Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование активных центров и механизмов взаимодействия компонентов стероид-гидроксилирующей ферментативной системы митохондрий коры надпочечников

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование активных центров и механизмов взаимодействия компонентов стероид-гидроксилирующей ферментативной системы митохондрий коры надпочечников"

■ НАЦИОНАЛЬНАЯ АШИШ НАУК АРНЕНИГ I ШСТШЗТ ИГОШШИ ж. Т.1~ЕтШШ

I- На птжваг рукапиаг

УЖ 576.3U.347, 577.11.,. 577Л52*'Г» 577Л58»» 577*158»8» 577.352.5

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ И МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ СПШЗЭД-ГЙДРОКСШШРУ ЩЕЙ <$ЕГМ5НТАТИВН0Й СИСТЕМЫ МИТОХОНДРИЙ НОШ НАДПОЧЕЧНИКОВ

03.00.04 - БШШШ

Д"и с с в- р т а ц и г ' на соискание ученой, •степени доктора биологияеоких. наук в виде научного, доклада .

МАОДНЯЕ США. С5ЕАТ0ВШ1

ЕЕЕВЖ — 1394 г..

Работа выполнена в Институте биохимии Национальной Академии Наук Республики Армения им. Г.Х.Еунятяна

Официальные оппоненты: член-корреспондент HAH РА, профессор

Карагеаян Константин Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Срахгаонян Рвкма Мкртьгчевна

доктор биологических наук Бадяшян Сергей Авотович

Ведущая организация: Ереванский Государственный Университет, кафедря биофизики

Зашита состоится " if * ноября 1994 г., в 12 часов на заседании специализированного совета по защите докторских диссертаций Д.005,15.С$ при Институте биохимии HAH РА им. Г.Х. Дунятяна, S75044, Ереван, ул. П. Севака,~5/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии HAH РА им. Г.Х.Бунятяка

' г ' ■

Диссертация в виде научного доклада разослана " /У " октябрк 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета,

, -..¿а

-.V-. ОЕПДЯ XAPAKTSFKCrm' РАБОТЫ

Акт?адпноетъ асоблзмн. Еиссянтез стероядж:*: горгг.оноз з сте-юядогекШЙГ' ticíbsx - коре надпочечников, 'личинках, оеменнгках л даденте, осуществляется на регулируемых '$ер:ентатизгшх сцсте-:?jc, обеспзчпзаздих яеобходашй _ уровень этпг горглопоз invito у .елозеяа и яспзотных. В метаболизма. стероиданх гормонов прзнп-:шэт участие и другие, не" стерсздсгенкке ткана:' мозг, сердце, :ечекь, почки (Сергеев П«В»,-1984)Однако» же преобладающее пело (по крайней t/.epe 305» синтезируется.з кора яадпочочкгкоз эклэ трех типов: Аяяералсхбртзкоидоз;- глахскортиколдоз а анд— огонов, ответственных, соответственно, за регулятдпэ злэктро— и.тного л водного обмена, метаболизм белков д лкпздов и за фор— цровапие .вторичных половых признаков. Очевидно участие указания гсржналънкх факторов' в фукл1д:онированкп глпотэлаяо-гнпофа— арко-надпочечникозой система» -Например* гл&кокартиксллн, сек-етпруекыб надпочечнгк&ми под. воздейстгзаем. АКЗГ -аденсгшгофаза, ндзягекый з ответ- на кортпсотропзк-риллзлнг фактор (ii?2) или азспресспл гипоталамуса, согласно .келгнпгглу обратной связи, хазнзаатся регуляторами синтеза а высвобождения АНН л К?3 Johr.es М.Т. et al., I9S2; ■ DeKloe.t S.H., "cH'.ver. R.S., 1976). лгказорткхошщ влияют на процессу роста л длффэренпиаази кле-ок»керз:-2й; тканей, их функциональную активность, обуслагдззан:-уо фенсггенн памяти, сна, адаптации,, •загззтких проявлений срга-из:.:а з стрессовых ситуациях. Повагендэ • Уровня .глззкокортпхоздэз озет стать причиной вознлннозеяпп пспхолг.тслсгЕчес:сп: а сггао-еск:-::-: отклонений деятельности высших отделов EEC.

Установлена зелу^зл роль цятохро** '?-450-зазгсл.\!ых моноокся-эназнкх систем з биосинтезе стероидов. 3 ^ктохоядраях'кори адпсчечжгков тлеется -по меньшей «ере два типа штохромоз Р-450: зтохром Р—430seo, осуществивший расщепление боковой цепи холэ-герина, г цвтохром р-450ир , которп;; катализирует II? 13-19-гидрсксилирозание хортикостероадоз (7/ilaon Ъ D. et al.,

965; 0капо to et al., 1932).

Реакция расцепления бокозо« цепи холестерина, протекагпая с íacTHe:- ц::то:-рс--.а ?-43С3сс , является одно;; из наиболее зазяых г^ци: стероядогенеза. Зо-перзки, в результате зто;г сеакции пго-1ло~:т синтез продцэстзекника всей стероипнцц госмсноз, цце-^е-

элояа.

таг:

--нал система синтеза прегнеЕолона.

функционирует б митохондриях всех отероидогенных тканей. В тре тьих, именно на этой стадии осуцествляется регулирование процессов . стероидогенеза специфичными тропнши гормонами аденоги-пофиза;. Имеется множество данных, доказывающих, что АКТГ стиму лирует синтез прегненолона из холестерина (Korits S.3.' »Kumar A,lí-, 1970 )- Стимулирование ксртвкотропином Р-450всс-зависшо-го расщепления боковой цепи холестерина в коре надпочечников имеет бифазный характер (Siapson E.'R. et al.',1972 ).• Быстрая фаза проявляется в течение нескольких минут и дане секунд,, медленная фаза - в течение нескольких часов или суток. Последняя сопровождается специфичным увеличением.синтеза се novo компонентов ферментативных систем, ответственных за стероидогенез: цитохромоз Р-450осс и Р-450 А5-3£>-гидроксЕстеронд дегвд-рогеназы изомеразы, электронных переносчиков — адренодоксина и HAEFH-адренсдоксинредуктазы (Siapson E.R.', Waterman К.'Е., 1988).. .

Исследование механизмов стимулирования в быстрой фазе показало, что АКТГ кницирует в митохондриях коры надпочечников последовательность явлений, которые, приводят к перераспределению холестерина и возрастанию его количествам форме, связанной с цитохроиом ?-450soc (Simpson E.'R.' et al., 1978). В обеспечении адхректЕвности стимулирования кортикотропиноы реакций стероидогенеза вахдое места отводится интактности митохондриалъной мем-брани, ее фоефэладвдному составу (Jefcoate С.Н.' et al., 1974, Hall F.F. et al.i 1979), в частности, увеличению синтеза фосфа-тютлинсзнтола, наделенного свойствам" аллсстерического активатора процесса взаимодействия, холестерина с F-45Gscc (Parese л.У. et al. ,1979). АКТГ изменяет лилидный состав фос^олшшдной мембраны в соответствии с кикетиками, сопоставимыми с возмояной медиаторной ролью указанных соединений. Механизм модулирования субстрат-связызарцего центра Р-450асс липидами мембран рассматривается как одир из возможных путей быстрого реагирования .ки-тохондриалького /стероидогенеза на воздействие кортикотропина.

Таким образок, к настоящему времени накоплен большой материал феноменологии быстрого стимулирования стероидогенеза в коре надпочечников .кортикотропином, молекулярные .механизмы развития которого,- пока еще .мало изучены.

Цитохромы Р-450 принадлежат 'классу гем-протеинов, содер;:{а-

-3 -

них з качестве простетической групп прстопорфия IX- S белкам этого класса относятся электронные переносчики дыхательных цепей - цитохромы сив, переносчики кислорода - гемоглобин и миоглобин, . терминальные (ферменты дыхательных. цепей - цятсзрома ат, ач, о. По своим спектральным свойствам цитохромы Р-450 откосятся к группе цитохромоз д, отличаясь от них высоким сродством к кислороду, способностью взаимодействовать с CQ и азто-окисляться,. Цитсхрома Р-450 отличаются от всех гем-протепноз необычно длинноволновым расположением ¡5 -пазссы оптического спектра СО-комплекса восстановленных ферм (полоса Соре- при 45G нм). Это сзойство цитохромов Р-450 определяется тем, что пятым .тигандом гема у них язляется' сера цистейна(shlnizu г., 1983), а не азот гистидина, как у других гемпрстеинов.

Окисленные формы цитохромов Р-450 обычно находятся в состоянии равновесия высоко- а низко-спиновых 'форм, соответстзую-лих спину гемового' железа 5/2 и 1/2. Это равновесие модулируется такими факторами среды, как температура, pH, наличие в среда лшпиоз, детергентов, различных химических соединений, субстра-гоз и их аналогов.

Помимо влияния на спиновое равновесие, связывание субстрата, холестерина, -сильно изменяет такзэ окислительно-восстановл-гэльный потенциал Р-450зос (Light-D.H., Orr.s-Johnson I'.R., IS3I). ;сли стерсцц-сзрбодная, низкоспиновая форма характеризуете^ гстенциалом - 412 мВ, то связывание холестерина.переводят фер-лент в высоко-спиновое состояние с редок с потенциалом - 305 мВ. Считывая, что адренодокскн (Ад), донор электронов для Р-45Сасс, клеет яотенодал - 2S5 :лЗ, -этот сдвиг потенциала р-450scc пра связывании с холестерином приобретает особую значимость: связанный с субстратом фермент восстанавливается эффективнее, чем ¡зободный от субстрата.(^illiams-Smith D.L., Сапжаск R., 1977).

Редокс потенциалы комплексов фермента с субстратом, пводук-^ом и промежуточными метаболита».®, проявляют тенденцию к пезы-:эник в направлении метаболита более высокого лосядка, тем са-** «Чжюиамгюаи предопределяя его преимущество перед дру-'ими.при восстановлении.

Взаимодействие Р-45Сзсс и Ад шао наблздать по а^е^чиз

SSVr^^ П0Л0- характёрнаму « пе-■ з v......-.^- состояние, (Xatagiri И. et al. ,1977)

В Ад-связквакшек центре Р-450зсс бцл идентифицирован остаток лузина (Tsubaki г. et al., 1989), аналогично цитохрому P-450d из печени, в котором Ьуз-453 .участвует в образовании мезмолеку-лярного злзктрокпереносящгго котлплекса с редуктазой фермента (siiiaisu г., i59i). Доказало, что функциональные положения P-45ûecc, ответственные за взаимодействие с Ад, экспонированы не Боднув фазу, а -экспонированные на мембранную фазу гидрофобные участки ответственны за взаимодействие с холестеринои; Несмотря на четкое разделение участков связывания, процессы -озя-Е-хвакпя Ад и холестерина взаимозависимы и проявляют пелонитель-нук кооператйзность: К а связывания Лд возрастает 20-кратно в присутствии насьщазких концентраций холестерина (laaocth j.b. et al., X9SC). 00a субстрата, Ад и-холестерин, демонстрируют одинаковое влияние на Кш реакции гидрокагушроваиия (ц£Г.икс c-iu I." et al., I9SI).

Танин образом, очевидно существование до крайней мере двух контрольных иеханкзмов, препятствующее восстакаалекию фермента в отсутствии гвдроксижруемсго субстрата и.способствующих восстановлению фермент-субстратного комплекса. Это, с одной сторо-нн, сти1зулир>тщип эффект холестерина на реакцию взаимодействия P-450scc с Ад, с другой - повыкение1 рэдонс потенциала фермента, находящегося в комплексе с холе с терпнет,-Эти механизмы вместе способствуют экономии внутриклеточной энергии, поскольку пре-рнваат поток электронов ка пустой, бессубстратный фермент, нре-пятствулт функционированию F-450scc в качестве НАПГК-окездазк и образовании высокореактивных радикалов кислорода, способствующих деструкции как фермента, так и фосфолдппдного бислоя мемб-"раны (Wang К.'-?., l'icura T.', 1976).

Физиологический донор электронов для р-450асс, Ад, в качестве активного центра содержит негемовый гелззо-серный 2î'e-2S мастер. Подоено другим 2Fs-2S ферредоксинам, для восстановления Ад требуется один злектрон-зсткзалент. Ад образует комплексы как с ?-450socf Так к с НАБРН-здрекодоксин редуктазой (АдР). В обои?: случаю: кокплексообразозание зависит от ионной силы и рН среды. Первое условие указывает на преимущественно электростатический характер взаимодействий (Kimura T.' et al., 1972). А характер ■ рК-эавксимостк комплексообразования, видимого спектра и редокс потенциала Ад давали основания для предположения об

учаотпз одного из остатков глстадяна белка з процессах электронного перекоса (Huang j.J.,kl-ura т., 1973). Впсследствил пето^ои зззогееской модификация диэталлярокарбонатсм бито доказано, что именно His-дб но не Kis-IO или Hiз-бг, играет зознуп рслъ б сопрсвогзазосзх восстановление геле2о-сорного кластера конйсрмодиснных изменениях з области заряженных групп глугамата и аспартата, обсазуших домен для взаимодействия Ад с Ад? Л С В-4503ОС (liiura S., Ichite-s У., 1391).

(\нал.сг—ло белкам митохондрий других. стерепдогз'дзпх тканой, Ад? является флавопротеином, содержащим одну молекулу нексва— лзнтпо связавшего <5АД. Подобно известки ЯАДгн- завпсд?«н фавс— пззим скспдоредуктазам, з ее взаимодействии с дсяорои электронов существенны остатки гнетидина л цистеина (Eanukoolu Г. ,C-it-iin-sr ?.). За образование комплекса Ад.с Лд? отзечгзт отрицательно заряженные карбоксильные группы аспартата п глутзиата первого(Gersa L.U., O'Brien ?л, 1934) л лелегкитально заряаен-аая £-аьинэгруша лизана второго (Baaacoto I., IchlSavra Г., 1334). Образованна коьпдекса {Ад Ад?] и знуграхомплекенкй перенос электрона от группы ФАД на 2?o-2S кластер представляет собой звено, лиг,»лтирутхзее скорость электронного транспорта о?- SA2PH на тергяпнадзннЗ ферлект, (Leabeth J.в.', Kanin. н.,197э5пр2допрэдэ— гая эффективность реакций, катализируемых штохромамз Р-450. Сб— разованпе комплекса [АдР Ад] сопровождается конфорглгдпоЕНкмг дзмз— зеняжп в АдР:' рэдуятаза перестраивается э "активную" форму, ^лосебстзуя более быстрому восстановлению Ад (Lambeth J.3,' st al. £930). с другой стороны. Ад? принадлежит ряду дегидрогеназ с '¿-ах'-новой молекулой в активно:.; центре, осуществлявших ключевую ;тадд:о электронного транспорта - трансформацию двухэлектренного ютока от какотинагддгпкуялеокщоз з однезлектроякнй на цито— speis (Kanin н~. st al., 1980). В переключении двух тнпоз электронного транспорта обычно принимаат участие два редокс центра, зервыгл из которых, как правило, является молекула <ЗАД, а зторы:.;-гем, другая флазинсзая молекула или яелезо-серкый кластер,. Б различных случаях два редокс центра могут быть расположены на одной или на двух белковых молекулах, образующих прочный комплекс 1:1.. Зо всех исследованных системах двухцентроЕКЙ комплекс ¡га г.толэкула з процессе редокс цикла фу-цщокирует гдекду 2- а

1-злектрон содержащими состояниями (ЬшпЪе^ .т."б;, Как±п к., 1377). В соответствии сэтим рассматриваемый нами комплекс ¡Адг Ад} в начале каталитического цикла восстанавливается до трен-электронного состояния, затем передает по одному два электрона на цитохромы с или Р-4Г и вновь восстанавливается двумя злеь-тронами ст 1;абрн. в течение всего каталитического цикла полю-го окисления молекулы ©АД не происходит, его сосртоякие меняется между полностью восстановленным, двухэлектронным, и полувос-етановлешгым, так называемым семихинонным, однозлектроянкм. Таким образом, механизм функционирования ФАД в Адр определяется не только оелковой частью редуктазы, по -тшае и образованием комплекса с Ад. Поэтому Екфррмзцзао о роли полипеитидной глобулы АдР и его комплекса в определении характера функционирования ФАД мы считаем ключевой для понимания механизма переключения двухзлектронного потока на одно электронный, осуществляемого фла-зопротеиновкми оксидоредуктаза\п:.

Б то время как кинетические характеристики связывания, взаимодействия и переноса электронов мелду тремя партнерами стеро-идгидроксилирующей ферментативной системы считаются хороао изученными и описанными, структурная основа этих процессов остается исследованной недостаточно. Очень мало имеется информации о структурных и энергетических факторах, контролируюсь внутримолекулярные и внутрикомплексные процессы переноса электрона в многоцентровых редокс системах. В частности, нет четкого пред- . ставленкя о внутримолекулярном механизме, по которому связывание холестерина с Р-450зсс модулирует его Ад связывающий центр и контролирует процесс восстановления фермента. Ке исследованы конформационные изменения в АдР, сопровождающие образование его комплекса с Ад, ■ пути внутримолекулярного переноса электрона в АдР от Кабрн -связывающего цзнтра к Ад-связывающему центру, не раскрыты молекулярные основы механизма трансформации двухэлек-тронного потока от яабрн • на флавопротеин в одноэлектронный поток от комплекса fAдP Ад]на цитохромы Р-450. Усилия в направлении выяснения этих вопросов могут стать решающими в понимании природы механизмов регулирования скоростей и эффективности жизненно важных реакций митохендриального стероидогенсза.

Цель к задачи исследования. Исходя из вышесказанного мы поставили перед собой цель исследовать молекулярные основы взак-

мозействкя к юункпионирования трех компонентов ферментативной систеш. В зтой связи предполагалось исследовать:

1. аминокислотный состав центров связывания Ад и холестерина на нитохроие F-450 seo и структурные особенности, воздейст-вуюглие на лигандкое окружение гемовой простетической группы;

2. механизм взаимодействия Ад с партнерам! ферментативной системы и с соединениями, меделиоташкли внутриклеточные (внутри— китохондриальные) молекулярные структуры;

3. молекулярную основу образования комплекса |дР Ад, являюще-гсся звено;,i. лимитирующим скорость электронного переноса;

-1. механизм передачи электрона от группы ФАД на группу 2?е-23, прздетавлястего собой пример переключения 2-х электронного потока на одкеэлектронкый, осуществляемого шлазиксвыу.и окендоре-дуктазами одектрснтранспортных цепей.

Научная яоназна работы. Установлено участие первого модл--шинируемого остатка триптофана АдР в переносе электрона от ФАД на Ад. Показано, что внутримолекулярные перегруппировки в АдР, сопровокдастие образование комплекса /Ад? Ад}, приводят к кон.рор-мадии, способствующей переносу энергии от остатка триптофана на ФАд по ^еретербвекому механизм:/. Предложен гипотетическ::;! путь электрона от '¿АД на 2?е-23 кластер с участием остатков Тгр АдР и Туг Ад. Предполагаемый порядок расположения участвующих в перекосе групп объясняет механизм стабилизации кисло-род-устойчпзои семлш-шонкой формы АдР и переключения деавиновы-ми окепдередуктазами дзухзлектронногс потока на одкозлектронный.

Обнаружено разрупап^ее действие на Ад адренолептикоз, со- ' дер:саг;и;-: з структуре пиридиновое кольцо. Выявлено различие чувствительности адреналового и растительных ферредоксиноз к анионным и неионным детергентам, указывавшее на различие их молекулярных свойств. • '

бромсукцинигтид и диэтилппрокарбонат разрушают.'Ад-связы-вагщий центр Р-450зсс и ингибируют взишдействие фермента, с холестерином. Аналогично идентичности АдР- и Р-450 зсс -езя- ' зываащих центров Ад, подобны Ад-связывашие центры. АдР' и.Р-45С.

Практическая ценность. Разработанные методы одновременного выделения и очистки .компонентов дыхательной и стерондегенкод систем электронного-транспорта могут быть использованы пси проведении различных биохимичесгасс исследований прикладного

характера по принципу их активного регулирования извне в направлениях, выгонных для достижения поставленных биологических целей» Впервые обнаружено прямое взаимодействие триптофана и 5Ад в Ад?, как результат образования комплекса |Ад? Ад^ с раскрытием механизма переключения флавзноЕЬ2.п: оксидородуктазали 2-х электронного потока на 1-глектро!пшй.

Обг^ругвЕйз в владельцах опыта:-: эффектов детергент-белкозцх £заплоде1ствпй позволяет по-нозому рассматривать значение глоле-цудяркцц особенностей феррздэкспнов гивотного п растительного прсисиоадгнпя, ответственна: за формирование тс Функциональных раагкий.. Установлен факт дозгруютн компонента стерсидсгсккс" chctsis: парк нсдсочешаповглззд воздействием ингибиторов стгрои-догс-н^са» содгрггпнх с своей структуре пиридиновое кольцо.

ПолуззнЕыа данные пролавааг свет на особенности структура п азажздеДстайй коипонзнтов ферментативной система китоискдрл-альиого сгерсцдсгенега, углубляет подходы г: осглыслэнгэ молокуд-ярпнх солод г.-дгк?рок-травспортнах явлений. Атабания -аэботн, LМатериалы диссертационной работа скли представлены на; симпозиутлз "Структура и Функции активных центров ¿эр-глентоь"» Москва, 1972; 17 Всесоюзной симпозиуме по белкам is лу-пидрлл, Минск» 197?; В Всесесзногл симпозиуме "Структура и биэак-нтетическио превращения лпдгдоз б организме человека к кивоткых Ленинград, 1978; И Закавказской конференции по прмеиекию радиоспектроскопии в хшки, физике и биологии, Ереван, 1972; Вез'ссцз-ногл сшлиоззуке "Мзгнитпай рсзоканс в биологии к медицине", Черноголовка, 1981; I Респуолкканско.*! молодеть: о* конкуренции по бпохитаж, биофизике и молекулярной биологии, Ереван, 1980; Всесоюзном симпозиуме по цитохромак ?-450 "Структура и vpscmz;", Минск, IS82; I Всесоюзном биофизическом съезде, ¡«оскза, 1902; International Conference en the application, of 'Koss'caucr effect Aliaa-Ata, 1983; I Всесоюзной койререкдии по электронному переносу, Вильнюс, 1984; Всесоюзной кон^ерещщл "Дитохрой Р-450 и охрана одрувашей среды", Новосибирск, 1987; 7-th International Conference on Cytcchrone P-450. Biochemistry end Biophysics. U oscovi, 1991.

Структура диссертации. Диссертация наложена в виде научного доклада. ' : .

- 9 - .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ' ОЕСШЗШЕ На Ряс.I представлена схема процедур, лсполь зеванных нами Коса надпочечников

рог!тто1'охочдрралянкй 'ся.отвор

Перфузия iг гомогенизация з буфере. А + 0,25 M сахарозы

.MaToxferocr

ДЗ-32

Адсорбированная фракция

СМ-32 0,2 M фосф.буф. рН 7,4; G-50.

____

[ЦитохтГом'сТ

■Буфер А + 0,3 M КС 1; сулъф.ам. 50-30^; G-50.

¡Адренодсксин^

Одепяатант

.ьуфер А +■ 50 мМ xci; 73, 22 Hltc, 40 сек.

Субмитохонллаальзне-' частица

¡Сулъф.ам» 25-70$; G—Т5; Ад-сесавсза 4В.

,__1_,

¡îiasph—адоенодохеин седуктаза]

Осадок

Г-

дитогром

Р-450

II?

Сулъф.ам.- 0-30/е.

Надссадо^кцЛ раствор

¡Сулъф.&ч. 30-50%i iiïST; Ад-Сефароза 4В.

Буфер Е + 0,5% холат натрия

QgalW

Буфер В + холат натрия

азтехремр—450

эс_д-

Стттесйятант __.__,________

[Смесь Ц2Тохрсмоз|

L~—-_tri____;

iryiep 3 + |хол.нат.1,5;ь.

Ряс. Г. Схема получения кемпенентоз двух электрон-транспсрткыц цепей митохондрий коры надпочечников. Обозначения: Буфер А -10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4 -i- 0,1 кУ ЗДГА; Буфер Б - 50 м'Л "а-фосфатный буфер, рН 7,4 + 0,1 И' КС1 + I м\! ЗДГА + ZŒb глццер:п-; Буфер 3—50 i.ôî ïTa-Ьосфатяый <5у§ер, рН 7,5 +• I мМ ЗЛА; С—50, 0-75 - гель-фильтрация на указанных сефадексах; D3-32, с::.-32 -ионообменная хроматография на ДЗАЗ' и целлюлозах;. Ад-Се,:аРозг 4В - аффинная хроматография на алренодоксяз сефаткззз 4В; ПсГ — фракционирование полиэтилеяглинолеи.

- ю -

для получения в гомогенном состоянии практически всех компонентов двух злектрон-транспортных митохондриадьных систем из одной и той ке порции коры надпочечников: окислительного фосфорилирова-кия и стероидного гадроксилирования (Мардакян С.С. .Налбандян P.M. 1979). В рамку сплошной линией взяты компоненты системы гидрокси-лировакия стероидов, в ращу пукктироной линией - компоненты система окислительного фосфорилирования.

§1. Иосл-здовакие кдЕРН-адренодоксик редухтаэы.

Лтарнзстантнре гатоктяпкотикк. Ад?. Простатическая группа АдР, ФАД, и остатки триптофана белковой молекулы представляют собой естественные внутренние флуоресцентные мотки, которые могут быть успсЕио использованы в исследовании структурно-фунгдиональных взаимодействий в ходе блэктронного транспорта с участием белка. Спектр флуоресценции АдР при комнатной температуре состоит из двуг основных полос, Ряс.2,а: коротковолновой эмиссии с максимума;,; при 331 ем, возбуждаемой при 290 км, принадлежащей остаткам триптофана, и длинноволновой вмкссии с макетном при 525 км, возбуждаемой при 450 .нм, принадлежащей простегической группе белка,' молекуле йАД. Изменение ионной силы среды в пределах концентрации фосфатного буф-эра от 0,01 М до 0,5 М не влияет на параметры флуоресценции. Kai: екдно ез Рис.2,б, в спектре люминесценции АдР при. -155°С наблюдается коротковолновый сдвиг гркзтефановой флуорзсценцип к 324 нм и сужение линии. Наряду с этим появляется полосы фосфоресценции триптофанов с максимумами при 415, 440 и 460 ни, а также сужается полоса эмиссии ФАЛ.

f 60

у 20

f 10

Длина волны, нм

Рис.2. Спектры-лю-[йинесценции. -АдР при комнатной температуре, а, и при температуре -196°С, б. Кривые I и 2 получены при

Авозб.= 295 нм' кривые 3 - при

Авозб.= 450 т'

- II -

Тушение флуоресценция Тг? коннкш (I-, Сз+)и незаряяеиини, (ахрплами^, тушителями происходи? с весьма низккла коэффициентами тушения. Как следует из данных Таблицы I, практически все остатки Тг? в ферменте доступны для акрялзмшга« а йоду а цезпзо л:и:ь 50 и соответственно. Б процессе тушения не наблюдается сдвиг максимума флуоресценции,, т.е. остатки Тгр, ямезшие существенный вклад во флуоресценцию, находятся в идентичном окружении. Удаление ФАД приводит к незначительно^ угеллчониэ

Таблица I

Параметры тушения флуоресценции Тгр в Ад?.

-Препарат Туштель Пасаметр АдР Ало-АдР АдР +• мочевина Тгр

£ * ' ¡1 1С0 100 100 100

Акрил- Кч ,уг1 5,0 8,3 10 •

амид к^.и-1 4,4 6,3 10 оо

•I 2,1 3,0 2,2 11,7

f гт 50 62 70 100

КХ ИГ1 £Т7 ' 5,3 1.5 5,1 1,7 5Д . 3,0 у о 12

-I 0,72 0,8 0,67 4,0

£> & 32 33 83 100

СзС1 к3 ,[ГА 10,7 . 15 4 4

1,22 1,15 2,8 4,5

к0,!Г1нс" -х 0,5 0,55 0,57 Г, 47

коэффициентов тушения и доступности Тгр . Параметры тушения флуоресценции простетической группы приведены в Таблице 2. Интенсивность флуоресценции Тгр и ФАД возрастает с увеличением концентрации мочевины, что указывает на ва-кпость водородных связей в стабилизации, конформалии белка. При этом для флуоресценции Тгр зависимость имеет кооперативный характер, со средней, концентрацией' перехода 6,5 М, а для флуоресценции 5АД зависимость монотонная (Армении А.Г. и сотр. 1554).'

-12- маслица 2

Параметры тушения ФАД свободного и включенного в АдР

Чупителъ КГ CsCl

Параметр г.* Kjj,«"- i: .к"1 BV f,% BV*

Препарат

ФАЛ своб. . 100 30 24 100 0,28 0,28

АдР нативн. юо 5 •3,3 70 0,82 2

. АдР + GuHCl юо 10 '12 40 0,8 5, Г

АдР + мочев. 83 .9,2 24 50 0,36 2,4

_Поскольку спектры поглощения алектрон-доноркых субстратов — 1?аб?н ж каин к спектр емисски тгр в АдР. эффективно перекрываются, (Ркс.3,а), то, при условии достаточно малого расстояния центра связывания субстрата от остатков ^гр белковой молекулы, . глокет клеть место индуктивно-резонансный перенос энергии воз-бртдения от остатков ТгР на динуклеоткды, Используя уравнение . Ферстера, исходя из результатов исследования интенсивности флуоресценции Тгр б присутствии субстратов, ш оиенили усредненное расстояние отостатког 2гр до центра связывания казрн .. Оно оказалось разным 3&-4С А. Следовательно, в АдР с молекулярной кассой 54 кДа центр связывания злектрон-дсношого субстрата находится на достаточно.больатал расстоянии, по крайней мере, от тех остатков Ггр , которые вносят существенный в::лад во фзуо-■ ресценцик при 531 нм,- '

А

0,5 . 0,4 0,2

60

/

ко

V 20

Т/л Р о

5

300 350 (нм)

О ,2 Г/с,

,4 -I

Рис.3, а - перекрывание спектров эмиссии ?гр

(---) и поглощения

J3ADPK (—--),.

б - графики пркзеден-; них зависимостей Штерна Фольмера для: АдР + NADH (I), апо-АдР + '

НАШ (2), АдР +HADPH

(3), апс-АдР. + liADPH

(4), свободный + HADPI3

5

. - 13-

Хиг.отческая модификация АдР ■я-бродоттадтотдом (KBS). В присутствии HBS интенсивность поглощения АдР.при 280 нм падает а при 2S0 и 300-нм - возрастает. Зти изменения отражают превращение Тгр в оксииндольное производное -(spand.e т.Р., witiiop в.,

1967). Из падения поглощения при 280 нм оценивают'число окисленных Тгр на моль белка,' -используя формулу из вышеуказанной работы: ■ n = If3I 6 280 ДА2до / 5500 А2ао

где ^280 и ^230' C00T3l3TCTseKf!0> молярная ^зкстинкция и начальное поглощение исследуемого белка при 280 нм, AA^rq ~ изменение поглощения в присутствии HBS с учетом разбавления: при вяесеша раствора реагента, 1,31 - эмпяричеокий фактор,- учитызахзонй поглощение окспиндола при 280 нм, . 5500 молярная- энстишшия Тгр при 280 нм. ' '

Обработку NBS 1,ы проводили при-двух условиях - при денатурации белка в ацетатном буфере, рЕ 4,5, содержащем 6 М мочевины, и в условиях сохранения активности АдР в 10 мМ -фосфатном-буфере, pH 7,4, без мочевины.'3 наших, опытах в■ первом случае окислялось около ГО остатков -irp на моль белка. Это число согласуется с известнкл из литературы- количеством Тгр в. АдР,. ГГ. В условиях сохранения активности модификации подвергалось 3 остатка Тгр на моль белка. Обработка приводила к полному, и необратимому тушению триптофановой фшуоресценции АдР, -которая ие восстанавливалась при удалении реагента с использованием процедур диализа или.гель-фильтрации. В-то же зреет, ни спектр поглолгения, ни флуоресценция >МД под'.воздействием KBS -не-изменялись.- Поскольку связывание • флазиковых -кофакторов с белками сопровождается падением квантового выхода- флуоресценции, в случае отрыва ФАД от АдР з присутствии 1135 следовало, бы ожидать увеличения интенсивности флуоресценции при'525 нм,' а-при диализе - падения интенсивности как флуоресценции, так и. поглощения ФАД. Стабильность этих спектров з процессе проведенных обработок" свидетельствует о то"..'., --то модификация не' призодила к отрыву простети-ческой группа от белкозой молекулы..

. Сравнение спектроз кругового дихроизма натизного и обработанных II3S препаратов АдР в области оптической активности пептидных связей,- 2СС-250-нм, позволили.'хсключить наличие '

конформапионных изменений вследствие примененной озраоэткк (Саркисова Е.Г., Марданян С.С., 1987).

З-тдиепуость электпон яетеяосяаей активности от мотатДй-кади-?. Зависимость активности Ад? от числа мсда^ицировакных остатков Тгр была оценена в опытах с вспольгозанием различных акцепторов» Физиологический акцептор, /л, был использован в реакции восстановления питохрзма £ частично реконструированной пе-гзю переноса электронов системы стероидного гидроксилираз&ния.

Рис. 4, а. Зависимость-электрон переносящей активности АдР от числа моди^ящированных б реакциях восстановления: цитохрома с в-присутствии комплекса [{их? Ад} (I); ДХЙЙ> в присутствии только

АдР (-----) п комплекса [АдР Ад] (-) (2); ферридаанида калия в

присутствии только Ад? (3). Кривые (-о-о-) получены при щз -обработке АдР при наличии в среде Ад.

б. Определение члсла остатков Тгр , существенных для активности АдР. Кривые построены при 1=1 (•). 2 (ч), 3 (*), для каМРн -цатохром о редунтазной активности комплекса [АлР Ад] (1);каЬРН -ДХШ> редуктаэной активности АдР (2) и комплекса [АдР Ад! (3).

- 15 - _

рсксилпрсзання: hadfh Ал? -2— Ад цит.с . 15з модельных акпепторсз ферркцнанид калия восстанавливался только Ад?, а дихлорфенолиндофенол { ДХФИЗ ) восстанавливался гсак непосредственно Ад?, таге и когякексом &д? Ад' .

На Рис.4,а приведены грабила зависимости остаточной активности Ад?* мода&карезанко« ' ззз, в процентах от активности дативной Ад? з случае трех использованных акцепторов. В условиях нагих опытов з отсутствия Ад или АдР зосстанозленпе аптсхроиа £ не происходят. Скорость восстановления фэррипнаняда или ЛЖШЗ з отсутствии Ад? составляла менее от скорости восстановления в ззисутствиз нативной Ад?» скетрапеляция начальных наклонов гра-С'лксв на ось абсцисс позволяет оценить число -гр з Ад?, судест-зеккых для изучаемой реакции. Для реакции с растлен Ад это чзс-;о близко к I. а в реакциях восстановления без участия Ад оно пользе: 1,5 для- восстановления ДХ5И5 и 2 - для феррицпгяида калия.

Для более точной оценки числа каталитически остатков

г? был применен метод Тзсм, как описано в работе oiarka а., 1937). Построенные на основе этого метода графика кнактиваддн д? приведены на Рис.4,б. Зависимости остаточной активности, а , степени 1/1 построены для значений i, (числа сугястаэккс: для ктпвнеотп остатков), равных 1,2 и 3, Как видно- аз ссукка, графики выптаггляются при i равно:.* I з рзздаях с учас-Ад и 2 - в реакции восстановления Е0И5 а отсутствии Ад. избирательность модификации остатков "г? д л\гр при обга-ту?1:. ;t3s- является реагентом, достаточно избирательно ¡ачмодейстзуюаим с остатками тгр в бзлках, Показателем моди-; калии аминокислоты одного типа язд^штоя линейность зависимос-падения поглощзякя при 230 ям о? «ояавнграшт реагента (заг-asax'a y.g. et а1.\ г990), Osimo, при нейтральный pH не кончается возможность его ззжедйгм';зкя с тирозином , цистеинсм ар. Позтот.гу з модифицированной препаратах Ад? мк кентролироза-такнэ содержание некоторых других аминокислот. Для оценки числа тирезиноз был использован метод, разработки edel hoch н;, (1967). Как видно из Рис.5, кривые i и-2 слоняется ст параллельности оси абсцисс ( уменьшение числа гг ) при молярном отношении звз н белку больше 40. лктив^—ь 1 в реакции восстановления цитохрома с оказывается' гагаб^сж" ' 733 a?:: с-тогсу отногекия 15-20. Следовательно \.0ди-

Тууддр

SO .50 ras/AsP

Тис.5. Графики зависимости числа остатков Туг в АдР от соотношения iras/ АдР, оцененного по разности поглощений А295 - AgI5

и А300 - %5 в результате повышения

рН до 12,5. Для сравнения приведен такке. график для Тгр - (3).

¡рияаиия тирозинов не может быть, причиной дезактивации АдР. Ранее японскими учеными было показано участие остатка- лизана АдР в ее взаимодействии с Ад (Hamanoto Icftiîfev/a У,', 1984), поэтому нам вакко было убедиться в. интаятнббти этой ашшокислоты. Мы следили за количеством лизина'по взаимодействию со специфичны;.® для него реагентами: пиридаксаль-5 -фосфатом' (Р-5" -Р) и орто-фталь-айьДёгйДОМ' (о-РА). В' нативноы и. обработанных в различной степени йрёпарйТйХ АдР не. отмечалось расхождений в характере погло-ЩШШГ й£й325 в присутствии P-S" -Р, что указывает на постоянство аданных групп. Во всех препаратах изменение этого пбГйбЩбййй соответствовало двум остаткам Lys, что совпадает с опенкбЕ ЧИйяа реагирующих с; Р-5 -Р лизинов у. вышеуказанных, авто?-' ров. ' АяШйикно этому результату наблюдается.параллельность

: . '.Таблица 3.

. Влияние блокирования SH. . групп на RBS -обработку АдР

Реагент - -

Остаточная активность (в % от исходной)

Число восста-■ Еазяшгае&зых датистреотолом .gH-irpjim'. (ноль/моль АдР)

Активность после восстановления групп от исходной)

-г

"ЯЗЖ6 + KBS

57 35,5

: 4 •

,0 2 2.

5? 62 ,4

зависимостей интенсивности флуоресценции'.компле:кса АдР к о-РА от концентрации.белка в.нативнои и модифицированном состояниях,

:о также свидетельствует о постоянстве числа остатков лизина

зи модификации АдР.-

Данные Таблиыц 3 показывают, что эк-группы, играющие су-ютвеннуи роль з процессе восстановления АдР а расположенные

ИА.ВРН - связывающем центре белка, з налет: опытах не явдяэт-; причиной дезактивации АдР.

Влияние Ад на инактивацию. Ад? реагентами, цодййяшрлзугшш

нвэ- титрование АдР я присутствии зквзмолярнсй кон— нттзацпи Ад не приводит к кодашкашш Тгр, наблюдаемой по па-нию поглощения при 230 нм, и не подавляет электрок-переносящух тивность Ад? ни в одной из использованных реакций восстановили ( см. Рис.4 и 6).

5 10' /Ад? I 2, часы

.6. Влияние Ад на инактивацию АдР при обработке нвб (.а) и : фстореакции в присутствии ТХЗ (б). Обработки проводились . добавок (•), з присутствии Ад (л), сывороточного альбумина и цитохрома с (а)„ За.электрон-переносящей активностью следа по восстановлении, ютохрома с комплексом [АдР Ад}. С -целью исключения вероятного неспецишического взанмодейст-1ГВЗ с Ад, были проведены опыты в присутствии экзимолярных зентраций сывороточного альбумина и цитохрома с (Рис.6,а)., гих случаях инактивация АдР з реакции с из Б происходила с ле эффективностью, что и в опытах без белковых добавок. ?е говоря, предотвращение инактивации АдР в присутствии Ад хется результатом образования комплекса |Ад? Ад]. 1пя модификации остатков £гр в АдР была применена фстореанция гисутстз;::: трихлорзтанола (ТХЭ), как было описано з работе ,ие J. et а!., (1284)Реакционную смесь, содерт^ащуго бе—

лок к реагент в 10 мМ какодилатном буфере, рН 7,4 облучали в кюзете, помещенной в камеру спектрофлуоркметра,светом при дайне волны 2S0 юл, специфичном для остатков Тгр. За ходом модификации следили по падению интенсивности поглощения при 280 нм. На Рис. 6,6 изображены зависимости активности от времени инкубации. Наличие Ад в облучаемой реакционной смеси предохранял АдР от инактивации.

Тушение Ад шяуореспенпии ^гр в нативной и модифицированной А£р. Взаимодействие с Ад приводит к тушению триптофаноаой флуоресценции АдР на 20-22?. На Рис, 7 приведены зависимости Штерна-Фольмера этого тушения для АдР, модифицированной в различной степени. Изменение наклонов как прямых, так и приведенных зави-

0 1-2 30 ■ 0,5 Ад , мкМ 1/Ад , мк¡Г1

симостей указывает на то, что с ходом модификации АдР уменьшается константа бимолекулярного взаимодействия тушителя, Ад, с флуорофором, Тгр редуктазы. Одновременно в графиках приведенных зависимостей, Рис.. 7,6, возрастают отрезки, отсекаемые от оси ординат. Это отражает уменьшение доли доступных для Ад остатков Тгр. Следовательно, модификации в первую очередь подвергаются остатки Тгр, ответственные за взаимодействие АдР с Ад.

Образование комплекса Ад с модифицированной АдР. Комплексо-

Ркс. 7. Простые, а, и приведенные, б, зависимости Штерна-Фоль-- мера тушения Ад флуоресценции Тгр в АдР, модифицированной при молярных соотношениях

ebs/АдР: о - (.); 5,5 - (л); 8,8 - (*)г

15,7 - (о);: 25,5 -

{<f). Точки перегиба

соответствует эквимо-лярности АдР и Ад.

образование между АдР и Ад сопровождается проявлением дафференцн-ального спектра в видимой области. На Рис.3,а приведены спектры таких комплексов, полученных при смешивании эквимолярных концентраций белков с использованиемАд? в различной степени модификации # На Рис.8,б приведет зависимости дифреренциальных спектров комплекса от концентрации Ад в виде графиков двойных обратных величин. Отсекаемые от оси абсцисс отрезки соответствует Кд вза-жодейстзия АдР л Ад порядка Ю"8 М для нативной и 10"^ М для модифицированных препаратов АдР. Этот результат говорит о том, 1Т0 модификация подавляет отраженное в дифференциальном сдект-:е взаимодействие белков»

Рас.8,а. Дифференциальные спектры комплекса Ад с нативной

(1) я модифицированной

(2) и (3) АдР. Дояцен-трация белков о мкМ. Ддя сравнения приведен спектр АдР (0). б. Графики зависимостей двойных обратных ■ величин интенсивности спектра комплекса от концентрации Ад при использовании натлзнол

л к

(1) и модифицированной

(2) и (3) АдР.

Изменение параметров ''дхаелиса-?'ентен цитохсом с редуктазной закшти. Как ухе говорилось, при модификации Тгр отмечается ■геныпение электрон-переносящей активности АдР во всех трех ре-щяях, катализируемых АдР, в том числе и в реакции восстановлена цитохрома с. Зависимости этой активности от концентрации Ад опытах с нативной и модифицированной з различной степени АдР, вставленные з виде графиков зависимостей двойных обратных ветчин, свидетельствуют об уменьшении 4-мэ.х реакции з результате

длина волны, км

Ад мкМ"*1

г

модификации.

Взаимодействие ФАД и Тгр в АдР, находштзжаг-р-тояпггексе с Ад, На Рис. 9,а, приведены спектры эмиссии АдР и свободного ФАД в видимой области возбуадаемых при 450 и 290 км. Из рисунка видим, что возбуждение в У1—области вызывает слабую эмиссию при 525 им в обеих пробах. На Рис. 9,6, приведены спектры возбуждения- зтой флуоресценции в ультрафиолетовой области.

Рис. 9. а. Спектры эмиссии ФАД свободного (I) Е (3) ж в АдР (2) и (4) при ^возб 450 нм (I) и

(2) и 290 нм

(3) и (4). б. Спектры возбуждения эмиссии при 525 нм в УФ-областп; свободного ФАД

(1), ФАД в'АдР

(2), в АдР + Ад (3). То ке что 3, в присутствии 0,4 И KCl

(4). Концентра. - -. ция простетичес- •

кой группы в препаратах - 1,2 икМ. Ширины щелей ыонохроматоров возбуждения и эмиссии - 6 и 8 нм, соответственно. Интенсивности не корректированы.

Сравнение спектров показывает, что широкий пик свободного ¿АД с максимумом при 280 нм, спектр I, разрешается на два узких пика с максимумами при 2G0 и 290 нм в АдР, спектр 2. При добавлении Ад отмечается увеличение интенсивности коротковолнового пика, спектр 3, а при диссоциации комплекса [АдР Ад) в среде с высокой ионной силой (0,4 М KCl), происходит упшрение пиков и ухуд-

5 00

600

Длина волны, нм

260

300

шение их разрешения, спектр 4. На спектр свободного ФАД добавление Ад не влияет.

Изменения, наблюдаемые в спектре возбуждения ФАД, являются свидетельством воздействия белковой части молекулы Адр на электронное состояние простетической группы, чувствительного к образованию комплекса [АдР Ад? и к ионной силе среды. Для выяснения природы наблэдаемого эфректа мн сравнивали поляризацию эмиссии ФАД в различных препаратах при возбуждении длинами волн 290 и 450 нм. По данным Таблицы 4 в большинстве препаратов эти показатели оказались приблизительно одинаковыми. Исключение составляет комплекс /АдР Ад} , для которого флуоресценция, возбуждаемая, при 290 нм, деполяризована по сравнению с возбуждаемой при 450 нм. Следовательно, с комплексообразованием в возбуждение ФАД вносится вклад от других, групп,' поглощающих при 290 нм. Такт.® группами могут быть остатки триптофана, поскольку спектральные характеристики, а именно, эффективное перекрывание спектра эмиссии триптофанов и спектра возбуждения ЗАД в области 330-340 нзл, бла-годриятны для Ферстеровского безкзлучательного переноса энергии от триптофанов на ФАД.

Таблица 4.

Сравнение поляризации эмиссии ФАД при 525 шл, возбуждаемой при 450 нм - р- и при 290 нм - р2.

Препарат Pj £ Ю% р2 + log Pj/P2»^ ;

I. ФАЛ свободный" " 0,3 | 0,29 96

2. то ке + Ад . 0,3 0,28 93

3. ЗАД в АдР .0,3 ■ 0',27 90

4. то яе + Ад 0,25 0,14 56

5. ФАД в АдР + Ад

+ 0,4 М KCI 0,24 0,21 88

Ранее из интегралов.перекрывания вышеуказанных спектров было оценено критическое расстояние для переноса энергии от тирози-нов и триптофанов на флавины, оказавшееся равным 20 А (в ''Anns J.'a.', Tollin g;, is7i)Следует, однако, заметить, что для переноса энергии, кроме пространственной близости флуорофорсв, трс-

буется такяе определенная ориентация диполей донора и акцептора (Weber О., i960).'

Из Рис. 8,а, видел, что спектр поглощения комплекса ¡АдР Ад) напоминает спектр редуктазы, но несколько уширенный и смещенный в длинноволновую область (спектры О и I). Сходное влияние на спектр поглощения свободных фдазинов оказывали ароматические аминокислоты - тирозин и триптофан (Inoue М.' et al., 1981). а на спектр ФАД в полшгептидной молекуле - триптофан (MacKonzie пл; .»t aiV, 1559)." Иначе говоря, из спектра комплекса (АдР Ад/ узе следует, что комплексообразование сопровождается взаимодействием. мззду ФАД и триптофаном (или тирозином). Спектры 2 и 3

Рис. 8,а, свидетельствуют о подавлении спектра комплекса, если АдР, взаимодействующая с Ад, модифицирована по триптофаном. Мы полагаем на этом основании, что в случае нативной АдР конформа-ционные перегруппировки в результате комплексообразования приводят к взаимодействию ФАД с триптофаном. • 0 таком взаимодействии говорит также вид дифференциального спектра комплекса (АдР АдJ.

Включение ФАД в апобелок при реконструкции голо-АдР приводит к тушении флуоресценции как ФАД, так и триптофанов (Hiwataabi А. et al., X9f6).Тушение эмиссии обоих флуорофоров наблюдается также при образовании комплекса (АдР Ад]. 3 связи с этим авторами был сделан вывод о непосредственной близости Тгр к центрам связывания ФАД и Ад. Строго говоря, имеющихся у авторов данных было недостаточно для такого заключения, поскольку включение ФАД в апобелок и образование комплекса с Ад могут сопровождаться кон-формационными изменениями в окружении обоих флуорофоров, приводящими к возрастания безызлучательного рассеяния энергии возбуждения и к уменьшению интенсивности флуоресценции. Прямым указание« на близость Тгр к центру связывания ФАД могло бы быть наличие Ферстеровского переноса энергии между ними. Однако, на ioo-не падения интенсивности флуоресценции обоих флуорофоров при реконструкции голобелка и при образовании комплекса с Ад, описанного японскими учеными и наблюдаемого в наших опытах (см. Рис. 7) невозможно проследить за переносом энергии по интенсивности '¡¡лу-оресцекции. В то же время известно, что перенос энергии возбуждения сопровождается деполяризацией эмиссии акцептора (Weber с. i960).Блззость значений поляризации эмиссии ФАД при 525 нм, воз-

¿3 -

о уедаемой при 290 и при 450 нм, указывает ка отсутствие переноса зкергии от Тгр на ФАД. Деполяризация эмиссии при 525 ям в комплексе [АдР Ая} , возбуждаемой при 230 нм (Таблица 4, строка 4) и подавление дифференциального спектра комплекса при модификации Тгр (Рис.8, спектры 2 и 3), говорит о появлении взаимодействия тгр и ФАД в АдР, вовлеченной в комплекс с Ад. В исследованиях banbeth JVB.', Kamin Н.', (1979) было установлено, что при полном восстановлении АдР ФДД' получает гидридион (Е~) от пиридиннуклеотпда и протон (Н*) из окружения. Авторы предположили, что источником протона могла бы оыть молекула воды. Учитывая способность Тгр отдавать протон школьного кольца, что было продемонстрировано в реакциях пнтохром-с-персксидазы (Goodin D.B.' et ах.', 1991), в качес'тйе источника протона для ФАД в АдР следует рассматривать тага® расположенную вблизи молекулу Тгр .

В исследованиях с применением методов химической модификации ранее было показано,' что Туг-32 в Ад учаотвует во внутримолекулярном' переносе электрона на 2Fe-25 кластер (Taniguchi т.', Kinrura Т-)-Недавние исследования с применением ЯМР-спектро-скошш показали, что тирозин в восстановленном'Ад смещен по отношению к положению в окисленном белке (Uiura 5. .Ichikavra. У.). За основании этих и полученных каст данных ш считаем, что внутрикомплексный электронный перенос от ФАДредуктазы на 2Fe-2S кластер адренодокскна происходит следущим образом:

-ФАДTrp^^I^-^ZF.-ffl^

С другой стороны, согласно исследованиям, проведенным на зинтетических полипептидах» содеряадих тирозин и триптофан, в зтой паре аминокислот предпочтительны:.! является перенос электрона от тирозина на триптофан (Farragi м. et ai.', 1989). а грименение квантово-хшических методов рассчета к комплексам с гереносомзаряда флавинов и ароматических аминокислот показало, reo первые выступают в качестве акцепторов, а последние - доно-юв электронов (Watanabe Y. et al., 1982). Это согласуется с ■ем фактом, что при смешивании окисленного АдР и восстановленно-'о Ад в эквимолярных количествах происходят быстрый перенос зл--. ктрона от Ад на АдР с образованием окисленного Ад и семихпноя-ой формы АдР. (bambeth J.D., Kamin Н.', 1977).

Из вышесказанного следует, что предлагаемый в качестве рабо-

чей гипотезы порядок расположения групп, принимающих участие во внутрзкомплексном переносе электрона от ФАД на 2Fe-2S кластер, способствует созданию энергетического барьера между редокс центрами АдР и Ад, описанного Light D.R.j Walsh Ch., (1980). для преодоления этого барьера необходимо, повидимому, чтобы дазеку-ла ФАД з процессе каталитического цикла находилась в форме полу-т1,постановленного семютнока» Это обстаятельотво и определяет характер функционирования комплекса [АдР Ад] мезду 3- а 1-электрон содержащими состояниями.

Исследования-, проведанные на ряде других флавин-содеряащих. сксидоредуктаз , осуществляющих переключение двухэлектронного потока на одноэлектронный, свидетельствуют о наличии ароматических аминокислот вблизи молекулы флавина а об их возможном участии в процессах электронного переноса (Nishimoto Y., Shihata 1.,1932рледовательно, описанный механизм создания энергетического барьера, возможно, является обшим для многих случаев внут-р-жишлексного (внутримолекулярного) переноса электрона между двумя редокс центрами, первым из которых является молекула флавина, осуществляющими переключение двухэлектронного потока на одноэлекгронвый..

Такта образом, изучение Феротеровского переноса энергии показало удаленность остатков Тгр.от КАЕРН-связывающего центра АдР; использование методов химической модификации обнаружило участие ?гр во внутримолекулярном-переносе электрона от ФАД па Ад-связызагский центр АдР; из исследования поляризации эмке-, сип ОАД сделан вывод о взаимодействии ФАД к тгр , который подтверждается формой диф.оеренцяального спектра оптического поглощения комплекса [Ад? АД

Предполагается, что это взаимодействие является причиной стабилизации се'охинояяой.форш редуктазы в процессе каталитического цикла, способствует созданию качала дяя вяутрикомплекс-пего переноса электрона с энергетическим барьером медду редокс центрами, обуславливающим такой реяам переключения дзухэлектрок-ного потека на одноэлектрояный, когда электроны поступают на ачиэпгер при одном и том не редокс потенциале.

§ 2. Исследование, адренодоксина.

. Взаимодействие адреналового и растительных ферредоксинов с детергентами. Характер влияния детергентов на Ад сопоставлялся с их воздействием на растительные 2?e-2S ферредоксины (Фд). Были использованы внсокоочищенные препараты Фд из мари, Cheno-podiutf album, кресс-салата, lepldium sativ. шпината, Spinacea oleraoea, сине-зеленых водорослей, Spirulena platensis. Все эти белки схожи с'Ад по своим молекулярным свойствам: наличие 2Ре-2S кластера в активном центре, присоединенного г. белку серными лигандами цистеинов, оптические и ЗПР-спектрк, образование 1 функционально активного прочного'комплекса 1:1 с фяавинсо-деркашим партнером ферментативной - системы, неожиданно низкие для железо-содеряащих редокс центров окислительно-восстановительные потенциалы,, небольшая молекулярная масса, низкая изоэл-ектрическая точка. Кроме того, Ад и Фд демонстрирует способность замещать друг'друга в спедадачных. ферментативных реакциях, проводимых in vitro .(JacquotJ.-P, et el., 2938). Однако,vivo функции этих белков весьма различны: Ад и ряд других гРе-22 ферредоксинов животного и бактериального происхождения являются, оксидазами флавинсодержащнх партнеров, '"КАОТН-ферредокспн редух-таз, в то врекя, как Фд растительного происхождения восстанавливаются фотосвстекой I хлороплнстов и выступают в качестзе редук-таз флавопротениов,'. ферредоксин-HADP* редуктаз. Для объяснения этих различий исследователи' сравнивают структурные характе- . ристики ферредоксинов. Обнаружены -различия в их магнитной воспри шчивости, g-тензоров ЭПР, спектров магнитного кругового дихроизма и.Рамановского рассеяния. При подобии %-Ж-Р спектров, ферредоксинов двух типов в окисленном состоянии, обнаружено различие делокализации электронов' на восстановленных 2Fe-2s кластерах (Skjeldai L. etal., 1991)Влияние детергентов на ферредоксины мы . 'наблюдали по обесцвечиванию характерных максимумов поглощения оптического спектра при 415 нм дня.Ад и при 420 шл, для Фд. линей ность полулогарифмических- графиков, приведенных на Рис. 10, свидс' тельствует о кинетшшх первого-порядка, характеризующихся бимолекулярной природой взаимодействия Детергентов с белками.

В качестве на'тионных,- заряженных разноименно по отнопе^ю к ферредоксина-.!, детергентов были использованы цетилпиридияий 'хлористый, цетилтриметиламконий■ бромистый и- этялт:рцдпкп,Т бсо;ц:стг..';.

Дна первых детергента эффективно обесцвечивали как Ад, так и Фд-н (РисЛО, кривые 2 п 3). Обесцвечиванию обычно- предааствоаа-ло изменение форга» спектров поглощения в еидккой области, свад тегьстзукщэе о внутримолекулярных наярняениях, искалаю'дпх окру-ЗЗПП2 2?е-25 кластера. Применением диализа, гель-фильтрадип ык яоясоймакной хроматографии не удалось освободить препараты от детергентов. Влияние катпояяых детергентов было лесбратпным: попытки реконструировать в обесцвеченных препаратах келзго-сер-пай кластер на дала пологцтелышх. результатов;

гИс.Ю. Обесцвечивание Ад (а} и £д из плаката (б)прп комнаткой тампэратуре в присутствии: I -ns-íía « 2 - цетилпиридикш-хлористого, 3 - шттркмвтилашояяя бромистого, 4 - Тритона Х-ICO, 5 - Дуброла РХ. Концентрация белков, растворенных з 10 -а -фосфатном буфере, рЗ 7,4,-равна 45 мкМ. Концентрация детергентов - 0,5 % (вес/объем).

В качестве анионных детергентов использовали додещшеульфат ндтрия, децгдеульфат натрия, натриевые соли холезой и дезо'кси-холззой кислот. lía Рис. 10 графики I представляют кинетики обесцвечивания Ад и }д в присутствии вз-Яа . Детергент обесцвечивал .Ад зесьма эффективно. Аналогичным образом проязлялссь влиялае Дгцнлсульфата натрия. В то ze время обесцвечивания Фд в присут-анионных детергентов не происходащо.столь эффективно. Э присутствии нлзксмслекуляркых детергентов как катлекных,

- а —

не п анионных, белки не обесцвечивались, по крайней мере, з эченне 20 часов при комнатной температуре.

Из неиотясг детергентов били использованы Лубрат ?Х, Тритсп -100, Тритон Х-505. Твияы 20, 40, 60. Взаимодействие с этими гтергентакн не сопровождалось изменением фориы спектров поглс-2ния. Примечательно, что к воздействию неполных детергентов СД казались более чуэств-гтелыпдги, чем Ад (Его .10, нргпц-з 4 л 5). 2КПМ образен. оказалось, что если Дд элективно обеспзечивает-I однопкэкяо заряЕенпыет, акиош5.г.я детергентами, то кроятся устойчивость г. ггм, значительно более чувствительны зоздей-ккз пегонгах детергентов, по сткосенпв к которым более устой-гз Ал. Объяснение:« этого набящеяяя, возможно, является налл-ге внрог.эпного гпдрофобчсго участка дблизя активного центра и злее кислый характер Фд по сравнению с Ад.

Препараты, полученные з результате обработки ферредоксинсв ;ег.си д&тгргекта?,31, исключая катионнпе, представляли собой соот-этотазлЕТЯй апобелкя. После удаления детергентов из решгвоютоИ леей обесцвеченные препараты имеля злектрохгаретическую педви?:-эсть и спектр. поглезоншг, совпадаицяе с'подвиглостьп и опект-э?л.апобелка, подученного осагде.нзем данного 5д в 55? растворе £7. В них кош) бшго реконструировать гелезо-сернкй кластер по ззработапному ДЛЯ фэрродоксиноз методу(2иЬага 1.,сЧ а1.,1372).

Феррццпанид калия ускорял процесс обесцвечивания Ад и Фд этэпгентами (КдУйаШал 3.3-, еЪ а!.. 1976}. Титрование окислен-эго .Ад ферршдшкЕДом в присутствии детергентов показало, что йесцвечквание белка сопровождается восстановлением воск.® моей феррит-анида. Т.е., при распаде келезо-серного кластера в рисутствки детергентов происходит иеспецифическоз окисление вух атомов лабильной серн мастера и четырех ' 5Н -групп цис-экнов, поддерзылаших структуру кластера. Оказалось, что фер-нцизнид не только ускоряет обесцвечивание детергентами расти-эльннх 5д, ко и обесцвечивает их в отсутствии детергентов. Т. ., железо-серный кластер Фд более подвержен разрушительному содействию окислительных процессов, что подтверждается боль-эй лабильностью Фд яри хранении.

Значение'окислительных процессов в обесцвечивании и разру-бнии'2?е-25 кластера изучено нами с использованием кювет-:.Тун-ерга, снабженной отростком для смешивания реагентов после эва-

куации системы. Инкубация ферредоксинов в присутствии детерге; тов в анаэробных условиях в течение нескольких часов не приводила' к падений интенсивности • поглощения при 415 и-420 нм. При регистрация всего видимого спектра обнаружено зависимое от времени изменение формы' спектров (Рис. II). При контакте с во: духом эти препараты полностью обесцвечивались в течение 4-5 га нут. Трансформированные в анаэробных условиях спектры предстаз 'ляли собой спектп 2Fe~2S кластера, не связанного с белком (ai еrill в.А. et ai., 1978). Трансформация спектра наблвдг

лась также при инкубировании белков с детергентами в концентр! рованном'растворе соли. Поскольку в солевых растворах раствор? мость кислорода понижена, белки обесцвечивались в них только j, некоторой степени, после чего остаточное поглощение трансформв оовалось в спектр не связанного с белком кластера.

Рис.II. Спектры поглощени нативного (--—) и инкубированного в присутствии 0,5$ детергента в течение трех часов в анаэробных условиях (— -) Ад (а) и Фд из кресс-салата (б) Спектры записаны на спектрофотометре Specord UV-

Vis , в кювете Тунберга с дяиной оптического пути I см, при комнатной температуре .

Так-.-", образом, совокупность наблюдаемых процессов взаимодействия Тгррелоксинов с детергента'*;! поззоляет придти к определенному зызоду о механизме разрушения- :хелезо~серного кластера, заключавшемуся в том, что длиннодепочечные детергенты разрыхляют белкозуо молекулу,- создают-в ней напряжения, разрывайте связи'кластера с пептидной частью белка. 'В отсутствии окислителей это прпзодит к высвобождению кластера- без наруления его целостности. Последующий -контакт с воздухом приводит к окисле-

- 29 -

j лабильной серы и быстрому обесцвечиванию белка. При иниу-эовакии смеси белков и детергентов в присутствии кислорода i ферркыианида калия параллельно конформашшнным налркгени-, создаваемы:,! детергентом, происходит окисление лабильной эы и одновременное с высвобождением из белка разрушение ке-зо-серного кластера.

Близость макромолекулярных характеристик растительного и эеналового ферредоксинов проявляется в одинаково эффективном ¡рулении гелезо-сернбго кластера в присутствии положительно жженных, катионных детергентов. Однако,..по. отношению к отдельно заряженным и нейтральным детергентам белки птоявля-различную степень чувствительности, Это указывает на элск-•статически более надежную защищенность-'активных центров рас-■ельных Фд. Еелезо-серный кластер Ад, наоборот, оказывается тупным влиянию анионных детергентов и стабильным в присест-нейтральных детергентов.

Влияние на Ад органических растворителей< При изучении уктуры и свойств окружения яелезо-серного-кластера, елределя-х механизмы взаимодействия с редокс партнера:.® фзрмектатнз-систем, включаюцнх ферредоксины {в нашем случае система мп-зндриального гидроксилироваяия стероидов-), исследователя::;: нанялись различные методы воздействия на ферредоксины. При гении влияния на белки и их активные центры различных хши-Cix факторов - органических растворителей и келезо-хелатиру-с агентов наш показана устойчивость Ад в формашще, дизтил-*е, диэтаноламине, этиленгликоле г в к 20J« водных растворах, räaniän S.S.', Kalbandyan R.lil., 1974).

InosHür.! оказалось влияние на Ад водно-пиркдиноЕых смесей.- Вы-:е концентрации пиридина (>80£, объем:объем) стабилизирсва->елок,в разбавленных по пиридину растворах (<20$3 объем:объ-келезо-серньш кластер быстро разрушался. Скорость обесцве-ичия белкового раствора зависела от температуры и времени пп-щии, а такке от концентрации пиридина. Пиридин эффективно цвечивал также восстановленный Ад, что сопровождалось исчез-■нием сигнала ЕПР.

налогично обесцвечиванию детергентами, продукт обесигеч/лза-пиридилом по спектрам поглощения и электрофорстпческой погости представлял собой адобелок, в котором могло было

=*' СНп

кояструирозать железо-серный кластер с восстановлением ейвк- " трон-переносящэй активности Ад.

Разрушение активного центпя Ад метиоалоном. Метирадон известен как конкурентный ингибитор функции цитохромов Р-450. Химическая структура метирапона, 2-ыетад-1,2-да-3-пирид1широпан-1-он,указывает на то, что это соединение благодаря наличию в мо-

0 СНс, ___ н

* 1

лекуле реактивных атомов азота пиридиновых колец моает обладать металл-хелатирующим свойством, В таком случае логично было следать, что мишенью воздестзия метирапона в ацренокорти- ■ кадь.'гых клетках, кроме цитохромов Р-450, моает быть такие геле— зо-серннй мастер Ад. Действительно, в присутствии 'Метирапона кы наблюдала разрушение железо-серного кластера по обеецзечива-киэ раствора бзлка, исчезновению сигнала ЗПР восстановленного Ад к трансформации спектров ЯГР железа (эффект Месбауэра) (бикаа ауап а.Е. е-ь а!. ,1380) Для применения метода ЯГР к исследованию .Ад, высокоочищенный препарат Ад (оптический индекс А415А278 = 0,8) переводили в адо-форму осаждением в 5% растворе ТХУ, последующей реконструкцией нелезо-серного кластера, используя я-эегзп 5,'?е , вместо природного 5<=ре . На Рис. 12 приведены спектры ЯГ? натизкого и обработанного различными реагентами Ад.

3 Таблице 5 приведена параметры Месбауэровских спектров -химический сдаяг я кзадрупольное расщепление д е^ ► ЯГР-пара-?.:этры двух атомов железа келезр-серного кластера в нативном окисленном белке соответствуют высокоспиновоиу ферри-нелезу со слабо рагличаючпмлся зектроакыми структурами,- Кратковременное воздействие метирапона приводит к уменьшению интенсивности внешне:; паря линий, не влияя на спектр внутренней пары. Сравнение спентроз катпвного и обработанного метирапонш препаратов Ад с.т.гдетелъстзует о взаимодействия реагента сначала с одним из дзух ато:.:оз зелеза в кластере► Дальнейшее инкубирование в тече-н::о 24-х часов при - 5°С ус::лнзает взаимодействие, в результате -.:-гс пзм-ьнлется так.*э электронная структура второго атома аеле-за (спахт? 5).

Зосстакозленпе дптпондтом обработанного метарапоном Ад приво-

-I О . *I

скорость, мл/сек

Параметры спектров присутствии келезо-

Рис. 12. Спектры ЯГ? окисленного Ад при 77К, Сплошные линии изображают результаты компьютерной обработки. Шкала скоростей представлена относительно о7Со, дн-фундированного в медь. Вертикальные линии изображают положение л интенсивность составляющих лорен-аиан. Спектры соответствует кат^з-нсму препарату - 2t и препаратам, занорагенвш сразу после добавления: метирадона - 2, пиридина - 3, о-фенантролпна - 4. Спектр препарата с метиропонсм, дккубпрозанкс-го в течение 24-х часов прп-5°С, представлен кривой 5.

Таблица 5 Мессбаузра (ИГР) окисленного -Ад в -хелатярувдих агентов.

JS спектра и Химический сдвиг Квацрупальное рас-

препара

aeq, мм/се:с

цепленке, F" ,мм/сек ^либка

0,77

1И

0,53,

2г-f О

± 0,01

1 - Ад кат. 0,53j 4 0,492 3

2 - + метн-

рапон 0,50j з 0,77g * J— + пири- -

дин 0,57It3 0,742j4 1 - + о-фен-

антролпн С,52j 3 С,752 4 i - 2 через 24 часа

;ри-5°С 0,54Ij3 0,742j4 0,641>3 0'602,4 ± °'02

0,65j 3 °«6is,4 ± °'05 0,56 - 0 0.61„ . + 0,02

Х*»-1 ¿t ■t

.0,63

I,s

0,60,

2,4

± 0,02

- изомерный сдвиг определен относительно нктропруссида н'.трп.'-

- указаны парк линий по их порядку в спектрах.

дат к спектру низкэмолекулярного соединения зкелеза указывая : удаление атомов железа из белка (?.1агйап1ап э.з. et а1., 1983 Спектры 3 и 4'показывают, что хелатирование двух атомов геле, из активного центра Ад под влиянием пиридина и о-феяавтролин также происходит последовательно.. Зги реагенты более агресив ны, чем метирапон, и их воздействие приводит к более быстрым и глубоким изменениям в спектре Ад.- Изложенные результаты ук зызают на то, что подобно пиридину и о-фенантролшну, адрено-кортикостатический агент* метирапон, способен взаимодейстзо-вать с кзлезо-серным кластером Ад и удалять из его активного центра атомы железа.

Таким образом, исследование влштаия детергентов на Ад и Ф, выявили механизм разрушения активного центра, который заключается з высзобоздении железо-серного кластера из белка всле; стзке конфссмационкых напряжений, производимых детергентами п последующем окислении атомов серы кластера и его распад»

Наблюдаемые различия в чувствительности к детергентам Ад и дд указывают на различия г ггироокруяеянз этих белков в кл< точных структурах обуславливающие функциональные различия от« схоних по физико-химическим свойства?.! гТе-гз ферредоксинов . вотного (и бактериального) происхождения, являющихся оксидаз; ил флазопротеинов, л ферредоксинов растительного происхожден: зыступагдих в роли редуктаз флавопротаинов.-

Обнарузеннкй факт разрушения аелезо-серного кластера в Ад пиридином, о-фенантролином и метирапоноы указывает па то, чт< это звено ферментативной система стероидогенэза,•подобно тер-;.пц-:сдзкому ферменту Р-45С, аодзераано воздействию, притом ра: рудакдего характера; здранолептикоз» содержащих в своей стру; турз пиридиновое кольцо.

•ЗС. Изучение терминального фермента систе:ы мнтохондркалъногс стерокдогенеза, цитохрсш Р-450зсс. Гаяистмсоть от сН равновесия мекцу высоко и нлзкосгпшови;." ст7счн;',-лп1 цитохпсма Р-450„г,. Равновесие ыеаду двумя спино; ми ссстсяжяпл в ?-450ЗСс модулируется связыванием гздрокс; лпруемогэ субстрата (холестерина), донора электронов, Ад, а Т2к.~з 'тзгзгературой, рЫ, содержанием в среде дишадов, детергег

80

о,;

Г

»7

'3SC-420

- 23 -

тов и пр.. Из амплитуды спектральных изменений при 390 к 420 ки, дА( 390-420), оценивается степень высокоспшювости фермента. На Рис.- 13, кривая а, приведена рН-зависимость этого параметра для холестерин-связанного Р-450Есс- Представленный график имеет сигмощшый характер и свидетельствует о роли в этом процессе группы с р!С ?. 7 (Light D.H.',Orae-Johnsón IT .'Д.", 1231). Свободный ст холестерина ?-450оос таккэ подвержен рН-зависпмцм изменениям спинового состояния, ко в меньшей степени, Pro. 12, кривая б.

Рис» 13- Зависимость от рН:: разности поглощения SO ~ „-^"Ч ' при 3S0 к 420 км при спи-

новых переходах (а) холестерин -свободного, (б) хо-лестернн-свясанксго ?-/-i л -7 450вое ; расстояния мзшу крайни:,® кокяопентеж ннз-коепкнового сигнала SHP холе с т ерга-с вя з ан к ого ао р-мента (в); интенсивности флуоресценции при 331 им, // б / (г). Оптические спектры

при указанных рН регистрировали против поглеяенпя образца прс: рН 7,4 на спог.-трофотсметревескшап 1'-2б, 5 концентрация белка 2,7 - ЗЯР-спектры записаны на 7 6 9 рН спектрометре Varían E~í

при микроволновой мокюстк 10 МВатт, микроволновой частоте 9,08 Гц, температуре 77К, концентрации P-450sec 0,12 i.¿í в объеме 0,4 мл. Спектры шуорес-ценцЕи записаны на спектрошлуоркметре «pp-ua, ?ег1с5.п-"1и«г в прямоугольных кюветах со стороной 10 иц, при концентрации белка 0,4 kkí.í. Во всех случаях к раствору фермента в 10 фосфатном буфере рН 7,4 добавляли 1/10 объема I Г.1 -.¿юс^атного

буфера требуемого рН. Результирувщпй рН контролировали с использованием микроячейки рн~*,:етра.

A. á

/

ñ t (* fls

ota

-o,r

- 34 - •

Ннзкоспиновый сигнал 3ÏÏF холестерин-связанного Р-450. представляет собой триплет с g -факторами при 1,91; 2,25; 2,42, Изменение в спиновом состоянии фермента отражаются в изменении интенсивности трпплетного сигнала. Однако, кроме увеличения интенсивности низкоспинового сигнала, при возрастании рН мы наблюдали такке увеличение постоянной сверхтонкого расшепления: ■изменялось расстояние между компонентами. Крайние компоненты с g -факторами 1,91 и 2,42 с повышением рН обратило смещались, соответственно, в положения с g-факторами 1,88 и 2,52. Центральный сигнал при g . = 2,24 при этом не изменял форму или положение и не показывал признаков расшепления. Зависимость смешения крайних компонентов от рН имела сигмоидный характер, подобно 'оптически наблдаемому смещению спинового состояния. На Рис. 13 кривая в представляет собой зависимость от рН суммарного смешения боковых компонентов ЗПР-сигнала, выраженного разностью их g -факторов. Изменение этой величины происходит ^ рй при 7,8, что подтверждает наличке в лкгандном окружении делеза холестерин-связанного Р-450зос группы, протонируемой при нейтральных рН, влияющей на состояние гемового железа.

Спектр фнуоресценцш! р-450зсс представляет собой узкую полосу' эмиссии при 331 ни, озойстЕенную остатка« триптофана в гидрофобном окружении. рН-зависалссть интенсивности этой полосы хгмэет кслоколообразкый характер с максимумом при рН 7,6 (Рис. 13, кр:эая г). Следовательно, группа, протонируеглая при рН 7,67,5 -ответственна такке за конфорпационные изменения, г.сто*чз отрслоэтся на триптофадозсй цяуоресценции белкозой молекулы.

'.'т:: "..'."•рлд'д ?-45Свсс дхэтджкстжаьбоаатст.; dspl Р-450 sco обрабатывали взр по методу, описанному инез E.W., (1977).-Л раствору фермента в 50 фос,ратном буфере, рН 7,4 добавляли а.~п;зсты реагента в абсолютном метаноле, д идентичному раствору в контрольной кювете добавляли равное количество растворителя, "з ди^йрзяцкального спектра по максимутлу поглощения при 240 ям определял:! число модифицированных остатков гистидкна. Реакцию останавливали добавлением имидазола до конечной концентрат-;:! 50 м,:. Хоэфсщкент экстинкшш H -этоксаформилпроизводнсго' гисти-дгна прлнзгалп -разлым 3,2 а.Г^сц"'*. Стабильность этого пика и

бурера в наших жжявчаю вклад

, э-о п^ише вследствие .

[йагг1вэп С .К., Нияез Н.К., 1975).' В спектре поглощения в об-тасти 270—290 го.? в ходе обработки не наблюдалось изменений, сотовые он указывали на модификацию остатков тирозина.

Взаимодействие с субстратами изучали на препаратах Р-450зсс, гнкубированных в присутствии 0,3 и;." Г)ЕР в течение 20 ищут. Гсглосение такого препарата при 240 ям соответствовало модификации приблизительно четырех остатков гистидинз на моль гема. ¡одлилгкаиия ингибкровала способность Р-450все связызать Ад и :олестерип. сто отражено на графиках двойках обратных величин, редставленных ка Рис.14. На этом рисунке взаимодействие фер-епта с субстратами выражено величиной разности поглощений при 90 п 420 км» Эта разность отражает сдвиг состояния гемового се-е.за в более вксокоспиновое при образовании комплекса с субстра-нмл. Обработка ве? приводит к уменьшению Д А(330-420)макс ля взЕЕМодействин фермента с Ад, без изменения константы д::с-сададаи. Такое изменение параметров свидетельствует о разрухе— гш Ад-связызшэщего центра Р-450зос .

с.14. Графики двойных обратных.величин взаимодействия с Ад (а) с холестерином (б) Р-450зос : нативного(1) и обработанного сзр ) и N35 (3). Препараты после обработки реггента-.;л пятнттзтно • збазлены для титрования субстрата!.»:, а - спектре залисыва1::: с пользованием тандешых кювет. Предварительно установлено, эюшиеся в кюветах концентрации реагентов не влпяэт на спектра' ьные и электрон-переносящие свойства Ад. б - нспользозгч .рзег-р холестерина в этаноле, Соот:етствуюилте количества г-тлол^ эсили в контрольную кювету с ферментом.

Обсаботка es? приводит к уменьшению сродства фермента к • холестерину (Рис.146). Этот результат, вместе с изложенными впей особенностями pH-зависимости некоторых макромолекулярных характеристик холестерин-связанного Р-450зсс ¿позывает на важную роль остатков гистидина в процессах фермент-субстратного взаимодействия и в определении свойств холестерин-связанного p-450scc. При зто:.< оти остатки, скорее всего, не расположены в субстрат-связыпаюцем центре фермента,

йпм:ческяя шзцЬвнадия ~т -бис-моукцинтстдом. Обра-

ботку фермента H3S проводили, 'как описано в опыта-: с Ад?, при двух условиях - денатурации и сохранения активности. Титрование холестерин-связанного фермента приводит к уменьшению интенсивности поглощения при 230 км. Число окисленных тгр на моль rer.ia натизнсго белка, зачисленное из величины разности поглощений при 220 нм, равно 4. В процессе обработки спектр цермента в видимой области не изменялся. В спектрах uü-компдексоз восстановленных дитпонитом модифицированных в различной степени препаратов наблю -даэтея умзяькение пика при 450 ни по отношению к поглощения при 420 к.:. Это означает, что модификация тгр переводит Р-450 00tP каакткэлроззнкузв, Р-420 форму. Следовательно, в области пятого, цлетеннозего лигачда гемозого железа в результате проведенной обработки происходят изменения, вл:жоцие ка гем-белковые взадмо-дзйстзпя. Ооработкаязз такае ингибирует взаимодействие P^45Q,oo с холестерином: увеличивается наклон графика двойных обратных величин, возрастает вшетачта диссоциации (Рис. 14, б). Характер наблюдаемых изменений"не'позволяет сделать вывод об участии jr? в связывании холестерина, однако, возможно, что они расположены, го крайней мере, вблизи хояестерия-связнзашего центра, как зто било продемонстрировано для стероид-сзязнзаэдего центра цзгохро-ма F-450^_2j мпкросо:: коры надпочечникоэ,используя :.:етод тушения Флуоресценции акрилалэдон (rarasir.hulu 5., 1991).

'.'з графиков зависимостей дзойных обратных величин, представленных на Pi:c.I4,a следует, что модификация тгр привода? к раз рутению Ад-свягызаюсего центра Р-45СЬоо • Ранее была показана ::г.сн?:гчнссть центров Ад, ответственных за его ззаимсдействие с А.:? и с P-45Cscc {Ахре:л A.A. и сотр., 1£?7). Известно та::::э,

2_Ад-са=сдзаггд:: центрах Дд? (Ha^anoto i., iChika*»a Y..I98A) - Г—i-Csce (Tsubaii :.!. et al.,1989вовлечэны остатки лизина. Зьгдз

(Vi) продемонстрировали 'участие 'Trp во ззалмодеПствки АдР

с Ад. Iis результатов, представленных на Ркс.14,а следует, что

P-450scc заген для'взаимодействия фермента с Ад. Т.е., Ад-связызахспе центры Ад? и P-45Cscc , кроме сстаткои лизина, со-детпат, по крайне мере, есе по одной одинаково;" аминокислоте, "ГР • Интересно сопоставить наличие з этих центрах Тгр с фактов участия едннстсгнксго 2гр бактериального 2Pp-2S .^ергедэк-сппз, путкзоредоксика, s его ззакюдеистзяи как с .¿дзгкн-содер-пу?кД2редоя2кнредз?ктазо.';, так и с гидроксидирустя: к&'йару цитсхромом Р-450оак, (Stayton P.S., Sligar 5.1., 1991).

Представленные результаты показывают, что обработка :лзз и В2Р разрушает Ад-связызата:^ цэптр P-450scc и икгпбирует гза:::.:о де.';стл.™е фермента с холестерином. Аналогично подобию центров сел зывания АдР и Р-45Сзсо на Ад, оказываются подобны:,::; таклсе Дд-связываюпще центра АдР и P-45Csoc.

ВЫВОДЫ

Г. Один из трех модифицируемых K3S остатков Тгр з АдР принимает участие во внутримолекулярном перекосе электрона от *АЦ на Ад-связывающкй центр.

2. Поляризация флуоресценции ФАЛ. свидетельствует о переносе энер -гкп возбуждения от Тгр на ^АД по Фсрстеровскому механизму, если АдР находится в комплексе с Ад. О взаимодействии и Тгр свидетельствует также дифференциальный спектр оптического поглощения комплекса [Ад? Ад) ,

3. Предложена гипотеза о зиутрикокпяексном пути электрона от ЗАД 'лР на группу 2?«-2S Ад с участием Тг? и Туг .Взаимодействие [угзеиновых редокс центров с ароматическими аминокислота1."! предлагается з качестве механизма трачсформаций^ухэлектрснного потока'на одноэлектрокныл с участие:.: фдагкнозых'схсидоредуг.таэ.

1. Изучение Ферстерсвского переноса энергии позволило оценить усредненное расстояние остатков ~~р от 2?А2?н -сзязиз&чцего гентра АдР в 35-40 А. /

j. Выявлен механизм разрушения активного центра 2Ря-аз ферре-¡окскнов в присутствии детергентов. Определена роль окислителе;: I этом процессе.

>- Обнаружено различие чувствительности адреналозого :: растлтель :ых ферредоксиноз к отрицательно заряженным и незаряженным детер 'ентам.

7. Установлен факт разрушения железо-серного кластера Ад мети-рапояом, пиридином и о-^енантролином. Показана подверженность этого звена ферментативной системы стероидогенеза поврекдашдн-му действию адренолептиков, содержащее в своей структуре пиридиновое звено.

8. Обработка iras и dbp разрушает Ад-связывающий центр цитох-рома Р-450зсс и ингибирует взаимодействие фермента с холестерином.

S. Продемонстрированное■в работе участие 7гр АдР.и P-450scc в их взаимодействия с Ад указывает на подобие Ад-связываицкх центров зтих компонентов системы стероидогенеза, аналогично подобна АдР- и Р-450зсс, -связывавших центров Ад. 10. Значение Тгр в функционировании системы стероидогенеза является ецэ одни:.: фактом общности структур гидроксилазных ферментативннх систем бактериальной* и митохондриальной природы.

Список использованных соксадений Р—450sec -цитсхро:.: Р-450, осу-естзлшдай трехступенчатое гидрок садарозгяие и рЪ^еиление боковой цепи холестерина с образование прэгненолона.

Ад - адренодокскн, электрон-цереносядай компонент ферментатпвно сгстемы митсхондриального стероидогенеза в коре надпочечников, класса ' 2?e-2S ферредокскнов,

АдР - -КА2РН -адренодоксия редуктаза, электрон-переносящий компонент систем стероидогенеза митохондрий коры надпочечников, сояер-а-'п:. з .качестве активного центра ипазинаденияд-гнуалеот:«;. Ъ - ¿=ГГзлокскны нз растений, содеркадне з активном центре 2?е-23 кластер.

— ш:? тилпг'тсу.орбонат. ;;bs - î: -бр0мсукп:!нн:::;д. с-?А - орто^тальзльдегид. Т."? - тр^слсрзтзяол. ?-5*-Р - ппридоксаль- о*-легат. сП? - метод с-ле:-:тгон:-:ого парамагнитного сезояанса. ЯГ? - метод ядерного r?-.z:a рэзозаяса (зф^ект Иессбауэоа). -w - ":етол япернсгс и^гнитнего резонанса. '.I' - дшсг.оа^0Нолиндэгенсл..

U ir О П Ф nh IT

tTilll(b[l(ll{UlirUbpe Ц br^ílfl ifjlínnpnVuptinLlTUbpnLir UUlbpnfiq-lfiqpnptip-lunAinq îibpJbXimu/mjii| SiuiTui^ujpqf) piuqiuqpiuifiuubpfi ul|wfii| l| ЬЪпрпЪЪЬ-pfi к tjínfjuqqiTuAi Ji:fjia^fiqiTVjpfi ni.Uni.iftiu:u[ipnLi?p

NA BPH -luryiblmqnpufru nbnnt.l{mu!q|i /Uq!>/ II -ppmiurutiyji"^ Jfiqnij ¿кшфп'тГш'и b\j¡Sujpl{t)nq inp{iu¡inníiui\iti ЬрЬр ifUurjapqfiy Jbtin ifi»uW{-gnuiT t шЦт}^ 4b\impnu{ig /»UT1/ r}bu¡[i «urjpbïjnqnpuf^ /Uq/ üuiujnq [{ЬЪирпЪ t^bbmpn^ft ЪЬри'щ Uljm ^ j»p i¡mnmi"ugirui\i[i :

Uq-fi Sbw l(mTü»(_bpu IfaqJb^u Uqft-rn.if -linWinpifiiii;^пЪ ilimjjnjurct-ßjntVubpp "UqumpiiuiT ЬЪ Ърш iíb¿ ÍUT—ji It Trp -{i if njuuiq^ifmVn : rjpuíi.npt(ni.tr t ^тГвцЬри}» rjtiibpb'ljgjiu^ шцЬЬир[1 áiini| It uijq |uJ"ub-fh ^ff*ï'jnpuinbpji libjuuAjfiqifm} qpqmliu'ü t^bpqjiiujh ijin/uuilnjifuiti iunl¡ui jriL^ jnL'hn^ !

ЬЪршг^р^пиГ t, np Uqí>-ji ¿"UT—jig qbujfi 2Fe-2S 1цшитЬр ti.bii-

юрп\ф ifcnjiíui'UgihiAi ujpncbufi fbbpq bin|il{ uipqb^pp ЦшрЬ^ t puigun.-.pb¿ mpjitumnJ'm'li II «фрпс^Ъ шрт/шефЦ imi|i'lmiß[änL'libpji ^шиЪшЦупир juiup : 7рш\фд inuippbp Ь^ЬЦтрпЪ ^nj-juilignq jlP^bpniiJ Ьци^риш-

jjili opufiqwitbr¡nLl(nwa'uhp[i tfumliu!t(gni.ßjiiftfp bpl)si ЫцгрпЪ Vr.upb áltu¡tjin|um.Jp ifЬЦ11 ЬЦopnVjijVfi 1{шрЬ^|) t i(bpuiqpb^ J^uj^'i'Uuijp'h шЦЦЬЪ\г.ппЪ[1 ti upniíu-irjiL; uiiTJt'UujBpni.'ljbpji AnpiaqqtignLß ju¡\jq :

¿ta jtr."liuipbpl(bi t» "P [ГшЦЬр^ЦеиГиЬр^. g Il . ртиш'^шЪ SjnLUi}ufc;>-\ibpfig uAi^ujLiijiu?) 2Fe-2S SbpbqnpuhVuhpfi ¿ L. ршдаив-

ЦшЪ j^figpiu^npriLJ ni.'ljbgnq qbnbpqb'Lii,i'ubp|i 'Ы^пшй'илТр спиgtiphpriLJ" bli 1к1Ци1ПыЦ qqiuj\jn..f! jnt.^: "¡шрошриЛ.^ b[ t $bpbqn[>u|i'u\jbpfi iul(uifii{ ЦЬ\илрпЪ[1 qbuibpqb'üin\ibpm} orajpuijijbinL mpnrjbufi iTb¡juAj[iqirp :

fcnLjg t nP npu(bu qbqiHtffi^nj oqir.uiqnpfc'.j nq Jbvpuiu|n\ipf

mjipjiqli'lifi к o-a-bWütnpnLli-UfT Wieb, puijpuijnLi/ t Ut\—[1 2Pe-2S ЦциитЬрр: ihiriiuipiup Цшппи у([шЬрщ ur u¡|ip}iq¡i'lJ|Jijfi'li oqui'.i ajoipntliui-l(r,q аг1рЬЪп^ buiUi.hlllihpp, pagfi »ДчаппртГ P-450-Ji ijpœ тЪЬушЬ uu(byiiîi{)l{ uiqqbontß jriL\¡[i 9, t{uipnq ЬЪ puijpiujbi Wi ü>bpifbW.um¡ii| luiifuiljupqfi uiju Unifu(n'L'b'Uinp:

к —ppmíuntijiih^h^hic 11 ahtphii:ííiDnM'"ppn-'uuiuip pmjpmjnti/ ьъ P_450soe-[> Uq l^uiiqnq Ijb'liwpn'Un Il рЪЦОпчГ bV ibpiTb^ti^ i¡in¡uwqqb-grn.|3jnLlip ^¡i. ^buinbp[ilifi íbui:

Ibmgtjwb imjjmt'ubpp tjliiajnuT ЬЪ, np Uq-(i tjpui Uqi> !i P- 450 IttiOjnq Ijb'üt.ipnli'ljbpl'' Wfflljni.Eä.jnL'UJiti pmyfi X-Jw'ü b*U 'bull UqlVJi I 3_450sco-ti 1|СШ Uq Циицпц ЦЬЪтрпЪЪЬрр:

С1ШШ РАБОТ, 0ПУШ5К0ВАНЙЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАцИМ I.. Бгшин A.S., Бурбаез Д.Ш., Сарк Т., Царданян С.С. Исследование соединений,. моделирующих комплексы негсмин'ового аелеза, ответственных за сигнал ЗП? при g ср = '2,03. Биофизика, IS72, 17, 179.

2. Варданян С.С,., Налбандян P.M. Влияние денатурирующих агентов на свойства негемпновых келозолроте'инов. Симпозиум "Структура с функции активных центров ферментов". Москва, 1972.

3. Vasin А.Р., l-'erdaniün S.S., ITalbandyan R,M. liitrosyl non-hsera coaplex in der.atursted adrenodoxia. Studia biophysica, 1979, 30, I69-X95.

4. Kardanlaa ,5.S,, Halbaadyan R.M., The deatruction. o? the oiironophoriä group of adrenodoxin in water-pyridine mediu-, Studia biophysica, 1974, 47, 229-233.

5. "ардаяян'С.С., Ездбандян P..M. Кристаллический препарат адрэ-нодоксина - негешяозого яелезосодеряащего белка из коры надпочечников. Еаохкдля, 1975, 40, 43-52»

6- Варданян C.G., Саркисоза 2.Г., Оскпова с.К., Григорян К.А., Налбандгч Р.:.!. Цитохром с из' кора-надпочечников крупного рогатого скота. Биохимия, 1976, 41, 223-227.

7. "ardanian S.S.', Crigorysn "i.A., Sälüandyat: R.M. ?hc effeet of detergsr.tз on "the bovine adrenal fsrreücxln. 3iochem.J., 1976, 153, 725-727.

8. .'.'лрданян С.С., Демин '£.;.:», Налбандян IL Флуоресцентные свойства ферредоксиноз типа з. Биохимия, IS77, 42, IC24-I029.

9. :.'дрданяк С.С., Еолбандян Р.:.;. О субстратно/': специфичности мптсхокдрналъногэ цитохре.на Р-450, 17 Всесоюзны;: симпозиум по белкам и ллпидам. Минск, 1Э77.

10. Лрданян С.С., Погосян Г .Г., Налбадзян ?,:.*.. Реконструкция холс-стергл-расцепляхг.ег система М-нтохсндрий кори надпочечников. III Всосо-ззгй спгпозпу^ по структуре и биссинтег-гчесхим дрезра-данилм дидлдез з организме ннзогкых и человека. Ленинград, 1278.

11. Арменян А.Г., Лрданян С.С.,'ЙалСаддян ?...;. Злиялиз среды на скорость электронного переноса з ренонструзрозанной системе азтехондрдатълего гидрохспллрозакня. Биохимия, '1379, 44,

12. :.;ардачлл- J.C., Нзлбаяднн ?.:,:. Электронные переносч;и-:;; ;д'то-

хондрий коры надпочечников. Терминальные системы. Биохимия, 1979, 44, I203-I2II.

.13. Арменян А.Г., Марданян С. С. ЭГЕР-свойства адренодоксин редук-тазы. II Закавказская конференпия по применению радиоспектроскопии в химии, физике и биологии. Ереван, 1979.

14. Марданян С.С. ,, Гукасян С.Е. Исследование адренального ферре-доксина методом ядерного гамма резонанса, там же.

15. Gukasyan S.Y., Aadriaaov Y.А., Mardanian S.S., Halbandyan H.M., The destruction of the active site of edrenal ferredojcin by metirapone. Biochemical medicine, 1980, 24, 15-20.

16. Арменян А.Г,,Марданян C.C_. Оптические, и шгнитные свойства JTADFH -адренодоксин редуктазы. I Республиканская молодежнач конференция по биохимии, биофизике и молекулярной биологии. Ереван, 1980..

17.. Бахарян А.С., Марданян С,С. Спектры ЭПР цитохрома Р-450 из митохондрий коры надпочечников. II Всесоюзный симпозиум "¡Магнитный резонанс в биологии и.медицине". Черноголовка, 1981.

18. Марданян С.С., Арменян А.Г., Налбандян P.M. Цитохроиы ?-450 и с как терминальные акцепторы электронов в реконструированной системе митохоццриального гидроксилирования. Биохимия, 1932, 47, 784-790.

19. Маданян С.С., Гаспарян В.К., Арменян А.Г., Налбандян P.M. Флуоресцентные свойства адренодоксин редуктазы. Всесоюзный симпозиум по цитохромам Р-450.. Структура и функции. шинск. IS32.

20. Захарян-А.С., Варданян С.С., Налбандян P.Li. Взаимодействие цитохрома Р-45С из митохондрий со стероидам и детергентами. Там же, 54. . ■

21. Гаспарян В.К., Арменян А.Г., Марданян С.С. Тушение флуоресценции адренодоксин редуктазы. I Всесоюзный биофизический,съезд, Москва, 1982.

22. Mardanian S.S., Ilalbandyan Е.М., Gukaeyan S.Y., Reiman S.I., The interaction of adrenodoxin with some inhibitors of adrenal cortex function. Proceedings of the International Conference on Application of Kosabauer effect. Alma-Ata, 1983, I6I5-I6I9.

23. Арменян А.Г., Гаспарян В.К., Марданян С.С., Налбандян ?.'!. Люминесцентные свойства наврн -адренодоксин редуктазы. Биохимия, 1384, 49, I44I—I449..

24. .Марданян С.С., Саркисова Е.Г. Методы естественного и ыгнит-

ного кругового дихроизма в изучении взаимодействия адренодоксй-на и цитохрома F-45Cbcc » I Всесоюзная конференция по электронному переносу. Вильнюс, 1985, 5$.

25. Саркисова Е.Г., Ыарданяа С.С. Зависимость электрон-перено^ сящей активности адренодоксин редуктазы от модификации остатков 'триптофана- Там же, 58. ■

26. Арменян А.Г., Гаспарян В.К., Мардаяян С.С. Локализация остатков триптофана в надрн -адренодоксин редуктазе относительно ITADFH -связывавшего центра» Биохимия, 1987, 52, 1087-1089.

27. Саркисова Е.Г.-, МарданянС.С. Роль, остатков триптофана 17ADPH -адренодоксин редуктазы в образовании комплекса с адре-нодоксшом. Биохимия; 1987, 52, 1253-Д262.

28. Саркисова Е.Г., Марданян,С.С. Модификация остатков трипто— фананАРРЕ -адренодоксин редуктазы, расположенных в центре связывания адренодоксина. Всесоюзная конференция. "Цитохром Р-450

и охрана окружающей среда", Новосибирск, 1987, 76.

29. Марданян G.C., Саркисова Е.Г. Роль остатков триптофана цитохрома Р-450зео в обеспечении нативности его структуры.Там же. 80. Саркисова Е.Г., Марданян С.С., Арутюнян А.в. Роль остатков триптофана в. передаче электрона от адренодоксин редуктазы на адренодоксин- Арм-<5иол» журнал, 1990, 43, 779-783.

31. Sarkissova Y.'G.'.Mardanian S.'S,Haroutunian A.Y.'.Hole of tryp-. tophan residues in. electron transport from SABJE-adrenoftoxin reductase to adrenodoxin. Biochem.'Intern."I990,_2Q, Э77-982..

32.' Mardanian S.'S'.'.SarTdssova Y.'G.'.Theinfluenceof chemical modification by DEP on the substrate interaction of P-450scc.Proc.7-th Int.Conf. "Cytochrome ?-450.Biochem.Biophys.MHoscow,I990,75-77. .33.' Sarkissova Y.G.'.iiardanian S.'S.' The interaction of adrenodoxin and adrenodoxin reductase.- Xbid. Э12-Э14. .

34. :.!арданяи C.C., Григорян Н.А,. Взаимодействие 2Pe-2S ферредок-сизов о детергентами. Арм. биол. журнал, в печати.

25. 'Ларданян С.С. Взаимодействие Р-450 асе, модифицированного hbs и ESP- с адренодоксином и холестерином. Биохимия, в печати.

26.-Варданян С.С., СаркисоваЕ.Г. Взаимодействие ЗАД. ипш^даеда-

на в наерн -адренодоксин .редуктазе, находаша^жЛб'^шлексе о эдренсдоксином. Биофизика, в печати. OJV^//

Подписано в печати X0.I0.94r.

Формат бз«.£0хВ4 I/I6 4,5 пэч.диет.За к. 126 Тираж, 60 Отд.Опер-поляг.Ары.СЖ уя.Теряна 74.