J. Interleukin-5 inhibits translocation of Bax to the mitochondria, cytochrome c release, and activation of caspases in human eosinophils // Blood. 2001. - Vol. 98. - N. 7. - P. 2239-2247

50. Druilhe A., Wallaert B., Tsicopoulos A. et al. Apoptosis, proliferation, and expression of Bcl-2, Fas, and Fas ligand in bronchial biopsies from asthmatics // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1998. - Vol. 19. - N. 5. - P. 747-757

51. Eissa S., Seada L.S. Quantitation of Bcl-2 protein in bladder cancer tissue by enzyme immunoassay: comparison with Western blot and immenohistochemistry // Clinical chemistry. 1998. - Vol. 44. - N. 7. - P. 1423-1429

52. Eskes RM Antonsson B.,Osen-Sand A. et al. Bax-induced cytochrome c release from mitochondria is independent of the permeability transition pore but highly dependent on Mg2+ ions //The journal of cell biology. 1998. - Vol. 143. - P. 217-224

53. Eskes R., Desagher S., Antonsson B. Bid induces the oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane // Molecular and cellular biology. — 2000. — Vol. 20.-N. 3.-P. 929-935

54. Farid P., Gomb S.Z., Peter I. et al. Bcl-2, p53 and Bax in thyroid tumors and their relation to apoptosis // Neoplasma. 2001. - Vol. 48. - N. 4. - P. 299-301

55. Ferrante A., Thong Y.H. A rapid one-step procedure for purification of mononuclear and polymorphonuclear leukocytes from human blood using a modification of the Hypaque-Ficoll technique // J. Immunol. Methods. 1978. - Vol. 24. - P. 389-393

56. Finucane D. M., Bossy-Wetzel E., Waterhouse N. J. et al. Bax induced caspase activation and apoptosis via cytochrome c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-XL // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 4. - P. 2225-2233

57. Fortuno M. A., Zalba G., Ravassa S. et al. p53 mediated upregulation of Bax gene transcription is not involved in Bax a protein overexpression in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats // Hypertension. 1999. - Vol. 33. - P. 1348-1352

58. Fracker P.J., King L.E., Lill-Elghanian D., Telfold W.G. Quantification of apoptotic events in pure and heterogeneous populations of cells using the flow cytometer // Methods in cell biology. 1995. - V. 46. - P. 57-76

59. Friess HM Lu Z., Graber H. U. et al. Bax, but not Bcl-2, influences the prognosis of human pancreatic cancer//Gut. 1998. - Vol. 43. - P. 414-421

60. Gaumann A., Tews D.S., Mayer E. et al. Expression of apoptosis-related proteins, p53, and DNA fragmentation in sarcomas of the pulmonary artery // Cancer. 2001. - Vol. 92.-N. 5.-P. 1237-1244

61. Germain M., Mathai J. P., Shore G. C. BH-3-only BIK functions at the endoplasmic reticulum to stimulate cytochrome c release from mitochondria // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 18053-18060

62. Gil J., Yamamoto H„ Zapata J. M. et al. Impairment of the proapoptotic activity of Bax by missense mutations found in gastrointestinal cancers // Cancer research. — 1999. — Vol. 59.-P. 2034-2037

63. Gobe G., Rubin M., Williams G. et al. Apoptosis and expression of Bcl-2, Bcl-XL, and Bax in renal cell carcinomas // Cancer Investigation. 2002. - Vol. 20. - P. 324-332

64. Gong B., Chen Q., Endlich B. et al. Ionizing radiation induced Bax mediated cell death is dependent on activation of cysteine and serine proteases // Cell Growth & Differentiation. 1999. - Vol. 10. - P. 491-502

65. Goping I.S., Gross A., Lavoie J. N. et al. Regulated targeting of Bax to mitochondria // The journal of cell biology. 1998. - Vol. 143. - N. 1. - P. 207-215

66. Griffiths G. J., Dubrez L., Morga C. P. et al. Cell damage-induced conformational changes of the pro-apoptotic protein Bak in vivo precede the onset of apoptosis // The journal of cell biology.- 1999. Vol. 144. - N. 5. - P. 903-914

67. Gross A., Jockel J., Wei M. C. et al. Enforced dimerization of Bax results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis // The EMBO journal. 1998. -Vol. 17.-P. 3878-3885

