Исследование актин-миозинового мотора в скелетной мышце с помощью рентгеновской дифракции

Кубасова, Наталия Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование актин-миозинового мотора в скелетной мышце с помощью рентгеновской дифракции
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование актин-миозинового мотора в скелетной мышце с помощью рентгеновской дифракции"

005005865 На правах рукописи

Кубасова Наталия Алексеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИН-МИОЗИНОВОГО МОТОРА В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ С ПОМОЩЬЮ РЕНТГЕНОВСКОЙ ДИФРАКЦИИ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора физико-математических наук

1 2 янвт

Москва -2011

005005865

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте механики МГУ имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ Доктор физико-математических наук

А.К. Цатурян

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Доктор физико-математических наук, профессор Доктор физико-математических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

В.В. Смолянинов

А.Н. Тихонов

Д.И. Левицкий

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Специализированного Учёного совета Д. 501.001.96 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, Кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Учёный секретарь Специализированного Учёного совета Д. 501.001.96 доктор биологических наук У/

Защита диссертации состоится

2012 г. в 15-30 на заседании

Автореферат разослан

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из классических и, по-прежнему, актуальных проблем биофизики. Мышца - уникальный орган, преобразующий химическую энергию гидролиза АТФ в механическую работу с недостижимым в искусственных двигателях КПД. Актин-миозиновый молекулярный мотор приводит в движение не только поперечно-полосатые и гладкие мышцы, но и обеспечивает многие другие виды клеточной подвижности. Высокоупорядоченная организация миозиновых моторов в скелетной мышце делает её чрезвычайно удобным объектом для изучения свойств этого мотора.

Современные представления о механизме мышечного сокращения были заложены около пятидесяти лет назад и в настоящее время уже не подвергаются сомнениям. Согласно теории скользящих нитей и мостиковой теории (Н.Е. Huxley, Hanson, 1954; A.F. Huxley, Niedergerke, 1954; A.F. Huxley, 1957; H.E. Huxley, 1969; A.F. Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие глобулярных фрагментов миозиновых молекул, или S1, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами актина, составляющими основу тонких нитей. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, определение атомных структур мономера актина, актиновой нити и миозиновой головки (Holmes и др., 1990, 2004; Rayment и др., 1993; Houdusse и др., 1999, 2000, Oda и др., 2009), многие важные детали механизма работы этого молекулярного мотора остаются неизвестными. По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие силы или укорочения мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу. Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновая головка может переместить актиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995; Simmons и др., 1996; A.F. Huxley, 2000; Kraft и др., 2002; Linari и др., 2007).

является рентгеновская дифракция, с помощью которой можно изучать структуру изолированных мышечных клеток как интактных, так и с частично разрушенной мембраной. Развитие современных источников синхротронного излучения и быстродействующих двумерных детекторов рентгеновских фотонов высокого пространственного разрешения позволило существенно расширить возможности этого метода.

Интерпретация экспериментальных рентгенограмм затрудняется тем, что в двумерной дифракционной картине мышцы не содержится информации о фазе рассеянных рентгеновских лучей, что не позволяет непосредственно определить электронную плотность исследуемых объектов. Распространённый подход к решению таких задач состоит в разработке упрощённых моделей, описывающих лишь один или несколько рефлексов (например, Irving и др., 1992, 2000; Malinchik, Yu, 1995). Сколько-нибудь общих моделей, количественно описывающих всю двумерную картину рентгеновской дифракции сокращающейся мышцы, включая интерференционное расщепление миозиновых меридиональных рефлексов, в настоящее время нет. ' Представляется актуальным создание и содержательный параметрический анализ таких моделей, а также разработка на их основе новых методов количественного анализа рентгенограмм.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании структурных изменений в актин-миозиновом моторе, сопровождающих работу скелетной мышцы, с помощью малоугловой рентгеновской дифракции.

При этом были поставлены следующие задачи:

• получить осевые рентгенограммы мышечных волокон лягушки и кролика и оценить по данным интерференционного расщепления миозиновых рефлексов осевое перемещение присоединённой миозиновой головки в ответ на увеличение температуры и растяжение волокон во время активного сокращения и в ригоре;

• исследовать вклад регуляторных белков тонких нитей в двумерную дифракционную картину мышцы в различных физиологических состояниях;

• построить математическую модель рентгенодифракционной картины скелетной мышцы в состоянии ригора и в ходе активного сокращения;

• на основе сопоставления экспериментальных данных и результатов моделирования определить долю и конфигурацию миозиновых моторов, присоединённых к актину и участвующих в поддержании активного напряжения в мышце.

Положения, выносимые на защиту

1. Получены дифракционные рентгенограммы волокон скелетных мышц в различных физиологических состояниях. Предложена модель для количественного анализа структурных изменений в актин-миозиновом моторе во время мышечного сокращения по данным рентгено-дифракционных экспериментов. В результате анализа рентгенограмм определены фундаментальные характеристики молекулярного мотора мышц:

- доля миозиновых головок, присоединённых к актиновым нитям во время активного изометрического сокращения, составляет 40%;

- сила, развиваемая одной миозиновой головкой, составляет около 6 пН.

2. Разработан метод измерения осевых перемещений миозиновых головок в мышце, основанный на анализе интерференционной структуры миозиновых рефлексов на рентгенограмме волокон скелетных мышц и проведены эксперименты по исследованию изменений тонкой структуры этих рефлексов в ответ на различные воздействия. Получены оценки изменения осевого положения центра масс миозиновых головок при растяжении волокон в состоянии ригора.

3. Показано, что предложенная нами новая структурно-кинетическая модель актин-миозинового взаимодействия в мышцах, в которой различным стадиям цикла гидролиза АТФ поставлены в соответствие структурные состояния Б1 и его комплексов с актином, хорошо описывает изменения интенсивности основных рентгеновских рефлексов в изометрически сокращающихся мышечных волокнах.

Научная новизна

■ Впервые получены осевые рентгенограммы одиночной мышечной клетки высокого пространственного разрешения, из которых методом рентгеновской интерферометрии получены количественные оценки осевых перемещений присоединённой к актину миозиновой головки в активном сокращении и в ригоре с точностью до 0,1-0,2 нм.

■ Впервые построена математическая модель интерференционного расщепления миозинового меридионального рентгеновского рефлекса МЗ в активном сокращении и в состоянии ригора.

■ Впервые систематически исследован вклад регуляторных белков тонких нитей в двумерную дифракционную картину мышцы в различных физиологических состояниях.

■ Впервые построены математические модели всей двумерной рентгенодифракционной картины скелетной мышцы в состоянии ригора и в активном сокращении.

■ Впервые получены количественные оценки числа стереоспецифически присоединённых к актину миозиновых головок в активном сокращении

по данным измерения внемеридиональной интенсивности актиновых слоевых линий и прямого моделирования.

Научная и практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе не только сокращения мышц, но и многих других видов биологической подвижности. В результате проведённых исследований выяснены некоторые важные детали работы этого механизма и разработаны новые экспериментальные и теоретические методы, которые могут быть применены и в прикладных исследованиях сокращения скелетных и сердечных мышц. К ним относятся использованные в работе экспериментальные подходы, позволяющие одновременно исследовать механическое поведение мышечных клеток и получать их высококачественные дифракционные рентгенограммы с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные в работе математические модели могут быть использованы для рентгенодифракционных исследований особенностей работы актин-миозинового мотора в скелетных и сердечной мышцах в норме и при патологиях.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 73 публикациях в научных журналах и материалах конференций, из них 18 статей в журналах, входящих в Перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на Всероссийских рабочих совещаниях по биомеханике (Москва - Санкт-Петербург, 1999-2011); на II, III и IV Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004, 2007, 2010); V, VI, VIII, IX, X Всеросийской конференциях по биомеханике (Нижний Новгород, 2000, 2002, 2006, 2008; Саратов, 2010), X Всероссийском съезде по фундаментальным проблемам теоретической и прикладной механики (Нижний Новгород, 2011), XX и XXI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), на XXIV, XXVIII, XXX, XXXII и XXXIII Европейских мышечных конференциях (Флоренция, Италия, 1995; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 2001, 2004, 2007, 2010); VI Международной конференции по проблемам динамики взаимодействия деформируемых сред (Горис, Армения, 2008), Всемирных конгрессах по биомеханике (Мюнхен, 2006; Сингапур, 2010), а также на других научных конференциях и семинарах.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 256 страницах, включая 67 рисунков и 7 таблиц. Диссертация состоит из 8 глав, первая из которых представляет собой обзор литературы. Список цитируемых источников содержит 284 наименования.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1 представляет собой обзор литературы. Изложены современные представления о строении мышцы, механизме мышечного сокращения. Рассмотрены возможности метода малоугловой рентгеновской дифракции на скелетной мышце.

А Саркомер

Б Упаковка нитей в зоне перекрытия

г-диск

¿-диск

зона ' перекрытия

В Спиральная структура белковых нитей

Актин (тонкая нить)

Миозин (толстая нить)

2.75 нм 36 им

-ц*~ ..........

Рис. 1.1. Периодические белковые структуры саркомсра и соответствующие им рефлексы на рентгенограмме скелетной мышцы. На В показаны параметры спиралей актиновых (тонких) и миозиновых (толстых) нитей. Шаг спирали (осевое расстояние между соседними мономерами) актина -2,75 нм и её период (полный повтор) -36 нм, шаг миозиновой спирали 14,5 нм, период -43 нм. Положение главных рефлексов на рентгенограмме показано на схеме Г.

Миофибриллы в скелетной мышце упорядочены настолько хорошо, что упаковка сократительных белков в саркомере близка к кристаллической. Актин, миозин, а также другие белки толстых и тонких нитей порождают богатый набор экваториальных и меридиональных рефлексов и слоевых линий на дифракционной диаграмме. Наиболее яркие рефлексы видны на экваторе - оси детектора, перпендикулярной оси волокна. Рефлексы на меридиане - оси детектора, параллельной оси волокна, - заметно слабее. Слоевые линии - рефлексы в форме линий, параллельных экватору, в целом, ещё менее яркие, чем меридиональные рефлексы. Соответствие между белковыми структурами саркомера и рентгенодифракционной картиной схематически показано на рис. 1.1.

Экваториальные рефлексы отражают регулярную упаковку нитей в плоскости, перпендикулярной оси волокна; меридиональные рефлексы обусловлены периодически повторяющимися структурами вдоль оси. Наиболее яркий меридиональный рефлекс МЗ в 1/14,5 нм'1 соответствует периодичности выхода миозиновых головок со ствола толстой нити, -14,5 нм. Спиральная организация молекул актина и миозина в нитях порождает семейства актиновых и миозиновых слоевых линий на рентгенограмме; появление актин-миозиновых слоевых линий вызвано тем, что распределение присоединённых к тонким нитям миозиновых головок сохраняет-14,5 нм периодичность толстой нити.

Глава 2. Объект и методы исследования

Результаты, вошедшие в диссертацию, были получены в экспериментах на двух типах объектов: одиночных интактных волокнах скелетной мышцы лягушки и одиночных химически демембранизованных волокнах скелетной мышцы кролика.

Экспериментальная установка для рентгенодифракционных экспериментов состояла из следующих основных узлов: экспериментальной термостатируемой камеры, или ячейки; линейного мотора для продольных деформаций мышечного волокна; датчика силы; устройства измерения длины саркомеров; комплекса приборов для задания скачка температуры и измерения его величины; компьютерных плат и программ управления экспериментом и цифровой регистрации сигналов датчиков, а также устройства дистанционного управления положением экспериментальной камеры. Джоулев скачок температуры получали пропусканием высоковольтного импульса переменного тока частотой -40 кГц и длительностью 0,15-1 мс через одиночное мышечное волокно (или пучок волокон), подвешенное во влажном воздухе камеры при температуре ~5 °С Максимальная амплитуда напряжения достигала 5 кВ, что позволяло повышать температуру волокна до 40 °С (ВегэЬЛзку, ТэаШгуап, 1995, 2002).

Эксперименты были выполнены на станции 16.1 источника синхротронного излучения SRS (Daresbury Laboratory, Великобритания) и станции ID02 Европейского источника синхротронного излучения ESRF (Франция). Дифракционные рентгенограммы регистрировали с помощью двухкоординатного детектора. Для анализа рентгеновских данных использовали пакеты программ (BSL, ХОТОКО, XFIT и XFIX), разработанных в Лаборатории Дасбери в рамках программы ССР13, а также программы для персональных компьютеров, работающих под операционной системой Windows: Peakfit (Jandel Scientific; SPSS, Chicago, IL), HV (Dr A. Stewart, Brandeis University, Waltham, MA) и BS. Последняя программа была написана автором (Koubassova, 2003).

Глава 3. Интерференционное расщепление миозинового меридионального рефлекса МЗ в активно сокращающихся интактных волокнах мышцы лягушки

В изометрическом сокращении миозиновый меридиональный рефлекс МЗ расщепляется на два суб-пика. Предложена модель, объясняющая расщепление рефлекса МЗ интерференцией рентгеновских лучей, рассеянных на симметричных половинах саркомера. Показано, что структурные изменения в миозиновых нитях при активации не зависят от длины зоны перекрытия. 3.1. Экспериментальные результаты

Мы регистрировали рентгенограмму интактного волокна скелетной мышцы лягушки в двух состояниях, в покое и на плато изометрического тетануса на источнике ESRF. В меридиональном распределении интенсивностей рефлексов МЗ и Мб видны два или три пика. При активации мышечного волокна осевой профиль Мб почти не менялся, малоугловой пик оставался примерно вдвое выше высокоуглового. Меридиональное распределение интенсивности рефлекса МЗ изменялось существенно. В состоянии покоя большая часть всей интенсивности МЗ находилась в центральном пике в (14,35 нм)'1, а пики, соответствующие периодам 14,15 нм и 14,55 нм, составляли лишь небольшую часть интенсивности МЗ, /мз (Haselgrove 1975; Malinchik, Lednev, 1992). В активном сокращении рефлекс МЗ состоял из двух пиков примерно равной интенсивности с координатами (14,46 hm)'1 и (14,67 нм)"1 в обратном пространстве.

Для изменения длины зоны перекрытия актиновых и миозиновых нитей волокно медленно растягивали в расслабленном состоянии, постепенно увеличивая длину саркомеров. В расслабленном волокне с уменьшением зоны перекрытия /мз падала, а радиальная ширина рефлекса МЗ увеличивалась. В активном сокращении снижение интенсивности МЗ с увеличением длины саркомеров было еще более выраженным, но при этом

его ширина почти не изменялась. Чтобы определить количественную зависимость /мз от длины саркомеров, мы умножали наблюдаемую интенсивность рефлекса на его ширину (Huxley и др., 1982), а также нормировали /мз в активном сокращении на /мз в том же волокне при той же длине саркомеров в расслабленном состоянии. Скорректированное таким образом значение /мз> /МЗп, можно сравнивать в разных волокнах при разных длинах саркомера. Оказалось, что /Мзп линейно убывает при увеличении длины саркомеров от 2,2 мкм до 3,2 мкм, прямо пропорционально длине зоны перекрытия между актиновыми и миозиновыми нитями в саркомере и, следовательно, доле миозиновых головок, которые могут взаимодействовать с актином и развивать силу.

В изометрическом сокращении отношение максимумов высокоуглового и малоуглового пиков интенсивности МЗ слабо зависело от длины саркомеров в интервале 2,0 - 3,2 мкм. Расстояние между двумя максимумами МЗ уменьшалось с увеличением длины саркомеров. Этот эффект был заметнее при более коротких длинах саркомеров, при которых /Мз выше, и, следовательно, измерения осевого положения максимумов в этой области длины зоны перекрытия нитей были более точными. Как будет показано ниже, такое поведение соответствует увеличению интерференционного расстояния между ярусами присоединённых к актину миозиновых головок.

3.2. Математическая модель интерференционного расщепления МЗ

Предполагая, что саркомер симметричен относительно М-линии, интенсивность /( Z) меридионального миозинового рефлекса можно вычислить как квадрат косинус-преобразования Фурье, F(Z), осевой проекции электронной плотности р{£) миозиновых головок: /(Z) = F2(Z), где

>т

F(Z) = 2jcos(2nZz)p(z)dz, (3 !)

z, Z - осевые координаты в физическом и обратном пространствах, соответственно; начало координат физического пространства совпадает с центром саркомера, 1т - половина длины толстой нити. Дополнительные предположения позволяют записать F(Z) и /(Z) в явном виде. Пусть: 1) число миозиновых головок, дающих вклад в рефлекс, и их конфигурация одинаковы в каждом ярусе; 2) расстояние между соседними ярусами, d, постоянно по всей длине толстой нити.

Число ярусов в полусаркомере мышцы лягушки известно, N = А9 (Sjôstrôm, Squire, 1977; Craig, 1977); центры миозиновых решёток в левой и правой половинах толстой нити находятся на расстоянии L = 2b+(N-l)d друг от друга, b — осевое расстояние от центра саркомера до центра масс первого яруса миозиновых головок, или половина длины "голой зоны", примерно

80 нм (Page, Huxley, 1963; Squire, 1981). Величину L будем называть интерференционным расстоянием. Зная F0(Z) = |F0(Z)|exp(/fi(Z)) - одномерное осевое преобразование Фурье яруса головок, можно выписать выражение для интенсивности: /(Z) = F(Z), где

F(Z) = | F0 (Z) I œs(xZ(2b + (N-\)d + (3.2)

' sin (mZ)

Заметим, что если симметрия нарушена и формула (3.1) неприменима, следует пользоваться общими формулами теории дифракции (Вайнштейн, 1963).

В упрощённой модели точечных дифракторов (ТД), пренебрегают распределением электронной плотности внутри яруса и считают её сосредоточенной в центре масс яруса. Тогда

F(Z) = cos(*Z(26 + (tf -\y/))Sm(rjVdZ), (3-3)

sin (ж/Z)

I(Z) = cos (лZL) . .

sm "(naZ)

Если все головки в ярусе имеют одинаковую форму и ориентацию, а также расположены с периодом d, то в формуле (3.2) F0(Z) - преобразование Фурье одной головки. Поскольку характерный поперечный размер миозиновой головки составляет 5 нм, то характерный размер области в которой F0(Z) заметно изменяется, имеет порядок (1/5 нм) = 0,2 нм"1 (Вайнштейн, 1963). В силу этого в интервале Z от 0,065 до 0,073 нм"1, где сосредоточена интенсивность рефлекса МЗ (рис. 3.2), F0(Z) меняется слабо. Поэтому при моделировании одного рефлекса МЗ результаты расчётов по модели одинаковых (3.2) или точечных (3.3) дифракторов совпадают. Среднее положение миозиновой головки при расчёте было таким же, как в работе Dobbie и др. (1998) и сконструировано из модели ригорной головки (Rayment и др., 1993) поворотом домена лёгких цепей на 40° в сторону центра саркомера.

Для анализа экспериментальных данных мы использовали модель точечных дифракторов. Расстояние между соседними ярусами миозиновых головок вычисляли как 1/SM3, где Sm - координата рефлекса МЗ в обратном пространстве, вычисленная как центр масс интенсивности всего рефлекса. Наилучшее приближение к наблюдаемому распределению интенсивности при дифракции на волокнах с длинами саркомеров, соответствующими полному перекрытию актиновых и миозиновых нитей, было достигнуто при длине голой зоны 167,5 нм (b = 83,75 нм).

полное перекрытие

|"ТЧ ЩИ) ТУ

частичное перекрытие

1.........ц^х-щф . щул

Рис. 3.2. Результаты моделирования профиля рефлекса МЗ при разных длинах саркомеров. А и 5: наблюдаемые (сплошные линии) и расчетные (пунктир) распределения интенсивности МЗ в активном сокращении при длинах саркомеров 2,07 и 2,75 мкм соответственно. Данные нормированы на высоту максимального пика в А. Б и /': схема расположения ярусов миозиновых головок при двух разных длинах саркомера. Миозиновые голозки вне зоны перекрытия (показаны серым цветом) находятся в большем беспорядке, чем в зоне перекрытия (показаны чёрным).

При увеличении длины саркомеров растёт и расстояние между центрами дифрагирующих миозиновых решёток (рис. 3.2). При увеличении Ь в модели расстояние между интерференционными максимумами уменьшалось, в соответствии с экспериментальными данными. Несоответствие расчёта и эксперимента при больших длинах саркомеров может быть вызвано увеличивающимся числом отсоединённых головок, вклад которых в МЗ не учитывался моделью. Относительная интенсивность пиков МЗ не зависела от длины саркомеров. И это экспериментальное наблюдение тоже воспроизводится моделью, в которой периодичность ярусов миозиновых головок вдоль ствола толстой нити одинакова и в перекрытой, и в неперекрытой зоне саркомера.

3.3. Обсуждение результатов

Оказалось, что и нормированная интенсивность МЗ, /МЗп, и нормированное активное изометрическое напряжение в волокне имеют одинаковую

0.066 0.068 0.070 0.072

обратная координата, им"1

линейную зависимость от длины саркомеров в интервале 2,2-3,2 мкм, т.е. структурные изменения в миозиновых нитях при активации не зависят от длины зоны перекрытия. И /МЗп, и напряжение пропорциональны длине перекрытия актиновых и миозиновых нитей, следовательно, рефлекс МЗ в изометрическом сокращении обусловлен, главным образом, миозиновыми головками, находящимися в зоне перекрытия. Хотя доля головок, присоединённых к актину, в точности неизвестна, большие изменения /мз в первую миллисекунду после быстрых изменений длины препарата показывают, что основной вклад в МЗ дают именно присоединённые к актину миозиновые головки (Huxley и др., 1983; Irving и др., 1992; Lombardi и др., 1995). Головки, находящиеся вне зоны перекрытия, дают небольшой вклад в интенсивность МЗ в активном сокращении. В отличие от МЗ, интенсивность Мб в активном сокращении почти не зависела от длины саркомеров. Следовательно, значительный вклад в интенсивность Мб дают стволовые участки миозиновых молекул, составляющих основу толстой нити, и расположенные на ней минорные белки, а также, возможно, отсоединённые миозиновые головки.

