Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белков и геномных последовательностей Candida utilis, содержащих элементы гомологии с альфа цепью коллагена высших эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование белков и геномных последовательностей Candida utilis, содержащих элементы гомологии с альфа цепью коллагена высших эукариот"

Московский государственный университет км. ИВ. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи УДК 575. 577

НУРМШСШ Уарил Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ И ГЕНОМНЫХ П^.та^лтв^ютРй Candida utlUs . СОДЕРЖА®« ЭЛЕМЕНТЫ ГОМОЛОГИИ С АЛЬФА ПЕПЬЮ КОЛЛАГЕНА ВЫСШИХ ЗУКАРЮТ.

03. 00.03 - молекулярная биология

д в т ореферат'

диссертации »«а соискание ученой степени канд^ата биологических наук

Мэсква - 1991

Работа выполнена на кафедре молекулярной биология Биологического факультета МГУ им. М. а Ломоносова

Научные руководители -

Официальные оппоненты

Г

Чапиия ппганмаашщ -

, ческого факультета МГУ.

Автореферат разослан "_

член-корреспондент РАН, профессор И. С. Кулаев; кандидат биологических наук, н. сотр. Т. С. Каледина

- доктор биологических наук И. А. Белозерский, доктор биологических наук . Г. Честухина

—ясной биологии РАН.

х 1992 г. юго совета \10899 Мэск-

? Биологи-

Ученый секретарь совета

кандидат химических наук эв

РОСС У/' СЧАя ГОСЗ?ДА«'0ТЧЕНЙЛ» библиотека

ОВЙАЯ до/яхвнюггад PABOTU

Лкту&яыюсхь лроблмал Коллагены - основные белки соединительных тканей - чрезвычайно широко распространены в органах и тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Они характерн-вуются необычной первичной последовательностью и наличием уникального спирального домена. ГЬмимо истинных коллагенов хорошо изучены коллагеноподобные белки (такие как первый компонент системы комплемента Clq, ацетилхолинэстераза и некоторые лек-тины млекопитающих), также имеющие домен тройной спирали. Совсем недавно кодлагеноподобные последовательности были обнаружены в бактериальном ферменте - пуллуланазе Klebslela pneumoniae FQ9 (CharalaKbous, 1988) и в потенциально транскрибируемом полипептиде герпесовкруса Saimirí (Geck, 1990). В' растительных белках подобные последовательности и домены ко обнаружены. Данные о наличии кодлагекоподобных последователь-костей в белках низших эукариот (в частности, грибов) к настоящему моменту отсутствует. В связи с этим поиск и изучение коллагеноподобянх последовательностей у грибов на уровне белков и соответствующих геномных последоватеьноетей представляется весьма актуальным, поскольку монет помочь в понимании эволюционных связей организмов данной группы с животными и растениями.

Отметим, что многие виды грибов (в частности, диморфные дрожли рода Candida) являются патогенными. Проблема взаимодействия грибов и тканей организма-хозяина, богатых коллагена-заш, далека от разрешения. В этой связи особенно интересным представляется поиск коллагеноподобных последовательностей в бедках клеточных стенок грибов. Изучение таких белков мояет быть полезно также и для понимания общей структуры клеточной стенки этих микроорганизмов, что, в свою очередь, является актуальным в свяаи со все расширяющимся применением дрожжей в биотехнологии и пищевой промышленности.

Кроме того, многочисленное семейство ко ллагеновых генов является интересной моделью для понимания общих тенденций эволюции генов (Vuorio, 1990). Новые сведения о геном»« последовательностях низших эукариот, гомологичных коллагеновым генам высших организмов, могут внести существенный вклад в решение панной проблема

Ранее в лаборатории проф. И. С. Кулаева при изучении лизиса

дрожжей С.utilis различными протеиназ аьш (Калебина, 1985) были получены данный, позволявшие предполагать существование в белках дрожжевой клеточной стенки коллагеноподобных фрагментов. В связи с изложенным вше, эти результаты явились основанием для настоящего исследования.

Цеи> и азддч* ксслэдоезяйл. Цель» данной работы являлось выявление и характеристика у грибов геношых последовательнос-Toti, гомологичных кДНК спиральной части молекулы коллагена, а такяе исследование белков клеточных стенок на наличие коллагеноподобных последовательностей. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) исследовать представителей различных классов грибов на наличие геномных последовательностей, гомологичных кДНК генов 1 типа коллагена цыпленка; 2) охарактеризовать геношую последовательность одного из исследованных организмов, демонстрирующую наивысшую степень гомологии с использованным зондом; 3) исследовать белки клеточкой стенки данного организма на наличие коллагеноподобных последовательностей.

Научная ноекзш. работы. В настоящей работе показано присутствие в геномах грибов различных классов последовательностей, гомологичных коллагеновым генам высших эукариот в области кодирования спирального домена Анализ подобной последователь-кости, клонированной на генома дрожгай С.utilis, позволяет предполагать образование участка гомологии путем тандемной амплификации 54 п. н. - предшественника, общего для всех генов фибриллярных коллагеноь (Yamada, 1980). В клеточной стенке дрожжей С. utilis идентифгщирован белок, содержащий коллагено-подобную последователь!' сть. Обсуадается его возможная протео-литическая активность и участие в морфогенезе клеточной стенки. Обнаружена и охарактеризована коллагенолитическая активность у представителей всех трех известных групп сериновых протеиназ субтилизинового типа.

Рраетичесявя ценность работ. Локализация в клеточной стекке условнопатогенных дрохявй рода Candida белков, гидроли-ауемых коллагеназаци, и обнаружение активации коллагеназой ав-толитическнх протеиназ дрожжевой клеточной стенки представляет несомненный интерес с точки врения практических вопросов меди-

- з -

цшгн и понимания диморфного перехода в патогенезе кандидозов. Описанная нами коллагеназная активность субтилюкнов толэт найти применение в медицинской практике лечения сютов и кожных заболеваний.

АпроОзовя pa£5o7ii Результаты работы докладывались па 2-ом международном конгрессе по биотехнологии (Куба, 1989), на Всесоюзной конференции "Секреция у микроорганизмов" (Пущею, 1990), на lS-оч международном специализированно» сиштоэиуме по дролзаы (Рига, 1991). Работа прошла апробацию на кафедре моле-кулярнсЛ биологии биологического факультета ЫГУ им. М. а Ломоносова.

DyfcraKicn lb материалам диссертации опубликована 3 статьи и тезисы двух сообп^нкй.

Огрутущ я сОгем я/явсераезю. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов к их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, выючавеого ... наименований. Работа изложена на ... страницах иашинснтского текста, экспериментальная часть содержит 17 рисунков и 6 таблиц.

ШЙЕРШШ1 И шкщи коездзшш,

В работе использовали стамыы микроорганизмов, полученные из Всесоюной Коллекции Микроорганизмов (Peniclllum versniculatum ВКМ F-907, Peniclllum purpurogenum BKM F-693, Achlva bisexualis EKU F-1799, Cryptococcus laurentii BKM Y-1665, Filobastdiun capsullgenura BKM Y-1439, Rhodosporidium diobovatu.ii ВКМ Y-1571, Phaffia rbodozyne ШИ Y2274, Schlsoblastosporion starkev-heurtci i BKM Y1947,

Schlzosaccbaroiwces рояЬэ ВКМ Y-658, E'lchia Jadtnii BKM Y-2515. Metschmcowia lun&ta Bitti Y-1651, Saccharomyces cenmsiae BKM Y-288, Candida utills BKM Y-74, Candida maltcsa EKM Y-1506, Nadsoma commutata БШ Y-1573, Micrococcus lutous BKM B-1314, Micrococcus rose us BKM B-123S, Bacillus brsvis Ей: В-503, Bacillus subtil is BKM B- 501, Ertrlnia carotovore ВКЫ B-1247, PseudcRoria-з aeruginosa ЕКЧ B-588, 'Xanthcrronas campsstris BKM B-618), а такте от ami, полученные иа (соллекции микроорганизмов !<ГУ (Fusarlum heterosporum, Sordarta sp.,

Candida albicans 133, Propionibacterium sheruanii, Nocardia sp., Mycobacterium flaveseens). Штаммы Halobactertum sp. 39 и Halobacterium sp. 584, были любезно предоставлены А. Тарасовым (Институт Микробиологии РАЮ. Также были использованы ютаиыы E.COÜ НВ101 и PLK17.

Культивирование ыикроорганизюв проводили на рекомендованных для них средах (Дудка, 1982; Игашатис, 1984;Стейниер, 1979)

Использованные плазмиды: pCg54 и pCg45, содержащие фраг-шнты кД1!К генов коллагена 1 типа цыпленка ( предоставлены проф. П. Доти, Массачуееетс).

Использованные ферменты - субтшшзин72 (продуцент Вас. subttlis), субтилизиновая протеинаэа TV (продуцент Thermoactynovyces vulgaris) и коллагеназа гепатопанкреаса краба Р. camtschatica - были любезно предоставлены Г. Е Руденской.

ДНК из дрояией к грибов выделяли по методикам (Mann, 1989; Tilburn,19S3), ДНК бактерий и архебактерий выделяли по штоду (Marmur,19Sl), плазмздную ДНК выделяли по штоду (Birnbolm,1979). Генно-инженерные процедуры проводили преиму-Е^ственко согласно лабораторным руководствам (Гловер, 1938; Уашатис, 1984; SaJnbrook,1989).

Дрожяевые клеточные стенки получали после механического разрушения клеток, как описано ранее (Elorza, 1985). Клострн-днопептидазу А, свободную от общей протеолитической активности, получали очисткой на ДЕАЕ-целлюлозе (Hanada, 1S76) и электрофорезом в натпусловиях коммерческого препарата кодлагеназы Cl.histolyUcum (Serva) (Маурер,1971).

Активности гидрод>гги веских фершнтов определяли о использованием следуюцих су^тратов: окрашнный казеин (Люблинская, 1978); хромогенные субстраты ашшопептидаэ p-Ala-NA, р-Are-НА, p-Leu-MA (Frey,1979); синтетический субстрат коллагеназ PZ-Pro -Leu-ßly-ProDArg (Vunsh, 1653); глзкан (Rorrbouts, 1978); ХМтен (Тиуноьа, 1976); n-HP-si-D-глхкоза и 4- KP -tf-D-иаанопираноанд (Ratto,1988) ; .^С-моченый коллаген 1 типа из кояи крыс.

Белок определяли по кзтоду Лоурн (Lowrv, 1961). Электрофорез в денатурирующих условиях проводили согласно методика Язшлн (Laamnli, 1970). Окрашивание гликопротеюгав в геле проводили, как, описано ранее (Racusen, 1979).

- Б -

результаты и оасуидяю

На основании анализа данных литературы, посвяврнных идентификации и изучению коллагеновых белков, можно выделить два основных подхода к поиску подобных белков: а именно, поиск на уровне геномных последовательностей фрагментов гошлогни с практически любым выделенным ранее коллагеновым геном в области кодирования спирального домена (Füller, 1981), и поиск коллагеновых последовательностей в белке с использованием высокоспецифичного теста - бактериальной коллагеназы Clostridium histoiyticum, клостридиопептидазы А, которая способна гидроли-зовать только коллагены по связи X-Glv-Pro, и не гидролизует глобулярные белки (Nordwt?, 1971).

Идентификация геномных последовательностей иикрооргшга-

моВл_ гошлопгшых кДНК_ спирзж1Юй_части »дале1^.ш галлагеча_1

типа ншленка.

Целью данного этапа работы являлось создание обп^эй картины распространения последовательностей, гомологичных коллагэ-новым генам высших эукарнот, в геноиах микроорганизмов.

Саузерн-гибридизацию геномных ДИК микроорганизмов проводили с использованием в качестве зондов фрагментов кЕШ, 1»ди-ругсза спиральные домены Al(t) и AI(2) цепей молекулы коллагена цыпленка Е плазмида pCg54 этот фрагмент соответствует 600 д. н. фрапенту, полученному совместной рестрикцией плазинды рестрнктазаш Aval и Hindill ( обозначен как АН-фрагмент).

В reHo;.sax 10 из 19 исследованных етаимов грибов разных классов выявляются последовательности, гомологичные кДНК спирального дошка ¡»ллагеяа 1 типа цыпленка.'

¡Ззсьма шггереенш, на наа взгляд, является обяарузэюга . последовательностей, гокшопганых кодлагеноЕьад генам, в гено-liax только двух из 10 бактериальных иаюв - Microcoocus luteus и Mocardia sp. По филогенетической cxei«e происхождения кжроорганнзмов, предлоязеншй й А. Красильншзвш (Красильки-иов.1938), шифококкн я гкнсардии, наряду с пексторьш другими родами ияфоорганиз1®в, относятся к классу штшом»щетсв,' эво-лясганнровавяг£гу. согласно его представлениям, параллельно [«зссу грибов. В то га bpöis в гекоюх "истинных" (по ¡ижеи-

фикации Красильникова) бактерия подобные последовательности наш не выявлена

Обнаружение в грибах геномных последовательностей, имеющих сходство с коллагеновыми генами животных организмов, представляет несомненный интерес. Поскольку, коллагеновые и коллагеноподобные белки широко представлены в животных организмах (от примитивных беспозвоночных до млекопитающих), но не обнаружены в растениях. Излученные результаты можно рассматривать, как еще один довод в пользу выделения грибов в самостоятельное царство организмов, имеющих некоторые черты сходства с животными (Беккэр, 1988).

Наиболее интесивные сигналы гибридизации были получены при анализе ДНК различных видов дрожжей рода Candida. Обработка рестриктазой EcoRI позволила выявить в да трех видов Candida С С. utilis, С. nsaltosa, С. albicans) один фрагмент инвариантного размэра (около 3,4 т. п. н.) при наличии других Фрагментов различающейся длины. Данный фрагмент (см. рис Л) и явился предметом более пристального исследования. Таким образок, круг исследуемых организмов был сукон и дальнейшие эксперименты мы проводили конкретно с дрокяами рода Candida, как носителями наиболее вьградйнной геномной гомологии с коллагеновым геном высших зукарнот.

->

Л

В

Рис.1. Саузерн-анализ геномных ДНК С. utilis (А) и С. maltosa СБ), обработанных рестрикта-зами EcoRI (1), Hindi 11 (2), Banfll (3), с АН -фрагментом pCg54. Отмечен 3,4 т. п. н. -EcoRI фрагмент гомологии с кДНК коллагеновых генов, общий для обоих видов дрожжей.

- ? -

Как было оказано вше, белки клеточных стенок грибов представляют определенный интерес для исследований в связи с патогенность» многих видов грибов. Кроме того, все коллагены и »¡звестные коллагеноподоОные белки являются внеклеточными белками, иногда связанными спиральным доменом с клеточной поверхностью (например, в случае пуллуланазы К. pneumoniae (Charalairtoous, 1988)). Шзтому следующим вагон работы явились эксперименты по идентификации коллагеноподобкых последовательностей в белках клеточных стенок дрожжей Candida util is с использованием в качестве геста кяострвдиопептвдазн А.

Идентифтафш коллагеноподобных последовательностей _ в бедках дрожтей С. util is с использованием клостридиопептидазы_ А"

Была проведена обработка клострияиопептидазой А как изолированных клеточных стенок дрожзяей ( с целью выявления индивидуальных белков, содержащих коллагеноподобные последовательности), так и живых клеток С. ut il is (с целью изучения возможной роли таких белков).

На Рис. 2, представлены результаты кратковременной обработки клостркдиопептидазой А изолированных меточных стенок С. util is. Из более чем 50 белков дрожжевой клеточной стенки кол-лагеназа гидролиэует только один белок (мол. масса около 80 кДа, степень гликозилирования менее 1%), составляющим около 4% от общего количества Оелкз клеточных стенок. Инкубация изолированных дроатаевых клеточных стенок с коллагеназой в присутствии 5 мМ ЭДТА (ингибитора клостридиопептидазы А) не вызывает гидролиза отмеченного белка, что подтверждает специфичность действия коллагенааы.

Отметим, что гидролиз одного из множества белков дроете- • зой клеточной стекки не связан с пространственной недоступностью остальных белков коллагеназе. Шиш результаты показывает, что практически все белки изолированной клеточной стенкп дрожжей С. util is доступны действию экзогенных протеиназ, например, субтилизинов. Выбор субтилизина в качестве литического фермента для сравнения его действия на белки дроловзвой клеточной стенки с действием коллагеказы не случаен.

В серии отдельных экспериментов нами было показано, что

Рис.2 Денситограы-ыа белков клеточной стенки С. иЫ 115 в 102 БИЗ-ПААГ геле. А - контрольный препарат клеточных стенок; В - препарат клеточных стенок, обработанных клостридиопептида-зой /, в течение 90 минут. Отмечен пик. соответствующий гн-дроляэуеноыу колла-генааой белку.

субтилиаин 72 (откосятся к группе субтилиэинов типа Кард- . сберг) (Акпаров, 1979) я тиодаависишя сериновая протеинааа IV ^ерапоу, 1981) в отдашэ от других протеиназ (например, трипсина), обладают аа'^ной коллагенолитической активностью. Ранее подобная активнеегь у суСтилизинов известна не была. Результаты экспериментов по характеристике обнаруженной наш коллагенолитической активности субтилизинов показали, что данная активность исследованных ферыентов существенно ниш, чэа у кодлатеназы С1. Мз1оуИсит, и в количественном выражении близка к таковой коллагенологических ферментов трнпсинового типа, например, коллагенаэы из гепатопаикреаса краба (табл. 1).

В качестве представителя третьей известной подгруппы субтилизинов (подгруппы ВРЯ") была исследована сериновая протеи-

Таблица 1.

Коллагенолитическая активность субтилизинов*

Штод~опрёлёнйя Исследованные ферменты активности ___._

субти- лизин 72 субти- лиаин ТУ трипсин колла- геназа гепато- панкреаса краба** 'КЛОСТ- ридио-пепти-даза А

уменьшэние вязкости раствора коллагена (в X от исходной) 27 28 7 60 80

гидролиз молекулярной формы коллагена *** 860 1430 0.7 - 4560

гидролиз реконструированных фибрилл коллагена 2.2 * 4 0.8 1.6 200

гидролиз ГС-пептида **** 0.31 0.02 0.00 - 50

гидролиз ¡казеина *** 1000 1400 1200 присутствует 0

* - субстратом служил коллаген 1 типа из кожи крыс

** - приводится по работе (УсвЬтака, 1936). и-и обозначает,

что данные в указанной работе не приводятся.

*** - активность выракэна в ыкг коллагека/мг фермента х мкн

**** - активность выражена в шмоль субстрата/ мг Фермента х шп

Рис. 3. Схема электрофореза в 7Х ЗОЗ-ПААГ геле продуктов гидролиза коллагена 1 типа: 1 - клостридио-пептидазой к Виден одновременный гидролиз е<- цепей и^4 - и компонентов (диыеров и тримеров о<-це-пей); 2 - субтилизином 72 [данные с субтилизином ТУ аналопрсны и не приводятся] и 3 - коллагеназой трипсинового типа краба Заметно накопление «(-цепей на первой стадии реакции в результате гвдролкза

и компонентов, и появление целого ряда фрагментов о меньинми колекулярныш массами. К - контрольный образец коллагена Внизу отмечено время инкубации а ьз шутах.

15 15 30 15 30

нага, секретируемая Вас. brevis шт. 5/4 (Калебина, 1983). Было показано, что активность данного фермента относительно реконструированных коллагеновых фибрилл в 5-7 раз выше, а по отношению к молекулярной форме коллагена близка к активности субти-лизиов 72 и TV. Отметим, что коллагенолитическая активность трех исследованных протеиназ полностью ингибировалась 5 ыМ

Анализ продуктов гидролиза коллагена субтилизинаыи (рис.3) позволяет предполагать, что по механизму действия изученные протеиназы субтилизинового типа существенно отличаются от классической клостридиальной коллагеназы и ближе к серино-вьш коллагеназам трююиноього типа.

Наличие коллагенолитической активности у представителей трех известных подгрупп семейства субтилизинов позволяет предположить, что подобная активность свойственна большинству ферментов этого семейства.

Возвращаясь к вопросу о действии клостридиопептидазы А на белки дрожжевой клеточной стенки подчеркнем еще раз. что суб-тилизкн, обладакций как коллагенолитической. так и обшей про-теолиткческой активностями, гидролизует все белки клеточной стенки С.utiIls, а клостридиопептидаза А, обладающая только коллагенолитической активностью - лишь один. Видимо, чувствительность данного бедка к действию Клостридиопептидазы действительно связана с наличием в его составе кодлагеноподобных последовательностей и/или структур.

Дальнейшая характеристика выявленного коллагеназо-чувс-твительиого белка клеточной стенки С.utiIls была связана с изучением его функциональной роли.

Охарактеризованные к настоящему времени бедки (в большинстве своем маннопротеины) дрозкевыз клеточных стенок могут быть разделены ка две группы - структурных белков и ферментов, участвующих в метаболизме данной органеллы. В связи с тем, что минорный белковый компонент вряд ли шиет определять структуру всей кяеточной стенки, выявленный коллагенаэо-чувствительный белок, скорее всего, не относится к группа структурных белков и, возможно, является ферментом.

Следушим вагой калюй работ явилось изучение влияния

- и -

коллагенаэы на активность ферментов клеточных стенок дрожжей.

Влияние клостридиопептидазы А на ферментативные активности клеточных стенок С. utilts

Данные о молекулярной массе (80 кДа) и степени гликозкли-рования (менее IS) исследуемого Селка позволили нам не включать в круг изучаемых ферментативных активностей активности таких ферментов, как инвертаза или кислая фосфатаза, которые сильно гликозилированы и имеют значительно большую молекулярную массу (Tanner, 1987). Было исследовано изменение глшанаа-ных, маннозидазной, хитиназной и раличных протеолитических активностей, ассоциированных с дроюкевой клеточной стенкой, з присутствии коллагенаэы.

Нам не удалось зафиксировать изменения активностей глкт-наз, манноэидззы и хмтиназы. При этом выявлен значительный (в относительном выражении) прирост неспецифической протеолитической активности. Разброс коэффициентов возрастания обгрй протеолитической шггивности относительно активности контрольного препарата в ряде опытов составлял от 1.6 до 14,7 (для препаратов клеточных стенок) и от 2 до 6 для живых клеток дрожяэй. при постоянной тенденции возрастания данной активности под воздействием юмагенааы

Присутствие 5 Ш Ш?Ф не влияло на детектируемую протео-литическую активность. Отметим, что в работах других авторов (Sanz, 1985) также показано существование в дрожжевой клеточной стенке протеиназ, не ингибируеиыз ®ЖФ и участвущих в автолизе этой органеллы. Возрастание протеолитической активности дрожжевых клеточных стенок должно, на кал взгляд, сказываться на их ригидности и проницаемости. Было изучено влияние клост-ридиопептидазы А па эти параметры живых клеток С. utilts.

Показано, что даже относительно кратковременной обработки коллагеназой достаточно для снижения устойчивости дрокяевых клеток к внешней нагрузке . (давлению в 50- 60 г/кв. см.) (рнс. 4). Однако, наблюдения за изменением проницаемости стенки по тесту, предложенному Арнольдом (Arnold, 1975) - выходу з инкубационную среду инвертазы - не выявили влияния коллагенавы на данный параметр. 14зкно рассматривать такой результат, как подтверждение наоего предполотания о той, что обнаруженный

коллагенаэо-чувствительный белок не играет существенной структурной роли в организации внешнего каннопротеинового слоя дрожжевой клетки.

А Б

Рисунок 4. Флуоресцентное цжрос копирование »слеток С.utilis, окрашивание примулином; х 4000. Клетки инкубировали в течение 1.5 часов при 30 С, после чего подвергали давлению 50-60 г/кв. см. : А - контрольный препарат клеток; В - препарат клеток, инкубированных с коллагеназой. Заиэтко разрушение клеток и окрапиаание внутреннего содерхишго приыулинои, в нориз не входящие в клетки.

Кроме того, получены данныэ, • позволяющие предполагать, что обработка коллагеназой клеток С. utilis способствует развитию зародызевых трубок, что является первой стадией перехода иэ кепатогенной дрогаешдобной ь патогенную шщелиальную форму.

Таким образом, резуль'тты проведеиша экспериментов свидетельствуют в пользу сусрствования в клеточной стеши С.utilis как ыиншум одного белка с кодлагеноподобной последовательностью. Более того, шею предполагать( что этот белок является прстеолиг!5Ческкы «рэршнтом, участвую^*! в ¡¿гтаэолнэш клеточной стекгаи

Дальнейший акцент исследований был перенесен ка гаучепке rôKoicîba последовательностей, ишкдат гошэлопса с коллагеаовы-т генами висия оргаякэуэв.

- 13 -

Клонирование фрагмента ^геномной ДНК С. ut 11 i s, гомологичного кДНК <у1иральной_част11 молекулы галлагена 1 типа.

Была создана шниОиблиотека C.utllis, клонированием геномных EcoRI-фрагментов размером 2,8-4,5 т. п. н. в вектор лямбда gtlQ. Грансфекция в пег- вггаш Е. col 1 -PLK17- и ркркнинг примерно 10 тыс. бляшек с использованием в качестве зонда АН-фрагмента кДНК А1(1) коллагена цыпленка позволили получить 20 идентичных клонов, имеющих независимое происхождение (поскольку минибиблиотека не была амплифицнрована до скрининга). Саузерн-акалиа геномной ДНК C.utllis, обработанной различными рестрютазаш, с использованием в качестве зонда вставки а од-коы из отобранных клонов, обозначенном pCUl - выявил тот rs кайор гомологичных геномных фрагментов (8а исключение и одного, не гибридизуодзгося с pCUl), что и анализ с АН-фрагиентом pCg54 в качестве зонда. Этот результат свидетельствовал о кло-шпровании дрожяэвого фрапкнта, гомологичного кДНК коллагена.

Вставки трех клонов были субгслоннрованы в вектор pTZ19R. Рестриктная карта одного из них - pCUl - приведена на рис. 5 с указанием стратегия секвенирозаякя ( остальные клоны идентич-

Ш) ' ЕйаШЗЗЖЖЭЗ

R S H V V ft XV G fi Y AV V R

Или.

^тявммммяпжипма'Ц

Риоуиок S. Рэотрюггкея карта н стратегия оеетемнроваяия плазшды рСШ. Использованные рэстркктааы : R - EooRI, 5 - SphI, H - ¡(indiП. У - Stvl, А - Apal, X - Jtoal, 3 - BslII, Av - Aval.

Сг&рху отмечена область гомологии с плазмилой pCg64, выявляемая при Сауэеря-анализе.

Анализ нуклеотидной последовательности pCUl.

Для выявления в клонированной дрожкевой последовательности участков гомологии с использованными в работе зондами (кДНК А(1)1 и А1(2) коллагена цыпленка) была применена программа дот -матричного анализа гомология Re ve Ion . Выявлены множественные фрагменты гомологии, покрывающие практически всю область кДНК, кодирующую спиральную часть коллагеновой молекулы (рис.6). Область максимальной гомологии pClil представлена 114 п. н. -последовательностью (2628-2742 п. н.).

Степень гомологии данной дрожжевой последовательности четырем, произвольно выбранным фрагментам гомологии в кДНК коллагена, обозначенным CGI - 0G4, составляет 46-56г. При этом, дролкевой фрагмент обогащая заменами, инсершшми к делециями, что, видимо, говорит о его нефункциональности. Это же подтверждается и фактом отсутствия протяженных потенциальньс< открытых рашк считывания в его составе. В таком случае, шхко предположить, что гену коллагеназо-чувствительного белка дрожжевой клеточной с тетей соответствует упоминавшийся виве геномный фрагмент, дапяий положительный сигнал при Саузерн-гибридизации с pCg54, и не гкбридиаующкйся с pCUl.

сзлзсть квдирб&аша спщшый2Г0 9ВШ

Выявление 54 п. и. -коллагеновогз модуля клонированной дрохтевой последовательности.

Все известные коллагенов® гены могут быть разделены на две группы, эволзоционмровавшнэ разкши путями (Fields, 19S8): гены всех фибриллярных и части кефкбридлярнш: коллагенов, образовавшиеся из 5-1 п. н. -предиэствекшгка, н гены некоторых не-фибрнллярных коллагенов, в основном - беспозвоночных организмов (Blunders, 1988; Сок, 1S89; Kinsrstor., 1SSO),

PCUl

Рис. 6. Область наибольшей гомологии последова-

тельности pCLÍl 8 pCg54 (картина распределения

10D

БШ

- 1б -

образовывалмеся беа участия модуля фиксированного размера. Су-сэствениый интерес представлял вопрос: к какой группе коллаге-новых генов ближе выявленная последовательность генома С. utllis.

Анализ фрагментов CGI - CG4 pCg54, гомологичных выявленной 114 п. н.-дролмевой последовательности, показал, что их длина соответствует 108 п. н. ( т. е. 2 х 54), а границы часто совпадай? с границами экзонов в гене проА(1)1 коллагена Такое расположения участков гомологии с дрожжевым фрагментом в последовательности кДНК коллагена цыпленка представляется неслучайным и позволяет предположить, что дрозшэвую последовательность можно рассматривать как результат тандемной амплификации 54 п. н. -предшественника группы генов фибриллярных коллагенов, хотя и подвергиегося значительным перестройкам.

Приняв такое предположение, можно ожидать, что 54 п. н.-юдули коллагенового гена цыпленка (например, модули CGl(i) и CGI(2) в последовательности CGI) будут в равной степени сходны с обеими половинами 114-п. н. области гомологии в дролаах. Действительно, значения степеней гомологии 54 п. н. -половин блоков CG1-CG4 с дрожжевой последовательностьи различаются не значительно (Табл.2).

Таблица 2.

Степень гомологии 114 п. н.-дрожжевого фрагмента блокам CGI - CG4 кДНК А1(1) коллагена цыпленка

54 п. н. - фрагменты Степень гомологии с pCUl ( вХ)

гомологии pCg54 2628-2684 а. н. 2685-2742 п. н.

CGI (1) 40.7 48

CGI (2) 33.3 53.7

CG2 (1) 55.6 50

CG2 (2) 35.2 '55.6

CG3 (i) 42.6 46.3

CS3 (2) - CG4 (1) Б7. 4

CG4 (2) ,44.4 Б7.4

Кроме того, перестановки различных половин областей CG не влияет существенно на степень их гомологии с дрожжевой последовательностью. Так, например, степень гомологии блока CG2(1) с обеими половинами дрожжевой 114-п.н. последовательности составляет 55. 62 и 501.

Таким образом, данная дрожжевая последовательность действительно может являться результатом эволюции амплифицирован-ного 54 л. н. - предшественника, участвовавшего в образовании генов фибриллярных коллагенов.

вшоды

1. В геномах представителей различных классов грибов выявлены последовательности, гомологичные генам коллагена вьевих эукариот в области кодирования спирального домена.

2. Обший для трех исследованных видов дрожжей рода Candida 3,5 г.п. н. -фрагмент, гомологичный кДНК спиральной части цепей А1(1) и Ш2) коллагена цыпленка, клонирован из генома С. uttl is.

3. Анализ нукаеотидной последовательности клонированного фрагмента выявил в его составе 114 п.н. -последовательность, гомологичную ряду 108 п. н. -фрагментов кШШ спиральной части Al (1) молекулы коллагена. Предполагается образование дрохяевой 114 п. н.-последовательности амплификацией 54 п. н. -модуля, характерного для генов всех фибриллярных и части нефибриллярных коллагенов высших зукариот.

4. В клеточной стенке дроивэй С.utilis с использованием специфического теста - бактериальной коллагеназы выявлен белок, содержащий коллагеноподобкые последовательности и/лги структуры. Показана протеолитичзская активности данного белка

5. Обнаружена и частично охарактеризована коллагеполитическая активность у представителей трех известных подгрупп семейства субтилизкнов. Показано, что по своим характеристикам выявленная активность субтилизинов существенно отличается от активности кдостридиальной иоллагенааы и близка к активности коллагеназ трипсинового типа.

- 17 -

Qmxa щЯжвдй в> гиио хмхвршрк

1. Кулаев И. С., Соловьева В. И., Калебина Т. С., Руденская Г. Е , Вуршшская 11 & "Обнаружение и характеристика коллагено-лгсическоЗ активности сериновых протеиназ субтилиа«нового типа", Докл. Акад. Каук, 1988. т. 303, с. 49в-50а

2. Nurminskaya М. V., Kalebina T.S. , Kulaav I.S. "New enzynotic activity of subtillslns: hydrolysis of collagen**, 2nd International Congress on Biotechnology, Cuba, 1989, p. 216

3. Калебина Т. С., Нуркинская К В. "Увеличение выхода ин-вертазы в среду из клеток С.utilis, обработанных субтилизина-ад*\ в сб.: "Современные ироблэш бнохиюш эукариотов и прокариотов**, ПУВДНО, 1990, с. 108-115

4. Нуршшская IIЕ, Калебина Т. С., Кулаев й. С. "Коллагекоподобные последовательности в генома грибов", Генетика, 1991, Т. 27, п 2, С. 364-366

5. Nurminskaya U.V., Kalebina Т.S., Kulaev I.S. "Collagen -like sequences in Candida utilis proteins and their possible physiological role**, 16th Intranational Specialized Symposium on Yeasts, Riga, 1991, p. 101