68. Gross A., McDonnell J. M., Korsmeyer S. J. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis//Genes Dev.-1999.-Vol. 13.-N. 15.-P. 1899-1911

69. Guo B., Godzik A., Reed Y.R. Bcl-G, a novel pro-apoptotic member of the Bcl-2 family //The journal of biological chemistry. 2001. - Vol. 276. - N. 4. - P. 2780-2785

70. Guo Y., Srinivasula S. M., Druilhe A. et al. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria // The journal of biological chemistry. — 2002. -Vol. 277.-P. 13430-13437

71. Gurin C. C., Federici M. G., Kang L.et al. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma // Cancer research. 1999. - Vol. 59. - P. 462-466

72. Hansma P.K., Elings V.B., Marti O., Bracker C.E. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy: application to biology and technology // Science. 1988. -Vol. 242.-P. 209-216

73. Harima Y., Harima K., Shikata N. et al. Bax and BcI-2 expressions predict response to radiotherapy in human cervical cancer// J. Cancer research. Clin. Oncol. 1998. - Vol. 124.-P. 503-510

74. Harris M. H., Heiden M. G. V., Kron S. J. et al. Role of oxidative phosphorylation in Bax toxicity // Molecular and cellular biology. 2000. - Vol. 20. - N. 10. - P. 3590-3596

75. Heiden M. G. V., Chandel N. S., Li X. X. et al. Outer mitochondrial membrane permeability can regulate coupled respiration and cell survival // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - N. 9. - P. 4666-4671

76. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis // Nature. 2000. - Vol. 407. - P. 770776

77. Hirotani M., Zhang Y., Fujita N. et al. NH2-terminal BH4 domain of Bcl-2 is functional for heterodimerization with Bax and inhibition of apoptosis // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 29. - P. 20415-20420

78. Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M. et al. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex // Molecular and Cellular Biology. 2003. - Vol. 23. - N. 4. - P. 1428-1440

79. Hsu Y.-T., Youle R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family // The journal of biological chemistry. 1997. - Vol. 272. - N. 21. - P. 13829-13834

80. Huang C.-l., Kohno N., Inufusa H. et al. Overexpression of Bax associated with mutations in the loop-sheet-helix motif of p53 // American journal of pathology. 1999. -Vol. 155.-P. 955-965

81. Huang D.C.S., Hahne M., Schroeter M. et al. Activation of Fas by FasL induces apoptosis by a mechanism that cannot be blocked by Bcl-2 or Bcl-XL// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 14871-14876

82. Huang D.C.S., O'Reilly L. A., Strasser A. et al. The anti-apoptosis function of Bcl-2 can be genetically separated from its inhibitory effect on cell cycle entry // The EMBO journal. 1997. - Vol. 16. - N. 15. - P. 4628-4638

83. Iimura M., Nakamura T., Shinozaki S. et al. Bax is downregulated in inflamed colonic mucosa of ulcerative colitis // Gut. 2000. - Vol. 47. - P. 228-235

84. Ilyas M., Hao X.P., Wilkinson K. et al. Loss of Bcl-2 expression correlates with tumour recurrence in colorectal cancer // Gut. 1998. - Vol. 43. - N. 3. - P. 383-387

85. Inohara N., Ekhterae D„ Garcia I. et al. Mtd a novel Bcl-2 family member activates apoptosis in the absence of heterodimerization with Bcl-2 and Bcl-XL // The journal of biological chemistry. - 1998. - Vol. 273. - N. 15. - P. 8705-8710

86. Ionov YM Yamamoto H., Krajewski S. et al. Mutational inactivation of the proapoptotic gene Bax confers selective advantage during tumor clonal evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - N. 20. - P. 10872-10877

87. Jansson A., Sun X.F. Bax expression decreases significantly from primary tumor to metastasis in colorectal cancer// J. Clin. Oncol. 2002. - Vol. 20. - N. 3. - p. 811-816

88. Jia L., Patwari Y., Srinivasula S.M. et al. Bax translocation is crucial for the sensitivity of leukaemic cells to etoposide-induced apoptosis // Oncogene. 2001. - Vol. 20. — N. 35. -P. 4817-4826

89. Johnson A. L. Editorial: Mcl-1 just another antiapoptotic Bcl-2 homolog? // Endocrinology. - 1999. - Vol. 140. - N. 12. - P. 5465-5468