В процессе мышечного сокращения в миозиновых головках происходят конформационные изменения, которые приводят к движению актиновых нитей к центру саркомера. Интерференционное расщепление интенсивности МЗ может быть инструментом для измерения осевого движения актин-миозиновых моторов. При движении миозиновой головки меняется положение её центра масс, с, и, следовательно, должно меняться интерференционное расстояние L, определяющее соотношение между интенсивностями суб-пиков рефлекса (рис. 3.3).

Чтобы оценить устойчивость модели по отношению к возможным нарушениям симметрии, мы рассмотрели несколько возможных вариантов отклонения положений ярусов миозиновых головок от их идеального расположения в регулярной симметричной дифракционной решётке, рассматриваемой в модели одинаковых дифракторов. При реалистичных искажениях решётки получали изменения R в пределах 5 %. Таким образом, результаты расчётов показали, при достаточном пространственном разрешении рентгенодифракционных данных в меридиональном направлении отношение значений интенсивности в высокоугловом и малоугловом суб-пиках, R, может быть использовано для измерения интерференционного расстояния L, которое, в свою очередь, можно использовать для определения субнанометровых осевых перемещений миозиновых головок.

Рис. 3.3. Схема метода интерферометрии. А. Модель одинаковых дифракторов. Каждый из N ярусов миозиновых головок в полусаркомере представлен эквивалентной миозиновой головкой, расстояние между соседними головками постоянно и равно с!. Расстояние от центра саркомера до первого яруса миозиновых головок обозначено Ь. В этой модели Ь есть сумма двух интервалов - расстояния от центра саркомера до точки соединения головок данного яруса со стволом толстой нити, И, и расстояния от этой точки до центра электронной плотности яруса, с (врезка справа). Б: Движение миозиновой головки изменяет расстояние с. При этом возможны также изменения "голой зоны", поэтому изменение ДЬ, определяющее профиль интерференционного расщепления рефлекса, складывается из Ас и ДА, Дй = ДА + Ас (врезка справа).

Глава 4. Измерение упругих свойств миозиновых молекул в состоянии ригора с помощью дифракционной интерферометрии

Метод интерферометрии был использован нами для изучения структурных изменений миозиновых головок в состоянии ригора при растяжении мышечных волокон. Рентгенограммы были получены при двух уровнях напряжения Т в волокне: "низком", Т < 0,1 Т0 и "высоком" - около 0,5 Т0, где Т0 — напряжение, развиваемое интактным волокном на плато изометрического тетануса. "Высокое" напряжение было достигнуто медленным растяжением ригорного волокна под контролем длины саркомеров. Индексы I, ЬТ и ИТ в этой главе соответствуют следующим состояниям: плато изометрического сокращения, ригор с "низким" и "высоким" напряжением, соответственно.

4.1. Экспериментальные результаты

Изменения интенсивностей миозиновых рефлексов, вызванные медленным вытяжением волокна в ригоре, исследовали на станции 16.1 синхротронного источника SRS с помощью газонаполненного детектора RAPID. Использование этого детектора позволило регистрировать рентгенограммы одного и того же волокна в ригоре при низком и высоком уровнях напряжения. Когда волокна были растянуты так, что развиваемое ими напряжение увеличивалось до 0,45 ± 0,15 Т0 (п = 3; здесь и далее в этой главе М ± SD, среднее ± стандартное отклонение), Im росла на 137±2% от её значения при низком напряжении (рис. 4.1). Увеличение интенсивности происходило без значительных изменений радиальной ширины рефлекса. Похожее увеличение /мз наблюдали и ранее в фазе растяжения при синусоидальных изменениях длины волокна с частотой 3 кГц, приложенных к одиночному ригоризованному волокну (Dobbie и др., 1998), и при медленном вытяжении целых мышц (Takezawa и др., 1999). Это увеличение /мз связывают с чисто упругим изгибом миозиновой головки, или её фрагмента, который ведёт к изменению проекции её электронной плотности на ось волокна. Интенсивность рефлекса М2, 1М2, при вытяжении волокна существенно не изменялась, /мгНТ = 0,97 ± 0,041Ш1Т (рис. 4.1 Б).

Изменения в распределении интенсивностей миозиновых рефлексов с высоким пространственным разрешением исследовали на станции ID02 синхротронного источника ESRF с помощью фосфорных пластин Phosphor Image Plates (Molecular Dynamics). Из-за того, что цикл считывания информации с пластины требует длительного - около 30 мин - времени, зарегистрировать рентгенограммы одного и того же волокна в ригоре при разных уровнях напряжения было невозможно. Поэтому усреднённые распределения интенсивности, полученные для волокон с низким и высоким уровнями напряжения (рис. 4.1 В) были нормированы на интегральную интенсивность М2, на основании результатов, полученных на SRS. После нормировки /мз"7 = 1,27 /M3LT- Вытяжение волокна с уровня низкого напряжения до высокого напряжения изменяло структуру интерференционного профиля МЗ (рис. 4.1 В).

В изометрическом сокращении отношение интенсивности высокоуглового пика к интенсивности малоуглового пика, R, составляло 0,76. Отношение интенсивности рефлекса МЗ в ригоре с низким напряжением, /M3LT, к интенсивности в изометрическом сокращении, /мз'. составляло 0,32 ± 0,14; и = 6). Скорректированное на радиальную ширину рефлекса отношение /мзЬТ//мз' составляло 0,25 ±0,10.

/—

■лм 1/13 1/14

Обратная координата, нм"'

0.066 0.068 0.070 1/нм

Рис. 4.1. Изменения интенсивности меридиональных рефлексов, вызванные растяжением волокна в состянии ригора. А. Характерные изменения длины и напряжения волокна в эксперименте. Внизу бинарной функцией показаны два интервала экспозиции волокна при низком и высоком уровнях напряжения. Б. Осевое распределение интенсивности М2 и МЗ при низком (Ь'Г, полужирная линия) и высоком (НТ, тонкая линия) уровнях напряжения, эксперименты на ЗЯБ. В. Осевые профили МЗ в ригоре с низким и высоким напряжением, эксперименты на ЕБЯР. обозначения те же, что и в Б.

4.2. Структурно-механическая модель

Расщепление осевого профиля рефлекса МЗ в изометрическом сокращении и в ригоре было проанализировано с помощью модели точечных дифракторов. На плато изометрического тетануса Л1 = 0,76 и 5МЗ' = 14,575 нм. Параметры модели, обеспечивающие наилучшее приближение к этим значениям: Ь{= 83,34 нм, 4= 14,573 нм.

В ригоризованных волокнах с низким уровнем напряжения Я1Л = 4,0 и >Яии = 14,444 нм. Эти значения наилучшим образом воспроизводятся при <4т = 14,446 нм и ¿а = 77,98 нм. Мы знаем, что при сравнении состояний активного сокращения и ригора с низким уровнем напряжения, часть

изменения Ь вызвана изменениями в самой толстой нити, АЬ (рис. 3.3), а часть - изменением положения центра масс ярусов миозиновых головок, Дс. Но, поскольку причины изменения периодичности толстой нити при смене состояния волокна ещё не изучены, трудно делать какие-либо оценки изменения И, а следовательно, и оценивать Дс.

Для распределения интенсивности МЗ в растянутых ригоризованных волокнах было характерно наличие одного главного пика, а интенсивность боковых пиков составляла не более 10% центрального, ¿»из™ -14,461 нм. Такое ограничение соответствует интервалу возможных значений Ьш = 79,379,8 нм при 4гг = 5мзет. Следовательно, растяжение волокна в ригоре вело к увеличению Ь на 1,3-1,8 нм. Посмотрим, какой вклад может дать податливость толстой нити. Увеличение 5мз при вытяжении составляло 5мзит/5мз1'т = 14,461/14,446= 1,001, т.е. в предположении линейного распределения деформаций вдоль ствола толстой нити длина голой зоны может измениться только на -0,002x80 нм = 0,16 нм. Следовательно, вклад изменения А в изменение Ь при растяжении ригоризованных волокон мал, и центр масс миозиновых головок должен был сместиться на Дс = 1,2-1,6 нм в направлении г-линии.

Изменения конфигурации миозиновых головок были рассчитаны по модели изгиба "шейки" (БоЬЫе и др., 1998, Кубасова, 1999). Распределение интенсивности МЗ вычисляли по формулам (3.2). Для расчёта /^(2) рассматривали две модели: в первом случае считали, что ярус может быть представлен одной "средней" головкой, во втором - учитывали тот факт, что молекула миозина имеет две головки и, по современным данным, значительная часть миозиновых молекул в ригоре присоединяется к соседним мономерам одной актиновой нити, находящимся на осевом расстоянии 5,46 нм друг от друга. Чтобы учесть профиль рентгеновского луча и функцию пространственного разрешения детектора, мы использовали свёртку расчётной интенсивности с гауссианом, описывающим аппаратную функцию распределения:

6(2) = ехр(-Х2/(2ст2))/(2л 4сг ), (4.1)

где ст - эффективное стандартное отклонение. Качество приближения к экспериментальным данным было наилучшим при ст между 2,2x10'4 нм'1 и 2,39х10"4 нм"1, что соответствует 2,7-2,9 пикселям детектора. Оптимизацию параметров модели для наилучшего приближения экспериментальных данных проводили методом наименьших квадратов с помощью специально написанной программы.

Для модели актин-миозинового мостика с одной характерной головкой поворот миозиновой головки при растяжении составил 14°. Результаты

моделирования двуглавой молекулы миозина, в которой две головки присоединены к соседним мономерам актина, показаны на рис. 4.2. Отметим, что и в этом случае наилучшее совпадение с экспериментальными данными достигалось при повороте пары миозиновых головок на 15°, что соответствует расчётам по модели, учитывающей только одну головку.

4.3. Обсуждение результатов

Описанные выше эксперименты и моделирование их результатов хорошо иллюстрируют достоинства и недостатки метода интерферометрии.

Отношение интенсивностей высокоуглового и малоуглового пиков интенсивности МЗ на плато изометрического тетануса в экспериментах, описанных в данной главе, Л = 0,76, несколько отличалось от величины, полученной в экспериментах, описанных в Главе 3, R = 0,93. Такое изменение соответствует осевому смещению центра масс яруса головок на 0,4 им, что демонстрирует неопределённость в определении конфигурации миозиновых головок в изометрическом сокращении по данным интерферометрии.

Очевидно, что измерений интенсивности одного рефлекса недостаточно, чтобы однозначно судить об изменениях формы головки. Более того, представляется слишком спекулятивным давать какие-либо оценки изменения осевого положения головок при переходе из состояния изометрического сокращения в ригор лишь по интенсивности рефлекса М3„ поскольку имеется много малоизученных факторов, которые могут влиять на форму, положение и общую интенсивность этого рефлекса. Однако для состояния ригора получено достаточно данных о положении S1 на актине, использование которых позволяет рассчитать осевые движения головок с субнанометровой точностью.

Положение миозиновой головки на поверхности актина в состоянии ригора было определено с помощью крио-электронной микроскопии (Rayment и др., 1993). На основании данных, полученных в экспериментах с парамагнитными метками, присоединенными к каталитическим доменам головок (Cooke, 1981), можно полагать, что изменения конфигурации миозиновой головки в ригоре сводятся к изменению положения её шейки. Ранее нами было предложено две модели упругого ответа "шейки" S1 в ригоре на внешнее изменение длины волокна - модель изгиба и модель поворота "шейки" вокруг конвертера (Dobbie и др., 1998; Кубасова, 1999). В этой работе было показано, что наблюдаемые изменения интенсивности МЗ при синусоидальных изменениях длины волокна могут быть одинаково хорошо описаны в рамках обеих моделей. В настоящей работе мы пользовались моделью поворота "шейки". Заметим, что углы поворота S1 при расчётах по "одноглавой" (14°) и "двуглавой" (15°) модели почти совпадают. Приведённые значения обеспечивали лучшее соответствие с 16

экспериментальными данными по оценке методом наименьших квадратов, однако с учётом шума данных, особенно интенсивности МЗ в состоянии ригора с высоким напряжением, удовлетворительное совпадение с экспериментальными данными достигалось в диапазоне углов поворота шейки S1 12-17°, что соответствует смещению центра масс S1 на 0,5 нм.

По расчётам, выполненным по модели точечных дифракторов, при растяжении ригоризованного мышечного волокна до напряжения 0,55 Т0 осевое смещение центра масс миозиновых головок составляло 1,1—1,6 нм. Используя соотношение между смещением каталитического домена и центра масс, можно оценить, что каталитический домен "средней" головки в данных экспериментах сдвигался на 1,4-2,1 нм. Анализ электронных микрофотографий вытянутых волокон летательной мышцы насекомых показывает похожее значение для среднего смещения центра масс поперечного мостика в ригоре - в среднем, 1,6 нм (Liu и др., 2004).

Глава 5. Моделирование двумерной рентгенодифракцнонной картины в состоянии ригора

Для интерпретации рентгенограмм, в особенности рентгенограмм активно сокращающейся мышцы, обычно используют простейшие модели, воспроизводящие один или несколько рефлексов. На наблюдении за единственным рефлексом основан и описанный в предыдущих главах метод интерферометрии. В то же время хотелось бы построить модель для описания полной двумерной дифракционной рентгенограммы сокращающейся мышцы, которая учитывала бы все доступные экспериментальные данные и привлекала бы лишь минимально необходимые гипотезы. Имеются модели рентгенограммы расслабленной мышцы, в которой миозиновые головки не взаимодействуют с актином (Malinchik, Lednev, 1992; Hudson и др, 1997). Известно, что в ригоре, т.е. в отсутствие АТФ, все миозиновые головки сильно и стереоспецифически связаны с актином (Cooke, Franks, 1980), а дифракционная картина скелетной мышцы содержит целый набор ярких слоевых линий, свидетельствующих о хорошей структурной упорядоченности этого состояния. Таким образом, модель актин-миозиновой решётки в ригоре могла бы быть первым шагом для изучения более сложных состояний мышцы. Целью моделирования была разработка надёжных методов количественной интерпретации наблюдаемых изменений на рентгенограмме в терминах изменения структуры актин-миозинового комплекса или актин-миозиновой решётки. 5.1. Структурная модель актин-миозиновой решётки в саркомерах скелетных мышц

В зоне перекрытия актиновые и миозиновые нити образуют гексагональную решётку. В нашей модели актин-миозиновая ячейка содержала 6 актиновых

и 3 миозиновые нити, причём центральная нить имела азимутальную ориентацию, отличную от двух других нитей ячейки. Актиновую нить считали целочисленной спиралью 13/6. Осевое расстояние между ближайшими мономерами в модели актина было принято 2,75 нм. Период правой трёхзаходной спирали миозиновой нити составлял 42,9 нм, так что истинный период актин-миозиновой решётки (осевой размер элементарной ячейки) в модели был 214,5 нм, равный 6 периодам актиновой спирали или 5 периодам миозиновой спирали. Итого в элементарной супер-ячейке модели было 270 миозиновых головок. Мы также считали, что все актиновые нити имеют одинаковую азимутальную ориентацию, радиус толстой нити предполагали равным 7,5 нм, а расстояние между центрами соседних миозиновых нитей, а, было выбрано равным 45,5 нм.

Чтобы присоединиться к тонкой нити, миозиновая головка должна отсоединить свой субфрагмент-2, 82, от ствола миозиновой нити и изогнуть его. Полную упругую энергию связывания миозиновой головки с актином, Е, можно приближённо записать в виде

где kf и кг - трансверсальная и осевая жёсткости поперечного мостика, соответственно, a Ai и Az - соответствующие смещения точки соединения S1-S2 от её "образа" на стволе толстой нити, т.е. места её прилегания к поверхности толстой нити, в условиях, когда весь S2 "прилеплен" к её стволу. Алгоритм выбора удобных актиновых мономеров был устроен таким образом, чтобы минимизировать энергию Е для каждой миозиновой молекулы в ячейке. Разметка актиновых нитей миозиновыми головками, обеспечивающая минимум упругой энергии, зависела от отношения трансверсальной и осевой жёсткостей головки, е = /сДг и, в меньшей степени, от осевого смещения между актиновыми и миозиновыми нитями, z0.

Электронные плотности актинового мономера, S1 и актин-Si комплекса брали из открытой базы данных Brookhaven Protein Database (http://www.pdb.org/; Holmes и др., 1990; Lorenz и др., 1993; Rayment и др., 1993; Mendelson, Morris, 1997) или открытого доступа в интернете (Holmes и др., 2003). Электронную плотность актинового мономера и S1 приближали однородными, но имеющими различную плотность, сферами. В наиболее подробной модели каждую аминокислоту приближали сферой радиуса 0,3 нм, рассеивающая мощность которой пропорциональна числу электронов в аминокислоте.

Мы предполагали, что присоединение миозиновой головки к актину сопровождается упругим изгибом её "шейного" домена по направлению к месту прилегания точки соединения S1-S2 на стволе толстой нити. Чтобы учесть этот изгиб, использовали трёхмерное обобщение нашей ранней 18

(5.1)

модели (Dobbie и др., 1998; Кубасова, 1999), в которой упругий изгиб "шейки" S1 был рассчитан по формулам изгиба защемлённой балки.

Хотя актиновые и миозиновые нити в зоне перекрытия образуют квазикристаллическую гексагональную супер-решётку, эта решётка обычно находится в значительном беспорядке. Такое упругое взаимодействие "между соседями" может быть описано беспорядком второго рода с двумя параметрами: среднеквадратическим отклонением в радиальном, Агт, и осевом, AzT, направлениях центральной миозиновой нити соседней супер-ячейки от её положения при идеальной упаковке (Вайнштейн, 1963). Для актиновых нитей, единственные силы, удерживающие их в узлах решётки -это силы, создаваемые миозиновые головками. Поэтому радиальные и осевые смещения актиновых нитей в большинстве случаев выше, чем миозиновых. Актиновый беспорядок не передаётся от соседа к соседу, а определяется случайным отклонением нити от её "идеального" положения в центре треугольника, образованного толстыми нитями. Поэтому он может быть описан беспорядком первого рода с двумя параметрами: среднеквадратическим отклонением в радиальном, АгА, и осевом, ЛгА, направлениях актиновой нити от её идеального положения в ячейке (Вайнштейн, 1963). Поскольку осевая податливость толстых и тонких нитей мала (Н.Е. Huxley и др., 1994; Wakabayashi и др., 1994), смещением при осевой трансляции ячейки пренебрегали.

Интенсивности слоевых линий вычисляли в области, соответствующей экспериментальной рентгенограмме: |Z|, |/?| < 0,2 им"', где Z и R - осевая (меридиональная) и радиальная (экваториальная) координаты в обратном пространстве. Вычисления слоевых линий проводили в цилиндрических координатах г, ц/, : в физическом (прямом) пространстве, где ось z совпадала с осью центральной миозиновой нити единичной ячейки. Преобразования Фурье каждой актиновой нити с присоединёнными миозиновыми головками были вычислены с использованием сферических моделей актиновых мономеров и миозиновых головок, следуя теории дифракции на цепных молекулах (Вайнштейн, 1963). Затем интенсивности слоевых линий вычисляли как азимутально осреднённый квадрат преобразования Фурье, с учётом беспорядка 1-го и 2-го рода (Вайнштейн, 1963).

Для актиновых нитей Al, А2, ..., соответствующих в нашей модели слоевым линиям с номерами 1 = 6, 12, ... (/ = 6то, m - целое), также были рассчитаны их интенсивности без присоединённых головок, чтобы учесть вклад в дифракционную картину актиновых нитей вне зоны перекрытия. При длине саркомера 2,4 мкм длина неперекрытой зоны актина составляет примерно половину длины зоны перекрытия 385 нм/735 нм = 0,52. Интенсивности слоевых линий актиновых нитей без присоединённых головок прибавляли к их иитенсивностям в зоне перекрытия с весом 0,52.

Поскольку вне зоны перекрытия гексагональная упаковка актиновых нитей становится четырёхугольной (Squire, Harford, 1988), мы предполагали, что рентгеновские лучи, рассеянные различными частями актиновых нитей, не интерферируют.

5.2. Экспериментальные результаты

Эксперименты были выполнены на станции 16.1 SRS Daresbury Laboratory с использованием детектора 'RAPID' (Глава 2). Расстояние от образца до

детектора было 3,25 м, детектор работал в режиме 512x512 пикселей.

Экспериментальная двумерная рентгенограмма была получена на одном пучке из 7 волокон, время экспозиции - 200 с. На дифракционной картине присутствует характерный набор актиновых слоевых линий Al, ..., Al. Эти линии особенно яркие в ригоре из-за того, что миозиновые головки стереоспецифически присоединены к актину и декорируют актиновую спираль. Также видны яркие меридиональные миозиновые рефлексы МЗ и Мб. Осевые положения А5 и Мб очень близки, но А5 находится на 2,5 % дальше от центра рентгенограммы из-за того, отношение периодов актиновой и миозиновой линии не совпадает с 5:6. В наших моделях эта разница не учитывается и 30-я слоевая линия соответствует и А5, и Мб одновременно. Кроме актиновых и миозиновых слоевых линий для состояния ригора характерны две актин-миозиновые слоевые линии AM.i и АМ+| с осевыми положениями (-24 нм)"1 и (-10,4 нм)"1, соответственно (Н.Е. Huxley, Brown, 1967; Bordas и др., 1993; Yagi, 1996). На рис. 5.1 показаны радиальные распределения слоевых линий, полученные из экспериментальных данных и рассчитанные для "лучшей" модели, т.е. модели с набором параметров, обеспечивающим наилучшее приближение к экспериментальным данным. Этот набор был получен из прямого параметрического анализа, не прибегая к глобальной или локальной оптимизации параметров. Влияние различных параметров модели на дифракционную рентгенограмму будет описано ниже.

5.3. Результаты расчётов

В расчётах было исследовано влияние всех параметров модели на распределение интенсивности наиболее ярких слоевых линий. Параметры беспорядка актин-миозиновой решётки определяются радиальным распределением слоевых линий Al и МЗ и соотношением интенсивностей МЗ и Мб. Хорошее приближение к экспериментально наблюдаемому распределению интенсивности Al было получено при Агл = 1 нм, АгЛ=1,5нм, Дгт = 3,5нм, AzT = 4,5 нм (рис. 5.1, "лучшая" модель, тонкая непрерывная линия). Наиболее интересным результатом оказалось то, что в разумном диапазоне значений беспорядка решётки, изменения полной внемеридиональной интенсивности Al, /дь не превышали 2 %.

Хотя в случае "свободного выбора", пары миозиновых головок могли выбрать различные актиновые нити, тем не менее, большинство головок, 5566 %, (крайние значения достигались при е = 0,1 и е= 1, соответственно) "предпочитали" парное присоединение. Для расчёта "лучшей модели" мы взяли случай "вынужденных пар". Параметр е определял функцию разметки нити присоединёнными головками, которая в значительной степени модулируется миозиновой периодичностью.

Увеличение е ведёт к падению интенсивности актин-миозиновых слоевых линий. Заметим, что сумма интенсивностей AI, AM.] и АМ+) меняется не более, чем на 5 % при изменении е от 0,1 до 1 в то время как /А1 падает на 28 %. Таким образом, экспериментально полученное отношение интенсивностией актин-миозиновых слоевых линий к /Ai может быть использовано для определения параметра е. Для случайного распределения присоединённых миозиновых головок суммарная интенсивность AI, AM.i и АМ+1 была на 20 % ниже, чем в расчётах по моделям, основанным на принципе минимума упругой энергии.

Для всех рассмотренных конфигураций миозиновых головок (Rayment и др., 1993; Mendelson, Morris, 1997; Holmes и др., 2003) полная внемеридиональная интенсивность AI менялась не более, чем на 3 %. Даже небольшие изменения формы головки приводили к видимым изменениям радиального распределения интенсивности дальних актиновых слоевых линий. В "лучшей" модели конфигурация актин-миозинового комплекса была такой же, как в модели Holmes и др. (2003). Максимально допустимое смещение шеек миозиновых головок было dmax = 2 нм.

Результаты расчёта двумерной рентгенограммы для "лучшей" модели показаны на рис. 5.1. Мы не проводили дальнейший перебор параметров, который, возможно, улучшил бы приближение к конкретным экспериментальным данным, т.к. целью работы было построение модели и исследование влияния каждого параметра на дифракционную картину.

Для оценки качества приближения к экспериментальным данным использовали квадратичный Ä-фактор, R/.

где Iе и Г - экспериментальная и расчётная интенсивности, соответственно. Для "лучшей" модели Я/=6,9%. Единственная слоевая линия, для которой расчёт сильно отличается от экспериментально наблюдаемой интенсивности, это А2. Без неё Щ уменьшается до 6,4 %.

Учитывая, что приближение данных было достигнуто без специальной оптимизации, его качество представляется нам весьма неплохим. Однако мы

(5.2)

столкнулись с определёнными трудностями при моделировании А2 и дальних актиновых слоевых, Аб и А7. Возможные причины такого несоответствия обсудим ниже. 5.4. Обсуждение результатов

В нашей модели один безразмерный параметр - отношение трансверсалыюй и осевой жёсткости поперечного мостика, е, - полностью определяет, какие актиновые мономеры в единичной ячейке будут заняты миозиновыми головками в состоянии ригора. Несмотря на свою простоту, это правило позволяет воспроизвести некоторые характеристики структуры зоны перекрытия в саркомере мышцы в ригоре.

Принцип минимальной упругой энергии предсказывает появление не только актин-миозиновых слоевых линий, но и изменений интенсивности самих актиновых слоевых линий, вызванных актин-миозиновой модуляцией с периодом ~7,2 нм. Суммарная внемеридиональная интенсивность А1, АМ +1 и АМ -1 оказывается постоянной и не зависит от е.

обратный радиус, нм-1

Рис. 5.1. Интенсивности наиболее ярких слосвых линий, полученные экспериментально (точки) и вычисленные по модели с "лучшим" набором параметров (сплошные линии). Вычисленные интенсивности были шкалированы гак, чтобы обеспечить наилучшее совпадение с экспериментальными данными при минимальном /¿-факторе (см. текст). Интенсивность А1 показана с весом 0,25.

Важный результат моделирования состоит в том, что, как показали наши расчёты, полная внемеридиональная интенсивность слоевой линии А1 не

зависит от беспорядков решётки и определяется только функцией расстановки миозиновых головок на тонких нитях и формы актин-миозинового комплекса.

Хотя "лучшая" модель и обеспечивала неплохое совпадение с экспериментальными данными, для всех расчётных вариантов наблюдали систематическое их отклонение друг от друга, не зависящее от выбора параметров модели. Отношение интенсивностей актиновых слоевых А7 и А6, вычисленное для структур F-актина, предложенных в работах Holmes и др. (1990) и Lorenz и др. (1993), составляет -0,4, в то время как экспериментально наблюдаемое отношение интенсивностей этих слоевых линий в расслабленной мышце кролика не превышает 0,2. Одна из возможных причин такого несоответствия состоит в том, что использованные нами атомные модели не достаточно хорошо описывают структуру F-актина и тонкой нити. Существующие модели актиновой нити построены встраиванием атомной структуры G-актина в карты электронной плотности, полученные по данным рентгеновской дифракции на гелях F-актина, в которых более плотная упаковка нитей может изменять их структуру по сравнению с разреженной упаковкой в мышечных волокнах. Кроме того, в настоящей главе мы не учитывали вклад регуляторных белков в интенсивность дифракции и в размещение миозиновых головок на актине, их влияние будет рассмотрено в Главах 6 и 7.

Несмотря на указанные выше недостатки модели, стоит отметить, что прямое моделирование, основанное на некольких очень простых предположениях, впервые позволило удовлетворительно воспроизвести интенсивности всех главных слоевых линий на рентгенограмме мышцы в ригоре. В результате модельных расчётов получены новые практически важные результаты: независимость полной внемеридиональной интенсивности слоевой линии от степени разупорядоченности нитей в ячейке и при трансляции ячеек в пространственную решетку, а также независимость суммы интенсивностей трёх слоевых линий, AI, АМ_: и AM+i, от параметров модели. Всё это позволяет нам перейти от модели состояния ригора к моделированию рентгенограммы активно сокращающейся мышцы.

Глава 6. Модель рентгеновской дифракции на тонких нитях в саркомерах скелетных мышц

В состоянии ригора основной вклад в актиновые слоевые линии на рентгенограмме скелетной мышцы дают присоединённые к актину миозиновые головки. При моделировании рентгенограмм мышцы в других физиологических состояниях, в которых только часть миозиновых головок присоединена к актину, становится существенным вклад регуляторных

белков тонкой нити. Недавно были предложены модели (Pirani и др., 2006; Poole и др., 2006), которые объясняют изменения в структуре тонкой нити, происходящие при её активации кальцием, а также соответствующие изменения на рентгенограмме мышцы. Эти модели, однако, не обеспечивают все наблюдаемые соотношения интенсивностей наиболее ярких актиновых слоевых линий. В настоящей главе рассмотрены модели тонкой нити, основанные на различных атомных структурах G-актина и разных способах их упаковки в спиральную структуру F-актина, и проведено сравнение расчётных интенсивностей актиновых слоевых линий с рентгенограммой тонких пучков волокон скелетной мышцы кролика в расслабленном состоянии. Проведён анализ вклада основных белков тонкой нити в интенсивности актиновых слоевых линий. 6.1. Структурная модель тонкой нити

Модель тонкой нити, общий вид которой был заимствован из работы Poole и др., (2006), показана на рис. 6.1. Чтобы учесть различие периодов актина и регуляторных белков, F-актин в этой модели рассматривали как целую левовращающую спираль 28/13, т.е. на 13 оборотов спирали приходится 28 мономеров, с полным периодом с = 28х2,75 = 77 нм.

Заметим, что интенсивности актиновых слоевых линий AI - А7, рассчитанные по модели актиновой спирали 13/6 (с = 35,75 нм) или 28/13 для одной и той же конфигурации мономера, почти не отличаются друг от друга. Также почти не заметны отличия в профилях этих слоевых линий для моделей, где мономер актина был взят из исходной (Holmes и др., 1990; Lorenz и др., 1993) и усовершенствованной моделей Holmes и соавторов (Holmes и др., 2003).

акт «п

Рис. 6.1. Структурная модель тонкой нити. Фрагмент тонкой нити включает в себя мономеры актина (показаны серым цветом), витки тропомиозина (7т, чёрные двухзаходные спирали) и две молекулы тропомиозина (Тп, тёмно-серые выступы). 2-линия по отношению к рисунку находится сверху.

Рассмотренные в настоящей работе три состояния тонкой нити: блокированное, закрытое и открытое, - соответствуют таковым в модели Poole с соавторами (Poole и др., 2006). Эти состояния, в свою очередь, имитируют кинетические состояния модели тонкой нити, предложенной McKillop и Geeves (1993). В блокированном состоянии в отсутствие Са2+ тропонин удерживает тропомиозин на тех участках актиновых мономеров, к которым могут присоединяться миозиновые головки. В закрытом состоянии присоединение Са2+ к тропонину ведёт к его отсоединению от актина, что, в свою очередь, вызывает поворот тропомиозина (в модели угол поворота принят равным -25°), открывая участки актина для связывания с миозиновыми головками. Открытое состояние достигается лишь после прочного присоединения миозиновой головки к актину и характеризуется ещё большим поворотом комплекса регуляторных белков относительно оси актина (в модели угол поворота регуляторных белков относительно блокированного состояния равен -40°).

На рентгенодифракционной картине скелетной мышцы заметно, что меридиональная координата актиновых рефлексов чуть больше, чем координата тропониновых, что говорит о том, что период актиновой спирали чуть меньше, чем осевая периодичность регуляторных белков. Чтобы учесть это различие, в нашей модели мы предполагали, что период актиновой спирали короче, чем тропомиозин-тропониновый (35,75 нм и 38,75 нм). Эта разница оказалась важна для моделирования тех состояний мышцы, в которых миозиновые головки стереоспецифически присоединяются к актину и контрастируют актиновую спираль, давая вклад в актиновые слоевые линии (Глава 7). Для имитации расслабленного состояния модель Poole и др. (2006) и наша модель дают очень похожие результаты, поэтому для сокращения времени вычисления в настоящей главе расчёты были сделаны для случая, когда периоды актина, тропомиозина и тропонина совпадают ("модель Холмса", Poole и др., 2006).

Для того, чтобы сравнить новые модели F-актина, предложенные Galkin, Egelman и соавторами (2008) и Oda с соавторами (2009), с экспериментальными данными, мы слегка изменили параметры актиновой спирали, использованные в этих работах, приведя их к модели 28/13 с полным перидом 77 нм, но оставив при этом неизменным мономер G-актина и его пространственную ориентацию по отношению к оси спирали. Как показали тестовые расчёты, такая модификация несущественна для расчётных интенсивностей слоевых линий, но позволяет совместить модели F-актина с известными атомными структурами регуляторных белков (Poole и др., 2006). Такие модели тонкой нити условно назовём "модель Эгельмана" и "модель Оды". Интенсивность // 1-й актиновой слоевой линии рассчитывали

как осреднённый по азимутальному углу квадрат преобразования Фурье электронной плотности одного периода тонкой нити.

6.2. Зависимость интенсивностей актиновых слоевых линий на рентгенограмме мышцы от состояния регуляторных белков тонкой нити

Для рассматриваемых моделей в блокированном состоянии тонкой нити были рассчитаны актиновые слоевые линии Al, А6 и А7. Для всех рассмотренных моделей расчётное соотношение 1м/1А6 оказывалось неправдоподобно большим. На экспериментальной рентгенограмме расслабленной мышцы интенсивность первой актиновой слоевой линии, А1, очень мала и составляет лишь несколько процентов от интенсивности соседней первой миозиновой слоевой линии, Ml (Bershitsky и др., 2009), а суммарная интенсивность первой слоевой линии (LL1=A1+M1) не превышала ]А6 ни в наших экспериментах, ни в работе Poole и др. (2006). В то же время, 1М, рассчитанная для актиновой спирали без регуляторных белков в 2-3 раза меньше, чем её значение для всей тонкой нити в блокированном состоянии.

На рис. 6.2 показан эффект вращения регуляторных белков, тропомиозина и тропонина, вокруг актина. Расчёт был сделан для трёх модельных конфигураций тонкой нити, соответствующих блокированному, закрытому и открытому состояниям. Видно, что интенсивности дальних слоевых А6 и А7 почти не зависят от вращения регуляторных белков. Разница в неколько процентов наблюдается только для А6 при переходе из блокированного в закрытое состояние, что соответствует экспериментальным данным (Yagi, Matsubara, 1989). Поведение Al и А2 совпадает с экспериментально наблюдаемыми изменениями, вращение регуляторных белков ослабляет двускладчатую симметрию тонкой нити и усиливает четырёхскладчатую. Из-за этого возрастает интенсивность А2, где индекс главного члена Фурье-Бесселя п - 4, и падает интенсивность А1, у которой главный член имеет индекс п = 2.

Хотя структура F-актина, очевидно, является подвижной (Reisler, Egelman, 2007), мы показали, что интенсивности слоевых линий не зависят от параметров спирали, но могут меняться в зависимости от выбранной модели актинового мономера и ориентации мономера в спирали.

Дальние акгиновые слоевые линии часто используют для оценки числа и конфигурации поперечных мостиков в сокращающейся мышце. Проведённый анализ показывает, что расчётные интенсивности этих актиновых слоевых являются модель-зависимыми и ни одна из существующих моделей пока не может удовлетворительно описать все экспериментальные данные. Интенсивности слоевых линий А6 и А7 при максимальной активации расслабленной мышцы в изометрических условиях при в отсутствие перекрытия тонких и толстых нитей увеличиваются 26

(Б^нтиЛо и др., 2008), что показывает существенный вклад белков тонкой нити в интенсивность этих слоевых линий. Поэтому без адекватной модели тонкой нити невозможно использовать экспериментально наблюдаемые /А6 и /Л7 для получения информации о структуре и количестве миозиновых головок, присоединённых к актину.

А Б

обратный радиус, нм"1 обратный радиус, нм"1

Рис. 6.2. Влияние поворота рыуляторных белков на актиноном нити на интенсивности слоевых линий. Блокированное (сплошные толстые линии), закрытое (сплошные тонкие линии) и открытое (пунктир) состояния рассчитаны по модели Холмса (см. Модель). А. Распределения интенсивности первой. AI, и второй, А2, актиновых слоевых линий. Для каждого состояния интенсивность второй слоевой линии ниже, чем интенсивность первой, поэтому для А! и А2 нет различных обозначений. Б. Шестая, А6. и седьмая. А7. актиновые слоевые линии. Для каждого состояния график интенсивности шестой слоевой линии лежит выше, чем график Л7.

Расчётные графики показывают, что 1М в блокированном состоянии выше, чем в закрытом или открытом, и, следовательно, интенсивность А] в области 0,06-0,1 нм"1 может быть использована для определения структуры присоединённых к актину миозиновых головок в сокращающейся мышце.

Глава 7. Моделирование рентгенодифракционной картины сокращающейся мышцы

Число головок, одновременно участвующих в активном сокращении, по разным оценкам варьирует от 5 % (Iwamoto и др., 2003) до 75 % (Kraft и др., 2002). При этом, по-видимому, головки находятся в различных конформационных состояниях, но их распределение по состояниям неизвестно. Кроме того, часть миозиновых головок, вероятно, присоединена к актину нестереоспецифически (Bershitsky и др., 1996; Taylor и др., 1999:

Wu и др., 2010). Это означает, что каталитические домены этих головок могут быть расположены под различными углами к актину, а не под одним определенным углом, как в ригоре. Таким образом, новая модель должна оценивать долю присоединённых головок в активном сокращении, а также различать различные структурные состояния присоединённых миозиновых головок.

7.1. Математическая модель

Структура А-зоны саркомера, использованная в модели, была дополнена регуляторными белками тонких нитей, и поэтому немного отличалась от описанной в Главе 5. Высота элементарной ячейки была принята равной 14 периодам актиновой спирали (14x35,75 нм) или 35 ярусам миозиновых головок на стволе толстой нити (35x14,3 нм) и составляла 500,5 нм. В эту ячейку входят 3 миозиновые нити и 6 актиновых, все тонкие нити были ориентированы одинаково, в то время как ориентации центральной и периферийных миозиновых нитей в супер-ячейке отличались на 180° (рис. 5.1). Актиновые нити состоят из левой 13/6 спирали актиновых мономеров; миозиновые молекулы образуют трёхзаходную правую спираль на стволе толстой нити, поворот между соседними молекулами в ярусе составляет 120°. Молекулы тропонина связывали каждый седьмой актиновый мономер в актиновой длинной псевдоспирали, или 1-й и 2-й из 14 последовательных мономеров в истинной спирали. Период тропомиозина совпадал с периодом тропонина и составлял 38,5 нм или 14*2,75 нм. Период актиновой спирали был короче, чем период регуляторных белков; это обеспечивало наблюдаемую экспериментально разницу в положениях актиновых и тропониновых меридиональных рефлексов на рентгенограмме.

Атомные модели актина и миозиновых головок были взяты из работы Holmes и др. (2003), тропомиозина и тропонина - из работы Pirani и др. (2006). Тропомиозин и тропонин были повёрнуты из "блокированного" состояния на -25°, в открытое положение, характерное для активно сокращающейся мышцы (Pirani и др., 2006; Poole и др., 2006). Для упрощения полагали, что угол поворота регуляторных белков остаётся одинаковым в сокращении при высокой и низкой температурах, а также в ригоре. Миозиновые головки могли присоединяться к актину либо стереоспецифически, S, или нестереоспецифически, /У(рис. 7.1).

Каталитические домены (CD) стереоспецифически присоединённых головок были зафиксированы на актине, но домены лёких цепей (LCD) могли изгибаться или поворачиваться в осевой и азимутальной плоскостях по отношению к CD. Пресилогенерирующее состояние миозиновых головок моделировали 50° осевым поворотом домена лёгких цепей по отношению к CD так, что "шейка" оказывалась почти перпендикулярной оси тонкой нити. Нестереоспецифически связанные головки могли присоединяться к актину в

широком секторе углов. В то же время положение домена лёгких цепей относительно CD полагали фиксированным. Структуры нестереоспецифически связанных акто-Sl комплексов были получены поворотом S1 вокруг центра актиновой нити под случайными углами в азимутальной и осевой плоскости, равномерно распределёнными внутри секторов с границами iH^ and +4'az соответственно. В модели нестереоспецифического присоединения или для анализа возможных углов стереоспецифического связывания S1 поворачивали как твёрдое тело по поверхности, актинового мономера в осевой или азимутальной плоскости, сохраняя контакт миозиновой головки с той областью поверхности мономера актина, которая участвует в связывании S1 в ригоре.

а Б ШЯ*

Рис. 7.1. Схема элементарной супер-ячейки. А. Гексагональная актин-миозиновая супер-ячейка показана в плоскости, перпендикулярной оси волокна. Актиновые нити изображены маленькими более тёмными кружками, все они имеют одинаковую ориентацию (фаза акгиновой спирали одна и та же для всех нитей). Ориентации миозиновых нитей (большие круги) разные у центральной и приграничных нитей, положения ярусов миозиновых головок на толстых нитях показаны выступами. Б. Участок акгиновой нити с присоединёнными к ней миозииовыми головками. Стерсоспецифичсски связанные миозиновые головки, приходящие с трех соседних толстых нитей, показаны различными оттенками тёмно-серого цвета, актиновая нить показана светло-серым цветом. Миозиновые головки могут быть нестереоспецифически присоединены к актину, возможные углы присоединения лежат в секторах ±*Рах и в осевой и азимутальной плоскости соответственно. Мы предполагали, что распределение нестереоспецифически присоединённых головок равномерное, нулевые значения осевого и азимутального угла соответствуют конфигурации стереоспецифического связывания.

Принцип минимума упругой энергии (5.1) задавал разметку мономеров актина миозиновыми головками. Два параметра: е = к/к,, отношение

трансверсальной и осевой жёсткостей присоединённой миозиновой головки, и / - доля присоединённых головок, - полностью определяют расстановку миозиновых головок в элементарной ячейке модели. Ниже будем обозначать доли стереоспецифически присоединённых, нестереоспецифически присоединённых и отсоединённых головок как .Д5), ДМ) и ./(О), соответственно. В части расчётов вкладом отсоединённых головок в интенсивность слоевых линий пренебрегали. Вычисления слоевых линий были выполнены так же, как и в модели, описанной в Главе 5.

7.2. Результаты

Двумерные рентгенограммы, собранные с одиночного мышечного волокна скелетной мышцы кролика в трёх различных состояниях: расслабления, ригора и в активном сокращении при 30 °С, показаны на рис. 7.2.

А. расслабление б. ригор

ш Шт ш

1 ^ :УГУ У :

1! :

1: ! 1||

/У; ./■ 1' ■ шт

1ШУ Е = ^ II

Е: 'СУУУУУУ:; УЗУ ^«¿аВ

В. сокращение, тепло

Рис. 7.2. Рентгенограммы одиночного мышечного волокна: А: в состоянии расслабления (верхний левый квадрант). Б: в риторе (верхний правый квадрант), В: в активном сокращении при 30 °С (нижняя половина). Интенсивность в кадрах была нормирована на время экспозиции в каждом ю состояний. Для изображения интенсивности использована линейная ткала оттенков серого цвета, более высоким значениям соответствует белый цвет, более низким - черный. Экваториальная ось на рисунке расположена вертикально, меридиональная - горизонтально. Область экваториальных рефлексов закрыта аттенюатором, чтобы не допустить насыщения детектора. Длина сегментов 3,2 мм и 3.1 мм, поперечные размеры 90x100 мкм, длина саркомерои 2,4 мкм.

В изометрическом сокращении все актиновые слоевые линии были ярче, чем в расслабленной мышце. Рост интенсивности актиновых слоевых линий вызван увеличением эффективной электронной плотности актиновой спирали, в которую дают вклад присоединённые к актину миозиновые головки.

Сравнение интенсивности актиновых слоевых линий, рассчитанных по модели, и полученных из экспериментальных данных

Мы провели систематический анализ параметров модели подобный тому, который был проведён для модели состояния ригора. Конкретные значения параметров подбирали для лучшего совпадения с экспериментальными данными по следующим правилам. Отношение жёсткостей мостика, е, определяли из отношения интенсивностей МЗ, АМ.| и АМ+) к интенсивности А1. Для состояния ригора было выбрано значение е = 0,25 и модель "свободного выбора", для активного сокращения е = 0,5. Рентгенограмма состояния ригора была рассчитана, исходя из предположения о том, что все миозиновые головки стереоспецифически связаны с актином в конфигурации, предложенной Holmes и др. (2003). В активном сокращении при высокой температуре доля присоединённых головок составляла 40 %, их конфигурацию подбирали так, чтобы лучше описать интенсивность МЗ и радиальный профиль А6 и А7. Шейка присоединённой миозиновой головки была повёрнута на 50° по направлению к М-линии, а вся головка была повёрнута на 10° в азимутальном направлении. Шейки присоединённых головок могли изгибаться в направлении ствола толстой нити. Был проведён глобальный поиск параметров, описывающих беспорядок решётки,. чтобы обеспечить наилучшее совпадение расчётных и экспериментальных данных.

Модель количественно воспроизводит относительные значения интенсивностей наиболее ярких слоевых линий в активном сокращении и в ригоре и достаточно хорошо воспроизводит радиальные распределения интенсивностей вдоль этих слоевых линий. Общий Л-фактор для двух наборов по 6 слоевых линий составлял 9,9 %, по отдельности Л-фактор для рентгенограмм ригора и активного сокращения при высокой температуре составлял 8,9 % и 11,9 % соответственно. Модель также воспроизводит все основные черты экспериментальных рентгенограмм. В ригоре все актиновые и актин-миозиновые слоевые линии были очень яркими. Также яркими были интенсивности меридиональных рефлексов МЗ и Мб. При сокращении интенсивность актиновых и актин-миозиновых слоевых линий снижалась, в то время как интенсивность МЗ и Мб оставалась достаточно большой.

В то же время есть и некоторые несоответствия между расчётами по модели и экспериментальными данными. Модель всегда занижала интенсивность Мб, по-видимому, из-за того, что в Мб дают вклад не только миозиновые головки, но и другие структуры толстой нити. Расчётная

интенсивность А7 была немного выше, а А6 - ниже, чем наблюдаемые значения в ригоре и активном сокращении также как при расчётах рентгенограммы расслабленной мышцы. Мы полагаем, что это вызвано несовершенством атомных моделей Р-актина.

Расчёты, проведённые с учётом рассяния на отсоединённых головках, показали, что их вклад в актиновые и актин-миозиновые слоевые линии, по-видимому, пренебрежимо мал. Их влияние сказывается только на величине и распределении интенсивности миозиновых слоевых линий. Наиболее интересным для нас был рефлекс МЗ, изменение интенсивности которого часто используют для оценки изменений формы присоединённых головок. Оказалось, что в его интенсивность дают вклад не только присоединённые, но и отсоединенные головки, наличие которых немного повышало общую интенсивность, а также меняют ширину рефлекса в радиальном направлении. Влияние формы присоединённой миозиновой головки на интенсивность слоевых линий

Интенсивность первой актиновой слоевой линии А1 почти не зависит от изменения углов поворота домена лёгких цепей по отношению к СБ. Изменения в расчётной интенсивности А1 в области интегрирования экспериментальной рентгенограммы [0,014; 0,06] нм"' меньше 5 % для углов поворота ЬСБ в пределах 50° и Д5) = 0,4. Интенсивность МЗ была наибольшей, если шейки присоединённых головок были примерно перпендикулярны оси волокна, и падала при движении домена лёгких цепей к г-линии. Расчёты показали, что к форме присоединённой головки особенно чувствительны дальние актиновые слоевые линии. Самые выраженные изменения интенсивности, вызываемые поворотом шейки, были найдены для АМ+). Её полная интенсивность при повороте ЬСО на 50° вырастала вдвое, а положение пика сдвигалось от 0,055 нм'1 для ригороподобной конфигурации в область 0,025-0,03 нм"' для пре-силогенерирующего состояния, в котором он почти перпендикулярен оси волокна.

Были вычислены и изменения интенсивности слоевых линий при осевых и азимутальных поворотах стереоспецифически связанной головки как твёрдого тела. При ±30° вращении головки в обеих плоскостях интегральная интенсивность слоевой линии менялась не более, чем на 7 %. Форма слоевой линии А6 и её интенсивность оказались очень чувствительны к углу поворота миозиновой головки на поверхности мономера актина. Азимутальное вращение сдвигает положение пика интенсивности этой слоевой линии. Поскольку в экспериментальных данных положение пика А6 на рентгенограммах мышцы в сокращении остаётся там же, как в расслабленном состоянии, это означает, что вращение Б1 в азимутальной плоскости на -10... -15° позволяет улучшить соответствие между расчётной и экспериментально наблюдаемой интенсивностью А6. 32

Влияние числа стереоспецифически присоединённых миозиношх головок на интенсивность слоевых линий

Зависимость расчётных интенсивностей слоевых линий от числа стереоспецифически присоединённых головок показана на рис. 7.3. Интенсивность первой слоевой линии, 1Аь почти пропорциональна числу стереоспецифически присоединённых головок,график этой зависимости лежит чуть ниже, чем линейная функция, но выше, чем квадратичная. Поскольку при больших обратных радиусах может проявляться вклад регуляторных белков тонкой нити, мы рассмотрели графики интенсивности А1, интегрированной в узкой, [0,014; 0,06] нм"', и широкой, [0,014; 0,1] нм'1, области по отдельности. После нормирования на максимальное значение при Д5) = 1 никакой существенной разницы в поведении двух графиков не было обнаружено. Как было показано выше, /А| не зависит от конфигурации стереоспецифически присоединённых головок, поэтому функция может быть использована для определения Д5) в активном сокращении.

доля стереослецифичеом присоединённых головок, ДО

Рис. 7.3. Расчётная зависимость интегральных интенсивностей слоевых линий от числа стереоспецифически присоединённых головок,/(ф. А. Интенсивности А7 (точка - тире), А6 (точки), внемеридионалыгай части А5 (пунктир) и А1 (сплошные линии). Для А1 использовали два интервала интегрирования: широкий [0,014; 0,1] им"', полужирная линия, и узкий [0,014; 0,06] нм"1, тонкая линия. Последний интервал использовали при анализе экспериментальных данных, чтобы отделить вклад в /А| тонких нитей миозиновых головок. Б. Интенсивности МЗ (сплошная линия), АМ.| (тире - две точки). Мб (пунктир) и АМ+1 (точка - тире). Все интенсивности нормированны на их значение при Д5) = I. Остальные параметры модели те же, что и для "лучшего" набора, обеспечивающего минимальный Л-фактор.

Дифракция на нестере (¡специфически связанных миозиновых головках

Нестереоспецифическое присоединение миозиновых головок к актину моделировали, присваивая каждой головке случайные значения азимутального и осевого угла присоединения к актиновому мономеру. Нулевые значения этих углов соответствовали ранее рассмотренному случаю стереоспецифического связывания, возможные случайные значения углов в каждом расчёте были ограничены и лежали в пределах ±4"^ и ±1Рах. Интенсивность А1 была не очень чувствительна к осевому беспорядку, но быстро падала с увеличением ширины сектора в азимутальной плоскости. При /=0,4 и Ущ - 60-70° 1М падала до -0,3 её значения при стереоспецифическом присоединении головок, хотя доля присоединённых к актину головок оставалась постоянной. Наиболее чувствительной к азимутальному беспорядку оказалась интенсивность внемеридиональной части А5. Наименее чувствительны к изменениям Ч'щ были полные интенсивности слоевых линий А6 и А7. Однако эти интенсивности падали значительно при увеличении ширины сектора осевых углов присоединения, 1Рах. Осевой беспорядок также приводил к снижению интенсивностей меридиональных рефлексов МЗ и Мб, внемеридиональной части А5 и, в меньшей степени, к снижению интенсивности А1. Моделирование эффекта температуры

Увеличение температуры сокращающегося мышечного волокна кролика от -5 °С до -30 °С ведёт к трёхкратному росту изометрического напряжения. Поскольку рост напряжения происходит без изменений динамической жёсткости волокна (ВегвИИзку, ТэаШгуап, 1989, 2002), было высказано предположение, что рост температуры сопровождается переходом нестереоспецифически связанных головок в состояние стереоспецифического связывания (ВегеИНэку и др., 1997). Чтобы проверить это предположение, мы сравнили двумерные рентгенограммы волокон, изометрически сокращающихся при ~5 °С и при -30 °С с расчётными. При моделировании сокращения при высокой температуре все головки были присоединены к актину стереоспецифически:.Д5) = 0,4, ДАО = 0 . Сокращение при низкой температуре моделировали следующими параметрами Д5) = 0,13, ДЛО = 0,27, Ч'-и = 60°, Ч^ = 0°, т.е. влияние температуры состояло в переходе большей части присоединённых головок из нестереоспецифического в стереоспецифически связанное состояние. Модель воспроизводит многие характерные черты экспериментальной рентгенограммы при обеих температурах. Расчётные распределения интенсивности А1, МЗ, Мб (=А5) и А7 слоевых линий очень похожи на экспериментально наблюдаемые. /А6 в экспериментальной рентгенограмме выше, чем полученные в расчётах, а интенсивности АМ.Ь АМ+) несколько ниже, чем их расчётные значения.

7.3. Обсуждение результатов

Предложенная модель не только воспроизводит характерные рефлексы на рентгенограмме активно сокращающейся мышцы при разных температурах, но и позволяет изучить связь изменения физических и структурных параметров модели с изменениями рентгеновских рефлексов. Тем самым, модель становится инструментом для количественного анализа экспериментальных рентгенодифракционных данных.

О 0.1 0 0.1 0 0.1 0 0.1

обратный радиус , мм'1 обратный радиус . нм"'

Рис. 7.4. Расчётные (пунктир) и экспериментальные (тонкие линии) интенсивности наиболее ярких слоевых линий иа рентгенограмме мышечных волокон во время изометрического сокращения при холодной (А, ~5 °С) н горячей (В, ~30 °С) температурах. Данные собраны но 90 скачкам температуры в 5 пучках из 3 мышечных волокон кролика каждый (см. Методы), общая экспозиция при каждой температуре составляла 450 мс. Интенсивности показаны в условных единицах. Все экспериментальные интенсивности шкалированы одним множителем. Параметры модели е = 0,5, ДгЛ= 3,5 нм, Дгл=1.5нм, пре-силогенерируюшая конфигурация 81: для А:ДЯ) = 0,13,ДЛ) = 0,27 = 60°, 1Ра11 = 0); для Д5") = 0,4,

Мгах = 4 нм, = 0, = —10°).

Особенности модели

В этой главе метод прямого моделирования, использованный ранее для описания рентгенограммы скелетной мышцы в ригоре, был распространён на изучение дифракционной картины сокращающейся мышцы. Этот подход основан на использовании доступных атомных стуктур основных белков саркомера скелетной мышцы в сочетании с физически обоснованной

параметризацией функции распределения миозиновых головок. Это, во-первых, обеспечило воспроизведение всех характерных черт рентгенограммы активно сокращающейся мышцы, а, во-вторых, позволило существенно сократить время вычислений. Два параметра, доля связанных с актином головок,/, и отношение продольной и трансверсальной жёсткостей, е, полностью определяют функцию распределения миозиновых головок в единичной ячейке. Параметр е обеспечивает соотношение между двумя осевыми миозиновыми периодичностями ячейки. Кроме хорошо изученной ~14,3 нм, или МЗ, периодичности (Bordas и др., 1993; Yagi, 1996; Yagi и др., 2005, 2006), наблюдается второй период ~7,2 нм, или- Мб, эти меридиональные рефлексы очень хорошо видны и в активном сокращении, и в ригоре (рис. 7.2). Меньшему е соответствует более выраженная МЗ периодичность, и менее выраженная периодичность Мб. Периодичность МЗ при присоединении миозиновых головок к актину обеспечивает появление смешанных актин-миозиновых слоевых при (-24 нм)"1 и (~10,4 нм)'1, АМ+] и AM.i, соответственно (рис. 7.4; Глава 5; Tsaturyan, 2002). Мб периодичность даёт вклад во внемеридиональную интенсивность Al, А6 и А7 актиновых слоевых линий (Глава 5; Tsaturyan, 2002). Наши расчёты проведены при значениях параметра е обеспечивающих наилучшее приближение трёх величин: интенсивностей МЗ и Мб, а также отношения полной интенсивности смешанных слоевых линий к 1М в активном сокращении (е = 0,5) и в ригоре (е = 0,25).

Хотя наша модель объясняет многие основные черты наблюдаемой двумерной рентгенограммы мышечных волокон, сокращающихся при -30 "С, интенсивность некоторых слоевых линий заметно отличается от экспериментально наблюдаемых. Модель переоценивает интенсивности актин-миозиновых слоевых, возможно, из-за того, что вклад в рентгенограмму отсоединённых миозиновых головок, а также структур толстой нити, больше, чем учитывается настоящей моделью. Другое несоответствие видно на профилях А6 слоевой линии, где наблюдаемые значения раза в два выше расчётных. На основании оценок, сделанных в предыдущей главе, мы предполагаем, что основная причина этого расхождения - качество имеющейся в настоящее время атомной модели F-актина.

Интенсивность первой актиновой слоевой линии как мера числа стереоспецифически присоединённых головок

Проведённые расчёты показывают, что полная интенсивность первой актиновой слоевой линии 1М не чувствительна к поворотам хвостовых доменов миозиновых головок. Только физически нереализуемые повороты целой миозиновой головки вокруг актина способны привести к изменениям /Ai более, чем на 15 %. Тем самым, в условиях, когда все миозиновые

головки присоединены к актину стереоспецифически, 1М может быть использована для определения доли присоединённых миозиновых головок. Во время изометрического сокращения при -30 °С, 1М составляет примерно 30 % от своего значения в ригоре. Опираясь на собственные экспериментальные данные, а также данные других авторов, мы полагаем, что в этих условиях доля нестереоспецифически связанных головок мала, и, поэтому, ßS) ~ 40 %. Похожее значение было получено в экспериментах на одиночных волокнах кролика (Linari и др., 2007). Как было замечено ранее, расчётная /Л1 не следует квадратичному закону, который предсказывает простая теория (Holmes и др., 1980), главным образом из-за модуляции 7,2 нм. Поэтому график зависимости 1М от_Д5) лежит между квадратичной и линейной функциями. Моделирование актиновых слоевых линий высоких порядков А5, А6 и А7 показывает, что их нельзя использовать для оценок числа присоединённых головок, поскольку интенсивности этих слоевых очень чувствительны к форме присоединённых головок. Конфигурация стереоспецифически связанных головок во время активного сокращения

Отметим, что выбор "активной" конфигурации миозиновых головок не единственный, интервал возможных углов поворота LCD, обеспечивающий хорошее совпадение с экспериментальными данными, составляет примерно 10°, и, например, 40° угол поворота LCD также мог бы быть использован для моделирования активного сокращения. Такой диапазон углов поворота "шеек" совпадает с результатами экспериментов с быстрыми изменениями длины интактных мышечных волокон лягушки (Irving и др., 2000). Наша конфигурация 'я' похожа на атомную модель "пресилогенерирующего" состояния S1 из мышц гребешка (Houdusse и др., 2000).

Интенсивности А6 и А7 актиновых слоевых линий не могут быть использованы для определения формы стереоспецифически связанных головок, так как их интенсивности зависят как от углов поворота хвостиков, так и от положения всей миозиновой головки относительно актина. Вклад нестереоспецифически связанных головок в эти слоевые линии остается большим даже при больших разбросах возможных углов присоединения миозиновых головок к актину.

Следует отметить, что моделирование рентгенодифракционной картины может выявить только свойства большинства миозиновых головок и не исключает возможности того, что небольшая доля головок находятся в других состояниях.

Структурные изменения во время силогенерации

Приведённый выше анализ рентгенограмм показывает, что развитие напряжения в скелетной мышце, вызванное увеличением температуры,

сопровождается структурными изменениями в присоединённых миозиновых головках. В демембранизованном волокне кролика молярная концентрация миозиновых головок составляет 154 мкМ. Соответственно их концентрация в 1 м3 равна (0,154 М-м"3)-(6Т023 М*1) = 9,3ТО22 головок. Пусть длина саркомеров 2,45 мкм и доля присоединённых головок 0,4, тогда в полусаркомере на 1 м2 площади сечения приходится (9,ЗТ022 м"3)-(2,45/2-10"6 м)-0,4 = 4,67-Ю16 стереоспеиифически связанных с актином головок. Чтобы напряжение волокна составило 300 кПа, каждая из этих головок должна в среднем развивать силу около 6,5 пН.

Глава 8. Регистрация осевых перемещений миозиновых головок в процессе развития силы в ответ на скачок температуры с помощью дифракционной интерферометрии

Чтобы оценить перемещения поперечных мостиков во время развития ими силы, мы регистрировали изменения тонкой структуры и интенсивности рефлекса МЗ в серии экспериментов со скачком температуры в активно сокращающихся скелетных волокнах кролика. Перемещение миозиновых головок, оцененное по интерференционным данным с помощью модели точечных дифракторов, составило менее 0,6 нм, что не согласуется с классической моделью силогенерации, в которой сила, развиваемая актин-миозиновым мотором, прямо пропорциональна углу поворота домена лёгких цепей присоединённого S1 миозина Проведён анализ моделей интерференционного расщепления МЗ. Показано, что разницу между реальным перемещением миозиновых головок и его оценкой по данным рентгеновской интерферометрии можно объяснить дисперсией углов присоединения миозиновых головок к актину или углов взаимного расположения каталитического домена и "шейки". Предложена структурно-кинетическая модель, объясняющая результаты нескольких типов экспериментов.

8.1. Экспериментальные результаты и их интерпретация

Эксперименты были выполнены на станции ID02 Европейского источника синхротронного излучения (ESRF, Франция) с использованием FReLoN CCD детектора. Рентгенограммы получали в трёх "кадрах" длительностью 5, 5 и 2,5 мс, соответственно, при трёх различных уровнях напряжения волокон: низком (стационарное сокращение при ~5 °С), высоком (стационарное сокращение при 30 °С) и среднем, примерно соответствующем половине прироста напряжения после скачка температуры (рис. 8.1). Рентгенограммы каждого из трёх кадров были просуммированы по всем 65 скачкам температуры в 7 образцах (от 5 до 15 скачков температуры в одном образце).

температураС

100

напряжение,кНУм

0.068 0.07

время, мс

осевое положение, 1/нм

Рис. 8.1. Механические и структурные изменения в мышце в ответ на скачок температуры. А. Экспериментальные записи температуры (вверху) и напряжения (внизу). Пустой, серый и чёрный прямоугольники показывают времена экспозиции образца в "холодном", "промежуточном" и "горячем" кадрах, соответственно. Б. Осевые профили МЗ в холодном, промежуточном и горячем кадре показаны точками, пунктиром и сплошной линией, соответственно. Радиальное интегрирование в области ±0.016 нм"'.

Скачок температуры от 5 °С до 30 °С вызывал увеличение напряжения, развиваемого препаратом, в 2,68 ±0,17 раза (и=7, среднее ± стандартное отклонение). Экспериментальные графики изменения температуры и напряжения, а также временные интервалы экспозиции показаны на рис. 8.1 А. Осевые профили МЗ в этих трёх кадрах показаны на рис. 8.1 Б. Увеличение интенсивности МЗ, /мз, было небольшим в промежуточном кадре, /мз' = 1,13 /мзс, в то время как в горячем состоянии /мзь= 1,44 /М1° (здесь и далее индексы 'с', Ч' и 'Ь' соответствуют холодному, промежуточному и горячему кадрам, соответственно). Чтобы определить изменения профиля данных, интенсивность рефлекса в каждом состоянии была нормирована на величину малоуглового пика (рис. 8.2).

Изменения осевого положения рефлекса и интерференционного расстояния были оценены с помощью модели точечных дифракторов (3.2). Результаты расчёта по модели ТД (точки), обеспечивающие наилучшее приближение к экспериментальным данным, показаны на рис. 8.2 (пунктир). Соответствующие значения параметров показаны в первой строке таблицы 8.1. Чтобы учесть дополнительные аппаратные эффекты, мы также использовали свёртку расчётной интенсивности с гауссианом (4.1).

Рис. 8.2. Сравнение расчётных и экспериментальных профилей МЗ в холодном (//), промежуточном (/>) и горячем (В) кадрах. Сплошные чёрные линии -экспериментальные данные, пунктир - лучшее приближение идеальной моделью точечных дифракторов. Расчёты по модели точечных дифракторов с учётом размеров луча и разрешения детектора (расчёты для о= 2,15х10"4 нм*1 и о= 2,39x10"4 им'1 показаны частыми и редкими точками, соответственно).

Таблица 8.1. Параметры модели точечных дифракторов, обеспечивающие наилучшее приближение к экспериментальным данным.

о, х104нм"' экспериментальные кадры

"холодный" "промежуточный" "горячий"

Ь, пм (1, нм Ь. нм с/. нм Ь. нм й, нм

0 82.8 14.520 82,5 14,545 83,05 14,572

2,15 82,87 14,522 82,62 14.553 83,08 14,568

2,39 82,86 14.523 82,59 14,554 83,08 14,566

Многостадийная модель

Дополнительные расчёты показали, что в случае широкого распределения миозиновых головок, например, по углу присоединения к актиновой нити, абсолютное смещение голововок в каждом яруса и изменение положения их центра масс в ярусе могут существенно отличаться.

На основе результатов Главы 7, нами была предложена новая структурно-кинетическая модель работы поперечного мостика (Регепсг! и др., 2005), основанная на следующих предположениях:

1. Силогенерирующий процесс миозиновых головок просходит в два отдельных шага: а) вращение нестереоспецифически присоединённых

головок с их застегиванием как целого в стереоспецифически связанное состояние (переход 3 -> 4 на рис. 8.3) и б) последующий поворот шейного домена вокруг моторного домена (переход 4 -> 5). Первый шаг не сопровождается изменениями в субфрагменте-1, тогда как второй связан с открытием фосфат-связывающего кармана (сопряжённого с движением рычага, то есть шейного домена), способствующего высвобождению фосфата и АДФ (Geeves, Holmes, 1999).

2. Оба шага силогенерирации быстрые (-1,000 с"1), обратимы и зависят от механического напряжения, как предполагается моделями типа модели Huxley и Simmons'a (Huxley, Simmons, 1971; Piazzesi, Lombardi, 1995). При низкой нагрузке каждый из этих шагов может переместить толстые и тонкие нити на 4-5 нм друг относительно друга. Если скольжение нитей невозможно, механическая энергия сохраняется в виде упругой энергии изгиба шейного домена субфрагмента-1 (Dobbie и др., 1998).

3. Переход 'вращение-застёгивание' (3->4 на рис. 8.3) может происходить только после гидролиза АТФ.

4. Открытый и закрытый М.АТФ и пре-силогенерирующий М.АДФ.Pi комплексы связывают актин слабо, обратимо и нестереоспецифически, видимо через электростатические контакты между лизин-содержащей петлёй 2 на субфрагменте-1 и положительно заряженой N-терминалью актина (Rayment и др., 1993). Эти комплексы обладают существенной осевой, или продольной, жёсткостью, но головки в таких комплексах присоединены к актину нестереоспецифически, т.е. под разными азимутальными и осевыми углами. Вклад нестереоспецифически присоединённых головок в актиновые слоевые линии низок.

Здесь и на кинетической схеме (Б) рис. 8.3 А, М, АТФ, АДФ и Р, обозначают актин, субфрагмент 1 миозина, аденозин-трифосфат, аденозин-дифосфат и неорганический фосфат, соответственно.

В соответствии с кинетической схемой модели получали систему обыкновенных дифференциальных уравнений, решение которой описывает изменение относительных концентраций головок в различных состояниях. Параметры распределения головок в нестереоспецифически свзязанных состояниях и углы поворота "рычага" в силогенерирующих состояниях подбирали так, чтобы описать все полученные экспериментальные данные. Модель воспроизводит временной ход напряжения, /А, и /мз, а также качественно описывает изменение R, наблюдавшееся в наших экспериментах (рис. 8.4).

переход поворот

"вращение-застегивание" шейного домена

нестереоспецифическое присоединение

стереоспецифическое связывание

АМАТФ

к7..

А + М-АТФ А + М-АТФ

к*Г о.

Р,- АДФ

) Л

АМ-АДФ-Р,- ч-Э* АМ-АДф-Р,- АМ АДФ Р; --

дтф 5

Рис. 8.3. Структурная и кинетическая схема механизма генерации силы головками молекулы миозина (Регепсг1 и др., 2005). А. Различные состояния (1—5) головки миозина (показаны серым и чёрным цветом), присоединённой к нити актина (тёмно-серый цвет) показаны в двух проекциях: в верхнем ряду ось актиновой нити перпендикулярна, в нижнем - параллельна плоскости рисунка. В нижнем ряду Ъ-линия саркомера находится справа. Б. Кинетическая схема биохимического цикла мостика, используемая в модели. Пре- и пост-гидролизные состояния 2 и 3 структурно идентичны, но отличаются биохимически. В состояниях 1, 2 и 3 головки в осевом направлении жёсткие, но могут присоединяться к актину под разными углами в осевом и азимутальном направлении. Полный диапазон азимутальных и осевых углов ±60° и ±30°, соответственно; на рисунке показаны центральное и крайние положения головок. Распределение по азимутальным и осевым углам случайное, равномерное во всём телесном секторе. Переход «вращение-застёгивание» (шаг 3 —» 4) сопровождается средним осевым вращением субфрагмента 1 как твёрдого тела на 26°, шаг 4 5 - поворотом шейного домена со средним осевым вращением на 50° по отношению к моторному домену. Ненапряжённые формы головок в силогенерирующих состояниях 4 и 5 показаны серым цветом (правое положение в паре, нижний ряд на А), напряжённые - чёрным (левое положение Головки могут обратимо отсоединяться из состояний 1, 2 и 3 в состояния 1', 2' и 3', соответственно.

время, мс

Рис. 8.4. Изменение отношения пиков интенсивности рефлекса МЗ, Я, в ответ на скачок температуры.

Квадратами показаны экспериментальные значения в трсхкадровом протоколе, сплошная линия -результат расчёта по многостадийной модели (см. текст).

8.2. Обсуждение результатов

Рост напряжения в сокращающихся волокнах скелетных мышц кролика, инициированный скачком температуры, сопровождается изменением интерференционного профиля меридионального рефлекса МЗ. Эти изменения говорят о том, что во время быстрого роста напряжения миозиновые головки поворачиваются в сторону М-линии, и этот поворот частично компенсируется на плато изометрического сокращения при высокой температуре. Было показано, что установление стационарного сокращения после скачка температуры сопровождается перецеплением миозиновых головок к более удобным для них актиновым мономерам (ВегзЬкБку и др., 1996, 1997). Это перецепление, возможно, и объясняет небольшую разницу между осевым положением головок в стационарном сокращении при высокой и низкой температурах.

Модификации модели одинаковых дифракторов

Максимальное перемещение усреднённой головки в наших экспериментах наблюдалось в промежуточном кадре. Его величина, оцененная с помощью модели ТД, составляла не более 0,6 нм. Рост напряжения, вызванный скачком температуры, был около 100 кН-м"^, что соответствует мгновенному вытяжению мышечного волокна кролика на ~5 нм/полусаркомер. Рост напряжения в среднем кадре по сравнению с холодным кадром соответствовал бы мгновенному изменению длины на -2,5 нм, что примерно в 4-5 раз выше, чем приведённая выше оценка, полученная из интерферометрии.

Причины несоответствия между измеренным (кажущимся) и реальным перемещениями в сокращающихся мышцах были предложены в работе (Р^аггеэ! и др., 2002) и использованы в дальнейших публикациях этой

(Reconditi и др., 2004; Linari и др., 2005) и других (Huxley и др., 2006) групп. Авторы предполагали, что существует дополнительная структура, с электронной плотностью, сравнимой с плотностью присоединённых к актину головок и периодом, равным осевому периоду миозина, которая не изменяется при относительном скольжении актиновых и миозиновых нитей. Авторы этой гипотезы предполагают, что эта структура - отсоединённые миозиновые головки. Недостаток этого объяснения состоит в том, что, во-первых, наличие дополнительных свободных параметров в модели снижает информативность интерференционных измерений - их становится больше, чем количество параметров, измеряемых экспериментально. Во-вторых, основное предположение не согласуется с данными прямых наблюдений. Электронно-микроскопическая томография тонких срезов сокращающихся волокон показывает, что поперечные мостики в изметрически сокращающемся мышечном волокне, в отличие от ригорных, состоят, преимущественно, из одной головки (Hirose и др., 1994; Taylor и др., 1999; Wuhäp, 2010).

Результаты нашего моделирования показывают, что увеличение ширины распределения углов присоединения миозиновых головок к актину (либо рычагов головок относительно жёстко связанного с актином каталитического домена) приводит к существенным различиям между приложенным внешним перемещением и величиной перемещения средней головки, оцененной по модели точечных дифракторов. Такое объяснение не противоречит данным электронной микроскопии, в которых интервал распределения азимутальных углов LCD присоединённых головок составлял 76°, а интервал осевых углов присоединения каталитического домена к актину был около 40° (Taylor и др., 1999), и обеспечивает удовлетворительное объяснение наблюдаемых изменений интерференционного расщепления МЗ (рис. 8.4). Перспективы использования структурно-кинетической модели для моделирования двумерной рентгенограммы сокращающейся мышцы в переходных состояниях

При построении структурно-кинетической модели (Ferenczi и др., 2005) расчёты интенсивности МЗ и AI были упрощены. В частности, мы считали, что в интенсивности AI дают вклад только стереоспецифически присоединённые головки прямо пропорционально их количеству. В свою очередь, при прямом моделировании рентгенограмм мы не учитывали возможных различий между головками, присоединёнными в различных биохимических состояниях. Вследствие этих упрощений, доли головокßN) и ßS) немного различаются в разных моделях. Так в структурно-кинетической модели при 5 °С ßN) = +N2+N3 = 0,40, ßS) = 5, + 52= 0,085, а при 30 °С ßN) = 0,28, ßS) = 0,25. В Главе 7 для моделирования рентгенограммы активно сокращающейся мышцы при 5 °С мы использовали ßN) = 0,27,

y(S) = 0,13, а при 30 °С fiN) = 0, J(S) = 0,4. Как показывают приведённые цифры, эти различия не существенны и, в целом, отражают качественные процессы, происходящие при повышении температуры в активно сокращающейся мышце, а именно, переход головок из слабо и нестереоспецифически связанных состояний в сильное стереоспецифическое связывание с актином. В то же время, благодаря упрощениям, принятым в моделях, мы смогли понять природу изменений в актин-миозиновых моторах, лежащих в основе развития силы при сокращении скелетной мышцы.

Мы полагаем, что совмещение структурно-кинетических моделей и метода прямого моделирования рентгенограмм позволит в дальнейшем изучить детали работы актин-миозинового мотора в переходных процессах, вызванных такими воздействиями как изменение температуры, длины волокна, или концентрации субстрата или продуктов реакции гидролиза АТФ, что позволит понять детали молекулярных механизмов, лежащих в основе мышечного сокращения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в понимании принципов работы актин-миозинового мотора, многие детали механизма его действия остаются неизвестными. В частности, неизвестно, как именно происходит начальное связывание миозиновой головки с мономером актина, не выяснено, какие именно изменения формы миозиновой головки связаны с генерацией силы, когда и как происходит сброс фосфата из активного центра миозиновой головки после расщепления АТФ. Современные методы биохимии, белковой кристаллографии и электронной микроскопии применимы только к таким объектам - растворам или кристаллам белков, быстрозамороженным образцам, используемым в электронной микроскопии, - в которых невозможно реализовать основную, механическую, функцию мышцы. В результате таких исследований были получены атомные структуры актина, S1, тропонина и тропомиозина, и модели актин-миозиновых комплексов или тонких нитей. При этом, нет уверенности в том, что структура, полученная кристаллизацией S1 в специальных условиях, соответствует конфигурации миозиновой головки, принимаемой ею ш vivo. Скорости биохимических реакций, измеренные в растворах, не соответствуют их значениям в мышце, поскольку до 40% свободной энергии гидролиза АТФ может запасаться в виде молекулярной упругой энергии, а затем высвобождаться в виде макроскопической механической работы. В результате этого в мышце скорости реакций зависят от напряжения, развиваемого миозиновыми головками. Эффективная концентрация белков в мышце недостижима в лабораторных исследованиях их растворов.

Перечисленные соображения указывают на особое, чрезвычайно важное место исследований интактных мышечных клеток и волокон с частично разрушенной мембраной, в которых механическая функция сохранена. Только в таких исследованиях можно выяснить, как на самом деле движутся молекулярные моторы и их отдельные детали в ходе мышечного сокращения.

Малоугловая рентгеновская дифракция не даёт столь высокого пространственного разрешения, как основные методы структурной биологии - белковая кристаллография, электронная микроскопия, - и новые методы сканирующей зондовой микроскопии. Однако, в отличие от вышеназванных методов, этот метод позволяет исследовать живую систему и, не конкурируя с белковой кристаллографией и электронной микроскопией, обладает комплементарными им возможностями. Одновременная регистрация механических и структурных изменений в функционирующих мышечных клетках позволяет изучать связь между структурой и функцией актин-миозинового мотора в мышце, а также проверять различные гипотезы, предложенные на основе результатов других экспериментальных методов.

В то же время, количественная интерпретация рентгенодифракционных диаграмм - непростая задача, требующая разработки адекватных физико-математических моделей. Все модели, построенные в настоящей работе, основаны на методе прямого моделирования и базируются на современных достижениях белковой кристаллографии и электронной микроскопии. Сочетание доступных атомных структур актина, миозина, регуляторных белков тонкой нити и, в некоторых случаях, комплексов этих белков с физически обоснованными дополнительными предположениями об их взаимодействии позволяет построить модель с небольшим числом свободных параметров, которые затем можно определить из экспериментальных рентгенограмм. Как нам кажется, во многих случаях этот подход даёт исследователю больше содержательной информации, чем метод глобального поиска лучшего приближения к экспериментальным данным при большом количестве свободных параметров, зачастую превышающем возможности экспериментальных данных.

Когда десять лет назад мы получили экспериментальные рентгенограммы одиночных интактных волокон в тетанусе, и на них невооружённым глазом было видно расщепление меридиональных рефлексов на несколько пиков, казалось, что эти данные несут новую точную информацию о структуре миозиновых головок. Используя результаты ранних работ В.В. Леднева и С.Б. Малинчика о строении толстых нитей скелетной мышцы и о положении миозиновых головок в расслабленной мышце, мы построили модель, воспроизводящую расщепление меридиональных миозиновых рефлексов мышцы в активном сокращении и в ригоре, и применили её для разработки метода рентгеновской

интерферометрии - измерения осевых перемещений присоединённых головок. Оказалось, что теоретическая точность метода необыкновенно высока, 0,1-0,2 нм, но он позволяет получить однозначные результаты только в тех условиях, когда все миозиновые головки находятся в одном структурном состоянии, т.е. в примерно одинаковой пространственной конфигурации. Более детальный анализ модели показал границы применимости этого метода. В тех случаях, когда его использование корректно, он представляет собой высокоточный измерительный инструмент, а других случаях дает важную дополнительную информацию об осевых молекулярных перемещениях величиной до 0,2 нм, что намного меньше, чем пространственное разрешение малоугловой дифракции на мышцах и одиночных мышечных волокнах.

ВЫВОДЫ

Основные результаты работы можно кратко сформулировать в следующем виде.

1. На источнике синхротронного излучения впервые зарегистрированы осевые рентгенограммы одиночных волокон скелетных мышц с высоким пространственным разрешением в состояниях активного сокращения и в ригоре.

2. Построена математическая модель интерференционного расщепления миозиновых меридиональных рефлексов, зарегистрированных на рентгенограмме мышечных волокон в ходе активного сокращения и в ригоре. Разработан метод интерферометрии, позволяющий определять изменения осевого положения миозиновых головок в мышце. Показано, что изменение осевого положения центра масс миозиновых головок при растяжении волокон в состоянии ригора составляет 1,2-1,6 нм.

3. Построены структурные модели сократительного аппарата поперечнополосатых мышц, позволяющие определять число и форму актин-миозиновых моторов в различных физиологических условиях на основе экспериментальных рентгенограмм.

4. С помощью разработанных структурных моделей определены основные характеристики миозинового мотора мышц:

— доля миозиновых головок, присоединённых к актиновым нитям во время активного изометрического сокращения, составляет 40%;

- сила, развиваемая одной миозиновой головкой, составляет около 6 пН.

5. В результате анализа экспериментальных рентгенограмм найдено соответствие между структурными состояниями миозиновой головки и различными биохимическими стадиями цикла гидролиза АТФ в ходе актин-миозинового взаимодействия в мышцах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследования, вошедшие в работу, были поддержаны грантами РФФИ, Президента Российской Федерации для молодых учёных - кандидатов наук, INTAS, MRC, Daresbury Laboratory, NATO, ESRF и EMBL, стипендиями МГУ и Института механики МГУ для молодых талантливых учёных.

Автор считает своим долгом почтить память профессора С.А. Регирера, руководителя семинаров по биомеханике в Институте механики МГУг чьё отношение к науке неизменно утверждало автора в правильности выбранного пути. Эксперименты с использованием интактчых мышечных клеток лягушки были выполнены совместно с М. Linari, V. Lombardi, G. Piazzesi и M. Reconditi (Universita di Firenze, Флоренция), эксперименты с использованием демембранизованных мышечных клеток кролика -совместно с С.Ю. Бершицким (Институт иммунологии и физиологии УрО РАН). А.К. Цатуряном (МГУ) и М.А. Ferenczi (Imperial College, Лондон), -всем им автор искренне признателен за сотрудничество.

ПУБЛИКАЦИИ

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях в научных журналах, входящих в Перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки.

1. Кубасова Н. А., Цатурян А. К. Молекулярный механизм работы актин-миозинового мотора в мышце. // Успехи биологической химии. - 2011. — Т. 51.-С. 233-282.

2. Tsaturyan А. К., Bershitsky S. Y., Koubassova N. A., Fernandez М., Narayanan Т., Ferenczi М. A. The fraction of myosin motors that participate in isometric contraction of rabbit muscle fibers at near-physiological temperature. // Biophys. J. - 2011. - V. 101. - P. 404-410.

3. Bershitsky S. Y., Koubassova N. A., Bennett P. M., Ferenczi M. A., Shestakov D. A., Tsaturyan A. K. Myosin heads contribute to the maintenance of filament order in relaxed rabbit muscle. // Biophys. J. - 2010. - V. 99. - P. 1827-1834.

4. Воротников А. В., Кубасова H. А., Цатурян А. К. Молекулярный мотор мышц. // Природа. - 2010. - № 4. - С. 29-36.

5. Кубасова Н. А., Бершицкий С. Ю., Цатурян А. К. Математическая модель механических ответов сокращающихся мышечных волокон на скачки температуры. // Биофизика. - 2009. - Т. 54. - С. 718-725.

6. Кубасова Н. А., Бершицкий С. Ю., Ференцзи М. А., Панин П., Нараянан Т., Цатурян А. К. Рентгенодифракционные измерения осевых перемещений миозиновых головок в мышце во время силогенерации, вызванной скачком температуры. // Молек. Биол. - 2009. - Т. 43. - С. 689-699.

7. Bersiiitsky S. Y., Ferenczi M. A., Koubassova N. A., Tsaturyan A. K. Insight into the actin-myosin motor from x-ray diffraction on muscle. // Frontiers in Bioscience. - 2009. - V. 14. - P. 3188-3213.

8. Кубасова H. А. Оценка моделей тонкой нити саркомера по рентгенограммам расслабленной мышцы кролика под малыми углами. // Биофизика. -2008. - Т. 53. - С. 936-942.

9. Koubassova N. A., Bershitsky S. Y., Ferenczi М. A., Tsaturyan А. К. Direct /nodeliing of X-ray diffraction pattern from contracting skeletal muscle. // Biophys. J. - 2008. - V. 95. - P. 2880-2894.

10. Ferenczi Bershitsky S. Y., Koubassova N., Siththanandan V., Helsby W. I., Panine P., Roessle M., Narayanan Т., Tsaturyan A. K. The 'roll and lock' mechanism of force generation by myosin II in muscle. // Structure. -2005. -V. 13.-P. 131-141.

11. Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K., Koubassova N., Narayanan Т., Roessle M., Ferenczi M. A. Strong binding of myosin heads stretches and twists actin helix.//Biophys. J.-2005.-V. 88.-P. 1902-1910.

12. Reconditi M., Koubassova N., Linari M., Dobbie I., Narayanan Т., Diat O., Piazzesi G., Lombardi V., Irving M. The conformation of myosin head domains in rigor muscle determined by X-ray interference. // Biophys. J. -2003.-V. 85.-P. 1098-1110.

13. Piazzesi G., Reconditi M., Koubassova N., Decostre V., Linari M., Lucii L., Lombardi V. Temperature dependence of the force-generating process in single fibres from frog skeletal muscle. // J. Physiol. - 2003. - V. 549. - P. 93106.

14. Koubassova N.A., Tsaturyan A. K. Direct modeling of x-ray diffraction pattern from skeletal muscle in rigor. // Biophys. J. - 2002. - V. 83. - P. 1082-1097.

15. Linari M., Piazzesi G., Dobbie I., Koubassova N., Reconditi M., Narayanan Т., Diat O., Irving M., Lombardi V. Interference fine structure and sarcomere length dependence of the axial X-ray pattern from active single muscle fibers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2000. - V. 97. - P. 7226-7231.

16. Piazzesi G., Koubassova N., Irving M., Lombardi V. On the working stroke elicited by steps in length and temperature. // Adv. Exp. Med. Biol. - 1998. -V. 453.-P. 259-264.

17. Dobbie I., Linari M., Piazzesi G., Reconditi M., Koubassova N., Ferenczi M. A., Lombardi V., Irving M. Elastic bending and active tilting of myosin heads during muscle contraction. //Nature. - 1998. - V. 396. - P. 383-387.

18. Linari M., Dobbie I., Reconditi M., Koubassova N., Irving M., Piazzesi G., Lombardi V. The stiffness of skeletal muscle in isometric contraction and rigor: the fraction of myosin heads bound to actin. // Biophys. J. - 1998. - V. 74. - P. 2459-2473.

Заказ № 143-р/11/2011 Подписано в печать 29.11.2011 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 2,75

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 I (V)) \vw\v. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Кубасова, Наталия Алексеевна

Общая характеристика работы

Список использованных обозначений

Глава 1 Введение и обзор литературы

Глава 2 Объект и методы исследования

Глава 3 Интерференционное расщепление миозинового меридионального рефлекса

МЗ в активно сокращающихся интактных волокнах мышцы лягушки

Глава 4 Измерение упругих свойств миозиновых молекул в состоянии ригора с помощью дифракционной интерферометрии

Глава 5 Моделирование двумерной рентгенодифракционной картины в состоянии ригора

Глава 6 Модель рентгеновской дифракции на тонких нитях в саркомерах скелетных

Глава 7 Моделирование рентгенодифракционной картины сокращающейся мышцы

Глава 8 Регистрация осевых перемещений миозиновых головок в процессе развития силы в ответ на скачок температуры с помощью дифракционной интерферометрии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование актин-миозинового мотора в скелетной мышце с помощью рентгеновской дифракции"

Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из классических и, по-прежнему, актуальных проблем биофизики Мышца - уникальный орган, преобразующий химическую энергию гидролиза АТФ в механическую работу с недостижимым в искусственных двигателях КПД Актин-миозиновый молекулярный мотор приводит в движение не только поперечно-полосатые и гладкие мышцы, но и обеспечивает многие другие виды клеточной подвижности Высокоупорядоченная организация миозиновых моторов в скелетной мышце делает ее чрезвычайно удобным объектом для изучения свойств этого мотора

Современные представления о механизме мышечного сокращения были заложены около пятидесяти лет назад и в настоящее время уже не подвергаются сомнениям Согласно теории скользящих нитей и мостиковой теории (H Е Huxley, Hanson, 1954, A F Huxley, Niedergerke, 1954, A F Huxley, 1957, HE Huxley, 1969, A F Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие глобулярных фрагментов миозиновых молекул, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами актина, составляющими основу тонких нитей Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, определение атомных структур мономера актина, актиновой нити и миозиновой головки (Holmes и др , 1990, 2004, Rayment и др , 1993а,б, Houdusse и др , 1999, 2000, Oda и др , 2009), многие важные детали механизма работы этого молекулярного мотора остаются неизвестными По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие силы или укорочение мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновая головка может переместить актиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995; Simmons и др., 1996; A.F. Huxley, 2000; Kraft и др., 2002; Linari и др., 2007).

Трудности изучения актин-миозинового мотора в значительной степени связаны с тем, что современные методы биохимии, структурной и молекулярной биологии имеют дело с изолированными белковыми молекулами, не способными развивать активных усилий и совершать механическую работу. Поэтому особое значение приобретают структурные исследования миозиновых моторов в таких условиях, в которых их механическая функция сохраняется. Одним из методов таких исследований является рентгеновская дифракция, с помощью которой можно изучать структуру изолированных мышечных волокон как интактных, так и с частично разрушенной мембраной. Развитие современных источников синхротронного излучения и быстродействующих двумерных детекторов рентгеновских фотонов высокого пространственного разрешения позволило существенно расширить возможности этого метода (Dobbie и др., 1998; Piazzesi и др., 2002). Одним из новых направлений исследований является рентгеновская интерферометрия, основанная на исследовании тонкого расщепления рентгеновских рефлексов, возникающего из-за интерференции рентгеновских лучей, рассеянных двумя половинами саркомеров поперечно-полосатых мышц.

Интерпретация экспериментальных рентгенограмм затрудняется тем, что в двумерной дифракционной картине мышцы не содержится информации о фазе рассеивающих объектов. Распространённый подход к решению таких задач состоит в разработке упрощённых моделей, описывающих лишь один или несколько рефлексов (например, Irving и др., 1992, 2000; Malinchik, Yu, 1995). Сколько-нибудь общих моделей, количественно описывающих всю двумерную картину рентгеновской дифракции сокращающейся мышцы, включая интерференционное расщепление миозиновых меридиональных рефлексов, в настоящее время нет. Представляется актуальным создание и содержательный параметрический анализ таких моделей, а также разработка на их основе новых методов количественного анализа рентгенограмм.

Методы исследования: рентгеновская дифракция высокого пространственного разрешения с использованием источников синхротронного излучения третьего поколения; прямое математическое моделирование.

Объект исследования: одиночные интактные волокна скелетных мышц лягушки или химически демембранизированные (скинированные) волокна скелетных мышц кролика.

Научная новизна

• Впервые получены осевые рентгенограммы одиночной мышечной клетки высокого пространственного разрешения, из которых методом рентгеновской интерферометрии получены количественные оценки осевых перемещений присоединённой к актину миозиновой головки в активном сокращении и в ригоре с точностью до 0,1-0,2 нм.

• Впервые построена математическая модель интерференционного расщепления миозинового меридионального рентгеновского рефлекса МЗ в активном сокращении и в состоянии ригора.

• Впервые систематически исследован вклад регуляторных белков тонких нитей в двумерную дифракционную картину мышцы в различных физиологических состояниях.

• Впервые построены математические модели всей двумерной рентгенодифракционной картины скелетной мышцы в состоянии ригора и в активном сокращении.

• Впервые получены количественные оценки числа стереоспецифически присоединённых к актину миозиновых головок в активном сокращении по данным измерения внемеридиональной интенсивности актиновых слоевых линий и прямого моделирования.

Положения, выносимые на защиту

- сила, развиваемая одной миозиновой головкой, составляет около 6 пН.

3. Показано, что предложенная нами новая структурно-кинетическая модель актин-миозинового взаимодействия в мышцах, в которой различным стадиям цикла гидролиза АТФ поставлены в соответствие структурные состояния и его комплексов с актином, хорошо описывает изменения интенсивности основных рентгеновских рефлексов в изометрически сокращающихся мышечных волокнах.

Научная и практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе не только сокращения мышц, но и многих других видов биологической подвижности. В результате проведённых исследований выяснены некоторые важные детали работы этого механизма и разработаны новые экспериментальные и теоретические методы и подходы, которые могут быть применены и в прикладных исследованиях сокращения скелетных и сердечных мышц. К ним относятся использованные в работе экспериментальные подходы, позволяющие одновременно исследовать механическое поведение мышечных клеток и получать их высококачественные дифракционные рентгенограммы с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные в работе математические модели могут быть использованы для рентгенодифракционных исследований особенностей работы актин-миозинового мотора в скелетных и сердечной мышцах в норме и при патологиях.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на Всероссийских рабочих совещаниях по биомеханике (Москва - Санкт-Петербург, 1999-2010); на Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004, 2007, 2010); V, VI, VIII, IX, X Всеросийской конференциях по биомеханике (Нижний Новгород, 2000, 2002, 2006, 2008; Саратов, 2010), X Всероссийском съезде по фундаментальным проблемам теоретической и прикладной механики (Нижний Новгород, 2011), XX и XXI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), на XXIV, XXVIII, XXX, XXXII и XXXIII Европейских мышечных конференциях (Флоренция, Италия, 1995; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 2001, 2004, 2007, 2010); VI Международной конференции по проблемам динамики взаимодействия деформируемых сред (Горис, Армения, 2008), Всемирных конгрессах по биомеханике (Мюнхен, 2006; Сингапур, 2010), а также на других научных конференциях и семинарах.

Благодарности. Исследования, вошедшие в работу, были поддержаны грантами РФФИ, Президента Российской Федерации для молодых учёных - кандидатов наук, INTAS, MRC, Daresbury Laboratory, NATO, ESRF и EMBL, стипендиями МГУ и Института механики МГУ для молодых талантливых учёных.

Автор считает своим долгом почтить память профессора С.А. Регирера, руководителя семинаров по биомеханике в Институте механики МГУ, чьё отношение к науке неизменно утверждало автора в правильности выбранного пути. Автор хотел бы выразить благодарность своим учителям и наставникам: профессору V. Lombardi и д.ф,-м.н. А.К. Цатуряну. Автор благодарит также академика РАН С.С. Григоряна за интерес к работе и обсуждение некоторых её результатов.

Эксперименты с использованием интактных мышечных клеток лягушки были выполнены совместно с М. Linari, V. Lombardi, G. Piazzesi и M. Reconditi (Universita di Firenze, Флоренция), эксперименты с использованием демембранизованных мышечных клеток кролика - совместно с С.Ю. Бершицким (Институт иммунологии и физиологии УрО РАН), А.К. Цатуряном и М.А. Ferenczi (Imperial College, Лондон). На разных этапах в работе принимали участие Д А. Шестаков, P. Panine, Т. Narayanan и V. Siththanandan, -всем им автор искренне признателен за сотрудничество.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АТФ (АТР) - аденозинтрифосфат; АДФ (ADP) - аденозиндифосфат; БДМ (BDM) - 2,3-бутандион моноксим; ГЛТ (GLH) - глутатион;

ДЛЦ (LCD) - домен лёгких цепей субфрагмента S1 миозина (см. S1); КД (CD) - каталитический домен субфрагмента S1 миозина; КФ (CP) - креатинфосфат; КФК (СРК) - креатинфосфокиназа;

МОПС (MOPS) - 3-(ТЧГ-морфолино)пропансульфоновая кислота;

ТЭС (TES) - N-трис [гидроксиметил]метил-2-аминоэтан сульфоновая кислота;

ЭГТА (EGTA) - этиленгликоль-бис-(Р-аминоэтил)-тетраацетат;

ЭДТА (EDTA) - этилендиамин-тетраацетат;

ЭДК (EDC) - этил-диметил-карбодиимид;

ХДТА (HDTA) - 1,6-гексаметилен диамин-тетраацетат;

То - напряжение, развиваемое интактным волокном на плато изометрического тетануса;

51 — субфрагмент-1 молекулы миозина;

52 - субфрагмент-2 молекулы миозина.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кубасова, Наталия Алексеевна

Основные результаты работы можно кратко сформулировать в следующем виде.

3. Построены структурные модели сократительного аппарата поперечно-полосатых мышц, позволяющие определять число и форму актин-миозиновых моторов в различных физиологических условиях на основе экспериментальных рентгенограмм.

4. С помощью разработанных структурных моделей определены основные характеристики миозинового мотора мышц:

- сила, развиваемая одной миозиновой головкой, составляет около 6 пН.

5. В результате анализа экспериментальных рентгенограмм, найдено соответствие между структурными состояниями миозиновой головки и различными биохимическими стадиями цикла гидролиза АТФ в ходе актин-миозинового взаимодействия в мышцах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в понимании принципов работы актин-миозиного мотора, многие детали механизма его действия остаются неизвестными. В частности, неизвестно, как именно происходит начальное связывание миозиновой головки с мономером актина, не выяснено, какие именно изменения формы миозиновой головки связаны с генерацией силы, когда и как происходит сброс фосфата из активного центра миозиновой головки после расщепления АТФ. Современные методы биохимии, белковой кристаллографии и электронной микроскопии применимы только к таким объектам - растворам или кристаллам белков, быстрозамороженным образцам, используемым в электронной микроскопии, - в которых невозможно реализовать основную, механическую, функцию мышцы. В результате таких исследований были получены атомные структуры актина, S1, тропонина и тропомиозина, и модели актин-миозиновых комплексов или тонких нитей. При этом, нет уверенности в том, что структура, полученная кристаллизацией S1 в специальных условиях, соответствует конфигурации миозиновой головки, принимаемой ею in vivo. Скорости биохимических реакций, измеренные в растворах, не соответствуют их значениям в мышце, поскольку до 40 % свободной энергии гидролиза АТФ может запасаться в виде молекулярной упругой энергии, а затем высвобождаться в виде макроскопической механической работы. В результате этого в мышце скорости реакций зависят от напряжения, развиваемого миозиновыми головками. Эффективная концентрация белков в мышце недостижима в лабораторных исследованиях растворов белков.

Перечисленные соображения указывают на особое чрезвычайно важное место исследований интактных мышечных клеток и волокон с частично разрушенной мембраной, в которых механическая функция сохранена. Только в таких исследованиях можно выяснить, как на самом деле движутся молекулярные моторы и их отдельные детали в ходе мышечного сокращения.

Малоугловая рентгеновская дифракция не даёт столь высокого пространственного разрешения, как основные методы структурной биологии - белковая кристаллография и электронная микроскопия - и новые методы сканирующей зондовой микроскопии. Однако, в отличие от вышеназванных методов, этот метод позволяет исследовать живую систему и, не конкурируя с белковой кристаллографией и электронной микроскопией, обладает комплементарными им возможностями. Одновременная регистрация механических и структурных изменений в функционирующих мышечных клетках позволяет изучать связь между структурой и функцией актин-миозинового мотора в мышце, а также проверять различные гипотезы, предложенные на основе результатов других экспериментальных методов.

В то же время, количественная интерпретация рентгенодифракционных диаграмм -непростая задача, требующая разработки адекватных физико-математических моделей. Все модели, построенные в настоящей работе, основаны на методе прямого моделирования и базируются на современных достижениях белковой кристаллографии и электронной микроскопии. Сочетание доступных атомных структур актина, миозина, регуляторных белков тонкой нити и, в некоторых случаях, комплексов этих белков с физически обоснованными дополнительными предположениями об их взаимодействии позволяет построить модель с небольшим числом свободных параметров, которые затем можно определить из экспериментальных рентгенограмм. Как нам кажется, во многих случаях этот подход даёт исследователю больше содержательной информации, чем метод глобального поиска лучшего приближения к экспериментальным данным при большом количестве свободных параметров, зачастую превышающем возможности экспериментальных данных

Когда десять лет назад мы получили экспериментальные рентгенограммы одиночных интактных волокон в тетанусе, и на них невооруженным глазом было видно расщепление меридиональных рефлексов на несколько пиков, казалось, что эти данные несут новую точную информацию о структуре миозиновых головок Используя результаты ранних работ В В Леднева и С Б Малинчика о строении толстых нитей скелетной мышцы и о положении миозиновых головок в расслабленной мышце, мы построили модель, воспроизводящую расщепление меридиональных миозиновых рефлексов мышцы в активном сокращении и в ригоре, и применили ее для разработки метода рентгеновской интерферометрии - измерения осевых перемещений присоединенных головок Оказалось, что теоретическая точность метода необыкновенно высока, 0,1-0,2 нм, но он позволяет получить однозначные результаты только в тех условиях, когда все миозиновые головки находятся в одном структурном состоянии, т е в примерно одинаковой пространственной конфигурации Более детальный анализ модели показал границы применимости этого метода В тех случаях, когда его использование корректно, он представляет собой высокоточный измерительный инструмент, а других случаях дает важную дополнительную информацию об осевых молекулярных перемещениях величиной до 0,2 нм, что намного меньше, чем пространственное разрешение малоугловой дифракции на мышцах и одиночных мышечных волокнах

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Кубасова, Наталия Алексеевна, Москва

1. Бершицкий С Ю Исследование механизма генерации силы в мышце Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург, 2005 178 с

2. БэгшоуК Мышечное сокращение М Мир, 1985 159 с

3. Вайнштейн Б К Дифракция рентгеновских лучей на цепных молекулах М Издательство АН СССР, 1963 372 с

4. Воротников А В , Кубасова Н А , Цатурян А К Молекулярный мотор мышц // Природа -2010 № 4 - С 29-36

5. Гусев Н Б Молекулярные механизмы мышечного сокращения // Соросовский образовательный журнал 2000 - Т 6, № 8 - С 24-32

6. Кубасова Н А Исследование механических и структурных свойств миозиновых поперечных мостиков в скелетной мышце Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук М,1999 112с

7. Кубасова Н А Оценка моделей тонкой нити саркомера по рентгенограммам расслабленной мышцы кролика под малыми углами // Биофизика 2008 - Т 53 - С 936-942

8. Кубасова Н А , Бершицкий С Ю , Ференцзи М А , Панин П , Нараянан Т , Цатурян А К Рентгенодифракционные измерения осевых перемещений миозиновых головок в мышце во время силогенерации, вызванной скачком температуры // Молек Биол -2009 Т 43 - С 689-699

9. Кубасова Н А , Бершицкий С Ю , Цатурян А К Математическая модель механических ответов сокращающихся мышечных волокон на скачки температуры // Биофизика -2009 -Т 54 -С 718-725

10. Ландау Л Д, Лифшиц Е М Теоретическая физика М Наука, 1987 Т VII Теория упругости

11. Малинчик С Ю , Леднев В В Интерпретация картины меридиональной рентгеновской дифракции от скелетной мышцы лягушки в состоянии покоя // Доклады Академии наук СССР 1986 -Т 289 - С 1258-1262

12. Малинчик С Ю , Леднев В В Интерпретация рентгеновской дифракционной картины от скелетной мышцы в состоянии покоя Трехмерная модель миозиновой нити // Доклады Академии наук СССР 1987 - Т 293 - С 238-242

13. Пинаев Г П Структура и функции белков сократительных систем Л Наука, 1987 -180с

14. Поглазов Б Ф , Левицкий Д И Миозин и биологическая подвижность // М Наука, 1982 160 с

15. Подлубная 3 А Минорные белки толстых нитей //Веб "Структура и функции белков сократительных систем" Л,- 1987 С 32-70

16. Соловьева О Э, Кацнельсон Л Б Коновалов ПВ, Мархасин ВС Математическое моделирование электрических и механических явлений в миокарде // Современные проблемы биомеханики. М МГУ -2006 Вып 11 -С 131-151

17. Филатов В Л, Катруха А Г, Буларгина Т В, Гусев Н Б Тропонин структура, свойства и механизм функционирования //Биохимия 1999 -Т 64 -С 1155-1174

18. Цатурян А К Бершицкий С Ю , Кубасова Н А, Шворина Е Н , Шестаков Д А Молекулярная механика мышечного сокращения // Современные проблемы биомеханики. М МГУ -2006 -Вып 11 -С 120-130

19. Энгельгардт В А, Любимова М Н Аденозинтрифосфотаза и миозин мышц // Биохимия 1939 - № 4 - С 716-736

20. Al-Khayat Н A, Hudson L, Reedy М К, Irving Т С, Squire J М Myosin head configuration in relaxed insect flight muscle X-ray modeled resting cross-bridges in a pre-powerstroke state are poised for actin binding //Biophys J -2003 -V 85-P 1063-1079

21. Al-Khayat H A , Morris E P , Kensler R W, Squire J M Myosin filament 3D structure in mammalian cardiac muscle //J Struct Biol -2008 -V 163 -P 117-126

22. Al-Khayat H A, Squire J M Refined structure of bony fish muscle myosin filaments from low-angle X-ray diffraction data //J Struct Biol -2006 -V 155 -P 218-229

23. Bagni, M A, Cecchi G, Griffiths P J, Maeda Y, Rapp G, Ashley С С Lattice spacing changes accompanying isometric tension development in intact single muscle fibres // Biophys J 1994 -V 67 -P 1965-1975

24. Bailey К Tropomyosin a new asymmetric protein component of the muscle fibril // Biochem J 1948 - V 43 -P 271-279

25. Bauer С В , Holden H M, Thoden J В , Smith R, Rayment I X-ray structures of the apo and MgATP-bound states of Dictyostehum discoideum myosin motor domain // J Biol Chem -2000 -V 275 -P 38494-38499

26. Bennett P M, Tsaturyan A, Bershitsky S Rapid cryofixation of rabbit muscle fibres after a temperature jump //J Microsc -2002 -V 206 -P 152-160

27. Berger C L, Craik J S , Trentham D R, Corrie J E, Goldman Y E Fluorescence polarization of skeletal muscle fibres labeled with rhodamine isomers on the myosin heavy chain // Biophys J 1996 -V 71 -P 3330-3343

28. Bershitsky S Y, Ferenczi M A, Koubassova N A, Tsaturyan A K Insight into the actin-myosin motor from x-rav diffraction on muscle //Front Biosci 2009 -V 14 -P 31883213

29. Bershitsky S Y, Koubassova N A, Bennett P M, Ferenczi M A, Shestakov D A, Tsaturyan A K Myosin heads contribute to the maintenance of filament order in relaxed rabbit muscle //Biophys J -2010 -V 99 -P 1827-1834

30. Bershitsky S Y , Tsaturyan A K Effect of joule temperature jump on tension and stiffness of skinned rabbit muscle fibers //Biophys J 1989 - V 5 -P 809-816

31. Bershitsky S Y, Tsaturyan A K Tension responses to Joule temperature jump in skinned rabbit muscle fibres //J Physiol 1992 -V 447 -P 425-448

32. Bershitsky S Y , Tsaturyan A K Force generation and work production by covalently cross-linked actin-myosin cross-bridges in rabbit muscle fibers // Biophys J 1995 - V 69 - P 1011-1021

33. Bershitsky S Y, Tsaturyan A K The elementary force generation process probed by temperature and length perturbations in muscle fibres from the rabbit // J Physiol 2002 - V 540 -P 971-988

34. Bershitsky S. Y., Tsaturyan A. K, Bershitskaya O. N., Machanov G. I., Brown P., Burns R, Ferenczi M. A. Muscle force is generated by myosin heads stereospecifically attached to actin. //Nature. 1997 -V. 388-P. 186-190.

35. Bloom W., Fawcett D. W. A Textbook of Histology. Philadelphia. W.B. Saunders Co., 1975. -2nd edn.

36. Boesecke P., Diat O., Rasmussen B. High-brilliance beamline at the European Synchrotron Radiation Facility. //Rev. Sei. Instrum. 1995. -V. 66. - P. 1636-1638.

37. Bordas J., Svensson A., Rothery M., Lowy J., Diakun G. P., Boesecke P. Extensibility and symmetry of actin filaments in contracting muscles. // Biophys. J. 1999. - V. 77. - P. 31973207.

38. Brenner B. Muscle mechanics and biochemical kinetics. Molecular mechanics and biochemical kinetics. // Molecular mechanics in muscle contraction. / Macmillan Press, 1990.

39. Brenner B., Yu L. Structural changes in the actomyosin cross-bridges associated with force generation. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. -V. 90. - P. 5252-5256.

40. Brenner B., Yu L. C , Podolsky R. J. X-ray diffraction evidence for cross-bridge formation in relaxed muscle fibers at various ionic strengths. // Biophys. J. 1984. - V. 46. - P. 299-306.

41. Brenner B , Schoenberg M , Chalovich J M, Greene L E , Eisenberg E Evidence for cross-bridge attachment in relaxed muscle at low ionic strength // Proc Natl Acad Sci USA -1982 -V 79 -P 7288-7291

42. Brenner B , Xu S , Chalovich J M, Yu L C Radial equilibrium length of actomyosin cross-bridges in muscle // Biophys J 1996 -V 71 -P 2751-2758

43. Cambridge G W , Hemes J A new versatile transduser system // J Physiol 1959 - V 149 -P 2-3

44. Cecchi G, Colomo F, Lombardi V A loudspeaker servo-system for determination of mechanical characteristics of isolated muscle fibres //Boll Soc Ital Biol Sper 1976 -V 52 -P 733-736

45. Cecchi G, Griffiths P , Bagni M, Ashley C , Maeda Y Time resolved changes in equatorial x-ray diffraction and stiffness during rise of tetanic tension in intact length-clamped single muscle fibres //Biophys J -1991 -V 59 -P 1273-1283

46. Clarke M L, Rodger C D , Tregear R T Modification of crossbridge states by ethylene glycol in insect flight muscle //J Muscle Res Cell Motil 1984 -V 5 -P 81-96

47. Cochran W, Crick F H C , Vand V The structure of the synthetic polypeptides I The transform of atoms on a helix //Acta Cryst 1952 - V 5 -P 581-586

48. Conibear P B , Bagshaw C R, Fajer P G, Kovacs M, Malnasi-Csizmadia A Myosin cleft movement and its coupling to actomyosin dissociation //Nat Struct Biol 2003 -V 10 -P 831-835

49. Cooke R Stress does not alter the conformation of a domain of the myosin cross-bridge in rigor muscle fibres //Nature -1981 -V 294 -P 570-571

50. Cooke R The mechanism of muscle contraction //CRC Crit Rev Biochem 1986 - V 21 -P 53-118

51. Cooke R , Crowder M S , Thomas D D Orientation of spin labels attached to cross-bridges in contracting muscle fibers //Nature 1982 -V 300 -P 776-778

52. Cooke R , Crowder M S , Wendt C H Muscle cross-bridges Do they rotate? // Contracting Mechanism in Muscle /Eds GH Pollack and H Sugi NY, London, Plenum Press, 1984 -P 413-423

53. Cooke R, Franks K All myosin heads form bonds with actin in rigor rabbit skeletal muscle // Biochemistry 1980 -V 19 -P 2265-2269

54. Cope M, Whisstock J , Rayment I, Kendrick-Jones J Conservation within the myosin motor domain implications for structure and function //Structure 1996 - V 4 -P 969-987

55. Coureux P -D , Wells A L , Menetrey J , Yengo C M , Morris C A , Sweeney H L , Houdusse A A structural state of the myosin V motor without bound nucleotide // Nature 2003 - V 425 -P 419-423

56. Craig R Structure of A-segments from frog and rabbit skeletal muscle //J Mol Biol -1977 -V 109 -P 69-81

57. Dias Banos F G, Bordas J , Lowy J , Svensson A Small segmental rearrangements in myosin head can explain force generation in muscle //Biophys J 1996 -V 71 -P 576-589

58. Dobbie I, Linari M, Piazzesi G, Reconditi M, Koubassova N , Ferenczi M A , Lombardi V , Irving M Elastic bending and active tilting of myosin heads during muscle contraction // Nature 1998 -V 396 -P 383-387

59. Dominguez R , Freyzon Y , Trybus К M , Cohen С Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain visualization of the pre-power stroke //Cell 1998 -V 94 -P 559-571

60. Ebashi S Third component participating in the superprecipitation of "natural actomyosin" // Nature 1963 -V 200 -P 1010

61. Ebashi S , Ebashi F A new protein component participating in the superprecipitation of myosin В //J Biochem 1964 -V 55 -P 604-613

62. Ebashi S , Kodama A A new protein factor promoting aggregation of tropomyosin // J Biochem 1965 -V 58 -P 107-108

63. Ebashi S , Kodama A Interaction of troponin with F-actrn in the presence of tropomyosin // J Biochem 1966 -V 59 -P 425-426

64. Egelman E H The structure of F-actin //J Muscle Res Cell Motil 1985 -V 6 -P 129151

65. Engelhardt W A , Lyubimova M N Myosin and adenosine triphosphatase //Nature 1939 -V 144 -P 668-669

66. Farman G P , Allen E J, Gore D , Irving T C, de Tombe P P Interfilament spacing is preserved during sarcomere length isometric contractions in rat cardiac trabeculae // Biophys J -2007 -V 92 -P L73-L75

67. Ferenczi M A , Bershitsky S Y , Koubassova N , Siththanandan V , Helsby W I, Panine P , Roessle M , Narayanan T . Tsaturyan A K The "roll and lock" mechanism of force generation in muscle //Structure -2005 -V 13 -P 131-141

68. Finer J T, Simmons R M, Spudich J A Single myosin molecule mechanics piconewton forces and nanometre steps //Nature 1994 -V 368 -P 113-119

69. Fisher A J , Smith C A , Thoden J B , Smith R , Sutoh K , Holden H M, Rayment I X-ray structures of the myosin motor domian of Dictyostehum discoideitm complexed with MgADP BeFx and MgADP A1F4 //Biochemistry 1995 -V 34 -P 8960-8972

70. Ford L E , Huxley A F, Simmons R M Tension responses to sudden length change in stimulated frog muscle fibres near slack length //J Physiol 1977 -V 269 -P 441-515

71. Ford L E , Huxley A F , Simmons R M Tension transients during steady shortening of frog muscle fibres //J Physiol 1985 -V 361 -P 131-150

72. Ford L E , Huxley A F , Simmons R M The relation between stiffness and filament overlap in stimulated frog muscle fibres //J Physiol -1981 -V 311 -P 219-249

73. Fortune N S , Geeves M A, Ranatunga K W Pressure sensitivity of active tension in glycerinated rabbit psoas muscle fibres effects of ADP and phosphate // J Muscle Res Cell Motil 1989 -V 10 -P 113-123

74. Foth B J , Goedecke M C , Soldati, D New insights into myosin evolution and classification //Proc Natl Acad Sci USA -2006 -V 103 -P 3681-3686

75. Frye J, Klenchin V A, Rayment I Structure of the tropomyosin overlap complex from chicken smooth muscle insight into the diversity of N-terminal recognition // Biochemistry -2010 -V 49 -P 4908-4920

76. Fuchs F , Martyn D A Length-dependent Ca(2+) activation in cardiac muscle some remaining questions Hi Muscle Res Cell Motil -2005 -V 26 -P 199-212

77. Galkin V , Orlova A, Cherepanova O Lebart M C , Egelman E H High-resolution cryo-EM structure of the F-actin-fimbrin/plastin ABD2 complex // Proc Natl Acad Sci USA 2008 -V 105 -P 1494-1498

78. Geeves M A , Holmes K C The molecular mechanism of muscle contraction // Adv Protein Chem -2005 -V 71 -P 161-193

79. Gordon A M, Huxley A F, Julian F J The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres //J Physiol 1966 -V 184 -P 170-192

80. Griffiths P J , Bagm M A , Colombini B , Amenitsch H , Bernstorff S , Ashley C C , Cecchi G Changes in myosin SI orientation and force induced by a temperature increase // Proc Natl Acad Sci USA -2002 -V 99 -P 5384-5389

81. Gu J, Yu L C X-ray diffraction of helices with arbitrary periodic ligand binding // Acta Crystallogr D -1999 V 55 -P 2022-2027

82. Gu J, Xu S , Yu L C A model of cross-bridge attachment to actin in the A*M*ATP state based on x-ray diffraction from permeabilized rabbit psoas muscle // Biophys J 2002 - V 82 -P 2123-2133

83. Hanson J , Huxley H E Structural basis of the cross-striations in muscle // Nature 1953 -V 172 -P 530-532

84. Hanson J , Lowy J The structure of F-actin and actin filaments isolated from muscle // J Mol Biol 1963 -V 6 -P 46-60

85. Harford J , Squire J "Crystalline" myosin cross-bridge array in relaxed bony fish muscle Low-angle x-ray diffraction from plaice fin muscle and its interpretation // Biophys J 1986 - V 50 -P 145-155

86. Harford J J , Squire J M Evidence for structurally different attached states of myosin cross-bridges on actin during contraction of fish muscle //Biophys J 1992 -V 63 -P 387-396

87. Harford J J, Squire J M Time-resolved diffraction studies of muscle using synchrotron radiation //Rep Prog Phys 1997 -V 60 -P 1723-1787

88. Haselgrove J X-ray evidence for a conformational change in the actin-containing filaments of vertebrate striated muscle //Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1972 -V 37 -P 341352

89. Haselgrove J C X-ray evidence for conformational changes in the myosin filaments of vertebrate striated muscle //J Mol Biol 1975 -V 92 -P 113-143

90. Haselgrove J C , Huxley H E X-ray evidence for radial cross-bridge movement and for the sliding filament model in actively contracting skeletal muscle // J Mol Biol 1973 - V 77 -P 549-568

91. Haselgrove J C , Reedy M K Modelling rigor cross-bridge patterns in muscle I Initial studies of the rigor lattice of insect flight muscle //Biophys J 1978 -V 24 -P 713-728

92. Higuchi H , Yanagida T , Goldman Y E Compliance of thin filaments in skinned fibers of rabbit skeletal muscle //Biophys J 1995 -V 69 -P 1000-1010

93. Hirose K , Franzini-Armstrong C , Goldman Y E , Murray J M Structural changes in muscle crossbridges accompanying force generation //J Cell Biol 1994 -V 127 -P 763-778

94. Holmes K C The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction //Curr Biol 19971. V 7-P R112-118

95. Holmes K C , Angert I, Kull F J , Jahn W , Schroeder R R Electron cryo-microscopy shows how strong binding of myosin to actin releases nucleotide // Nature 2003 - V 425 - P 423-427

96. Holmes K C, Popp D , Gebhard W, Kabsch W Atomic model of the actin filament // Nature 1990 -V 347 -P 44-49

97. Holmes K C, Tregear R T, Barrington Leigh J Interpretation of the low angle x-ray diffraction from insect flight muscle in rigor //Proc R Soc B 1980 -V 207 -P 13-33

98. Horowits R, Podolsky R J The positional stability of thick filaments in activated skeletal muscle depends on sarcomere length evidence for the role of titin filaments // J Cell Biol -1987 -V 105 -P 2217-2223

99. Hoskins B K , Ashley C C , Pelc R , Rapp G, Griffiths, P J Time-resolved equatorial X-ray diffraction studies of skinned muscle fibres during stretch and release //J Mol Biol 19991. V 290 -P 77-97

100. Houdusse A , Kalabokis V N , Himmel D , Szent-Gyorgyi A G, Cohen C Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP a novel conformation of the myosin head //Cell 1999 -V 97 -P 459-470

101. Houdusse A, Szent-Gyorgyi A G, Cohen C Three conformational states of scallop myosin SI //Proc Natl Acad Sci USA -2000 -V 97 -P 11238-11243

102. Hudson L , Harford J J , Denny R C , Squire J M Myosin head configuration in relaxed fish muscle resting state myosin heads must swing axially by up to 150A or turn upside down to reach rigor //J Mol Biol - 1997 -V 273 -P 440-455

103. Hudson L, Harford J J, Denny R C, Squire J M 3D Structure of fish muscle myosin filaments //J Struct Biol 1997 -V 137 -P 154-163

104. Huxley A F Muscle structure and theories of contraction //Prog Biophys Biophys Chem -1957 V 7 - P 255-318

105. Huxley A F Reflections on Muscle // The Sherrington Lectures XIV / Liverpool. University Press, 1980

106. Huxley A F Cross-bridge action present views, prospects, and unknowns // J Biomech -2000 -V 33 -P 1189-1195

107. Huxley A F , Lombardi V A sensitive force transducer with resonant frequency 50 kHz // J Physiol 1980 -V 305 -P 15-16

108. Huxley A F, Lombardi V, Peachey L D A system for fast recording of longitudinal displacement of a striated muscle fibre //J Physiol -1981 -V 317 P 12-13P

109. Huxley A F , Niedergerke R M Structural changes in muscle during contraction // Nature -1954 -V 173 -P 971-973

110. Huxley A F , Simmons R M Proposed mechanism of force generation in striated muscle // Nature -1971 -V 233 -P 533-538

111. Huxley H Low-angle X-ray diffraction studies on muscle //Disc Faraday Soc -1951 -V 11 -P 148

112. Huxley H Investigations in biological structures by X-ray methods The structure of muscle PhD Thesis University of Cambridge, Cambridge, UK , 1952

113. Huxley H E X-ray analysis and the problem of muscle //Proc R Soc Lond B 1953 -V 141 -P 59-62

114. Huxley H E Electron microscope studies of the organisation of the filaments in striated muscle // Biochim Biophys Acta 1953 -V 12 -P 387-394

115. Huxley H E The double array of filaments in cross-striated muscle // J Biophys Biochem Cytol 1957 - V 3 -P 631-648

116. Huxley H E The contraction of muscle //Sci Am 1958 -V 199 -P 67-72

117. Huxley H E Structural difference between resting and rigor muscle, evidence from intensity changes in the low angle equatorial x-ray diagram // J Mol Biol 1968 - V 37 - P 507520

118. Huxley H E The mechanism of muscular contraction //Science 1969 -V 164 -P 13561365

119. Huxley H Structural changes in the actin- and myosin-containing filaments during contraction //Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1972 -V 37 -P 361-376

120. Huxley H E A personal view of muscle and motility mechanisms // Annu Rev Physiol -1996 -V 58 -P 1-19

121. Huxley H E , Brown W The low-angle x-ray of vertebrate striated muscle and its behaviour during contraction and rigor //J Mol Biol 1967 -V 30 -P 383-434

122. Huxley H E, Faruqi A R, Kress M, Bordas J, Koch M H J Time-resolved x-ray diffraction studies of the myosin layer line reflections during muscle contraction // J Mol Biol 1982 -V 158 -P 637-684

123. Huxley H E, Hanson J Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation // Nature 1954 - V 173 - P 973-976

124. Huxley H E , Holmes K C Development of synchrotron radiation as a high-intensity source for x-ray diffraction //J Synchrotron Radiat 1997 -V 4 -P 366-379

125. Huxley H E , Kress M Crossbridge behaviour during muscle contraction // J Muscle Res Cell Motil 1985 - V 6 -P 153-161

126. Huxley H , Reconditi M, Stewart A , Irving T X-ray interference studies of crossbridge action in muscle contraction evidence from quick releases // J Mol Biol 2006 - V 363 - P 743761

127. Huxley H , Reconditi M, Stewart A , Irving T X-ray interference studies of crossbridge action in muscle contraction evidence from muscles during steady shortening // J Mol Biol 2006 -V 363 -P 762-772

128. Huxley H E , Simmons R M , Faruqi A R, Kress M , Bordas J , Koch M H Changes in the X-ray reflections from contracting muscle during rapid mechanical transients and their structural implications //J Mol Biol 1983 -V 169 -P 469-506

129. Huxley H E, Stewart A, Sosa H, Irving T X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle // Biophys J 1994 - V 167 -P 2411-2421

130. Irving M, Lombardi V , Piazzesi G, Ferenczi M A Myosin head movements are synchronous with the elementary force-generating process in muscle //Nature 1992 -V 354 -P 156

131. Irving M, Piazzesi G, Lucn L, Sun Y B, Harford J J, Dobbie I M, Ferenczi M A, Reconditi M, Lombardi V Conformation of the myosin motor during force generation in skeletal muscle // Nat Struct BioL 2000 - V 6 - P 482-485

132. Iwamoto H , Oiwa K , Kovács M, Sellers J R, Suzuki T , Wakayama J , Tamura T , Yagi N , Fujisawa T Diversity of structural behavior in vertebrate conventional myosins complexed with actin //J Mol Biol -2007 -V 369 -P 249-264

133. Iwamoto H, Oiwa K, Suzuki T, Fujisawa T X-ray diffraction evidence for the lack of stereospecific protein interactions in highly activated actomyosin complex // J Mol Biol -2001 -V 305 -P 863-887

134. Iwamoto H, Wakayama J, Fujisawa T, Yagi N Static and dynamic x-ray diffraction recordings from living mammalian and amphibian skeletal muscles // Biophys J 2003 - V 85 -P 2492-2506

135. Juanhuix J, Bordas J, Campmany J, Svensson A, Bassford M L, Narayanan T Axial disposition of myosin heads in isometrically contracting muscles // Biophys J 2001 - V 80 -P 1429-1441

136. Kabsch W , Mannherz H G , Suck D , Pai E F , Holmes K C Atomic structure of the actin DNAaseI complex //Nature 1990 -V 347 -P 37-44

137. Kishino A, Yanagida T Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles //Nature 1988 -V 334 -P 74-76

138. Klug A., Crick F. H. C., Wyckoff H. W. Diffraction by helical structures. // Acta Cryst. -1958. -V. 11. P. 199-213.

139. Kojima H., A. Ishijima, T. Yanagida. Direct measurement of stiffness of single actin filaments with and without tropomyosin using in vitro nano-manipulation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 1994. - Vol. 91. - P. 12962-12966.

140. Koubassova N. A. BS 2D X-ray diffraction data processing program. // Fibre Diffraction Review. - 2003. -V. 11. - P. 131.

141. Koubassova N. A., Bershitsky S. Y., Ferenczi M. A., Tsaturyan A. K. Direct modeling of X-ray diffraction pattern from contracting skeletal muscle. // Biophys. J. 2008. - V. 95. - P. 2880-2894.

142. Koubassova N. A., Tsaturyan A. K. Direct modeling of x-ray diffraction pattern from skeletal muscle in rigor. // Biophys. J. 2002. - V. 83. - P. 1082-1097.

143. Kraft T., Mattei T., Brenner B. Structural features of force-generating cross-bridges. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. -V. 453. - P. 289-296.

144. Kraft T., Mattei T., Radocaj A., Piep B , Nocula C., Furch M., Brenner B. Structural features of cross-bridges in isometrically contracting skeletal muscle. // Biophys. J. 2002. - V. 82. - P. 2536-2547.

145. Kraft T., Xu S., Brenner B., Yu L. C. The effect of thin filament activation on the attachment of weak binding cross-bridges. A two-dimensional x-ray diffraction study on single muscle fibers. //Biophys. J. 1999. -V. 76. -P. 1494-1513.

146. Kress M., Huxley H. E., Faruqi A. R, Hendrix G. Structural changes during activation of frog muscle studied by time-resolved x-ray diffraction. // J. Mol. Biol. 1986. - V. 188. - P. 325342.

147. Krön S J , Spudich J A Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface //Proc Natl Acad Sei USA 1986 -V 83 -P 6272-6276

148. Kuehne W Untersuchungen über Bevegungen und Veränderungen der contraction Substanzen // Archiv fur Anatomie, Physiologie und wissenschaftliche Medicrn 1859 - P 748-835

149. Lewis R A , Helsby W I, Jones A O , Hall C J , Parker B , Sheldon J , Clifford P , Hillen M , Sumner I, Fore N S , Jones R W M, Roberts K M The "RAPID" high rate large area X-ray detector system //Nucl Instrum Meth A 1997 -V 392 -P 32-41

150. Li X E, Holmes K C, Lehman W, Jung H, Fischer S The shape and flexibility of tropomyosin coiled coils implications for actin filament assembly and regulation // J Mol Biol -2010 -V 395 -P 327-339

151. Linari M, Aiazzi A, Dolfi M, Piazzesi G, Lombardi V A system for studying tension transients in segments of skinned muscle fibres from rabbit psoas // J Physiol 1993 - V 473 -P 8

152. Linari M, Brunello E , Reconditi M, Sun Y B , Panine P , Narayanan T , Piazzesi G, Lombardi V , Irving M The structural basis of the increase in isometric force production with temperature in frog skeletal muscle // J Physiol 2005 - V 567 - P 459-469

153. Linari M , Caremani M , Piperio C , Brandt P , Lombardi V Stiffness and fraction of myosin motors responsible for active force in permeabilized muscle fibers from rabbit psoas // Biophys J -2007 -V 92 -P 2476-2490

154. Linari M , Dobbie I , Reconditi M , Koubassova N , Irving M , Piazzesi G , Lombardi V The stiffness of skeletal muscle in isometric contraction and rigor the fraction of myosin heads bound to actin //Biophys J 1998 -V 74 -P 2459-2473

155. Liu J , Wu S , Reedy M C , Winkler H , Lucaveche C , Cheng Y , Reedy M K , Taylor K A Electron tomography of swollen rigor fibers of insect flight muscle reveals a short and variably angled S2 domain //J Mol Biol -2006 -V 362 -P 844-860

156. Lombardi V , Piazzesi G The contractile response during steady lengthening of stimulated frog muscle fibres //J Physiol 1990 -V 431 -P 141-171

157. Lombardi V , Piazzesi G, Linari M Rapid regeneration of the actin-myosin power stroke in contracting muscle //Nature 1992-V 355 -P 638-641

158. Lombardi V , Piazzesi G , Ferenczi M A , Thirlwell H , Dobbie I, Irving M Elastic distortion of myosin heads and repriming of the working stroke in muscle //Nature 1995 -V 374 -P 553-555

159. Lorenz M, Popp D , Holmes K C Refinement of the F-actin model against X-ray fiber diffraction data by the use of a directed mutation algorithm //J Mol Biol 1993 -V 234 -P 826-836

160. Lovell S J , Knight P J , Harrington W F Fraction of myosin heads bound to thin filaments in rigor fibnlls from insect flight and vertebral muscle //Nature -1981 -V 293 -P 664-666

161. Luther r K, Squire J M Three-dimensional structure of the vertebrate muscle A-band II The myosin filament superlattice //J Mol Biol 1980 -V 141 -P 409-439

162. Luther P K , Squire J M , Forey P L Evolution of the simple lattice and superlattice A-band in vertebrate skeletal muscle //J Morphol 1996 -V 229 -P 329-335

163. Lymn R W, Cohen G H Equatorial x-ray reflections and cross-arm movement in skeletal muscle //Nature 1975 -V 258 -P 770-772

164. Lymn R W , Taylor E W Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomyosin // Biochemistry -1971 -V 10 -P 4617-4624

165. Malinchik S B , Lednev V V Interpretation of the x-ray diffraction pattern from relaxed skeletal muscle and modelling of the thick filament structure // J Muscle Res Cell Motil -1992 -V 13 -P 406-419

166. Malinchik S , Xu S , Yu L C Temperature-induced structural changes in the myosin thick filament of skinned rabbit psoas muscle //Biophys J. 1997 -V 73 -P 2304-2312

167. Malinchik S , Yu L C Analysis of equatorial x-ray diffraction pattern from muscle fibers factors that affect the intensities //Biophys J 1995 -V 68 -P 2023-2031

168. Manstem D J , Ruppel K M, Spudich J A Expression and characterization of a functional myosin head fragment in Dictyostelium discoideum //Science 1989 -V 246 -P 656-658

169. Margossian S S , Lowey S Substructure of the myosin molecule III Preparation of single-headed derivatives of myosin //J Mol Biol 1973 -V 74 -P 301-311

170. Margossian S S , Lowey S Substructure of the myosin molecule IV Interactions of myosin and its subfragments with adenosine triphosphate and F-actin // J Mol Biol 1973 - V 74 -P 313-330

171. Matsubara I, Goldman Y, Simmons R Changes in the lateral filament spacing of skinned muscle fibres when crossbndges attach //J Mol Biol 1984 -V 173 -P 15-33

172. Matsubara I , Yagi N Movements of cross-bridges during and after slow length changes in active frog skeletal muscle //J Physiol 1985 -V 361 -P 151-163

173. Matsubara I, Yagi N, Hashizume H Use of an X-ray television for diffraction of the frog striated muscle //Nature 1975 -V 255 -P 728-729

174. Matsubara 1, Yagi N , Miura H , Ozeki M, Izumi T Intensification of the 5 9-nm actin layer line in contracting muscle //Nature 1984 -V 312 -P 471-473

175. McKillop D F, Geeves M A Regulation of the interaction between actin and myosin subfragment 1 evidence for three states of the thin filament // Biophys J 1993 - V 65 - P 693-701

176. McLaughlin R J Systematic design of cantilever beams for muscle research // J Appl Physiol 1977 -V 42 -P 786-794

177. Mendelson R, Morris E P The structure of the acto-myosin subfragment 1 complex results of searches using data from electron microscopy and x-ray crystallography // Proc Natl Acad Sci USA 1997 -V 94 -P 8533-8538

178. Miller A , Tregear R T Structure of insect fibrillar flight muscle in the presence and absence of ATP //J Mol Biol 1972 -V 70 -P 85-104

179. Molloy J E , Burns J E , Kendrick-Jones J , Tregear R T , White DCS Movement and force produced by a single myosin head //Nature 1995 -V 378 -P 209-212

180. Nishiye E , Somlyo A V , Torok K , Somlyo A P The effect of MgADP on cross-bridge kinetics a laser flash photolysis study of guinea pig smooth muscle // J Physiol 1993 - V 460 -P 247-271

181. Oda T , Iwasa M , Aihara T , Maeda Y , Narita A The nature of the globular- to fibrous-actin transition //Nature -2009 -V 457 -P 441-445

182. Oda T , Makino K, Yamashita I, Namba K, Maeda Y The helical parameters of F-actin precisely determined from X-ray fiber diffraction of well-oriented sols // Results Probl Cell Differ -2001 -V 32 -P 43-58

183. Oda T, Namba K, Maeda Y Position and orientation of phalloidin in F-actin determined by X-ray fiber diffraction analysis // Biophys J 2005 - V 88 - P 2727-2736

184. Padron R, Alamo L , Murgich J , Craig R J Towards an atomic model of the thick filaments of muscle //J Mol Biol 1998 -V 275 -P 35-41

185. PageS G, Huxley H E Filament lengths in striated muscle //J Cell Biol 1963 -V 19 -P 369-390

186. Parry D A , Squire J M Structural role of tropomyosin in muscle regulation analysis of the x-ray diffraction patterns from relaxed and contracting muscles // J Mol Biol 1973 - V 75 -P 33-55

187. Perry S V Vertebrate tropomyosin distribution, properties and function // J Muscle Res Cell Motil -2001 -V 22 -P 5-49

188. Piazzesi G , Lombardi V , Ferenczi M A , Thirlwell H , Dobbie I, Irving M Changes in the X-ray diffraction pattern from single, intact muscle fibers produced by rapid shortening and stretch // Biophys J 1995 -V 68S -P 92-98

189. Piazzesi G, Reconditi M, Koubassova N , Decostre V, Linari M, Lucn L , Lombardi V Temperature dependence of the force-generating process in single fibres from frog skeletal muscle //J Physiol -2003 -V 549 -P 93-106

190. Piazzesi G, Reconditi M, Linari M, Lucn L, Sun Y B , Narayanan T, Boesecke P, Lombardi V , Irving M Mechanism of force generation by myosin heads in skeletal muscle // Nature -2002 -V 415 -P 659-662

191. Pirani A, Vinogradova M V, Curmi P M G, King W A, Fletterick R J, Craig R, Tobacman L S , Xu C, Hatch V, Lehman W An atomic model of the thin filament in the relaxed and Ca2+-activated states //J Mol Biol -2006 -V 357 -P 707-717

192. Poole K J V , Lorenz M, Ellison P , Evans G , Rosenbaum G , Boesecke P , Holmes K C , Cremo C R A low angle diffraction study of the structure of the actomyosin complex effects of ADP binding //J Muscle Res Cell Motil 1997 -V 18 -P 264

193. Popp D , Lednev V V, Jahn W Methods of preparing well-orientated sols of f-actin containing filaments suitable for X-ray diffraction//J Mol Biol 1987 -V 197 -P 679684

194. Rapp G, Schrumpf M, Wray J Kinetics of the structural changes in the myosin filaments of relaxed psoas fibres after a millisecond temperature jump // Biophys J -1991 V 59 -P 35

195. Rayment I, Holden H M, Whittaker M, Yohn C B , Lorenz M , Holmes K C , Milligan R A Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction // Science 1993 -V 261-P 50-58

196. Rayment I, Rypniewski W R , Schmidt-Base K , Smith R, Tomchick D R, Benning M M, Winkelmann D A, Wesenberg G, Holden H M Three dimensional structure of a subfragment-1 a molecular motor //Science 1993 -V 261-P 58-65

197. Reconditi M, Koubassova N, Linan M, Dobbie I, Narayanan T, Diat O, Piazzesi G, Lombardi V , Irving M The conformation of myosin head domains in rigor muscle determined by X-ray interference //Biophys J -2003 -V 85 -P 1098-1110

198. Reedy M K , Holmes K C , Tregear R T Induced changes in orientation of the cross-bridges of glycennated insect flight muscle //Nature 1965 -V 207 -P 1276-1280

199. Reisler E , Egelman E H Actin structure and function what we still do not understand // J Biol Chem -2007 -V 282 -P 36133-36137

200. Reubold T F, Eschenburg S , Becker A Kull F J, Manstein D J A structural model for actin-induced nucleotide release in myosin //Nat Struct Biol -2003 -V 10 -P 826-830

201. Rome E Relaxation of glycennated muscle low-angle x-ray diffraction studies //J Mol Biol 1972 -V 65 -P 331-345

202. Rome E Structural studies by x-ray diffraction of striated muscle permeated with certain ions and proteins //Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1972 -V 37 -P 331-339

203. Rome E , Offer G , Pepe F A X-ray diffraction of muscle labelled with antibody to C-protein //Nat New Biol 1973 -V 244 -P 152-154

204. Rosenbaum G , Holmes K C , Witz J Synchrotron radiation as a source for x-ray diffraction //Nature -1971 -V 230 -P 434-437

205. Schipiloff C , Daniliwsky A Ueber die nature der anisotropen Substanzen des quergestreiften Muscels und ihre räumliche // Vertheilung in Muscelbundel (Hoppe-Seyl Z ) 1881 - V 5 -P 349-365

206. Sheetz M P , Spudich J A Movement of myosin-coated fluorescent beads on actin cables in vitro //Nature 1983 -V 303 -P 31-35

207. Simmons R M, Finer J T , Chu S , Spudich J A Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap //Biophys J 1996 -V 70-P 1813-1822

208. Sjostrom M , Squire J M Fine structure of the A-band in cryo-sections The structure of the A-band of human skeletal muscle fibres from ultra-thin cryo-sections negatively stained // J Mol Biol 1977 -V 109 -P 49-68

209. Smith C A , Rayment I X-ray structure of the magnesium(II) ADP vanadate complex of the Dirtyostehum discoideum myosin motor domain to 1 9 A resolution // Biochemistry 1996 -V 35 -P 5404-5417

210. Squire J M The structural basis of muscle contraction 1981 Plenum, New York

211. Squire J M , Al-Khayat H A , Harford J J , Hudson L , Irving T , Knupp C , Reedy M K Modelling muscle motor conformations using low-angle X-ray diffraction // IEE Proc Nanobiotechnol -2003 -V 150 -P 103-110

212. Squire J , Cantino M, Chew M , Denny R, Harford J, Hudson L , Luther P Myosin rod-packing schemes in vertebrate muscle thick filaments //J Struct Biol 1998 -V 122 -P 128-138

213. Squire J, Harford J Muscle crossbridge positions from equatorial diffraction data an approach towards solving the phase problem // Adv Exp Med Biol 1984 - V 170 - P 221-236

214. Sqiure J M, Harford J J Actin filament organization and myosin head labelling patterns in vertebrate skeletal muscles in the rigor and weak binding states // J Muscle Res Cell Motil -1988 -V 9 -P 344-358

215. Squire J M, Harford J J, Al-Khayat H A Molecular movements in contracting muscle towards "muscle-the movie" //Biophys Chem 1994 -V 50 -P 87-96

216. Squire J M , Harford J J , Edman A C , Sjostrom M Fine structure of the A-band in cryo-sections III crossbridge distribution and the axial structure of the human C-zone // J Mol Biol 1982 -V 155 -P 467-494

217. Spudich J A , Huxley H E , Finch J Regulation of skeletal muscle contraction II Structural studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin // J Mol Biol -1972 -V 72 -P 619-632

218. Stehle R, Brenner B Cross-bridge attachment during high-speed active shortening of skinned fibers of the rabbit psoas muscle implications for cross-bridge action during maximum velocity of filament sliding //Biophys J -2000 -V 78 -P 1458-1473

219. Stewart M, McLachlan A D , Calladine C R A model to account for the elastic element in muscle crossbridges in terms of a bending myosin rod // Proc R Soc Lond B 1987 - V 229 -P 381-413

220. Straub F Actin Studies from the Inst of Med Chem Univ Szeged (reprinted by S Karger, Basel-New York), 1943, 2, 3

221. Sweeney H L, Houdusse A The motor mechanism of myosin V insights for muscle contraction //Philos Trans R Soc Lond B -2004 -V 359 -P 1829-1841

222. Sweeney H L , Houdusse A Myosin VI rewrites the rules for myosin motors //Cell -2010 -V 141 -P 573-582

223. Szent-Gyorgyi A Nature of the contraction of muscle //Nature -1951 -V 167 -P 380381

224. Takemori S , Yamaguchi M, Yagi N Effects of adenosine diphosphate on the structure of myosin cross-bridges an X-ray diffraction study on a single skinned frog muscle fibre // J Muscle Res Cell Motil 1995 -V 16 -P 571-577

225. Takezawa Y , Sugimoto Y . Wakabayashi K Extensibility of the actin and myosin filaments in various states of skeletal muscle as studied by X-ray diffraction // Adv Exp Med Biol -1998 -V 453 -P 309-316

226. Tamura T , Wakayama J, Fujisawa T , Yagi N, Iwamoto H Intensity of X-ray reflections from skeletal muscle thin filaments partially occupied with myosin heads effect of cooperative binding //J Muscle Res CellMotil -2004 -V 25 -P 329-335

227. Tamura T , Wakayama J , Inoue K , Yagi N , Iwamoto H Dynamics of thin-filament activation in rabbit skeletal muscle fibers examined by time-resolved x-ray diffraction // Biophys J -2009 -V 96 -P 1045-1055

228. Tawada K , Kimura M Stiffness of carbodnmide-crosslinked glycerinated muscle fibres in rigor and relaxing solutions at high salt concentrations // J Muscle Res Cell Motil 1986 - V 7 -P 339-350

229. Taylor K A , Schmitz H , Reedy M C , Goldman Y E , Franzini-Armstrong C , Sasaki H , Tregear R T , Poole K , Lucaveche V , Edwards R J , Chen L F , Winkler H , Reedy M K

230. Tomographic 3D reconstruction of quick-frozen, Ca2+-activated contracting insect flight muscle //Cell 1999 -V 99 -P 421-431

231. Thomas D D, Cooke R Orientation of spin-labeled myosin heads in glycerinated muscle fibers // Biophys J 1980 -V 32 -P 891-906

232. Tirion M M, ben-Avraham D, Lorenz M, Holmes K C Normal modes as refinement parameters for the F-actin model //Biophys J 1995 -V 68 -P 5-12

233. Tobacman L S Thin filament-mediated regulation of cardiac contraction // Annu Rev Physiol 1996 -V 58 -P 447-481

234. Towns-Andrews E , Berry A , Bordas J , Mant G R, Murray P K , Roberts K, Sumner I, Worgan J S , Lewis R Time-resolved x-ray diffraction station X-ray optics, detectors and data acquisition//Rev Sci Instrum 1989 -V 60 -P 2346-2349

235. Tregear R T , Poole K , Lucaveche C , Edwards R J , Chen L F , Winkler H , Reedy M K Tomographic 3D reconstruction of quick-frozen, Ca2+-activated contracting insect flight muscle //Cell -1999 -V 99 -P 421-431

236. Tsaturyan A K Diffraction by partially occupied helices // Acta Crystallogr A 2002 - V 58 -P 292-294

237. Tsaturyan A K, Bershitsky S Y, Burns R, Ferenczi M A Structural changes in the actin-myosin cross-bridges associated with force generation induced by temperature jump in permeabilized frog muscle fibers //Biophys J 1999 -V 77 -P 354-372

238. Tsaturyan A K , Bershitsky S Y, Burns R, He Z H , Ferenczi M A Structural responses to the photolytic release of ATP in frog muscle fibres, observed by time-resolved X-ray diffraction //J Physiol 1999 -V 520 -P 681-696

239. Tsaturyan A K , Koubassova N , Ferenczi M A , Narayanan T , Roessle M, Bershitsky S Y Strong binding of myosin heads stretches and twists the actin helix // Biophys J 2005 - V 88 -P 1902-1910

240. Urbanke C , Wray J A fluorescence temperature-jump study of conformational transitions in myosin subfragment 1 //Biochemistry -2001 -V 358 -P 165-173

241. Uyeda T Q , Abramson P D , Spudich J A The neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement // Proc Natl Acad Sci USA 1996 - V 93 - P 4459-4464

242. Varriano-Marston E , Franzini-Armstrong C , Haselgrove J C The structure and disposition of cross-bridges in deep-etched fish muscle // J Muscle Res Cell Motil 1984 - V 5 - P 363-386

243. Vinogradova M V , Stone D B , Malanina G G, Karatzaferi C , Cooke R, Mendelson R A, Fletterick R J Ca(2+)-regulated structural changes in troponin // Proc Natl Acad Sci USA -2005 -V 102- P 5038-5043

244. Wakabayashi K, Sugimoto Y, Tanaka H, Ueno Y, Takezawa Y, Amemiya Y X-ray diffraction measurements for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction //Biophys J 1994 -V 67 -P 2422-2435

245. Wray J Structure of relaxed myosin filaments in relation to nucleotide state in vertebrate skeletal muscle //J Muscle Res Cell Motil 1987 -V 8 -P 62a

246. Woodhead J L , Zhao F -Q , Craig R, Egelman E H Alamo L , Padrón R Atomic model of a myosin filament in the relaxed state //Nature -2005 -V 436 -P 1195-1199

247. Xu S , Gu J, Belknap B , White H, Yu L C Structural characterization of the binding of Myosin*ADP*Pi to actin in permeabilized rabbit psoas muscle //Biophys J -2006 -V 91 -P 3370-3382

248. Xu S , Gu J , Melvin G , Yu L Structural characterization of weakly attached cross-bridges in the A M ATP state in permeabilized rabbit psoas muscle // Biophys J 2002 - V 82 - P 2111-2122

249. Xu S , Gu J , Rhodes T , Belknap B , Rosenbaum G , Offer G , White H , Yu L The M-ADP-Pi state is required for helical order in the thick filaments of skeletal muscle // Biophys J -1999 -V 77 -P 2665-2676

250. Xu S , Malinchik S , Gilroy D , Kraft T , Brenner B , Yu L X-ray diffraction studies of cross-bridges weakly bound to actin in relaxed skinned fibers of rabbit psoas muscle // Biophys J -1997 -V 73 -P 2292-2303

251. Xu S , Offer G , Gu J , White H , Yu L Temperature and ligand dependence of conformation and helical order in myosin filaments //Biochemistry -2003 -V 42 -P 390-401

252. Xu S , White H D , Offer G W , Yu L C Stabilization of helical order in the thick filaments by blebbistatin further evidence of coexisting multiple conformations of myosin // Biophys J -2009 -V 96 -P 3673-3681

253. Yagi N Intensification of the first actin layer-line during contraction of frog skeletal muscle // Adv Biophis -1991 -V 27-P 35-43

254. Yagi N Effects of N-ethylmaleimide on the structure of skinned frog skeletal muscles // J Muscle Res Cell Motil 1992 -V 13 -P 457-463

255. Yagi N Labelling of thin filaments by myosin heads in contracting and rigor vertebrate skeletal muscles //ActaCryst D 1996 -V 52 -P 1169-1173

256. Yagi N , O'Brien E J , Matsubara I Changes of thick filament structure during contraction of frog striated muscle //Biophys J -1981 -V 33 -P 121-138

257. Yagi N , lwamoto H , Wakayama J , Inoue K Structural changes of actin-bound myosin heads after a quick length change in frog skeletal muscle // Biophys J 2005 - V 89 - P 11501164

258. Yagi N, lwamoto H, Inoue K Structural changes of cross-bridges on transition from isometric to shortening state in frog skeletal muscle //Biophys J -2006 -V 91 -P 41104120

259. Yagi N , Matsubara I Structural changes in the thin filament during activation studied by X-ray diffraction of highly stretched skeletal muscle //J Mol Biol 1989 -V 208 -P 359-363

260. Yagi N, Takemori S Structural changes in myosin cross-bridges during shortening of frog skeletal muscle //J Muscle Res Cell Motil 1995 -V 16 -P 57-63

261. Yagi N , Takemori S , Watanabe M An X-ray diffraction study of frog skeletal muscle during shortening near the maximum velocity //J Mol Biol 1993 -V 231 -P 668-677

262. Yanagida T , Nakase M, Nishiyama K , Oosawa F Direct observation of motion of single F-actin filaments in the presence of myosin //Nature 1984 -V 307 -P 58-60

263. Yu L C Analysis of equatorial x-ray diffraction patterns from skeletal muscle // Biophys J -1989 -V 55 -P 433-440

264. Yu L , Brenner B Structures of actomyosin crossbridges in relaxed and rigor muscle fibres // Biophys J 1989 -V 55 -P 441-453

Информация о работе

Кубасова, Наталия Алексеевна
доктора физико-математических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование актин-миозинового мотора в скелетной мышце с помощью рентгеновской дифракции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы