Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на лимфоциты

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на лимфоциты"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ имени М.В. ЛОМОНОСОВ/

003494575

На правах рукописи УДК 577.353.2

ВЛАДЫЧЕНСКАЯ ЕЛИЗАВЕТА АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ГОМОЦИСТЕИНА И ГОМОЦИСТЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ЛИМФОЦИТЫ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

специальность 03.01.04 - Биохимия

Москва 2010

2 5 МА? 2010

003494575

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гроздова Ирина Дмитриевна

доктор биологических наук Порешина Лидия Петровна

Ведущая организация:

Институт Биофизики Клетки РАН

Защита диссертации состоится 5 апреля 2010 г. В 15 часов 30 минут па заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «0 » марта 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, ..

кандидат биологических наук с/^/в Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гомоцистеин (ГЦ) является природным метаболитом, который образуется в ходе взаимопревращений метионина и цистеила. Он обнаруживается в крови преимущественно в связанном с цистеином белков состоянии, а также в виде продуктов его спонтанного окисления, главным образом, гомоцистеиновой кислоты (ГЦК). Содержание общего ГЦ в крови грызунов и человека не превышает 15 цМ [Seshadri et al., 2002], а повышение его уровня является фактором риска для развития нейродегенеративных заболеваний и деменции [Perry et al., 1995, Seshadri et al., 2002]. В литературе отмечается, что нейротоксический эффект у ГЦК выражен сильнее, чем у ГЦ [Gortz et al., 2004].

Токсическое действие этих соединений не ограничивается нервной тканью - отрицательные эффекты ГЦ и ГЦК описаны на тромбоцитах, гладкомышечной степке сосудов, нейтрофилах [Болдырев, 2009]. В ряде исследований обнаружено, что мишенью действия ГЦ в мозге могут быть глутаматные рецепторы, в частности, NMDA-реценторы [Zieminska et al., 2002; Махро и соавт., 2004]. Активация NMDA-рецепторов в нейронах инициирует вход кальция внутрь клетки, рост активных форм кислорода (АФК) и, возможно, азота.

Недавно в литературе было описано наличие глутаматных рецепторов не только в нервной ткани, но и в некоторых клетках иммунной системы, в частности, в лимфоцитах [Ganor et al., 2003; Boldyrev et al., 2004; Pacheco et al., 2004; Mashkina et al., 2007]. Какова функция этих рецепторов в иммупокомпетептной системе, и какое значение имеет ГЦ для ее активности, оставалось неизвестным. В то же время, постоянная циркуляция ГЦ в крови в условиях гипсргомоцистсипемии делает клетки иммунной системы потенциальной мишенью для этого соединения.

Целью нашей работы явилась характеристика действия ГЦ и ГЦК на лимфоциты крысы.

В работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оценить экспрессию глутаматных рецепторов NМОЛ-класса в лимфоцитах крысы.

2. Охарактеризовать взаимодействие ГЦ и ГЦК с глутаматными рецепторами на мембране лимфоцитов.

3. Исследовать влияние ГЦ и ГЦК на уровень внутриклеточного Са2+ и свободных радикалов в лимфоцитах.

4. Определить преимущественные источники свободных радикалов, образующихся при инкубации лимфоцитов с ГЦ и ГЦК.

5. Оценить влияние ГЦ и ГЦК на продукцию цитокинов лимфоцитами.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе детально охарактеризован механизм действия ГЦ и ГЦК на иммунокомпетентные клетки. Показано, что при активации ЫМОЛ-рецепторов в лимфоцитах крысы происходит увеличение содержания внутриклеточного кальция и следующее за ним увеличение уровня свободных радикалов. Выявлено, что при действии ГЦК на лимфоциты источником свободных радикалов являются НАДФН-оксидаза и ЫО-сиптаза. Показана способность ГЦ и ГЦК регулировать синтез НТЧ-у и Т№-а в лимфоцитах крыс. Полученные данные указывают, что в основе токсического действия ГЦ лежит специфическое влияние на иммунную систему, опосредованную глутаматными рецепторами. Проведенные исследования существенно расширяют представления о механизмах взаимодействия гомоцистеипа и гомоцистеиповой кислоты с лимфоцитами, что существенно для понимания молекулярных механизмов токсичности гомоцистеина.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, 29lh Annual Meeting of Neurochemical Society of Japan (Japan, Kyoto, 2006); 17lh ESN Meeting (Spain, Salamanka, 2007); на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Россия, Москва, 2007); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Россия, Москва, 2007); Int. Symp. Lipid Peroxidation (Japan, Karuizawa, 2008); Ehrlich II World Conf. Magic Bullets (Germany, Nurnbcrg, 2008); 7lh Int. Conf. on Homocysteine Metabolism (Czech Republic Prague, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и списка цитируемой литературы. Работа содержит 109 страниц машинописного текста, 6 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 140 отечественных и зарубежных источников.

В работе приняты следующие сокращения:

АФК - активные формы кислорода, ГЦ - гомоцистсин, ГЦК - гомоцистсиповая кислота, НАДФН - никотипамидаденипдинуклеотидфосфат восстановленный, Con Л -concanavalin A, D-AP5 - L-(+)-2-Amino-5-phosphonopcntainoie acid, DCF -dichlorofluorescein, DCFI12-DA - dichlorofluorescein diacctate, D1IR 123 - dihydrorhodamine 123, ELISA- Enzymc-linkcd immunosorbent assay, FITC - fluoresceinc isotiocianate, Fluo-3 AM - 4-(6-Acctoxymethoxy-2,7-dichloro-3-oxo-9-xanthenyl)-4'-methyl-2,2'-(cthylcncdioxy)-dianiline-N,N,N',N'-letraacclic acid tetrakis(acctoxymcthyl) ester, IFN-y - interferon gamma, LY 294002 - 2-(4-Morpholinyl)-8-phenyl-4H-l-bcnzopyran-4-one, MK-801 - (5S,10R)-(-)-5-Methyl-10,ll-dihydro-5H-dibcnzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine, NMDA - N-methyl-D-aspartic acid, PI - Propidium iodide, PKC - Protein kinase C, TNF-a - tumor nccrosis factor.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились лимфоциты периферической крови

крыс.

Выделение лимфоцитов проводили стандартным методом. Для получения лимфоцитов кровь наслаивали на специфическую селективную среду «Lymphosep» (MP «Biomedicals»). Кольцо лимфоцитов, локализованное на границе двух сред, собирали, отмывали сначала от среды и тромбоцитов, после чего оставляли на 40 мин в пластиковой чашке Петри для адгезии гранулоцитов, B-лимфоцитов и моноцитов.

Количество клеток подсчитывали в камере Горяева и анализировали с использованием проточной цитометрии; кроме этого, клетки оставляли для роста на 72 ч, после чего анализировали методом «Elisa».

Культура периферических лимфоцитов. Все работы проводили в стерильном ламинарном боксе. После отмывания клетки, полученные, как описано выше, суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированную телячью эмбриональную сыворотку, гентамицин 2 мг/мл, и инкубировали в СОг-инкубаторе. Плотность клеточной суспензии составляла 10б кл/мл. О появлении мертвых клеток в ходе эксперимента судили по окраске проб трипановым синим. Активированные лимфоциты получали в результате инкубации с конканавалином A (Con А, ПанЭко, Россия) (10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество продуцируемых цитокинов оценивали методом ELISA (Bender Medsystems).

Проточная цитометрия. Измерения проводили на приборе «EPICS XL» фирмы Beckman Coulter (США), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 485 им. В каждой пробе анализировали 10000 событий. Данные обрабатывали в программе WIN MDI. Для определения внутриклеточного уровня свободных радикалов использовали 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат (DCFH2-DA, А.сх 485 нм, Хст 535 нм) в конечной концентрации 100 цМ. Для регистрации изменения

концентрации внутриклеточного кальцин использовали флуоресцентный зонд Fluo-3 AM (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси - 3 - оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфепокси)этан-N,N,N',N'-'icTpayKcycna!i кислоты, Хсх 485 им, Хст 535 им), в конечной концентрации 20 рМ. Для определения уровня свободных радикалов в митохондриях использовали флуоресцентный зонд дигидрородамин 123 (DHR 123, Х.ех 485 им, Хст 535 им), в конечной концентрации 10 цМ. Для идентификации некроза клетки окрашивали иодидом пропидия (PI, Хсх 485 нм, Ä,cm 610 нм), в конечной концентрации 10 рМ.

Для оценки экспрессии рецепторов использовали иммуноцитохимическое окрашивание. Окраску моноклональными антителами к NR1 субъсдиницс NMDA-рсцсптора (Abeam) проводили согласно протоколу производителя, затем клетки отмывали и окрашивали вторичными (FITC-мечеными) антителами. В пробу вносили около 100000 клеток. Антитела использовали в разведении 1:200.

Определение продукции цитокинов с помощью набора «ELISA» осуществляли, как рекомендовано производителем «Bender Mcdsystems». В эксперименте использовали киты для определения IFN-y и TNF-a.

Для исследования вовлеченности рецепторов и ферментов, участвующих в процессах внутриклеточной сигнализации лимфоцитов, использовали специфические агонисты, антагонисты, субстраты и ингибиторы в подобранных концентрациях.

Статистическая обработка результатов. Результаты измерений, проведенных в 3-5 параллельных пробах, представлены в виде «среднее значение ± средняя ошибка». Обработку результатов проводили при помощи программы «Biostatistika», используя для сравнения полученных выборок парный критерий Стыодента. При этом исходили из предположения, что исходные данные имеют нормальное распределение. Достоверными считали различия с р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика действия ГЦ и ГЦК на лимфоциты

Недавно методом ПЦР было показано, что лимфоциты грызунов содержат мРНК для канальной субъединицы ЫМОА-рецепторов, а лимфоциты мыши и человека способны продуцировать свободные радикалы в присутствии ЫМОА [Тунева и соавт., 2003; МаяЫипа сЧ а1., 2007]. Мы сопоставили действие КМБА, ГЦ и ГЦК на продукцию свободных радикалов лимфоцитами крысы и обнаружили, что ГЦ и ГЦК также способны увеличивать уровень свободных радикалов в этих клетках, как и NMDA. На рис. 1 видно, что при добавлении ГЦ и ЫМПА, происходит заметное смещение пика па гистограмме вдоль по оси флуоресценции ЭСГ в область более высоких значений флуоресценции.

Рис. 1.

Флуоресценция ОСР в лимфоцитах крыс в контроле (А) и после инкубации с 0,5 мМ ^ЭА (Б), 0,5 мМ ГЦ (В) и 0,25 мМ ГЦК (Г)

Взаимодействие же ГЦК с лимфоцитами сопровождается еще большим смещением пика на гистограмме в область с еще более высокой флуоресценцией ОСР, что указывает на более выраженное влияние ГЦК на свободнорадикальнуго продукцию в лимфоцитах. Временная и концентрационная характеристики действия ЫМОА, ГЦ и ГЦК на лимфоциты представлены на рис. 2 и 3.

Оказалось, что ГЦ, ГЦК и NMDA увеличивают уровень свободных радикалов в лимфоцитах в диапазоне концентраций от 0,1 до 1,0 мМ (данные концентрации соответствуют концентрациям ГЦ и ГЦК, характеризующих выраженную гипергомоцистеинемию) во временном интервале от 0 до 30 мин.

0 0,5 1

Исследуемое соединение, мМ

1,5

Рис. 2. Концентрационная зависимость действия NMDA, ГЦ и ГЦК на флуоресценцию ОСР в лимфоцитах, (инкубация 30 мин при 37°С)

О 330

11." ?80

О

и

С X £¿¿0

X ь

V о 1Я0

о к

о

о 130

с

е 80

» МЛЗА -*-ГЦК

/ ¿АХ

V ^

20 40 60

Время, мин

80

Рис. 3. Сравнение действия КМОА, ГЦ и ГЦК на флуоресценцию ОСР в лимфоцитах (концентрация агонистов 0,5 мМ, температура 37°С)

Графики концентрационной и временной зависимостей для ГЦ и 1ММОА имеют сходный характер, в то время как действие ГЦК имеет особенности: в присутствии ГЦК нарастание свободных радикалов происходит быстрее и достигает более высоких значений.

Следует отметить, что в разных опытах эффект этих соединений на уровень свободных радикалов в лимфоцитах варьировал в широких пределах. Вероятно, этот факт можно объяснить разным физиологическим состоянием самих животных и их индивидуальными особенностями.

2. Обнаружсннс функционально активных NlVIDA-pc^^eптopoв на мембране лимфоцитов периферической крови крыс

Исходя из того, что влияние ЫМГ)А па лимфоциты предотвращается антагонистом NMDA-peцeптopoв МК-801 (таблица 1) и имеется аналогия в действии на лимфоциты ЫМПА, ГЦ и ГЦК, а также прослеживается их явное

структурное сходство, можно было предположить, что на мембране лимфоцитов крыс экспрессируются функционально активные ЫМОЛ-рецепторы, обладающие способностью реагировать на ГЦ и ГЦК.

Таблица. 1. Эффект ЫМОЛ на флуоресценцию ОСТ в лимфоцитах крысы в отсутствие и присутствии МК-801 (время инкубации 30 мин). «*» - (р<0,05 по сравнению с контролем); «**» - (р<0,05 по сравнению с N^/IDA)

Условия инкубации Флуоресценция ОСР, % от контроля

Контроль 100±1

0,5 мМ ИМОА 207±3*

0,5 мМ ^ЭА+Ю рМ МК-801 105±2**

Для проверки этого предположения мы использовали моноклональные анти-ИМОЛ антитела к N1^ 1 субъединице этого рецептора (рис. 4).

Ж-

«II

ч

! Я?

ю

100

«V™ О.- )'• • •

. Л - л.* . ■

1

10

100

Флуоресценция Р1ТС-меченых анти-ЫР1 антител

Рис. 4. Вид популяции лимфоцитов в контрольных условиях (А) и после обработки клеток моноклональными антителами к N1*1 субъедипице ЫМОА-рецептора (Б). Видно, что после обработки антителами часть клеточной популяции демонстрирует более высокие значения флуоресценции, отражая присутствие на мембране этих клеток ЫК1 субъединиц NMDA-peцeптopa

На приведенном рисунке видно, что в популяции лимфоцитов, выделенных из периферической крови крыс, имеются клетки, взаимодействующие с антителами па N1^1 субъединицу NMDA-peцeптopa.

Это позволило нам угверждать, что на мембране лимфоцитов действительно присутствуют функционально активные 1ММ1)Л-рсцспторы, способные реагировать увеличением уровня свободных радикалов в ответ па добавление N№11^.

3. Исследование действия ГЦК на NlVlDA-peцe^lтopы лимфоцитов

Полученные нами данные позволяли предположить, что действие гомоцистеина и его метаболитов в кровяном русле может быть направлено на лимфоциты и реализоваться с участием глутаматных рецепторов. Для оценки этого действия мы использовали ГЦК, как соединение, эффект которого наиболее выражен.

Чтобы определить, какие классы рецепторов могут быть вовлечены во взаимодействие с ГЦК, мы использовали: МК-801 — антагонист КМОА рецепторов, который реализует свое действие, блокируя канал NMDA-рецептора; 0-АР5 — антагонист ЫМОА-рецепторов, предотвращающий связывание лигапда с рецептором (рис.5).

180 ■ 160 140 120 100 80 60 40 20 о

Нп*

**

г^П

пН

т **

.г

л?

пН*'*

/

г

Рис. 5. Действие разных антагонистов КМОА-рецепторов на флуоресценцию ЭСГ, вызванную инкубацией лимфоцитов с 0,25 мМ ГЦК (15 мин). Концентрации антагонистов: МК-801 10 цМ, 0-АР5 10 рМ.

«*» - соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05,

«**» - соответствует достоверност и относительно ГЦК с величиной р<0,05

Полученные данные указывают на то, что действие ГЦК на лимфоциты опосредовано NMDA-рецепторами. Тот факт, что оба антагониста NMDA-рецептора, МК-801 и D-AP5, предотвращают эффект ГЦК, указывает, что ГЦК не только связывается с NMDA-рецептором на мембране лимфоцитов, но и вызывает открывание канала рецептора, через который происходит вход кальция в клетку.

В связи с этим мы провели оценку изменения уровня внутриклеточного кальция в ответ на действие ГЦК. Результаты, представленные на рис. 6, указывают на то, что инкубация лимфоцитов с ГЦК приводит не только к росту свободных радикалов (как уже отмечалось выше), но и к увеличению уровня внутриклеточного кальция.

Рис. 6. Временная зависимость действия ГЦК (0,25 мМ) на стационарный уровень ионизированного кальция (оценивается по изменению флуоресценции Р1иоЗ) в лимфоцитах крыс. Инкубация при 37°С

О 10 20 30 40

Время, мин

Для выяснения того, существует ли причинная и временная связь между этими процессами, мы измерили активацию лимфоцитов в присутствии ГЦК и проникающего хелатора ионов кальция ВАРТА-АМ (ЮрМ). Оказалось, что в присутствии этого хелатора роста свободных радикалов под действием ГЦК не происходит. Этот факт позволил нам заключить, что первым (инициирующим) из этих двух процессов является рост уровня внутриклеточного кальция, а рост уровня свободных радикалов происходит только после этого.

Вход кальция в клетку может регулировать активность большого числа ферментов, что, в конечном итоге, приводит к росту свободных радикалов в лимфоцитах. Поэтому следующим этапом работы явилось выяснение того, какие ферменты вовлечены в передачу сигнала от рецепторов к внутриклеточным мишеням, обеспечивающим продукцию свободных радикалов. РКС и PI-3-киназа являются ключевыми ферментами, находящимися в начале этого регуляторного пути [Jones et al., 2000; Kashiwada et al., 2007].

4. Исследование роли РКС и PI-3-киназы в активации лимфоцтов гомоцнетеииовой кислотой

Для проверки того, что активация протеинкиназы С в лимфоцитах приводит к росту свободных радикалов в этих клетках, нами был использован активатор этой протеинкиназы ФМА, а для оценки его специфичности - специфический ингибитор РКС - хелеритрин (1С50 = 660 им) [Herbert et al., 1990] (таблица 2).

Таблица 2. Действие ингибитора РКС хелеритрина на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией лимфоцитов с ФМА. Используемая концентрация ФМА I (У1 М («*» - р<0,05 по сравнению с контролем, «**» - р<0,05 по сравнению с ФМА)

Название пробы Флуоресценция DCF, % от контроля

Контроль 100±3

ФМА 10'7М 149±2*

ФМА 10'7М + хелеритрин 10 цМ 95±5**

При добавлении к клеткам ФМА наблюдалось увеличение уровня свободных радикалов в клетке, а в присутствии хелеритрина флуоресценция ЭСР, вызванная ФМА, не увеличивалась по сравнению с контролем. Этот

факт доказывает, что в используемых нами условиях действие ФМА на РКС в лимфоцитах является специфическим.

Далее мы исследовали вовлеченность РКС в ГЦК-индуцированный рост свободных радикалов, для чего оценили влияние ГЦК на флуоресценцию ОСР в присутствии хелеритрина.

Согласно полученным данным, представленным на рис. 7, при инкубации лимфоцитов с ГЦК в присутствии двух различных концентраций хелеритрина роста уровня свободных радикалов в клетке пе наблюдается. Это свидетельствует о том, что ГЦК, взаимодействуя с лимфоцитами, запускает сигнальный каскад, ключевым ферментом которого является протеинкиназа С.

Для оценки вовлеченности Р1-3-кипазы в ГЦК-индуцироваиное увеличение уровня свободных радикалов в лимфоцитах был использован ее специфический ингибитор ЬУ 294002 (1С50 = 1,4 рМ) [УкЛов е1 а1„ 1994].

На рис. 7 видно, что ЬУ 294002 даже в концентрации, соответствующей десятикратной величине 1С50, не препятствует действию ГЦК. Таким образом, Р1-3-киназа, в противоположность РКС, не вовлекается в процесс генерации радикалов в лимфоцитах, который инициирует ГЦК.

Рис. 7. Действие ингибитора протеинкиназы С хелеритрина (Хел) и ингибитора Р1-3-киназы ЬУ294002 на флуоресценцию ОСЯ, вызванную инкубацией с 0,25 мМ ГЦК (15 мин).

«*» - соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05,

«**» — соответствует достоверности относительно ГЦК с величиной р<0,05

о 150 о

о; 140

з:

? 130

ф

5 120

О)

О- 110 о

с 100

90

¿1

-V?

-у?

» /

/ «V

5. Источники свободных радикалов при активации лимфоцитов гомоцистсиновой кислотой

Основным источником ЛФК в нейтрофилах считают НАДФН-оксидазу. Недавно в лимфоцитах был также найден этот комплекс [Jackson et al., 2004], что делало целесообразным исследование его участия в ГЦК-индуцированном росте свободных радикалов. Другим источником свободных радикалов в лимфоцитах может быть кальций-зависимая NO-сиитаза [Karupiah et al., 2000]. Возможно, в этой системе она также задействована в реализации сигнала от глутаматных рецепторов. Свободные радикалы в клетках могут образовываться и при работе дыхательной цепи митохондрий. В настоящей работе мы проверили вовлеченность всех трех вышеуказанных процессов в образование свободных радикалов при активации лимфоцитов ГЦК.

Вовлеченность НАДФН-оксидазы и NO-синтазы в генерацию свободных радикалов при действии ГЦК на лимфоциты была проверена с помощью ингибиторов НАДФН-оксидазы (апоцинипа) и NO-синтазы (N-нитроаргинина). Мы использовали различные концентрации ингибиторов, учитывая их величины IC50. Так, для апоципина IC50 = 10 цМ [Stefanska et al, 2008J, а для NNA = 0,35 рМ [Alderton et al., 2001]. На рис. 8 представлены данные по ингибированию НАДФН-оксидазы различными концентрациями апоципина. Отчетливо видно, что повышение концентрации апоцинина приводит к пропорциональному снижению эффекта ГЦК.

Для характеристики работы NO-синтазы в лимфоцитах мы использовали субстрат этого фермента L-аргинин и его ингибитор N-нитроаргинин и обнаружили, что NO-синтаза в исследуемых клетках также функционально активна и активация данного фермента снимается специфическим ингибитором NNA.

Убедившись в этом, мы исследовали вовлеченность данного фермента в эффект, вызванный ГЦК на лимфоцитах.

Рис. 8. Действие различных концентраций иигибитора НАДФН-оксидазы апоципина на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией лимфоцитов с ГЦК. «*» — соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05, «**» — соответствует достоверности относительно ГЦК с величиной р<0,05

В таблице 3 представлены данные по ингибированию NO-синтазы различными концентрациями NNA. Видно, что эффект имеет отчетливую дозовую зависимость. Из приведенных данных следует, что как апоцинин, так и N-нитроаргинин предотвращают увеличение флуоресценции, вызванное добавлением ГЦК, и эти эффекты являются дозо-зависимым. Этот факт свидетельствует, что как НАДФН-оксидаза, так и NO-синтаза участвуют в генерации свободных радикалов нри инкубации лимфоцитов с ГЦК.

Таблица 3. Действие ингибитора NO-симтазы NNA на флуоресценцию DCF, вызванную инкубацией лимфоцитов с ГЦК. «*» — соответствует достоверности относительно контроля с величиной р<0,05, «**» -достоверности относительно ГЦК с величиной р<0,05

Состав проб Флуоресценция DCF, оти. ед.

ГЦК 24±4*

ГЦК+NNA 0,7 рМ 20±3

ГЦК+NNA 3,5 цМ ю±з**

ГЦК+NNA 30 цМ

с 125

о

контроль ГЦК ГЦК+ ГЦК+ ГЦК+ ГЦК+ -е- апоцинин апоцинин апоцинин апоцинин

5мкМ ЮмкМ 20мкМ 50мкМ

Сложно сказать, какой из этих ферментов в большей степени вовлекается в ответ лимфоцитов на добавление ГЦК, поскольку и тот, и другой ингибитор почти полностью предотвращают ГЦК-индуцированное увеличение стационарного уровня свободных радикалов. Это позволяет предположить существование общего промежуточного радикала, участвующего в реализации эффекта ГЦК в лимфоцитах.

Кроме этого, мы оценили, участвует ли в исследуемом процессе дыхательная цепь митохондрий. Для этого был использован DHR 123 -флуоресцентный зонд, проникающий в митохондрии и отражающий количество свободных радикалов в них.

Оказалось, что уровень флуоресценции DHR не изменяется при инкубации лимфоцитов с ГЦК по сравнению с контрольными клетками. Следовательно, дыхательная цепь не вовлечена в процесс генерации радикалов в лимфоцитах, запускаемый ГЦК.

В результате проведенных экспериментов мы убедились, что ГЦ и ГЦК могут стимулировать рост уровня свободных радикалов в лимфоцитах, активируя NMDA-рецепторы. Однако функция образующихся при этом свободных радикалов оставалась не ясной. При анализе клеток с флуоресцентным зондом PI, в популяции не было обнаружено мертвых клеток (рис. 9), из чего следует, что образующиеся свободные радикалы в используемых условиях не приводят к окислительному стрессу клетки и ее смерти.

Опираясь па данные литературы о том, что свободные радикалы в лимфоцитах могут выполнять функции вторичных мессенджеров и приводить к изменению в иммунных функциях этих клеток [Arnold et al., 2001; Jackson et al., 2004], мы предприняли исследование того, как влияют ГЦ и ГЦК на продукцию цитокинов лимфоцитами.

А .................................................1 Б

** " Р1 1 ъ ъ * . 4 *

йСР ОСР

Рис. 9. Вид популяции лимфоцитов в контрольных условиях (А) и после инкубации с 0,25 мМ ГЦК (Б) в координатах Р1/ОСБ. Линией обозначена граница, выше которой должны находится мертвые клетки

6. Оценка продукции цитокинов лимфоцитами

Ранее в нашей лаборатории были проведены исследования по идентификации субпопуляций лимфоцитов, которые участвуют в реализации клеточного ответа па активацию глутаматпых рецепторов. С помощью специфических антител было показано, что такими клетками являются Т-лимфоциты и НК-клетки [МаБЫапа е! а1., 2007]. Об активации Т-лимфоцитов обычно судят по продукции II'"N"7 и некоторых других цитокинов [Ройт и соавт., 2000]. Поэтому мы решили оценить влияние ГЦ и ГЦК на способность лимфоцитов продуцировать различные цитокины. Были выбраны два основных цитокина, продуцируемых Т-лимфоцитами и НК-клетками - и Т№-а.

Проведенные исследования показали, что продукция №N-7 лимфоцитами, активированными Соп А, дополнительно активируется ГЦ, в то время как действие ГЦ на не активированные Соп А лимфоциты, пренебрежимо мало (рис. 10).

В этих опытах было получено, что ГЦК проявляет гораздо более слабое активирующее влияние.

Рис. 10. Влияние ГЦ на продукцию lFN-y активированными лимфоцитами. «*» - соответствует достовер!юс™ относител ы i о контроля с величиной р<0,05

Аналогичные данные были получены и нри анализе продукции ТТМР-а; ГЦ увеличивает продукцию ТЫР-а активированными клетками, и этот эффект снижается при использовании антагонистов ЫМОА-рецепторов; влияние Г ЦК выражено гораздо слабее (рис. 11).

На рис. 11 также видно, что МК-801, антагонист ЫМОА-рецептора предотвращает действие ГЦ па продукцию цитокинов лимфоцитами, свидетельствуя, что NMDA-pcцeптopы, задействованные, как мы показали, в продукции свободных радикалов в присутствии ГЦ (см. гл.1 и 3), участвуют и в регуляции этого процесса.

600

500

400

з5 300

200

100

Рис. 11. Влияние 0,5 мМ ГЦ и Ю fxM МК-801 на продукцию TNF-a активированными лимфоцитами.

«*» - (р<0,05 по сравнению с контролем), «**» - (р<0,05 по сравнению с Con А + ГЦ).

I - контроль, 2-Con А, 3 - Con А+ГЦ,

4-Con А+ГЦ+МК-801,

5-ГЦ

Возможно, что ГЦ является посредником между иммунной и нервной системами, связывая их в единую функциональную сеть.

Обращает на себя внимание и тот факт, что влияиие ГЦ и ГЦК на продукцию свободных радикалов и продукцию цитокинов неравнозначно. ГЦ вызывает меньший, по сравнению с ГЦК, рост уровня свободных радикалов в лимфоцитах, но имеет гораздо более сильное влияние на продукцию цитокинов, нежели ГЦК. Однако количественное сопоставление действия этих лигандов на 2 исследуемых процесса провести сложно вследствие неодинаковых условий эксперимента - рост уровня свободных радикалов мы наблюдаем через 15-30 мин промежуток времени, который недостаточен для измерения продукции цитокинов - их измерение проводится через 72 часа инкубации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В своей работе мы показали, что гомоцистеин, взаимодействуя с ЫМПЛ-рсцепторами на мембране лимфоцитов, увеличивает уровень кальция и свободных радикалов в клетке, что, в конечном итоге, приводит к увеличению продукции лимфоцитами 1РМ-у и ЮТ-а. В этих процессах задействованы РКС, НАДФН-оксидаза и >Ю-синтаза.

Полученные данные позволяют считать, что в кровяном русле в условиях гипергомоцистеинемии ГЦ и продукты его обмена (главным образом, ГЦК) могут оказывать систематическую стимуляцию клеток иммунной системы, тем самым истощая ее и являясь серьезным фактором риска при возникновении ряда заболеваний.

Нельзя исключить, что при нормальном уровне гомоцистеина в крови он может служить регулятором вышеназванных рецепторов, модулируя активность иммунной системы.

выводы

1. Методом иммуноцитохимического анализа выявлены ионотропные рецепторы NMDA-класса на мембране лимфоцитов периферической крови крыс.

2. ГЦ и ГЦК вызывают увеличение продукции свободных радикалов в лимфоцитах крысы через активацию NMDA-рецепторов.

3. Охарактеризованы концентрационная и временная зависимости действия ГЦ и ГЦК. Обнаружено, что увеличению внутриклеточного уровня свободных радикалов в лимфоцитах предшествует увеличение концентрации кальция.

4. В реализации эффекта ГЦК участвуют РКС, а также НАДФН-оксидаза и NO-синтаза.

5. Активация лимфоцитов в присутствии ГЦ и ГЦК приводит к усилению продукции IFN-y и TNF-a; этот эффект ослабляется в присутствии антагониста NMDA-рецепторов МК-801.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.А. Владыченская, О.В. Тюлипа, А.А. Болдырев. Влияние гомоцистеина и гомоцистиновой кислоты па глутаматные рецепторы лимфоцитов крысы. Бюлл. эксп. биол. мед., 2006,142 (№1), 47-50.

2. A.A. Boldyrev, E.R. Bulygina, O.N. Davydova, A.P. Mashkina, E.A. Vladychenskay, O.V. Tyulina. Functional role of glutamate receptors of NMDA class in immune system. Abstr. of the 29th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society (Japan, Kyoto), 2006, OS3P-3-01.

3. E.A. Vladychenskaya, O.V. Tyulina. Effect of glutamate analogs homocysteine and homocysteic acid on blood cells. Abstr. 17th ESN Meeting

«Advances in Mol Mechanisms of Neurological Disorders» (Spain, Salamanka), 2007, PS3-22.

4. E.P. Булыгина, E.A. Владыченская, A.B. Maxpo, О.В.Тюлина. Гомоцистеин как фактор риска для нервной и иммунной систем. В материалах XX съезда Физиол. общества имени И.П. Павлова (Москва), 2007, с. 21.

5. Е.А. Владыченская. Влияние гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на лимфоциты крысы. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, с. 179.

6. A.A. Болдырев, Е.А. Владыченская, Л.В. Карпова, Е.А. Брюшкова, Е.Е. Аккуратов, М.С. Беляев, И.С. Добротворская, O.A. Трунова. Роль природных факторов в защите мозга от окислительного стресса. Международная конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». Санкт-Петербург, 2008, с. 19.

7. Е. Vladychenskaya, S. Urano, A. Boldyrev. Effect of homocysteine and homocysteic acid on blood cells. Int. Symp. on lipid peroxidation (Karuizawa, Japan), 2008, P-16.

8. L. Karpova, E. Bryushkova, A. Makhro, A. Mashkina, E. Bulygina, E. Vladychenskaya, M. Stepanova, T. Fedorova, A. Boldyrev. Toxic effect of homocysteine on nervous and immune system. In Abstr. book of Ehrlich II World Conf. on Magic Bullets (Nürnberg, Germany), 2008, p. 151.

9. Е.А. Владыченская, A.A. Болдырев. Влияние гомоцистеина на дыхательный взрыв нейтрофилов, вызванный индуктором хемотаксиса 1MLP. Нейрохимия, 2009, 26 (1), 72-78.

10. Е. Bryushkova, Е. Vladychenskaya, Т. Fedorova, A. Boldyrev. Molecular mcchanisms of homocysteine toxicity. 7th Int. Conf. on Homocysteine Metabolism (Prague, Czech Republic), 2009, p.60.

Подписано в печать 25.02.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Acgis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Владыченская, Елизавета Александровна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1 Форменные элементы крови - краткая характеристика.

2.2. Гомоцистеин и гомоцистеиновая кислота.

2.3. Глутаматные рецепторы в нервной и иммунной системах.

2.3.1. Глутаматные рецепторы в нейронах.

2.3.2. Глутаматные рецепторы в лимфоцитах.

2.4. Роль свободных радикалов в нейронах и клетках крови.

2.4.1. Источники свободных радикалов в нервных клетках.

2.4.2. Источники свободных радикалов в лимфоцитах.

A) НАДФН-оксидаза - источник АФК в лимфоцитах.

Б) Участие РКС и PI-3-киназы в свободнорадикальной продукции.

B) NO-синтаза - источник радикала в лимфоцитах.

3. Материалы и методы.

3.1.Объекты исследования.

3.1.1. Выделение лимфоцитов.

3.1.2. Подсчет клеток в камере Горяева.

3.1.3. Первичная культура периферических лимфоцитов.

3.2 Методы исследования.

3.2.1. Использование проточной цитометрии для характеристики клеток.

3.2.2. Использование различных флуоресцентных зондов для характеристики клеток.

A) Измерение уровня свободных радикалов.

Б) Измерение количества ионизированного кальция.

B) Окраска лимфоцитов с помощью антител.

Г) Определение доли мертвых клеток.

Д) Связывание цитоплазматического кальция.

Е) Определение уровня свободных радикалов в митохондриях.

3.2.2. Количественное определение IFN-y и TNF-a с помощью иммуноферментого анализа.

3.2.3 Обработка результатов.

4. Результаты.

4.1. Характеристика действия ГЦ и ГЦК на лимфоциты.

4.2. Обнаружение функционально активных NMDA-рецепторов на мембране лимфоцитов периферической крови крыс.

4.3. Исследование действия ГЦК на NMDA-рецепторы лимфоцитов.

4.4. Исследование роли РКС и PI-3 киназы в активации лимфоцитов ГЦК.

4.5. Источники свободных радикалов при активации лимфоцитов ГЦК.

4.6. Влияние ГЦ и ГЦК на продукцию цитокинов лимфоцитами крыс.

5. Обсуждение результатов.

6. Выводы.

7. Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на лимфоциты"

Гомоцистеин (ГЦ) и различные продукты его окисления, в частности гомоцистеиновая кислота (ГЦК), являются факторами риска при возникновении многих сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Так, известно, что гипергомоцистеинемия (состояние, характеризующееся повышенной концентрацией ГЦ и продуктов его метаболизма в крови) может приводить к развитию атеросклероза [Refsum et al., 1998; Thambyrajah et al., 2000], к инфаркту миокарда [Stampfer et al., 1992], инсульту [Perry et al., 1995] и болезни Альцгеймера [Seshadri et al., 2002].

ГЦ, находясь в крови в избыточной концентрации, оказывает патологическое воздействие на эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры сосудов, а также на клетки крови.

Как известно, глутамат является основным нейромедиатором в центральной нервной системе, обеспечивающим передачу электрического сигнала в синапсах, которая реализуется через активацию глутаматных рецепторов. В последнее время глутаматные рецепторы вызывают особый интерес у исследователей в связи с тем, что эти рецепторы, ранее считающиеся структурами, присущими, в основном, нервной ткани, были обнаружены и в других тканях, в частности в лимфоцитах [Ganor et al., 2003; Boldyrev et al., 2004; Болдырев и соавт., 2005; Pacheco et al., 2004; Mashkina et al., 2007].

Недавно в нашей лаборатории методом ОТ-ПЦР было продемонстрировано наличие мРНК, необходимой для синтеза глутаматных рецепторов в лимфоцитах грызунов. Кроме этого, было обнаружено, что лимфоциты мыши и человека способны отвечать на добавление NMDA ростом свободных радикалов, а также ростом уровня кальция в этих клетках [Тунева и соавт., 2003; Boldyrev et al., 2004;

Болдырев и соавт., 2005]. В последнее время обнаружена способность гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты, которые могут рассматриваться как структурные аналоги глутамата, взаимодействовать с глутаматными рецепторами в нейронах [Zieminska et al., 2003; Gortz et al., 2004; Boldyrev et al., 2004].

Гомоцистеин, находясь в кровотоке, способен взаимодействовать с различными клетками крови. К настоящему времени в литературе детально не описано влияние ГЦ и ГЦК на лимфоциты, хотя известно о патологичсеких изменениях в деятельности сердечно-сосудистой системы в условиях гипергомоцистеинемии.

В связи с этим целью наших исследований стало изучение действия ГЦ и ГЦК на лимфоциты, которое предположительно может реализоваться через глутаматные рецепторы, В нашей работе мы сфокусировали свое внимание на влиянии ГЦ и ГЦК на продукцию свободных радикалов в этих клетках. Уровень свободных радикалов в клетках крови является важной характеристикой метаболического состояния клетки и его изменение служит сигнальным механизмом для запуска различных клеточных процессов, таких как дифференцировка, пролиферация, апоптоз. В качестве объекта исследования мы использовали лимфоциты крысы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Владыченская, Елизавета Александровна

6. выводы

1. Методом иммуноцитохимического анализа выявлены ионотропные рецепторы NMDA-класса на мембране лимфоцитов периферической крови крыс.

2. ГЦ и ГЦК вызывают увеличение продукции свободных радикалов в лимфоцитах крысы через активацию NMDA-рецепторов.

3. Охарактеризованы концентрационная и временная зависимости действия ГЦ и ГЦК. Показано, что увеличению внутриклеточного уровня свободных радикалов в лимфоцитах предшествует увеличение в них уровня ионизированного кальция.

4. В реализации эффекта ГЦК участвуют РКС, а также НАДФН-оксидаза и NO-синтаза.

5. Активация лимфоцитов в присутствии ГЦ и ГЦК приводит к усилению продукции IFN-y и TNF-a.

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубокую благодарность Александру Александровичу Болдыреву за качественное и ответственное научное руководство над диссертацией. Я также благодарю к.б.н. Тюлину Ольгу Владимировну и к.б.н. Булыгину Елена Романовну за неоценимую помощь в работе и поддержку. Я благодарна всем сотрудникам лаборатории нейрохимии ГУ Научного Центра Неврологии РАМН, в особенности Сергею Львовичу Стволинскому, за всестороннюю помощь и ценные рекомендации.

Выражаю особую благодарность профессору Широ Урано, и всем сотрудникам его лаборатории в Shibaura Institute of Technology (Токио, Япония), в которой была выполнена часть экспериментов по исследованию влияния гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на синтез цитокинов лимфоцитами.

И в заключении мне хотелось бы выразить благодарность всему коллективу лаборатории Болдырева А.А. на кафедре биохимии МГУ имени М.В. Ломоносова, в которой я выполнила свою курсовую, дипломную и диссертационную работы за дружескую и теплую атмосферу, понимание и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Владыченская, Елизавета Александровна, Москва

1. Алейникова Т.Л., Авдеева JI.B., Андрианова Л.Е. и соавт. (2004) Биохимия Под редакцией Е.С. Северина, Изд-во ГЭОТАР-МЕД, Москва. С. 260-261, 665-680

2. Березов Т.Т, Коровкин Б.Ф. (2002) Биологическая химия, Изд-во «Медицина», Москва. С. 296-297, 568, 599-605.

3. Болдырев А.А. (2009) Молекулярные механизмы токсичности гомоцистеина. Биохимия, 74(6), 725-736.

4. Болдырев А.А., Тунева Е.О. (2005) N-MeTmi-D-аспартат усиливает образование активных форм кислорода и активирует каспазу-3 в лимфоцитах мыши. Биол. мембраны, 22, 142-145.

5. Булыгина Е.Р., Карпова JI.B., Степанова М.С., Болдырев А.А. Экспериментальная нейрохимия (практические работы). Учебное пособие, электронная версия. 20, 23-26.

6. Галактионов В.Г. (2000) Иммунохимия, Изд-во РИЦ МДК, Москва. С. 134-139.

7. Калмыков Ю.М., Кузнецова Н.Н., Мирошниченко И.И., Птицына С.Н. (2009) Гомоцистеин предиктор патологических изменений в организме человека. Рос. Мед. Ж., 17, 224-228.