90. Kaklamanis L., Savage A., Whitehouse R. et al. Bcl-2 protein expression: association with p53 and prognosis in colorectal cancer // Br. J. Cancer. 1998. - Vol. 77. - N. 11.— P. 1864-1869

91. Khaled A. R., Kim K., Hofmeister R. et al. Withdrawal of IL-7 induces Bax translocation from cytosol to mitochondria through a rise in intracellular pH // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - N. 25. - P. 14476-14481

92. Kim T.-H., Zhao Y., Barber M. J. et al. Bid induced cytochrome с release is mediated by a pathway independent of mitochondrial permeability transition pore and Bax // The journal of biological chemistry. 2000. - Vol. 275. - N. 50. - P. 39474-39481

93. Kingham P. J., Pocock J. M. Microglial apoptosis induced by chromogranin A is mediated by mitochondrial depolarisation and the permeability transition but not by cytochrome с release // Journal of neurochemistry. 2000. - Vol. 74. - N. 4. - P. 14521462

94. Kirsch D.G., Doseff A., Chau B. N. et al. Caspase-3-dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome с // The journal of biological chemistry. 2001. - Vol.274.-N. 30.-P. 21155-21161

95. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R. et al. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science. 1997. - Vol.275.-P. 1132-1136

96. Komatsu К., Suzuki S„ Ohara S. et al. Expression of Bcl-2 and Bax in human gastric cancer tissue // Nippon Rinsho. 1996. - Vol. 54. - N. 7. - P. 1929-1934

97. Kondo S., Shinomura Y., Kanayama S. et al. Over-expression of Bcl-XL gene in human gastric adenomas and carcinomas // Int. J. Cancer. 1996. - Vol. 68. - N. 6. - P. 727-730

98. Kornblau S.M., Vu H.T., Ruvolo P. et al. Bax and PKCa modulate the prognostic impact of Bcl-2 expression in acute myelogenous leukemia // Clinical cancer research. -2000. Vol. 6. - P. 1401-1409

99. Koyama S., Koike N., Adachi S. Fas receptor counterattack against tumor-infiltrating lymphocytes in vivo as a mechanism of immune escape in gastric carcinoma // J. Cancer research. Clin. Oncol. 2001. - Vol. 127. - N. 1. - P. 20-26

100. Krajewska M., Fenoglio-Preiser C.M., Krajewski S. et al. Immunohistochemical analysis of Bcl-2 family proteins in adenocarcinomas of the stomach // American journal of pathology. 1996. - Vol. 149. - N. 5. - P. 1449-1457

101. Krajewska M., Moss S.F., Krajewski S. et al. Elevated expression of Bcl-X and reduced Bak in primary colorectal adenocarcinomas // Cancer research. 1996. - Vol. 56.-N. 10.-P. 2422-2427

102. Krammer P. H. CD95's deadly mission in the immune system // Nature. 2000. -Vol. 407.-P. 789-795

103. Krueger A., Baumann S., Krammer P. H., Kirchhoff S. FLICE-inhibitory proteins: regulators of death receptor-mediated apoptosis // Molecular and cellular biology. 2001. - Vol. 21. - N. 24. - P. 8247-8254

104. Kurabayashi A., Furihata M„ Matsumoto M. et al. Expression of Bax and apoptosis-related proteins in human esophageal squamous cell carcinoma including dysplasia // Mol. Pathol. 2001. - Vol. 306. - N. 3. - P. 741-747

105. Lam M., Bhat M. B., Nunez G. et al. Regulation of Bcl-XL channel activity by calcium // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. - N. 28. - P. 1730717310

106. Lee S.S., Cho K.J., Hong S.I. et al. Nuclear overexpression of Bcl-2 oncoprotein during the progression of human stomach cancer // J. Korean. Med. Sci. 1998. - Vol. 13.-N. 2.-P. 153-158

107. Leung W. K., Kim J. J., Kim J. G. et al. Microsatellite instability in gastric intestinal metaplasia in patients with and without gastric cancer // American journal of pathology. 2000. - Vol. 156. - P. 537-543

108. Li B., Dou Q. P. Bax degradation by the ubiquitin/proteasome-dependent pathway: Involvement in tumor survival and progression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. Vol. 97. - N. 8. - P. 3850-3855

