Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование динамики негистоновых белков нуклеазочувствительных областей хроматина в процессе химического канцерогенеза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование динамики негистоновых белков нуклеазочувствительных областей хроматина в процессе химического канцерогенеза"

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ 5Н. О. а ПАЛЛАДІИА Р Ґ г- All І'ІЇРЛJ їй

____________0-Д.________________________________________

На права* рукопису

Сзлабзй Пзтро Володимирович

ЛОСЛІДХЕЖІЯ ШАШКИ П5ГІСТ0ІЮБИХ ШЛНВ НУКЛЕА30ЧУ'.ГЛКЕЙХ ОВЛАОТЕЯ XPOUMW В ПРОДО1 ХІМІЧГОГО КЛІЩСРОГЕШ53У

03.00.04 - біоГ'Мія

Лвтореферат дисертації !>'-і здобуття вченого ступеню ьандиуата йіслопчііта каг<?

ЙПЕ-ІЙЗІ

Робота виконана в Інституті біохімії ін. С. В. Палладіна АІі України.

Науковий керівник академік АІІ України,

професор ТЕРКОВІМ К. С.

Офіційні опоненти: доктор біологічних нау;:

' професор Бойцицький ЕII

доктор медичних наук . Сакало Е С.

Проьідна установа: Інститут експериментальної

патологГі, онкології та радюйіологп їм. Р. С. Кавецького АН України

Захист відбудеться 1994 р. о 14.00 на вас і данії 1

спеціалізованої вченої ради Д 016.07.01 в Інституті біохімії їм. 0. Е Палладіна АН України за адресою; 252601, Киї в* ЗО,

пул. Лоонтовича,9. '

& дисертацією ккжяа ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім. 0.Е Палладіна АН України

Автореферат розісланий 1994р.

Вчений секретар спец і ал і Еовано і ради канд. біол. наук

Кирсенко 0. Е

- 1 -

ВСТУП. ,.

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОШйМІ. Дослідженню проблем, пов’язаних з різними сторонами розвитку і функціонування злоякісних новоутворень и най час приділяється все б'вьсо уьаги. З розвитком генно інженерних та молекулярной іологічинх методів посилився пошук генів та білків, відповідальних за перехід у злоякісний стан. Визначено, ир гони для елективної ексярс-сіі потребуют:, участі специфічних білків-регу."ятсрів. Було показано, цо в хроматині ракових клітин з’являються білки, є визначені в нормальних препаратах. З розвитком імунологічних мзтодіе розширились можливості ідентифікації окремих білків, та дослідження змін білкового складу спадкового апарату клітин;;. З 'іх допомогою було показано, що іцуногениі білки хроматину зосереджені в областях хроматину, гар характеризуються перевагою чутливістю та надчутливістю до нуклоаз. Можлива участь імуногенних білків у регу-ляцп активності гем і в дозволяє припустити ’їх важливу роль у малігнізацП клітини і- виводить 'іх в ряд об’єктів першочергового інтересу в дослідженні змін у білковому складі хроматину при пухлинному переродженні. »

МЕТА ТА ЗАДАЧІ ДОСЛІДЖЕННЯ Мето» даної роботи було дослідження змін у складі імуногенних пухлиногасоційовачих білко, локалізованих в иуклеагочутливих областях хроматину, в процесі індукції ІНПт.роаодіети.’пміном гопатоми у курів.

У конкретні задачі входило: ’

1. Індукція ІИіітрозсдіетшіаміном гепатоми у яіурів.

2. Вивченім співвіднокешш тганшгоспепифічних та гетепоорган-

. них антигенів у хроматині з гепатошітій іл клітин грпатомн.

3. Пошук та характеристика пухлинеасоційовених антигенів хроматину тератоми.

4. Дослі діяння залежності антигенності препаратів хроматину зід нукдеос.чмої структури хроматину.

Б. Дослідязнпч локалізації ікуногепчга і серед них пухлі-юосо-ційоааістх білкіз хроматину в ділянках хроматину чутливих та кадчутгпвіпс до нуіиеаз різних сроках індукці ї ге натоми.

НАУКОВА !Г-0»«ЗШ. Вперта, па моделі індукованої К-ііітро-водіетилачітом гекатоми курів показана поява пухлинопсоційованих, антигенів у нуклеапочутлнсих чілинках хроматину. Показана в ході індукції гепято?/:- лмл'ч спектру імуногенних білків иуклоалочут-

Либих областей хроматину. ■ '

ПРАКТИЧНА ЦІННІСТЬ РОБОТИ, балуючись на приведених даних, можливі дослідження п напрямку очистки, ідентифікації та характеристики білків,-пр беруть участь у регуляції транскрипцп при канцерогенезі. Отримані дані мокуть бути використані у розробці імунологічних методів диференціальної діагностики пухлинних захворювань. ■ •

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали- дисертаційної роботи доповідались на VII Міжнародній конференції по пухлинним маркерам людини,

(м. Київ, 1990 р.), на II Російсько-Ізраїльському симпозіумі по пептидам та білкам(м. Москва, 1832 р.), на IV Українському біохімічному з’іздЦм. Київ, 1992 р.), на ХХГ конгресі міжнародного товариства по біології та медицині пухлинного розвитком. Ерусалим, Ізраїль, 1933) та на наукових семінарах відділу молекулярних основ семіотики Інституту біохімі ї ім. 0. а Палладіна АН Мфаіни.

ПУШІП?ЛЦІ І. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт.

СТРУКТУРА ТА ОБСЯГ РОБОТИ. Дисертація складається аі вступу, огляду літератури, огшсу матеріалів та методів дослідження, ре-вулматів, викладених у чотирьох роздіпах, заключної частини, списку літератури (209 найменувань). Робота викладена на 157 сторінках і містить ЗО малш:ів та 1 таблицю.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ.

Препарати печінки курів на різних сроках індукції гепатоми Іі-нітрозодіетиламіном були люб’язно надані відділом хімічного канцерогенезу інституту проблем онколог і І ім. Р. Є. Кавецького.

У роботі використовували наступні препарати: ДСКазаІ, - мікрохо-кова куюгеаза, повний ад’квант Фрайнда,- мічені пероксидазою анти-кролмчі а:;:іігі лаС’Зіега" СШД), гемолізин (ИЕІІ им. М О. Гамало и, Росія). .

Хроматин в шити.! гепатоии, нормальної печінки, тиьусу та легень виділяли чсгрес стадію ядер (ІІжпзку о І аі.).

Фрагг.знтаці»' хроматину ДИКдоовІ здійг»ьзаі.л аміикг-чи концанг-рацію чі або час інкубації. Зупгакші реакцію із льодовій бані.

За продукт порэвзрнван;:» єндогєкіжг.; гутазапами припікали фракцію ядерного соку, яку отрш.гука»",; крп очистці хроматсну на стадії гіпзеоііічного /.ігг.су ядер.

Г»>;о'5тр'>.{ор*;з 6ілі:іь в ПААГ-ДОН куоіу.т;^'" пэ г?іи,пу (Ілистіу, іето), е.^пгроіорсг коиллаксіЕ Д'Ц-оизг. ь 0,?:% п:: уіп-

. - з -

оано (Удшіатис и др. 1S8-1).

Імунізацію кролів проводили сушити їда хроматину з рівним сО'смом повного ад'кзанту Фрейнда з ккіру, з наступною шестикратною приедільною імунізацією внутрім’язево. 'Крсв брали з крабової еєни вуха.

IgQ счпзрли осаджуючи в 1,75 М розчині сульфату амоній а подальшою хроматографією на ДЕЛЕ-32.

Реакцію зв’язування комплементу в мікропостаі;оБЦі( РЗК) проводили по (Levina et al. 19G7), імуноферментний аналіз(ELISA) стосовно хроматину та його фракцій згідно (Pumo et аі. ,1983).'

РЕЗУЛЬТАТИ '

1. Визначення пухлиноассційсваних та спільних для гепатокитів

та клітин гепатоми антигенів хроматину а клітин гепатоми.

, Вікористовувчи антитіла проти-хроматину гепатоцитів досліджували аитигешіиа склад хроматинів гепатоми та інтактної печі кіот.

З рис. 1 в'.ідно, п р і в ГЗК (рис. 1Л), і в ELI ПА (рис. 1Б) вати-печпшові антитіла зв'язуються з хроматинами і гепатоцит?в (кр. 1), 1 клітки гепатоми (кр. 2), в аутологічнин хргммшюм ан-

титіла взаємодіють а випри ефективністю.

Аналогічні результати отримані при тестуванні вже антигепа-токшіми IgG в ELISA (рис. 1Б) та ГЗК (рис. 1Г) хроматину інтактної печінки (кр.1) та гепатоми (кр.2). Антитіл»;.взаємодіяли з обома препаратам, і виду імупорешпі-зність показав зутологічний хроматин. •

Ексиа*£Н! хроматином з гепатоцитій антигепатомні антитіла і в ELISA (рис. С А), і в РЗК (рис. 2Б) практично втратили здатність зв’язуватись а хроматином гепатоцитів (кр.1), але ефективно взаємодіяли з хроматином гепатош(кр. 2). Такий глзультат лказус на присутність в тотальному хрематжц з клітин гепато;.'и пухлино-асоційованих антигенів. Отак, пскааако, ер ос hop. ну масу внтигенів хроматину гепатоми о кладите ь слткгени,. спільні а хроматином інтактної печінки. Частіша иуиогешгих білків хрохагину нагшггь до пухлинсасоці Пованих.

Перехресне зиснгтакня пнтигепатомйнх irj-G хроматинами гепатоцн-тіп, тимусу та легень сляпили зростання при малігкізацп частій гетероергашшх антигенів, характерних для нормальних тегеиь(рис.3)

В Г

концентрація актигоііу.мкг/мл концентрацій антигену,мкг/мл

?ііс. 1. Вв'язування •хроматинами s 1) клітин інтактної печінки; 25 клітин гєійтсміі

ангмпеч пікових антитіл А- в РОК; Б- в EUSA. гиітигепат0.«них антитіл їі- в Р3!і; Г- в ELISA.

АяІСЮО

А

Б

ІООО

глкцентрація антигену,ї.'кг/глл

концентрація антигену,мкг/мл

. Ркс.2. Взаємодія ачтигепатомяих ІгО вкснахэиих хроматином в гепатоцитіз : з хроматина»,ж 1)гепатоцитіз, 2)клітин гелатоми, А- ЕЫ5А, Б- РЗК

С’%

100

2

4‘. 80

1 -

3 60

40

• • 20

В

10 , 00 100 концентрація антигену. ют/мл

10 БО 100

концентрація антигену,мкг/мл

Рис. 3. Зв'язування з РЗК комплементу хроматинами: і)гегтатомі; 2)гепатоціА . тів; 3)дегекь; 4)тимусу з присутності: А- аптппс'пнкових І^С,

Б- актигепатомтшх

- G -

1 зкил чином, тотальний хроматин а клітин індукованої N-ЩЕА іелатоми'містить як пухлиноасоційовані антигени так і антигени спільні для зразків в гепатоцчтів та клітин гепатомп, шо складать головну мацу антигенів. Малігнібаці я гепатоцитів супровод-яуетьса зоуьом складу білків в Сік переважання в хроматині гепа-томи антигенів, характерних для хроматину 8 легень.

Локалізація імуногенних білків хроматину а гепатоцитів та клітин гепатомп в нуіслеазочутливих ділянках’хроматину.

Пошук пухлиноасоційоваких антигенів у областях хроматину, збагачених регуляторними послідовностям:!, детальна характеристика ділянок хроматину, чутливих до нуклеаз, та білків вв’язаних з ними, на наш погляд, мо:ке дати багато для розумінні! походжання даних білків в хроматині хімічно-індукованої гепатсми щурів, іх ьзаемздп а хроматине:.! та можливої ролі в процесі пухлинного пз-реродк ння клітини.

Фрагменти отримані переварюванням хроматину а гепатоцитів та та клітин гепатоми екзогенноа ДІКазов І, а тззїож ядеріїий сік, що містить продукти аполітичного переварювання ендогенними нуклеа-;шми порввіряли на здатність зв’язувати з F3K аутологічні антитіла з порівнянні в хроматином.

Приведені на рис.4 дані, вказують на різке концентраційне <!йагаченпя (в БО - 100 разів) імуногенними білками ДНКазочутли-бо'і фракції порівняно а тотальним хроматияом(кр. 2). Ез значні не гбагаченнл проявляють зразки ендогенного гідролізу хроматину як для препаратів інтактної пзчінкк (рис. 4А), так і для гепатоми (рис. 4Б). тканин. Визначено, шр головна кількість антигенів во-сері-джена у 1-2% хроматину, тобто локалізована у надчутливих до нуглеаз ділянках. З літератури (Veintraub et al. 1901) відомо, up надчутливість до нуклеаэ характерна длл регуляторних ділянок генів, шр вказує на мокжпзу регуляторну іюль дослідгув-.;!их білків у процесі канцерогенезу.

Для дослідязшш лоїалі'аацн пухлиноасоційованих антигенів хроматину, в F3K,вивчали кзазмздіп зразків ядерного соку, ДІЖа-зочутливоі фракції та тотального хроматину а анткгепатоіпшмк антитілами, ьиекааїеними хроматином з гепатоцитіЕ (рис.Б). Контролем виаиатекна е відсутність взаємоді ї проінкуСованих IgG з хроматином о гепатоцнгів(кр. 4). Пухлиногсоціиоваяі антигени на-явш б надчутливих до куклеаз діллШізх хроматину гепатоми (кр. 2) ті’ препаратах ядерного соку (кр. 3), кр значно сбагачокі імуно-

концентрація антигену,мкг/мл концентрація антигену,нкг,'ул

Рис. *4. Зв’язування аутологічних антитіл в РЗ’Л 1 - хроматином; У - /ЛТ-озочутливимн фракція і,яг, 3 - ядерним соком а клітин:

Л - Інтактної печінки; В - гепатоми.

концентрація антигену,мкг/мл Рис. 6. Взаємодія виснажених'хроматинам в гепатоціпчв антигеиат.'мких антитіл в РЗК а: 1 - хроматином; ?. - надчутливими до ДІШаниІ ділянками хроматину; 3 - ядерним соком я клітин гепатоми;

-1 - хромчтином з геїштоцнтіп

- 8 - ' генними пухднксааоційоЕаяі’.ма З і лісами в порівнянні в натнвнкм хроматином гепатоми (іф. 1). Цри цьому, пдерний сік демонструй менш ефективне, ніж продукти розщеплення ДККазоюІ, вв'язування антитіл. Спад реакційної здатності ядерного соку, в реакції 8 виснаіинкми антитілами, до рівня иилмсго, ніж показаний ДНКазо-

чутлпЕоа фракціаю, передбачав;' яр ядерний сік містить більш ви-

соку частку неспецифічних'імуногенних детермінант, тоді як про-дуьїи догредації ДіШазоюІ містять в основному білки

пухлинрасоційовані, . :

Таким чином, дані, отримані в дослідах’з антитілами проти хроматину гепатоми показують, ар імуногенні детермінанти, як спільні для препаратів хроматину з інтактних та ракових клітин, так і пухлнноасоційоваш локалізовані в областях» надчутливих до ДНКазиІ. Ці області різко збагачені імуногенними білками

порівняно а тотальним хроматином в препаратах з нормальної тканй: ни та гепатоми. • . , ' ■

В наступній серії експеришнтів вивчали спектр імуногенних білків хроштішу регуляторних ділянок активних генів у клітинам гег.атоми та штатної печінки щурів. Для цього порівнювали іму-ногеїші НТВ а ділянок хроматину, надчутливих до ендо- і екаоген-них иуклеаз із клітин гепатоми та нормальної Печінки'іаурів. •

В імуиоблоті (рис..б), ЯКІСНІ ЕІДиііШОСТІ в складі снтигєнів виявити складно. Як видно, відмінності мій білками хроматину гепа-тоцитів (1) та гепатоми (2) иаоть скорісз кількісний ник якісний характер. Але, розглядаючи білки нуклзааа-чутливих'ооластєв бачимо, ідр їх склад в нормальних та пухлинних зразках відрізняється. Умовно, їх можливо поділити на кілька груг; 1 - антигени спільні для всіх препаратів з ракової та інтактної печінки, ви-яблпїльсн у двох смугах в області Бб кД, причому в ДККзаочут-лішй фракції хроматину гепатоми сильніш виражена някча смуга, слабо репрезентована у всіх піших арааках; 2 - антигени, характерні тільки для пух’ликних арааків, розташовані ь області блшь-кс іео та і БО кД; 3 - група антигенів, вівуаліаованих тільки у куклоааочутлиьих ділянках хі-оматину 8 гепатоцитів, і розмінних -в області 60-70 кД. Оскільки віауаліаащя відбувалась в присут-насті антитіл проти тотального хроматину гепатоми, то антигени, знайдені у всіх фракціях, перш за все наявні та імуногенні у тотальному хроматині гепатомі;. Отже, мокна зробити висновок; при хімічному канцероїі, крім понси/гншкныини ноти сіілків в

2. З і

Гга. 0. іуЯісСлої і-ДЛ’лзо'іутлиг.ої фракції урозгокку; 2- х. парного соку; с-»ро*іг«иу с геп&гоцігмв. 4,5,6- вштовштх прл-

п?ра?іп г r^nato?-^.

Рис.7. Імукойлот Сілкій ииснахошти кромаїіікоїл о гег.атоцитів ішти^епатомними аітп ідами:

І- хрок^тину; 2- ядерного соку; 3- ДШ'л^і.угл/Т.юі фракції ’/.роштшіу б клітин гепатоми; 4.5,6- відповідних препарат і ті з гегіатопитів.

хроматині, паралельно відбувається перехід деяких областей хроматину, з якини зв'язані імуногенні білки, а репресованого спи/ в гктивний та навпаки, при уі/оаі існуганпя цих білків в хроматині з клітин інтактної печінки щурі в до вьздонт; їм канцерогену.

Приведені віш;е дані були отримані з участю невиснажних аити-гепатоьних- Іев і тему характеризують антигоии, головним чином спільні для хроматинів і з кл«ин геп.чтоми, і э гепатоцитіп. І! наступному експерименті, Сула пройдена ідентифікація пухлиноа-соційованнх антигенів. Рис. 7 містить результати пзаечоді і іммобілізованих на Кітроцелет оз: білків з хроматину (1), осаду ядерного соку ("), ДНКазочутлііБоі фракції гепатоми та відповідні в разки з гепатошітіа (4,5, в) з антигєпатоі/ними шшітілам.и, виснаженими хроматином з гвпатоцктів. Ш гпцно, дню зразок ЛїС^а&о-чумивої фракції деїздногрур забарвлену смугу з області коло 150 кД. Тобто, пухлияоаооційовані антигени зосг'рздмбні у обласслх хроматину, надчутливих де ДШ'лзиІ, : кількісно о ду*с- малочц-сяльяоя групою, пка зізуаліяуеться лисе у фракції, рівно збагаченій пухлиноассціДаваними імуногенними білками.

Стяв нуклеааоиодчутлівІ діляпки хреяатину з клітин геп.лтомл та ;:иаістпоі печшкл ріако збагачені імуногеншши Сидачии гор і ьяїтн.і з уроматииси, а для гепатоми - пухліш.-.'ассі» йованві/н. БіЛі'ЛГ/і'1 склад нуклеазочутливих Фракцій з хроматину ген»-тоци?іи гаііаюми представлення: 1 - антигенами спільними дли

доолі.пжаких орпвків з клітин пухлини та гвпатспитів; 2 - антиге-нчігі характер..ими тільки для нуклеазочутливих обчастуй хроматину з клітин дефінітивної тканин.;; З - білками, ір мниачзст.са дт> в над-<у гливих до нуклева ділянках хроматину з клітин гапатоки. Пухлиноасоційовані антигени вианачаються у іракці» надчутливих до ДНКазиІ областей хроматину ГРпатс;.^.

3. Зв'язок імунореактивності антигенів а розмірами фрагментів хроматину. '

Відомо, ар структура грсиаткну відіграє пакливу роль у Фунціснуванні як всього глеладного спадкового апарату, так і окремих його ланок. З цієї точки зору вначниі'1 інтерес: птанозчть дослідження- ва’язку антигенності білків хроматину а Лого надчук-леосомноп структурою,

Для цього Фрагменти хроматину гапатоми, итрчмип внаслідок переварювання мікрококковою пуклссзою розділяли гель-Смлвг-мтчй

1Г» _

•С. -

на ее^арозі СЬ-ОВ. Отримані Фракції пзравіряли на їх впагність воаешдіати а антитілами в аалекіосп від ровмірів фрагк8".тів. Комплекси Ді5І-білок виходять у п’яти основних хроматографічних піках, йжиекси парного піку лежать у махах 12С0 К.Д.- 2000 ьД '/а ЕИіда, фрагменти хроматину другого її іку цаоть масу приблизно від 400 кД до 1200 кД. Третій пік містить іісишгкси які х&ракто-ризуюїьси діапазоном 100 - 400 кД. Четвертий пік представлений фрагментами ДНК розмірами £0-100 кД та значною кількістю розчинних в 24 МаСІ білків. Останній пік характеризується тим, цо містить фракцію по розмірам меншу за нижню малу солективкості 20 кД, в яку можуть входити низькомолекулярні білки та олігснуклєо-

ТІІДИ,

Отриїйіїн фракції перевіряли на їх здатність зв'явувати антитіла в РЗК. На рис. СЛ приведені результати електрофоретично-, го поділу комплексів ДШ{-білок в нати£них умовах, які показують, щр першій хрокатиграфічний пік містить тісокомолекулярні комплекси до 23 000 п. н., другий-середнього рос.міру ( де КІЛЬКОХ тисяч п. н.), третій містить комплекси перепаяно розмірами менша ва 1300 її. н., а останні два піки не виявляються на електрофорезі. 0 рис. 8В видно, щр зразок пориого хроматографічного піку (кр. 1) взаешдіс з антитілами значно сильніше ва зразки другого (кр.2), третього (кр. 3), та останнього піку (кр. 5), проте препарат четвертого піку (кр. 4) показує збагачення по відношенню до всіх інших фракцій від двох ( у випадку першого піку), до десяти раз, (у випадку третього піку). Здачі їсть вв'язувати антитіла різ^о вменауеться у фракції, ср шеткть в основному низькомолекулярні комплекси в порівнянні з фракцією нервого піку, в якому переважають комплекси вксокомолекулярні.

Результати даної серії'експериментів кожна підсумувати у наступних висновках. Імукороагтшшість комплекс їв ДНН-білок вала->їіть від їх розмірів, і характерна для середньо- та висошлеку-лярних фрагментів. Вона ноь’паанч а існуванням двох основних класів імунорзактнЕНих білків, а точки зору несбхіднос'.і їх ло-калівацп іга ьисокоиолєкулярній ДНК для виявлення здатності зв'язувати антитіла: білки, шр у вільному стані та у складі

низькомолекулярних комплекс і в ДНК-білок втрачають платність зв'язувати антитіла тг ґмлки, вр зберігають цю вдати і от1. Низькомолекулярна ДііК бідна на білки не здатна зв'язувати аитих^ма-тиіпві антитіла.

5 10 £0

концентрація антигену,ют/«і

Ряс. 3. А - олэгсгрофореграма гссшлзкоіп ДНК-білок: 1,2,3 - відповідно перпого, другого та трзтього хроматографічних пшь, отрит-ш«х при гель-фільтрації фраткт і в хроматину на сефарсаі СЬ-бЬ’. В - тестування їх здатності вв'язувати аитигепатоині ІрО в Рі-К: 1,2,3 4,5 - відповідні хроматографічні піки.

Б

П.и

ІЯЙ’

юкі

мгіїр

і-і

і 2. і

ІЙЙЇІ'ГЗ'З

кМйд

А

' ‘ '$І

і г з

Ц їііі дч >■■'4 ■ і* г.й $

и ‘А 1 ге] $ж ш

м ШІ

г*.?-

Иїз. 0. А- електрофорез в натканих умоьах иуклеосом, отриманих при пореварвва.нн і хроматину гепатоми мікрококко-вою нуклеазою 1- Б хв; Е-'Ю хв; 3- 20 хв.

Е- вивчання в імунсблоті розподілу антигенів 1,2,3-відповідния нуклеосоїлких вравків.

- ІВ -

Пі’ііБ9ДЄ!!і дані ПІДїЕОрДЖУІГГЬСЯ електрофорезом в натшіних умовах комплексів ЛНК-білок хроматину з клітин гспатоик, перевареного мікрококовою нуклеазоо 8 наступним імунофермгнтним за-баралвнним зразків в імуноЗдоті. Р: вядно а рве. ЗД при перепа• рвсатіі хроматину 5 хп насш фрагменти всіх розмірів (1), а при збільшенні члеу інкубації а нуклеезоз до Юхв (2) та 30х?,(::). спостерігається емонлйяйз кількості вшокошлзі^йчрних ко«*п-Л5КСІВ. Проте, на ІКГНСбЛОТІ ВСІ Ш!ССК0>50ЛЭКуЛЯрН1 коіга_?кси зберігають вдатність зв’язувати акті-Гіла, к~гн.кмю від змонизина КІЛЬКОСТІ (ркс.ЭВ, ДоріЖКН 1,2,3 відповідно). Імунорзак-Тіггяіс?ь зникає а комплексам ДНК-білск розмірами імшпгих аа співвідносні з тзтразукдзоаочся. фахезуотя результати зквчония комплексів ДНІ{-біл>к зразків ссаду ядерного соку та ДПКаза-надчутливих фрЗКЦІЙ, ДЭ ІКуНОреШГГИЕПІСТЬ була восеред.тепа у ышо-коьіолекулярних фракціях, мозиа зробити висновок, пр здатність пропвллти непнеціняу антигенність зал9?згть від розмірів фряг-м~ гігів хроматину і пов'язана а каднуклеосоетоо структурою, для ЕЗэрэжзьчш 1 мупср-заіггивксеті необхідні розміри, не і;зкпі еа тет-ранукїеосому. '

4. Дослідження дтеемікя імуногенних білків тотального хроматину та його фракції*.

Білки хроматину в клітин печінки цурїв на різних сроках іядукцп піддавали електро&зреву в денатуруючих ?швах. Зизначн-тк якісні еуіїи з складі такої гетерогенної популяції Оілків важко, але кількісні з:»'і!Пі помітні і виявляються у послабленні з яз на ранніх етапах індукції смуги в області біля 70 кД.

Далі норівнїлаля здатність хроматинів на рівнях стадіях індукції зв'язувати антитіла в Р5К. З рис. 10 видно, по імуноре-яктивність тотального хронатину послідовно зростає зі збільзен-на« гасу згздзкяя ї«-иітрозсдіетяламіну, со ькезус на зміну антигенного складу хрокзтияу клітин нормальної печінки в напрямку ПУХЗЮпого язроровгяКК:

Ікупсблот хрсяи^тішіл різних термінів індукції гепатоми показав, к> зі зби;ьаеиаям сроку зргстгг іктсксиезість зебарвлчнни чисокомолекулчркях С!“т г сагтяті ІбО кД, та близько 90 кЦ.

От.тз, з тотальное/ ?ром?.тияі клітин печінки при кинперогекепі імуноблоток .«ганачастьса кількісні зміни в напрямку абільяк-кая кількості даяких високочоле куялряше та середньої тл«;кулярко і

!«С!1 тГЇИГСНІЕ.

?D

£'j

s&

Гї.о. 10.

л

Vi ~Й<Г

то rqt/<

Зь’пзуьаиия сштигепатозяня IjQ-b Р2К хрс^гшжлг rc-ішоцнпа ка рісшії: сгздіг.х ziurea: ішиїїи гспзго-UK і' цуриі.

Рип. 11. Сів'язуЕачни антнгепатошшх їз*3 ь ГОЛЗЛ •Дітчаочі/чліви-ия фракціяісч хрогаткну а клітин пачжк^ на рівних стадіях гспЕтскаяцерогвчвзу.

А- иввкснзйані антигвт;ато«йі ?гй в концентраціях:

1- 10 мкг/кл; 2- '{У. мкг/млі 3- 40 мкг/мл.

П- анткгеиатомш ІегЗ з кош:*нтраці ї ?0 нкг/ш: 1- ви' снаиекі хроматнкпм геїттоіиггіз; Я- неьіісмг-Л'йні.

Доояіджуьаги ТШКагоч/эдив! фракції хроматину а гепатоцигів різних термінів індукції гевгсоми нз чх здатність зв’язувати ан-тигєпатомні антитіла в РЗІІ 3 часом індукції платність зв’язувати шітигепатомні Іьв зростає, а починаючи з 57-і доби спостерігається різкий ярігт імуиореактивності. В ELISA (рис. 11А) спостерігається аналогічне вростання імунореактивнооті в і збільшенням часу вгавання цураш канцерогену на всіх досліджуваних концентраціях. Ті дослідах 8 виснаженням актигепатомшіх Іц(5 хроматикой г інтактної печінки (рис. 11Р0 видно, ио антиген-антитіло також виявляє тенденцію до посилення. Крива 1 відповідає тестуванню фракцій виснаженими антитілами, і показує різке підвищення іі/унореактивиості, починаючи з 57-ч доби після початку інлукцП. Для порівняння приведеш результати тестування проб невисртахени-

і.пі антитілами у концентрації, що дорівнює початковій концентрації виснажєнихС кр. 2). Видно, що на першому еталі виснаження призводить до повної елімінації вдатності зв’язувати антитіла, тобт^ СілкошіЛ склад нуклеазр чутливих ділянок хроматину гепато-цііїір до 57 доби хгфс.кторпзу.'-ться перо ваганням білків, спільних ,гм препаратів хроматину з пухлинної та дефінітивної печінки. Тоді, як на більш пізніх стадіях спостерігаються поява в ДККазо-чутдганх ділянках хроматину пухлиноасоційогдних антигенів.

Ш рис. 1" подані результати дослідження зміни антигенного

складу ДІКазочуглішіх" ділянок хроматину різних сроків індукці’І

гепатоми в імунобдоті. Починаючи з 5)2-1 доби в ДИКазочутливих

фракціях хроматину імунохі мічно визначається смуга в високомоле-

куллрніґ. області близько 120 КЦ, і на 160-у добу, що близько до

часу появи гістологічно визначеної гепатоми, посилюється смуга в

С

області 55 кД та з’являється в області 150 кД. Поява високомоле-ісулярного антигену 1Е0 кД відповідає точці, в якій ДНКазочутливі фракції демонструють різке підвищення імунореактивності в РЗК з невиснаж;іш:д! антитілаїш, та в ELISA з антигепатсмними IgQ, вг.с-,'а*й'’ими хроматином-з гепатоцитів. -

Дослід.ташя в імукоблсті змін білкового складу осаду ядерного -■оку, в якому міститься фракція хроматину чутлива до Са"'-8алек-ішх ен.дзгенниу нуіслеаз, покаьуе ар в ході хімічно! індукції ге-патош, Еисок.омаілкуіяриі білки 1Е0 та 150 кЦ з’являться в те на ?Я добу після початку індукції.

Оскільки після виснаження пнтигепатомиих IpG хроматином з ге-;'атацитів антиген в області коло fffi кЛ не иізуалізувався, то ito-

12 3 Н * в 7 % 9

Рис. 12. Ь-гупзЗлог, л шггигеиатоьяшка 1дС, бишв ДНКаггачут-/л;:шх дипжж ка р1зпих сроках хшршсл 1 плутай! ге-пйтоуя з хрегапму:

1- ПТ"'\'.7П!!Х 1 РЛПТОЩ'ИП; 2-8- срок1в шдукш 1

Ш.-:;ю2!д;ю; 1, 28, -13, 57, СС, 106, 150 Д1б; 5- к.и-и:н гспг’то:^:.

. - £0 -го появу в ііуклоазочутливій Фракції громатику гепатаїгл кожна пояснят!! аСэ кількісним вростанням питомої частки білків присутніх і і хроютин< в гегіатсцктів, ал<* п *.;і =;ор>гіґ: кількості, або пере-холом прп канцерогенезі повних областей хроматину в стан чутливості до нуклсаа, характерний для активних генів. ГМсогюмолеку-лярімі' антиген близько 120 кД , щр проявляється на 02-й день, нзіиюьірніш маг аналогічне походження. Тоді як, антиген 150, цо визначастьси лише на останніх сроках індукції та в клітинах ге натоми ! продовжує зв’язувати вігагаївш антигепатомкі антитіла, иов’нваш’.й а неоним новіш якісний станом клітини. Також, слід звернути увагу нй антигени, присутні ь ДЖазочутливих об-лаптих хроматину з гепатоцптіг., які ро^мітакі в області коло 70 :Ш : книхамгь на перший дані, після, початку ікдукці'і. Цікава, що на «‘локгрофораграмі хроматинів різних стадій канцерогенезу , -також послаблюється смуга в області УО ііД. Зникнення цик антигені ь мол® маги місце завдяки п-ппходу генів, ь якими вв’язані дані білки у неактивний стан, і звідси, втраті ц:ош областями, чутлньості до нуклеаз. ...

Отьв, хімічна індукція геп.атоии у щурів викликає зшни у складі антигенів хроматину як кількісні, тьк і якісні. Також а аз нас амін і композиція імуногенних бідкіо нуклеазочутливих ділянок хроматину, в яг.як злякають антигени р області 70 »їЛ, та візуалізуються антигени в області 120 кД і 1£30 кД. Процес, на нашу думку, відбуьасться дзостадійно; перший етап включає перевалю кількісні зміни або дисбаланс антигенного складу хроматину, другий етал ьожэ бути поа’ «заний о появою в хроматині в клітині індукованих до ракового перароджанкя Н-нітроеодіети-ламіком, якісно нових білків— пухдиноасоційозанюс.

_ Л _

Е'СКОВЖ

1. Хроматин з клітин гепатоки індуковаиої Н-нітішодіетикшіилм містить спільні з хроматином в гепатоцитів', гєтеросргашп чз-генавоі природи та пухлиноасопіисвані антигени.

2. Частіша антигенів тотального хроматину екранована від впішіи вання антихроматиноввми антитілами.

3. Здатність антигенних комплексів ;ш’ лзувати антитіла аалемть від розмірів комплексу ДІК-білок. Тетрануклеооома а мін і мильною антигпнков огиницеи хроматину.

4. Ііуклеавочутливі області хроматину різко ."Загачені нухлиноа-соційованпми імуногенними білками по зід.юшшш до тотального хроматину.

5. Антигени нуклоабичутлипик областей хроматину а гєіідтоці’.гів ча

клітин гепатоми Діжтки нз три групи, по здатності вв'явуь'.-ти антигелагомпі антитіла: 1) антигени спільні дл:і нуклеазо

чутливих фракцій хроматинів з ракових клітки та гепатошітів а м. м. и області 50 кД ; 2) антигени, характерні лито д.чл

врааків з гвпатогдіпв а и. м. близько 70 кД; 3) анч;и’глпі, визначаються лише в аукязваочутлкзих франтих хроматину :« клітин глитоки з «.». коло 120 кД та і50 кД, з них гішігеи і ЗО !,іт - лухліїноасоційовошій.

0. В процесі ХІМІЧНО! ІНДУКЦІЇ гепатоми Відбупнигьпч ДВОСТадіРКі

зіпни о спеипр! імуногенних білків нуклеагі.тіуг лисих облаатей хроматину. '

СГСЮОК РСЧІТ, ОПУБЛІКОВАНЕ? ПО ЇШ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Tarnovnt К. 3. , Ritko V. N. , Galanui К. Л , D;!.rr,va Т.!.. , Kulakcvski V. I., Salebai P. V. , E’rxekoya У. :.1 UncmaUii

antigens of Ьияап oolon and Inn- U;iefs//?t'n !nU-: паї icnal СспГагепсо cn Нчпзп Тіітаг terksrs, Kiev, fTeiJtomb =t' 10-14.1900, -P. 270.

2. Терног.иі* K.C., Biк» a 11, Діброва T Л. , Кулакомн^ій В. !. , Салабай UR .Єртнова R.M. Доелідтзкнл антиген-,п чг-оіті пугіпоосомах та їх олігс»«рах//Дои ДН України.- іййі. -1.'?. -0. 1С0- 109.

гг

3. Терновой К. С., Салабай II 0,. Ермакова Е \L Исследование ишу-ногенник белков хроматина гепатоїш крыс, индуцированной М-нитроводизтиламиж.и//Укр. биохим. курн. -1991. -63,6. -С. 16-20.

4. Бітко В. М., Терновий К. С., Діброва Т. JL , Кулаковський а I., Салабай П. Е , Єрмекова В. Ы. Дослідження пухлкноасоційованих імуногенних білків хроштину//Теан док. VI Унраінсьішго біохімічного з'їзду, Київ, 1992.-1.-С. 6.

5. Кулаковський Е І., Терновий КС., Бітко В. М., Діброва Т. л. ,

Салабай П. В , Єрмекова В. М. Зв’язок антигенів хроматину а нуклеосомко» структурою//Теви док. VI Українського біохімічного з'їзду, Київ,1992.-3. -С. 101. .

6. Салабай П. В. , Терновий К. С., Бітко Е Ы., Діброва Т. Л. , Кула-ковський В. І., Єрмекова В. У. Пухликоасоційовані білки нуклеа-аонадчутливих ділянок хроматину а ракових клітин//Тези док. ’

VI Українського біохімічного з’їзду, Київ, 1992. -3.-С. 108.

7. К. S, Ternovoi, V. N. Bltko, V. I. Kulakovsky, P. V. Salabai, V. Ц Yerrrekova. Immunogenic proteins of nuclease-sensitive region of tumor cell chromatin//11 Russian-Israel Symposium on Peptides & Proteins, Moscow, Pushchino, June 2-9,1992. P. 60.

8. Салабай ІІ R , Терновой К С. , Ермакова R М. Иммуногенные белки нуклепза-чувствительных областей хроматина нормальной печени крыс й гепатокы, индуцированной Ы-нитрозодизтиламином// Укр. биохим. sypii. -1992. -Є4.3. -С. 29-33.

9. Садаб'-А П. R , Терновой К С., Бабенко А. Ю. , Ермекова R И Характеристика нуклэааа-чувствителышх участков хроматина из

О

клеток гепатсмьі, индуцированной Н-ннтрозодлзтиламином// Укр.

о бнохиь;. журн. -1993. -65,5. -С. 30-36.

lOt'rmekova V.U , Kulakovsky. V. I., Bltko V. N. , Salabai P. V., Galahin К.A., Ternovoi K.S. Localisation of turarassoctated chro.ratіn antigens in nucleosomes and their oligomers // KXI (.toeting of the International Society For Oncodevelopmantal Biology antf Madioine.-Jerusalem, Israel.-Kovembar 7-11.-19S3. -P. БЗ.

‘ )