8. Костанян И. А., Наволоцкая Е. В., Нуриева Р. И., Завьялов В. П., Липкин В. М. (1997) Взаимодействие L-глутаминовой кислоты с Т-лимфоцитами человека. Биоорг. химия, 23, 805-808.

9. Марри Р., Греннер Д., Майес П., Родуэлл В. (1993) Биохимия человека, Изд-во Мир, Москва, 304-305, 335-336.

10. Maxpo A.B., Булыгина E.P., Болдырев А.А. (2007) Влияние гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на гранулярные клетки мозжечка. Нейрохимия, 1(2), 127-132.

11. Николлс Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П. А. (2003) От нейрона к мозгу. Изд-во «Едиториал УРСС», Москва. С. 65, 66, 186, 190, 297.

12. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. (2000) Иммунология. М., Мир.

13. Тунева Е.О., Бычкова О.Н., Болдырев А.А. (2003) Эффект NMDA на продукцию активных форм кислорода лимфоцитами человека. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 136(2), 159-166.

14. Alam Z., Coombes N., Waring R.H., Williams A.C., Steventon G.B. (1998) Plasma levels of neuroexcitatory amino acids in patients with migraine or tension headache. J. Neurol. Sci., 156(1), 102-106.

15. Alderton W.K., Cooper С. E., Knowles R. G. (2001) Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition Biochem. J., 357, 593-615.

16. Baier G. (2007) PKC isotype functions in T lymphocytes. Ernst. Scher. Found Symp. Proc., 3, 29-41.

17. Berman R.S., Martin W. (1993) Arterial endothelial barrier dysfunction: actions of homocysteine and the hypoxanthine-xanthine oxidase free radical generating system. Br. J. Pharmacol., 108, 920-926.

18. Berridge M.J., Bootman M.D., Lipp P. (1998) Calcium -a life and death signal. Nature, 395, 645-648.

19. Boldyrev A.A., Kazey V.I., Leinsoo T.A., Mashkina A.P., Tyulina O.V., Johnson P., Tuneva J.O., Chittur S., Carpenter D.O. (2004) Rodent lymphocytes express functionally active glutamate receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun., 324, 133139.

20. Boldyrev A.A. Homocysteinic acid causes oxidative stress in lymphocytes by potentiating toxic effect of NMDA. (2005) Bull. Exp. Biol. Med., 140(1), 33-37.

21. Brennan A.M., Suh S.W, Won S.J., Narasimhan P, Kauppinen T.M., Lee H., Edling Y, Chan P.H., Swanson |R.A. (2009) NADPH oxidase is the primary source of superoxide induced by NMDA receptor activation. Nat. Neurosci., 12(7), 857-863.

22. Burdon R.H. (1996) Control of cell proliferation by reactive oxygen species. Biochem. Soc. Trans., 24, 1028-1032.

23. Chan S.L., Lee M.C., Tan K.O., Yang L.K., Lee A.S., Flotow H., Fu N.Y., Butler M.S., Soejarto D.D., Buss A.D., Yu V.C. (2003) Identification of chelerythrine as an inhibitor of BclXL function. J. Biol. Chem, 278(23), 20453-20456.

24. Chao M.D., Chen I.S., Cheng J.T. (1998) Inhibition of protein kinase С translocation from cytosol to membrane by chelerythrine. Planta Med., 64(7), 662-663.

25. Choi D.W. (1994) Calcium and excitoxic neuronal injury. Ann. N.-Y. Acad. Sci., 747, 162-171.

26. Clarke R., Smith A.D., Jobst K.A., Refsum H., Sutton L., Ueland P.M. (1998) Folate, vitamin В12, and serum total homocysteine levels in confirmed Alzheimer disease. Arch. Neurol., 55(11), 1449-1455.

27. Collingridge G.L., Randall A.D., Davies C.H., Alford S. (1992) The synaptic activation of NMDA receptors and Ca signaling in neurons. Ciba Found Symp., 164, 162-171, 172-175.

28. Collins R.C., Dobkin B.H., Choi D.W. (1989) Selective vulnerability of the brain: new insights into the pathophysiology of stroke. Ann. Intern. Med., 110(12), 992-1000.

29. Cuenod M., Do K.Q., Streit P. (1990) Homocysteic acid as an endogenous excitatory amino acid. Trends Pharmacol. Sci.,11(12), 477-478.

30. Culcasi M., Lafon-Cazal M., Pietri S., Bockaert J. (1994)

31. Glutamate receptors induce a burst of superoxide via activation of nitric oxide synthase in arginine-depleted neurons. J. Biol. Chem., 269, 12589-12593.

32. Danysz W., Parsons C.G. (1998) Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacol. Rev., 50(4), 597-664.

33. Davies S.P., Reddy H., Caivano M., Cohen P. (2000) Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem. J., 351, 95-105.

34. Domagala T.B., Undas A., Libura M., Szczeklik A. (1998) Pathogenesis of vascular disease in hyperhomocysteinaemia. J. Cardiovasc. Risk, 5, 239-247.

35. Duan W., Ladenheim В., Cutler R.G., Kruman I.I., Cadet J.L., Mattson M.P. (2002) Dietary foliate deficiency and elevated homocysteine levels endanger dopaminergic neurons in models of Parkinson's disease. J. Neurochem., 80, 101-110.

36. Esaki Т., Hayashi Т., Asai Y., Kumar T.N., Капо H., Muto E., Iguchi A. (1997) Expression of inducible nitric oxide synthase in T lymphocytes and macrophages in vessels with advanced atherosclerosis. Heart Vessels, 12, 89-92.

37. Fenech M. (1999) Micronucleus frequency in human lymphocytes is related to plasma vitamin В12 and homocysteine. Mutat. Res., 16, 428, 299-304.

38. Gomperts В., Kramer I., Tathan P. (2003) Signal transduction, Elsevier/Academic Press, 119-125, 198-205.

39. Gortz P., Hoinke A., Fleischer W., Otto F., Schwahn В., Wendel U., Siebler M.J. (2004) Implications for hyperhomocysteinemia: not homocysteine but its oxidized forms strongly inhibit neuronal network activity. Neurol. Sci., 218, 109-114.

40. Gosh A., Greenderg M.E. (1995) Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science, 268, 239-247.

41. Grimble RF. (2006) The effects of sulfur amino acid intake on immune function in humans. J. Nutr., 136, 1660S-1665S.

42. Halliwell В., Whiteman M. (2004) Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br. J. Pharm., 142, 231-255.

43. Hardingham G.E. (2009) Coupling of the NMDA receptor to neuroprotective and neurodestructive events. Biochem. Soc. Trans., 37, 1147-1160.

44. Harriague J., Bismuth G. (2002) Imaging antigen-induced PI3K activation in T cells. Nat. Immunol., 3(11), 1090-1096.

45. Hayashi K, Altman A. (2007) Protein kinase С theta PKCtheta): a key player in T cell life and death. Pharmacol. Res., 55(6), 537-544.

46. Herbert J.M., Augereau J.M., Gleye J., Maffrand J.P. (1990) Chelerythrine is a potent and specific inhibitor of protein kinase C. Biochem. Biophys. Res. Commun., 172(3), 993-999.

47. Hildeman D. A., Mitchell Т., Teague Т.К., Henson P., Day B.J., Kappler J., Marrack P.C. (1999) Reactive oxygen species regulate activation-induced T cell apoptosis. Immunity, 10, 735-744.

48. Ignarro L.J., Gruetter C.A. (1980) Requirement of thiols for activation of coronary arterial guanylate cyclase by glyceryltrinitrate and sodium nitrite: possible involvement of S-nitrosothiols. Biochim. Biophys. Acta, 631, 221-231.

49. Irani K., Xia Y., Zweier J. L., Sollott S. J., Der C.J., Fearon E.R., Sundaresan M., Finkel Т., Goldschmidt-Clermont P.J. (1997) Mitogenic signaling mediated by oxidants in ras-transformed fibroblasts. Science, 275, 1649-1652.

50. Jackson S.H., Devadas S., Kwon J., Pinto L.A., Williams M.S. (2005) T cells express a phagocyte-type NADPH oxidase that is activated after T cell receptor stimulation. Nat. Immunol., 5(8), 818827.

51. Jeremy J.Y., Rowe D., Emsley A.M., Newby A.C. (1999) Nitric oxide and the proliferation of vascular smooth muscle cells. Cardiovasc. Res., 43, 580-594.

52. Jia L., Furchgott R.F. (1993) Inhibition by sulfhydryl compounds of vascular relaxation induced by nitric oxide and endothelium derived relaxing factor. J. Pharmacol. Exp. Ther., 267, 371-378.

53. Jing D., Xian W. (2007). Immunoregulatory effects of homocysteine on cardiovascular diseases. Act. Physiologic. Sin., 59 (5), 585-592.

54. Jones O. T.G., Hancock J. T. (2000). Free radicals and inflammation (Blake P.R. and Evans C.H., Eds.) Switzerland.

55. Joyal J. L., Burks D.J., Pons S., Matter W.F., Vlahos C.J., White M.F., Sacks D.B. (1997) Calmodulin activates phosphatidylinositol 3-kinase. J. Biol. Chem., 272, 28183-28186.

56. Karupiah G., Hunt N.H., King N.J., Chaudhri G. (2000) NADPH oxidase, Nrampl and nitric oxide synthase 2 in the host antimicrobial response. Rev. Immunogenet., 2(3), 387-415.

57. Kashiwada M., Lu P., Rothman P.B. (2007) PIP3 pathway in regulatory T cells and autoimmunity. Immunol. Res., 39(1-3), 194-224.

58. Kawakami N., Takemasa H., Yamaguchi Т., Hayakawa Т., Shimohama S., Fujimoto S. (1998) Indication of a protein kinase C-independent pathway for NADPH oxidase activation in human neutrophils. Arch. Biochem. Biophys., 349(1), 89-94.

59. Kim J.P., ICoh J.Y., Choi D.W. (1987) L-homocysteate is a potent neurotoxin on cultured cortical neurons. Brain Res., 437(1), 103-110.

60. Kim W.K. (1996) S-nitrosation ameliorates homocysteine-mediated neurotoxicity in primary culture of rat cortical neurons. Korean J. Pharmac. (South Korea), 32, 169-175.

61. Kim W.K., Рае Y.S. (1996) Involvement of N-methyl-D-aspartate receptor and free radical in homocysteine-mediated toxicity on rat cerebellar granule cells in culture. Neurosci. Lett. 216, 117-120.

62. Kobayashi S., Imajoh-ohmi S., Nakamura M., Kanegasaki S. (1990) Occurrence of cytochrome b558 in В cells lines of human lymphocytes. Bl., 74, 458-461.

63. Koponen S., Kurkinen K., Akerman K.E., Mochly-Rosen D., Chan P.H., Koistinaho J. (2003) Prevention of NMDA-induced death of cortical neurons by inhibition of protein kinase Czeta. J Neurochem., 86(2), 442-450.

64. Krogsgaard-Larsen P., Hansen J.J. (1992) Excitatory amino acid receptors design of agonists and antagonists, 13-17, 18.

65. Kruman, I.I., Culmsee, C., Chan, S.L., Kruman, Y., Guo, Z., Penix, L., Mattson, M.P. (2000) Homocysteine elicits a DNA damage response in neurons that promotes apoptosis and hypersensitivity to excitotoxicity. J. Neurosci., 20, 6920-6926.

66. Kwon J., Devadas S., Williams M.S. (2003) T cell receptor-stimulated generation of hydrogen peroxide inhibits MEK-ERK activation and lck serine phosphorylation. Free Rad. Biol. Med., 35(4), 406-417.

67. Lombardi G., Dianzani C., Miglio G., Canonico P.L and Fantozzi R. (2001) Characterization of ionotropic glutamate receptors in human lymphocytes. British J. Pharmacol., 133, 936-944.

68. Lombardi G., Miglio G., Dianzani C., Mesturini R., Varsaldi F., Chiocchetti A., Dianzani U., Fantozzi R. (2004) Glutamate modulation of human lymphocyte growth: in vitro studies. Biochem. Biophys. Res. Commun., 318(2), 496-502.

69. Loscalzo J. (1996) The oxidant stress of hyperhomocyst(e)inemia. J. Clin. Invest., 98, 5-7.

70. Maron B.A., Loscalzo O. (2009) The treatment of hyperhomocysteinemia. Annu. Rev. Med., 60, 39-54

71. Mashkina A., Tyulina O., Solovyova Т., Kovalenko E., Kanevski L., Johnson J., Boldyrev A. (2007) The excitotoxic effect of NMDA on human lymphocyte immune function. Neuroch. Int., 51, 356-360.

72. Mattson M.P., Shea T.B. (2003) Folate and homocysteine metabolism in neural plasticity and neurodegenerative disorders. Trends Neurosci., 26(3), 137-146.

73. Mattson, M.P., Kruman, I.I., Duan, W. (2002) Folic acid and homocysteine in age-related disease. Ageing Res. Rev., 1(1), 95111.

74. Mayer M.L., Miller R.J. (1990) Excitatory amino acid receptors, second messengers and regulation of intracellular Ca" in mammalian neurons. Trends Pharmacol. Sci., 11(6), 254-260.

75. Mayer M.L., Westbrook G.L. (1987) Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cationes in mouse cultured central neurons. J. Physiol., 394, 500-527.

76. McCully K.S., Wilson R.B. (1975) Homocysteine theoiy of arteriosclerosis. Atherosclerosis 22, 215-227.

77. Michaels R.L., Rothman S.M. (1990) Glutamate neurotoxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations. J. Neurosci., 10, 283-292.

78. Miglio G., Varsaldi F., Lombardi G. (2005) Human T lymphocytes express N-methyl-D-aspartate receptors functionally active in controlling T cell activation. Biochem. Biophys. Res. Commun, 338(4), 1875-1883.

79. Moilanen E., Vapaatalo H. (1995) Nitric oxide in inflammation and immune response. Ann. Med., 27(3), 359-367.

80. Muijsers R.B.R., Worm E.v.D., Folkerts G., Beukelman C.J., Koster A.S., Postma D.S., Nijkamp F. P. (2000) Apocynin inhibits peroxynitrite formation by murine macrophages. Br. J. Pharmacol., 130(4), 932-936.

81. Mutus В., Rabini R.A., Staffolani R., Ricciotti R., Fumelli P., Moretti N. (2001) Homocysteine-induced inhibition of nitric oxide production in platelets: a study on healthy and diabetic subjects. Diabetologia, 44, 979-982.

82. Nagy G., Koncz A., Perl A. (2003) T cell activation-induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca and redox dependent production of nitric oxide. J. Immunol., 171, 5188 -5197.

83. Obeid R., Herrmann W. (2006) Mechanisms of homocysteine neurotoxicity in neurodegenerative diseases with special reference to dementia. FEBS Lett., 580(13), 2994-3005.

84. Obeid R., Schorr H., Eckert R., Herrmann W. (2004) Vitamin В12 status in the elderly as judged by available biochemical markers. Clin. Chem. J., 50(1), 238-241.

85. Olney J.W., Price M.T., Salles K.S., Labruyere J., Ryerson R., Mahan K., Frierdich G., Samson L. (1987) L-homocysteic acid: an endogenous excitotoxic ligand of the NMDA receptor. Brain Res. Bull., 19(5), 597-602.

86. Ostanin D.V., Barlow S., Shukla D., Grisham M.B. (2007) NADPH oxidase but not myeloperoxidase protects lymphopenic mice from spontaneous infections. Biochem. Biophys. Res. Commun., 355(3), 801-806.

87. Pacheco R., Ciruela F., Casado V., Mallol J., Gallart Т., Lluis C., Franco R. (2004) Group of metabotropic glutamate receptors mediates a dual role of glutamate in T cell activation. J. Biol. Chem., 279,33352-33358.

88. Pani G., Colavitti R., Borrello S., Galeotti T. (2000) Redox regulation of lymphocyte signaling. IUBMB Life, 49(5), 381389.

89. Pellegrini-Giampietro D.E. (2003) The distinct role of mGluj receptors in post-ischemic neuronal death. Trends Pharmacol. Sci., 9, 461-470.

90. Perkinton M.S., Ip J.K., Wood G.L., Crossthwaite A.J., Williams R.J. (2002) Phosphatidylinositol 3-kinase is a central mediator of NMDA receptor signaling to MAP kinase (Erkl/2), Akt/PKB and CREB in striatal neurons. J. Neurochem., 80(2), 239254.

91. Perry I.J., Refsum H., Morris R.W., Ebrahim S.B., Ueland P.M., Shaper A.G. (1995) Prospective study of serum total homocysteine concentration and risk of stroke in middle-aged British men. Lancet, 346, 1395-1398.

92. Peterson J.R., Sharma R.V., Davisson R.L. (2006) Reactive oxygen species in the neuropathogenesis of hypertension. Curr. Hypertens. Rep., 8(3), 232-241.

93. Purves D., Augustine G.J., Fitzpatrick D., Katz L.C., Lamantia A-S., McNamara J., Williams S.M. (2001) Neuroscience (2nd edition), 176-177, 547.

94. Ravaglia G., Forti P., Maioli F., Martelli M., Servadei L., Brunetti N., Porcellini E., Licastro F. (2005) Homocysteine and folate as risk factors for dementia and Alzheimer disease. Am. J. Clin. Nutr., 82(3), 636-643.

95. Refsum H., Ueland P.M., Nygard O., Vollset S.E. (1998) Homocysteine and cardiovascular disease. Annu. Rev. Med., 49, 3162.

96. Reiling N., Kroncke R., Ulmer A.J., Gerdes J., Flad H.D., Hauschildt S. (1996) Nitric oxide synthase: expression of the endothelial, Ca /calmodulin-dependent isoform in human В and T lymphocytes. Eur. J. Immunol., 26 (3), 511-516.

97. Robert K., Pages C., Ledru A., Delabar J., Caboche J., Janel N. (2005) Regulation of extracellular signal-regulated kinase by homocysteine in hippocampus. Neuroscience, 133(4), 925-935.

98. Rodionov R., Lentz S.R. (2008) The homocysteine paradox. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 28(6), 1031-1033.

99. Sauer D., Fagg G.E. (1992) in "Excitatory amino acid receptors. Desing of agonists and antagonists" (Krogsgaard-Larsen P. and Hansen J.J. Eds.) Ellis Horwood, Chichester, pp. 13-34.

100. Seshadri S., Beiser A., Selhub J., Jacques P.F., Rosenberg I.H., D'Agostino R.B., Wilson P.W.F., Wolf P.A. (2002) Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 346, 476-483.

101. Signorello M. G., Pascale R., Leoncini G. (2002) Effect of homocysteine on arachidonic acid release in human platelets. Eur. J. Clin. Invest., 32, 279-284.

102. Singh S.S., Chauhan A., Brockerhoff H., Chauhan V.P. (1993) Activation of protein kinase С by phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 195(1), 104-112.

103. Stamler J.S., Osborne J.A., Jaraki O., Rabbani L.E., Mullins M., Singel D., Loscalzo J. (1993) Adverse vascular effects of homocysteine are modulated by endothelium-derived relaxing factor and related oxides of nitrogen. J. Clin. Invest., 91, 308-318.

104. Stampfer M.J., Malinow M.R., Willett W.C., Newcomer L.M., Upson В., Ullmann D, Tishler P.V., Hennekens C.H. (1992) A prospective study of plasma homocysteine and risk of myocardial infarction in US physicians. J. Am. Med. Assoc., 268, 877-881.

105. Starkebaum G., Harlan J.M. (1986) Endothelial cell injury due to copper-catalyzed hydrogen peroxide generation from homocysteine. J. Clin. Invest., 77, 1370-1376.

106. Stefanska J., Pawliczak R. (2008) Apocynin: molecular aptitudes. Mediators Inflamm., 2008, 106507.

107. Suh Y.A., Arnold R.S., Lassegue В., Shi J., Xu X., Sorescu D., Chung A.B., Griendling K.K., Lambeth J.D. (1999) Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl. Nature, 401, 79-82.

108. Sundaresan M., Yu Z.X., Ferrans V.J., Sulciner D.J., Gutkind J.S., Irani K., Goldschmidt-Clermont P.J., Finkel T. (1995) Regulation of reactive-oxygen-species generation in fibroblasts by Racl. Biochem. J., 318, 379-382.

109. Sung F.L., Slow Y.L., Wang G., Lynn E.G., О К. (2001) Homocysteine stimulates the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in endothelial cells leading to enhanced monocyte chemotaxis. Mol. Cell Biochem., 216, 121-128.

110. Sweeney J.F., Nguyen P.K., Atkins K.B., Hinshaw D.B. (2000) Chelerythrine chloride induces rapid polymorphonuclear leukocyte apoptosis through activation of caspase-3. Shock, 13(6), 464-71.

111. Thambyrajah J., Townend J.N. (2002) Homocysteine and atherothrombosis — mechanisms for injury. Eur. Heart, 21, 967-974.

112. Upchurch G.R., Jr., Welch G.N., Fabian A.J. (1997) Homocysteine decreases bioavailable nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase. J. Biol. Chem., 272, 17012-17017.

113. Van den Berg M., van der Knaap M.S., Boers G.H., Stehouwer C.D., Rauwerda J.A., Valk J. (1995) Hyperhomocysteinaemia with reference to its neuroradiological aspects. Neuroradiol, 37, 403-411.

114. Verhoef P., Stampfer M.J., Buring J.E., Gaziano J.M., Allen R.H., Stabler S.P., Reynolds R.D., Kok F.J., Hennekens C.H.,

115. Willett W.C. (1996) Homocysteine metabolism and risk of myocardial infarction: relation with vitamins B6, В12, and folate. Am. J. Epidemiol., 1, 143(9), 845-859.

116. Vig M., Kinet J.P. (2009) Calcium signaling in immune cells. Nat. Immunol., 10(1), 21-7.

117. Vlahos C.J., Matter W.F., Hui K.Y., Brown R.F. (1994) A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-l-benzopyran-4-one (LY294002). J. Biol. Chem., 18, 269(7), 5241-5248.

118. Wall R.T., Harlan J.M., Harker L.A., Striker G.E. (1980) Homocysteine induced endothelial cell injury in vitro: a model for the study of vascular injury. Thromb. Res., 18, 113-121.

119. Wan K.F., Chan S.L., Sukumaran S.K., Lee M.C., Yu V.C. (2008) Chelerythrine induces apoptosis through a Bax/Bak-independent mitochondrial mechanism. J. Biol. Chem., 283(13), 8423-8433.

120. Watkins D., Rosenblatt D.S., (1989) Functional methionine synthase deficiency (cdlE and cbIG): clinical and biochemical heterogeneity. Am. J. Med. Genet., 34, 427-434.

121. Williams M.S., Henkart P.A. (1996) Role of reactive oxygen intermediates in TCR-induced death of T cell blasts and hybridomas. J Immunol., 157(6), 2395-2402.

122. Williams S., Kwon J. (2004) T-cell receptor stimulation, reactive oxygen species, and cell signaling. Fr. Rad. Biol. Med., 37, 1144-1141.

123. Wolos J.A., Frondorf K.A., Davis G.F., Jarvi E.T., McCarthy J.R., Bowlin T.L. (1993) Selective inhibition of T cell activation by an inhibitor of S-adenosyl-l-homocysteine hydrolase. J. Immunol. 150, 3264-3273.

124. Xiao L., Eneroth P.H., Qureshi G.A. (1995) Nitric oxide synthase pathway may mediate human natural killer cell cytotoxicity. Scand. J. Immunol., 42(5), 505-511.

125. Yaname H., Fukunaga Т., Nigorikawa K., Okamura N., Ishibashi S. (1999) Pervanadate activates NADPH oxidase via protein kinase C-independent phosphorylation of p47-phox. Arch. Biochem. Biophys., 361(1), 1-6.

126. Yang Q., Botto L.D., Erickson J.D., Berry R.J., Sambell C., Johansen H., Friedman J.M. (2006) Improvement in stroke mortality in Canada and the United States, 1990 to 2002. Circulation, 113(10), 1335-1343.

127. Zeng X., Dai J., Remick D.G., Wang X. (2003) Homocysteine mediated expression and secretion of monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-8 in human monocytes. Circ. Res., 93, 311-320.

128. Zhang D., Lipton S.A. (1992) L-homocysteic acid selectively activates N-methyl-D-aspartate receptors of rat retinal ganglion cells. Neurosci Lett., 139(2), 173-177.

129. Zhang Q., Zeng X., Guo J., Wang X. (2002) Oxidant stress mechanism of homocysteine potentiating Con A-induced proliferation in murine splenic T lymphocytes. Cardiovasc. Res., 53(4), 1035-1042.

130. Zieminska E, Stafiej A, Lazarewicz JW. (2003) Role of group I metabotropic glutamate receptors and NMDA receptors in homocysteine-evoked acute neurodegeneration of cultured cerebellar granule neurons. Neurochem. Int., 43(4-5), 481-492.