109. Li P.-F., Dietz R„ von Harsdorf R. p53 regulates mitochondrial membrane potential through reactive oxygen species and induces cytochrome c-independent apoptosis blocked by Bcl-2 // The EMBO journal. 1999. - Vol. 18. - P. 6027-6036

110. Liang Y., Nylander K. D., Yan C., Schor N. F. Role of caspase 3-dependent Bcl-2 cleavage in potentiation of apoptosis by Bcl-2 // Mol. Pharmacol. 2002. - Vol. 61. - P. 142-149

111. Lian-Jun Y., Wen-Liang W. Expression of Bcl-2 and Bax proteins in hepatocellular carcinoma tissue // J. Fourth Mil. Med. Univ. 2002. - Vol. 23. - P. 337340

112. Lim M.L., Minamikawa T., Nagley P. The protonophore CCCP induces mitochondrial permeability transition without cytochrome c release in human osteosarcoma cells // FEBS Lett. 2001. - Vol. 503. - N. 1. - P. 69-74

113. Lim S.C. Fas-related apoptosis in gastric adenocarcinoma // Oncol. Rep. 2003. -Vol. 10.-N. l.-P. 57-63

114. Lindblom B, Holmlund G. Rapid DNA purification for restriction fragment length polymorphism analysis // Gene Anal. Tech. 1988. - Vol. 5. - N. 5. - P. 97-101.

115. Ling Y.-H., Tornos C., Perez-Soler R. Phosphorylation of Bcl-2 is a marker of M fhase events and not a determinant of apoptosis // The journal of biological chemistry. -1998. Vol. 273. - N. 30. - P. 18984-18991

116. Liu X.-H., Castelli J. C., Youle R. J. Receptor-mediated uptake of an extracellular Bcl-XL fusion protein inhibits apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. - Vol.96. -N. 17. - P. 9563-9567

117. Lock R. B. Bcl-2 inhibits a Fas induced conformational change in the Bax N-terminus and Bax mitochondrial translocation // The journal of biological chemistry. -2000. Vol. 275. - N. 23. - P. 17225-17228

118. MacFarlane M., Merrison W., Bratton S. B. et al. Proteasome-mediated degradation of Smac during fpoptosis: XIAP promotes Smac ubiquitination in vitro // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 36611-36616

119. Marani M„ Tenev T., Hancock D. et al. Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis // Molecular and cellular biology. 2002. - Vol. 22. - N. 11. - P. 3577-3589

120. Marone M., Scambia G.f Mozzetti S. et al. Bcl-2, Bax, Bcl-XL, and Bcl-XS expression in normal and neoplastic ovarian tissues // Clinical cancer research. 1998. -Vol.4.-P. 517-524

121. Martin A. G., Fearnhead H. O. Apocytochrome c blocks caspase-9 activation and Bax-induced apoptosis // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 50834-50841

122. Martin S., Toquet C., Oliver L. et al. Expression of Bcl-2, Bax and Bcl-XL in human gliomas: a re-appraisal // J. Neurooncol. 2001. - Vol. 52. - N. 2. - P. 129-139

123. Marzo I., Brenner C., Zamzami N. et al. Bax and adenune nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 2027-2030

124. Matsuyama S., Schendel S. L., Xie Z. et al. Cytoprotection by Bcl-2 requires the pore-forming a5 and a6 helices // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. - N. 47. - P. 30995-31001

125. Maurer C.A., Friess H„ Buhler S.S. et al. Apoptosis inhibiting factor Bcl-XL might be the crucial member of the Bcl-2 gene family in colorectal cancer // Dig. Dis. Sei. 1998. - Vol. 43. - N. 12. - P. 2641-2648

126. McDonnel J., Bechm A., Sarkiss M. et al. Importance of the Bcl-2 family in cell death regulation // Experientia. 1996. - Vol. 52. - P. 1008-1017

127. McGinnis K. M., Gnegy M. E., Wang K. K. W. Endogenous Bax translocation in SH-SY5Y human neuroblastoma cells and cerebellar granule neurons undergoing apoptosis //Journal of neurochemistry. 1999. - Vol. 72. - N. 5. - P. 1899-1906

128. Medema J. P., Scaffidi C., Krammer P. H., Peter M. E. Bcl-XL acts downstream of caspase-8 activation by the CD95 death-inducing signaling complex // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. - P. 3388-3393

