Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование дифференциального окрашенных хромосом овцы, крупного рогатого скота и козы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование дифференциального окрашенных хромосом овцы, крупного рогатого скота и козы"

Н6

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

КАФГАНОВСКАЯ ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

УДК 575.155:575.116:636.934.2

ИССЛВДОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ОКРАШЕННЫХ ХРОМОСОМ ОВЦЫ, КРУШОГО РОГАТОГО СКОТА И КОЗЫ.

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ, диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1993

Работа выполнена

в

Институте цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук О.Л.Серов,

Институт цитологии и генетики СО РАН

/

доктор биологических наук Э.Б.Всеволодов Институт экспериментальной биологии АН Казахстана.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Н.Стегний, НИИ биологии и биофизики при Томском государственном университете, г. Томск

доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.С.ГрафодатскиЙ, Институт цитологии и генетики СО РАН

Ведущее учеревдение: Институт общей генетики РАН, Москва

Защита состоится -¿о» смТМАл

заседании специализированного совета по защите Диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

1993 Г.

Ученый секретарь специализ1фованного совета

доктор биологических наук ———~~ А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Кариотип домашних коз, овец и коров характеризуется практически полной аутосомяо-плечевой гомологией. Присутствие в кариотипах ряда хромосом со сходным G-рисунком и большого числа мелких хромосом с трудно выявляемым индивидуальным рисунком затрудняет создание рациональной классификации и устойчивой номенклатуры. Более подробно списаны основные морфологические признаки хромосом коровы, мокэе изучены карнотиш козн к овцы (ISCNDA, 1990 Так~ но достаточно изучена для надежной идентификации структура двух крупных экроцентриков 4~и~6,~ отсутствует детальная характеристика хромосомы 9 и пары гомологичных хромосом 8 и 14 овцы и козы, соответственно. Отсутствует детальное описание идентификационных критериев мелких гомологичных пар хромосом 19 и 23, 20 и 22, 21 и 25, 24 и 29, 25 и 28, 26 и 27 овцы и козы.

Исследование кариотипов домашних коз, овец и крупного рогатого скота при снсоком разрешении GTG-сегментов дифференциально окрашенных хромосом {G-сегмэяты выявляются окрашиванием препаратов красителем Гимза после инкубации в солевом растворе трипсина) представляет интерес как в теоретическом, так и в прикладном аспектах. В теоретическом аспекте сравнительное изучение морфологии хромосом может дать ценную информацию о закономерностях эволюции хромосом животных этих видов. Применение методов дифференциального окрашивания хромосом в цитогенетике млекопитающих делает возможным более тщательное исследование дивергенции хромосом на протяжении десятков миллионов лет эволюции. Анализ G-рисунков хромосом высокого разрешения позволяет определять районы лрезумптивной гомологии в хромосомах далеких видов, даже если общая морфология хромосом значительно различается (O'Brien et al., 1985). Изучение кариотипов фенотипически близких видов способствует выявлению межпопуляционных, подвидовых и видовых различий (Воронцов, 1958, IS66; Воронцов и др., 1972; Орлов, 1974; Радкабли, ГрафодатскиЯ, 1977 и др.).

Методы дифференциального окрашивания хромосом высокого разрешения и использование точных цитогенетических стандартов обеспечивают возможность проведения надежной диагностики хромосомных аномалий в ветеринарной и селекционной практике. Описание главных морфологических признаков всех хромосом в кариотипах коров, коз и овец может служить основанием надежной идентификации хромосом этих видов в гибридах соматических клеток, что, в свою очередь, сделает возможным хромосомное картирование генов с помощью методов

плеточной биологии.

Цели и задачи. исследования. Основной целью этой работы было получение цитогенетических стандартов дифференциально окрашенных хромосом высокого разрешения овец, коров и коз и оценка возмоааости использования этик стандартов для определения индивидуальных хромосом этих видов в клеточных гибридах.

Для достижения этой цели били поставлены следующие задачи:

1. Провести детальное описание хромосом домэыней овцы, козы и крупного рогатого скота с использованием й'С-дафференциально окрашенных хрмосом при разных уровнях конденсации, сопоставить эти результаты с имеющимися международными стандартами описаний и номенклатуры хромосом этих видов.

2. Провести сравнительный цитогенетический анализ, хромосом коровы, овцы и кози и детально -описать межвидовые различия.

3. Используя методы гибридизации соматических клеток, получить гибридные клоны коза- китайский хомячок, овца- норка, корова-мышь.

4. Исследовать надежность идентификация хромосом коровы, овцы или козы в клеточных гибридах на фоне хромосом мшш, норки или китайского хомячка.

Научная новизна и практическая ценность. Выявлены новые существенные детали в С-рисунках индивидуальных хромаем оьцы.козы и крупного рогатого скота, касающиеся хромосом 4 и 6, 8 и 14, 9, 19 и 23, 20 и 22, 21 и 25, 24 И 29, 25 и 28, 2Б и 27.

Сравнительный цитогенетический анализ кариотипов козы, овцы и крупного рогатого скота позволил впервые обнаружить множественные минорные различия СТС-структур хромосом коровы с одной стороны, козы и овцы - с другой.

Впервые, путем слияния клеток костного мозга овцы и мутантных клеток норки получены стабильные гибридные клоны овца-норка, показана возможность надежной идентификации хромосом овцы на метафазных пластинках гибридных клеток овца-норка.

Апробация работ. Основные результаты работы докладывались на З-ей школе-семинаре по генетике животных (Новосибирск, 1989) и в комитете по сравнительному картированию П-ой Международной конференции по картированию генома человека (Лондон, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объел рабош. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы ( 155 ссылок).

-Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована II рисунка;«! и содержит I таблицу.

Материал и летоды. Материалом проведанных иследованнй служили следуйте клеточные линии: I. Первичные культуры фиороо.пвгтсш овця, яолучевнче от 6 взрослых и 5 новорожденных жсотных. 2. Гйрвпчкяа культура фкброблзстов козн, полученные от 3 зр-ос пах" www«.. 3._ Псргкчкш ф'бробласты крупного рогатого сксто, от Hcnofv«yi,PHi®T stwvrnHX.. ...4. Перевиваемая

линия клеток китайского ь -<?як8 sits, д&фсяпыя по актлввоети •-------

ГФРТ. б. Перевиваемая .тдаия клеток аш» .49, дефицитная по активности г; FT. 8. Ч^рег-ивйОкал .шшя клеток смэриканской норки ?ЯГГ'К~, деЗкцитизя про акяазкоста '»'К. Дания получена и лзйэяяо предоставлена «аредам нгуязд» сотрудником лаборатсраа генетических основ он-гогсаоэа Института цитология к гс-hötkkk СО ран Н.С.Ктановой.

!«мршч.п:е Сзбройтастов получали из биоптатоа кд

взятых с наружной сго^се: уг?

Гибриды соматических клеток были поадчвйв тт^тдм перевиваемых мутантных линий мыши, китайского хомячка или норки со спленоцитами коровы или клетками костного мозга козы или овцы. Слияние проводили по методу Davidson, Gerald (1976) с некоторыми модификациями. Гибриды мевду клетками козн и китайского хомячка, клетками овцы и норки были получены автором. Гибридные клоны керова-ммщь были предоставлены сотрудаиками лаборатории генетических основ онтогенеза А.Г.Шиловым и Н.М.Матвеевой.

Для получения препаратов хромосом первичных фйробластсв клетка помещали в бодьвке стеклянные культуралыю* фявконк (75 или 120 см") в такой концентрации, чтобы они покривили 1/2 - 2/И поверхности дна сосуда. В зависимости от плотности монослоя клетки культивировал: 24 л® 4в часов. Для увеличения кв препаратах количества пластинох: га стадии прометафаед за 1,5 - 2 часа до конца культивирования в среду дсоавляли интеркалвррдай агент -бромистый етвдий (Tkeuchi, 1984) до конечной концентрации 3 мкг/мл. По окончанию культивирования среду сливали, клеточгой монослой оорабатывали 0,25% раствором трипсина, и клетки снимали в среду Игла, содержащую 20% сыворотки коровы и колтшн в концентрации 0,5 мкг/мл. Суспензию клеток переносили з центрифужные пробирки и оставляли при комнатной температуре на 15 - 20 мин. Затем суспензию центрифугировали, к полученному осадку добавляли 5 мл гипотонического раствора (0,075 М KCl) и оставляли

на 5 мин. при комнатной температуре. Затем в пробирки добавляли еце 3 мл 0,04 М раствора KCl (экспозиция 3 мин.), потом еще 2 мл 0,04 М KCl (экспозиция 2 мин.). Гипотоническую обработку останавливали -добавлением 0,3 мл фиксатора (смесь метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1). Суспензию центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Осадок встряхивали и по стенке пробирки осторожно наслаивали свеззй! охлазденный фиксатор; пробирки ставили в лед на 10 мин. Затем осадок ресуспендировали встряхиванием и центрифугировали. Смену фиксатора производила три раза. Для получения качественных препаратов с оптимальным разбросом хромосом гибргдные клетки коза-китайский хомячок обрабатывали 0,075 М KCl в течение 7 минут, гибридные клетки овца-норка обрабатывали 0,056 М KCl в течение 15 минут, а гибридные клетки корова-мышь - 0,075 М KCl в течение 25 - 30 минут.

Для GTG-окраски хромосом использовался метод Seabright (1971), модифицированный в лаборатории цитогенетики млекопитающих ИЦиГ (Графодатский, Радаабли, 1988). При описании хромосом и построении идиограм хромосом овцы, корова и козы использовали микрофотографии хромосом, полученные на основе 4 линий первичных фибробластов баранов, 3 линий - бычков, I - телки и 3 линий - коз.

Для первичного анализа гибридных клонов применялся метод гибридизации in situ 3Н-меченой суммарной ДНК коровы или овцы.

Работа по анализу клонов с помощью гибридизации In situ проведена сотрудниками лаборатории генетических основ онтогенеза Института цитологии и генетики СО РАН Н.М. Астаховой и О.В.Черяукене.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индивидуальная характеристика хролосол овцы (Ovis arles) При проведении цитогенетического анализа препаратов хромосом фибробластов коки овец было детально проанализировано 104 пластиншси при разной степени конденсации хромосом, проведена микрофотосъемка этих пластинок. Из 104 микрофотографий пластинок были отобраны лучшие и на их основе построено 22 кариотипа овцы (раскладки хромосом по парам ). В ходе анализа этих раскладок были начерчены схематические изображения хромосом, а затем на компьютере построены идиограммы.

На рис л представлены хромосомы овцы. Каждый ряд образуют фотографии одной хромосомы при несколько различающемся уровне конденсации. Такое расположение фотографий позволяет наблюдать

Рисунок I

Хромосомы овцы (Ovia ariea) при различающихся уровнях конденсации и их идеограммы. GTG-окраска.

í а

g

;,«i г;

ñ $

■ »!

»? M

8 ? I?

>à

OLL «

а

^ $ щ

' , t

я —

с?

«ХМ

» »

«

V Y"«......s.....

ГГГГГТ'1

w V M я к 8 в

щ ц—ц {

? *

! I i

". «

& Ö ф «S il

Рисунок I. Продолжение. I 8

V"» тту SE

■ s

изменения G-рисунка в зависимости от изменения конденсации. Справа на рис.1 расположены идеограммы для максимального уровня разрешения в 496 сегментов на гаплоидный набор хромосом овцы. При исследовании прометафазннх хромосом овцы были выявлены ранее не описанные новые сегменты. Идентифицирован целый ряд субсегментов в структуре позитивных блоков, а также тонкие "серые" (слабопозитивные) сегменты в структуре негативных районов. В представленном в работе описании всех хромосом овцы основное внимание обращается на главные идентификационные признаки отличающие GTG-рисунок.одной хромосомы от другой.

ОТй-струнтура хролосол крутого рогатого скота. При исследовании препаратов хромосом фибробластов кожи крупного рогатого скота было проанализировано и отснято на фотопленку 90 прометафазннх и метафазных пластинок. Из них были отобраны лучшие фотографии и составлено 15 кариотипов высокого разрешения (раскладок хромосом). Исследования GTG-окрашенных хромосом на стадии прометафазы позволило получить кариотипы при максимальном разрешении 519 сегментов на гаплоидный набор хромосом. В работе представлены микрофотографии прометафазных хромосом крупного рогатого скота при несколько различающихся уровнях разрешения G-сегментов. При составлении идиограм хромосом коровы мы следовали ориентирам, установленным ISCNDA (1990). Выявленные субсегменты обозначены соответствующим номенклатурным номером с точкой, за которой следует порядковый номер субсегмента. Кроме того, на идеограммах обозначены обнаруженные околоцентромерные сегменты: маленькие короткие плечи и негативные прицентромерные блоки на ряде аутосом.

В работе приводятся описания хромосом 9 и 14 крупного рогатого скота, в отношение которых уже много лет ведется дискуссия (Evans et al., 19ТЗ; Zartman, Bruere, 19T4; ISCNDA, 1990; Hayes, 1991; Gallagher, Womack, 1992), при сравнении их строения со строением гомологичных хромосом 9 и 14, 9 и 8 козы и овцы, соответственно. Кроме того, мы остановились на подробном описании мелких хромосом - 22 , 23 , 25 , 27 , 28 и 29, поскольку в отношении этих хромосом все еще существует неоднозначность в номенклатуре (ISCNDA, 1990; Iannuzzi, 1991).

Сравнение ' GTG-структур голологичнзхс хролосол крупного рогатого ската, козы и овцы. При исследовании препаратов хромосом фибробластов коки козы было детально изучено и отснято на фотопленку 84 пластинки, из 14 лучших фотографий были составлены

ю

раскладки (кариотипы).

В работе представлен комбинированный гаплоидный кариотип, составленный из микрофотографий G-окрашенных хромосом крупного рогатого скота, козы и овцы. Наше исследование не обнаружило различий в GIG-структурах аутосом и Х-хромосомы между козой и овцой.- Метацентрические хромосомы овцы I, 2 и 3 являются результатом робертсоновских ~ слияний хромосом, морфологически соответствующих I и 3, 2 и 8, 5 и II хромосомам козы или коровы. Морфологические особенности ряда аутосом и Х-хромосомн крупного рогатого скота в сравнении с гомологичными им хромосомами козы и овцы при самом высоком достигнутом автором уровне разрешения иллюстрирует рис. 2. На идаограммах показано, в результате каких перестроек могла образоваться современная Х-хромосома крупного рогатого скота (рис.2).

Сравнение при высоком разрешении обнаруживает дополнительную тонкую позитивную полосу в районе 13-18 хромосом! 9 крупного рогатого скота (рис. 2) по отношению к гомологичной хромосоме овцы. Существует гомология между GTG-структурами центральной и дастальной частей хромосомы 9 сравниваемых видов.

При достигнутом наш! уровне разрешения хромосома 14 крупного рогатого скота была короче гомологичных 14 и 8 хромосом козы и овцы, соответственно, на один маркирующий яркий прицентромернкй позитивный блок и прилежащий к нему крупный негатинвный сегмент (рис. 2).

В структуре хромосом I, 7, 16, 22 и 26 наблюдается необычно большой прицентромерннй негативный блок. 3 районе, прилежащем к центромере, на всех этих хромосомах обнаруживается дополнительный тонкий позитивный сегмент. Этот слабо позитивный (серый) сегмент отличает указанные хромосомы крупного. рогатого скота от гомологичных хромосом 1, 7, 16, 22, 26 и I, 5, 12, 20, 27 коза з: овцы, соответственно (рис. 2).

На рис. 2 представлена гипотетическая модель структурных перестроек приведших к формированию совремэниой Х-хромосомы коровы. Обнаружилось совпадение G-рисунка всего длинного плеча субметзцентрической x-хромосом коровы и значительной части длинного плеча Х-хромосомы козы (овцы). Совпадают районы (12-42)q коровы и (12-34}д козы (овцы). В таком случае для преобразования Х-хромосомы козы (овцы) в Х-хромосому коровы необходим поворот центромеры вместе с коротким плечом на 180° и транспозиция этого участка хромосомы в район ЗЬд (рис. 2). Выглядят гомологичными

Охвхос^ дхзхос^

СиЭи Б,

с, д7

ы

С«дк&г

9зх сх^

\

1! а

с» 58 с, д» 5»

Ш Ш

СггОа Бго СавЭгв Бг?

« г

Рисунок 4.

Морфологические особенности ряда аутоеом и Х-хромосомы коровы (С) в сравнении с гомологичными хромосомами козы (С) и овцы (в) при максимальном уровне разрешения. СТС-окраска.

Стрелка указывает на то, что Х-хромосома коровы развернута на 180". Справа идиограммы представляют модель предполагаемой перестройки Х-хромосомы коровы.

районы (36-38)д козы (овцы).и (21-23)р коровн. Нами не обнаружен в структуре Х-хромосомы коровц район, гомологичный прителомерной части Х-хромосомы козы или овцы (42-43)ц - предполагается его деления. Обнаружение различий в структуре й-рисунков хромосом козы (овцы) и крупного рогатого скота может способствовать пониманию механизмов эволюции кариотипов семейства БогНбзе. Определение - степени гомологам хромосом г?их ь-.:доз вакво и для сравнительного т-аь.-эигг.'оь'иго ь-ортярс-ве-тпя," поскольку- экстраполяция данных по ,'«р?>п:с/;1ЭЯ1*:.) с одного е;У!0 Во1>1с'а& ка другие моаэт сделать" генетические кярты взаимодополняемыми.

1ЩяОы ссгоч:и\эсю1г си и ш цжогыж&еский аулкиэ. В двух опытах по гибрадазацяк клеток костного мозга козы и кгв гок тл-ряского хсиучкз {зстог М15, ИРМ") было получено 26 ги^рвдаых ••монор. ^/тжшч знал'^зсм Си лс отобрзг.ю 5 %;:снср о Солхлп"» содержанием хромосом козы. При цятоголегичоском гяегздо &тлх г«оо»йи1их злт?*» »«опнилась, прежде всего, невозможность получения тр^моош« па мтшы*. грг'ссо« китайского

хомячка. Мелкие и даже средние по велачкйв коьы и«

удавалось точно идентифицировать. Таким образом, гибриды менду козой (коровой, овцой) могут быть использованы только для анализа синтенных групп.

В опыте по гибридизации клеток селезенки крупного рогатого скота с клетками мыши (линия А9, НРЭДГ) было получено три гибридных клона. На некоторых лучших пластинках все-таки удавалось г-'гатс-гЮ яад&ляо идентифицировать все хромосомы коровы. ■'чнт'.'суя что разница с размерах хроиосок .'.^ии и ксро?ч тто сто,ль колика "»*гк з гибридах коза- китайский хоил-гок и "чгг'-.г'.г.ст-" хрс-.'осои коровы нзлежео ко Форо хг'омосг.г; ?«У'"11. портнерствс коропа (коза, овцс;-5сазь можнс считать услог.ьо перстакт«31£им Д-'.о построения попел! гиорадких кленов,

ь двух опытах по гиоридазацки р качеств.-) • зргк^рг к кльткок костного мозга овин были использоейнц перевиваемою клетки носки, дьфпшиые по тамиданкинаоо (шифр лаши - МУЖ ). Ливия игюет устойчивый карйотип (2п = 28), близки! к нормальному. Все хромосомы нерка ?гатацентрические, что контрастирует с хромосомами гищ, коровы и косы, где? основная массь тьомосом ооооц-птряческие. В этих опытах по гибрлдизашга к: сток ошга получено 3 ^иорид-йх клонов. Ответ хромосом обоих геномов в гибридных клонах овца-норка на интеркалирущее воздействие бромистого этидия бил т.е. одинаково хорошо "растягивались" как хромосомы

овцы, так и хромосомы норки. При хорошем соответствии размеров хромосом это не мешало получать хромосомы овцы на фоне хромосом норки такой длины, при которой все хромосомы овцы могли быть надежно идентифицированы. В целом же клеточное партнерство между овцой (козой, коровой) и норкой можно считать наиболее перспективным для построения панели гибридных клонов.

ВЫВОДЫ

1) Проведено детальное исследование кариотипа овцы (Ovia artes). Метод дифференциального окрашивания хромосом высокого разрешения позволил выявить 496 G-сегментов, что обеспечило возможность описания основных идентификационных признаков всех хромосом и создания основы для новой номенклатуры хромосом овцы.

2) Проведено исследование дифференциально окрашенных хромосом при высоком разрешении (около 500 G-сегментов) козы (Сарга hircus) и коровы (Boa taurvs), обеспечившее возможность надежной идентификации всех хромосом этих видов.

3) Проведено сравнительное цитогенетическое исследование, позволившее уточнить характер видовых особенностей хромосом 9 и 14 Boa taurua. Кроме того, впервые обнаружены множественные минорные видовые отличия хромосом коровы от хромосом овцы и козы, касающиеся прицентромерных районов ряда аутосом: I, 7, 16, 22 и 26. Сравнение GTG-структур хромосом козы и овцы не обнаружило аутосомно-плечевых различий и различий в строении Х-хромосом этих видов.

4) Исследованы GTG-структуры половых хромосом козы, овцы и коровы в сравнительном аспекте. Уточнены районы структурной гомологии и описан предполагаемый вариант хромосомных перестроек, приведших к формированию Х-хромосомы коровы в процессе эволюции семейства Bovldae.

■ 5) Впервые получена серия гибридов соматических клеток между овцой и норкой (клетки костного мозга овцы х культура клеток норки

штаг).

6) Цитогенетическое сравнение клеточных гибридов овца-норка, коза-китайский хомячок и корова-мышь показало, что надежная идентификация всех хромосом Bovldae возможна только на фоне кариотипа норки. Таким образом гибридные клетки овца(корова)-норка перспективны для создания панелей клонов, предназначенных для хромосомного.картирования генов овцы (коровы).

Список работ, опубликованных по тема диссертации

I. Шарипов И.К., Вишневская С.С., Кафтановская Е.М., Канапин А.К. Некоторые проблемы цитогенетшш сельскохозяйственных

йиастпкх//Сборнйк тезисов 33 кколч тго генетике и селекции

лэот:«х. Нопг.сйбарск,-IS80 .-зЛ8.

?.. Ea/tanorj'/eys" Н.7 'Зггст- О.-High-resolution .G-rbeadlag о f.

¿iicep Ciu'oino^osfei; _/' J.b-хч^, -i SOf . -7.83.-f .5?-99.

Ь. Н М.. S<=rov O.L. aigb resolut ion GTC--

North American Colloquium oü Boz-sssie Aniroal Cytogenetics чг.а