Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование чувствительности иммобилизованного ферментативного реагента для экологических биолюминесцентных тестов

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование чувствительности иммобилизованного ферментативного реагента для экологических биолюминесцентных тестов"

На правах рукописи

Торгашина Ирина Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕСТОВ

03 00 16- экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ159697

Красноярск - 2007

003159697

Работа выполнена на кафедре биофизики Института естественных и гуманитарных наук ФГОУ ВПО «Сибирский федеральный университет»

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор Кратаскж Валентина Александровна Официальные оппоненты.

Доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич Кандидат биологических наук, профессор Григорьев Юрий Сергеевич

Ведущая организация ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Защита состоится 23 октября 2007 г в 14 час 00 мин на заседании диссертационного совета К 212 099 02 при ФГОУ ВПО «Сибирский федеральный универсиггет» по адресу 660041 г Красноярск, пр Свободный, 79

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института естественных и гуманитарных наук ФГОУ ВПО «СФУ»

Автореферат реферат разослан сентября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного

совета, к б н, доцент

Г Н Скопцова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В настоящее время для решения различных задач экологического мониторинга используется более 100 методов биологического тестирования. Наряду с общепринятыми живыми организмами, такими как бактерии, простейшие, водоросли и др, в качестве тест-объектов начинают использоваться разные ферментативные системы, отвечающие за важнейшие функции живых организмов Примеров ферментативных биотестов в настоящее время можно привести только два Это датчик, созданный на основе холинэстеразы, а также ферментативные тесты с использованием моноферментной и биферментной систем светящихся бактерий Однако при использовании ферментов в биотестах возникает ряд трудностей Во-первых, ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях повышенных температурах, экстремальных значениях рН и тд Во-вторых, использование ферментов светящихся бактерий в экологическом мониторинге осложняется отсутствием удобного и высокочувствительного реагента. Решение вышеизложенных проблем возможно при использовании в биотестах иммобилизованного реагента Иммобилизация ферментов позволяет разработать стабильный и удобный дозированный реагент, включающий все необходимые компоненты биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, для биолюминесцентного анализа. Однако успех получения такого препарата определяется выбором подходящего носителя и метода иммобилизации В связи с этим, чрезвычайно актуальным является поиск методов и условий иммобилизации ферментов светящихся бактерий, обеспечивающих высокую каталитическую активность при максимальной чувствительности к поллкугантам

Цель работы: Исследование взаимодействия ферментов и субстратов в гелевом окружении в зависимости от условий иммобилизации для создания многокомпонентного иммобилизованного реагента, предназначенного для ферментативного биотестирования при проведении экологического мониторинга водных систем

Основные задачи исследования

1 Изучение условий иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий для разработки реагента, обеспечивающего высокую чувствительность к действию поллюташов

2 Сравнение фермент-субстратных взаимодействий в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза для понимания условий работы реагента в экологических ферментативных биотестах

3 Сравнение чувствительности растворимого и иммобилизованного реагента к действию антропогенных поллютантов с целью разработки нового ферментативного биотеста с использованием иммобилизованного реагента.

Научная новизна Впервые изучено взаимодействие ферментов и субстратов при совместной иммобилизации ферментов (НАДН. ФМН-оксидоредукгазы и люциферазы) и субстратов (тетрадеканаль, ФМН и НАДН) Проведено сравнение влияния полимерных носителей различной природы на чувствительность и активность биферментной системы светящихся бактерий Изучены механизмы стабилизации смесей ферментов и субстратов при смене микроокружения в различных условиях (температура, рН и т.д) Получены зависимости чувствительности люциферазных биотестов от условий иммобилизации

Практическая значимость. Впервые разработан многокомпонентный иммобилизованный реагент для экологических ферментативных биотестов, отличающийся следующими преимуществами простота проведения анализа, высокая стабильность при хранении и использовании, а также при воздействии повышенных температур, экстремальных значений рН и т д На основе иммобилизованного реагента разработан новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического мониторинга водных экосистем и других видов мониторинга Метод и реагент пригодны для использования, как в лабораторных, так и в полевых условиях

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1 Многокомпонентный иммобилизованный дозированный реагент для биолюминесцентных ферментативных биотестов условия получения и применения в экологическом мониторинге водных экосистем

2 Фермент-субстратные взаимодействия в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза как основа для увеличения чувствительности ферментативных биотестов

3 Сравнительный анализ чувствительности экологических ферментативных биотестов с использованием растворимого и иммобилизованного реагента

4 Новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического и других видов мониторинга с использованием иммобилизованного многокомпонентного реагента

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на 41-ой Международной научной студенческой конференции, «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004), 11-ой Всероссийской студенческой научной конференции «Экология и проблемы защиты окружающей среды» (Красноярск, 2004), Научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков «Физика и Эйнштейн» (Красноярск, 2005), Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005), IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005), Всероссийской конференции аспирантов и студентов rio приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005), Школе-конференции «Экотоксикология. современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Социально-экологические проблемы природопользования в центральной Сибири» (Красноярск, 2007)

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов и материалов конференций,

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, главы с изложением результатов работы, заключением, выводов и списка литературы Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 16 таблицами и 9 рисунками Список литературы содержит 124 источников, в том числе 65 - зарубежных

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ФМН, ФМНН2 - окисленная и восстановленная формы флавинмононуклеотида, НАД, НАДН-окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотида, RCHO, RCOOH -длинноцепочечный алифатический альдегид и соответствующая жирная кислота, КРАБ - комплект реактивов аналитической биолюминесценции, L - люцифераза,

R - НАДН ФМН-оксидоредуктаза, С,4-тетрадеканаль, ДТТ - дитиотрейтол, ПДК - предельно допустимая концентрация, ЦБК - целлюлозно-бумажный комбинат, ХПК - химическое потребление кислорода, 1макс - максимальная интенсивность свечения, С - концентрация субстрата или ингибитора, К, - константа инактивации, Кт-константа Михаэлиса, Еа-энергия активации

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Первая глава диссертационной работы посвящена обзору литературы по методам биотестирования токсичности сред Приведены примеры использования бактериальных биолюминесцентных биотестов и биотестов на основе ферментативных реакций светящихся бактерий Представлен обзор методов иммобилизации различных светящихся организмов и выделенных из них ферментных систем. Рассмотрены преимущества и недостатки использования иммобилизованных биолюминесцентных систем в биотестировании Обосновано использование метода иммобилизации в гели для создания иммобилизованного реагента для ферментативных биолюминесцентных тестов Метод иммобилизации в полисахаридные i ели выбран, поскольку в этом случае не происходит искажения структуры фермента и сохраняется высокая каталитическая активность Выбор желатинового геля в качестве носителя обусловлен тем, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, в частности с липидами и белками и поэтому полагают, что изучение поведения ферментов иммобилизованных на белках позволяет понять закономерности их функционирования in vivo Кроме того, ценность выбранных полимерных носителей заключается в их нетоксичности, легкости биодеградации, что позволяет применять крахмал и желатину в фармацевтической и пищевой промышленностях Вместе с тем предложенные методы иммобилизации обеспечивают возможность совместной иммобилизации ферментов с их субстратами, что позволяет разработать удобный и высокочувствительный биотест для экологического мониторинга

Вторая глава диссертации посвящена описанию методов исследования В работе использовали комплект реактивов аналитической биолюминесценции (КРАБ), содержащий люциферазу (L) из рекомбинантного штамма Ecoli и НАД(Р)Н ФМН-оксидоредуктазу (R) из Photobacterium leiognathi, произведенный лабораторией бактериальной биолюминесценции Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Иммобилизацию люциферазы и НАДН ФМН-оксвдоредуктазы в гель проводили по модифицированному методу Кратасюк В А и др(1986) Для получения многокомпонентного иммобилизованного реагента в гель помимо ферментов вносили растворы субстратов тетрадеканаль, ФМН, НАДН Об активности полученных иммобилизованных препаратов судили по величине максимальной интенсивности свечения (1шкс, мВ)

Исследование влияния фенолов, хинонов, солей металлов, а также проб воды ЦБК различной степени очистки на биферментную систему в растворимом и иммобилизованном состоянии проводили путем добавления анализируемых водных проб в реакционную смесь для измерения биолюминесценции Реакцию биолюминесцентных биотестов определяли по величине остаточного свечения Iq/Ik'100% и константе ингибирования К Константы Михаэлиса для биферментной системы в растворе и иммобилизованном состоянии определяли по углу наклона прямых зависимостей скорости реакции от концентрации субстратов в

координатах Лайнуивера - Бэрка За скорость реакции принимали величину максимальной интенсивности свечения биферментной системы (1макс) Зависимость активности ферментов от рН окружающего раствора изучали, измеряя интенсивность свечения реакционной смеси, содержащей биферментную систему в растворимом или иммобилизованном состоянии при добавлении буфера с различным рН и ионной силой при комнатной температуре Зависимость активности ферментов от температуры изучали, измеряя интенсивность свечения биферментной системы после инкубации ферментов в жидкостном термостате УТ-8 (Термэкс-2, Россия) при температурах от 5 до 70 °С Реакцию инициировали добавлением НАДН

Третья глава диссертации посвящена описанию результатов исследований и их обсуждению В первом разделе рассматриваются условия иммобилизации биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в крахмальный и желатиновый гели, относящиеся к полисахаридам и белкам, соответственно

Иммобилизованные препараты ферментов получали в виде дисков, активность Которых зависела от условий приготовления реагента Для приготовления геля использовали пищевой желатин и различные типы крахмала картофельный, рисовый и кукурузный Варьировали концентрации гелей, время и режим высушивания иммобилизованных реагентов Выход активности биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза,

иммобилизовайной в крахмальный и желатиновый гель, рассчитывали как процентное отношение интенсивности свечения иммобилизованного реагента к интенсивности свечения биферментной системы в растворе Выход активности биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза зависит от природы полимерного геля, используемого для иммобилизации и его концентрации (табл 1) Максимальный выход активности ферментов, иммобилизованных в крахмальный гель, составил 100%, иммобилизованных в желатиновый гель - 17% Такой результат объясняется различным влиянием носителя на биферментную систему В случае иммобилизации в крахмальный гель не происходит ковалентного взаимодействия с активными грз'ппами фермента и полностью сохраняется его активность В случае иммобилизации ферментов в желатиновый гель происходят белок-белковые взаимодействия, что, возможно, приводит к частичному изменению конформации люциферазы и НАДН ФМН-оксидоредуктазы Для работы выбран 3,5% картофельный крахмальный гель и 5% желатиновый

Иммобилизованная ' биферментная система НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза не требует специальных условий хранения для обеспечения поддержания высокой активности ферментов при иммобилизации в крахмальный гель максимальная активность сохраняется

в течение 2-х лет, при иммобилизации в желатиновый гель - месяц В то же время, интенсивность свечения раствора биферментной системы уменьшается до нуля в течение трех суток

Необходимым этапом для разработки многокомпонентного высокочувствительного реагента, включающего и ферменты и субстраты биолюминесцентной реакции, является поиск условий, определяющих чувствительность биферментной системы светящихся бактерий

Таблица 1

Выход активности биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной в крахмальный и желатиновый гель

Носитель для иммобилизации биферментной системы Концентрация геля, %

3 | 3,5 | 4 | 5 | 6

Выход активности биферментной системы, %

Картофельный крахмал 100 82,6 64,4 31,8 -

Рисовый крахмал 51,4 - 12,8 22,6 -

Кукурузный крахмал 17,4 - 26 14,5 -

Желатин - - 17 7,2 6,9

«-» - измерения не проводились

Известно, что чувствительность ферментативных реагентов к действию поллютантов уменьшается при увеличении концентрации ферментов, так как от количества ферментов зависит их активность (Березин и др, 1987) Поскольку биферментная система, иммобилизованная в крахмальный гель, имеет высокую активность, одним из путей для обеспечения высокой чувствительности к действию поллю гантов является уменьшение количества ферментов в иммобилизованном реагенте (диске) Наряду с этим, для увеличения чувствительности к поллютантам варьировали количеством субстратов ФМН и НАДН в реакционной смеси Зависимости остаточной интенсивности свечения биферментной системы, иммобилизованной в крахмальный гель, при действии сульфата меди от количества люциферазы в диске при разных количествах ФМН и НАДН в реакционной смеси представлены в таблице 2

Из таблицы 2 видно, что чувствительность биферментной системы увеличивается с уменьшением как количества люциферазы, так и количества субстратов Максимальная чувствительность иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы достигалась при количестве люциферазы - 0,8 мкг, ФМН - 1,3 мкг и НАДН - 14 мкг

Для дальнейших исследований был приготовлен иммобилизованный реагент, содержащий ферменты и субстраты в ранее подобранных количествах, а именно 0,8 мг люциферазы, 1,3 мг ФМН, 14 мг НАДН, 137 нг тетрадеканапя Наибольшей активностью обладали реагенты, содержащие (И+Ь)+С14, (К+Ь)+НАДН+С[4, иммобилизованные в 3% и 3,5% крахмальный гель В этом случае выход активности составлял 100% (рис 1)

Реагент, содержащий все компоненты реакционной смеси имел низкий выход активности (4%) и характеризовался высокой скоростью каталитической реакции, что делает невозможным регистрацию свечения, вследствие этого реагент Ь+К+Сн+НАДН+ФМН является непригодным для биолюминесцентного анализа

Таким образом, в качестве лучшего из препаратов для дальнейшего исследования выбран реагент следующего состава (И+Ь)+С14+НАДН Этот реагент содержит необходимое количество ферментов и двух субстратов, анализ

токсичности водной среды при этом упрощается, так как сводится к добавлению к иммобилизованному препарату раствораФМН и анализируемой пробы.

Таблица 2

Остаточная интенсивность свечения иммобилизованной в крахмальный гель биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-лющ1фераза при добавлении СивО* (1 мг/л).

Субстрат ы Количество люциферазм

4 мкг 2 мю'

ФМН, МКГ 13 1,3 1,3 13 1,3 1,3

НАДН, мкг 56 28 14 56 28 7

Остаточная интенсивность свечения, % 100 100 69 100 100 48,7

1,3 мкг 0,8 мкг

ФМН, мкг 13 6,5 1,3 13 1,3 1,3

НАДН, мкг 56 28 14 56 14 7

Остаточная интенсивность свечения, % 66,5 79 62,5 33 12 0

120 -,

ФМИ

□ 3% гель ¡3 3,5% гель Ш 4% гель

Рис, 1. Выход активности биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной совместно с субстратами и крахмалы ¡ый гель.

Аналогичные эксперименты проводили с иммобилизацией а желатиновый гель. Дня совместной иммобилизации ферментов и субстратов в

желатиновый гель использовали выше подобранные в экспериментах с крахмальным гелем количества субстратов 14 мг НАДН и 137 нг тетрадеканаля Количество люциферазы было выбрано 4 мкг, поскольку при иммобилизации в желатиновый гель происходит более сильная инактивации фермента. Уменьшение содержания люциферазы становится нецелесообразным из-за низкой активности иммобилизованного в желатиновый гель реагента.

Ранее нами было показано, что чувствительность биферментной системы зависит от количества ФМН, поэтому была получена зависимость чувствительности многокомпонентного реагента Ь+Ш-С^+НАДН к действию сульфата меди от количества ФМН в реакционной смеси (табл 3)

Таблица 3

Остаточная интенсивность свечения биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной совместно с тетрадеканалем и НАДН при добавлении Си804

Концентрация Си804 -1 мг/л Ь+Я+С^+НАДН, иммобилизованные в крахмальный гель

Количество люциферазы 0,8 мкг

ФМН, мкг 13 6,5 3,3 1,3

Остаточная интенсивность свечения, % 100 100 100 52

Концентрация Си804 -10 мг/л Ь+Л+С |4+НАДН, иммобилизованные в желатиновый гель

Количество люциферазы 4 мкг

ФМН, мкг 13 6,5 3,3 1,3

Остаточная интенсивность свечения, % 100 95 94 85

Из таблицы 3 видно, что чувствительность ферментативного реагента зависит от количества ФМН для биферментной системы, иммобилизованной как в крахмальный, так и в желатиновый гель Чувствительность реагента увеличивается при уменьшении количества добавляемого ФМН Причем чувствительность биферментной системы, иммобилизованной в крахмальный гель, выше в 10 раз по сравнению с биферментной системой, иммобилизованной в желатиновый гель Ингибирование ферментативной реакции, катализируемой иммобилизованным в крахмальный гель реагентом Ь+Я+С^+НАДН, начиналось при добавлении сульфата меди в концентрации 1 мг/л, в то время, как для реагента, иммобилизованного в желатиновый гель, это значение составляло 10 мг/л Таким образом, показано, что чувствительность многокомпонентного биолюминесцентного иммобилизованного реагента Ь+Л+Сн+НАДН зависит от природы выбранного носителя, а также от количества люциферазы и субстратов ФМН и НАДН

Во втором разделе главы 3 рассматриваются условия использования полученных иммобилизованных реагентов, поскольку для практических целей часто требуется, что бы ферменты работали при повышенных температурах,

экстремальных значениях рН, в присутствии высоких концент раций органических растворителей и т д

Исследовали влияние рН реакционной смеси на активность растворимой и иммобилизованной биферментной системы Исходный раствор ферментов для иммобилизации приготавливали в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,8, те в условиях, обеспечивающих максимальную активность биферментной системы in vitro

РН

Рис 2 Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза от рН реакционной смеси Нормирование интенсивности свечения проводили по отношению к максимальному значению 1 - Ь+Я, растворимые, 2 - Ь+Я, иммобилизован-ные в желатиновый гель, 3 - Ь+Ш-См+НАДН, иммобилизованные в желатиновый гель, 4 - Ь+Я+С^+НАДН, иммобилизованные в крахмальный гель; 5 - ЫЯ, иммобилизованные крахмальный в гель

Как видно из рисунка 2 зависимость интенсивности свечения растворимой биферментной системы от рН реакционной смеси имеет колоколообразный вид с максимумом в точке 6,8, что в данном случае является рН-оптимумом В случае реагентов Ь+Л и Ь+Я+С14+НАДН, иммобилизованных в крахмальный гель, наблюдается расширение рН-оптимума как в область низких значений рН, так и в область высоких значений

Интенсивность свечения была не менее 80% во всем рассмотренном диапазоне значений рН от 5,8 до 8,0, что указывает на значительную стабилизацию ферментов вследствие процесса иммобилизации по отношению к изменению рН реакционной смеси В случае реагентов Ь+Я и Ь+Я+С^+НАДН, иммобилизованных в желатиновый гель, происходил сдвиг рН - оптимума в щелочную область до 7,2

Таким образом, тест с использованием иммобилизованных в крахмальный гель ферментов и субстратов, не реагирует на изменение рН реакционной смеси и может быть использован для анализа водных проб, характеризующихся широким диапазоном значений рН

Известно, что при иммобилизации ферментов на разных носителях происходит увеличение термостабильности Для изучения зависимости

интенсивности свечения биферментной системы в растворимом и иммобилизованном состоянии от температуры проводилось инкубирование биолюминесцентных ферментативных реагентов при разных температурах с последующим измерением интенсивности свечения реагентов

На рисунке 3 показана зависимость интенсивности свечения биолюминесценции для разных реагентов от температуры инкубирования Для растворимой биферментной системы температурный оптимум (т е диапазон температур, при которых наблюдается максимальная интенсивность свечения препаратов фермешов) составлял 20-25°С, при 40°С растворимая биферментная система полностью теряла свою активность

1/1макс

Т,°С

Рис 3 Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктазы-люциферазы от температуры инкубирования Нормирование интенсивности свечения проводили на максимальное значение 1 -Ь+И, растворимые, 2 - Ь+Б, иммобилизован-ные в желатиновый гель, 3 -[-Ж+С [4+НАДН, иммобилизованные в желатиновый гель, 4 -Ь+Я+С^+НАДН, иммобилизованные в крахмальный гель, 5 - Ь+И, иммобилизованные крахмальный в гель

Иммобилизованные реагенты сохраняли высокую каталитическую активность при действии температур во всем рассмотренном диапазоне (от 4°С до 70°С), Так, для реагентов Ь+К. и Ь+Л+Сн+НАДН, иммобилизованных в крахмальный гель, интенсивность свечения составляла не менее 60% от максимальной, для реагентов, иммобилизованных в желатиновый гель, не менее 50% При иммобилизации ферментов и ферментов совместно с субстратами в крахмальный гель температурный оптимум составляет от 4 до 50 °С, в желатиновый гель - от 15 до 50 °С Таким образом, иммобилизованная в крахмальный гель биферментная система пригодна для использования в широком диапазоне температур

Для подтверждения стабилизации иммобилизованных реагентов необходимо исследовать их активность при длительном воздействии высоких

температур На рисунке 4 представлена температурная зависимость инактивации иммобилизованной и растворимой биферментной системы в координатах Аррениуса

По углу наклона прямых рассчитаны эффективные значения энергии активации для растворимой биферментной системы - 201 кДж/моль, для Ь+Л иммобилизованных в желатиновый гель - 79 кДж/моль, для Ь+Я+С^+НАДН иммобилизованных в желатиновый гель - 162 кДж/моль, для Ь+И иммобилизованных в крахмальный гель - 30 кДж/моль, для Ь+Я+Ск+НАДН иммобилизованных в крахмальный гель - 129 кДж/моль

1пК1

1000/Т, К"1

Рис 4 Константы скоростей инактивации биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в координатах Аррениуса 1 Ь+И, растворимые, 2 - Ь+к, иммобилизованные крахмальный в гель, 3 - Ь+Л, иммобилизованные в желатиновый гель, 4 -Ь+Ш-См+НАДН, иммобилизованные в крахмальный гель, 5 - Ь+Я+Сн+НАДН, иммобилизованные в желатиновый гель

Таким образом, значения энергии активации для иммобилизованных препаратов ферментов меньше, чем для растворимых.Это означает, что в процессе иммобилизации ферментов в крахмальный и желатиновый гели происходит ужесточение конформации белков и ограничение их подвижности в иммобилизованном реагенте Образовавшийся в процессе иммобилизации комплекс белок-матрица является термодинамически более выгодным по сравнению с растворимой биферментной системой, так как характеризуется меньшим значением энергии активации

При сравнении влияния различных носителей на термоинактивацию иммобилизованной биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза видно, что для желатинового геля значения энергии активации больше, чем для крахмального геля, как для реагентов ЫТ*, так и Ь+И+С14+НАДН Это подтверждает предположение о том, что иммобилизация в желатиновый гель приводит к частичному изменению конформации ферментов люциферазы и/или НАДН ФМН-оксидорудуктазы Среди рассмотренных реагентов самым термодинамически стабильным является иммобилизованный в крахмальный гель реагент Ь+И, поскольку характеризуется наименьшей энергией активации (30 кДж/моль)

Таким образом, реагенты, полученные путем иммобилизации биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, обладают рядом несомненных преимуществ по сравнению с растворимыми препаратами ферментов они сохраняют свою стабильность в более широком температурном диапазоне, являются более устойчивыми к изменению химического окружения (например, рН), хранятся в течение длительного времени без обеспечения специальных условий хранения В связи с этим многокомпонентный реагент Ь+Я+С14+НАДН удобен для использования в экологическом мониторинге водных систем, как в лабораторных, так и полевых условиях

В третьем разделе главы 3 рассматриваются способы проведения биолюминесцентного анализа для растворимой биферментной системы и многокомпонентного иммобилизованного реагента, приводится сравнение чувствительности растворимой и иммобилизованной биферментной системы к действию модельных поллютантов

Метод определения токсичности водной пробы с помощью биферментной системы заключается в изменении интенсивности свечения биферментной системы в реакционной смеси при добавлении исследуемого раствора Реакционная смесь для проведения биолюминесцентной реакции, катализируемой растворимой биферментной системой НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза включает раствор ферментов, суи-тратов и буферный раствор, необходимый для поддержания оптимального для работы ферментов рН К этой смеси добавляется анализируемая проба в объеме 50 мкл (метод 1, табл 4) Таким образом, соотношение объем пробы/объем реакционной смеси - 1/10 Здесь при анализе происходит разбавление пробы в реакционной смеси, где основной объем составляет буферный раствор (500 мкл) Соли буфера могут взаимодействовать с веществами в тестируемой пробе, не оказывая при этом должного эффекта на активность ферментов В этом случае затруднена корректная интерпретация результатов При анализе с использованием иммобилизованного реагента, как было показано выше, рН окружающего раствора не оказывает существенного влияния на измерения и потому не требует добавления буфера. В этом случае, реакционная смесь состоит из реагента, содержащего ферменты и субстраты, раствора ФМН и анализируемой пробы (метод 2, табл 4), что позволяет значительно упростить проведение анализа

На примере иммобилизованного в желатиновый гель реагента Ь+Я+См+НАДН проведено сравнение чувствительности реагента к действию сульфата меди в зависимости от используемого метода (рис. 5) Как видно из рисунка, различий в чувствительности иммобилизованного реагента Ь+Я+Сн+НАДН не наблюдается

Таким образом, метод анализа водных проб с использованием многокомпонентного ферментативного биолюминесцентного реагента Ь+Я+С|4+НАДН обладает значительными преимуществами по сравнению с использованием растворимой биферментной системы, а именно простотой проведения анализа, отсутствием необходимости добавления буферного раствора и поддержания определенного значения рН реакционной смеси

Необходимым этапом для успешного использования разработанных иммобилизованных реагентов является исследование их чувствительности к ряду различных токсических соединений В качестве модельных поллютантов в работе были выбраны ряды фенолов, хинонов и солей тяжелых металлов, поскольку эти

вещества относятся к наиболее распространенным загрязнителям, поступающим в поверхностные воды со сточными водами различных предприятий

Таблица 4

Методы биолюминесцентного анализа токсичности биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза

МЕТОД 1 МЕТОД 2

Растворимая биферментная система, иммобилизованный реагент Ь+К Многокомпонентный реагент Ь+К+С14+НАДН Многокомпонентный реагент Ь+Я+См+НАДН

Реакционная смесь

1) Раствор ферментов (или диск с иммобилизованными Ь+Л) 10 мкл 2) Раствор тетрадеканаля 50 мкл 3) Раствор ФМН 5 мкл 4) Раствор НАДН 50 мкл 5) Буферный раствор 400 мкл 6) Анализируемая проба 50 мкл 1) Мембрана с иммобилизованными ¡ы-к+с14-шдон 2) Раствор ФМН 5 мкл 5) Раствор буфера 500 мкл 4) Анализируемая проба 50 мкл 1) Мембрана с иммобилизованными Ы-Я+С,4+ЫАОН 2) Раствор ФМН 5 мкл 3) Анализируемая проба 500 мкл

В таблице 5 представлены концентрации поллютантов, вызывающие 50%-ингибирование биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза Показано, что для большинства исследуемых поллютантов чувствительность растворимой биферментной системы и иммобилизованных реагентов Ь+Я и Ь+К+С^+НАДН не различалась Для реагентов, иммобилизованных в желатиновый гель, чувствительность отличалась на порядок для ряда поллютантов бромгидрохинона, толухинона. В то же время, чувствительность биферментной системы, в том числе и иммобилизованной на исследуемых носителях, выше либо сравнима с ПДК некоторых хинонов для питьевой воды Однако, для фенолов чувствительность как иммобилизованной, так и растворимой биферментной системы меньше указанных ПДК Такой результат объясняется различиями в механизмах ингибирования биферментной системы фенолами и хинонами В отличие от фенолов, хиноны вступают в конкурентные отношения с ФМН и тем самым нарушают взаимодействие между НАДН ФМН-оксидоредуктазой и люциферазой, что приводит к увеличению чувствительности (Кудряшева и др , 1994)

С, мг/'л

Рис 5 Зависимость интенсивности свечения биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, иммобилизованной в желатиновый гель совместно с тетрадеканалем и НАДН, от концентрации сульфата меди при разных схемах проведения анализа

Проведено исследование влияния проб сз очных вод различной степени очистки Енисейского целлюлозно-бумажного комбината на биолюминесценцию биферментной системы В таблице 6 представлены результаты анализа проб сточной воды разной степени очистки, предоставленные лабораторией цеха очистки промышленных стоков

В работе исследовали чувствительность растворимой биферментной системы и иммобилизованного в крахмальный гель многокомпонентного реагента Ь+Я+С)4+НАДН в зависимости от соотношения объемов реакционной смеси и пробы, а также момента внесения пробы в реакционную смесь В первом случае исследуемую пробу воды добавляли после достижения максимального уровня свечения, т е когда биферментная система функционирует в стационарном режиме и определяли остаточную интенсивность свечения 1о/1к 100% (метод 1, табл 7) Во втором случае 50 мкл анализируемого образца сточной воды помещали в реакционную смесь непосредственно перед запуском реакции субстратом реакции - ФМН Контрольное значение интенсивности свечения регистрировали в реакционной смеси без добавления анализируемого образца сточной воды (метод 2, табл 7) В третьем случае объем реакционной смеси для растворимой биферментной системы был уменьшен до 100 мкл, при этом объем анализируемой пробы воды составлял 500 мкл Таким образом, соотношение количества компонентов биферментной системы и анализируемого раствора составляло 1 5

Концентрации поллютантов, вызывающие 50% ингибирование биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-

люцифераза, (мг/л)

Растворимая биферментная Иммобилизованная биферментная система

Название в крахмальный гель в желатиновый гель

Ь+Я Ь+Е1+С,4+НАДИ Ь+Я 1Ж+С14+НАДН

Бензохинон (ЩК 0,1 мг/л) 0,01 0,09 0,10 0,10 0,30

2 И о я Тимохинон 0,08 0,20 0,08 0,20 0,20

X Толухинон 0,09 0,05 0,01 0,40 0,30

Нафтохинон (ПДК 0,25 мг/л) 0,10 0,20 0,08 0,30 0,80

3 С! о Бромгидрохинон 3,80 8,30 9,90 39,60 39,60

ж и © Гидрохинон (ПДК 0,2 мг/л) 21,00 25,00 12,00 47,20 47,20

СоС12 2,60 0,10 0,50 0,50 0,50

к ч СиБ04 0,40 0,50 0,60 0,50 0,60

о о К4[Ре(СН)6] 0,70 0,80 0,80 0,70 1,20

Кз[Ге(СН)6] 0,50 0,60 0,60 0,60 0,50

Таблица 6

Протокол результатов анализа сточной и очищенной воды лаборатории цеха очистки промышленных стоков ООО Енисейский целлюлозно-бумажный комбинат (от 22 03 2007)

Определяемый компонент Ед изм Результат измерений

Проба №1 Проба№2 Проба№3

рН ед рН 6,5 6,2 3,3

ХПК мг/дм3 3000 2200 2000

Взвешенные вещества мг/дм3 300 74 51

Аммоний ион мг/дм3 66 53 48

Нитриты мг/дм3 <0,02 <0,02 <0,02

Нитраты мг/дм3 6,2 0,1 0,1

Проба №1 - поступающая в цех сточная вода, №2 - сточная вода после механической очистки, №3 -вода после очистных сооружений

Реакционная смесь иммобилизованного реагента Ь+Я+Сн+НАДН состояла из 500 мкл анализируемой пробы и 5 мкл раствора ФМН В качестве контрольного раствора добавляли либо 500 мкл 0,05 М натрий-фосфатный буфера рН 7, либо 500 мкл дистиллированной воды Контрольный и анализируемый образцы добавляли до запуска реакции ФМН (метод 3, табл 7)

Результаты эксперимента показали (табл 7), что проведение анализа с использованием растворимой биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза возможно методом 1 либо методом 2, где количество добавляемой в реакционную смесь пробы составляет 50 мкл Растворимая биферментная система оказалась непригодной для исследования представленных проб методом 3, поскольку в этом случае отсутствует буферный раствор и рН реакционной смеси не соответствует оптимальному значению (6,8) Таким образом, нельзя разделить два эффекта, уменьшение интенсивности свечения биферментной системы в результате ингибирования ферментативной активности компонентами анализируемого образца и инактивацию ферментов вследствие изменения рН реакционной смеси Препараты ферментов, иммобилизованные в крахмальный гель, не требуют добавления буфера в реакционную смесь и позволяют проводить измерение в широком диапазоне значений рН Показания биотеста с использованием иммобилизованного многокомпонентного реагента соответствуют изменению химических характеристик анализируемых проб согласно показаниям биотеста токсичность проб уменьшается в ряду проба 1>проба 2 > проба 3

Таким образом, показана возможность использования иммобилизованного ферментативного многокомпонентного реагента для определения степени загрязнения водных систем сточными водами ЦБК

Остаточная интенсивность свечения (1о/1к, %) биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза - люцифераза при

действии проб сточных вод ЦБК

Проба/ разведение МЕТОД 1 Добавление 50 мкл пробы после достижения 1тах МЕТОД 2 Добавление 50 мкл пробы перед запуском реакции ФМН МЕТОД 3 Изменение соотношения пробы и реакционной смеси (10 1)

Растворимая система Ь+Я Иммобилизованная система 1>И+С14+КАОН Растворимая система L+R Иммобилизованная система Ь+Л+См+МАБН Расгворимая система Ь+Я Контроль буфер/ Контроль дН20 Иммобилизованная ь+я+с14+каон Контроль буфер/ Контроль дН20

№1 /1 3,0 - - - 0/0 0/0

№1 /10 78,9 62,9 81,5 39,0 4,5 / 24,0 9,1/9,5

№1 /100 - - - - 36,3 / 190,0 65,9/69,0

№2/1 11,4 - - - 0/0 0/0

№2 /10 90,0 80,9 67,8 59,0 8,6 / 45,0 19,7/20,6

№2/20 106,7 - - - 22,6/118,0 41,4/43,4

№3/1 9,1 - - - 0/0 58,4 / 63,6

№3 /10 89,6 89,7 57,9 63,4 9,2 / 48,0 77,6/81,3

№3/20 104,0 - - - 13,9/73,0 105,1/110,1

«-» - измерения не проводились

ВЫВОДЫ

1 Разработаны условия получения многокомпонентного иммобилизо-ванного дозированного реагента для экологического мониторинга водных систем, включающего ферменты (НАДН ФМН-оксидоредуктазу и люциферазу) и субстраты (тетрадеканаль, НАДН) биферментной системы светящихся бактерий Реагент не требует специиальных условий хранения и сохраняет 100 % активности в течение 2-х лет

2 При иммобилизации биферментной системы НАД(Р)Н ФМН-оксидо-редуктаза-люцифераза в крахмальный и желатиновый гели наблюдается повышение устойчивости ферментов к химическим и физическим факторам среды pH-оптимум расширяется как в кислую, так и щелочную области, повышается устойчивость ферментов к высоким концентрациям солей, а также термостабильность

3 Иммобилизация биферментной системы в крахмальный и желатиновый гели не приводит к существенной потери чувствительности ферментативных реагентов к действию модельных токсических веществ Увеличение чувствительности иммобилизованного многокомпонентного реагента достигается варьированием состава реагента и выбором носителя для иммобилизации

4 Предложен новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического и других видов мониторинга, заключающийся в использовании иммобилизованного многокомпонентного реагента, позво-ляющего оптимизировать проведение фермешативного биотестирования

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах

1 Esimbekova Е N Disk-shaped immobilized multicomponent reagent for biolutmnescen analyses correlation between activity and composition / EN Esimbekova, V A Kratasyuk, I G Torgashina // Enzyme and Microbial Technology -2007 - №40 - P 343-346

2 Кратасюк В А Роль научного исследования в оптимизации экологического образования / В А Кратасюк, Е Г Лапатина-Кратасюк, И Е Суковатая, И Г Торгашина, О А Осипенко // Вестник КрасГУ - 2006 - N6/1 - С 281-286

3 Есимбекова ЕН Иммобилизованный многокомпонентный реагент для биолюминесцентных биотестов токсичности / Е Н Есимбекова, В А Кратасюк, Никифорова МА, Торгашина ИГ // Производство экологически безопасной продукции (проблемы и пути решения) Прил к «Вестнику КрасГАУ» Сб науч ст Вып 1 -2005 - С 109-114

4 Торгашина И Г Иммобилизованный реагент на основе биферментной системы светящихся бактерий для мониторинга водных экосистем / ИГ Торгашина, Е Н Есимбекова, В А Кратасюк // Материалы Всерос-сийской конф аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» 2005 - Ярославль, 2005 - С 205 - 208

5 Торгашина И Г Иммобилизация биферментной системы светящихся бактерий в крахмальный гель для мониторинга водных экосистем / ИГ Торгашина, Т А Парфенчук, Е Н Есимбекова, В А Кратасюк // Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии Тез докл Школа-конференция 2006 -Пущино, 2006 - С 121-123

6. Торгашина ИГ Исследование чувствительности иммобилизованной

биферментной системы НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза к действию

фенолов и хинонов /ИГ Торгашина // Материалы XLI международной науч студ конф 2003 - Новосибирск, 2003 - С 67

7 Торгашина И Г Исследование чувствительности биолюминесцентных тестов к компонентам химического и радиационного загрязнения водных экосистем /ИГ Торгашина // НКСФ-2004 Тез докл науч конф студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков 2004 - Красноярск, 2004 - С 61

8 Торгашина И Г Исследование чувствительности биолюминесцентных тестов к действию ионизирующего излучения /ИГ Торгашина // Экология и проблемы защиты окружающей среды Тез докл XI Всероссийская студенческая науч конф 2004 - Красноярск, 2004 - С 135-136

9 Есимбекова Е Н Исследование влияния гелевого окружения на активность биферментной системы светящихся бактерий НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза / Е Н Есимбекова, В А Кратасюк, И Г Торгашина // III Съезд биофизиков России. Тез докл 2004 - Воронеж, 2004 - С 33-34

10 Торгашина ИГ Разработка иммобилизованного реагента на основе биферментной системы светящихся бактерий НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза /ИГ Торгашина // Физика и Эйнштейн НКСФ-2005 Тез докл науч конф студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков 2005 — Красноярск, 2005 - С 119

И Торгашина ИГ Исследование чувствительности биолюминесцентных тестов к действию химического загрязнения водных экосистем /ИГ Торгашина, ЕН Есимбекова // 9-ая Дальневосточная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии Тез докл. 2005 - Владивосток, 2005 -С 57

12 Торгашина ИГ Исследование чувствительности биолюминесцентных тестов к действию ионизирующего излучения и химического загрязнения водных экосистем /ИГ Торгашина, Е Н Есимбекова, В А Кратасюк // Современные аспекты экологии и экологического образования Тез докл Всероссийская научная конференция 2005. - Казань, 2005 - С 303 - 304

13 Есимбекова ЕН Иммобилизованный реагент на основе биферментной системы светящихся бактерий НАДН ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза / Е Н. Есимбекова, В А Кратасюк, И Г Торгашина // IV Съезд фотобиологов России Тез докл 2005 - Саратов, 2005 - С 44-45

Подписано в печать 21,бд 0? Формат 60x84/16 Бумага тип Печать офсетная Уел п л Тираж 100 Заказ 55

Сибирский федеральный университет Институт естественных и гуманитарных наук Издательский центр

660041 г Красноярск, пр Свободный, 79

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Торгашина, Ирина Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологическое тестирование в экологическом мониторинге.

1.1.1. Задачи биологического мониторинга.

1.1.2. Биологическое тестирование водных объектов.

1.2. Биолюминесцентные биотесты.

1.2.1. Биотесты основанные на светящихся бактериях.

1.2.2. Биотесты, основанные на использовании ферментативных реакций светящихся бактерий.

1.2.3. Характеристика тест-объекта - ферментов светящихся бактерий.

1.3. Использование иммобилизованных ферментов в биотестировании.

1.3.1. Методы иммобилизации биолюминесцентных систем.

1.3.2. Преимущества и недостатки различных способов иммобилизации биолюминесцентных систем.

1.3.3. Гели на основе крахмала и желатина - носители для иммобилизации биолюминесцентной биферментной системы.

1.4. Обоснование задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Методы получения иммобилизованных ферментов.

2.3. Измерение активности биолюминесцентных биотестов.

2.4. Методы определения чувствительности биолюминесцентных биотестов к действию модельных поллютантов и сточных вод целлюлозно-бумажного комбината.

2.5. Определение кинетических параметров биолюминесцентных биотестов.

2.6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка биотеста на основе иммобилизованной биферментной системы светящихся бактерий.

3.1.1. Выбор условий иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза.

3.1.2. Особенности катализа иммобилизованными ферментами биферментной системы светящихся бактерий.

3.1.3. Зависимость чувствительности иммобилизованной биферментной системы к сульфату меди от состава реакционной смеси.

3.1.4. Создание многокомпонентного иммобилизованного реагента.

3.2. Подбор условий проведения ферментативного биотестирования с использованием многокомпонентного иммобилизованного реагента.

3.2.1. Влияние рН реакционной смеси на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.

3.2.2. Влияние ионной силы реакционной смеси на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.

3.2.3. Влияние температуры на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.

3.3. Анализ чувствительности иммобилизованных ферментативных реагентов для экологического биолюминесцентного биотестирования.

3.3.1. Подбор методики биолюминесцентного анализа с использованием иммобилизованной биферментной системы.

3.3.2. Исследование чувствительности иммобилизованной биферментной системы к действию модельных поллютантов.

3.3.3. Исследование влияния сточных вод Енисейского целлюлозно-бумажного комбината на биолюминесцентную реакцию, катализируемую биферментной системой НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование чувствительности иммобилизованного ферментативного реагента для экологических биолюминесцентных тестов"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время для решения различных задач экологического мониторинга используется более 200 методов биологического тестирования. В биотестах контролируется влияние факторов токсичности среды на такие параметры жизнедеятельности живых организмов как летальный исход, скорость роста, интенсивность дыхания и другие параметры жизнедеятельности, в основе которых лежат разнообразные метаболические процессы. Наряду с биотестами, где в качестве тест-объектов используются живые организмы, такие как бактерии, простейшие, водоросли и др., в последнее время в биотестах для экологического мониторинга широко используются разные ферментативные системы, отвечающие за важнейшие функции живых организмов. Очевидными преимуществами так называемых ферментативных биотестов является их высокая чувствительность, экспрессность, но главное - высокая надежность и точность анализа по сравнению с тестами с использованием живых объектов с постоянно меняющимися характеристиками. Такой подход дает возможность не только определить степень загрязнения окружающей среды, но и понять механизмы действия тех или иных токсикантов на живые организмы в экосистеме. Однако примеров ферментативных биодатчиков для контроля за токсичностью природных и сточных вод в настоящее время можно привести только два. Это датчик, созданный на основе холинэстеразы, а также ферментативные биотесты с использованием моноферментной и биферментной систем светящихся бактерий.

Новое направление биолюминесцентного анализа - люциферазные биотесты - было предложено и развивается в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН с использованием биолюминесцентных реакций бактерий (Кратасюк, 1994; Kratasyuk, 1990). Были найдены условия для конструирования биолюминесцентных ферментативных биотестов по заказу их пользователя под определенные задачи и с требуемыми характеристиками, например, для определения цветения водоемов, чувствительностью на уровне ПДК, высокой точностью, временем анализа -не более 5 минут и другими характеристиками (Есимбекова, 2000).

Однако широкое использование ферментов светящихся бактерий в качестве тест-объектов в биотестах имеет некоторые ограничения и недостатки по сравнению с общепринятыми биотестами, так как анализ проводят на растворимой смеси ферментов: НАДН: ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы. Разные партии реагентов (лиофилизованных препаратов этих ферментов) различаются по своим характеристикам, к тому же ферменты в растворах достаточно быстро теряют свою активность во время измерений. Это является причиной дороговизны и невысокой точности при длительном (например, ежедневно в течение месяца) использовании люциферазных биотестов в экологическом мониторинге. Наряду с нестабильностью препаратов ферментов при использовании и хранении, а также при различных воздействиях (повышенных температурах, экстремальных значениях рН и т.д.) по сравнению с тестом на бактериях, метод более сложный, так как в одном измерении надо дозировать 5 компонентов реакционной смеси (раствор ферментов, альдегида, ФМН, НАДН и буферный раствор).

Решение вышеизложенных проблем возможно при изучении возможности замены лиофилизованных и растворимых ферментов на иммобилизованный препарат. Однако успех получения такого препарата определяется выбором подходящего носителя и метода иммобилизации. В настоящее время предложено более десятка способов и носителей для иммобилизации ферментов светящихся бактерий (Kratasyuk, Esimbekova, 2003). Среди них наиболее перспективными для получения иммобилизованного реагента для экологических биотестов являются методы включения ферментов в полимерные гели, так как они позволяют создать оптимальное микроокружение для ферментов, и тем самым сохранить их высокую каталитическую активность и обеспечить стабильность препаратов при длительном хранении. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбора соответствующей гелеобразующей системы. В качестве носителей для иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий могут быть выбраны гели различной природы: желатиновый и крахмальный. Выбор крахмального геля, как полисахарида, обусловлен его нетоксичностью и нейтральностью. В то же время использование желатинового геля, как белкового носителя для иммобилизации биферментной системы, позволяет понять закономерности функционирования ферментов in vivo, поскольку многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, в частности с липидами и белками. Более того, крахмал и желатин являются относительно дешевыми реактивами, а процедура иммобилизации ферментов в гели не трудоемка, что немаловажно с точки зрения коммерциализации полученных реагентов. Все это доказывает, что при иммобилизации люциферазы в гели возможно получение стабильного, удобного в использовании и дозированного реагента, включающего все необходимые компоненты для биолюминесцентных ферментативных биотестов.

Необходимым этапом для разработки чувствительных биодатчиков на основе иммобилизованных ферментов НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и успешного использования разработанных биодатчиков в экологическом мониторинге является исследование влияния полимерной матрицы на активность и чувствительность ферментов, кинетико -термодинамические параметры, а также особенности взаимодействия ферментов с субстратами и ингибиторами.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Исследование взаимодействия ферментов и субстратов в гелевом окружении в зависимости от условий иммобилизации для создания многокомпонентного иммобилизованного реагента, предназначенного для ферментативного биотестирования при проведении экологического мониторинга водных систем.

Основные задачи исследования:

1. Изучение условий иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий для разработки реагента, обеспечивающего высокую чувствительность к действию поллютантов.

2. Сравнение фермент-субстратных взаимодействий в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза для понимания условий работы реагента в биолюминесцентных ферментативных биотестах.

3. Сравнение чувствительности растворимого и иммобилизованного реагента к действию антропогенных поллютантов с целью разработки нового ферментативного биотеста с использованием иммобилизованного реагента.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучено взаимодействие ферментов и субстратов при совместной иммобилизации ферментов (НАДН:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы) и субстратов (тетрадеканаль, ФМН и НАДН). Проведено сравнение влияния полимерных носителей различной природы на чувствительность и активность биферментной системы светящихся бактерий. Изучены механизмы стабилизации смесей ферментов и субстратов при смене микроокружения в различных условиях (температура, рН и т.д.). Получены зависимости чувствительности люциферазных биотестов от условий иммобилизации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые разработан многокомпонентный иммобилизованный реагент для экологических ферментативных биотестов, отличающийся следующими преимуществами: простота проведения анализа, высокая стабильность при хранении и использовании, а также при воздействии повышенных температур, экстремальных значений рН и т.д. На основе иммобилизованного реагента разработан новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического мониторинга водных экосистем и других видов мониторинга. Метод и реагент пригодны для использования, как в лабораторных, так и в полевых условиях.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Многокомпонентный иммобилизованный дозированный реагент для биолюминесцентных ферментативных биотестов: условия получения и применения в экологическом мониторинге водных экосистем.

2. Фермент-субстратные взаимодействия в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза как основа для увеличения чувствительности ферментативных биотестов.

3. Сравнительный анализ чувствительности экологических ферментативных биотестов с использованием растворимого и иммобилизованного реагента.

4. Новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического и других видов мониторинга с использованием иммобилизованного многокомпонентного реагента.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на 41-ой Международной научной студенческой конференции, «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); 11-ой Всероссийской студенческой научной конференции «Экология и проблемы защиты окружающей среды» (Красноярск, 2004); Научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков «Физика и Эйнштейн» (Красноярск, 2005); Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005); IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005); Школе-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Социально-экологические проблемы природопользования в центральной Сибири» (Красноярск, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов и материалов конференций.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, главы с изложением результатов работы, заключением, выводов и списка литературы. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 16 таблицами и 9 рисунками. Список литературы содержит 124 источника, в том числе 65 - зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Торгашина, Ирина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия получения многокомпонентного иммобилизованного дозированного реагента для экологического мониторинга водных систем, включающего ферменты (НАДН:ФМН-оксидоредуктазу и люциферазу) и субстраты (тетрадеканаль, НАДН) биферментной системы светящихся бактерий. Реагент не требует специальных условий хранения и сохраняет 100 % активности в течение 2-х лет.

2. При иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в крахмальный и желатиновый гели наблюдается повышение устойчивости ферментов к химическим и физическим факторам среды: рН-оптимум расширяется как в кислую, так и щелочную области, повышается устойчивость ферментов к высоким концентрациям солей, а также термостабильность.

3. Иммобилизация биферментной системы в крахмальный и желатиновый гели не приводит к существенной потери чувствительности ферментативных реагентов к действию модельных токсических веществ. Увеличение чувствительности иммобилизованного многокомпонентного реагента достигается варьированием состава реагента и выбором носителя для иммобилизации.

4. Предложен новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического и других видов мониторинга, заключающийся в использовании иммобилизованного многокомпонентного реагента, позволяющего оптимизировать проведение ферментативного биотестирования.

87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка методов иммобилизации ферментов без существенной потери их активности имеет неоценимое значение для развития как энзимологических исследований фундаментального характера, так и создания новых ферментативных аналитических методов и конструирования биологических датчиков.

В работе показано, реагенты, полученные путем иммобилизации биферментной системы, обладают рядом несомненных преимуществ по сравнению с растворимыми препаратами ферментов: они сохраняют свою стабильность в более широком температурном диапазоне, являются более устойчивыми к изменению химического окружения (например, рН или ионной силы), хранятся в течение длительного времени без обеспечения специальных условий хранения.

С точки зрения тиражирования иммобилизованных реагентов немаловажным является факт простоты процедуры иммобилизации и дешевизна используемых носителей (крахмала и желатина). Более того, применение иммобилизованных препаратов, включающих помимо ферментов также субстраты биферментной системы, позволяет максимально упростить процедуру проведения анализов. На основе иммобилизованного реагента разработан новый подход для создания ферментативных датчиков для экологического биолюминесцентного биотестирования и различных видов мониторинга. Метод и реагент пригоден для использования, как в лабораторных, так и в полевых условиях. Таким образом, полученный реагент имеет коммерческую значимость.

Данная работа показывает одно из возможных применений иммобилизованной биферментной системы: экологический мониторинг сточных вод промышленных предприятий. В тоже время, реагент может служить основой создания биологической части биолюминесцентного биосенсора. Несомненно, направление создания иммобилизованных сенсоров весьма перспективно и востребовано в различных областях человеческой деятельности: в том числе в медицинских исследованиях, пищевой промышленности для анализа качества пищевых продуктов, аналитической биохимии для анализа активности различных ферментов и их субстратов и т.д.

В заключение автор выражает искреннюю признательность своему руководителю и наставнику Кратасюк Валентине Александровне, а также своему учителю и научному консультанту за руководство работой Есимбековой Е.Н., за участие в обсуждении результатов Кудряшевой Н.С.

86

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Торгашина, Ирина Геннадьевна, Красноярск

1. Артюхова В.И. Мониторинг вод рек Подмосковья методами биотестирования / В.И. Артюхова, А.Г. Дмитриева, Е.Ф. Исакова, В.Е. Ларин, А.И. Утинцев, О.Ф. Филенко // Вод. ресурсы., 1991.-N 1. - С. 115-121.

2. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов, К. Мартинек // В 8 кн.Биотехнология; М.: Высшк. шк, 1987.- 159 с.

3. Болдырева Н.М. Метод биотестирования сточных и природных вод на культуре инфузорий / Н.М. Болдырева // Методы биотестирования вод. -Черноголовка, 1988. С. 42-43.

4. Брагинский Л.П. Интегральная токсичность водной среды и ее оценка с помощью методов биотестирования / Л.П. Брагинский // Гидробиол. журн., 1993.-Т. 29,N6.-С. 66-73.

5. Бузинова Н.С. Патологические изменеия активности пищеварительных ферментов рыб / Н.С. Бузинова // Теоретические проблемы водной токсикологии. Норма и патология. М.: Наука, 1983. - С. 131-137.

6. Васьковец Л.А. Биотестирование закисленных вод по пассивным электрическим параметрам крови рыб / Л.А. Васьковец, А.Н. Крайнюкова // Охрана вод реч. бассейнов Харьков, 1987. - С. 153-156.

7. Григорьев Ю.С. Оперативные методы и аппаратура для биоиндикации и биотестирования загрязнения окружающей среды. / Ю.С. Григорьев // Вестн. Хакас, гос. ун-та. Сер. 4. 1997. - N 4. - С. 60-62.

8. Гиль Т.А., Балаян А.Э., Стом Д.И. Гашение люминесценции светящихся бактерий как тест для оценки токсичности фенольных компонентов стоков / Т.А. Гиль, А.Э. Балаян, Д.И. Стом //Микробиология, 1983.-Т.52,N6.-С. 1014-1016.

9. Гиль Т.А. Элиминирование хинонов из водных сред фенолами и влияние их смесей на люминесценцию бактерий Vibrio harvey / Т.А. Гиль,

10. B.И. Нечаева, А.Э. Балаян, Г.В. Шахова // Биолог, науки: МГУ, 1985. N1.1. C. 58-62.

11. Гроздов А.О. Использование морских инфузорий для биотестирования донных грунтов / А.О. Гроздов // Вод. токсикол. и оптимиз. биопродукц. процессов в аквакультуре. М., 1988. - С. 53-57.

12. Джунковская И.П. Действие продукта окисления керогена на рост и люминесценцию Photobacterium fischeri / И.П. Джунковская, В.И. Сухаревич, В.Е. Шкинке, Л.А. Виестуре // Микробиология, 1985. Т.54, N1. - С. 89-92.

13. Диунов А.Г. Качество природных вод реки Волги в пределах города Ярославля по данным биотестирования / А.Г. Диунов, Г.П. Жариков, А.В. Павлов, Г.Е. Сабуров ; Яросл. мед. ин-т; Ярославль, 1993. - 8 с.

14. Егорова К.В. Токсикологическая оценка нефтезагрязненных почв / К.В. Егорова, С.К. Зарипова, Г.П. Каюкова, Г.В. Романов; Казан, гос. ун-т -Казань, 1998.-С. 20.

15. Есимбекова Е.Н. Исследование чувствительности трехферментных систем с бактериальной люциферазой при биотестировании водных экосистем: Автореф. дис. . канд. биолог, наук / Е.Н. Есимбекова. -Красноярск, 2000. С. 17.

16. Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестироания в России. / М: Междун.дом сотрудничества, 1997.-С. 148.

17. Истамов Х.И. Биотестирование производственных сточных вод / Х.И. Истамов, Е.П. Савельев // Загрязнение окруж. среды: Пробл. токсикол. иэпидемиол.: Тез. докл. междунар. конф., Москва-Пермь, 11-19 мая, 1993 -Пермь, 1993.-С. 58.

18. Карпович Т.А. Рекомендации к разработке комплексного, экспрессного метода биотестирования сточных вод с использованием рыб в качестве тест-объекта / Т.А. Карпович, В.И. Лукьяненко // Эксперим. вод. токсикол, 1990. -N 14.-С. 232-237.

19. Кириллова И.П., Зайцева Л.А., Дмитриева Л.В. Биолюминесцентный анализ и его возможности. / И.П. Кириллова, Л.А. Зайцева, Л.В. Дмитриева // Общие вопросы микробиологической промышленности, 1983. С. 44.

20. Колосова Л.В. Использование для токсикологических исследований прудовика обыкновенного / Л.В. Колосова, О.П. Данильченко, Н.С. Бузинова // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод Л.: Гидрометеоиздат, 1987. - Вып. 1. - С. 98-103.

21. Король В.М. Использование элодеи для биотестирования качества водной среды / В.М. Король // Физиол. и токсикол. гидробионтов. -Ярославль, 1989.-С. 98-103.

22. Крайнюкова А.Н. Метод биотестирования сточных вод по реакции ухода рыб из токсичной среды / А.Н. Крайнюкова, Г.А. Вальтер, С.В. Антонов, Г.Н. Катриченко // Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 66-68.

23. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение: Дис. . док. биолог, наук / В.А. Кратасюк -Красноярск, 1994. М. 377 с

24. Кратасюк В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон //Успехи микробиологии, 1987 N21 - С. 3-30.

25. Кратасюк В.А. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы // В.А. Кратасюк, О.Н. Дмитриева, П.И. Белобров; Люминесцентный анализ в медико биологических исследованиях, сб. науч. ст. - Рига: РМИ, 1986. - С 93 - 97.

26. Кудряшева Н.С. Закономерности ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами компонентами сточных вод / Н.С. Кудряшева, Е.В. Шалаева, Е.Н. Задорожная, В.А. Кратасюк // Биофизика, 1994. - Т.39, N3. - С. 455-464.

27. Кудряшева Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова; Краснояр. гос. ун-т. Красноярск, 2002. -154 с.

28. Лапина Н.Ф. Использование пролина в качестве биотеста загрязненности почвы металлами / Н.Ф. Лапина, П.Е. Тулупов, Л.А Ласточкина // Миграция загрязняющ. веществ в почвах и сопредел. средах -Л., 1989.-С. 334-338.

29. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер // М.: Мир, 1974. 960 с.

30. Макарова Т.А. Возможности использования ядрышкового критерия для биотестирования / Макарова Т.А. //40 Науч.-техн. конф. проф.-преп. состава Астрах, гос. техн. ун-та: Тез. докл. Астрахань, 1996 - С. 94-95.

31. Максимов В.Н. Биотестирование вод, загрязненных сульфонолом. / В.Н. Максимов, X. Нагель, С.А. Остроумов, Т.Н. Ковалева // Вод. Ресурсы, 1988.-N 1.-С. 165-168.

32. Мецлер Д. Биохимия / Д. Мецлер М: Мир, 1960. - Т.1.

33. Михайлова JI.В. Накопление и выведение водорастворимой фракции нефти бокоплавами Gammarus Lacustris при различной температуре воды и вырьирующих концентрациях. / Л.В. Михайлова // Экспер.водн.токсикол, 1987.-Вып. 12.-С. 137-153.

34. Остроумов С.А. Биотестирование вод, загрязненных поверхностно-активными веществами. / С.А. Остроумов, B.C. Хорошилов // Изв. АН. Сер. биол. Россия, 1992. N 3. - С.452-458.

35. Остроумов С.А. Биотестирование токсичности поверхностно-активного вещества (сульфонола) с использованием проростков риса как тест-объекта. / С.А. Остроумов, А.Э. Головко // Гидробиол. ж, 1992. Т. 28, N 3.- С. 72-75.

36. Петушков В.Н. Термоинактивация бактериальной люциферазы / В.Н. Петушков, Г.А. Кратасюк, В.А. Кратасюк, П.И. Белобров // Биохимия, 1982. -Т.47, вып.11. С. 1773-1777.

37. Помазовская И.В. Биотестирование качества воды, поступающей в Онежское озеро с водосбора / И.В. Помазовская, Е.В. Флинк, Л.В. Дубровина // Притоки. Онеж. оз. Петрозаводск, 1988. - С. 25-29.

38. Потапова Н.А. Метод биотестирования загрязненных вод с помощью культур водных микроорганизмов. / Н.А. Потапова, Т.В. Королевская // Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 17-18.

39. Равин-Щербо М.И. Физическая и коллоидная химия / М.И. Равин-Щербо, Т.А. Анненков // М. ВШ, 1964.

40. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002. - 118 с.

41. Сазонова В.Е. Сравнительный анализ чувствительности двух биотестеров для определения степени токсичности воды / В.Е. Сазонова, Е.В. Панькина // Вод. Ресурсы, 1998. Т. 25, N 1. - С. 80-84.

42. Скуриатов Ю.И. Экотоксикологические особенности сточных вод предприятий лесопромышленного комплекса / Ю.И. Скуриатов, Н.Е.

43. Гусельникова, Е.В. Штамм, Н.Б. Козлова // Водоснабж. и сан. техн, 1998. -N 2. С. 24-28.

44. Стрельцов А.Б. Региональная система биологического мониторинга на основе анализа стабильности развития / А.Б. Стрельцов, В.М. Захаров // Использование и охрана природных ресурсов в России, 2003. N 4. - С.47

45. Стручкова H.JI. Биотестирование как способ экологического контроля качества сточных вод / H.JI Стручкова. // Молодежь и экол. Москвы Тез. докл. Науч.-техн. конф. 22-23 дек. 1986. М., 1986. - С. 145-146.

46. Тернест JL Современная органическая химия / JI. Тернест М: Мир, 1981.-Т.2.

47. Тимофеева С.С. Активность окислительных ферментов как биотест для оценки токсичности природных и сточных вод / С.С. Тимофеева // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. JL: Гидрометеоиздат, 1987.-Вып. 1.-С. 76-84.

48. Тимофеева С.С. Использование биотестирования для оценки способов утилизации шламов сточных вод / С.С. Тимофеева, А.Э. Балаян // Эксперим. водная токсикология, 1990. Вып. 14. - С. 238-245.

49. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен М.: Мир, 1983. - с 213.

50. Тушмалова Н.А. Метод биотестирования природных и сточных вод по уровню двигательной активности инфузорий спиростомы. / Н.А. Тушмалова, О.П. Данильченко, М.Д. Бресткина // Методы биотестирования вод -Черноголовка, 1988. С. 44-46.

51. Тюрин А.Н., Христофорова Н.К. Выбор тестов для оценки загрязнения морской среды. Докл. Междунар. совещ. по мор. биотестир., Владивосток,авг. 1994 / А.Н. Тюрин, Н.К. Христофорова // Биол. Моря, 1995. Т. 21, N 6. -С. 361-368.

52. Урванцева Г.А. Применение методов биотестирования в оценке загрязнения вод тяжелыми металлами. / Г.А. Урванцева // 10 объед. пленум сов. и респ.ком.по прогр. Юнеско Человек и биосф. Тез. докл. Всес.конф. -Алма-Ата, 1988. С. 68.

53. Хоружая Т.А. К проблеме создания системы биотестирования уровня токсического загрязнения природных вод / Т.А. Хоружая // Биотестир. в решении экол. пробл: Зоол. ин-т РАН; СПб, 1991. - С. 63-70.

54. Хоружая Т.А. Методы биоиндикации и биотестирования в исследованиях пресноводных экосистем при аварийном и экстремально высоком загрязнении / Т.А. Хоружая, В.А. Брызгало, Л.М. Предеина, Е.И. Короткова// Гидрохим. матер, 1991. Т. 100. - С. 47-68.

55. Щербань Э.П. Биотестирование токсичности воды нижнего Днестра для планктонных ракообразных / Э.П Щербань // Гидробиол. ж.; Киев, 1989. -С. 121.

56. Backhaus T. Toxicity testing with Vibrio fischeri: A comparison between the long term (24 h) and the short term (30 min) bioassay / T. Backhaus, K. Froehner, R. Altenburger, L.H. Grimme // Chemosphere, 1997. Vol. 35, N 12. -P. 2925-2938.

57. Barah M. The use of luminous bact eria for determination of phagdcytoses / M. Barah, S. Ulitzur, D. Merzbach // Immunol. Meth, 1983. V.64. - P. 353-363.

58. Beach M.J., Pascoe D. The role of Hydra vulgaris (Pallas) in assessing the toxicity of freshwater pollutants / M.J. Beach, D. Pascoe // Water Res, 1998. Vol. 32, N 1. - P. 101-106.

59. Bulich A.A Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity / A.A. Bulich, D.Z. Isenberg // Instrum. Soc. Am. Tranc., 1981. V.20,N1.-P. 29-33.

60. Chang M. Activities, stabilities, and reaction kinetics of three free and chitosan-clay composite immobilized enzymes / M. Chang, R Juang // Enzyme and Microbial Technology, 2005. V.36, - P. 75-82.

61. Chawla G.Algal bioassay of water pollutants. / G. Chawla, P.N. Viswanathan // Manual Aquat. Ecotoxicol.: Proc. Indo-Dutch Train. Course Aquat. Ecotoxicol., Lucknow, 1988 New Delhi etc.; Dordrecht etc., 1988. - P.294-297.

62. Curtis C. Evaluation of a bacterial bioluminescence bioassay as a method for predicting acute toxicity of organic chemicals to fish / C. Curtis, A. Lima, S.J. Lozano, G.D. Veith // ASTM Spec. Tech. Pabl., 1982. V.766. - P. 170-178.

63. De Groote J. Environmental monitoring of dredging operations in the Belgian nearshore zone. / J. De Groote, G. Dumon, M. Vangheluwe, C. Jansen // Terra et aqua., 1998. N 70. - P. 21-25.

64. Diehl K. Biotests zur Beurteilung der Reinigungslei stung von Deponiesicker-wasserbehandlungsverfahren. / K. Diehl, U. Hagendorf, J. Hahn // Entsorg. Prax., 1995. N 3. - P. 47-50.

65. Dinnel P.A., Stober Q.J. Application of the sea urchin sperm bioassay to sewage treatment efficiency and toxicity in marine waters / P.A. Dinnel, Q.J. Stober//Mar. Environ. Res., 1987. V. 21, N 2. - P. 121-133.

66. Esimbekova E.N. Bioluminescent method non-specific endotoxicosis in therapy / E.N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk, V.V. Abakumova // Luminescence, 1999.-N 14.-P. 197-198.

67. Felkner I.C. Quantitative bioassay using laser-monitored bacteria to assess toxicology and metabolism of bioactive Group IV compounds / I.C. Felkner, B.E. Worthy // Sci. Total Environ., 1992. Vol. 112, N 2 - 3. - P. 177-188.

68. Gaur Abha Toxicity of selected chromium compounds in microbial bioassay system / Abha Gaur, J.W. Bhattacherjee // Water. Air. and Soil. Pollut., 1991. -Vol. 59, N 1-2. P. 193-197.

69. Gellert G. Development of an optimal bacterial medium based on the growth inhibition assay with Vibrio fischeri. / G. Gellert, A. Stommel, A.B. Trujilano // Chemosphere., 1999. Vol. 39, N 3. - P. 467-476.

70. Gerhardt A. New online biomonitoring system for Gammarus pulex (L.) (Crustacea): In situ test below a copper effluent in south Sweden / A. Gerhardt, A. Carlsson, C. Ressemann, K.P. Stich // Environ Sci Technol., 1998. V. 32, N 1. -P. 150-156.

71. Gil G. A biosensor for the detection of gas toxicity using a recombinant bioluminescent bacterium / G.C. Gil, R.J. Mitchell, S.T. Chang, M.B. Gu // Biosens. Bioelectron, 2000. -N 15. P. 23-30.

72. Gossiaux D.C. A survey of Saginaw River and Saginaw Bay, Lake Huron, sediments using two bioassay with the amphipod Diporeia spp / D.C. Gossiaux, P.F. Landrum, V.N. Tsymbal // J. Great Lakes Res., 1993. V. 19, N 2. - P. 322332.

73. Kirby M.F. Assessment of water quality in estuarine and coastal waters of England and Wales using a contaminant concentration technique. / M.F. Kirby,

74. M.A. Blackburn, J.E. Thain, M.J. Waldock // Mar.Pollut.Bull., 1998. Vol. 36, N 8.-P. 631-642.

75. Kossler F. Physiologische Untersuchungen zur Autmung von Vibrio Luminosus Beijerinck/F. Kossler// Arch. Microbiol., 1968. V.64. - P. 146-157.

76. Kratasyuk V.A. Principle of luciferase biotesting. / V.A. Kratasyuk // In: Proceeding of the First International School "Biological Luminescence". -Singapore, 1990. World Scientific Publishing Co., 1990. - P. 550-558.

77. Kratasyuk V.A. Polymer Immobilized Bioluminescent System for Biosensor and Bioinvestigations / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova // PBM Series 2003.-V.1/-P 307-341.

78. Kudryasheva N.S. Development of the bioluminescent bioindicators for analysis of environmental pollution /N.S. Kudryasheva, V.A, Kratasyuk E.N. Esimbekova, E.V. Vetrova // Field Analytical Chemistry and Technology, 1998. -N2.-P. 277-280.

79. Lucan Bouche M.L. Experimental study of the lethal effects induced by copper and lead on the Oligochaeta Tubifex tubifex / M.L. Lucan Bouche, S. Biagianti Risbourg, F. Habets , G. Vernet // Bull Soc Zool Fr., 1997. V. 122, N 4. -P. 389-392.

80. Maeda M. Flow injection determination of glucose, bile acid and ATP using immobilized enzyme reactor and chemiluminescent assay of NAD(P)H / M. Maeda, A. Tsuji, N. Ohshima, M. Hukuoka // J. Biolumin. Chemilumin,1993. -V.8, N 5. P. 241-246.

81. Marigomez J.A. Copper treatment of the digestive gland of the slug, Arion ater L. 1. Bioassay conduction and histochemical analysis / J.A. Marigomez, E. Angulo, J. Moya // Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 1986. V. 36, N 4. - P. 600-607.

82. Matthiessen P. Use of a Gammarus pulex bioassay to measure the effects of transient carbofuran runoff from farmland / P. Matthiessen, D. Sheahan, R. Harrison, M. Kirby // Ecotoxicol. and Environ. Safety., 1995. V. 30, N 2. - P. 111-119.

83. McGibbon S. Routine toxicity testing of toxicants using a sea urchin gamete bioassay / S. McGibbon, A.G.S. Moldan // Mar. Pollut. Bull., 1986. V. 17, N 2. -C. 68-72.

84. NaleczJawecki G. Toxicity of inorganic compounds in the spirotox test: A miniaturized version of the Spirostomum ambiguum test / G. NaleczJawecki, J. Sawicki // Arch Environ Contam Toxicol., 1998. V. 34, N 1. - P. 1-5.

85. Naveh M. A new rapid and sensitive bioluminescence assay for antibiotics that inhibit protein synthesis / M. Naveh, S. Ulitzur // J. Appl.Bacteriol., 1984. -V.56, N3.-P. 457-463.

86. Nendza M. Quantitative structure-toxicity relationships and multivariate data analysis for ecotoxic chemicals in different biotestsystems/ M. Nendza, J.K. Seydel // Chemosphere, 1988a. V.17, N 8. - P. 1575-1584.

87. Poulton M. Disruption of precopula in Gammarus pulex (L.) Development of a behavioural bioassay for evaluating pollutant and parasite induced stress / M. Poulton, D. Pascoe // Chemosphere., 1990. - V. 20, N 3-4. - P. 403-415.

88. Puget K. Studies in bioluminescence. Bacterial NADH: FMN -oxidoreductase / K. Puget, A.M. Michelson, S. Adrameas // Anal. Biochem .,1977. -V.79.-P. 447-456.

89. Reynoldson T.B. A sediment bioassay using the tubificid oligochaete worm tubifex tubifex / T.B. Reynoldson, S.P. Thompson, J.L. Bamsey // Environ. Toxicol, and Chem., 1991. V. 10, N 8. - P. 1061-1072.

90. Richardson M. Ecotoxicity monitoring use of Vibrio Fischeri / M. Richardson // Arh.Hig.Rada.Toksikol., 1996. V.47, N4. - P. 389-396.

91. Ringwood A.H. Seed clam growth: An alternative sediment bioassay developed during EMAP in the Carolinian Province / A.H. Ringwood, C.J. Keppler // Environ Monit Assess., 1998. V. 51, N 1-2. - P. 247-257.

92. Ruiz M.J. Toxicity assessment of pesticides using the microtox test: application to environmental samples / M.J. Ruiz, L. Lopez-Jaramillo, M.J. Redonto, G. Font // Bull.Environ.Contam.Toxicol., 1997. V.59, N4. - P. 619-625.

93. Salama M.S. Toxicity assessment of pollutants in the marine environment of Kuwait using microbial bioassay. / M.S. Salama, A.A. Salem // Toxicity Assess., 1990. Vol. 5, N 3. P. 237-252.

94. Santiago-Faundino V.J.R. The effects of nikel and cadmium on the growth rate of Hydra littoralis and an assesment of the rate of uptake of 63Ni and 14C by the same organism / V.J.R. Santiago-Faundino // Water Res., 1983. V. 17 N 8, - P. 917-923.

95. Sauvant M.P. Tetrahymena pyriformis: a tool for toxicological studies. A review / M.P. Sauvant, D. Pepin, E. Piccinni // Chemosphere., 1999. V. 38, N 7. -P. 1631-1669.

96. Serat W.F. Evaluation of biological effects of air pollutants by use of luminescent bacteria / W.F. Serat, F.E. Budenger // J. Bacterid., 1965. V.90, N3. -P. 832-833.

97. Serat W.F., Budinger F.E., Mueller F.K. Toxicity evaluation of air pollutants by use of luminescent bacteria / W.F. Serat, F.E. Budenger // Atmospher. Environ., 1967.- V.I.- P. 21-32.

98. Simmers J.W. Bioassay and biomonitoring assessments of contaminant mobility from dredged material / J.W. Simmers, R.G. Rhett, S.H. Kay, J.M. Marquenie // Sci. Total Environ., 1986. V. 56. - P. 173-182.

99. Smith S. Use of aquatic macrophytes as a bioassay method to assess relative toxicity, uptake kinetics and accumulated forms of trace metals. / S. Smith, M.K.H. Kwan //Hydrobiologia, 1989. V. 188-189. - P. 345-351.

100. Stom D.I. Bioluminescent method in studying the complecs effect of sewage components / D.I. Stom, T.A. Gill, A.E. Balayn, O.I. Shahova // Arch.Environ.Toxicol., 1992. V.22. - P. 202-203.

101. Sunderaraman V. Paramecium bioassay for fresh water pollution Анализ загрязнения пресных вод по парамеции. / V. Sunderaraman // Manual Aquat.

102. Ecotoxicol.: Proc. Indo-Dutch Train. Course Aquat. Ecxtoxicol., Lucknow, 1988 -New Delhi etc., Dordrecht etc., 1988. P. 311-313.

103. Tchan J.T. A new rapid specific bioassay method for photosynthesis inhibiting herbicides / J.T. Tchan, I.E. Roseby, G.R. Funnel // Soil Biol. Biochem., 1975.- V.7.- P. 39-44.

104. Ulitzur S. Determination of antibiotic activities with the aid of luminous bacteria / S. Ulitzur//Methods Enzymol., 1986a.- V. 133. P. 275-284.

105. Ulitzur S. A new sensitive and simple bioluminescence test for mutagenic compounds / S. Ulitzur, I. Weiser, S. Yannai // Mutant Res., 1980. V.74, N2. - P. 113-124.

106. Ulitzur S. Factors affecting the cellular expression of bacterial luciferase/ S. Ulitzur, A. Reinhertz, J.W. Hastings // Arch. Microbiol., 1981a. V.129. - P. 6771.

107. Ulitzur S. H-NS Protein Represses Transcription of the lux Systems of Vibrio fischeri and Other Luminous Bacteria Cloned into Escherichia coli / S. Ulitzur, A. Matin, C. Fraley, E. Meighen // Curr. Microbiol., 1997. V. 35. - P. 336-342.

108. Waring, C.P. Sublethal effects of a carbamate pesticide on pheromonal mediated endocrine function in mature male Atlantic salmon (Salmo salar L) parr / C.P. Waring, A. Moore // Fish Physiol Biochem., 1997. V. 17, N 1-6. - P. 203211.

109. Yang Y. M.Immobilization of glucose oxidase on chitosan-Si02 gel / Y. M. Yang, J. W. Wang, R. X. Tan // Enzyme and Microbial Technology, 2004. V.34, -P. 126-131.

110. Yordan A.Z. Toxicant detector / A.Z. Yordan, E.R. Schnauss, E.H. Sie, A. Thanos // Pat. USA, 1968 N 3370175.

111. Zhang T. Use of duckweed (Lemna minor L.) growth inhibition test to evaluate the toxicity of acrylonitrile, sulphocyanic sodium and acetonitrile in China / T. Zhang, H.J. Jin // Environ Pollut., 1997. V. 98, N 2. - P. 143-147.