129. Meijerink J. P.P., Mensink E. J.B.M., Wang K. et al. Hematopoietic malignancies demonstrate loss-of-function mutations of Bax // Blood. 1998. - Vol. 91. - N. 8. - P. 2991-2997

130. Mercatane D.R., Bortner C.D., Cidlowski J.A. et al. Modification of alternative splicing of Bcl-X pre-mRNA in prostate and breast cancer cells // The journal of biological chemistry. 2001 - Vol. 276. - P. 16411-16417

131. Micheau O., Solary E., Hammann A. et al. Fas ligand-independent, FADD-mediated activation of the Fas death pathway by anticancer drugs // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 12. - P. 7987-7992

132. Misao J., Hayakawa Y., Ohno M. et al. Expression of Bcl-2 protein an inhibitor of apoptosis and Bax an accelerator of apoptosis in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction // Circulation. 1996. - Vol. 94. - P. 1506-1512

133. Мок C.-L., Gil-Gómez G., Williams O. et al. Bad can act as a key regulator of T cell apoptosis and T cell development // The Journal of Experimental Medicine. 1999. -Vol. 189.-N.3.-P. 575-586

134. Shinoura N., Yoshida Y., Nishimura M. et al. Expression level of Bcl-2 determines anti or proapoptotic function // Cancer research. 1999. - Vol. 59. - P. 41194128

135. Narasimhan S. R., Yang L., Gerwin В. I. et al. Resistance of pleural mesothelioma cell lines to apoptosis relation to expression of Bcl-2 and Bax // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 1998. - Vol. 275. - N. 1. - P. L165-L171

136. Narita M., Shimizu S., Ito T. et al. Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome с release in isolated mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - N. 25. - P. 14681-14686

137. Nechushtan A., Smith C. L., Hsu Y.-T. et al. Conformation of the Bax C-terminus regulates subcellular location and cell death //The EMBO journal. 1999. - Vol. 18. - P. 2330-2341

138. Nechushtan A., Smith C.L., Lamensdorf I. et al. Bax and Bak coalesce into novel mitochondria-associated clusters during apoptosis //The journal of cell biology.- 2001. -Vol. 153.-N. 6.-P. 1265-1276

139. Nomura M., Shimizu S„ Ito T. et al. Apoptotic cytosol facilitates Bax translocation to mitochondria that involves cytosolic factor regulated by Bcl-2 // Cancer research. 1999. - Vol. 59. - P. 5542-5548

140. O'Connell J., Bennett M.W., Nally K. et al. Altered mechanisms of apoptosis in colon cancer: Fas resistance and counterattack in the tumor-immune conflict // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. - Vol. 910. - P. 178-192

141. Ogura E., Senzaki H., Yamamoto D. et al. Prognostic significance of Bcl-2, Bcl-XL/S, Bax and Bak expressions in colorectal carcinomas // Oncol. Rep. 1999. - Vol. 6. -N. 2.-P. 365-369

142. Osaki M., Kase S., Kodani I. et al. Expression of Fas and Fas ligand in human gastric adenomas and intestinal-type carcinomas: correlation with proliferation and apoptosis // Gastric cancer. 2001. - Vol. 4. - N. 4. - P. 198-205

143. Oto M., Miyake S., and Yuasa Y. Optimization of nonradioisotopic single strand conformation polymorphism analysis with a conventional minislab gel electrophoresis apparatus // Analytical biochemistry. 1993. - Vol. 213. - P. 19-22

144. Ouyang H., Furukawa T., Abe T. et al. The Bax gene, the promoter of apoptosis, is mutated in genetically unstable cancer of the colorectum, stomach, and endometrium // Clinical cancer research. 1998. - Vol. 4. - P. 1071-1074

145. Peiro G., Diebold J., Mayr D. et al. Prognostic relevance of hMLHl, hMSH2, and Bax protein expression in endometrial carcinoma // Mol. Pathol. 2001. - Vol. 14. - N. 8.-P. 777-783

146. Perfettini J.L., Reed J.C., Israel N. et al. Role of Bcl-2 family members in caspase-independent apoptosis during chlamydia infection // Infect. Immun. 2002. -Vol. 70.-N. l.-P. 55-61

