Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование действия экстремальных факторов на микроорганизмы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование действия экстремальных факторов на микроорганизмы"

Г/

/

АКАДЕМИЯ НАУК. СССР____

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

МУРЗАКОВ БОРИС ГЕРАСИМОВИЧ

УДК 573.5:579.043 + 631.46

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

(специальность 03.00.07 — микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

и0ишсииуи4 '

Москва—1987 г.

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР.

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН УССР, профессор Е. И. Андреюк, доктор биологических наук, профессор И. Л. Работнова, доктор физико-химических наук С. И. Аксенов.

Ведущая организация — Институт медико-биологических проблем Министерства здравоохранения СССР.

Защита состоится « » _1987 г, на

заседании специализированного совета Д.002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР по адресу: 117811, Москва, В-811, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2, Институт микробиологии АН СССР в _ч._мин.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан « »_198 г.

Ученый секретарь специализированного совета, канд. биол. наук,

старший научный сотрудник Л. Н. Москаленко

: ИГ'З »

! АКАДЕМИЯ HOT СССР

р4ссертадии I ИЕСТЮТ ШЖРОШЭДЮШ

На оравах pjxonaca

ШТЗШВ Борзо Гарасшдавач

УДК 573.5:579.043i6SI.43

ИССВДОВАНИЕ ДЕЙШИЯ ЖСТРШЛЬВЫ! SAKTOPOB Ш. Ш5КР00ШНИЕШ

(споцпальнооть ОЗ.00,07-штро<3аалотш )

Автореферат дассортадан на сопсканно учоноа отапока доктора баологачасках ваук

}4оскез - 1987 г.

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР.

Офгцяальные оппоненты: член-корреспондевг АН УССР, профессор

Е.Н.АНДРЕШ

доктор биологаческих наук, профессор И.Л.РАВОТНОВА.

доктор физико-математических наук С, И, АКСЕНОВ.

Ведущая организация: Институт ывякко-баологнческюс проблем Министерства здравоохранения СССР.

Защита состоится **_" ________ 198_г. на заседании

специализированного совета Д.002.64.01 при Институте иакробио-логш АН СССР по адресу: 1Г78Ы, Москва B-8II, Проспект 60-лэ-тия Октября, д.7,корп.2, Институт макробиологии АН СССР.

С диссертацией моашо ознакомиться в библиотека Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан " "_198_г.

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема существования еизпи в экстремальных условиях является одной из центральных пройдем биология.

Актуальность изучения действия экстремальных факторов на микроорганизмы диктуется необходимостью получения теоретических и экспериментальных данянх о граннщх вьшаваемости шшроорганиаиов, о длительности сохранения гш низкеспособносги и о механизмах адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среди обитания. Эти данные позволяют познать защитные реакции организмов, ответственные за устойчивость 1С экстремальным воздействиям. На их основа эколога вносят постоянные коррективы в суждения о крайних границах биосферы, в познание сущности жизни. Вопроси, рассматриваемые в диссертации, шеют непосредственное отношение к проблемам существования иноземной яазни. Особая актуальность предается изучению действия экстремальных факторов, имеющихся па других планетах н воспроизводимых экспериментально в специальных установках, на различные группы микроорганизмов. Общие закономерно ста приспособления живых систем к комбинированному воздействии различных экстремальных факторов (как имеющихся в природе, так я создаваемых в лаборатории) служат одним из главных аргументов в пользу существования внеземной жизни. В свою очередь, данные зкзобиологни имеет непосредственное отношение к решению общей проблемы современного естествознания - проблеме происхождения и распространения етвки во Вселенной, представляющей огромное философское и биологическое значение.

Состояние вопроса, шли, задачи. Литературные данные свидетельствуют о тш, что многие микроорганизмы характеризуются высокой устойчивостью к экстремальным условиям среды (температура, рН„ еь 8 радиация, давление и т.п.), широким разнообразием рэ-аквзй, используемых для нукд енэргетаческого а конструктивного обмена, что позволяет им развиваться в условиях, практически исключающх возможность, существования других известных форм ставя.

Вместе с теы необходимо откатить, что, несмотря на огрогшнй интерес к проблема существования жизни в экстремальных условиях, данная проблема изучена все еще в недостаточно полном объема.

Имеющиеся данные не позволяют составить представления об естикных резервных возможностях организмов; слабо изучены особенности приспособления микробов к действию накис факторов, как различный газовый состав атмосферы, шзкая влажность среды» низкое барометрическое давление» присутствие каталитически активных шнэралове высокие концантрацаа дарекиса водорода и т.д. Недостаточное вншанае уделено изучению действия комплекса экстро-кальных факторов на микроорганизмы.

В связи с неопределенностью данных» полученных станциям йЕшшигя ярд биологическом изучении Марса» в значительной шра ослаб интерес к зкзобнологачекош исследованиям. Однако, дополнительная пнфорзация о физических и ХЕмачвсхсшс параметрах Марса побуждает в ином аспекте изучить вероятность существования шж-робной лизни. в марсианском грунте как возможной уникальной экологической ниша, не встречающейся в природных условиях на Земдв.

Актуальность всех перечисленных вопросов н обусловила вкб-рашгш дели к задача проведенных исследований. Диссертация относится к новому направлению в микробиологии ~ эхсологяи экстре-шльнкх сред обитаяяя дакрооргаяизыов.

. Паяв и задачи. Б связи о вывшэшкеннш основная даль настоящей работы заключалась в том, чтобы изучсть жизнеспособность етфоорганнзмов в-экстремальных гошштачаскнх и фззшсо-хвшческих условиях» близких к марсиансшш» и теоретически обобщать.аксп&-рпкзнтаяьнце данные относительно возшашости существования внеземной *яаш. Для изучения выгиваэкостк микроорганизмов выбраны наиболее характерные клаштичасасяе факторы: циклы зашраяивания-отганвания, шзкоэ давлеше4 высокая ультрафиолетовая радиация, угаекаеяотная атмосфера» наэная влажность,, а также воздействие каталитически активных природных минералов и высоких концентраций перекоса водорода. Выбор данных факторов бал предопределен тви, та па Марсе шатав ез перечисленных Акторов обнаружены в ходе космических исследований. Чтобы достичь поставленной цалн, планировалось решить следувдяе задачи:

- разработать методы и создать аппаратуру для воспроизведения в лабораторных условиях перечисленных выше экстремальных факторов и воздействовать ими на бактерии, относящиеся к отдельным физиологическим группам;

- изучить фазЕкьхишчвсяш кегодн, асаольэувына в зколоки гакроорганизмов, я разработать лриящпы ах применения для общ-роевая ?зщ>ооргаввзюв в акотрешлышт .условиях среда ойаташш}

- изучить динамику роста* размножения а катаболизма микроорганизмов при действия на них шягрбмаяьннх доз таких факторов, лав шзкая влажность, преобладание в атмосфере углекислого газа, нрисуЕсяше в шгаагвльншс средах ватшшжачаввя акгивншс манера-лов и высоких концентраций перекиси водорода;

- с зетэдьзо модальных отлов изучить механизмы, спссойствуз-ер5в вишваеыостп микроорганизмов в экстремашпа условиях» еоо-проявводимых в эксперименте;

- создать лабораторные аналоги марсианского грунта и провоста эксперименты по моделированию биологических исследований Марса, осуществленных но программе "Викинг";

~ экспериментально доказать* но шрсианскай грунт пригоден для обитания микроорганизмов»

Научная,.ядвиз;а к значимость. Комплекс вопросов, решенных в диссертации, направлен на развитие одного из совремелних разделов микробиологии - экологии экстремальных сред обитания микроорганизмов. Задачей донного направления является изучение вши-ваеглостз микроорганизмов при действии на них экстремальных ш-матачоских а других абиотических «факторов, встречавдихся как в естественных условиях, так и воспроизводимых в лаборатория. Цель исследований состоит в определении резервных возможностей кякроб-ной клетки, а такге в установлении экологических границ жззнн на Зеылв я других планетах.

На основе новейшх данных о Марсе создана камора "искусственный Марс", поэвилян^щш воспроизводить комплекс основных факторов, опредбдшиих климат планеты: суточный "ход" температур, низкое барометрическое давление, газовый состав атмосферы, высокое ультрафиолетовое излучение, низкая плавность грунта. В сочетании с каталитической активность» аналогов гранта, создавши; в лаборатория, давние параметры впервые в максимальной объеме воссоздают условяя существования гипотетической ыареганокоа шкрофяоры.

Получены новые данные о влияние комплекса экстремальных факторов и отдельных из них на различные группы микроорганизмов.

причем показано, что при комплексных экстремальных воздействиях стабильность микробных популяций может повышаться за счет антагонистических взаимодействий отдельных факторов. Установлено, что токсическое действие перекиси водорода снижается в присутствии каталитически активных железосодержащих минералов; в совокупности с этюда минералами углекислый газ способствует обогащению микробных популяцай спорообразувдями бактериями. Впервые сформулировано полсжени о сопряженности некоторых фязиодого-вкологических свойств микроорганизмов» обусловленном синэргичв-скиы взаимодействием экстремальных факторов; его суть состоит в том, что экстремальное воздействие, направленное на выявление того или иного еколого-физиологаческого свойства микроорганиз-шв (например, температурной устойчивости), способствует выявлению другого сопряженного свойства, прямо необусловленного данным воздействием (например, ксерофитности). По-видимому, это положение имеет общебиаяогическое значение.

Впервые получены данные о жизни оллготрофных бактерий при суммарном воздействии факторов в камере "искусственный Марс". Зашдяенный тип обмена у этой группы микроорганизмов не является основным критерием, опредеяявдим их реакодв на внешние экстремальные воздействия.

Изучение влияния отдельных экстремальных факторов показало, что ведущим климатическим фактором» регулирующим распространенность микроорганизмов в природных и модельных системах, является влажность. Впервые из почвы холодной пустыни острова Диксон выделен макроскопический гриб Feniciiiiuw adametzii , сохраняющий жизнеспособность при влажности, близкой к максимальной гигроскопической, и растущий при aw = 0,55. Представлены данные о том, что перекись водорода в умеренных концентрациях оказывает на популяции накроорганизмов двоякое действие: она может быть токся-чэсшш агентом для каталазоотрицатальных организмов, но вместе о тем при es разложении усиливается аэращш и стимулируется рост аэробных микроорганизмов. Сделан вывод о тоы, что каталитическая активность марсианского грунта в совокупности с климатическими условиями не исключает возможности существования на данной планете шкробной жизни. Экспериментально установлено, что положительные результаты, полученные станкиякд "Викинг", могут быть объяснены как биологическими, так а химическими процессами;'

ото на позволило сделать определенный вывод о присутствия илн отсутствии жизни на этой маната. Подчеркнуто, что такие физико-химические методы, как нефелометрия, рН-ыетрия, спектропаляри-кетрия, радиореспирометрия, пиролиз-газовая хроматография куль-туралышх жидкостей я другие, могут в комплексе о методом концентрирования микроорганизмов на поляризуемых носителях достоверно обнаружить микроорганизмы в почвах и грунтах, обладащих каталитической активностью.

Практическая ценность. Разработанные в диссертации методологические и методические прянщпы обнаружения микробной лизни в экстремальных условиях создает основы для создания и применения автоматических приборов дош контроля состояния окружающей среды и в космобиодогических целях. Трудности, связанные с обнаружением дисперсно распределенных шкроорганазмов в природных средах могут быть преодолены при применении метода эдектроудеран-вания макроорганизмов на поляризуемых материалах. Основные принципы создания установок для воспроизведения комплекса экстремальных факторов стимулируют развитие исследований по изучению резервных возможностей микроорганизмов, представляющих я.терес а различных отраслях народного хозяйства.

Данные о сохранении жизнеспособности микроорганизмов при высоких концентрациях перекиса водорода требуют изменения асептических норм, основанных на применении этого вещества в медицине. Так как проведенные исследования показывают, что микроорганизмы обладает значительной устойчивостью к воздействию экстремальных факторов, подчеркнута необходимость проведения жесткой стерилизация космических аппаратов, направляемых на другие планеты, а также осуществления всех возможных карантинных мероприятий при возвращении их на Зе1ша.

Апробашя работы. Материалы диссертация доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета Института микробиологии АЛ СССР (1980, 1983 гг.), на научной конференции отделов ИЯ^И АН СССР (1981 г.), на методологическом (философском) семинаре ШШ АН СССР (1985 г.), на сессиях Международного Комитета по космическим исследованиям (КОШАР): Д!) в Ленинграде (1970 г.), ХУТ в Констанце (ФРГ, 1973 г.); ПХ в Лоо-Анда&лвсе (США, 1Ш г.). Ш в Инсбруке (Австрия, 1978 г.), ХХП в Банголоре (Индия,1979г.), ХХШ в Будапеште (Венгрия, 1980 т.), а также па X Международной

биофизическом конгрессе в Москве (1972 г.)» на Международных симпозиумах по биологии почв в Шопрснв (Венгрия, I972, 1985 гг.), на УП съезде Всесоюзного микробиологического общества в Алма-Ате (1265 г.).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 38 наунных работах.

Основные защищаемые положения диссертации.

Моделирование в лаборатории климатических экстремальных факторов и воздействие ими на почвенную микрофлору позволяет обнаруживать и выделять микроорганизмы, устойчивые к этим воздействиям.

Присутствие микроорганизмов, дисперсно распределенных в экстремальных природных и модельных системах, монет быть достоверно обнаружено общепринятыми физико-химическими методами после концентрирования микрофлоры на поляризуемых носителях с помощью аяектроудерживания.

В природе обитает микроорганизмы, выниваюоде при действии на них климатических факторов, имеющихся на Марсе.

Мшдзооргаяизыы способны расти и размножаться в почвах и модельных системах, содержащих жалезосодераавдае минералы и высокие концентрации перекиса водорода.

Замедленный тип оСмена у олиготрофных бактерий не является доминирушам фактором, опредаляицам реакцав данной группы микроорганизмов на внешние экстремальные климатические воздействия.

Подсдагаельные результаты, переданные станциями "Викинг", могут быть объяснены как биологическими процессами» так и химическими реакциями.

Марсианский грунт с точки зрения микробиологии - еозиое-вая уникальная экологическая нша.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из "Введения", 15 глав, сгруппированных в три раздела, выводов и списка литературы. В конце диссертации помещается "Обсуждение", в котором обобщается теоретические и экспериментальные исследования. Материал: изложен на 299 страницах учетного машинописного текста,

включает 21 таблицу и 90 рисунков. Список литературы на 61 страница содержит 680 ссылок на иностранных: (440) и русском (240) языках.

Место проведения исследований. Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР, в отделе экспериментальной изыенчиво-кя микроорганизмов (впоследствии отдел физиологии мутантов микроорганизмов), возглавляемом академиком А.А.Ишганещим. Б проведении лабораторных работ принимали участие И.К.Дорофеева, М.Д.Евдокимова, Л.А.Кузюрина, В.М.Якшина, которым автор выражает глубокую благодарность. Планирование а постановка совнестных экспериментов осуществлялась по инициативе автора. Результаты данных исследований оформлены в виде совместных публикаций.

Автор приносит глубокую и искреннюю благодарность академику А.А.Имшенецкому за интерес и внимание к работе, помощь в организации исследований и обсуждении результатов экспериментов.

Содержание работы.

Изложению литературных и экспериментальных данных предшествует "Введение", в котором сформулированы основные понятия и определения, используемые в диссертации, классифицирована терминология.

В диссертации развиваются представления о том, что термин "экстремальный фактор" подразумевает такие дозы отдельного физического дли химического фактора, действующего на конкретный вид микроорганизмов, которые, ограничивая активную жизнедеятельность (рост, размножение, метаболизм) организма, обусловливают его консервацию в виде переживающих форм. Экстремально вцрааен-нне факторы такого типа как в отдельности, так и в комбинациях и их совокупности превалируют в жарких пустынях и в пустынях Антарктики, высокогорных районах, в верхних слоях атмосферы, а также на некоторых планетах Солнечной системы (Марсе, Вэнеро, Юпитере). Ыпогае из этих факторов воспроизводятся но замыслу исследователя' в специальных камерах з приборах.

ЧАСТЬ I.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Дридачвнца фукт<?йшгаи ад^рр^одотвсто МвУОДРЙ В ЩШУМ №Р99РУади^09 Я В экзобиологии.

Обобщен обширный литературный материал по применение в лабораторных и полевых исследованиях функциональных микробиологических (нефелометрия, рН-ыатрия.поляриметркя, определение желе-зопорфирзшовых белков, АТФ-ыетрия, радиометрия, калориметрия, определение 180 и %, газохроыатографаческое определение летучих метаболитов) и функциональных биогеохишческих ("дыхание почвы* по определении 14С02, фото- и гетеротрофная ассимиляция 14С02 и ^О, газообмен в система "почва-атмосфера") методов.

Глава 2, Макробиология пряррдшяс сред, подвергнут^ воздействию -экстремальных Факторов.

Приведены литературные данные о распространения микроорганизмов в экстремальных условиях, амащяхея в зеьшой биосфере (Арктические е Антарктические районы, почвы яарких пустынь, верхние слон-'атмосферы, морские глубины и т.д.), обсуждены различные механизмы устойчивости микрофлоры к низкой влажности, чередующимся пдаам зааораязшзния - оттаивания, низкому атмосферному давлению, ультрафиолетовой и ионазарувдей радиация.

- II -

Глава 2, Экология ;шкшоргптаз?лов а поующ внеземной

мша«

Рассмотрены дянтоо о возможности. еущэсгвоваягя гизнк на других планетах, условия на которых экстремальны для зешой бкотц.

Представлены основные данные, получанные при биологических исследованиях Марса» предпринятых но программе "Викинг".

ЧАСТЬ П.

ЖСПГОМЕНТАЖЬШЕ ИССЩ0ВШ1Я

Для изучения различных вопросов биохимии и физиологии кнк-роорганизмов, а также для химических исследований был применен комплекс современных методов: радаоресшрометрия, газовая хроматография, АТФ-метрия, спектрополяриметрия и другие. Ряд методов разработан автором и впервые применен для биохимических исследований почв и микроорганизмов (пиролиз-газовая хроматография ночв и хсультуральнкх жидкостей, колоночная хроматография почвенных экстрактов, концентрирование шкробных суспензий на поляризуемых носителях и т.д.).

Исследовала свыше 40 коллекционных культур микроорганизмов, относящихся я различным систематическим группам, л свыше 600 штаммов микроорганизмов, выделенных из почвенных образцов, подвергнутых различным экстремальна воздействиям; до вида было идентифицировано около 30 культур бактерий я микроскопических грибов. В качестве модели марсианского грунта-применяли лимонит и другие железосодержавде шнераяы; по данный элементного состава была созданы различные аналоги марсианского груи~. та.

В диссертации представлены результаты химических исследований, позволявшие полагать, что пгрунте планеты на поверхности минералов монет находиться замороженная перекись водорода.

РАЗДЕЛ I

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКРООРГАНИЗАОВ, ОБЙТАИЩХ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СРЕДАХ

Экстремальные климатические и другие абиотические воздействия способствуют переходу жизнеспособных клеток в покоящиеся (так называемые "переживащие") формы, присутствие которых в природных и модельных системах явно не проявляется. В связи с этим актуальным является вопрос о применимости физико-химических методов,применяемых в микробиологии, для индикации микрофлоры, обитающей в почвах жарких и холодных пустынь, в различных грунтах, в каталитически активных и других агрессивных средах, то есть в таких условиях, когда артефакты, обусловленные физическими и химическими процессами, могут маскировать слабые сигналы о присутствии дисперсно распределенной микрофлора

Проведенные эксперименты подтвердили, что наиболее убедительным и прямым доказательством существования микроорганизмов в экстремальных условиях остаются общепринятые методы обнаружения процессов роста и размножения микроорганизмов, определяемых» например, по данашнэ нарастания биомассы.

На рио.1 представлены данные, полученные в опытах о экстрактами аналогов грунта, в которых содержались различные количества черноземной почвы. Добавление ингибитора (40^-ый раствор формалина) прерывает процесс размножения, что на графике отмечается снижением оптической плотности. Нарастание биомассы в процесса культивирования в данных условиях коррелирует с изменением рй среды. По мере развития микроорганизмов в фильтрате, содержащем в качестве источника углерода Д-гликозу, наблюдается такао уменьшение оптической активности (рис.2).

Для обнаружения роста и метаболической активности макроорганизмов предложен метод исследования валового химического состава культуральной жидкости с помощью ниродиза-газовой хроматографии.

Обсуждение полученных хроматограш исходной питательной среды и образцов культуральных жидкостей, взятых для анализа через различные периоды вырашивания микробов, а такке пирограммы щзнтрафутатов, биомассы микроорганизмов .и образцов почвы пустыни позволяет сделать вывод о высокой степени. на-

дежности и информативности данного метода и возможности его конструктивного совмещения в автоматических приборах с другими функциональными микробиологическими методами (нефелометрическим, рН-метрией, спектрополяриметрией и т.д.).

Изложены обширные экспериментальные данные о применении метода радиораспирометрш для изучения метаболизма микроорганизмов в экстремальных условиях (почвы пустынь, смеси минералов и почв пустынь, смеси почв и минералов, обработанные НдС^). При воздействии на почвенную микрофлору суздаы экстремальных факторов, воспроизводимых в установке "искусственный Марс", а также единичных Факторов в экстремальных дозах, было установлено, что выделение СО2 является доказательством выживаемости микроорганизмов при любых экстремальных воздействиях.

Дальнейшим развитием данных подходов явились исследования по индикации метаболизма отдельных физиологических групп микроорганизмов. Это достигается добавлением в среду в качестве единственных источников углерода тех или иных органических субстратов. В диссертации описаны эксперименты по обнаружению группировок почвенных микроорганизмов, утилизирукщих йелок, отдельные аминокислоты, октадекан, органические кислоты (пировиноградную, с1-кб~ то-глутаровую, щавалевоуксусную, муравьиную, уксусную, пропионо-вую и т.д.), мочевину.

Обнаружение динамики биосинтеза клеткой специфических веществ колет быть прямым и достоверным доказательством микробной активности. Регистрацию динамики накопления железопорфириновых белков производили по интенсивности хемилкминесценции на флуоресцентном спектрофотометре. Установлено, что состав минеральных смесей оказывает разнообразное действие на синтез белка (рис.3).Обработка смесей минералов и почв пероксидом водорода также оказывает воздействие на интенсивность хемялкшнисценщи. Однако, биосинтез белка при этом не ингибируется полностью. Методы регистрации динамики накопления этих веществ рекомендованы для обнаружения шкробной жизни в экстремальных условиях среды обитания.

Действие экстремальных доз различных факторов ведет к существенному снижению содержания микроорганизмов- как в естественных средах их обитания, так и при воспроизведении экстремальных факторов в лаборатории. В диссертации разработаны способы кон-

40

Отн.ед.

80 г /3 Рис Л. Изменение оптической

плотности в процессе инкубирования экстракта, приготовленного иэ смеси Z г аналога марсианского грунта ИНШ-А и 0,2 ж ЗОЙ Н2с навесками чернозема. I - 0,1 г, 2 - 0,3 г, 3 - 0,5 г. Стрелкой обозначено время добавления 4Сй-ного раствора формалина

Рис.2. Изменение оптической активности среды в процессе инкубирования экстрактов следующего состава. I - 0,1 г'чернозема,

2 ~ 0,1 чернозема + 0,2 мл 30% Н^О^. Смеси ОД г чернозема + + 0,2 мл Й^О^ с I г следующих аналогов марсианского грунта:

3 - №6040 , 4 - В-2, 5 - Ах, 6 - ИНШ-А, 7 - ИНШ-Б

Рис.3. Динамика накопления железопорфмркноЕых белков при инкубировании экстрактов* приготовленных из смесей 0,2 г чернозема, 0,2 мл. и г следующих аналогов марсианского грунта: I - №6040, 2 - Ар 3 - В-2, 4 - ИНШ-А, 5 - ИНШ-Б

центрирования разбавленных суспензий микроорганизмов с помощью электроудерживания микроорганизмов на порюткх, волокнистых п других материалах, хорошо поляризуемых з поле постоянного тока (Гвоздяк с соавт., 1974; 1976, 1377). Установлено, что эффективность удерживания микроорганизмов может достигать 99,9$. При отключении тока и протоке среды микроорганизмы до сорбируются; тем самым достигается необходимая степонь концентрирования микроорганизмов.

Почва как основная среда обатшшя земных микроорганизмов является отражением многообразных биологических процессов, что проявляется в составе почвенных органических веществ. Примененный в диссертации метод пнролиза-газовой хроматографии образцов различных почв показал, что бедные органическим веществом и слабо засаленные почвы пустынь имеют чрезвычайно скудный набор пиков на хроматограммах. С переходил к почвам, расположенным в зонах умеренного климата, лирограммы все более обогащается пиками, отражающими продукты пиролиза. В диссертации описывается метод ви-деления и фракционирования водорастворимых почвенных органических веществ на неполярном (активированный уголь) и полярном (окись алшагаи) носителях с помощью колоночной -хроматографии. Для долинных почв умеренных климатических зон (чернозем, дерново-подзолистая почва) получены 13 фракцай фульвокислот, идентифяцяро-ванных по химическому составу. Каждая из фракций является отражением активности почвенной микрофлоры. Сделан вывод о той, что изучение почвенного органического вещества позволяет получить данные о присутствии микроорганизмов в экстремальных условиях.

РАЗДЕЛ П.

ФИЗИОЛОПЗ-ШОШШЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ - МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБИТАЩЙХ -В ЖСТШЗДЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Изучение роста и метаболизма микроорганизмов ■ при различной тажностд.

Для определения нижнего предела роста микроорганизмов щи различном значении а<? был модифицирован "эксякаторний метод", позволяющий соедавать постоянный уровень влажности в рабочей камере. Вио установлено, что при = 0,55, хорошо развитый иицэ-

лий давал лишь Pénicillium adametr-ii , ввделеннай из почв полуострова Таймыр.

Дрожжи и актиномицеты уm щи ап = 0,90 и ниже роста не проявляли. Однако, они сохраняли свои жизнеспособность при ая = 0,70 и активно росли к метаболизировали при повышении влажности. Бактерий проявляли активный рост приaw = 0,95. При понижении влажности выделения СО^ из питательных сред, содержащих глюкозу или органические кислоты, не наблвдалось. Однако, нижний предел влажности, при которой бактерии сохраняли свою жизнеспособность, достигал aw = 0,85.

При приближении к экстремально низкому уровню влажности метаболическая активность клетки существенно снижается. Это было установлено по образованию С0а при росте микроорганизмов в условиях с различной влажностью. Методом газовой хроматографии установлена способность гриба слабо расти при aw » 0,65 (рис.4). При более низкой влажности в условиях 45-суточного опыта рост гриба не обнаруживается.

Газо-хроштографачаским методом но удается обнаружить присутствия микроорганизмов по выделению С02 из нативных образцов почвы пустыни, влажность'Которых составляет 0,5-0,5%, что значительно шив максимальной гигроскопической влажности, составляющей дая данных почв 3,В% (Новогрудский, 1956). При добавлении раство-pi меченой глшозн, совдавдей аяашюсть образцов также не регистрируется динамика выделения отражающая катаболическу» активность почвенной микрофлоры.

Повышение влажности способствует обнаружению шкроорганиз-мов, На pic.S представлены графики зависимости относительного прироста полученных при добавлен®! к почзеннш образцам

равномерномаченной глшозн.

При внесении 10 да почвы пустыни, содержащих 1,00 клеток, ь редкую питательную среду с радиоактивней глккозой могут быть получены данные о присутствии микрофлоры через несколько суток накопления в инкубационной камере обнаруживаемого количества

Вместе с тем 1000 клеток обнаруживается всего через 5-6 ч. При влажности почвы, составляющей I00?i от веса почвы, кривые выделения углекислого газа имеет специфический характер: наблюдается циклы в вццелешга и поглощении С02. Это свидетельствует," воз-

можно о существовании своеобразного углеродного цикла, состоящего из процессов декарбоксилировакия органических субстратов и ассашлвдт углекислого газа ( Hubbard , 1972), Количество полезного материала не оказывает влияния на эти эколого-микробиологи-ческив процессы, происходящие в почвах.

Специфический характер углеродного цикла обнаружен и при инкубировании образцов чернозема и почвы пустыни (рис.6) в жидкой среде. По абсолютным показателям интенсивность процессов выделения углекислого газа была значительно выше, чем при увлажнении почвенных образцов.

Обитание микрофлоры в природных условиях, характеризующихся недостатком физиологически активной воды, обусловливает ряд особенностей в потреблении микробными популяциями, органических субстратов различного химического строения. Так, при инкубировании микрофлоры пустынной почвы в жидкой синтетической среде, содержащей глккозу в качестве единственного источника углерода и энергии, кривая роста практически не имеет лаг-фазы. Однако, выделение ^4С02, служащего показателем катаболической активности, в первые часы опыта происходит очень медленно; его интенсивное выделение начинается лишь после перехода кривой роста в стационарную фазу (рис.7). Это объясняется тем, что цепная в питательном отношении глюкоза интенсивно расходуется микроорганизмами в качестве источника конструктивного обмена. Возможно также, что ксерофиты более активно реагирует на добавление физиологически доступной воды, чем на обеспечение их питательными субстратами (viatmiac, 1972), и лишь поме восстановления функциональной активности и их приспособления к избытку воды и питательных субстратов активно начинают проявляться их метаболические возможности. Этому же способствует и повышение в среде количества ортофосфата.

Иная картина найлкдается при утилизации микробами солей органических кислот: выделение СО,, из культуральной жидкости проходят чрезвычайно интенсивно сразу ко после контакта питательных субстратов с почвенными образпдш. Добавление глккозы к среде, содержщейсоли органических кислот, поло.татзльно сказывается на накоплении биотссы. Интенсивность ввдоления снижается. Достоверные усредненные данные о метаболизме ксерофитов по обоим показателем (накоплению биомассы и выделению С02) могут б1/гь получены при использовании смеси органических питательных субстра-

Рис. б

Рис.4. Количество СС^. выделяющегося при инкубировании микроскопического гриба на агаризованной глюкозо-минеральной среде при различной влажности (активность вода: I - 0,99; 2 - 0,98; 3 - 0,96; 4 - 0,94; 5 - 0,92; 6 - 0,90; 7 - 0,85; 8 - 0,80; 9 - 0,75; 10 -

- Э,65КВре«я инкубирования: 1-ый столбик - 7, 2-ой - 14, 3-ий -21, 4-ый - 45 сут.

Рис.5. Влияние влажности почвы на величину относительного прироста сигнала (А^/А^при "дыхании" почвы: I - 200 , 2 - 100 , 3 - 50 , 4 -

- 10 микрокюри I-б-^С-глхзкозы/г почвы пустыни Каракумы

Рис.6. Выделение СО^ при инкубировании в 10 мл питательной среды, содержащей- 1% глюкозы: I - 500 ыг, 2 - 1,0 г, 3 - 1,5 г почвы пустыни (а) и чернозема (б)

тов. При совместном присутствии в среде меченых формиата, ацетата и глкгсозы в равных но активности пропорциях создаются, по-видимому» наиболее благоприятные условия для "совмещения" катабо-лической и анаболической активности микробных популяций почв пустыни (рис.8).

Низкеспособность микроорганизмов в экологических условиях.

характеризующихся каталитическими свойствами.

Данные о влиянии минералов, обладаниях каталитической активностью, на рост микроорганизмов могут быть получены при использовании радасресшрометрического метода. На рис.9а,б представлены результаты экспериментов по отделению динамики выделения ^СО^, образующегося при разложении %-формаата со смеся-ггл почв и железосодержащего минерала лимонита. Если в качестве компонентов смеси применяли навески чернозема, то вслед за быстрым выделением вызванным присутствием лимонита, наблвда-лось характерное повышение уровня радиоактивности за счет утилизации микрофлорой оставшегося количества формиата. Однако, если в качестве объекта исследования применяли почву пустыни, то характер выделения ^^СО^ оказывается иным. На графике вслед за выделением С0£, образующегося при химическом разлояечгл вещества лимонитом, отмечается лишь небольшой рост урозня радиоактивности. Это свидетельствует не только о слабой заселенности почв пустыни микроорганизмами, но и сильных каталитических свойствах железосодержащего минерала лимонита, разлагающего абиогенным путем фор-шат, что было подтверждено многочисленными экспериментами.

Истинные представления о метаболической активности микрофлоры, содержащей смеси минералов и почв, могут быть получены при изучении водных вытяжек (рис.10). Водная вытяжка, полученная из лимонита, каталитической активностью не обладает.

Газо-хроматографические исследования показали, что при добавлении образцов чернозема или почвы пустыни к замерзшему по-роксиду водорода изменений в тазовом составе инкубационных камер на происходит. Однако, при повышении температуры и оттаивания пероксида'наблюдается бурная реакция, в результате чего выделяется углекислый газ и кислород, причем различаются две стадии процесса: химическая.и биологическая. Химическое выделение Щ, обусловлено окислением органического вещества почвпероксидом водо-

• ТП*~тлмгт /п

■К/ иш/с

6 . Рис.96

Рис,"?. Крнше роста микрофлоры почьы пустыни: I - выделение ^СО^ при инкубировании I г почгч г. 20 мл питательной среды, содержащей 100 ш-крокюри 1-6-*"С-глшозы;2 - нарастание мутности среды в тех же условиях

Ркс.8. Ьццележе С0£ при инкубировании 500 мг почвы пустыни ь среде, содержимой: 1-6,3 ькКи ^С-форммвта/мл среды; 2-4,15 мкКи 1-6- С-глю-'коэн/мл среда; 3-6,3 мкКи " С-формната+дрожжеэой а1зтолиэ«т+ печеночный ркстр<..кт с 1 мл среды; 4- по 8,3 мкКи. глюкозы и формиата; 5- по 4,15 шКн формиата и ацетата; с-8,3 мкКи 1-6-^С глюкоаы/мл среды

Рис.9. Динамика выделения ^СО^ при инкубировании в среде с 100 мкКи -'*С-форми?.та: а - по I г лимокита(1) и чернозема (2), 0,5 г лимонита + I г чернозема (3); б - I г почрн пустыни (I), 0,25 г почвы пустыни + + 0,75 г лимонита (?)

рода. Абссл/отные величины С0£ отражает уровень содержания легко-окисляемого углерода в изученных почвах.

Химическое выделение кислорода обуслоачеио разложением пероксида водорода так называемыми полуторными окислами п окислами других металлов, имеющимися в каздой почве. Биологическое выделение СОд является следствием катаболичесяих процессов, осуществляемых почвенными микроорганизмами, устойчивы:«! к действию пероксида водорода, за счет разложения оставшихся пеокислениыми органических суостратов, Биологическое выделение кислорода моют инициироваться в результате: I) действия ферглентсв каталазы и пероксидазы, находящихся в почвах в свободном виде; 2} микробиологического процесса разложения пероксида водорода. Следовательно, динамика выделения как СОд, так и Од является признаком биологической активности почв, Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что если в случае образцов богатых почв свидетельством активности микрофлоры является регистрация динамики выделения как СО2, так и 02, то в случае почвы пустыни более достоверные данные получены при выделении кислорода. Это. естественно, поскольку обеспеченность пустышшх почв органическими субстратами чрезвычайно низка, и в условиях опыта биологическое выделение кислорода - единственный показатель присутствия активной микрофлоры, обладающей каталазой. Определение количества кислорода, выделящегося из активных и автоклавированных образцов почв, мо-ает дать сведения об уровне общей каталазной активности различных почв.

Стимулирование метаболизма микроорганизмов происходит при добавлении к смеси "пероксид водорода - образец почвы" питательной среды, содержащей дополнительный источник углерода. При этом метаболизируюг не только каталазо-пололителыше ьякрооргашзмы, но и те ф>рмы, которые переходят в состояние покоя при действии перекиси водорода. Соотношение различных группировок микробов в почве, по-видимому, нэ постоянно, чем можно объяснить отсутствие строгой корреляции мезду численностью шяроорганязков, количеством добавленного пероксида водорода и интенсивностью выделения из культуральной жидкости углекислого газа и кислорода,

Пероксид водорода не только вызывает гибель микроорганизмов, но косвенно оказывает положительное влияние на активность почвенных микробов за счет усиления аэрации кислородом, образующимся

при его распаде. Усилением аэрации среды следует также объяснить стимулирующую роль железосодержащего минерала лимонита. Помимо простого химического взаимодействия пероксида и железа,, способствующего сникегда бактерицидного уровня пероксида, его детоксика-Ц"и содействует также "включение" перекисного механизма окисления ионов металла (Дубинина, Ш7Г 1978).

В ходе исследования било выделено 200 штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию пероксида водорода. Среди йденткфици-

ровашых культур бактерии Bacillus globisporus ,B.brevie ,

B.subtills » B.meseilterxcus s Micrococcus piltonensis > Spirillum azotocoligens , а также гриб Aspergillus niger и другие микроорганизмы. В жидких питательных средах бактерии росли в присутствии 1,5/2 HjjOg к сохраняли свою жизнеспособность при H^Og при 3 пересевах в течение 15 суток. Микроскопические грибы способны метаболизировать в присутствии &% Н202 и сохраняли свою жизнеспособность вплоть до 15$ в течение 3 ч. Отмечен ряд характерных реаыщй клеток на действие пероксида водорода; утрата подвижности у Spirillum aaotocoiigens и других подвижных клеток микроорганизмов, формирование мелких колоний, в некоторых случаях образуются пигментные мутанты и т.д.

Была поставлена задача определить особенности роста бактерий в присутствии различных концентраций пероксида водорода. Во всех вариантах опытов количество выросшей биомассы превосходит данные контрольных опытов. Наибольший прирост биомассы установлен для всех изученных культур при содержании 1,2$ Н202 в среде. Как уже отмечалось, пероксид водорода обладает двойственным характером. С одной стороны, он является бактерицидным агентом. Однако, при -его разложении создается дополнительная аэрация для остающихся микроорганизмов, что благоприятно сказывается на их росте. Следовательно, токсическое действие пероксида водорода и дополнительная аэрация - антагонисты процесса инкубирования в. данных условиях. От сбалансированности этих процессов зависит эффективность роста почвенных популяций. Прироста биомассы в определенных условиях можно достигнуть повышением аэрации среды добавлением к ней пероксида водорода в дозах, не вызываниях табель микроорганизмов. Среда аэрируется при этом в большей степени, чем при пропускавши газообразного кислорода.

Таким образом, совместное присутствие пероксида водорода и минералов ведет к сохранению многих груш микроорганизмов, гби-таюцих в почве и обладаниях пониженной каталазной активностью. Разработанные в диссертации методики, позволяющие инактиляровать каталитическое действие минералов, в совокупности с методом концентрирования разбавленных суспензий на поляризуемых.материалах, дают возможность успешно применять функциональные микробиологические методы.

РАЗДЕЛ Ш.

АНАЛИЗ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В СВЯЗИ С ПРОБЛЕМОЙ ПОИСКА ЕНЕЗШНОЙ ЖЙШИ

Химическая характеристика марсианского грунта как ..возможно^ экологической нишщ.

При увлажнении стерильного образца лимонита раствором радиоактивного форшата почти одновременно с добавлением вещества происходит интенсивное выделение СО,,. Испытание в аналогичных ус-

и

ловлях других соединений, меченных по С, показало, что наиболее интенсивное выделение углекислого газа пайтедается из сред, содержащих формиат, ацетат, пропионат, некоторые аминокислоты, а затем глккозу. Аналогичные данные получены и при изучении смеаей минералов, имитирувдих марсианский грунт (ряс.II). Эти данные указывают на то, что многие минералы обладают декарбоксилирукщей активностью. Сделан вывод о том, что зарегистрированное американскими станциями "Викинг" выделение СО2 пр! анализе марсианского грунта могло быть обусяо&лено химическими реакциями, возникающими при взаимодействии грунта планеты с питательной средой, в составе которой, наряду с другими соединениями, находился форлиат - 14С. Основную роль в этих реакциях играют гидра тированные отела тте-за, содержащиеся в грунте.

Тот факт, что в' экспериментах по газообмену станции "Ёшшг" зарегистрировали выделение кислорода в условиях, всюгючзкцпх его биологическое происхондение, свидетельствует ©.присутствии в грунте планеты-химических источников кислорода; наиболее вероятны из них перекиенне соединена. Б диссертации показано, что химическая решения мезду лимонитом и замороженным пероксидом водорода не происходит. Но при повышении температуры наблюдается интенсивная

реакция с обильным выделением кислорода (рис.12). Если пероксид водорода добавить к питательной среде, содержащей меченные по

органические соединения, а также лимонит или аналоги грунта, то при этом выделяется ^С^, причем график выделения имеет специфический характер (рис.13).

На основании проведенных химических исследований была выдвинута гипотеза о том, что марсианский грунт состоит из смеси минералов, содержащих железо, и замороженного пероксида водорода, который при частичном оттаивании и взаимодействии с ионами железа разлагается с наделением кислорода.

В ряде опытов, проведенных станциями "Викинг", было обнаружено незначительное образование органических веществ из С02 и 14СО, добавленных в герметичную камеру, содержащую образец грунта Марса. Воспроизведение условий эксперимента в лаборатории позволило получить данные о слабом связывании газов аналогами грунта с образованием небольших количеств органических веществ. Описана методика пиролиза-газовой хроматографии образцов грунта после их экспозиции углекислым газом и окисью углерода.

Суммируя полученные данные, в диссертации сделан вывод о том, что марсианский грунт обладает каталитической активностью (Имшенацкий, Мурзаков, 1977). Позднее этот вывод в той или иной форме был подтвержден другими авторами { Оуаша et. ai. , 1979; Huguenin , 1979; Р1итЪ , 1979; Siegel JB.,, Siegel 8. ,1980). Марсианский грунт можно рассматривать как возможную уникальную экологическую нищу,- основной особенностью которой является каталитическая активность минералов, усиленная присутствием пероксида водорода - известного в микробиологии стерилизующего агента.

Марсианский грунт как возможная среда обитания микроорганизмов.

Была поставлена цель изучить комплексное влияние на рост почвенных микроорганизмов таких факторов, как углекислотная атмосфера, а также смесь минеральных катализаторов и пероксида водорода. Установлена общая тенденция к существенному снижению численности бактерий по сравнению с контролем после инкубирования в перколяторе в атмосфере.углекислого газа. Рост микробов существенно стимулируется при добавлении к инкубируемому офазцу .пе-

20

12

о и

3 §

о

а> -

» л к м

<$ а

р.

с.

о

Е*

имп/с

32 16 0

- имп/с

А'

.V

-г-т-ч1

12 18

24

ч

—-2

40

20

10 имп/с

I 0

___

/

-от.

4

Рис.10

600

о

в*

«

о о

3 «

200

■10 имп/с

2 3

I]

5 6

40

20

Рис.11

-3 2

:1

Рис.12

Рис.13

Рис.10. Динамика выделения при инкубировании 100 шКк

^С-формиата и I ад водного экстракта из лимонита (I)- и Из смеси лимонита и почвы пустыни (3:1)(2).

Рис.11. Количество

выделяющегося при взаимодействии I г лимонита с 100 мкКи: I - 14С-форлиата, 2 - I- %-ацетата, 3 - 1-'14С-про-пиоката, 4 - 1-^С-валина, 5 - 3- С-аланина, 6 - 1-6-14С-глшозы,

Рис.12. Выделение при взаимодействии I г лимонита с замороженной (а) и оттаявшей ЗС^-ной Н^, добавленной в следующих количествах: I - 0,1; 2 - 0,2; 3 - 0,3; 4 - 0,5 мл; 5 - содержание О2 в воздухе (контроль);-6 - количество 0^, образовавшегося при хранении 30&-ной Н^Ор при 4° (контроль).

Рис.13. Выделение при инкубировании 0,5 ад 1%-го раствора

-формиата .(100 мкКи) с I г.аналога марсианского грунта ИНИИ-А (I), I г аналога ИНШ-А + 0,2 мл 30%-ной Н^ (2), I г аналога ИНШ-А при последующем добавлении .0,2 мл 30%-ноЛ НоО^ (3).

в

роксида водорода» что на графике зависимости численности микробов от времени отмечается резким подъемом кривой. При непрерывном пропускании через перколятор углекислого газа количество организмов., растущих в данных условиях, вновь снижается.

Анализ состава микробных популяций, выраставших на чашках, помещенных в анаэростаты» показал, 'itо среда них преобладав споровые бактерии: B.raycoides , В.articulates , B.glutinosus . B.&ngulans t B.virgatus • В. ophaoric.ua о B.raaculatus » Clostridium sp. , Micrococcus subflavus , а также бактерии, относящиеся к плектридиальным формам спороношения. Напрашивается вывод о томг что углекислый газ и минералы обеспечивают элективные условия для формирования опорогенных бактериальных популяций. Однако, культивирование в тех яе условиях неспороообразуюцих бактерий ( Pseudoroonas iluoresoens , Micrococcus piltonenaia , Serratia гаагоезоепз к др.) показало, что хотя их рост подавлен, но и они сохраняют свою жизнеспособность. Для неспоровых бактерий характерна более замедленная скорость формирования колоний на агаризовакных средах. Таким образом, суммарное воздействие минеральных катализаторов, пероксида водорода и углекислого газа не исключает полностью возможности существования микроорганизмов.

Значительное внимание в диссертации уделено изучению выживаемости микроорганизмов в таких условиях, которые в земной экологии не встречается. Исследования проводили в специально сконструированной климатической камере "искусственный Марс". В ней воспроизведены следующие параметры: I) суточные изменения температуры от - 80° до +20°; 2) атмосфера, состоящая из 95$ углекислого газа, азота; 0,1-0,4.% кислорода, 1-2? аргона; 3) атмо-•оферное давление §-7 мм рт.ст; 4) ультрафиолетовое излучение при длине волны 2537 А.

В первой серии опытов была изучены бактерии, выделенные из богатых и бедных почв после воздействия на них эстрешльных химических факторов. Наибольшей выживаемостью характеризуются B.mycoides.I , B.meaantericua, Наименьшей выживаемостью обладают неспороносные бактерии, выделенные из пахотной черноземной почвы.

Наибольшее влияние оказывает высушивание бактериальных суспензий, помещаемых ь камеру, где устанавливается низкое атмосферное давление. При этом численность бактерий сразу же снижается на 2-6 порядков (рис.14). Последующее воздействие других факторов

Рис.14 Рис Л5

Рис.14. Выживаемость бактерий при высушивании; а - исходное количество клеток, б - количество клеток при высушивании в аналоге марсианского грунта ИНШ-А; в - то же для аналога ИНШ-Б. 1-B.mycoldea 1, 2-B.subtilia, 3-B.subtIlis 13/17, 4-B.aesentericue 13, 5-P.íluorescens 2, 6-P.fluorescena 9

Рис.15. Выживаемость олиготрофных бактерий при высушивании. Обозначения тс же, что и на рис.14; 1-proathecomicrobiun polyspheroldun, 2-P.enhydruB, 3-P.pneumatlcum, ¿*-Prosthecomicrobi.um sp.( 5-3telXa humosa 1137, 6-Stella humosa 12n

на высушенные клетки хотя к оказывает летальное действие на часть оставшихся жизнеспособных бактерий, но проявляющийся при этом эффект несоизмерим с летальным действием высушивания.

Олнготрофы подобно евтрофным бактериям проявляют неодинаковое отношение к действия экстремальных факторов. И а данном случае основным фактором, вызываниям гибель большей пасти популяции, является высушивание до экстремально низккх значений активности вода • (рис.15). Электронно-микроскопические исследования показали, что морфология простекобвктерий после экспонирования в яакэрэ "искусственный Мпрс" остается без изменений. Аналогичные данные были получены и' при электронно-микроскопических исследованиях клеток большинства изученных евтрофных бактерий. Лишь в ряде случаев обка-рукиЕаотся клетки неспоровых бактерий с явно нарушенной структурой. Гибель клеток других организмов обусловливается, по-вгщииоау, не-обратишм нарушением ультратонкой организации и функций клеток, на ведущих к изменении внешней структура.

Ограничивающим еизнь фактором является ультрафиолетовое излучение. Характерно, однако, что даже при 30-суточном облучении образцов почв пустыни в них сохраняется жизнеспособная микрофлора, что определялось по интенсивности выделения ^СО^, при инкубировании "Слученных образцов в питательных средах, содераащих меченные по углероду субстраты. Это свидетельствует о том, что даже такой наиболее экстремальный фактор, каким является ультрафиолетовое облучении, не может полностью предотвратить возможность сохранения киз-неспособной милрофлоры, экранируемой от облучения частицами почвы.

Таким образом, комплекс факторов и отдельные из них, определявши климат Марса и особенности его грунта, хотя и приводят к существенному сшшению численности популяций гетеротрофных микроорганизмов, но все ке не приводят их к полной гибели. Жизнеспособность довольно разнообразной в физиологическом отношении микрофлоры полностью сохраняется и активно проявляется в благоприятных условиях. Поэтому продолжение космобиалогических исследований данной планеты не теряет своей актуальности.

В работе значительное внимание уделено формулированию методологических и методических принципов обнаружения и изучения микроорганизмов в условиях других планет с помощью автоматических биологических станций.

ОБСУЗДЕШЕ

Расширение наших представлений об экологических границах распространения кизни как на Земле, так, возможно, и на других планетах, позволяет суммировать данные относительно резервных возможностей микробных клеток.

Для каждого организма имеются определенные пределы температуры и влажности, при которых клетка в состоянии» сохранить свою вйзнеспособность. При этом низкая температура (практически до абсолютного нуля) не является ограничивавшим жизнь фактором, хотя, естественно, имеется обширная группа микроорганизмов, погибающих при значительном снижении температуры. Для земных форм жизни температурные границы, простирающиеся в сторону высоких температур, ограничиваются тш.дми их значениями, при которых происходит необратимая денатурация белка и разрушение других химических сое-

данений - компонентов биологических структур. Перепады температур оказывают на рост и выживаемость микроорганизмов более выраженное экстремальное воздействие, чем сохранение предельных доз в течение длительного времени (Бекер с соавт., X98I; Biederbeck: , Campbell, 1971),

Наиболее существенным экологическим фактором, регулирующим распространение активной жизни в природных нишах, является влажность. Для почвенных ксерофитных микроорганизмов характерны две физиологические особенности: I) они развивает высокое осмотическое давление, достаточное для извлечения воды из частиц почвы,, адсорбирующих воду; 2) организмы обладают внутриклеточным механизмом удерживания воды, неизвяекаемой из клетки физическим и химическим способом (Аксенов, Николаев, 1972; Мшцустин, 1933). В диссертанта получены прямые доказательства роста Pénicillium, adamatzii при ад = 0,55, что позволяет говорить о более широком экологическом диапазоне существования ксерофитных форм яизни на Земле. Убедительные данные о метаболизме гриба получены при более высоком значении активности воды (при а = 0,65). Снижение интенсивности метаболизма повышает выживаемость микроорганизмов ( о'Те пае mu, , 1978).

Способность микроорганизмов выживать в экстремальных условиях не означает, что они утрачивает возможность расти в более благоприятных условиях. Это утверждение особенно важно для ксерофитов, обнаружение которых связано с помещением образцов почв в жидкие питатаяъные среды. .

При комплексном воздействии факторов решавдее значение для выживаемости имеет количество физиологически активной воды, поскольку высушивание способствует переходу клетка в состояние покоя .с ослаблением ее зависимости от других абиотических факторов.

Вскрытые закономерности полностью относятся и к такой уникальной группе микроорганизмов, как олигстрсфные бактерии. Чрезвычайно замедленный тип обмена у этой группы почвенных штробов кэ является обязательным условием их преобладания -в нишах, лишенных больших количеств органических субстратов и подвергнутых экстремальным воздействиям. В совокупности с каталитически активными минералами углекислый газ может оказывать' влияние m формирсва-_ ние почвенных' микробных популяций с преобладанием в них спорообра-зующих: бактерий. Бри изучении химических экстремальных факторов

(каталитически активных минералов и пероксида водорода) обнаруживается положительная роль минералов, способствующих снижению токсических доз.пероксвда и обеспечивающих дополнительную аэра-одю» что благоприятно сказывается на росте аэробных микроорганизмов. Установлена, таким образом, двойственная роль пероксида -и как токсического агента (снижающего выживаемость популяций), и как фактора дополнительной аэрации (способ ствуицей повышению жизнеспособности аэробов). От сбалансированности антагонистических эффектов,вызываемых перокеидом водорода, зависит не только выживаемость, но и интенсивность роста и развития микробных популяций.

Проведенные в диссертации эксперименты и их результаты имеют прямое отношение к проблемам зкзобиологии, изучающей возможность существования жизни вне Земли. Экспериментальная интерпретация данных, подученных станциями "Викинг", свидетельствует об их неоднозначности: любой положительный результат может быть объяснен как биологическими, так и химическими реакциями. Это не позволяет сделать определенный вывод о присутствии или отсутствии жизни на этой шанете. Химическое объяснение многим аномальным явлениям, обнаруженным станциями "Викинг", позволило сделать вывод о марсианском грунте как многокомпонентной системе, включающей в свой состав каталитически активные минералы и замороженный пероксид водорода. Созданные в лаборатории аналоги марсианского грунта представляют собой в общем-то благоприятные среды обитания почвенных микроорганизмов. В совокупности с климатическими экстремальными факторами химические характеристики такой экологической ниши, которой может' быть марсианский грунт, не препятствует существованию на планете микроскопических форм жизни.

Наибольшее значение при обнаружении жизни в экстремальных условиях имеет функциональные микробиологические методы, возводящие получать прямые доказательства роста, развития и метаболизма микроорганизмов. В присутствии каталитически; активных минералов и пероксвда водорода применение биогеохишческих методов, основанных-на обнаружении газообмена ыезду почвой и атмосферой при слабом увлажнении образцов, необходимо сочетать с микробиологическими анализами образцов* Химические аналитические методы, основанные на поиске и изучении- почвенных органических веществ биогенной природы, могут дать дополнительную информацию о микробной аизнл.

Предложенные в диссертации динамические функциональные методы обнаружения шкробоз в экстремальных условиях основаны нг посеве почвенных экстрактов в богатую питательную среду. Присутствуйте в почве роакционноспособные химические соединения не окажут влияния на интерпретацию результатов экспериментов, если в качестве посевного материала применять водные вытяжки, не обладайте каталитической активностью.

Экстремальные воздействия ведут к снижению общей численности шкроорганизмов, так как для многих из них эти факторы оказываются летальными. Чтобы получить достовернее данные о присутствии микробов, предлагается производить концентрирование микробной биомассы из разбавленных суспензий. Наиболее удобен дая этих целей метод, основанный на электроудерживанли микробных клеток на поляризуемых носителях.

Комплекс вопросов, рассмотренных в диссертации» представляет собой одно из направлений экологической микробиологии -"экспериментальной экологии микроорганизмов". Таким образом два самостоятельных раздела современной биологии - экспериментальная экология микроорганизмов и экзобиология - развиваются в тесном взаимодействии и их данные дополняют друг друга. Апробированные на земных почвах и модельных системах, подвергнутых экстремальным воздействиям, изложенные методологические и методические принципы предложено использовать в автоматических биологических станциях, планируемых для поиска жизни на других планетах и их спутниках. . •

ВЫВОДЫ

I. Описаны принципы создания лабораторных установок для воо-произведения комплекса экстремальных факторов. Разработаны экспериментальные подходы для обнаружения, выделения и культивирования в лаборатории микроорганизмов» обитавдих в экстремальных условиях. Показано, что серия функциональных микробиологических методов в совокупности с биологическим контролем позволяет достоверно обнаружить не только признаки жизни в экстремальных условиях» но й провести предварительную идентификацию различных фазяологаческах групп микрооргшшзмов. - -

2. Разнообразные в систематическом и физиологическом отноше-вш грувшаовкЕ гетеротрофных микроорганизмов устойчивы к воздействию -вкстремаявкнх климатических и другах абиотических факторов, изученных как в отдельности, так и в их комбинациях и суша (влажность iffise максимальной гигроскопической, смеси каталитических активных. Еелезосодераащих злинералов, содерацшие в среде парекшза водорода в концентрации ж выше, циклы замораживания-оттаивания прс температурах -80°++20°, барометрическое давление около 7 мбар, атмосфера,, состоящая из 95$ углекислого газа, 2-3% азота, 0,10,4/5 цаслорода, 1-2%% аргона» ультрафиолетовое облучение при длине 2537 А).

В, Ссщерзаняе физиологически активной воды является ведущим экологическим фактором, регулирующим рост и размножение микроорганизмов как в естественных» так ж модельных системах. Выделены шгкроскопаческке грибы, расгувде в почве экстремально холодных пустынь при хйгажкасти, близкой к максимальной гигроскопической; .es рост отмечен при э,.. =0,55, а катаболаческая активность при aw= 0,65. Ксерофатнне шюроорганизш проявляй? активную жизнедеятельность при аи близкой к 1,0, что свидетельствует об отсутствий явления облигатной ксерофшша как экологической потребности микроорганизмов в нишах, лишенных физиологически доступной вода»

4. Экстремальные условия среды обитания микроорганизмов определяют специфичность их метаболизма, что шяет быть проиллюстрировано па примере эндогенной микрофлоры пустынных почв, которой свойственно активное д скарб ок силиро ш пи в органических кислот; углеводы потребляется микрофлорой в основном для анаболических щюцассов к их ассимиляция с выделением углекислого газа происходит замедленно.

5. Почвенные микроорганизмы проявляют способность активно шиаболизяровать в ряде каталитически активных сред. Выделены чисты© культуры бактерий, проявляющие рост и размножение в присутствии 1,3-1,5% перекиси водорода; присутствие минералов сказывает стимулирующее действие на рост микроорганизмов за счет снижения концентрации перекиси в среде; выделены почвенные бактерии, устойчивые к действию 3$ перекиси водорода, а грибы, сохраняли© жизнеспособность в присутствии &% Я^О^.

6. Не. все олиготрофные бактерии, имеющие необычную морфолога», 'сохраняют свою лизнеспособность в экстремальных климатических

условиях; замедленный тин обмена у этой группы микроорганизмов не является доминирующим свойством, определяющим их реакцк» на внешне экстремальные воздействия.

7. Модельные эксперименты по интерпретации результатов биологических исследований Марса показали, что положительные рэзуль-' таты, полученные ста!гция?я1 "Викинг" при биологических исследованиях Марса, имеют ¡сак биологическое, так и химическое объяснение, что нэ позволило сделать определенный вывод о присутствии или отсутствии жизни на этой планете. Вид пину та и экспериментально обо-, снована гипотеза о каталитической активности марсианского рругига.

8. Микроорганизмы обладают высокой устойчивостью по отасшз-ни» к экстремальным фактора», близким к марсианским; это указывает на то, что марсианский грунт - возможная уникальная экологическая ниш, пригодная для существования микроскопических фора

ЙНЗШ.

Список основных научных трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Ишенецкий A.A., Мурэаков Б.Г., Восканяи А.Г., Суровое В.К. Динамика разложения I-6-^С-глшозы гакрофлорой пустынных почв/УМикробиология.-1972.-Т.41, шп.4.-С.727-732

2. Ишенецкий A.A., Мурэаков Б.Г., Суровов В.К. Об использовании эффекта "дыхание почвы" в целях поиска внеземной яисни/./Мж-робиология.-1972.-Т.41, шп.б.-С. 1086-1090

3. Имшенецкий A.A., ' %рзаков Б.Г., Сотников Г.Г., Евдокимова Й.Д. Сизшго-хнкические ггетоды обнаружения внеземной иизкя//10-й Меяд.биофиэ.конгр.-М. .Наука,1972.-С.107-108

4. Мурзаяов Б.Г. Применение газовой хроматографии в исследованиях органического вещества почвы//Почвоведение.-1972.-В7,-C.I19-126

5. Мурэаков Б.Г. Роль микроорганизмов в форггированин гуиусоЕых веществ/'/У спехи микробиологии, -1972. -Выя.8.-С.208-223

6. %рзакоЕ Б.Г., Покарицкая Л.М., Тарханова М.Б, Спектропляри-ыетрическое исследование фракция почвенных органических веществ// Иэв.АН СССР, серия биологическая.-1972,-Ш.-С.373-375

7. Иишзнецкий A.A., Цурзаков Б.Г., Блохин В.А. Чувствительный иэтод определения СО^, выделяемого почвеншми микроорганизмами при разлозении меченой глюкозы// Микробиология.-1973,-

Т.429выл.3.-С.552-554

8. Мурзаков Б.Г. О биогенезе гуцусовых веществ почв// Изв.АН СССР, серия биологическая.-1973.-М.-С. 507-516

9. Мурзаков Б.Г. Вопросы экологии микрофлоры пустынных почв в связи с проблемами космической микробиологии// Успехи микро. би од огии.-1974.-Вып.9.-С.96-121

10. йкаенецкий A.A., Цурзаков Б.Г. Исследование декарбоксилирув-щей активности микрофлоры пустынных почв радиометрическим методом// Микробиология.-1976.-Т.44, вш.З.-С.408-413

11. Цурэаков Б.Г. О методах обнаружения киэни вне Земли// Успехи микробиологии. -1976. -Выл ЛI. -С Л 01 -133

12. %рзаков Б.Г. Поиск кизни на Марсе с помощью космических аппаратов// Совр.достикения космонавтики.-1976.-Вып.12.-С.50-64

13. Имшенецкий A.A., %рзаков Б.Г. О поисках кизни на Марсе// Микробиология .-1977. -Т .46,вып.6.-С ЛI03-1113 •

14. Мурзаков Б.Г. Проблемы обнаружения кизни на планетах.-М., Знание, 1977

15. Иишзнецкий A.A., Ц/рзаков Б.Г., Дорофеева И.К. О происхождении кислорода, обнаруаенного станциями "Викинг" при анализе грунта Марса// Микробиология.-1978.-Т.47, вып.4.-С.699-705

16. Идаенецккй A.A., Цурзаков Б.Г. Газохроматографическоа исследование жидких культур микроорганизмов как метод обнаружения ейзни вне Земли// Микробиология.-1978.-Т.47,вып.5.-С.805-809

17. ймшанецкий A.A., Мурзаков Б.Г. Определение углекислоты, выделяющейся из почвы при различной ее влажности// Микробиология.-1978,-Т.47,вып. 6. -С,1086-1090

18. ймшенецкий A.A., Ыурзаков Б.Г., Дорофеева И.К. О возмокноста набмаяогнчееного связывания СО^ и СО котонвнтаин марсианско-

го грунта// Микробиология.-1979.-Т.48,вьгп.4.-С.723-728

19. йшпенециий A.A., Цурзаков Б.Г., Евдокимова М.Д., Дорофеева И.К. Влияние перекиси водорода и гидратированных окислов пе-леза на метаболизм почвенной микрофлоры// Микробиология.-1979.-Т .-48, вып.5.-С.919-926

20. ИишенецкиЯ A.A..Цурзеков Б.Г., Кузюрина Л.А., Яншина В.М., Евдокимова Ы.Д. Выделение культур микроорганизмов, растудия в присутствии перекиси водорода// Микробиология.-'1979.-Т.4Б, вып.5.-С.946-949

21. Имшемецкий A.A., Цурзаков Б.Г. О поисках кизня на Марсе// Микробиология.-1979.-Т.48, вып.6.-С.I075-J08I

22. Йаавкецкий A.A., Мурзаков Б.Г., Евдокимова Н.Д. Особенности существования микроорганизмов а присутствии аналогов шрсиан-ского грунта и перекиси водорода// Микробиология.-1981.-Т.50, вып.4,-С.689-692

23. ЙшенецкиЙ A.A., %рзаков Б.Г., Дорофеева И.К. Применение катода концентрирования микроорганизмов в электрическое полз для поисков аизни на Марсе// Микробиология.-1983.-Т.52, шп.1.~ C.I40-H4

24. ИишенецкиЯ A.A., %рэахов Б.Г., Евдокимова М.Д., Дорофеева Й.К. Рост почвенных бактерий в присутствии аналогов марсианского грунта, углекислого газа к перекиси водорода// Микробиология.-1934.- Т.53,вып.4.-С.605-608

25. Ммшенецкий A.A., Цурзаков Б.Г. * Евдокимова М.Д., Дорофееве Й.К. Выживаемость бактерий в установке "искусственный Марс"// Микробиология. -1984.- Т.53,выи.5.-С.731-737

26. Ишенецкий A.A., Мурзаков Б.Г., Кузврина Л.А., Яншина В.Й.' Рост и метаболизм микроскопических грибов при экстремально низкой влажности// Микробиология.-1984.-Т.53,вып.б.-C.9I8-922

27. Имшенецкий A.A., 1^рэахов Б.Г., Еэдскиноэа М.Д., Дорофеева И.К.

и др. Вызиваеггссть ольтотрофных бактерий при воздействии экстремальных факторов внешней среды// Микробиология.-1985.-Т.54, вда.1.~СЛ04-108

28. Имшенецкий A.A., Мурз ак о в Б.Г., Нузюрина Л.А., Якетна В.П. Определение кизнего предела елознос-ги для активного роста «гасро-организшв// В кн.:Физиология,биохимия и организация шкроор-ганизмов.-Алма-Ата,I385,С.63

29. Имшеяещкий А.А., Цурэаяов Б.Г., Евдокимова М.Д., Дорофеева И.К. Экспериментальное изучение действия комплекса экстремальных факторов на бактерии// В кн.:Экодогия, геохимическая деятельность микроорганизмов и охрана окружающей среды.-Алма-Ата, I985.-C.73

30. Imahenetsky A.A., Voskanjan A.G.; Evdokiaova К.О., Murzakov В.О., Sotnikov G.G. On the methods of the search for extraterrestrial life// The 13 Meet.C0SPAR.-1970.-P. 215

31. loehenetsky A,A., Murzakov B.C., Sotnikov G.G., Evdokimo-

ve M.D. Methods of веаг<h for extraterrestrie life// Life Sci, «. Space Res.-1971.-P. 147-151

32. Imshonetsky A.A., Murzakov B.G.// Detection of extraterrestrial life by radiometric techniques.// Life Sci.a,Space Res.-1974.-P.2-11

33. Imshenoteky A.A., Hurzakov B.G. Effect of huaidity on the

' rate of •respiration" of desert soils// The 19 Meet.COSPAR.-1976-P.348

34. Imshonetsky A.A., Murzakov B.C., E^dokimova H.D., DorofeJava I.K. On the possibility of life on Mars// The 22 Meet. COSPAR.- 1979.-P.210

35. Iiashenetsky A.A., Kurzakov B.C., Evdokimova M.D., Dorofeje-ve I.K., et al. On the possibility of life on Hars// Life Sci.a.Space Кеа.-19вО.-Р.45-5>1

36. lashenetsky A.A.i Murzakov B.C., Evdokinova M.D., Dorofeje-va I.K. Biological studies of H&rtian soil analogues// The

• 23 Heet.C0SPAR.-1980.-P.4Q5

37. Iashenetsky A. A., Murzakov B.G., Evdokinova И.О., Dorofeje-va I.K. Biological studies of Martian soil analogues// Adv. Space Res.-19tfW.1 ,H1 .-P.21-26

ЗЭ. Kureakov B.G., Evdokioove M.D., Kuzjurlna L.A., Yakshina

Т.И,, Dorofejeva I.K. Soil siicroorganieBB growing in the presence of iron-containing minerals and hydrogen peroxide// The 9 Meet.on soil biology.-19S5.-P.41

Подп.в печать в в свет 5I.C,'.87 T-I455I Заказ «36 Тираж 130 Тнп.ЮЗУ Мянсевзапстроя СССР