Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом"

правах рукописи

ШЕСТАКОВ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ РЯДА ГЕКОВ-КАНДИДАТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЛ ОМЕ РУЛОН ЕФРИТО м

специальность 03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических каук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики И геномной дактилоскопии ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ТосНИИ генетика").

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Носиков Валерий Вячеславович.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Савостьянов Кирилл Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Фаворова Ольга Олеговна

кандидат биологических наук Бабенко Ольга Владимировна

Ведущая организация: Институт Молекулярной биологии

им. В. А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится декабря 2006г. в 'Щ часов на заседании

Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан щ ноября 200В. г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, ^р

кандидат биологических наук •^З^с^с-сУ' Заиграева Г.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прогрессирование хронических заболеваний почек и поиск способов предотвращения. их развития, а также замедления прогрессировать остается одной из наиболее актуальных проблем нефрологии,

В общей сложности, по данным крупных европейских медицинских центров, наследственные гломерулопатии занимают от 6,5 до 15% среди патологий, ведущих к хронической почечной недостаточности (ХПН). Связь той или иной патологии почек с генетическими дефектами может помочь выработать тактику терапии этих заболеваний.

Роль генетики в развитии нефрологии состоит не только в выявлении генетической компоненты заболевания, но и в изменении представлений о так называемых приобретенных заболеваниях, появлении новых концепций механизмов развития болезни, дополнении информации о предохраняющих и предрасполагающих факторах в развитии заболеваний, а также формировании гипотезы о совокупности экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к болезни.

Для многофакторных заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Однако для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Одним из наиболее перспективных направлений в современной молекулярной генетике заболеваний является поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.

При исследовании ассоциации сравнивают распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера, расположенного внутри или рядом с геном-кандидатом, в группах больных и здоровых доноров. Наличие достоверных различий в распределении аллелей и генотипов свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера с заболеванием. -*

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее

осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного больного.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение ассоциации ряда полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием хронического гломерулонефрита. Это были полиморфные маркеры внутри генов, кодирующих подоцин (ЫРН52), нефрин {ЫРН31), антагонист рецептора интерлейкина 1 (ЯЛЯМ), интерлейкин 4 </£.4), интерлейкин 13 (11.13), поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов {СТ1А4), ген-супрессор опухолей (ТР53), главный регулятор супрессора опухолей р53 (МОМ2) и поли(АОР-рибоэил)полимеразу (АОРЯТ1). Кроме того использовались микросате ллитн ые маркеры 06Э2414 и Ов31271, расположенные рядом с генами Н1А класса Н.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ЫРНБ2, ЫРНЭ^ МЯЫ, И4, 11.13, СТШ4, ТР53, МОМ2 и АОРРТ1, а также, полиморфных микросателлитов 0632414 и 0631271 в группе больных ХГН и в группе здоровых доноров.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров, расположенных в вышеуказанных генах-кандидатах, и двух полиморфных микросателлитов в области Н1Л в исследованных выборках для выявления их ассоциации с развитием ХГН и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

Научная. новизна работы. В этой работе впервые в мире исследована ассоциация полиморфных маркеров А(-601)0 и Агд229Б!у гена ЫРНЭ2, аиИЛуэ гена ЫРН31, \ZN7R во втором интроне гена IL1RN, С(-590)Т гена И4, 64257А гена 11.13, А1а17ТЬг гена СТШ, Рго72Агд гена ТР53, в(~309)Т п»а МОМ2, Уа1762А1а И 1#и54РЬе гена АйРНТ1, полиморфных микросателлитов 0632414 и 0631271 у русских пациентов с ХГН, проживающих в г. Москве.

Практическая ценность работы. Выявление аллельных вариантов полиморфных маркеров различных генов-кандидатов, обуславливающих повышенный генетический риск развития хронического гломерулонефрита, создает базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения заболевания.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ Генетика» 25 Октября 2006 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, включая 3 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 94 страницах машинописного текста и содержат 16 таблиц и 11 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.Формирование группы больных с хроническим гломерулонефритом и методы исследования.

Общеклиническое обследование и формирование выборки больных, проводилось в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева ММА им. И. М. Сеченова, в Детской Городской больнице №13 им. Н.Ф. Филатова, а также а Научном Центре Здоровья Детей РАМН.

Морфологическое исследование ткани почки, полученной с помощью чрезкожной биопсии, проводилось на кафедре патологической анатомии ММА им. И. М. Сеченова. При определении морфологического варианта ХГН использовали классификацию В. В. Серова (1977 г.).

Обследовано 370 человек: 290 больных ХГН и 80 человек без заболеваний почек и артериальной гипертензии, составивших контрольную группу. Оценка клинических особенностей ХГН проводилась у больных на основании данных анамнеза. Она включала анализ дебюта ХГН, клинических и морфологических вариантов нефрита с характеристикой лабораторных показателей на момент первого обследования и на момент биопсии почки, а также анализ течения ХГН.

Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), используя при атом следующие разделы: MapView (расположение этих полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфизмах). Для подбора праймеров и реотриктаэ использовали пакеты программ DNAStar и VectorNTI 9.0:

Идентификация аллелей полиморфных маркеров проводилась с использованием лолимеразной цепной реакции, дальнейшего расщепления фрагментов ДНК рестриктазами и электрофоретического разделения фрагментов ДНКв 8-12%-вом полиакриламвдном геле или в 2-3% -ном агарозном геле.

2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров A(-G01)G и Arg229G!y гена NPHS2 с ХГН.

Интегральный мембранный белок подоцин с молекулярной массой 42 кДа относится к стоматиновому протеиновому семейству и на 47% гомологичен стоматину человека. В основном подоцин экспрессируется в гломерулярных подоцитах и в меньшей степени - а яичках, фетальных тканях сердца и печени (Boute et al. 2000). Подоцин. подобно «шпильке», замыкает нефрин в подоцитах и тем самым входит в единую структуру щелевой диафрагмы (ЩД) (Roselli et al, 2002), а также связан с липидными мостиками последней (Schwarz et al, 2001). Роль подоцина в формировании гломерулопатий стало возможным изучить после идентификации гена, кодирующего этот Оелок. Ген подоцина (NPHS2) расположен в хромосомной области 1q25-q31 (Huber et al, 2003). В пятом экзоне гена NPHS2 расположен одномуклеотидный полиморфизм A/G, в положении 755 от точки начала транскрипции, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков Arg/Gly в положении 229.

По данным Перейры и соавторов (2004) носительство гетерозиготного генотипа Arg229Gly коррелирует с микроальбуминурией у людей, не имеющих заболеваний почек (Pereira et al, 2004). В раде случаев спорадически возникший ФСГС во взрослом состоянии был ассоциирован с носительством гетерозиготного генотипа Arg/Gly. Считается, что у этих людей достаточно лолно сохранена функция подоцина в детском возрасте, но в дальнейшем она утрачивается, приводя к развитию нефротического синдрома.

В группах ХГН и здоровых доноров частота аллеля Gly резко преобладала над частотой аллеля Arg. Наиболее распространенным генотипом в обеих группах были гомозиготы Gly/Gly (0,87 и 0,89 в группе больных хроническим гломерулонефритом и здоровых доноров, соответственно). Гомозиготы Arg/Arg не наблюдались ни в группе ХГН, ни в группе здоровых доноров. В группе больных с ХГН было отмечено незначительное увеличение содержания гетерозигот Arg/Gly, однако оно косило недостоверный характер (табл. 1).

Таблица 1,

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Агд229&у гена ЫРНБ2 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

ХГН (п = 200) ЗД (n = S0)

Аллель Arg 0,065 0,053 нд

Аллель G1у 0,935 0,047 нд

Генотип Arg/Arg ■ - - -

Генотип Arg/Gly 0,130 0,105 НД

Генотип Gly/Gly 0,870 0,895 нд

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера Arg229Gty гена NPHS2 с развитием ХГН.

Второй полиморфный маркер расположен в промоторном участке гена NPHS2 и также представляет собой однонуклеотидный полиморфизм A/G в положении -601 п.н. от участка инициации транскрипции. В обеих группах отмечено преобладание содержания гллеля G, при этом наиболее частыми генотипами являлись: в группе больных гомозиготные генотипы G/G, а в группе контроля гетерозиготные генотипы A/G (0,47 и 0.59 в группах ХГН и здоровых доноров, соответственно). Гомозиготные генотипы А/А наблюдались крайне редко - их доля в выборке больных и здоровых доноров составляла 0,10 и 0.09. соответственно (табл. 2),

Таблица 2.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера А(-601)в гена NPHS2 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД),

Аппели и генотипы Частота аллелей и генотипов р on Cl

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

АллельЛ 0,31 0,39 нд - -

Аллель G 0,68 0,60 нд - -

Генотип AJA 0,10 0,09 нд - -

ГенотапА/G 0,41 0,59 0,019 0,49 0,27-0,88

Генотип G/G 0.47 0,31 0,027 1,99 1,09-3,63

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выявил как снижение доли генотипа A/G, так и возрастание содержания гомозигот G/G ь группе больных по сравнению с контрольной группой. Эти различия статистически достоверны и свидетельствуют об ассоциации данного полиморфного маркера с хроническим гломерулонефритом. При атом носительство гетерозиготного генотипа А/ХЗ связано с устойчивостью к развитию ХПН (OR = 0,49; Cl 0,27 - 0,88), тогда как гомозиготность по аллелю G повышает риск развития патологии (OR -1,99; Cl 1,09-3,63).

3. Изучение ассоциации полиморфного маркера GIu117Lys гена NPHS1 с ХГН.

Нефрин является основным белком щелевой диафрагмы (ЩД), он связывает два рядом расположенных подоцита (Hcizman et al, 1999). Обнаружение нефрина в составе ЩД дало новое понимание клубочкового фильтра и роли ЩД как заключительного фильтрационного барьера для прохождения белка (Kestila et al, 19S8).

Нефрин - это трансмембранный белок, который относится к суперсемейству иммуноглобулинов с адгезивными функциями. Он состоит из 1241 аминокислотного остатка и его молекулярная масса составляет 185 *Да (Lenkkeri et al, 1999). Доказательством важной роли нефрина в туб очковой фильтрации служат исследования, проведенные на крысах. Инъекция монокпональных антинефриновых антител, приводила к развитию протеинурии (Orikasa et al, 1988). Эти данные подтверждают значимость нефрина как обязательного компонента щелевой мембраны, формирующей фильтрационный барьер гломеруп (Tryggvason et al, 1999). Нарушения в структуре как самого нефрина, так и ассоциированного с ним белкового комплекса приводят к изменениям архитектоники подоцита - сглаживанию «ножек» и протеинурии (Boute et al, 2000). В 1998 г, Кестила и созвт. обнаружили, что ген NPHS1, расположенный на хромосоме 19, ответственен за развитие врожденного нефротического синдрома финского типа (Kestila et al, 1998). Ген NPHS1 содержит 29 экзонов. В финской популяции обнаружены две мутации: делеция в экзоне 2 и нонсенс-мутация в экзоне 26. Обе мутации приводят к нарушению синтеза нефрина.

В экзоне 3 гена NPHS1 (положение 349) расположен однонуклеотидны й полиморфизм А/в, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков Glu/Lys в положении 117. Ланденкари и соавт. обнаружили, что этот полиморфный маркёр (Q349A) ассоциирован как с той формой ХГН, что поддается терапии стероидами при минимальных изменениях нефротического

синдрома (форма завися моя от стероидов), так и с другой формой ХГН, при которой стероиды не эффективны (форма устойчивая к действию стероидов) (1_апйепкаг1 е! а1,2004).

Таблица 3.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера в1и1171.у5 гена ЫРН31 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

ХГН (п = 290) ЗД (п * 80)

Аллель Lys 0,35 0,39 нд

Аллель Glu 0.65 0,61 нд

Генотип Lys/Lys 0,11 0,14 НД

Генотип Lys/Glu 0,47 0,51 нд

Генотип Glu/Glu 0,41 0,35 нд

В группах ХГН и здоровых доноров частота аллеля Glu резко преобладала над частотой аллеля Lys, также как и встречаемость гомозигот Glu/Glu - над встречаемостью генотипа Lys/Lys (табл. 3). При этом различия в распределении аллелей и генотипов между двумя группами были незначительными и носили недостоверный характер.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера Gtu117Lys гена NPHS1 с развитием хронического гпомерулонефрита. Возможно, отсутствие корреляции между нашими данными, и данными, полученными Лачденкари с соавт. (Landenkarl et al, 2004), связано с различиями в формировании группы больных.

4. Изучение ассоциации полиморфного микисателлита, расположенного в интроке 2 гена ¡L1RN, с ХГН.

Цитокины представляют собой группу поли пептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма. В первую очередь они регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и клеток эпителия. Гиперпродукция цитокинов ведет к развитию системной воспалительной реакции и может служить причиной развития ряда патологических состояний, в частности, гпомерулонефрита. Экспрессия генов

цитокинов начинается в ответ на проникновение в организм патогенов, антигенное раздражение или повреждение тканей. Согласно данным последних лет, полиморфизм генов, кодирующих цитокины, оказывает существенное влияние на предрасположенность к гпомерулонефриту и способу его лечения, в частности на цитокиновую и антицитокиновую терапию.

. Антагонист рецептора интерлейкина-1 блокирует связывание интерлейки но в 1а и 1р (IL-1a и IL-1p) с рецептором. Ингибирующее действие антагониста имеет важное физиологическое значение в организации иммунного ответа и в развитии воспалительного процесса при различных патологиях. Ген IL1RN картирован в хромосомной области 2q14.2 (Patterson et al, 1993). Его продуктами являются две иэоформы антагониста, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга. Одна из них остается в цитоплазме, а другая секретируется наружу. Секреция антагониста осуществляется гепатоцитами, регулируется цитокинами на стадиях, предшествующих воспалительной реакции и происходит во время острой фазы воспалительного процесса (Gabay et al, 1997).

В интроне 2 гена IL1RN расположен VNTR, состоящий из тандемных повторов длиной 86 п.н. Минисателпит включает 5 аллелей, из которых наиболее распространены аллели с четырьмя (IL1RN"4) и двумя (JL1RN*2) повторами (Tariow et al., 1993). При этом аллель tL1RN*2 является маркером риска многих хронических заболеваний, сопровождающихся воспалительным процессом: язвы кишечника (Mansfield et al, 1994), системной красной волчанки (Иллариошкин и соает., 1995), сепсиса (Fang et al, 1999) и других. Противоречивы данные о роли гена IL1RN в развитии таких аутоиммунных заболеваний как ревматоидный артрит (Tjernstrom et al, 1999) и базедова болезнь (Blakemore et al, 1995). Показана ассоциация аллеля IL1RN*2 с повышенным риском поражения почек при СД типа 1 (Blakemore et al, 1996).

При анализе контрольной выборки (80 человек) было выявлено 3 аллеля длиной 240,410 и 495 п.н, (табл. 5). В группе больных ХГН встречались 4 аллеля размером 240, 326, 412, 495 П.н. Наибольшими частотами в группах больных и контроля обладали аллели с 2 (0,273 И 0,290) и 4 (0,699 и 0,685) повторами соответственно.

Из 10 возможных генотипов нам удалось обнаружить 61 Б группах больных и здоровых доноров преобладали гетерозиготные генотипы 2/4 (0,481 и 0,419) и гомозиготные генотипы 4/4 (0,435 и 0,468), соответственно (табл. 4).

Таблица 4.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного минисателлита в гене И.1М4 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД).

Ал лепи и генотипы Частота аллелей и генотипов р

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

Аллель 2 0,273 0,290 НД

Аллель 3 0,005 0,000 нд

Аллель 4 0,699 0,685 НД

Аллель 5 0,023 0,024 нд

Генотип 2/2 0.028 0,065 нд

Генотип 2/4 0,481 0,419 нд

Генотип 2/5 0,009 0,032 нд

Генотип 3/4 0,009 0,000 нд

Генотип 4/4 0,435 0,468 нд

Генотип 4/5 0,037 0,016 нд

Сравнительный анализ с использованием точного критерия Фишера не выявил достоверных различий в частотах аллелей и генотипов полиморфного минисателлита гена IL1RN между группой здоровых доноров и группой ХГН. следовательно, полиморфный минисателлит во втором интроне гена, IL1RNt не ассоциирован с хроническим гломерулонефритом.

5. Изучение ассоциации полиморфных маркеров С(-590)Т гена IL4 и C42S7A генаМ-ТЗсХГН.

В настоящее время установлено, что одной из возможных причин развития хронического гломерулонефрита является повышенный синтез интерлейкинов 4 и 13 (Laurent et al, 1987), При этом доказано, что при ХГН уровень экспрессии гена IL13 выше уровня экспрессии гена IL4 (Kimata et al, 1995). Оба эти цитокина играют важную роль в развитии атонических заболеваний и определяют высокую концентрацию IgE в крови. Вьюокая концентрация JgE и IgG* у больных выявлена во многих исследованиях и, по мнению Кимата и соавторов (Kimata et al, 1995), обусловлена повышенной экспрессией в Т-кпетках кнтерлейкинов 4 vi 13. Более того, обнаружены рецепторы к этим цитокинам на подоцитах. Выраженная экспрессия этих рецепторов при XI» подтверждает роль последних в патогенезе данного заболевания.

В последнее десятилетие большое внимание уделяется изучению участков в промоторах, регулирующих экспрессию генов IL4 и IL13. Предполагается, что ряд полиморфных маркеров этих генов ассоциирован с некоторыми атоническими заболеваниями и повышенной концентрацией IgE (Liu et at, 2003). При изучении полиморфных маркеров гена IL4 и его рецептора Кобаяши и соавт. (Kobayashi et al, 2003) обнаружили ассоциацию аплеля С полиморфного маркера С(-590)Т в промоторной области гена с нефротическим синдромом, чувствительным к действию стероидов. Ачзрья и соавт.( Acharya et al, 2005) изучая ассоциацию полиморфных маркеров генов IL4 и IL13 получили достоверное увеличение частоты встречаемости генотипа 7Т полиморфного маркера С{-590)Т гена IL4 и достоверное снижение частоты встречаемости генотипа GG полиморфного маркера G4257A гена IL13 в группе детей с нефротическим синдромом с минимальными изменениями. Однако Пэрри и соавт. (Parry et al, 1999), не обнаружили никаких ассоциаций между полиморфными маркерами генов IL4, рецептора ннтерлейкина 4 и хроническим гломерулонефритом. Столь разноречивые данные обусловили необходимость нашего исследования по изучению ассоциации полиморфного маркера С(-590)Т гена IL4 и полиморфного маркера G4257A гена IL13 с хроническим гломерулонефритом.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-590)Т гена /Ы статистически достоверных различий между двумя группами обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии ассоциации маркера с заболеванием (табл. 5.).

Таблица 5.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера С(-&90)Ттвна IL4 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

. Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

Аллель С 0,31 0,26 НД

АллельТ о,вд 0,74 нд

Генотип С/С 0,5 0,6 НД

Генотип С/Т 0,64 0,50 нд

Генотип Т/Г 0,31 0,44 нд

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного

маркера 04257А гена Н-13 было обнаружено как увеличение Частоты встречаемости генотипа АА, так и уменьшение частоты встречаемости генотипа Ав у больных ХГН по сравнению с группой здоровых доноров (табл. б.)

Таблица б.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера £4257А гена 11.13 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р ОЯ С1

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

Аллель А 0,84 0,75 нд - -

Аллель в 0,16 0.25 нд - -

Генотип (¡ИЗ 0,9 0,6 НД - -

ГенотипА/Б 0,13 0,39 0,0011 0,18 0,06-0,53

Генотип А/А 0,78 0,55 0,0117 3,12 1,28-7,59

Данные различия являлись статистически достоверными, что свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера 64257Д гена 11.13 с ХГН. При этом носительство генотипа АА (О/? = 3,12) предрасполагает к развитию заболевания, тогда как носительство генотипа Ав (ОЯ = 0,18), напротив связано с пониженным риском развития патологии.

в. Изучение ассоциации полиморфных микросателлитов йб32414 и 06Б1271, расположенных в локусе МНС класса II с ХГН.

В настоящее время активно обсуждают значение генетических факторов в определении особенностей иммунного ответа на те или иные воздействия. В частности, особое внимание уделяют изучению роли полиморфных маркеров, расположенных среди генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II.

Гены локуса МНС класса II: НМ-СЮ, Н1А-йК и Н1А-ОР расположены в хромосомной области 6р21 и экспрессируются в клетках, представляющих антигены. Белковые продукты данных генов участвуют в связывании и экспонировании на поверхности макрофагов фрагментов различных антигенов. В дальнейшем с участием- рецептора Т-клеток происходит распознавание антигенов и инициируется иммунный ответ (ЦеиНе е! а1, 1984).

Гены системы Н1А вовлечены в развитие многих аутоиммунных болезней. Обнаружение непосредственного регулирующего влияния антигенов системы НЬА на течение иммунного ответа при ХГН (Кйадауа е1 а1, 2005), а также

достоверно большей частоты выявления антигенов H LA AW19, В8, В14, В41 у больных ХГН, позволяет обсуждать возможный вклад генов МНС класса II в возникновение заболевания и в определение особенностей его развития и течения.

На основании этих исследований можно предполагать, что область HLA вовлечена в развитие хронического гломерулокефрита. Для изучения ассоциации локуса HLA с ХГН мы использовали тетрануклеотидиые полиморфные маркеры, расположенные среди генов МНС класса II. Это микросателлиткые маркеры D6S2414 и D6S1271. Оба маркера состоят из повторов GATA. При сравнительном анализе распределения аллелей и геногипов полиморфного маркера DSS2414 в группе больных ХГН и в группе здоровых доноров было обнаружено 6 аллелей размером от 164 до 184 п.н., включающих от 6 до 11 повторов (табл. 7).

У больных ХГН достоверно повышена частота аллеля 9 по сравнению с контрольной группой. Этот аллель обладает наибольшим значениям ОR и, таким образом, ассоциирован с повышенным риском развития ХГН. В то же время, у больных достоверно снижено содержание аллеля 10, характеризующегося минимальными значениями OR, что свидетельствует о связи этого аллеля со сниженным риском развития патологии (табл. 7).

Таблица 7.

Распределение аллелей полиморфного маркера D6S2414 в группе больных хроническим гломерулонефрщом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

Аллели Частота аллелей Р OR Cl

ХГН <п = 290) ЗД (п = 80)

Аллель 6 0,008 0,018 нд ■ ' -

Аллель 7 0,025 0,018 НД - -

Аллель 8 0,223 0,259 нд - -

Аллель 9 0.541 0,420 0,0396 1,63 1,04-2.57

Аллель 10 0,157 0,241 0,0366 0,59 0,34-1,02

Аллель 11 0,045 0,045 НД - -

У больных ХГН и здоровых доноров удалось обнаружить 13 генотипов из 21 возможного. Наблюдаемое распределение генотипов подчиняется равновесию Харди-Вайнберга. Однако, достоверных различий в распределении генотипов локуса 06Э2414 не наблюдалось, что, возможно, связано с небольшим размером выборки по сравнению с большим количеством возможных генотипов (табл. 8)

Таблица 8.

Распределение частот генотипов полиморфного маркера Ов32414 в группе больных хроническим гломерул о нефритом (ХГН) и в группе здоровых

доноров (ЗД).

Генотипы Частота генотипов Р

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

Генотип Ê/6 0,000 0,000 НД

Генотип 6/7 0,000 0,000 нд

Генотип 6/8 0,014 0,036 НД

Генотип 6/9 0,000 0,000 нд

Генотип 6/10 0,000 0,000 нд

Генотип 6/11 0,000 0,000 нд

Генотип 7/7 0,000 . 0,000 нд

Генотип 7/8 0,014 0,000 нд

Генотип 7/9 0,014 0,000 нд

Генотип 7/10 0,000 0,033 нд

Генотип 7/11 0,000 0,000 нд

Генотип 8/8 0,085 0,089 нд

Генотип 0,211 0,161 нд

Генотип 8/10 0,063 0,125 нд

Генотип 8/11 0,007 0,036 нд

Генотип 9/9 0.296 0,196 нд

Генотип 9/10 0,176 0,232 нд

Генотип 9/11 0,085 0,036 нд

Генотип 10/10 0,021 0,036 нд

Генотип 10/11 0,014 0,018 нд

Генотип 11/11 0,000 0,000 нд

При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера 0651271 найдено 4 аллеля размером от 184 до 196 п.н., причем аллель 12 длиной 192 п.н. встречался наиболее часто (таблица 9). Из 10 возможных вариантов генотипов обнаружили 5 (таблица 10). Наблюдаемое распределение генотипов хорошо подчинялось равновесию Харди-Вайнберга.

Таблица 8.

Распределение частот аллелей полиморфного маркера 0631271 в группе больных хроническим гломерул о нефритом (ХГН) и в группе здоровых

доноров (ЗД).

Аллели Частота аллелей Р оя С1

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

АллельЮ 0,074 0,019 0,018 4,12 1,19-14,3

Аллель 11 0,070 0,063 НД - -

Аллель 12 0,852 0,873 нд - -

Аллель 13 0,004 0,044 0,008 0,09 0,01-0,77

Обнаружены достоверные различия в частотах двух аллелей и двух генотипов. У больных было увеличено содержание аллеля 10 (табл. 9) и генотипа 10/12 (табл.10), тогда как доля аллеля УЗ (табл. 9) и генотипа 12/13 (табл.10) существенно снижены. Таким образом, аллель 10 и генотип 10/12 связаны с повышенным риском развития ХГН, тогда как аллель 13 и генотип 12/13, напротив, со сниженным.

Таблица 10.

Распределение частот генотипов полиморфного маркера 0651271 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых

доноров (ЗД).

Генотипы Частоты генотипов Р ОЯ С1

ХГН (л = 290) ЗД (л = 80)

Генотип 10/10 0,009 0,000 нд - -

Генотип?№*2 0,130 0.038 0,042 3,80 1,06-13,6

Генотип 11/12 0,139 0,127 ИД - -

Генотип 12/12 0,713 0,759 НД - . -

Генотип 72/73 0,009 0,063 0,040 0,13 0,01-5,63

Таким образом, оба микросателлита (0631271 и 06Б2414) ассоциированы с хроническим гломерулонефритом в русской популяции. Поскольку данные микросателлиты расположены в хромосомной области занимаемой генами ША,

то их ассоциация с ХГН косвенно свидетельствует возможной вовлеченности данной области е развитие патологии.

К сожалению, нет данных о сцепленности конкретных аллелей маркеров D6S2414 и D6S1271 с генами HLA. В дальнейшем было бы интересно провести подобный анализ тех же больных непосредственно по генам HLA-DOA1, HLA-DQB1 и HLA-DRB1 с тем, чтобы определить как ассоциацию с заболеванием конкретных аллелей HLA, так и группы сцепления последних с определенными аллелями локусов D6S1271 и D6S2414.

7. Изучение ассоциации полиморфного маркера Ala17Thr гена CTLA4 с ХГН.

Продукт экспреосии гена CTLA4 участвует в активации Т-клеток (Homann et al., 2006). Современная модель активации Т-клеток предполагает наличие двух сигналов (Kalergis et al, 2001). Первый специфический сигнал поступает в момент связывания комплекса МНС с антигеном, находящимся на поверхности клетки, представляющей антиген, с Т-клеточным рецептором (TCR), а второй, неспецифический сигнал поступает после соединения другого рецептора Т-клетки (CD28) с его лигандами В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86), также находящимися на поверхности клетки, представляющей антиген. Часто второй сигнал называют кости мул ирующим. Если оба сигнала поступили, то имеет место активация Т-клетки, секреция цитокинов и дальнейшая пролиферация Т-кпетки. Однако ситуация усложнилась после обнаружения другого рецептора (CTLA-4) с противоположным действием, связывающегося с теми же лигандами В7-1 и В7-2, но переводящего Т-клетку в состояние "безответности" к данному антигену, называемое анергией, за которой следует программируемая смерть Т-клетки (апоптоз) (Ostrov et at, 2000).

Последовательности рецепторов CTLA-4 и CD28 очень похожи. Нарушения в тонком взаимодействии этих белков с лигандами В7-1 и В7-2 могут являться одной из причин аутоиммунных заболеваний (Schwartz et al, 2001).

Ген CTLA4 находится в хромосомной области 2q33 и состоит из 3-ех экзонов (Guzman et al., 2005). Первый экэон кодирует сигнальный пептид и внеклеточный белковый домен из 116 аминокислот. В этом экзоне в ксдоне 17 расположен полиморфизм AiafThr, сцепленный со многими аутоимунными заболеваниями (tkegami et al., 2006). Последние исследования показали, что одни из важнейших локусов предрасположенности к аутоимунным заболеваниям лежат именно в области геное HLA (6р21) и CTLA4 (2q31-q33) и примерно наполовину определяют генетическую предрасположенность к патологии (Vaidya et al, 1999). Таким

образом, с высокой степенью вероятности можно сделать вывод, что ген CTLA4 не только вовлечен в развитие, но и связан с генетической предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту. так как нами уже была обнаружена ассоциация с локусом HLA.

У пациентов с хроническим гломерулонефритом наблюдается возрастание частоты аллеля Thr, тогда как в выборке здоровых доноров преобладающим аллелем являлся аллель Ala. Наиболее распространенным генотипом были гетерозиготы Ala/Thr. Гомозиготы Ala/Ala наблюдались редко — их доля в выборке больных ХГН и в контрольной группе составляла 0,13 и 0,17 соответственно. В группе больных ХГН количество гомозигот Thr/Thr было в 6,5 раз больше, чем в группе здоровых доноров (0,26 и 0,04 соответственно).

Таблица 11.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Л/af777м* гена CTLA4 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р OR С1

ХГН (п = 290) ЗД (л = 80)

Аллель Ala 0,43 0,56 0,011 0,59 0,39-0,89

Аллель Thr 0,57 0,43 0,011 1,70 1,12-2,57

ГенотипА/а/А/а 0,13 0,17 нд - -

ГенотипА/а/77)г 0,60 0,80 0,010 0,41 0,21-0,80

ГенотипТЛ/тТ/?/- 0,26 0,04 0,000 8,69 2,55-29,5

Все различия, кроме тех, которые касались генотипа Ala/Ala, были достоверными (табл.11). Таким образом, из этих данных следует, что полиморфный маркер Ala 17Thr гена CTLA4 ассоциирован с развитием ХГН у русских жителей г. Москвы. При этом аллель Thr и гомозиготность по данному маркеру' связаны с повышенным риском развития патологии (OR = 1,70 и OR = 8.69, соответственно), тогда как носительство аллеля Ala и гетероэигот Ata/Thr связано, Напротив, со сниженной вероятностью развития заболевания {OR = 0,59 и OR = 0,41, соответственно).

■ '" L 1 "

8. Изучение ассоциации полиморфного маркера Рго72Агд гена ТР53 с ХГН.

Белок р53 играет важную роль в регуляции транскрипции и клеточного цикла, он вовлечен в процесс апоптоза, связан с поддержанием геномной стабильности,

взаимодействует со многими клеточными белками. Показано, что повреждение ДНК приводит к накоплению р53, который в свою очередь блокирует клеточный цикл в фазе 61, таким образом препятствуя репликации ДНК до репарации повреждения. Если повреждение нерепарируемо, р53 запускает механизм апоптоза. При стрессах и повреждениях клеток активность и содержание р53 в них повышается. Показано, что активация р53 может происходить на фоне окислительного клеточного стресса, вызванного N0. При различных стрессах и внутриклеточных повреждениям происходят пост-трансляционные модификации, в частности, фосфорипирование и ацетилирование определенных аминокислот молекулы р53, определяющие ее переход в так называемую стрессовую конформацию. Такой р53 значительно более стабилен (т.е. резко увеличивается его количество в клетке) и эффективно транс-активирует и/или транс-репрессирует специфические гены-мишени, следствием чего является индукция в аномальных клетках, либо остановки клеточного цикла, либо апоптоза (Копнин, 2001).

Ген ТР53, кодирующий белок р53, расположен в хромосомной области 17q13.1. В данном гене и его фланкирующих областях обнаружен ряд полиморфных участков, в том числе однонуклеотидный полиморфизм G/C, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Рю/Агд в положении 72 попипептидной цепи (Ага et al, 1990). Участок, образованный аминокислотными остатками с 43-го по 73-ий, образует дополнительный транскрипционный домен (Walker et al, 1996). Участок, обогащенный остатками пролина между аминокислотами 63 и 97 предположительно вовлечен в процесс апоптоза (Venot et al, 1998, Sakamuro et al, 1997).

Показано, что при воспалительных процессах в клетках повышается содержание р53 (Hofsrth et. а!., 2002). Известно, что одной из главных причин развития гломерулонефрита является воспаление почечных клубочков. Это дает основания предполагать вовлеченность продукта гена ТР53 в патогенез хронического гломерулонефрита.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Рго72Агд гена TPS3 среди больных ХГН и здоровых доноров обнаружено преобладание частоты аллеля Arg над частотой аллеля Pro. и встречаемость генотипа Arg/Arg над частотой генотипа Pro/Pro в обеих исследованных группах (таблица 12).

• ' Таблица 12,

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Рго72Агу гена 7Р53 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

. -Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

ХГН (п = 290) ЗД (п = 60)

Аллель Arg 0,692 0,728 ИД

Аллель Pro 0,308 0,272 ид

Генотип Агд/Агд 0,463 0,500 нд

- Генотип Arg/Pro 0,458 0,456 нд

- Генотип Pro/Pro 0,079 0,044 нд

Однако различия в распределении аллелей и генотипов между группами были незначительными и носили недостоверный характер, что свидетельствовало об отсутствии ассоциации между данным полиморфным маркером гена ТР53 и хроническим гломерулонефритом.

9. Изучение ассоциации полиморфного маркера G30SГ гена MDM2 с ХГН.

Ключевую роль в стабилизации белка р53 и повышении его транскрипционной активности играют изменения во взаимодействии р53 с белком-ингибитором Mdm2, ген которого является потенциальным онкогеном. Этот белок, представляющий собой специфическую убиквитин-лигазу, связывается с N-концом молекулы р53 и стимулирует его убиквитанирование и, как результат, протеасомную деградацию белка р53 (Fry et al, 2005). Кроме того, связываясь с N-концевым участком р53 в районе домена, взаимодействующего с базовыми факторами транскрипции, Mdm2 подавляет способность р53 трансактивировать гены-мишени (Копнин, 2000). В результате, несмотря на то, что ген, кодирующий р53, постоянно транскрибируется и транслируется, сам белок быстро подвергается деградации зависимой от убиквитина, и при этом, даже не успевший распасться р53 не проявляет активности (Chan et al., 2006; Чумаков, 2000). Ускорение деградации рБЭ при связывании с Mdm2 происходит за счет двух процессов. Как р53. так и Mdm2 содержат участки, отвечающие за экспорт белка из ядра; Благодаря этим сигналам Mdm2 выводит р53 из ядра и направляет его в протеасомы, где оба белка подвергаются деградации зависимой от убиквитина.

Ген MDM2 содержит 12 экзонов и занимает 25 т.п.н. В первом интроне гена

М0М2 описан однонуклеотидный лолимофизм остатков Т/в а положении 309 от точки инициации транскрипции (Шкептд е! а1., 2006; Мешп е| а1, 2006). Бонд и соавт. показали, что этот полиморфизм связан с повышенным уровнем белкового продукта гена в организме, и пониженной активностью белка р53, а также со спорадичными формами саркомы у людей. При этом частота аллеля в была значительно повышена в группе людей, заболевших саркомой в раннем возрасте.

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера вЗОЗТ гена МОМ2 статистически достоверных различий между двумя группами обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии ассоциации маркера с заболеванием (табл. 13).

Таблица 13.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера вЗМГгена МОМ2 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе

здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

ХГН (п = 290) ЗД (л = 80)

Аллель Т 0,629 0,642 НД

Аллель G 0,371 0,358 нд

Генотип 7Т 0,377 0.415 НД

Генотип TG 0,503 0,453 НД

Генотип GG 0,119 0,132 НД

10. Изучение ассоциации полиморфных маркеров Va1762Ale и Leu54Phe гена ADPRT1 с ХГН.

Показано, что окислительный стресс и апоптоз вносят немалый вклад в патогенез ХГН. На определенном этапе л регрессирования ХГН апоптоз является одним из механизмов уничтожения гпомерулярных клеток при развитии склероза. Апоптоз происходит в меэангиальноЙ зоне клубочка и не наблюдается в капиллярах. Гибель интерстициальных клеток происходит на высоте активации механизма аполтоза, что доказано в экспериментальных работах. Повреждения ДНК, обусловпенные генотоксичным действием свободных радикалов, приводят к активации поли(АОР-рибозил)полимераэ (PARP). Эти ферменты участвуют в репарации ДНК, катализируя поли(АДФ-рибозилирование) белков, связанных с ДНК (Новожилова 1996, Oliver et al, 1999). Донором АДФ-рибозы является НАД+. Активность PARP возрастает в 500 раз и более при связывании с участками

разрыва ДНК. Известны несколько видов PARP, кодируемых разными генами. Из них ассоциации с патогенезом ХГН, прежде всего следует ожидать от PARP-1, так как она ответственна за синтез до 90% лоли(АОР-рибозы) в клетке (Суханова и соавт., 2004). Фермент PARP-1 вовлечен в процессы репликации (Cesarone et al, 1990), транскрипции (Meisteremst et al, 1997) и репарации (Dantzer et al, 199S) Повышенная активация PARP-1 может приводить к существенному снижению содержания внутриклеточного NAD+ и, как следствие, к гибели клетки (Skaper et al, 2003).

Ген ADPRT1 локализован в хромосомной области 1q41-1q42. В данной работе мы исследовали ассоциацию двух однонуклеотидных полиморфных маркеров гена ADPRT1: Т/С, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков Val/Ala в положении 762 полипептидной цели и одномуклеотидный полиморфизм C/G, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков Leu/Phe в положении 54 поли пептидной цепи.

В группе здоровых доноров частота обоих аллелей полиморфного маркера Val762Aia почти одинакова, в то время как в группе ХГН выявлено преобладание аллеля Val. В группе больных ХГН существенно преобладал гомозиготный генотип Vat/Val, наряду с резким уменьшением встречаемости генотипа Ala/Ala по сравнению с группой здоровых доноров (табл. 14).

Таблица 14.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Val762AJa гена ADPRT1 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р OR CI

ХГН (п = 290) ЗД (п = 80)

Аллель Ala 0,287 0,509 0.00003 0,39 0,25-0,61

Аллель Val 0,713 0,491 0,00003 2,57 1,64-4,03

ГенотипА/aWa 0,092 0,316 0,00165 0,22 0,10-0,49

ГенотипА/a/Vaf 0,390 0,386 НД -

Генотип Vaí/Val 0,518 0,298 0,00032 2,53 1,37-4,87

Различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов носили достоверный характер, что свидетельствует об ассоциации полиморфного

маркера Val762Ala гена ADPRT1 с развитием хронического гломерулонефрита. При этом носительство аллеля Val (OR = 2,57) и генотипа Val/Val (OR - 2,53) является фактором повышенного риска развития патологии, а носительство алпеля Ala (OR = 0,39) и генотипа Ala/Ala (OR = 0,22) коррелирует со сниженным риском развития ХГН.

В нашей работе при исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера Leu54Phe гена ADPRT1 в группе хронического гломерулонефрита и в группе здоровых доноров наибольшая частота была выявлена у аллеля Phe (0,647 в группе ХГН и 0,603 в группе здоровых доноров). Наиболее распространенным генотипом были гетерозиготы Leu/Phe, Гомозиготы Leu/Leu встречались наиболее редко - их доля в выборке больных ХГН и в группе здоровых доноров составила 0,076 и 0,098 соответственно. Гомозиготы Phe/Phe встречались с частотой 0,370 и 0,304 (табл. 15).

Таблица 15.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Lei#54P/m гена ADPRT1 в группе больных хроническим гломерулокефритом и в группе

здоровых доноров.

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

ХГН Здоровые доноры

Аллель Leu 0,353 0,397 НД

Аллель Phe 0,647 0,603 НД

Генотип Leu/Leu 0.076 0,098 НД

Генотип Leti/Phe 0,554 0,593 НД

Генотип Phe/Phe 0,370 0,304 НД

При исследовании распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера ¡-еи54РНв гена АОРЯТ1 в группе хронического гломерулонефрита и в группе здоровых доноров статистически достоверных различий обнаружено не было. Таким образом, полиморфный маркер ¿.еи54РЛе гена АОРЯТ не ассоциирован с ХГН у русских пациентов г. Москвы.

Полученные нами результаты коррелируют с ранее полученными данными об ассоциации полиморфного маркера Уа1762А1а гена АОРИТ1 с диабетической полинейропатией (ДПН) при сахарном диабете типа 1 (СД типа 1), при котором одним из патогенетических факторов развития является окислительный стресс и избыточное образование свободных радикалов оказывающих повреждающее

действие на ДНК и мембранные структуры нейронов, и как следствие приводящих к гибели клеток и апоптозу.

выводы.

1. Изучено распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров А(-601)С и Агд22вОу гена ЫРН32, 0!и1171.уз гена ЫРНЭ1, \ZNTR во втором интроне гена 111 ИИ, С(~590}Т гена 44, С4257А гена 11.13, полиморфных микросателлитов 0$$2414 и 06Б1271 расположенных среди генов НШ класса II, А1а 17ТЬг гена СПА4, Рго72Ащ гена ТР53. в(-303)Т гена МОМ2, \/а!762А)а и 1.еи54Р1ю гена АОРНТ в фупле больных хроническим гломерулонефритом, а также в группе здоров ых д оноро в.

2. Для полиморфных маркеров Агд229в1у гена ЫРН32, СМ171уш гена МРН$1, \ZNTR во втором интроне гена С(-590)Т гена 44, Рго72Ащ гена ТР53, 1.еи54Р/)е гена ADPRT1 показано отсутствие ассоциации с ХГН у русских пациентов г. Москвы.

3. Обнаружена ассоциация полиморфных микросателлигтных маркеров 0652414 и 0631271 расположенных среди генов ША с заболеванием, что косвенно свидетельствует о вовлеченности этой области в развитие ХГН.

4. Показана ассоциация полиморфных маркеров А(-601)3 гена ЫРНЭ2, А}а17ТЬг гена СТ1Л4, 04257А гена И13 и Уа1762А1а гена АОРЯТ1 с развитием хронического гломерулонефрита у русских пациентов города Москвы.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Петросян Э.К., Цыган А.Н., Шестаков А.Е., Носиков В.В. (2006) Роль генетического полиморфизма интерлейкина-4 и интерлейкина-13 в развитии нефротического синдрома с минимальными изменениями у детей и подростков. Педиатрия. №5, стр 7-10.

2. Шестаков А.Е., Камышова ЕС., Кутырина И.М., Савостьянов К. В., Носикое В.В. (20О6) Ассоциация полиморфных маркеров D6S2414 и D6S1271, расположенных в локусе МНС (6р21.31), с хроническим томерулонефритом среди русских г. Москвы. Генетика, 42 (12), стр. 1727-1730.

3. Шестаков А.Е., Камышова Е.С., Петросян Э.К., Кутырина ИМ., Савостьянов К.В., Носиков В.В. (2007) Изучение ассоциации полиморфных маркеров Val762A!a и Leu54Phe гена ADPRT1 с хроническим гломерулонефритом у русских пациентов города Москвы. Генетика, 43 (2), в печати

4. Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Врублевский С,Г., Шестаков А.Е. Генетический полиморфизм антагониста рецептора интерлейкина-1 у больных хроническим гломерулонефритом. Тезисы 10-го конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». Вопросы современной педиатрии, 5 (2), стр. 99 (6 - 9 февраля 2006 г.).

5. Петросян Э.К., Ильенко Л.И., Цыгин А.Н., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Полиморфизм гена антигена цитотоксического Т-лимфоцита-4 (CTLA-4) у больных хроническим томерулонефритом. Тезисы V-ro Российского конгресса по детской нефрологии, стр. 171, Воронеж, Россия (19-21 сентября 2006 г).

6. K.V. Savost'anov, А.Е. Shestakov, E.S. Kamyshova, I.M. Kutyrina, V.V. Nosikov. Association of CTLA4 gene and potymorphic microsatellite D6S2414 located in HLA région with chronic glomerulonephritis. Nephr. Abstráete of the XLII Congress of the ERA-EDTA, P.V219, Istanbul, Turkey (June 4 - 7, 2005).

Пришло к исполнению 16/11/2006 Исполнено 17/11/2006

^аказ№94б Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш.( 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шестаков, Алексей Евгеньевич

Введение

1.0бзор литературы

1.1.Полиморфные маркеры 7 1.1.1 .Типы полиморфизмов и методы их исследования 7 1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний

1.2. Характеристика хронического гломерулонефрита 16 1.2.1 .Классификация хронического гломерулонефрита

1.2.2. Иммунные механизмы развития гломерулонефрита

1.2.3. Генетические факторы риска развития хронического гломерулонефрита

1.3. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров

1.3.1. Ген подоцина

1.3.2. Ген нефрина

1.3.3. Ген антагониста рецептора интерлейкина

1.3.4. Гены IL4 и IL

1.3.5. Гены HLA-D области

1.3.6. Ген поверхностного антигена цитотоксических Т-лимфоцитов

1.3.7. Ген белка супрессора опухолей

1.3.8. Ген белка ингибитора Р

1.3.9. Ген поли(АБР-рибозил)полимеразы 1 42 2.Материалы и методы 47 2.1 .Реактивы и ферменты

2.2.Буферные растворы

2.3. Буферы для рестрикции

2.4. Формирование групп больных и здоровых индивидов

2.5. Выделение геномной ДНК человека методом фенол/хлороформной экстракции

2.6.Амплификация ДНК 4S

2.7. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами

2.8. Электрофоретическое разделение ДНК

2.9.Статистическая обработка результатов

2.9.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерийФишера. Поправка Бонферрони

2.9.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал 52 З.Результаты и их обсунедения

3.1. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с хроническимгломерулонефритом

3.2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров A(-601)G и Arg229Gly гена NPHS2 с ХГН. 5(

3.3. Изучение ассоциации полиморфного маркера GlulllLys гена NPHS1 с ХГН

3.4. Изучение ассоциации полиморфного минисателлита во втором интроне гена/mw с ХГН 6(

3.5. Изучение ассоциации полиморфных маркеров С(-590)Тгена IL4 и G4257A гена ZL 73 с ХГН.

3.6. Изучение ассоциации полиморфных микросателлитов D6S2414 и D6S1271 локализованных рядом с генами HLA с ХГН 6!

3.7. Изучение ассоциации полиморфного маркера AlaHThr гена CTLA4 с ХГН 6'

3.8. Изучение ассоциации полиморфного маркера Pro72Arg гена ТР53 с ХГН 6!

3.9. Изучение ассоциации полиморфного маркера G309Tгена MDM2 с ХГН 6'

3.10. Изучение ассоциации полиморфных маркеров Val762Ala и Leu54Phe гена ADPRT1 с ХГН

Выводы 7

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом"

Актуальность проблемы: Прогрессирование хронических заболеваний почек и поиск способов предотвращения их развития, а также замедления прогрессирования остается одной из наиболее актуальных проблем нефрологии.

В общей сложности, по данным крупных европейских медицинских центров, наследственные гломерулопатии занимают от 6,5 до 15% среди патологий, ведущей к хронической почечной недостаточности (ХПН). Связь той или иной патологии почек с генетическими дефектами может помочь выработать тактику терапии этих заболеваний.

Роль генетики в развитии нефрологии состоит не только в выявлении генетической компоненты заболевания, но и в изменении представлений о так называемых приобретенных заболеваниях, появлении новых концепций механизмов развития болезни, дополнении информации о предохраняющих и предрасполагающих факторах в развитии заболеваний, а также формировании гипотезы о совокупности экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к болезни.

Для многофакторных заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Однако для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Одним из наиболее перспективных направлений в современной молекулярной генетике заболеваний является поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.

При исследовании ассоциации сравнивают распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера, расположенного внутри или рядом с геном-кандидатом, в группах больных и здоровых доноров. Наличие 4 достоверных различий в распределении аллелей и генотипов свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера с заболеванием.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного больного.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение ассоциации ряда полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием хронического гломерулонефрита. Этими маркерами были полиморфные маркеры внутри генов кодирующих подоцин (NPHS2), нефрин {NPHS1), антагонист рецептора интерлейкина 1 (IL1RN), интерлейкин 4 (JL4), интерлейкин 13 (IL13), поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), супрессор опухолей (ТР53), главный регулятор супрессора опухолей (MDM2) и поли(АЕ)Р-рибозил)полимеразу 1 (ADPRT1). Кроме того, использовались микросателлитные маркеры D6S2414 и D6S1271, расположенные рядом с генами HLA класса II.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов NPHS2, NPHS1, IL1RN, IL4, IL13, CTLA4, ТР53, MDM2 и ADPRT1, а также, полиморфных микросателлитов D6S2414 и D6S1271 в группе больных ХГН и в группе здоровых доноров.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров, расположенных в вышеуказанных генах-кандидатах, и двух микросателлитов в исследованных выборках для выявления их ассоциации с развитием ХГН и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

Научная новизна работы. В этой работе впервые в мире исследована ассоциация полиморфных маркеров A(-601)G и Arg229Gly гена NPHS2,

Glull7Lys гена NPHS1, VNTR во втором интроне гена IL1RN, С(-590)Т гена 5

114, G4257A гена IL13, Alal7Thr гена CTLA4, Pro72Arg гена ТР53, G(-309)T гена MDM2, Val762Ala и Leu54Phe гена ADPRT1, полиморфных микросателлитов D6S2414 и D6S1271 у русских пациентов с ХГН, проживающих в г. Москве.

Практическая ценность работы. Выявление аллельных вариантов полиморфных маркеров различных генов-кандидатов, обуславливающих повышенный генетический риск развития хронического гломерулонефрита, создает базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения заболевания.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шестаков, Алексей Евгеньевич

ВЫВОДЫ:

1. Изучено распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров А(-601)G и Arg229Gly гена NPHS2, GlulllLys гена NPHS1, VNTR во втором интроне гена IL1RN, С(-590)Т гена IL4, G4257A гена IL13, полиморфных микросателлитов D6S2414 и D6S1271 расположенных среди генов HLA класса II, Alal7Thr гена CTLA4, Pro72Arg гена TP53, G(-309)T гена MDM2, Val762Ala и Leu54Phe гена ADPRT в группе больных хроническим гломерулонефритом, а также в группе здоровых доноров.

2. Для полиморфных маркеров Arg229Gly гена NPHS2, Glull7Lys гена NPHS1, VNTR во втором интроне гена IL1RN, С(-590)Т гена IL4, Pro72Arg гена ТР53, Leu54Phe гена ADPRT показано отсутствие ассоциации с ХГН у русских пациентов г. Москвы.

3. Обнаружена ассоциация полиморфных микросателлитных маркёров D6S2414 и D6S1271 расположенных среди генов HLA с заболеванием, что косвенно свидетельствует о вовлеченности этой области в развитие ХГН.

4. Показана ассоциация полиморфных маркёров A(-601)G гена NPHS2, Alal7Thr гена CTLA4, G4257A гена IL13, Val762Ala ADPRT с развитием хронического гломерулонефрита у русских пациентов города Москвы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шестаков, Алексей Евгеньевич, Москва

1. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: «Специальная литература», 1997. - 287 е.: ил.

2. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. Новый механизм мутаций у человека: экспансия тринуклеотидных повторов // Генетика. 1995. Т. 31. С. 1478-1489.

3. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. Вып. 65. №1. С.5-33.

4. Кутырина И.М., Рогов В. А., Шестакова М.В., Зверев К.В. Гиперфильтрация как фактор прогрессирования хронических заболеваний почек // Тер. архив. 1992. - № 6. - С. 10-15.

5. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов C.JI. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов мед. вузов. М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2003. - 544 е.: ил.

6. Пузырев В.П., Степанов В.А. Патологическая анатомия генома человека. Новосибирск: Наука. Сиб. Предприятие РАН, 1997. - 224 с. ил.

7. Тареева И.Е. Гломерулонефриты: клиника, лечение // Русский медицинский журнал. 2000 Том 8 №3.

8. Тареева И.Е., Шилов Е.М. Современные представления о гломерулонефрите. // Русский медицинский журнал 1997 Том 5 №23.

9. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. 2000. Т.65. Вып. 1. С.34-37.

10. Рябов С.И. Нефрология. Руководство для врачей. Изд-во СпецЛит. 2000. 67стр.

11. Суханова М. В., Лаврик О. И., Ходырева С. Н. Поли(АОР-рибозо)полимераза 1 регулятор белково-нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии. Молекулярная биология. 2004 38, 5 834-5847.

12. Баранов B.C., Киселев Л.Л., и др. Геномика медицине / Под ред. Академика РАМН В.И. Иванова и академика РАН Л.Л. Киселева. - ИКЦ «Академкнига», 2005. - 392 с.;ил.

13. Aaltonen Р, Luimula Р, Astrom Е, Palmen Т, Gronholm Т, Palojoki Е, Jaakkola I, Ahola Н, Tikkanen I, Holthofer H. Changes in the expression of nephrin gene and protein in experimental diabetic nephropathy. Lab Invest 2001, 81:1185-1190.

14. Acharya B, Shirakawa T, Pungky A, Damanik P. Polymorphism of the interleukin-4, interleukin-13, and signal transducer and activator of transcription 6 genes in Indonesian children with minimal change nephritic syndrome. Am J Nephr. 2005. Vol.25:30-35

15. Al-Elisa A., Haider M.Z., Srivastva B.S. Angiotensin converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism in idiopathic nephrotic syndrome in Kuwqaiti Arab children // Scan. J. Urol. Nephrol. 2001. - Vol. 35. - P. 239-242.

16. Ara S, Lee PSY, Hansen MF, et al. Codon 72 polymorphism of the TP53

17. Armour J.A.L., Wong Z., Wilson W., Royle N.J., Jeffreys AJ. Sequences flanking the repeat arrays of human minisatellites: association with tandem and dispersed repeat elements // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 4925-4936.

18. Beltcheva О, Martin P, Lenkkeri U, Tryggvason K. Mutation spectrum in the nephrin gene (NPHS1) in congenital nephrotic syndrome. Hum Mutat 2001; 17:368-373

19. Blakemore A.I., Cox A., Gonzalez A.M., Maskil J.K., Hughes M.E., Wilson R.M., Ward J.D., Duff G.W. Interleukin-1 receptor antagonist allele (IL1RN*2) associated with nephropathy in diabetes mellitus // Hum. Genet. 1996. V. 97. P. 369-374.

20. Blakemore A.I., Watson P.F., Weetman A.P., Duff G.W. Association of Graves' disease with an allele of the interleukin-1 receptor antagonist gene // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1995. V. 80. P. 111-115.

21. Brown D.L., Gorin M.B., Weeks D.E. Efficient strategies for genomic searching using the affected-pedigree-member method of linkage analysis.// Am. J. Hum. Genet. 1994. Vol. 54. P. 544-552.

22. Buraczynca M, Jozwiak L, Spasiewicz D, Nowicka T, Ksiazek A. Renin-angiotensin system genes in chronic glomerulonephritis. // Pol Arch Med Wewn. 2001 Jun;105(6):455-60

23. Cambien F. The angiotensin-converting enzyme (ACE) genetic polymorphism: Its relationship with plasma ACE level and myocardial infarction // Clin. Genet. 1994. - V. 46. - P. 94-101.

24. Cambien F., Poirier 0., Lecerf L. et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction // Nature. 1992. - Vol. 359. - P.641-644.

25. Campbell D,J. Circulating and tissue angiotensin systems // J. Clin. Invest. -1987.-Vol. 79.-P. 1-6.

26. Cao Z, Bonnet F, Candido R, Nesteroff SP, Burns WC, Kawachi H, Shimizu F, Carey RM, De Gasparo M, Cooper ME. Angiotensin type 2 receptor antagonism confers renal protection in a rat model of progressive renal injury. J Am Soc Nephrol 2002;13:1773-1787.

27. Caputo M, Cerrone GE, Lopez AP, Villalba A, Krochik GA, Cedola FN, Targovnik HM. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 heterozygous codon 49 A/G dimorphism is associated to latent autoimmune diabetes in adults (LADA). Autoimmunity. 2005 Jun; 38(4):277-81

28. Caridi G, Murer L, Carrea A, Maselle L, Rizzoni G, Perfumo F, Chiggeri GM. Infantile steroid-resistant nephritic syndrome associated with double homozygous mutations of podocin. Am J Kidney Dis 2004; 43:727-732.

29. Cesarone, C.F., Scarabelli, L., Scovassi, I., Izzo, R., Menegazzi, M., DePrati, A.C., Orunesu, M., Bertazzoni, U. Changes in activity and mRNA levels of poly(ADP-ribose)polymerase during rat liver regeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1990 1087:241-246

30. Chan WM, Мак MC, Fung TK, Lau A, Siu WY, Poon RY. Ubiquitination of p53 at Multiple Sites in the DNA-Binding Domain. // Mol Cancer Res. 2006 Jan 19.

31. Charlesworth C., Sniegovski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes.//Nature. 1994. Vol. 371. P. 215-220.

32. Chay SY, Jonston CI. Tissue distribution of angiotensin-converting enzyne // Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis, and Management (2nd ed), edited by Laragh JH, Brenner BM, New York, Raven Press, Ltd., 1995. P. 1683 - 1693.

33. Cherney, B. W.; McBride, O. W.; Chen, D.; Alkhatib, H.; Bhatia, K.; Hensley, P.; Smulson, M. E.: cDNA sequence, protein structure, and chromosomal location of the human gene for poly(ADP-ribose) polymerase. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 8370-8374,1987.

34. Cushman DW, Cheung HS. Concentration of angiotensin-converting enzyme in tissues of the rat // Biochem. Biophys. Acta. 1971. - V. 250. - P. 261265.

35. Dantzer F., Schreiber V., Niedergant C., Trusso C., Flatter е., de la Rubia G., Oliver J., Rolli V., de Murcia J.M., de Murcia G. Involvement of poly(ADP-ribose)polymerase in base excision repair. Biochimie. 1999 81, 69-75

36. Dariavach P., Mattei M.-G., Golstein P., Lefranc M.-P. Human Ig superfamily CTLA-4 gene localization and organization // Cytogenet. Cell Genet. 1989. V. 51: P. 983.

37. Das M, Hartley JL, Soffers RL. Serum angiotensin-converting enzyme. Isolation and relationship to the pulmonary enzyme // J. Biol. Chem. 1987. - V. 252. - P. 1316-1319.

38. Davies E., Holloway C.D., Ingram M.C. et al. Aldosterone excretion rate and blood pressure in essential hypertension are related to polymorphic differences in the aldosterone synthase gene CYP11B2 // Hypertension. 1999. - Vol. 33. - P. 703-707.

39. De Gasparo M., Catt K.J., Inagami T. et al. International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin receptors // Pharmacol. Rev. 2000. - Vol. 52.-P. 415-472.

40. Dixon F. J., Feldman J.D., Vasquer J. J. Experimental glomerulonephritis: the patogenesis of a laboratory model resembling the spectrum of human glomerulonephritis// J. Exp. Med.-1961. Vol.113.-2. P899-920.

41. Doublier S, Salvidio G, Lupia E, Ruotsalainen V, Verzola D, Deferrari G & Camussi G. Nephrin Expression Is Reduced in Human Diabetic Nephropathy: Evidence for a Distinct Role for Glycated Albumin and Angiotensin II. Diabetes 2003;52: 1023-1030.

42. Eiken H.G., Odland E., Boman H.// NAR. 1991. Vol. 19(7). P. 1427-1430.

43. Erdos E, Skidgel RA. The angiotensin I-converting enzyme // Lab. Invest. -1987.-V. 56.-P. 345-348.

44. Ewen M.E., Miller S.J. P53 and translational control // Biochim Biophys Acta. 1996. V.1242. №3. P.181-184.

45. Fang X.M., Schroder S., Hoeft A., Stuber F. Comparison of two polymorphisms of the interleukin-1 gene family: interleukin-1 receptor antagonist polymorphism contributes to susceptibility to severe sepsis // Crit. Care Med. 1999. V. 27. P. 1330-1334

46. Frishberg Y., Becker-Cohen R., Halle D. et al. Genetic polymorphisms of the renin-angiotensin system and the outcome of focal segmental glomerulosclerosis in children // Kidney Int. 1998. - Vol. 54. - P. 1843-1849.

47. Fry DC, Graves B. Development of E3-Substrate (MDM2-p53)-Binding Inhibitors: Structural Aspects. Methods Enzymol. 2005;399:622-33.

48. Funk WD, Рак DT, Karas RH, Wright WE, Shay JW. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes // Molecular and Cellular Biology. 1992. V. 12. №6. P. 2866-2871.

49. Gabay C., Smith M. F., Jr., Eidlen D., Arend W. P. Interleukin 1 receptor antagonist (IL-IRa) is an acute-phase protein // J. Clin. Invest. 1997. V. 99: P. 2930-2940.gene. Nucleic Acids Res 1990; 18:4961.

50. Gerke P, Huber ТВ, Sellin L, Benzing T & Walz G () Homodimerization and Heterodimerization of the Glomerular Podocyte Proteins Nephrin and NEPH1. J Am Soc Nephrol 2003;14: 918-926.

51. Ginsberg D, Mechta F, Yaniv M, Oren M. Wild-type p53 can down-modulate the activity of various promoters // Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA. 1991. V.88. №22. P.9979-9983.

52. Gomez-Guerrero С, Hernandez-Vargas P, Lopez-Franco O, Ortiz-Munoz G, Egido J. Messangial cells and glomerular inflammation: from the pathogenesis to novel therapeutic approaches // Curr Drug Targets inflamm Allergy, 2005 jun; 4(3):341-51.

53. Gonzalez-Escribano M.F., Rodriguez R., Valenzuela A., Garcia A., Garcia-Lozano J.R., Nunez-Roldan A. CTLA4 polymorphisms in Spanish patients with rheumatoid arthritis // Tissue Antigens. 1999. V. 53. P. 296-300,

54. Guzman VB, Morgun A, Shulzhenko N, Mine KL, Goncalves-Primo A, Mussatti CC, Gerbase-Delima M. Characterization of CD28, CTLA4, and ICOS polymorphisms in three Brazilian ethnic groups. // Hum Immunol. 2005 Jul; 66(7):773-6

55. Hamano Y, Grunkemeyer JA, Sudhakar A, Zeisberg M, Cosgrove D, Morello R, Lee B, Sugimoto H, Kalluri R. Determinants of vascular permeability in the kidney glomerulus. J Biol Chem 2002; 277:31154-31162.

56. Harbo H.F., Celius E.G., Vartdal F., Spurkland A. CTLA4 promoter and exon 1 dimorphisms in multiple sclerosis // Tissue Antigens. 1999. V. 53. P. 106110,

57. Hofseth LJ, Saito S, Hussain SP et al,. Nitric oxide-induced cellular stress and p53 activation in chronic inflammation.// Proc Natl Acad Sci USA 2003 Jan 7; 100(1): 143-8.

58. Holzman LB, St John PL, Kovari I A, Verma R, Holthofer H & Abrahamson DR Nephrin localizes to the slit pore of the glomerular epithelial cell. Kidney Int 1999; 56: 1481-1491.

59. Homann D, Dummer W, Wolfe T, Rodrigo E, Theofilopoulos AN, Oldstone MB. Lack of intrinsic ctla-4 expression has minimal effect on regulation of antiviral T-cell immunity. // J Virol. 2006 Jan;80(l):270-80.

60. Huber ТВ, Kottgen M, Schilling B, Walz G & Benzing T. Interaction with podocin facilitates nephrin signaling. J Biol Chem 2001; 276:41543-41546.

61. Hubert C, Houot AM, Soubrier F. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene: two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 15377-15383.

62. Ichikawa I, Harris RC. Angiotensin actions in the kidney: renewed insight into the old hormone // Kidney Int. 1991. - Vol. 40. - P. 583-596.

63. Johnston CI, Kohzuki M. Angiotensin converting enzyme: localization, regulation and inhibition // Current Advances in ACE inhibitors. Edited by Sever P, MacGregor G. London: Churchill Livingstone. 1989. - P. 3-7.

64. Kawachi H, Kurihara H, Topham PS, Brown D, Shia MA, Orikasa M, Shimizu F & Salant DJ. Slit diaphragm-reactive nephritogenic MAb 5-1-6 alters expression of ZO-1 in rat podocytes. Am J Physiol 1997; 273: 984-993.

65. Kern S.E, Kinzler K.W, Bruskin A, Jarosz D, Friedman P, Prives C, Vogelstein B. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein // Science. 1991. V.252. №5013. P.1708-11.

66. Kimata H, Fujimoto M, Furusho K. Involvement of interleukin (IL)-13, but not IL-4, in spontaneous IgE and IgG4 production in nephrotic syndrome. Eur J Immunol. 1995 Jun;25(6): 1497-501.

67. Kobayashi Y, Arakawa H, Suzuki M. Polymorphisms of interleukin-4-related genes in Japanese children with minimal change nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis. 2003 Aug;42(2):271-6.

68. Lahdenkari AT, Kestila M, Holmberg C, Koskimies О & Jalanko H. Nephrin gene (NPHS1) in patients with minimal change nephritic syndrome (MCNS). Kid Int, 2004; 65: 1856-1863/

69. Laurent J, Rostoker G, Robeva R, Bruneau C, Lagrue G. Is adult nephritic syndrome food allergy? Value of oligoantigenic diets. Nepron 1997. Vol 47:7-11

70. Lee D.Y., Kim W., Kang S.K. et al. Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism in patients with minimal-change nephrotic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis //Nephron. 1997. Vol. 77. 471-473.

71. Levidiotis V, Kanellis J, Ierino F, Power D. Increased expression of heparanase in puromycin aminonucleoside nephrosis. Kidney Int 2001; 60:1287— 1296.

72. Levine F., Mach В., Long E., Erlich H., Pious D. Mapping in the HLA-D region with deletion variants and cloned genes // Cytogenet. Cell Genet. 1984. V. 37. P. 523.

73. Li H., Gyllensten U.B., Gui X., Saiki P.K., Erlich H.A., Arncheim N. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells.//Nature. 1988. Vol. 335. P. 414-417. .

74. Locatelli F., Marcelli D., Comelli M., Giangrande A. Proteinuria and blood pressure as causal components of progression to end-stage renal failure // Nephrol. Dial. Tranplant. 1996. -N. 11 (3). - P. 461-467.

75. Lovati E., Richard A., Frey B. et al. Genetic polymorphisms of the renin-angiotensin-aldosterone system in end-stage renal disease // Kidney Int. 2001. -Vol. 60.-P. 46-54.

76. Ludwig E., Corneli P.S., Anderson J.L. et al. Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism is associated with myocardial infarction but not with86development of coronary stenosis // Circulation. 1995. - Vol. 91. - P. 21202124.

77. Luimula P, Aaltonen P, Ahola H, Palmen T & Holthofer H. Alternatively spliced nephrin in experimental glomerular disease of the rat. Pediatr Res 2000; 48: 759-762.

78. Ma H, Hu Z, Zhai X, Wang S, Wang X, Qin J. Polymorphisms in the MDM2 promoter and risk of breast cancer: a case-control analysis in a Chinese population. Cancer Lett. 2005 Nov 7.

79. Marre M., Bernadet P., Gallois Y. et al. Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism, plasma levels, and diabetic retinal and renal complication // Diabetes. -1994. Vol. 43. - P. 384-388.

80. Mendrysa SM, О Leary KA, McElwee MK, Michalowski J, Eisenman RN, Powell DA, Perry ME. Tumor suppression and normal aging in mice with constitutively high p53 activity. Genes Dev. 2006 Jan 1;20(1):16-21

81. Meisterernst, M., Stelzer, G., Roeder, R.G. Poly(ADP-ribose)polymerase enhances activator-dependent transcription in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94:2261-2265

82. Menin C, Scaini MC, De Salvo GL, Biscuola M, Quaggio M, Esposito G, Belluco C. Association between MDM2-SNP309 and age at colorectal cancer diagnosis according to p53 mutation status. // J Natl Cancer Inst. 2006 Feb 15;98(4):285-8

83. Morelli E, Loon N, Meyer TW, Peters W, Myers BD. Effect of converting-enzyme inhibition on barrier function in diabetic glomerulopathy // Diabetes. -1990.-Vol.-39.-P. 76-82;

84. Narita I, Goto S, Saito N, Song J, Kondo D, Omori K, Kawachi H, Shimizu F, Sakatsume M, Ueno M & Gejyo F. Genetic polymorphism of NPHS1 Modifies the Clinical Manifestations of IgA nephropathy. Lab Inv. 2003; 83: 1193-1200.

85. Nepom G.T. A unified hypothesis for the complex genetics of HLA associations with IDDM // Diabetes. 1990, V. 39. P. 1153-1157.

86. Ngo I.S.L., Pace R., Richard M.V. Methods for analysis of multiple cystic fybrosis mutations.//Hum.Genet. 1991. Vol. 87. P. 613-617.

87. Nguewa PA, Fuertes MA, Valladeres B, Alonso C, Peres JM. Poly(ADP-Ribose) Polymerases: Homology, Structural Domains and Functions. Novel Therapeutical Applications. Prog Biophys Mol Biol. 2005 May;88(l):143-72.

88. Odoni G, Ritz E. Diabetic nephropathy what we learned in the three decades? J Nephrol 12 Suppl 1999; 2:120-124.

89. Orikasa M, Matsui K, Oite T & Shimizu F. Massive proteinuria induced in rats by a single intravenous injection of a monoclonal antibody. J Immunol 1988; 141:807-814.

90. Ostrov D., Shi W., Schwartz J., Almo S., and Nathenson S. Structure of Murine CTLA-4 and Its Role in Modulating T Cell Responsiveness // Science. 2000, Vol. 290, P. 816-819.

91. Parry RG, Gillespie KM, Parhnam A, Clark AGB, Mathieson PW. Interleukin-4 and interleukin-4 receptor polymorphisms in minimal change nephropathy. Clin Sci (Lond). 1999 Jun;96(6):665-8. Clin Science.-1999.-Vol. 96.-P. 665-668.

92. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason К & Jalanko H. Expression of nephrin in pediatric kidney diseases. J Am Soc Nephrol 2001; 12: 289-296.

93. Patterson D., Jones C., Hart I., Bleskan J., Berger R., Geyer D., Eisenberg S. P., Smith M. F., Jr., Arend W. P. The human interleukin-1 receptor antagonist (IL1RN) gene is located in the chromosome 2ql4 region // Genomics. 1993. V. 15. P. 173-176.

94. Pereira AC, Pereira AB, Mota GF, Cunha RS, Herkenhoff FL, Pollak MR, Mill JG, Krieger JE. NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population. Kidney Int 2004; 65:1026-1030.

95. Ramirez-Soriano A, Lao O, Soldevila M, Calafell F, Bertranpetit J. Haplotype tagging efficiency in worldwide populations in CTLA4 gene. Genes Immun. 2005 Dec; 6(8):646-57.

96. Remuzzi G., Rugenenti P., Benigni A. Understanding the nature of renal disease progression // Kidney Int. 1997. - Vol. 51. - P. 2-15.

97. Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F. et al. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels // J. Clin. Jnvest. 1990. - Vol. 86. - P. 13431346.

98. Rigat В., Hubert H., Corvol P., Soubrier F. PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCP1) (dipeptidil carboxipeptidase 1) // Nucl. Acids. Res. 1992. - Vol. 20. -P. 1433.

99. Roselli S, Gribouval 0, Boute N, Sich M, Benessy F, Attie T, Gubler MC & Antignac C. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. Am J Pathol 2002; 160: 131-139.

100. Ruotsalainen V, Patrakka J, Tissari P, Hess M, Kestila M, Homberg C, Salonen R. Role of nephrin in cell junction formation in human nephrogenesis. Am J Pathol 2000; 157: 1905-1916.

101. Sacamuro D, Sabbatini P, White E, Prendergast GC. The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest // Oncogene 1997 Aug 18; 15(8):887-98

102. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for sickle cell anemia.// Science. 1985. Vol. 230. P. 13501354.

103. Samuelsson O., Attman P-O., Larsson R. et al. Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism in non-diabetic renal disease // Nephrol. Dial. Transplant. -2000. Vol. 15. - P. 481-486.

104. Savill J., Rees A. J. Mechanism of glomerular injury. Clinical Nephrol.-Oxford Med Pub, 1998. P403-441.

105. Schwartz J., Zhang X., Federov A., Nathenson S., Almo S. Structural Basis for Costimulation by the Human CTLA-4/B7-2 Complex // Nature. 2001. Vol. 410, P. 604-608.

106. Schwarz К, Simons M, Reiser J, Saleem MA, Faul C, Kriz W, Shaw AS, Holzman LB & Mundel P. Podocin, a raft-associated component of the glomerular slit diaphragm, interacts with CD2AP and nephrin. J Clin Invest 2001 ;108: 16211629.

107. Sdek P, Ying H, Chang DL, Qiu W, Zheng H, Touitou R, Allday MJ. MDM2 promotes proteasome-dependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma protein. Mol Cell. 2005 Dec 9;20(5):699-708

108. Sdek P, Ying H, Chang DL, Qiu W, Zheng H. MDM2 promotes proteasome-dependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma protein. Mol Cell. 2005 Dec 9;20(5):699-708.

109. Seidl C., Donner H., Fischer В., Usadel K.H., Seifried E., Kaltwasser J.P., Badenhoop K. CTLA4 codon 17 dimorphism in patients with rheumatoid arthritis //Tissue Antigens. 1998. V. 51. 62-66.

110. Sellin L, Huber ТВ, Gerke P, Quack I, Pavenstadt H , Walz G. NEPH1 defines a novel family of podocin interacting proteins. Faseb J 2003; 17: 115-117.

111. Shankland SJ. Cell-cycle control and renal disease. Kidney int. 1997. Vol 52-2.294-308.

112. Shunkert H., Riegger G. Association between a deletion polymorphism of the angiotensin converting enzyme gene and left ventricular hypertrophy // N. Engl. J. Med. 1994. - Vol. 330. - P. 1634-1638.

113. Simons M, Schwarz K, Kriz W, Miettinen A, Reiser J, Mundel P & Holthofer H. Involvement of lipid rafts in nephrin phosphorylation and organization of the glomerular slit diaphragm. Am J Pathol 2001; 159: 1069-1077.

114. Simons M, Schwarz K, Kriz W, Miettinen A, Reiser J, Mundel P & Holthofer H. Involvement of lipid rafts in nephrin phosphorylation and organization of the glomerular slit diaphragm. Am J Pathol 2001; 159: 1069-1077.

115. Simons M, Schwarz К, Kriz W, Miettinen A, Reiser J, Mundel P & Holthofer H. Involvement of lipid rafts in nephrin phosphorylation and organization of the glomerular slit diaphragm. Am J Pathol 2001; 159: 1069-1077.

116. Skaper S.D. Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 in Acute Neuronal Death and Inflammation. A Strategy for Neuroprotection. Annals of the New York Academy of Sciences 2003 993:217-228.)

117. Tan M, Li S, Swaroop M, Guan K, Oberley L.W, Sun Y. Transcriptional activation of the human glutathione peroxidase promoter by p53 //. The Journal of Biological Chemistry. 1999. V.274. №17. P. 12061-12066.

118. Tarunina M, Jenkins JR. Human p53 binds DNA as a protein homodimer but monomelic variants retain full transcription transactivation activity // Oncogene. 1993. V.8. №11. P.3165-3173.

119. Terwilliger J.D., Ott J. Handbook of human genetic linkage.// Baltimor: John Hopkins University Press, 1994.

120. Thomson G. Mapping disease genes: family-based association studies.// Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol.57. P. 487-498.

121. Tryggvason K, Ruotsalainen V, Wartiovaara J. Discovery of the congenital nephrotic syndrome gene discloses the structure of the mysterious molecular sieve of the kidney. Int J Devel Biol 1999; 43:445-451.

122. Tryggvason К. Unraveling the mechanisms of glomerular ultrafiltration: nephrin, a key component of the slit diaphragm. J Am Soc Nephrol 1999; 10: 2440-2445.

123. Tryggvason K. Unraveling the mechanisms of glomerular ultrafiltration: nephrin, a key component of the slit diaphragm. J Am Soc Nephrol 1999; 10: 2440-2445.

124. Tsukada Т., Yokoyama K., Arai T. et al. Evidence of association of the ecNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - Vol. 245. - P. 190-193.

125. Ueda S, Elliot HL, Morton JJ, Connel JMC. Enhanced pressor response to angiotensin I in normotensive men with the deletion genotype (DD) for angiotensin-converting enzyme // Hypertension. 1995. - Vol. 25. - P. 12661269.

126. Venot C, Maratrat M, Dureuil C, Conseiller E, Bracco L, Dubussche L. The requirement for the p53 proline-rich functional domain for mediation of apoptosis is correlated with specific PIG3 gene transactivation and with transcriptional repression.//

127. EMBO J 1998 Aug 17(16):4668-79

128. Venot C, Maratrat M, Sierra V, Conseiller E, Debussche L. Definition of a p53 transactivation function-deficient mutant and characterization of two independent p53 transactivation subdomains // Oncogene. 1999. V.18. №14. P. 2405-2410.

129. Waterhouse P., Penninger J. M., Timms E., Wakeham A., Shahinian A., Lee K. P., Thompson С. В., Griesser H., Мак Т. W. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4 // Science. 1995. V. 270, P. 985-988.

130. Weber S, Gribouval O, Esquivel EL, Morinire V, T.te MJ, Legendre C, Niaudet P, Antignac C. NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity ofsteroid-resistant nephritic syndrome and low post-transplant recurrence. Kidney Int 2004; 66:571-579.

131. Weissenbach J., Gyapay G., Dib C. et. al. A second-generation linkage map of the human genome.//Nature. 1992. Vol. 359. P. 794-801.

132. Wilkening S, Bermejo JL, Burwinkel B, Klaes R, Bartram CR. The Single Nucleotide Polymorphism IVS1+309 in Mouse Double Minute 2 Does Not Affect Risk of Familial Breast Cancer. // Cancer Res. 2006 Jan 15;66(2):646-8.

133. Wilcox C.S., Baylis C., Wingo C.S. Glomerular-tubular balance and proximal regulation, in Kidney Physiology and Pathophysiology, edited by Seldin D.W., Giebisch G., New York, Raven Press Ltd. 1992. - P. 1807-1842.

134. Welsch T, Endlich N, Kriz W, Endlich K. CD2AP and pl30Cas localize to differn F-actin structures in podocytes. Am J Phisiol Renal Phisiol 2001; 281: 769777.

135. Yan K, Khoshnoodi J, Ruotsalainen V & Tryggvason. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 1385-1389

136. Yoshida H., Kuriyama S., Atsumi Y. et al. Angiotensin I converting enzyme gene polymorphism in non-insulin dependent diabetes mellitus // Kidney Int. -1996.-Vol. 50.-P. 657-664.

137. Zee R.Y.L., Lou Y., Griffiths L.R., Morris B.J. Association of a polymorphism of the angiotensin I converting enzyme gene with essential hypertension // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - Vol. 184. - P. 9-15.

138. Zhang X, Miao X, Guo Y, Tan W, Zhou Y, Sun T, Wang Y, Lin D. Genetic polymorphisms in cell cycle regulatory genes MDM2 and TP53 are associated with susceptibility to lung cancer. Hum mutat. 2006 Jan;27(l):l 10-7.