147. Perlman H., Sata M., Le Roux A. et al. Bax mediated cell death by the Gax homeoprotein requires mitogen activation but is independent of cell cycle activity // The EMBO journal. 1998. - Vol. 17. - P. 3576-3586

148. Pinkoski M. J., Brunner T., Green D. R. et al. Fas and Fas ligand in gut and liver // Gastrointestinal and liver physiology. 2000. - Vol. 278. - N. 3. - P. G354-G366

149. Potten C.S., Wilson J.W., Booth C. Regulation and significance of apoptosis in the stem cells of the gastrointestinal epithelium // Stem cells. 1997. - Vol. 15. - N. 2. -P. 82-93

150. Proussakova O.V., Rabaya N.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of soluble Fas antigen induces its cytotoxicity//The journal of biological chemistry. — 2003. Vol. 278. - N. 38. - P. 36236-36241

151. Pryde J. G., Walker A., Rossi A. G. et al. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 °C prevents the release of cytochrome c // The journal of biological chemistry. 2000. - Vol. 275. - N. 43. - P. 33574-33584

152. Radmacher M„ Fritz M., Hansma H.G., Hansma P.K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope // Science. 1994. - Vol. 265. - P. 1577-1579

153. Rampino N., Yamamoto H., lonov Y., Li Y., Sawai H., Reed J.C., Perucho M. Somatic frameshift mutations in the Bax gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 967-969

154. Reed J. C. Balancing cell life and death: Bax, apoptosis, and breast cancer // J. Clin. Invest. -1996. Vol. 97. - N. 11. - P. 2403-2404

155. Roya S., Nicholsona D. W. Cross-talk in cell death signaling // The Journal of Experimental Medicine. 2000. - Vol. 192. - N. 8. - P. F21-F26

156. RudnerlJ., Lepple-Wienhues A., Budachl W. et al. Wild-type, mitochondrial and ER-restricted Bcl-2 inhibit DNA damage-induced apoptosis but do not affect death receptor-induced apoptosis // Journal of Cell Science. 2001. - Vol. 114. - P. 4161-4172

157. Ruvolo P.P., Deng X., May W.S. Phosphorylation of Bcl-2 and regulation of apoptosis // Leukemia. 2001. - Vol. 15. - N. 4. - P. 515-522

158. Saegusa M., Takano Y., Okayasu I. Bcl-2 expression and its association with cell kinetics in human gastric carcinomas and intestinal metaplasia//J. Cancer research. Clin. Oncol. 1995. - Vol. 121. - N. 6. - P. 357-363

159. Saeterdal I., Bjorheim J., Lislerud K. et al. Frameshift-mutation-derived peptides as tumor-specific antigens in inherited and spontaneous colorectal cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - N. 23. - P. 13255-13260

160. Sahara S., Aoto M„ Eguchi Y. et al. Acinus is a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation // Nature. 1999. - Vol. 401. - N. 6749. -P. 168-173

161. Saleh H.A., Jackson H., Khatib G. et al. Correlation of Bcl-2 oncoprotein immunohistochemical expression with proliferation index and histopathologic parameters in colorectal neoplasia // Pathol. Oncol. Res. 1999. - Vol. 5. - N. 4. - P. 273-279

162. Schaich M., Illmer T., Seitz G. et al. The prognostic value of Bcl-XL gene expression for remission induction is influenced by cytogenetics in adult acute myeloid leukemia // Haematologica. 2001. - Vol. 86. - N. 5. - P. 470-477

163. Schelwies K., Sturm I., Grabowski P. et al. Analysis of p53/Bax in primary colorectal carcinoma: low Bax protein expression is a negative prognostic factor in UICC stage III tumors // Int. J. Cancer. 2002. - Vol. 99. - N. 4. - P. 589-596

164. Schendel S. L., Xie Z., Montal M. O. et al. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 5113-5118

165. Schlesinger P. H., Gross A., X.-M. Yin et al. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic Bax and antiapoptotic Bcl-2 // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 11357-11362

166. Schwandner O., Schiedeck T.H., Bruch H.P. et al. p53 and Bcl-2 as significant predictors of recurrence and survival in rectal cancer // Eur. J. Cancer. 2000. — Vol. 36. -N. 3.-P. 348-356

167. Sharma S., Saltz L. B. Oral chemotherapeutic agents for colorectal cancer // The Oncologist. 2000. - Vol. 5. - N. 2. - P. 99-107

168. Sheehan K.M., O'Donovan D.G., Fitzmaurice G. Prognostic relevance of Fas (Apo-l/CD95) ligand in human colorectal cancer // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. -2003. Vol. 15. - N. 4. - P. 375-380

169. Shibasaki T., Kondo E., Akagi T., McKeon F. Suppression of signalling through transcription factor NF-AT by interaction between calcineurin and Bcl-2 // Nature. -1997.-Vol. 386.-P. 728-731

170. Shilkaitis A., Graves J., Mehta R. R. et al. Bcl-2 and Bax are differentially expressed in hyperplastic premalignant and malignant lesions of mammary carcinogenesis // Cell Growth Differ. 2000. - Vol. 11. - P. 437-445

171. Shimoyama M., Kanda T., Liu L. et al. Expression of Fas ligand is an early event in colorectal carcinogenesis //J. Surg. Oncol. 2001. - Vol. 76. - N. 1. - P. 63-68

172. Shiraki K., Tsuji N., Shioda T. et al. Expression of Fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 6420-6425

173. Simonian P.L., Grillot D.A.M., Andrews D.W. et al. Bax homodimerization is not required for Bax to accelerate chemotherapy-induced cell death // The journal of biological chemistry. 1996. - Vol. 271. - N. 50. - P. 32073-32077

174. Simonian P.L., Grillot D.A.M., Nunez G. Bcl-2 and Bcl-XL can differentially block chemotherapy-induced cell death // Blood. 1997. - Vol. 90. - N. 3. - P. 12081216

175. Soini Y., Kinnula V., Kaarteenaho-Wiik R. et al. Apoptosis and expression of apoptosis regulating proteins Bcl-2, Mcl-1, Bcl-X and Bax in malignant mesothelioma // Clinical cancer research. 1999. - Vol. 5. - P. 3508-3515

176. Song E., Chen J., Ouyang N. et al. Soluble Fas ligand released by colon adenocarcinoma cells induces host lymphocyte apoptosis: an active mode of immune evasion in colon cancer // Br. J. Cancer. 2001. - Vol. 85. - N. 7. - P. 1047-1054

177. Srinivas G., Kusumakumary P., Krishnan M. et al. Mutant p53 protein, Bcl-2/Bax ratios and apoptosis in paediatric acute lymphoblastic leulaemia II J. Cancer research. Clin. Oncol. 2000. - Vol. 126. - P. 62-67

178. Steinman H. M. The Bcl-2 oncoprotein functions as a pro-oxidant // The journal of biological chemistry. 1995. - Vol. 270. - N. 8. - P. 3487-3490

179. Sundararajan R., Cuconati A., Nelson D. et al. Tumor necrosis factor-alpha induces Bax-Bak interaction and apoptosis, which is inhibited by adenovirus E1B 19K // The journal of biological chemistry. -2001. Vol. 276. - N. 48. - P. 45120-45127

180. Tan K. O., Tan K. M. L., Yu V. C. A novel BH3-like domain in Bid is required for intramolecular interaction and autoinhibition of pro-apoptotic activity // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 34. - P. 23687-23690

181. Tan S., Sagara Y., Liu Y. et al. The regulation of reactive oxygen species production during programmed cell death // The journal of cell biology.- 1998. Vol. 141.-N. 6.-P. 1423-1432

182. Tapia-Vieyra J.V., Mas-Oliva J. Apoptosis and cell death channels in prostate cancer// Arch. Med. Res. -2001. Vol. 32. -N. 3. - P. 175-185

183. Uesugi H., Saegusa M., Takano Y. et al. Different expression of Bcl-2 protein in gastric adenomas and carcinomas // Pathol. Int. 1996. - Vol. 46. - N. 4. -P. 274-280

184. Ulvik A., Aarskog N.K., Ogreid D. Detection and identification of Ki-ras exon 1 mutations by minigel single-strand conformation polymorphism // Analytical biochemistry. 1995. - Vol. 232. - P. 137-138

185. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis // Genes Dev. 2001. -Vol. 15. - N. 22. - P. 2922-2933

186. Werner A.B., Vries E., Tait S.W.G. et al. Bcl-2 family member Bfl-l/Al sequesters truncated Bid to inhibit its collaboration with pro-apoptotic Bak or Bax // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 22781-22788

187. Williams T., Smith C.A. Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death // Cell. 1993. - Vol. 74. - P. 777-779

188. Wolf H.K., Stober C., Hohenfellner R. et al. Prognostic value of p53, p21/WAFl, Bcl-2, Bax, Bak and Ki-67 immunoreactivity in pTl G3 urothelial bladder carcinomas // Tumour Biol. 2001. - Vol. 22. - N. 5. - P. 328-336

189. Wolter K.G., Hsu Y.-T., Smith C. L. et al. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis//The journal of cell biology. 1997.-Vol. 139. -N. 5. -P. 1281-1292

190. Wu M.-S., Lee C.-W., Shun C.-T. et al. Clinicopathological significance of altered loci of replication error and microsatellite instability-associated mutations in gastric cancer// Cancer research. 1998. - Vol. 58. - P. 1494-1497

191. Xiang H., Kinoshita Y., Knudson C. M. et al. Bax involvement in p53 mediated neuronal cell death //The journal of neuroscience. 1998. - Vol. 18. - N. 4. - P. 13631373

192. Xiang J., Chao D.T., Korsmeyer S.J. Bax induced cell death may not require interleukin ip converting enzyme like proteases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. -Vol. 93.-P. 14559-14563

193. Yagi O.K., Akiyama YM Nomizu T., Iwama T., Endo M., and Yuasa Y. Proapoptotic gene Bax is frequently mutated in hereditary nonpolyposis colorectal cancers but not in adenomas// Gastroenterology. 1998. - Vol. 114. - P. 268-274

194. Yamaguchi H., Wang H.-G. Bcl-XL protects BimEL-induced Bax conformational change and cytochrome c release independent of interacting with Bax or BimEL // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol. 277. - P. 41604-41612

195. Yamamoto HM Sawai HM Weber T.K. et al. Somatic frameshift mutations in DNA mismatch repair and proapoptotic genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer // Cancer research. 1998. - Vol. 58. - P. 997-1003

196. Yamamoto K., Ichijo H., Korsmeyer S. J. Bcl-2 is phosphorylated and inactivated by an ASKl/Jun N-terminal protein kinase pathway normally activated at G2/M // Molecular and cellular Biology. 1999. - Vol. 19. - N. 12. - P. 8469-8478

197. Yang H.B., Chow N.H., Sheu B.S. et al. The role of Bcl-2 in the progression of the colorectal adenoma-carcinoma sequence // Anticancer Res. 1999. - Vol. 19. - N. IB.-P. 727-730

198. Yang J., Liu X., Bhalla K. Et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 1129-1132

199. Yokota J. Tumor progression and metastasis // Carcinogenesis. 2000. - Vol. 21. -N.3.-P. 497-503

200. Zha J., Harada H., Osipov K. et al. BH3 domain of Bad is required for heterodimerization with Bcl-XL and pro-apoptotic activity // The journal of biological chemistry. 1997. - Vol.272 . - N. 39. - P. 24101-24104

201. Zha J., Harada H., Yang E., Jokct J., Korsmeyer S.J. Serine phosphorylation of death agonist Bad in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not Bcl-XL // Cell. 1996. - Vol. 87. - P. 619-628

202. Zhang H., Xu Q., Krajewski S. et al. Bar: An apoptosis regulator at the intersection of caspases and Bcl-2 family proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 2597-2602

203. Zhou M., Demo S. D., McCIure T. N. et al. A novel splice variant of the cell death-promoting protein Bax // The journal of biological chemistry. 1998. - Vol. 273. -N. 19.-P. 11930-11936

204. Zhu L., Ling S., Yu X.-D. et al. Modulation of mitochondrial Ca2+ homeostasis by Bcl-2 // The journal of biological chemistry. 1999. - Vol. 274. - N. 47. - P. 3326733273

205. Zoltan N. Oltvai, Curt L. Milliman, and Stanley J. Korsmeyer. Bcl-2 hcterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programed cell death // Cell. 1993. - Vol. 74. - P. 609-619

Информация о работе

Обухова, Варвара Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование экспрессии апоптоз-специфических генов семейства BCL-2 и системы FAS/FASL при новообразованиях желудка и толстой кишки человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы