Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование дифференциально окрашенных хромосом овцы, крупного рогатого скота и козы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование дифференциально окрашенных хромосом овцы, крупного рогатого скота и козы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

фЩ

На правах рукописи

КАИАНОВСКАЯ ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

УДК 575.155:575.116:636.934.2

I

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ОКРАШЕННЫХ ХРОМОСОМ ОВЦИ, КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И КОЗЫ.

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ, диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1993

/

( /

/

/

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук О.Л.Серов, Институт цитологии и генетики СО РАН

доктор биологических наук Э.Б.Всеволодов Институт экспериментальной биологии АН Казахстана.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Н.Стегний, НИИ биологии и биофизики . при Томском государственном университете, г. Томск

доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.С.Графодатский, Институт цитологии и генетики СО РАН

Ведущее учереждение: Институт общей генетики РАН, Москва

Защита состоится С/сГл САМ на

заседании специализированного совета по защйтег да.

специализированного совета по защитег диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан "" ¿^/¿¿.^ 1993 г.

/

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук -— у/"" А.Д.Груздев

Актуальность проб.'.елы. Карнотита домашних коз, овец и коров характеризуется практически полной аутосомно-плечевой гомологией. Присутствие в кариотипах ряда хромосом со сходным G-рисунком и большого числа мелких хромосом с трудно выявлявши индивидуальным рисунком затрудняет создание рациональной классификации и устойчивой номенклатуры. Более подробно описаны основные морфологические признаки хромосом коровы, менее изучены кариотипы козы и овцы (IS CfiD А, 1990). Так, недостаточно изучена для надежной идентификации структура двух крупных акроцентриков 4 и 6, отсутствует детальная характеристика хромосомы 9 и пары гомологичных хромосом 8 и '14 овцы и козы, соответственно. Отсутствует детальное описание идентификационных критериев мелких гомологичных пар хромосом 19 и 23, 20 и 22, 21 и 25, 24 И 29, 25 и 28, 2G и 27 овцы и козы.

Исследование кариотипов домашних коз, овец и крупного рогатого скота при высоком разрешении GTG-сегментов дифференциально окрашенных хромосом (G-сегменты выявляются окрашиванием препаратов красителем Гимза после инкубации в солевом растворе трипсина) представляет интерес как в теоретическом, так и в прикладном аспектах. В теоретическом аспекте сравнительное изучение морфологии хромосом может дать ценную информацию о закономерностях эволюции хромосом животных этих видов. Применение методов дифференциального окрашивания хромосом в цитогенетике млекопитающих делает возможным более тщательное исследовашю дивергенции хромосом на протяжении десятков миллионов лет эволюции. Анализ G-рисунков хромосом высокого разрешения позволяет определять районы презумптивной гомологии в хромосомах далеких видов, даже если общая морфология хромосом значительно различается (O'Brien et al., 1985). Изучение кариотипов фэнотипически близких видов способствует выявлению межпопуляционных, подвидовых и видовых различий (Воронцов, 1958, 1966; Воронцов и др., 1972; Орлов, 1974; РаджаОли, Графодатский, 1977 и др.).

Методы дифференциального окрашивания хромосом высокого разрешения и использование точных цитогенетических стандартов обеспечивают возможность проведения надежной диагностики хромосомных аномалий в ветеринарной и селекционной практике. Описание главных морфологических признаков всех хромосом в кариотипах коров, коз и овец может служить основанием надежной идентификации хромосом этих видов в гибридах соматических клеток, что, в свою очередь, сделает возможным хромосомное картирование генов с помощью методов

клэ точной биологии.

Цели и задачи исследования. Основной целью отсй работы было получение онтогенетических стандартов дифференциально окрашенных хромосом высокого разрешения овец, коров и коз и оценка возможности использования этих стандартов для определения индивидуальных хромосом этих видов в клеточных гибридах.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести детальное описание хромосом домашней овцы, козы к крупного рогатого скота с использованием СТС-даКаренциально окрашенных хрмосом при разных уровнях конденсации, сопоставить эти результаты с имеющимися международными стандартами описаний и номенклатуры хромосом этих видов.

2. Провести сравнительный цитогенетичбский анализ, хромосом коровы, овцы и козы и детально описать межвидовые различия.

3. Используя методы гибридизации соматических клеток, получить гибридные клоны коза- китайский хомячок, овца- норка, корова-мшь.

4. Исследовать надежность идентификации хромосом коровы, общ или козы в клеточных гибридах на фоне хромосом мыши, норки или китайского хомячка.

Научная новизна и практическая ценность. Выявлены новые существенные детали в С-рисунках индивидуальных хромосы овцы,козы и крупного рогатого скота, касающиеся хромосом 4 и 6, 8'и 14, 9, 19 и 23, 20 и 22, 21 и 25, 24 и 29, 25 и 28, 26 и 27.

Сравнительный цитогенетический анализ кариотипов козы, овцы и крупного рогатого скота позволил впервые обнаружить множественные минорные различия СТС-структур хромосом корова с одной стороны, козы и овцы - с другой.

Впервые, путем слияния клеток костного мозга овцы и мутантных клеток норки получены стабильные гибридные клоны овца-норка, показана возможность надежной идентификации хромосом овцы на метафазных пластинках гибридных клеток овца-норка.

Апробация работы.. Основные результаты работы докладывались на 3-ей школе-семинаре по генетике животных (Новосибирск, 1989) и в комитете по сравнительному картированию 11-ой Международной конференции по картированию генома человека (Лондон, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объел рабош1. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы ( 155 ссылок).

Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована II рисунка?.® и содержат I таблицу.

истерши и jtemoôu. Материалом проведенных иследований слутлн следующие клеточные лирш: I. Первичные культуры фибробластов овцы, полученные от в взрослых и 5 новорожденных животных. 2. Первичные культуры фибробластов козы, полученные от 8 взрослых животных. 3. Первичные фибробласты крупного рогатого скота, полученные от 4 новорожденных тавотных. 4. Перевиваемая .линия клеток китайского хомячка М15, дефицитная по активности ГФРТ. 5. Перевиваемая линия клеток кьсш А9, дефицитная по активности ГФРТ. в. Перевиваемая линия клоток американской норки 'IVTK-, дефицитная про активности ТК. Линия получена и любззно предоставлена старшим научным сотрудником лаборатории генетических основ онтогенеза Института цитологии и генетики СО РАН Н.С.Ждановой.

Первичные культуры фибробластов получали из биоптатов коки взятых с наружной стороны уха животного.

Гибриды соматических клеток были получены путем слияния перевиваемых мутантных линий мыли, китайского хомячка или норки со спленоцитаки коровы или клетками костного мозга козы или овцы. Слияние проводил:! по методу Davidson, Gerald (1976) с некоторыми модификациями. Гибриды между клетками козы и китайского хомячка, клетками овцы и норки были получены автором. Гибридные клоны корова-мышь были предоставлены сотрудниками лаборатории генетических основ онтогенеза А.Г.Шиловым и U.M.Матвеевой.

Для получения препаратов хро?<гасом первичных фибробластов клетки помещали в большие стеклянные культуральные флакон® (75 или 120 смг) в такой концентрации, чтобы они покрывали 1/2 - 2/3 поверхности дна сосуда. В зависимости от плотности монослоя клетки культивировали 24 или 48 часов. Для увеличения на прэпараатах количества пластинок на стадии прометафазы за 1,5 - 2 часа до конца культивирования в среду добавляли интеркалирущий агент -бромистый этидий (Ikeuchl, 1984) до конечной концентрации 3 мкг/мл. По окончанию культивирования среду сливали, клеточный монослой обрабатывали 0,252 раствором трипсина, и клетки снимзли в среду Игла, содержащую 20% сыворотки корова и колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Суспензию клеток переносили в центрифужные пробирки и оставляли при комнатной температуре на 15 - 20 мин. Затем суспензию центрифугировали, к полученному осадку добавляли 5 мл гипотонического раствора (0,075 M KCl) и оставляли

на 5 мин. при комнатной температуре. Затем в пробирки добавляли еще 3 мл 0,04 М раствора KCl (экспозиция 3 мин.), потом еще 2 мл 0,04 М KCl (экспозиция 2 мин.). Гипотоническую обработку останавливали добавлением 0,3 мл фиксатора (смесь метанола и лодяной уксусной кислоты в соотношении 3:1). Суспензию центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Осадок встряхивали и по стенке пробирки осторожно наслаивали свежий охлавдешшй фиксатор; пробирки ставили в лед на 10 mim. Затем осадок ресуспендировали встряхиванием и центрифугировали. Смену фиксатора производили три раза. Для получения качественных препаратов с оптимальным разбросом хромосом гибридные клетки коза-китайский хомячок обрабатывали 0,075 М KCl в точение 7 минут, гибридные клетки овца-норка обрабатывали 0,056 11 KCl в течение 15 минут, а гибридные клетки корова-мышь - 0,075 М KCl в течение 25 - 30 минут.

Для GTG-окраски хромосом использовался метод Seabrigiit (1971), модифицированный в лаборатории цитогенетики млекопитающих ИЦиГ (Графодатский, Раджабли, 1988). При описании хромосом и построении идиограм хромосом овцы, коровы и козы использовали микрофотографии хромосом, полученные на основе 4 линий первичных фибробластов баранов, 3 линий - бычков, I - телки и 3 линий - коз.

Для первичного анализа гибридных клонов применялся метод гибридизации in situ 3Н-меченой суммарной ДНК коровы или овцы.

Работа по анализу клонов с помощью гибридизации in situ проведена сотрудниками лаборатории генетических основ онтогенеза Института цитологии и генетики СО РАН Н.М. Астаховой и О.В.Черяукене.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИидивиВусиъчая хараккериспшю. хролосоя обци (Ovis or 1ез) При проведении цитогенетического анализа препаратов хромосом фибробластов коки овец было детально проанализировано 104 пластики при разной степени конденсации хромосом, проведена микрофотосъемка этих пластинок. Из 104 микрофотографий пластинок были отобраны лучшие и на их основе построено 22 кариотипа овцы (раскладки хромосом по парам ). В ходе анализа этих раскладок были начерчены схематические изображения хромосом, а затем на компьютере построены идиограммы.

На рис Л представлены хромосомы овцы. Каждый ряд образуют фотографии одной хромосомы при несколько различающемся уровне конденсации. Такое расположение фотографий позволяет наблюдать

I

Рисунок I

Хромосомы овцы (Ovia oríes) при различающихся уровнях конденсации и их идиограммы. GTG-окраска.

ñ г.

* в

й

s

m

tí a

fê О

g te «

Ч СГ

ь»

£ a

;; i

¡¡ I! 1

i I i } И ж

lirrrn

ЯГ1—"i

Й « * 1 i « 1 < 5Я" " 11 о

s » • • « J « s * ff Ii «

¥ « б я 8 а 1 Й; :. ■ ; ч •--

** Ъ Ч Ц ц

© i V

Ш ш m " ^ •

/Л «

■ • 1

■

а

S

4 1» м 1

12

/• ч ■

S >ñ " %

■

т,

в

»

! I

? ^ Ii

* 9

i Y

11

g g

%

изменения G-рисунка в зависимости от изменения конденсации. Справа на рис.1 расположены идиограммы для максимального уровня разрешения в 496 сегментов на гаплоидный набор хромосом овцы. При исследовании прометафазных хромосом овцы были выявлены ранее не описанные новые сегменты. Идентифицирован целый ряд субсегментов в структуре позитивных блоков, • а - также тонкие "серые" (слабопозитивныэ) сегменты в структуре негативных районов. В представленном в работе описании всех хромосом овцы основное внимание обращается на главные идентификационные признаки отличающие GTG-рисунок одной хромосомы от другой.

QIQ-cmpymypa хролосол крупного рогатого скота. При исследовании препаратов хромосом фибробластов кожи крупного рогатого скота было проанализировано и отснято на фотопленку 90 прометафазных и метафазных пластинок. Из них были отобраны лучшие фотографии и составлено 15 кариотипов высокого разрешения (раскладок хромосом). Исследования GTG-окрашенных хромосом на стадии прометафазы позволило получить кариотипы при максимальном разрешении 519 сегментов на гаплоидный набор хромосом. В работе представлены микрофотографии прометафазных хромосом крупного рогатого скота при несколько различающихся уровнях разрешения G-сегментов. При составлении идиограм хромосом коровы мы следовали ориентирам, установленным ISCNDA (1990). Выявленные субсегменты обозначены соответствующим номенклатурным номером с точкой, за которой следует порядковый номер субсегмента. Кроме того, на идеограммах обозначены обнаруженные околоцентромерные сегменты: маленькие короткие плечи и негативные прицентромерные блоки на ряде аутосом.

В работе приводятся описания хромосом 9 и 14 крупного рогатого скота, в отношение которых уже много лет ведется дискуссия (Evans et al., 1973; Zartman, Bruere, 19T4; ISCNDA, 1990; Hayes, 4 991; Gallagher, Womack, 1992), при сравнении их строения со строением гомологичных хромосом 9 и 14, 9 и 8 козы и овцы, соответственно. Кроме того, мы остановились на подробном описании мелких хромосом - 22, 23, 25, 27, 28 и 29, поскольку в отношении этих хромосом все еще существует неоднозначность в номенклатуре (ISCNDA, 1990; lannuzzl, 1991).

Сравнение ' GTG-cmpymyp голологичных хролосол крупного рогатого енота, козы и овцы. При исследовании препаратов хромосом фибробластов кожи козы было детально изучено и отснято на фотопленку 84 пластинки, из 14 лучших фотографий были составлены

раскладки (кариотшш).

В работе представлен комбинированный гаплоидный кариотип, составленный из микрофотографий G-окрашенных хромосом крупного рогатого скота, козы и овцы. Наше исследование не обнаружило различий в GTG-структурах аутосом и Х-хромосомы между козой и овцой. Метацентрические хромосомы овцы I, 2 и 3 являются результатом робертсоновских слияний хромосом, морфологически соответствующих I и 3, 2и8, 5иП хромосомам козы или коровы. Морфологические особенности ряда аутосом и Х-хромосомы крупного рогатого скота в сравнении с гомологичными им хромосомами козы и овцы при самом высоком достигнутом автором уровне разрешения иллюстрирует рис. 2. На идиограммах показано, в результате казсих -перестроек могла образоваться современная Х-хромосома крупного рогатого скота (рис.2).

Сравнение при высоком разрешении обнаруживает дополнительную тонкую позитивную полосу в районе 13-18 хромосомы 9 крупного рогатого скота (рис. 2) по отношению к гомологичной хромосоме овцы. Существует гомология между GTG-структурами центральной и дистальной частей хромосомы 9 сравниваемых видов.

При достигнутом нами уровне разрешения хромосома 14 крупного рогатого скота была короче гомологичных 14 и 8 хромосом козы и овцы, соответственно, на один маркирующий яркий прицентромерный позитивный блок и прилежащий к нему крупный негатинвный сегмент (рис. 2).

В структуре хромосом I, 7, 16, 22 и 26 наблюдается необычно большой прицентромерный негативный блок. В районе, прилежащем к центромере, на всех зтих хромосомах обнарушВается дополнительный тонкий позитивный сегмент. Этот слабо позитивный (серый) сегмент отличает указанные хромосомы крупного рогатого скота от гомологичных хромосом I, 7, 16, 22, 26 и I, 5, 12, 20, 27 козы и овцы, соответственно (рис. 2).

На рис. 2 представлена гипотетическая модель структурных перестроек приведших к формированию современной Х-хромосомы коровы. Обнаружилось совпадение G-рисунка всего длинного плеча субметацентрической Х-хромосом коровы и значительной части длинного плеча Х-хромосомы козы (овцы). Совпадают районы (12-42)q коровы и (12-34)д козы (овцы). В таком случае для преобразования Х-хромосомы козы (овцы) в Х-хромосому коровы необходим поворот центромеры вместе с коротким плечсм на 180° и транспозиция этого участка хромосомы в район 35q (рис. 2). Выглядят гомологичными

Эхассх^ Охассх^

1 * , 1

1 1 г

9 \ 3' а

» 1 * \ ш 1_

т ■на >

1 I

4 > . ^ 1 1

• ? « В а' * '

4 г 1 1 63"

9зх сх^>

С»

с» 8» с, д, э»

Ш ш

СиОаБго СаЗа Бг?

Рисунок 4.

Морфологические особенности ряда аутосом и Х-хромосомы корош (С) в сравнении с гомологичными хромосомами козы (О и овцы (Б) при максимальном уровне разрешения. СТС-окраска.

Стрелка указывает на то, что Х-хромосома коровы развернута на 180°. Справа идиограммы представляют модель предполагаемой перестройки Х-хромосомы коровы.

районы (36-38)q козы (овцы) и (21-23)р коровы. Нага не обнаружен в структуре Х-хромосомы коровы район, гомологичный прителомерной части Х-хромосомы козы или овцы (42-43)q - предполагается его делеция. Обнаружение различий в структуре G-рисунков хромосом козы (овцы) и крупного рогатого скота может способствовать пониманию механизмов эволюции кариотипов семейства Bovldae. Определение степени гомологии хромосом этих видов вакно и для сравнительного генетического картирования, поскольку экстраполяция данных по картированию с одного вида Bovldae на другие может сделать их гзкетические карты взаимодополняемым!.

Ги£р±2ы солзпичеагах клепои и иг цшогензгтчеасий анализ. В двух опытах по гибридизации клеток костного мозга козы и клеток китайского хомячка (линия М15, НРЯТ~) было получено 2G гибридных кленов. Рутинным анализом било отобрано 5 клопов с большим содержанием хромосом козы. При цитогенетическом анализе этих гибридных клонов выяснилась, прэзде всего, невозможность получения промэтафазных хромосом козы на фоне крупных хромосом китайского хомячка. Мелкие и даже средние по величине хромосом! козы не удавалось точно идентифицировать. Таким образом, гибриды между козой (коровой, овцой) могут быть использованы только для анализа екктонннх груш.

В опыте по гибридизации клеток селезенки крупного рогатого скота с клетками мыши (линия А9, HPRT") было получено три гибридных клона. На некоторых лучших пластинках все-таки удавалось достаточно надэкно идентифицировать нее хромосомы коровы. Учитывая, что разница в размерах хромосом маши и коровы не столь велика как в гибридах коза- китайский хомячок и "читаемость" хромосом коровы надежнее на фоне хромосом мыши, партнерство корова (коза, свца)-мпшь можно считать условно перспективным для построения панели гибридных клонов.

В двух опытах по гибридизации в качестве партнера к клеткам костного мозга овцы были использованы перэвизьомыв клетки норки, дефицитные по тимидинкиназе (шифр линии - ЛVTX7). Линия имеет устойчивый кариотип (2п = 28), близкий к нормальному. Бее хромосомы норки метацентрические, что контрастирует с хромосома!® овцы, коровы и козы, где основная масса хромосом акроцрнтрическив. В этих опытах по гибридизации клеток было получено 8 гибридных клонов. Ответ хромосом обоих геномов г. гибридных клонах овца-норка на интеркалирукцее воздействие бромистого этидия был симметричным, т.е. одинаково хорошо "растягивались" как хромосомы

овцы, так и хромосомы норки. При хорошем соответствии размеров хромосом это не мешало получать хромосомы овцы на фоне хромосом норки такой длины, при которой все хромосомы овцы могли быть надежно идентифицированы. В целом же клеточное партнерство мезду овцой (козой, коровой) и норкой можно считать наиболее перспективным для построения панели гибридных клонов.

ВЫВОДЫ

1) Проведено детальное исследование кариотипа овцы (Outs arles). Метод дифференциального окрашивания хромосом высокого разрешения позволил выявить 496 G-сегментов, что обеспечило возможность описания основных идентификационных признаков всех хромосом ц создания основы для новой номенклатура хромосом овца.

2) Проведено исследование дифференциально окрашенных хромосом при высоком разрешении (около 500 G-сегментов) козы (Capra hlrcus) и коровы (Воз tanrua), обеспечившее возможность надежной идентификации всех хромосом этих видов.

3) Проведено сравнительное цитогенетическсе исследование, позволившее уточнить характер видовых особенностей хромосом 9 и 14 Boa tanrua. Кроме того, впервые обнаружены множественные ¡«шорные Еидовые отличия хромосом коровы от хромосом овцы и козы, касающиеся прицентромерных районов ряда аутссом: I, 7, 16, 22 и 26. Сравнение GTG-структур хромосом козы и овцы не обнаружило аутосомно-плечевых различий и различий в строении Х-хромосом этих видов.

4) Исследованы GIC-структуры половых хромосом козы, овцы и коровы в сравнительном аспекте. Уточнены районы структурной гомологии и описан предполагаемый вариант хромосомных перестроек, приведших к формированию Х-хромосомы коровы в процессе эволюции семейства Bovldae.

5) Впервые получена серия гибридов соматических клеток мезду овцой и норкой (клетки костного мозга овцы х культура клеток норки MVTK").

6) Цитогенетическое сравнение клеточных гибридов овца-норка, коза-китайский хомячок и корова-мышь показало, что надежная идентификация всех хромосом Bovlctae возможна только на фоне кариотипа норки. Таким образом гибридные клетки овца(корова)-норка перспективны для создания панелей клонов, предназначенных для хромосомного картирования генов овцы (коровы).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шарипов И.К., Вииневская С.С., Кафтановская Е.М., Канапин А.К. Некоторые проблемы цитогенетики сельскохозяйственных ::шютшх//Сборник тезисов " Зй школы по генетике и селекции квотных .Новосибирск, -1989. -с. 18.

2. Kaitanovskaya Н., Serov 0. High-resolution G-banding'of

sheep chrorncsoir.es.//J.Hered.-1992.-v.83.-P.92-99.

3. Kaftanovskaya H.M., Serov O.L. High resolution GTG- banded chrornoscces oi cattle, sheep, and goat: a comparative study//8th North American Colloquium on Domestic Animal Cytogenetics and Gwie Happing.Abstracts.Guelph,Canada,-1993.-p. 185.