Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма генерации силы в мышце

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма генерации силы в мышце"

На правах рукописи

Бершицкий Сергей Юрьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ГЕНЕРАЦИИ СИЛЫ В МЫШЦЕ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Институте иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор физико-математических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

A.Н. Тихонов

B.В. Леднев Д.И. Левицкий

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт экспериментальной кардиологии Кардиологического Научно-производственного комплекса МЗ РФ

Защита диссертации состоится 17 февраля 2005 г. в 15.30 на заседании

Специализированного Ученого Совета Д. 501.001.96 при Московском Государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

Автореферат разослан "_" января 2005 г.

Ученый секретарь Специализированного Ученого Совета Д. 501.001.96, доктор биологических наук

Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из интереснейших проблем биофизики. Согласно предложенным в середине 50-х годов гипотезе скользящих нитей и мостиковой теории мышечного сокращения (H. Huxley, Hanson, 1954; A. Huxley, Niedergerke, 1954; A. Huxley, 1957; H. Huxley, 1969; A. Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие миозиновых головок, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами акшна, составляющими основу тонких нитей. Это взаимодействие ведёт к укорочению саркомера, а дайна самих нитей остаётся постоянной Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, создание атомных трехмерных реконструкций актина, миозиновой головки и актин-миозинового комплекса (Holmes и др., 1990, 2004; Rayment и др., 1993а, б; Houdusse и др., 1999, 2000), многие важные детали механизма работы поперечных мостиков остаются неизвестными. По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие сипы или укорочения мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу. Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновый мостик может переместить актиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995; Simmons и др., 1996; Ishijima и др., 1998; Linari и др., 1998; A F.Huxley, 2000).

В 90х годах были получены кристаллы глобулярного актина (Kabsch и др., 1990) и субфрагмента 1 миозина в 'ригорной' конфигурации (Rayment и др., 1993а), сняты их pei птенограммы высокого разрешения (2,8 А) и сделаны реконструкции глобулярного (Kabsch и др., 1990) и филаменгарного актина (Holmes и др., 1990; Mendelson, Morris, 1994), субфрагмекга 1 (Rayment и др., 1993а) и акто-миозинового комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson, Morris 1997) Были получены кристаллы S1 миозина гладких мышц (Dominguez и др., 1998) и миозина моллюска (Houdusse, Cohen, 1996; Houdusse и др., 1999; Houdusse и др., 2000), а также ряд комплексов миозина с АДФ и негидролизуемыми аналогами АТФ, которые соответствуют конформациям миозина в разных стадиях силогенерирующего шага (Houdusse, Sweeney, 2001). Реконструкции миозина показывают существование 'шейного' домена в структуре S1, который является упругим элементом мостика, постулированным в модели A. Huxley и Simmcms'a 1971 г.

На основе реконструкций миозина и акто-миозинового комплекса была выдвинута гипотеза (Uyeda и др., 1996; Howard, Spudich, 1996; Anson и др., 1996; Holmes, 1997), согласно которой 'шейка' играет роль 'рычага', приводимого в действие 'конверторным' доменом (Holmes, 1997) По этой гипотезе актин-связывающий, или моторный, домен миозина к моменту силогенерирующего шага прочно и неподвижно связан с актином, а всё движение производится только шейным доменом. Было показано (Uyeda и др., 1996), что скорость движения актина по миозиновой поверхности линейно связана с длиной а-спирального хвостового участка субфрагмента 1 Изменения интенсивности рефлекса МЗ рентгеновской дифракции на мышечном волокне, синхронные с фазой быстрого всстановления напряжения после ступенчатой деформации, также интерпретируются в рамках этой гипотезы (Irving и др., 2000). Движение хвостового домена субфрагмента 1 молекулы миозина относительно моторного было подтверждено также резонансным переносом флуоресценции (Suzuki и др., 1998).

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПетербург

эмОк __

С другой стороны, томограммы элеетронно-микроскопических срезов летательных мышц насекомых, полученных быстрым замораживанием (Taylor и др, 1999), показывают серьёзные отличия в конфигурации моторного домена по сравнению с реконструкциями акго-Sl комплекса

Проблема изучения молекулярного механизма мышечного сокращения состоит, в частности, в том, что механическая функция акгин-миозинового мотора может быть реализована лишь щи сохранении надмолекулярной структуры мышцы, а исследование изолированных сократительных белков даже с использованием всех средств современной биохимии и молекулярной биологии способно дал. лишь косвенную информацию об их механической функции С другой стороны, изучение конформационных изменений акгин-миозинового комплекса в структурированных системах, способных совершать механическую работу, таких как мышечное волокно или миофибрилла, сопряжено с большими трудностями в ингерперетации результатов и определении механических параметров отдельных компонентов системы.

Таким образом, представляется актуальным исследовать взаимосвязи между макроскопическими механическими процессами сокрапщющения мышцы и молекулярными структурными событиями в сократительных белках, которые, как представляется, лежат в основе механической функции мышцы, в демембранизованных мышечных волокнах, где состав среды, окружающей сократительные белки, полностью контролируется экспериментатором, а механическая функция сохранена. Использование клеток с проницаемой мембраной позволяет применить такие современные метода нестационарной кинетики, как импульсный фотолиз веществ и скачок температуры для синхронизации процессов, происходящих в отдельных миозиновых молекулах. Малоугловая дифракция ретгеновских лучей представляет собой один из наиболее продуктивных методов исследования структурных изменений в мышце на молекулярном уровне (H. Huxley, 1996). Благодаря использованию мощных синхрсггронных источников рентгеновского излучения и быстродействующих электронных детекторов изменения ингенсивносгей самых ярких рефлексе® от одиночных ингакгных клеток лягушки были измерены с субмиллисекундным временным разрешением (Irving и др., 1992; Dobbie и др., 1998). Результатом этих исследований явилось структурное подтверждение правильности мосшковой теории мышечного сокращения, предложенной А Huxley и Simmens' ом в 1971 году. Прогресс, достигнутый в применении техники ретгеновской дифракции высокого временного разрешения к одиночным ингактым мышечным волокнам, делает актуальным её применение для изучения структурных изменений в волокнах с проницаемей мембраной. В таких волокнах можно, в частности, использовать для инициализации силогенгрирующего прсщесса в активном состоянии метод скачка темгкратуры как альтернативу методу механических деформаций В этом случае сиггагенерация происходит в изометрических условиях, то есть без относительного смещения толстых и тонких нитей. Результаты исследования механических характеристик переходных процессов в одиночных сокращающихся мышечных волокнах, вызванных высокоамплигудным скачком температуры показали, что эти характеристики существенно отличаются от таковых, вызванных механическими деформациями (Bershitsky, Tsaturyan, 1992; Bershitsky, 2001). Более того, по нашим данным, переходные процессы напряжения, вызванные ступенчатыми деформациями и скачком температуры имеют различную природу (Bershitsky, Tsaturyan, 2002). Поэтому представляется актуальным детально исследовать механические характеристики отдельных мостиков и структурные события, сопровождающие цикл работы мостиков, используя эти два типа воздействий. Комбинация разных методов возбуждения

силогенерирующего процесса в мостиках может помочь понять основы молекулярной природы мышечного сокращения.

Цели исследования состояли в изучениимолекулярного механизма генерации силы мышечного сокращения, а также тех структурных изменений в мышечных волокнах теплокровных, которые сопровождают этот процесс.

При этом были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработка метода скачка температуры для одиночных волокон скелетных мышц, совместимого с одновременным заданием и измерением их механических характеристик в субмиллисекундном временном диапазоне и структурных изменений в миллисекундном диапазоне;

2. Разработка экспериментальной модели демембранизованных клеток скелетных мышц теплокровных (кролика) со стабилизированной структурой саркомеров, способных к длительной (десятки минут) активации, что необходимо для структурных исследований с помощью интенсивного регагеновского излучения в различных физиологических состояниях;

3. Исследование кинетики и термодинамики силогенерирующего шага миозиновых мостиков при физиологической температуре;

4. Изучение механических реакций мышечных волокон кролика в ответ на скачок температуры и исследование тех процессов в поперечных мостиках, с которыми связаны эта реакц ии;

5. Сравнение переходных процессов силы в одиночных мышечных волокнах кролика, вызванных субмиллисекундными изменениями длины и температуры;

6. Регистрация с временным разрешением в 1 мс и исследование решгеноструктурных изменений в одиночных активированных мышечных волокнах кролика, сопровождающих силогенерируюшие процессы, вызванные быстрыми изменениями дайны и температуры.

Научная новизна:

- впервые разработана экспериментальная техника и модель одиночных волокон скелетных мышц теплокровных с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной коваленгной сшивкой, пригодная для исследования механических и структурных изменений методом рентгеновской дифракции высокого временного разрешения при физиологических условиях;

- впервые разработан и реализован метод джоулева скачка температуры в одиночных клетках (волокнах) скелетных мышц кролика, превосходящий по своим характеристикам и возможностям другие известные в настоящее время методы,

- с помощью джоулева скачка температуры впервые показано существование кинетически другого силогенерирующего шага в миозиновых мостиках, присоединенных к тонким нитям, по сравнению с шагом в ответ на ступенчатые деформации мышечного волокна;

- впервые показано, что силогенерирующий шаг мостиков может происходить без смещения толстых и тонких нитей в саркомерах и в условиях, исключающих отсоединение и присоединение миозиновых мостиков к тонким нитям;

- впервые исследована кинетика механических ответов одиночных волокон скелетных мышц кролика на быстрое изменение температуры;

- впервые показано и доказано, что увеличение напряжения в мышце при повышении температуры происходит за счёт увеличения силогенерирующей способности мостиков, а не их числа;

- впервые получен временной ход изменения ингенсивностей основных рефлексов рентгенограммы волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры;

- впервые показано, что реакция напряжения в мышце теплокровных в ответ на повышение температуры сопровождается значительным увеличением интенсивности первой актиновой слоевой линии на рентгенограмме без изменения жёсткости волокна, свидетельствуя о переходе присоединённых мостиков в стерео-специфически связанное с актином состояние;

- впервые показано, что кинетика роста интенсивности первой актиновой слоевой линии на рентгенограмме волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры с временным разрешением в 1 мс совпадает с кинетикой роста силы;

- впервые показано, что силогенерирующие процессы в мышце, вызванные механическими деформациями и скачком температуры имеют разную природу;

- найдены новые и уточнены известные детали механизма работы актин-миозинового мотора, что расширяет и дополняет знания о мышечном сокращении и ведёт к пересмотру существующих представлений о механизме генерации силы в мышце.

Практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - силогенерапии в мышце, то есть того молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе биологической подвижности. Методы и подходы, разработанные в работе могут быть применены во многих прикладных исследованиях особенностей сокращения скелетных и сердечных мышц. К ним относятся: экспериментальная модель одиночных мышечных клеток с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной коваленгаой сшивкой, метод скачка температуры в одиночных клетках, позволяющий исследовать механическое поведение мышечных клеток с проницаемой мембраной при физиологической температуре и в изометрических условиях; метод регистрации и контроля дайны саркомеров мышечных волокон в воздухе; метод регистрации рентгенограмм одиночных клеток в воздухе, то есть с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные подходы и методы могут бьпъ использованы для анализа особенностей работы актин-миозинового мотора в клетках различных типов в норме и при патологии, а метод джоулева скачка температуры потенциально применим и к другим биологическим объектам.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 44 публикациях в научных журналах и сборниках конференций.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на Международной конференции по медицинской биомеханике (Рига, 1986), на VI и VII Всесоюзных съездах по теоретической и прикладной механике (Ташкент, 1986; Москва 1991); на VIII и IX Всесоюзных симпозиумах "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Путцино, 1987; Тбилиси, 1990); на Выездном заседании секции биологической подвижности Научного совета по проблемам биофизики АН СССР (Ереван, 1988); на на Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); на собрании Национального комитета СССР по теоретической и прикладной механике (Москва, 1986); на Всесоюзных школах по

биологической подвижности (Лосево, 1985; 1989) и по физиологии и биофизике миокарда (Свердловск, 1981, 1984, 1987); на Всесоюзных семинарах "Биомеханика-84, -87, -90, -91" (Москва, 1984, 1990; Ленинград 1987; Санкт-Петербург, 1991, 1999, 2001); на П и Ш Международных симпозиумах "Биологическая подвижность' новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004); на ХУШ, XIX, XXIV, XXVI, ХХУШ, XXX, XXXI, ХХХП и ХХХШ Европейских мышечных конференциях (Лунтерен, Нидерланды, 1989; Брюссель, Бельгия, 1990; Флоренция, Италия, 1995; Шневердинген, Германия, 1997; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Лунтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на IV Международной конференции по мышечной энергетике (Сиена, Италия, 1992); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 1998, 2001, 2004); на восьми ежегодных конференциях получателей грантов Медицинского Института им. Ховарда Хьюза (ННЩ Прага, Чехия, 1996; Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998; Москва, Россия, 1999; Вашингтон, США, 2000; Ванкувер, Канада, 2001; Керне, Австралия, 2002; Таллинн, Эстония, 2004); на собраниях Физиологического общества Великобритании (Эдинбург, 1989; Бирмингем, 1994); на семинарах Лондонской мышечной серии (London Muscle Saies) в 1992 и 2002, а также на других научных конференциях и семинарах

Часть экспериментов бьпа выполнена в Отделе биофизики (Randall Institute) Королевского колледжа Лондонского университета (King's College London) при финансовой поддержке фонда Wellcome Trust; в Отделе физической биохимии Национального Института медицинских исследований Совета по медицинским исследованиям Великобритании (National Institute for Medical Research, MRC, Лондон); в Отделе биомедицинских наук Империал Колледжа Лондона (Biomedical Sciences Division, Imperial College London), и Лаборатории Дасбери (Daresbury Laboratory, Чешир, Великобритания); на Европейском синхротроне ESRF (Гренобль, Франция). Исследования, вошедшие в работу, были поддержаны грантами РФФИ, Wellcome Trust, HHMI, INTAS, MRC, Daresbury Laboratory, NATO, ESRF, EMBL, Royal Society, Международного научного фонда (ISF, фонд Сороса) и совместным грантом ISF и Правительства России.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения и восьми глав, изложена на 178 страницах, включая 44 рисунка, 3 таблицы и список литературы из 161 источника.

Автор считает своим долгом почтить память своего первого учителя профессора ВЯ Изакова, который побудил в нём интерес к биофизике и стоял у истоков настоящего проекта Автор хотел бы выразить благодарность своим учителям и наставникам: профессорам A.F. Huxley и RM Simmons'y и доктору D R. Trentham'y, в немалой степени содействовавшим выполнению этой работы. Автор признателен своему другу и коллеге А.К. Цатуряну за многолетнее и плодотворное сотрудничество Автор благодарит также профессора ВС Мархасина за его благожелательные и настойчивые усилия, подвигнувшие автора к написанию настоящей диссертации.

Реализация метода скачка температуры в одиночных мышечных волокнах и все механические и рентгеновские эксперименты, проводившиеся в течение более, чем 20 лег и представленные в данной работе, были сделаны совместно с А.К. Цатуряном (Институт механики МГУ); все эксперименты на источниках синхротронного излучения в Daresbury (Великобритания) и Grenoble (Франция) были выполнены совместна с MA Ferenczi (Imperial College, Лондон), значительная часть этих экспериментов была сделана в сотрудничестве с H.A. Кубасовой (Институт механики МГУ); на разных этапах в работе принимали участие О Н Бершицкая, Г.И Машанов, Р. Brown, R. Burns, Z.-H. Не, M Webb и V. Siththanandan; всем им автор глубоко признателен за сотрудничество.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Объект и методы исследований

В изучении механических, структурных и биохимических событий, происходящих в мышце во время сокращения, существует целый ряд излюбленных исследователями экспериментальных моделей, или объектов. Основными из них являются скелетные мышцы лягушки и одиночные волокна из них, традиционно используемые для механических и ренггеноструктурных исследований, и скелетные мышцы кролика, на которых биохимическими методами исследуется механизм преобразования энергии в мышце, регуляция и многие другие аспекты мышечного сокращения. Для биохимических исследований требуются обычно значительные количества мышц или мышечных белков, я

которые трудно получить из таких мелких животных, как лягушка, и, кроме того, мышечные белки холоднокровных плохо хранятся даже при 0°С. Волокна из мышц теплокровных также используются в механических экспериментах, однако при температуре, далёкой от физиологической. Мышцы теплокровных полноценно работают при температуре ~37°С, а активация их при высокой температуре ведёт к необратимому разупорядочиванию структуры саркомеров и к изменению механических и структурных характеристик сокращения мышечных пряиратов.

Разработанный нами метод скачка температуры (рис. 1.1), совместимый как с быстрыми механическими измерениями, так и с ретгеновской аппаратурой, позволяет в течение короткого интервала времени регистрировать механические и структурные события в одиночных химически демембранизированных волокнах теплокровных при физиологической для них температуре (Бершицкий, Цатурян, 1985, 1986; Bershitsky, Tsaturyan, 1992,1995,2002).

1 1. Мышечные волокна. Пучки мышечных волокон извлекались из мышц т. psoas кроликов, убитых внутривенным введением пенгобарбигала натрия. Пучки препарировали в расслабляющем растворе (Таблица 1). Одиночные волокна выделяли в том же растворе под препаровальным микроскопом при 5-7°С и сегмент волокна длиной от 2 до 4 мм (в зависимости от типа эксперимента) приклеивали к датчику силы и линейному мотору, с помощью шеллака, растворенного в этаноле и погружали в экспериментальную камеру с расслабляющим раствором Под контролем дифракции He-Ne лазера устанавливали длину саркомеров в 2,4-2,5 мкм Волокна активировали заменой расслабляющий раствора в камере активирующим Длительность каждой активации не превышала 3-4 секунд, общее число активаций волокна достигало 30, пока напряжение в нём не падло на 15% от начального. Размеры волокон измеряли препаровальным микроскопом в двух проекциях в растворе и в воздухе. Ошибка измерения диаметра при этом составляла примерно 5%.

1.2. Механические измерения Для механических экспериментов с одиночными мышечными волокнами использовались разработанные и построенные нами установки, которые состоят из следующих узлов: термостатируемой камеры, или ячейки; линейного мотора для продольных деформаций мышечного волокна; датчика силы; лазерного дифракгомегра; комплекса приборов для задания скачка температуры и измерения его величины, компьютерных плат и программ управления экспериментом и цифровой регистрации сигналов датчиков. Установка для экспериментов на синхротронных источниках рентгеновского излучения снабжена устройством дистанционного управления положением экспериментальной камеры.

Таблица 1.1. Состав растворов (в мМ)

Реактивы Растворы

Расслаблиощий Акплирукхций Препаровальный Дш хранена

На2АТФ 5 5 5 5

ЭГТА 5 - 5 5

Са-ЭГТА - 5 - -

МёС12 7 7 7 7

Креатин фосфат 22 20 - -

Креатин фосфокиназа 1 мУмл 1 мАи - -

Какодиловая кислота 100 100 - -

Имидазол - - 20 20

Пропионат калия - - 110 110

Глицерин - - - 50% об.

Ионная сила расслабляющего и активирующего растворов 200 мМ, pH всех растворов титрован до 7,0 с помощью КОН и HCl. Все реактивы от фирмы Sigma Chemical Co., St. Louis, МО, США.

1.2.1. Экспериментальная камера (Bershitsky, Tsaturyan, 1995) представляет собой блок из двух стенок толщиной 2 мм, шириной 10 мм и высотой ~15 мм из оксидированного алюминия, изолированных слоем силиконовой резины. Щель между стенками (~2 мм) служит собственно камерой: в ней находится волокно и раствор, удерживаемый поверхностным натяжением Температура блока контролируется элементом Пельтье по сигналу обратной связи с микротермомегра, вмонтированного в одну из стенок. В стенках камеры имеется две пары овальных отверстий дая лазерной и рентгеновской дифракции. Объём камеры -140 мкл.

1.2.2. Линейный мотор с длительностью фронта ступенчатой деформации -130 мкс, и точностью -50 нм необходим дая исследования механических характеристик мышечных волокон (Bershitsky, Tsaturyan, 1995,2002).

12 3 Дня измерения механического напряжения в мышечных волокнах использовались самодельные пьезоэлектрические датчики сипы (Бершицкий, Цатурян, 1985, 1986; Bershitsky, Tsaturyan, 1992, 1995), с резонансной частотой 8-15 кГц уровнем шумов <2 мкН и временем спекания заряда порядка десяти секунд Для регистрации постоянней составляющей силы и коррекции температурного дрейфа в конце каждого кадра записи (0,2-1 с) мышечное волокно мгновенно укорачивали с помощью линейного мотора так, что сила в нём падала до нуля и выходной сигнал датчика в этот момент использовали как нулевой уровень.

1.2.4. Длину саркомеров в волокне регистрировали с помощью 5 мВт He-Ne лазера и позиционно-чувствительного фотодиода (LSC/30D, United Detector Technology, USA) по положению первого максимума дифракции в диапазоне 2,2-2,8 мкм. Качество выходного сигнала таково, что в ряде экспериментов он использовался в схеме обратной связи линейного мотора для поддержания постоянства длины саркомеров.

12 5 Число миозиновых мостиков, присоединённых к тонким нитям, оценивали измерением жёсткости волокна по мгновенному ответу силы при ступенчатых деформациях В ряде экспериментов для контроля изменений жёсткости к волокну прикладывали малоамплигудные высокочастотные синусоидальные изменения длины - до нескольких килогерц в зависимости от максимальной частоты датчика - и регистрировали

т

Волокно\ /

1 У

1

Усилитель мощности

.п_г

т

J—и

Зн

X

] I*. («Р,/400) пцппгаштмь Аииопяый

Рис. 1.1. Блок-схема экспериментальной установки. Сегмент одиночного скинированного мышечного волокна приклеен шеллаком, растворённым в этаноле, к кончикам никелевых трубочек-электродов датчика силы, ДТ, и линейного мотора. Волокно освещается лучом 5 мВт Не-Ме лазера для непрерывной регистрации длины саркомеров по положению первого максимума дифракции с помощью позиционно чувствительного фотодиода. Другой первый максимум дифракции подаётся на измерительный экран для настройки начальной длины саркомеров и визуального контроля качества дифракции Электрод датчика силы заземлён, а электрод мотора соединён с выходом устройства скачка температуры. Генератор нагревающего импульса, ГНИ, запускаемый внешним импульсом формирует импульс тока длительностью 0,15 мс и частотой 40 кГц и запускает импульс генератора подогревающего импульса, ГПИ Длительность подогревающего импульса регулируется в диапазоне от 200 мс до 1 с Оба импульса преобразуются в высоковольтные, как показано на вставке рисунка, и подаются на мышечное волокно, подвешенное к этому моменту воздухе Амплитуда скачка температуры определяется с помощью электронной схемы, состоящей из аналогового умножителя, который вычисляет мощность IV, как произведение тока / нагревающего импульса (падение напряжения на 200 Ом резисторе Я1) на его напряжение и (после 400-кратного ослабления на делителе I? 1 /Я2) Мощность нагревающего импульса интегрируется для того, чтобы получить значение скачка температуры ПТ, который пропорционален энергии, Е, делённой на теплоёмкость волокна Интегратор обнуляется за 100 мс перед скачком температуры, чтобы избежать ошибки из-за остаточного заряда на конденсаторе С1 и закрывается немедленно по окончании нагревающего импульса. Таким образом, энергия подогревающего импульса не даёт вклада в вычисление амплитуды скачка температуры

изменения напряжения в волокне. Жёсткость волокна оценивалась по изменению полной длины волокна, Яц = ¿,хДР/А£, а также по изменению дайны саркомеров, = ЖхАР/Л!?!,, где ЛР - изменения напряжения в волокне, - изменения дайны волокна, АБЬ - изменения длины саркомеров. 5-п, и были получены следующим образом: сначала находили колебательные компоненты Р, Ь, и БЪ вычитанием из записей кривых, полученных сглаживанием скользящим средним за период колебания. Затем сглаженные компоненты детектировали, извлекая квадратный корень их квадратов и сглаживали ЛЬ, Ай, и АР

скользящим средним дайной в полупериод колебания, которые использовали для определения 5л, и

1.2.6. Аппаратура скачка температуры. Джоулев скачок температуры (рис. 1.1) получали пропусканием высоковольтного импульса переменного тока частотой -40 кГц и длительностью 0,15 - 1 мс через одиночное мышечное волокно (или пучок волокон), подвешенное во влажном воздухе камеры три температуре ~5°С. Амплитуда импульса достигала 5 кВ, что вело к повышению температуру волокна до 40°С (ВегеЪйзку, ТваЬиуап, 1992, 1995, 2002). Количество энергии Б, выделившейся в волокне во время импульса длительностью г, измеряли, интегрируя произведете тока импульса, /, на его напряжение, £/:

г

Е = |[/(0/(0<Л ■

о

Величину скачка температуры АТ определяли как количество энергии, выделившейся в волокне, деленное на его теплоёмкость:

wdjd2lpc

где d\ и d2 - диаметры волокна в двух взаимно перпендикулярных проекциях, / - длина волокна, р (1060 кгм-3) и с (3,65103 Джкг^К-1) - плотность и удельная теплоёмкость мышечной ткани (Woledge, Curtin, Homsher, 1985). Точность определения величины скачка температуры была -10% и проверялась в контрольных экспериментах с термочувствительным рН индикатором.

1.2.7. Подогревающий импульс. Для компенсации остывания волокна, вслед за нагревающим импульсом к нему прикладывали импульс переменного тока частотой 40 кГц, но меньшей амплитуды, что позволяло поддерживать повышенную температуру волокна в течение ОД -1 с точностью -10% величины скачка температуры. Методика выбора амгтигуды подогревающего импульса была отработана экспериментах по измерению кинетики температуры в волокне после скачка температуры. В эггах экспериментах регистрировали поглощениг света He-Ne лазера в волокне, окрашенном насыщающей концентрацией рН-чувствительного красителя бромгимоловый синий в расслабляющем растворе на основе 100 мМ трис в качестве рН буфера с ApKJ/sT= -0,027 K"'(Bershitsky, Tsaturyan, 1992). Было найдено, что зависимость между поглощением света лазера в таком растворе и его температурой линейна в диапазоне 0-40°С. Затем окрашенное волокно освещали лучом лазера, подвешивали в воздухе и подавали нагревающий импульс высокой амплитуды. Изменение в нём температуры регистрировали фотодиодом по изменению поглощения монохромного света. Зашей изменения температуры щи этом получаются довольно шумными (рис. 1.2), что однако, не мешает проследить кинетику остывания. Амплитуду подогревающего импульса подбирали так, чтобы поддерживать выходной сигнал постоянным в течение ОД - 1 с после скачка температуры. Величину подогревающего импульса масштабировали с амплитудой скачка температуры. Как было показано ранее, основной механизм остывания после скачка температуры - это диффузия тепла и пара с поверхности волокна, а кажущаяся константа скорости остывания обратно пропорциональна квадрату диаметра волокна (Bershitsky, Tsaturyan, 1992).

1.3. Эксперименты по регистрации рентгеновской дифракции с высоким временным разрешением выполняли на станциях 16.1 (Towns-Andrews и др., 1989) источника синхротронного излучения (SRS) Лаборатории Дасбери (Чешир, Великобритания) и Ю02

Европейского источника синхрспронного излучения (ESRF) в Гренобле (Франция). Обе станции снабжены системами монохроматор-зеркало и обеспечивают фокусированный пучок фотонов с дайной волны 0,141 нм и интенсивностью ~1012 фотон в секуцду на 161 SRS и0,1 нм и ~10и фотон в секунду на ID02 ESRF Размер луча на мышечном препарате 0,4x2,8 мм (16.1) и 0,2x0,4 мм (ГО02) получали с помощью вертикальных и горизонтальных заслонок

Продифрагировавший на мышечном волокне решгеновский луч, пройдя через вакуумированную камеру длиной от 2,8 до 10 м в разных экспериментах регилрировался двухкоординагшым детектором. На станции 16.1 SRS это - газозаполненный детектор RAP© с физическим размером матрицы 205x205 мм, максимальным разрешением до 1024x2048 пикселей и частотой «роса до 10 МГц (Lewis и др., 1997). На станции Ш02 ESRF '

использовался ПЭС (CCD) детектор FReLoN разработки ESRF с размером 200x200 мм, максимальным разрешением до 2048x2048 пикселей и частотой до 16 кадре® в секунду. На станции 16.1 луч фокусировали в горизонтальной плоскости на детекторе, а в вертикальной - на мышечном препарате с целью увеличения фотонного выхода. На ГО02, в силу высокой коллимированносги, луч всегда сфокусирован на препарате.

Рис. 12. Огпическая настройка импульса подогрева по временному ходу температуры в мышечном волокне. Волокно в течение 30 мин окрашивали красителем брошимоловый синий, в насыщающей концентрации при 2°С в расслабляющем растворе со 100 мМ трис буфера с термочувствительностью 4рКа = -0,027 при рН 7,8. Затем волокно подвешивали в воздух при ~6°С и давали скачок температуры. Изменения температуры регистрировали по поглощению света He-Ne лазера в волокне с помощью фотодиода. Поглощение в этой опуации зависит от рН, который, в свою очередь, зависит от температуры из-за сдвига рАГ, (где К, константа равновесия) буфера. Показаны записи выходного напряжения фотодиода, которое в диапазоне от О^С до 40°С линейно зависит от температуры. Подогревающий импульс начинался сразу после скачка температуры, прилаженного на 150 мс, и длился 200 мс. А. Без подогревающего импульса, скачок температуры 26,7°С, Б. Огггамальный подогрев, скачок температуры 25,5 °С; В. Переподогрев, скачок температуры 25,1°С. Пунктиром показаны линейные регрессии выходного сигнала во время подогревающего импульса, то есть со 150 по 350 мс:60,9оС/сдляД п

-0^5°С/с для Б, и 42,8°С/с для В, соответственно. Д иаметр волокна 82 мкм, д лина 1,9 мм

Пространственное разрешение детекторов калибровали с помощью влажного коллагена из хвоста крыс или по положению пика меридионального миозинового рефлекса МЗ в мышечном волокне в расслабленном состоянии. Длительность рентгеновских кадров составляла от 1 мс до 10 с в разных экспериментах. Мышечный препарат во время

регистрации рентгенограммы подвешивали в воздух, опуская экспериментальную камеру с помощью дистанционно управляемого лифта, так что не связанное с препаратом рассеяние рентгеновского луча во время экспозиции Сыло минимальным. Температура препарата составляет 5-6°С при 0-2°С в камере, поскольку это ниже точки росы, то испарение и конденсация воды та поверхности препарата пренебрежимо малы.

1.4. Управление экспериментом, регистрация, обработка и анализ данных. Для управления линейным мотором использовалась плата ЦАП L-154 (L-Card, Москва, Россия). Внутренний таймер этой платы и её цифровые выходы синхронизовали все приборы установки. Сигналы силы в мышечном волокне; положения мотора, то есть изменения длины волокна; длины саркомеров; а также величины скачка температуры регистрировали с помощью платы 4-канального 12-бигного АЦП DAS-50 (Keithley MetraByte Ссор., MA, USA), установленной в персональном компьютере. Частота опроса этого АЦП составляет до 250 кГц на канал при 4-х активных каналах, данные записываются в бортовую память объёмом 1 миллион 12-битных слов. Обычно использовалась частота от 40 до 150 кГц на канал, продолжительность записей составляла от ОД - 1 с. АЦП и ЦАП устанавливали в одном персональном компьютере и управляли разработанной нами и написанной Г.И. Малиновым программой. Данные обрабатывали на персональных компьютерах с помощью программного пакета GIM, предоставленного A.JL Драчёвым (Dr. Achev Development, США). Пакет включает в себя подпрограмму многоэкспоненциального анализа, на основе алгоритма, разработанного Provencher (1976). Для анализа решгеновских данных использовали пакет программ (BSL, ХОТОКО, XFIT и ХИХ), разработанных в Лаборатории Дасбери в рамках программы ССР13, и созданную H.A. Кубасовой программу BS для персонального компьютера, работающую в среде Windows.

2. Влияние быстрых изменений длины и температуры на напряжение в мышечных волокнах

Сила в сокращающейся мышце генерируется поперечными мостиками - молекулами миозина, которые выступают из толстых нитей, образуя временные связи с тонкими нитями и действуя независимо друг от друга и асинхронно (A. Huxley, 1957). Для синхронизации работы мостиков Huxley и Simmons (1971) использовали быстрые укорочения мышечных волокон, что ведло к мгновенному упругому падению напряжения, за которым следовало его быстрое щсгачное восстановление до промежуточного уровня (фаза 2 по Huxley и Simmons'y), после чего напряжение относительно медленно возвращалось к начальному уровню Согласно теории Huxley и Simmons'a фаза 2 - это силогенерирующий переход, или шаг, мостка который происходит на миллисекундной временной шкале и рассматривается как механизм генерации силы в мышце. Скачок температуры в мышечном волокне -альтернативный способ повлиять на силогенерацию - достигается либо с помощью импульса ИК лазера (Goldman и др, 1987; Davis, Harrington, 1987а, 1987b, 1993; Davis, Rodgers, 1995a, b; Ranatunga, 1996), либо джоулевым нагревом (Bershitsky, Tsaturyan, 1985,1992,1995,2002) Сокращающееся волокно отвечает на скачок температуры увеличением напряжения. Амплитуда и кинетика роста напряжения зависят от тачальной и конечной температур.

2.1 Переходные процессы напряжения в ответ на скачок температуры, зарегистрированные под контролем длины саркомеров. Температурная зависимость активного напряжения в мышечных волокнах На рис. 2.1 показана серия переходных процессов напряжения (переходников напряжения) в мышечном волокне, вызванных скачками температуры. Видно, что записи во время 2-й и 16-й активаций, где конечные температуры были 32,1°С и 33,2°С, практически совпадают.

Зависимость максимального напряжения после скачка температуры от конечной температуры показана на рис. 2.2. Данные (п = 34) получены из записей напряжения в экспериментах на одиночных волокнах под контролем обратной связи по длине саркомеров как на рис. 2.2. Видно, что в диапазоне от ~5°С до физиологической температуры изометрическое напряжение растёт примерно в 5 раз. Наклон зависимости снижается при высокой температуре, но даже при максимальных значениях кривая не выглядит насыщенной. (210 для изометрического напряжения 2,16 в диапазоне от 6°С до 25°С и 1,34 в диапазоне 25-37°С.

2.2. Временной ход ответов напряжения на скачок температуры. В ответ на скачок температуры напряжение в волокне росло быстрее при больших скачках (рис. 2.1). Это ясно видно после нормировки переходников на амплитуду прироста напряжения, как показано на рис. 23А. Полувремя роста напряжения уменьшалось в 6,5 раз, когда конечная температура возрастала с ~16°С до ~33°С, что соответствует температурной зависимости СЬо »3. После нормировки этих записей на полувремя роста напряжения (рис. 2.3Б) такие, дважды пронормированные, переходники расходятся только в поздних медленных фазах, тогда как в остальном они неотличимы друг от друга Заметим, что поздние фазы очень чувствительны к точности поддержания постоянства температуры в волокне после скачка температуры, что в наших экспериментах достигалось ручной настройкой подогревающего импульса.

Рис. 2.1. Переходники напряжения, вызванные скачками температуры с ~6°С до разных конечных температур, зарегистрированные под контролем обратной связи по длине саркомеров. Показаны записи температуры в волокне (вверху), изменений длины саркомеров (средние кривые) и напряжения (нижние кривые) в одном из экспериментов. Цифры возле записей температуры и напряжения -порядковые номера активаций в течение эксперимента. Конечные температуры после скачков составили 32,1°С (2), 25,4°С (3), 16,3°С (7), 21,9°С (10), 18.5°С (11) и 33,2°С (16). Размеры волокна: 2,06 мм х 4420 мкм2, длина саркомеров 2,4 мкм.

3001

„ А0 в

а 200 0 /

1 Ф"

X X У

1 /'

о.

X 100 /

/•>

/

у'

0 1 1 I 1 1 1 1 • 1 1 > 1 1 1 1 1 1 1 1

0 10 20 30 40

Температура, 'С

Рис. 2.2. Зависимость стационарного изометрического напряжения от температуры, полученная с помощью скачков температуры с ~6°С до различных конечных температур. Данные из трёх одиночных мышечных волокон (показаны разными символами), включая волокно, записи из которого приведены на рис. 2.2, полученные в экспериментах, где использовалась обратная связь по длине саркомеров. Амплитуды для точки 6°С получены усреднением напряжения перед скачком температуры в каждом волокне. Пунктирная линия -аппроксимация данных полиномом третьего порядка. Размеры волокон: 2,06 мм х 4420 мкм2, длина саркомеров 2,4 мкм; 1,96 мм х 5030 мкм2, длина саркомеров 2,44 мкм; 2,16 мм х 5030 мкм2, длина саркомеров 2,42 мкм, соответственно.

Рис. 23. А. Записи переходных процессов напряжения, показанные на рис. 2.1, нормированные на максимальную амплитуду ответа напряжения при конечной температуре. Б. Те же записи, что на А с временной шкалой, нормированной на полувремя, роста напряжения. Цифры на панели А показывают номера записей. Полувремя в записях 7, 11, 10, 3, и 16 составляет 16,9 мс, 12,9 мс, 8,6 мс, 5,3 мс и 2,6 мс, соответственно.

Следуя общепринятому подходу, мы пытались аппроксимировать временной ход переходников напряжения суммой экспонент слагаемых, используя алгоритм РгоуепсЬег (1976). Дня наших данных число экспонент варьировало от 1 до 4 в разных переходниках и не коррелировало с амплитудой скачка температуры, хотя в целом для малых скачков число экспонент было меньше, чем для больших. Это делает невозможным сравнение кинетики переходных процессов и определение числа процессов, лежащих в основе переходников напряжения на скачок температуры. Зачастую для переходников, выглядевших идентично, амплитуды и константы скоростей, и даже число экспонент, полученных таким алгоритмом, существенно различались. В связи с этим для анализа кинетики мы использовали график Аррениуса: логарифмы обратных значений временных интервалов ?0>25, ?о> и ?0)75 были отложены как функции абсолютной обратной температуры. Результат такого анализа

временного хода переходных процессов напряжения напряжения, полученных под контролем дайны саркомеров в трёх волокнах, показан на рис. 2 4 Линейные регрессии дня всех трёх временных интервалов оказались параллельны, указывая на одинаковую температурную зависимость процессов, лежащие в основе переходника напряжения

Рис. 2.4. График Аррениуса для констант скоростей переходников напряжения, вызванных скачком температуры под контролем длины саркомеров,

зарегистрированных в тех трёх одиночных мышечных волокнах, данные из которых использованы в рис. 2.3. Кажущиеся константы скоростей, 1/Го.н (о), 1/Г0^ (*), и 1/£),75 (□), соответствуют обратным величинам временных интервалов от момента скачка температуры до времени 0,25, 0,5, и 0,75 конечного уровня напряжения,

соответственно. Пунктир - линейные регрессии -1оао(4) от обратной абсолютной температуры, Т, с наклонами -3,7, -3,68, и -3,42 для ¿0.25, 'од и (о,75, соответственно.

2.3. Жёсткость волокна во время переходников напряжения, вызванных скачком температуры измеряли, меняя дайну волокну малоамплитудными синусоидальными колебаниями частотой 1,5 кГц до и во время переходника, вызванного скачком температуры, и регистрировали изменения напряжения и дайны саркомеров. Регистрация сигнала дайны саркомеров в волокне, находящемся в воздухе, представляет трудности в силу рассеяния света волокном На записи эксперимента, показанного на рис. 2 5Д, величина скачка температуры - 23,5°С. Напряжение (Р), изменения дайны волокна (L) и дайны саркомеров (SL) записаны с частотой 40 кГц на канал. Рост напряжения с 55 кНм"2 при 6°С до 240 кН м"2 при 30°С сопровождался увеличением амплитуды колебаний дайны саркомеров, ASL, и напряжения, АР, когда амплитуд а синусоидальных изменений дайны, AL (» 0,25% от пика до пика), оставалась постоянной Модуль жёсткость, оцененный по изменениям д лины волокна, Sji, возрастал с 12 МН-м"2 при 6"С до 15,5 МН-м'2 при 30°С, то есть примерно на 30% при 4,5-кратном росте напряжения. Таким образом, если рассматривать Sn. как меру жёсткости волокна, её изменение после скачка температуры слишком мало по сравнению с изменением напряжения. Если модуль жёсткости выражали нормированием напряжения на изменение длины саркомеров, то он был ~29 МН м"2 как до, так и после переходника напряжения, только временно падая сразу после скачка температуры (рис. 2.5Б). Почти двукратная разнида в величинах Sn, и SSL может быть следствием концевой податливости волокна, которая снижает Stl, но не влияет на

Несмотря на то, что увеличение напряжения в результате скачка температуры не сопровождается сколь-либо значительным изменением Ssl, нельзя исключить возможность того, что амплитуда изменений напряжения, АР, особенно при высокой температуре, недооценена из-за частотного обрезания регистрируемых изменений напряжения, связанных с конечной частотой датчика силы и мотора. Это, как было показано (Huxley, Simmons, 1971; Ford и др., 1977), может иметь место, если восстановление напряжения происходит быстрее

3

f /

» в É 2 Е ? ф 'V.

i

32 3.3 34 3.5

тЛи^к"

v 1 К О*

* "Ч

i «I

Рис. 2.5. Изменения жёсткости в мышечном волокне во время переходного процесса напряжения, вызванного скачком 23,5°С температуры.

А. Записи (сверху вниз): температура в волокне, изменения полной длины волокна, изменения длины саркомеров и напряжения Частота синусоидальных изменений длины волокна 1,5 кГц, частота регистрации 40 кГц на канал

Б. Верхняя кривая - временной ход изменения жесткости волокна во время переходного процесса, полученный делением изменений напряжения на изменения длины саркомеров, нижняя - делением на изменения длины волокна, 5-п. Процедура измерения жесткости описана в тексте Волокно 1 от 9 03 92, размеры волокна' 1,96 мм х 5030 мкм2, длина саркомеров 2,44 мкм.

деформации. Так как восстановление напряжения ускоряется с температурой (Ford и др., 1977), эффект частотного обрезания может маскировать увеличение жёсткости после скачка температуры. Амплитудно-фазовый анализ записей изменения длины саркомеров и напряжения до и после скачка температуры показал фазовый сдвиг в 0,19 радиана при 6°С и 0,51 радиана при 30°С. В простейшем приближении обрезание напряжения можно описать как моноэкспоненциальный процесс с константой времени

релаксации /ге1. В таком случае tg(Aifi) = Ma- /геЬ где Аф - фазовый сдвиг между колебаниями длины саркомеров и напряжения, <а - угловая частота колебаний, тогда жёсткость на частоте со, SSL(eo), может быть выражена как SSL (ú>)/Ssl (оо) = \Ц\ + (а /ге1 )~2 , где истиная мгновенная жёсткость SSL(oo) есть предел

Ssl(û>), когда о стремится к бесконечности. В этом случае Ssl(œ) = 1,018 SSl.(<w) пРи 6°С и SSL(oe) =1,123 Ssl(ú>) при 30°С, или 29,2 МН м"2 и 33,2 МНм 2, соответственно. При таком предположении жёсткость волокна, скорректированная на обрезание сигнала напряжения, возрастает на -15%, когда напряжение увеличивается с температурой примерно в 4,5 раза.

3. Сравнение переходных процессов напряжения, вызванных изменениями длины и температуры

Как мы видим, скачок температуры, как и мгновенное ступенчатое укорочение сокращающегося мышечного волокна, ведёт к генерации в нём силы. Можно, предположить, что один из этих типов воздействия должен влиять на характеристики переходного процесса напряжения, вызванного другим воздействием. Согласно Huxley, Simmons (1971), рост напряжения сопровождается сдвигом равновесия между присоединёнными поперечными мостиками в пользу тех, что генерируют силу. Таким образом, после переходного процесса доля мостиков, способных сделать силогенерирующий шаг, должна быть снижена до тех

пор, пока не восстановится их силогенерирующая способность. Если скачок температуры приложить вскоре после ступенчатого укорочения, до восстановления силогенерирующей способности мостиков после переходника, вызванного этой деформацией, то амплитуда нового переходного процесса должна быть ниже по сравнению с той, что зарегистрирована в изометрических условиях. С другой стороны, поскольку скачок температуры ведёт к росту средней силы, генерируемой мостиком, то этот рост также должен сопровождаться переходом мостиков в силогенерирукмцее состояние(я). Согласно теории Huxley-Simmons (1971), это переход должен снижать число мостиков, способных участвовать в ответе напряжения на ступенчатую деформацию, приложенную после скачка температуры.

Рис. 3.1. Переходники напряжения (нижние записи на А и Б), изменения полной длины волокна (верхние) и длины саркомеров (средние) в двух экспериментах, где примерно одинаковые скачки температуры были приложены к мышечным волокнам через 35 мс (Л) и 5 мс (£) после ступенчатых изменений длины разного знака и амплитуды Начальная температура была ~5,5°С.

А Конечные температуры 21,0°С (запись 9), 22,ГС (10), 21,7°С (11), 21,8°С (13), 21,9°С (15)

Размеры волокна' 1,80 мм х 4220 мкм2, длина саркомеров 2,50 мкм;

Б. Конечные температуры. 26,3°С (20), 25,6°С (21), и 26.4°С (22). Размеры волокна. 2,10 мм х 3340 мкм2, длина саркомеров 2,50 мкм.

Таким образом, если ступенчатое укорочение волокна предшествует скачку температуры, оно должно вести к вовлечению большего числа мостиков в силогенерирующий процесс и, тем самым, уменьшать число мостиков, способных к силогенерации в ответ на второе воздействие. В экспериментах показанных на рис. 3.1 ступенчатые изменения длины были приложены за 35 мс (А) и 5 мс (Б) перед скачками температуры. В обоих случаях конечное напряжение после скачков температуры не зависело от предшествующих изменений длины, тогда как напряжение непосредственно перед скачком температуры менялось в широком диапазоне. Таким образом, во время переходного процесса напряжения, вызванного скачком температуры, поперечные мостики «забывают» о распределении состояний после возмущения, вызванного изменением длины. Это наблюдение демонстрирует, что по крайней мере поздние фазы температурного переходника напряжения сопровождаются отсоединением мостиков и их перецеплением к «новым» участкам на актине. Зависимость параметров переходников силы на ступенчатые юменения длины и скачки температуры в экспериментах от уровня напряжения в поперечных мостиках иллюстрируется на рис. 3.2. Переходники напряжения, вызванные ступенчатыми изменениями длины, аппроксимировали либо

Рис. 3.2. Зависимость констант скоростей переходников силл в мышечных волокнах, вызванных ступенчатыми изменениями длины и скачком температуры (рис. 3.1А) от напряжения в поперечных мостиках, вызванных изменением дпшш. Константы скоростей к, (V) и к2 (А) получены из двух-, а кажущаяся константа скорости кщр (0) - из одно-экспоненциальной алфоксимации механических ответов на изменение длины Сплошные линии — параболические аппроксимации

соответствующих данных для к\, кг и кщ,. Временной ход температурных ответов характеризован здесь обратным полувременем, 1/% (о, •), умноженным на 10 для представления данных в одном масштабе. Открытые символы относятся к волокну 2 от 2.06.1992, а закрашенные - к волокну 1 от 6.05.1992. Пунктирные линии — линейные регрессии данных для

*■ ч

^ 20

100 120

Рис. 33. Эффект времени приложения ступенчатого изменения длины на переходный процесс напряжения, вызванный скачком температуры. Ступенчатое укорочение длины сокращающегося волокна на 0,5% прикладывали в различные моменты времени до (А, записи 7 и 8) и после (Б, записи 10 и 13) скачка температуры.

А: укорочение приложено за 30 мс (запись 7) and 5 мс (запись 8) перед скачком температуры. Конечная температура составляла 25,0 °С (7), 25,2 "С (8) и 24,9 "С в изометрической записи 9.

Б: укорочение приложено через 1 мс (запись 10), 3 мс (запись 11), 5 мс (запись 12) и 10 мс (запись 13) после скачка температуры. Конечная температура - 24,9 (10), 24,7 (11), 24,3 (12) и 24,3 °С (13).

Номера записей соответствуют порядку, в котором они были зарегистрированы Изометрическая запись 9 показана как на А, так и на Б. Размеры волокна: 2,12 мм х 5280 мкм2, длина саркомеров 2,50 мкм.

одной, либо двумя экспонентами. Вне зависимости от числа экспонент константы скоростей возрастали с амплитудой укорочения волокна и снижались после удлинения, как и в работе Huxley, Simmons (1971). Однако временной ход температурных переходников, лишь слегка замедлялся с амплитудой высвобождения волокна и, таким образом, радикально отличался

от механического переходника Временной ход переходников напряжения, вызванных скачком температуры, примерно на порядок медленнее, чем вызванных ступенчатыми деформациями (рис 3.2) Такая разница в константах скоростей, как и независимость температурных переходников от напряжения в мостике, указывают на то, что природа процессов, лежашцх в основе этих двух типов переходников, вероятно, различна.

Возможное взаимодействие переходников сипы, вызванных двумя топами воздействия, проверялось в другом экспериментальном протоколе в трёх мышечных волокнах-активированное волокно быстро высвобождали на 0,5% длины в различные моменты времени до (рис 3 ЗА) и после (рис 3.3Б) скачков температуры до конечной температуры 24,3-25°С. В записи 9 скачок температуры был сделан в изометрических условиях

Рис. 3.4. Механические переходники в мышечном волокне, вызванные

ступенчатым укорочением волокна при низкой и высокой температуре. То же волокно, что и на рис. 3.3. Низкотемпературный переходник

зарегистрирован в волокне, находящемся в растворе при 0°С, высокотемпературный переходник - через 80 мс после скачка температуры до 29,3 °С, когда напряжение в волокне достигло стационарного уровня (продолжение записи 7 на рис. 3.3).

ГУ

Колодный (6)

во во

Время, НС

Рис. ЗА Вызванные скачком температуры переходники напряжения экстрагированы из комшкнсиых переходников вычитанием из них механического ответа, инициированного ступенчатым укорочением волокна. Трвх-экспоненциальные аппроксимации

переходников напряжения, вызванных укорочением при высокой и низкой температуре и показанных на рис. 3.4, были вычтены из комбинированных ответе® напряжения (рис. 33) и сдвинуты на величину упругого ответа. Аппроксимации использовались вместо самих записей для того, чтобы уменьшил, шум и получил. кривые нужной длины. Низкотемпературная аппроксимация (запись 6 <

на рис. 3.4) вычтена из записей 7 и 8 на рис. 33, а высокотемпературная аппроксимация (запись 7 на рис. 3.4) - из записей 10 и 13 на рис. 33. Изометрическая запись 9 не изменена.

Для выделения ответов напряжения на скачки температуры из комплексных переходников, механические переходники в совет на 0,5% укорочение волокна регистрировали отдельно в тех же волокнах при 0°С и 25,0°С (рис. 3.4, 'холодная' и 'горячая' записи, 6 и 7, соответственно) Затем 'холодный' ответ напряжения на укорочение вычитали из записей напряжения 7 и 8 (рис. 3.3А% а 'горячий' ответ - из записей 10 - 13 (рис. Ъ.ЪБ), чтобы

получить чистые ответы на скачсж температуры. Результаты вычитания показаны на рис. 3.5. После вычитания записи разделились та две группы: первую, где ступенчатое укорочение предшествовало скачку температуры (рис. 3 5, записи 7 и 8), и вторую, в которой ступенчатое укорочение следовало после скачка температуры (рис. 3.5, записи с 10 по 13). Следует заметать, что изометрическая запись 9 попадает во вторую группу. Внутри каждой группы амплитуды и временной ход переходников практически совпадают. Различия между группами записей могут, видимо, быть объяснены следующим образом: когда ступенчатое укорочение следовало после скачка температуры (записи 10-13), ответы на температуру были получены вычитанием 'горячего' механического гвреходника, полученного при той же высокой температуре после скачка; при низкой же температуре 'холодный' механический ответ на укорочение вычитался из комплексного переходника, в кагором температура менялась после механического воздействия. Такие эксперименты, но со скачками температуры другой величины, дали тот же результат, что шказан на рис. 3.5. Эти эксперименты вновь демонстрируют отсутствие взаимодействия между силогенерирующими процессами в сокращающейся мышце, вызванными двумя разными типами воздействия: изменением длины и температуры

Обсуждение. Fond, A.F. Huxley, Simmons (1977), а впоследствии Linari и др. (1993) показали, что постоянство длины саркомеров в экспериментах со ступенчатыми изменениями длины мышечного волокна является необходимым условием для корректного определения временного хода механического переходника. Записи на рис. 2.1 показывают, как существенно поддержание постоянства длины саркомеров для определения временного хода температурных переходников напряжения. Иначе укорочение центрального участка(ов) волокна может драматически замедлять рост напряжения за счёт удлинения концевых сегменте®.

Температурная зависимость активного изометрического напряжения. На рис. 2.3 показана темпгразурная зависимость напряжения, полученная с помощью скачков температуры разной величины под контролем обратной связи по длине саркомеров в экспериментах с тремя мышечными волокнами. Изометрическое напряжение возрастало с ~55 кН-м"2 при 5-6°С до -270 кН м"2 при 32-36°С, то есть почти в 5 раз. Учитывая, что площадь поперечного сечения скинированных мышечных волокон по сравнению с ингактными увеличивается примерно на 44-50% (Godt, Maughan, 1977; Linari и др., 1998), изометрическое напряжение при почти физиологической температуре в наших экспериментах (рис. 2.2 и 2.3) соответствует 400 кНм"2 (= 270 кНм"2 х 1,47) для ингактных волокон. Наклон зависимости температура-напряжение слегка падает при температуре выше 20-25°С, но даже при физиологической температуре кривая далека от насыщения.

Механическое напряжение при 20-35°С во всех мышечных волокнах было практически одинаковым, но его значения при 5-6°С лежали в довольно широком диапазоне от 5060 кНм'2 (рис. 2.2 и 2.6) до 100-120 кНм'2 (рис. 3.1А и 3.3). Такой разброс напряжений при низкой температуре влияет на зависимость напряжения от температуры, так что для некоторых волокон эта зависимость может быть более пологой, чем показана на рис. 2.3. Однако даже в таком случае не наблюдается насыщения кривой при высокой температуре

Хотя напряжение менее чувствительно к неоднородности длин саркомеров, чем временной ход переходников напряжения, вызванных скачком температуры (рис. 2.15), напряжение, которое развивают мышечные волокна кролика с проницаемой мембраной при активации Са2+, может быть снижено при относительно высокой температуре. Например, напряжение при ~30°С, как показали Goldman с соавторами

(1987) и Zhao, Kawai (1994) составляло 63% и 78%, соответственно, по отношению к тому, что было в наших условиях, тогда как при 10-15°С оно было одинаковым (рис 2.3) С другой стороны, напряжение при высокой температуре в наших экспериментах было таким же, что в волокнах, активированных при низкой температуре, а потом нагретых за 50-60 секунд до 35-40°С (Ranatunga, 1990), либо быстро перенесённых в раствор, нагретый до 30°С (Pate и др., 1994).

Низкое изометрическое напряжение при высокой температуре может быть результатом неоднородной Са2+-активации из-за диффузионных ограничений и, как следствие, неоднородного укорочения саркомеров в волокне. Те саркомеры, куда Ca2* диффундирует быстро, сокращаются, вытягивая ещё не сократившиеся. Неоднородность, естественно, более выражена при высокой температуре, так как скорость укорочения саркомера гораздо сильнее зависит от температуры, чем скорость диффузии. В результате такой неоднородности длины значительной доли саркомеров оказываются либо больше, либо меньше длины полного перекрытия толстых и тонких нитей (Goldman, Simmons, 1984). Активное напряжение в этом случае становится ниже, чем при истинно изометрическом сокращении при оптимальной длине саркомеров.

Неоднородность длин саркомеров три высокой температуре в наших экспериментах гораздо менее выражена в силу мгновенного и однородного повышения температуры уже активированных при низкой температуре саркомеров, а также из-за использования обратной связи по длине саркомеров. В экспериментах Ranatunga (1990) и Pate и др. (1994) неоднородность длин саркомеров подавлялась путём активации волокон при низкой температуре с последующим относительно быстрым их нагревом. Снижение напряжения при высокотемпературной активации ведёт к кажущемуся насыщению температурной зависимости напряжения. Данные, показанные на рис. 2.3, как и данные Ranatunga (1990) демонстрируют гораздо меньшее насыщение кривой температура-напряжение, чем в более ранних работах (Goldman и др., 1987; Stephenson, Williams, 1985). Однако некоторые авторы не находят сколь-либо заметного насыщения этой кривой вплоть до 30°С даже три активации при высокой температуре (Zhao, Kawai, 1994).

Природа температурной зависимости напряжения: число мостиков или сила на мостик Скачок температуры в сокращающемся мышечном волокне кролика с 5-6°С до почти физиологической температуры ведёт, как показано на рис. 2.2 и 2 3, к 5-крягаому росту напряжения. Этот рост напряжения является результатом либо увеличения числа мостиков, взаимодействующих с актином, как это происходит при запуске сокращения в ингакгаой мышце, либо роста средней силы, развиваемой одним мостиком, либо комбинацией этих двух возможностей

Для того, чтобы оценить меняется ли число мостиков с рюсгом силы при увеличении температуры, мы регистрировали жёсткость волокна во время роста напряжения, вызванного скачком температуры. Оценка числа присоединённых к актину молекул миозина по измерению жёсткости не является прямым методом и требует рассмотрения факторов, влияющих на неё. После скачка температуры наблюдался кажущийся рост амплитуды колебаний напряжения и, соответственно, жёсткости Sn,, оцененной по изменениям длины волокна (рис. 2.6Б, нижняя кривая). Однако, если для нормировки использовались изменения длины саркомеров центральной части волокна, то жёсткость, оставалась практически неизменной несмотря на 4-кратный рост напряжения (рис. 2.6) Goldman с соавторами (1987) также обнаружили постоянство фазовой жёсткости или даже небольшое её снижение после ~5°С скачка температуры, используя 500 Гц синусоидальные колебания длины волокна и измеряя длину саркомеров по дифракции белого света. В наших 20

экспериментах жёсткость, измеренная по длинг саркомеров, 5SL (~30МН м"2), была примерно вдвое выше, чем при нормировке на изменения полной длины волокна, S^i (12 -16 МН-м"2, рис 2.627), и, в отличие от Ять не росла с температурой. Некоторый прирост с температурой обнаруживался и в наших ранних экспериментах (Bershitsky, Tsaturyan, 1989) и в экспериментах Zhao, Kawai (1994). Разнищ между 5Sl и Stl указывает на то, что примерно половина податливости волокна находится в концевых сегментах, которые не освещаются He-Ne лазером и, соответственно, изменения дайны саркомеров которых не регистрируются дифрактомегром. Концевая податливость, видимо, нелинейна и снижается с ростом напряжения после увеличения температуры, а её вклад в податливость волокна снижается. 6 результате Sj^ (величина, обратная податливости) растёт с температурой, тогда как собственно саркомерная жёсткость остаётся постоянной

Долгое время считалось, что мгновенная жёсткость волокна прямо пропорциональна числу поперечных мостиков (A. F. Huxley, Simmons, 1971b; Ford и др., 1981), т. е. молекул 1 миозина, соединённых с тонкими нитями, поскольку жёсткость толстых и тонких нитей

много выше, чем жёсткость мостиков Однако, недавно было найдено, что податливость нитей примерно равна податливости соединяющих их мостиков (H. Е. Huxley и др., 1994; Wakabayashi и др., 1994; Higuchi и до, 1995; Linari и др., 1998; Bordas и др., 1999)

Полагая, что во время активного изометрического сокращения податливость нитей равна податливости мостиков и используя теорию Ford, Huxley, Simmons (1981), можно оценить, что 15% увеличение мгновенной жёсткости SSL (с коррекцией на частотные характеристики установки) с температурой соответствует в худшем случае -35% увеличению числа мостиков. Даже эта верхняя оценка прироста числа мостиков слишком мала, чтобы объяснить -4-кратный рост напряжения после 24°С скачка температуры (рис. 2.6А). Таким образом, при 4,4-кратном росте напряжения сила на один мостик возрастает в 4,4/1,35 = 3,3 раза. На основе наших наблюдений и приведённых оценок можно заключить, что рост температуры сдвигает равновесие присоединённых мостиков в пользу силогенерирующих, увеличивая среднюю силу мостика, но не число мостиков, вовлечённых во взаимодействие с актином.

Временной ход температурных переходных процессов. В начале ответа напряжения на скачок температуры имеется небольшое мгновенное падение напряжения из-за теплового расширения (Bershitsky, Tsaturyan, 1989). При постоянной длине волокна это эквивалентно его ступенчатому укорочению, что ведёт к упругому падению напряжения. Ответ напряжения после скачка температуры представляет собой, таким образом, комбинацию ответов на укорочение и собственно скачок температуры. Важно, следовательно, оценить i вклад обоих компонентов в этом комплексном ответе. В наших экспериментах для скачков

температуры в ~25°С амплитуда падения напряжения составляла примерно 5% от его холодного уровня. Даже для 8-10°С скачков температуры падение напряжения не превышало 8% амплитуды прироста напряжения Более выраженное падение напряжения наблюдалось в экспериментах с лазерным скачком температуры. Goldman с соавторами (1987) наблюдали падение напряжения в 3-15% от его холодного уровня, или 15-50% от прироста напряжения при скачках температуры в 1,5-7°С. Оценки, основанные на записях, представленных взаимодействие между двумя типами переходников не увенчались успехом. Результаты Davis, Harrington (1993) показывают, что падение напряжения щи ~5°С лазерном скачке температуры в их экспериментах составляли 5-8% холодного уровня, или 15-17% полного прироста напряжения, соответственно. Большее начальное падение напряжения в экспериментах с использованием лазерного скачка температуры может быть результатом теплового расширения металлических крючков, к которым крепится мышечное

волокно и которые нагреваются вместе с волокном. При использовании техники джоулева скачка температуры нагревается только волокно, тогда как удерживающие его узлы остаются холодными (Bershitsky, Tsaturyan, 1992) По этой причине вклад механического ответа в тепловое расширение минимален по сравнению с ростом напряжения, вызванного собственно скачком температуры.

Временной ход роста напряжения в ответ на скачок температуры обычно аппроксимируют суммой экспоненциальных слагаемых. Число слагаемых варьирует в разных работах от 2 (Goldman и др., 1987; Bershitsky, Tsaturyan, 1986, 1988, 1992) до 3 (Etavis, Rodgers, 1995a; Ranatunga, 1996) и даже до 4 (Davis, Rodgers, 1995b). Представленные здесь данные указывают, однако, что вопрос о применимости мультиэкспоненциального анализа к переходникам напряжения в ответ на скачок температуры остаётся открытым Неясно, насколько воспроизводимы значения амплитуд и констант скоростей при повторных скачках температуры одной величины Переходники напряжения в наших экспериментах были высоко воспроизводимы (см, например, рис 2.2 кривые 2 и 16), однако три аппроксимации константы скоростей, амплитуды и даже наиболее вероятное число экспонент варьировали для переходников, выглядящих одинаково.

Поскольку экспоненциальный анализ оказался ненадёжным, мы просто измеряли полувремя роста напряжения, вызванного скачком температуры. Оно уменьшалось с конечной температурой с Qi0 ~2,6 (рис. 2.4). Время достижения 25% и 75% максимального напряжения также уменьшалось с Q10 -2,6 и ~2,4, соответственно Такой результат указывает на то, чш все фазы температурного переходного процесса (кроме, может быть, самой медленной) ускоряются с температурой примерно одинаково, хотя сами переходники не моноэкспоненциальны. Имеется два источника ошибок в определении кинетики поздних фаз переходников напряжения, вызванных джоулевым скачком температуры. Один из них, как уже обсуждалось (Bershitsky, Tsaturyan, 1992), это остывание концов волокна из-за диффузии теша в холодные металлические электроды, к которым ою крепится. Поскольку изометрическое напряжение в холодных концевых участках волокна ниже, чем в горячей центральной части, то они подвергаются вытяжению за счёт укорочения центрального сегмента. В экспериментах, приведённых здесь, обратная связь по длине саркомеров в центральном сегменте обеспечивала постоянство их длины, снижая вклад податливости остывающих концевых сегментов Второй причиной ошибки в определении кинетики медленных фаз переходного процесса является неточность в поддержании постоянной температуры после скачка температуры.

Механические и температурные переходники напряжения. Переходники напряжения, вызванные быстрым изменением длины сокращающегося волокна, отличаются от таковых, вызванных скачком температуры. Обратное полувремя температурных переходников всегда в несколько раз меньше, чем константы скоростей быстрого восстановления напряжения после ступенчатого укорочения мышечного волокна (рис. 3.2). Кроме того, временной ход температурных переходников не зависит от напряжения в волокне, тогда как механический переходник ускоряется с величиной укорочения (рис. 3.2; Huxley, Simmons, 1971b; Ford и др., 1977). Все наши попытки обнаружить какое-либо взаимодействие между двумя типами переходников не увенчались успехом. Изменения амплитуды ступенчатой деформации волокна перед скачком температуры не влияли на временной ход ответе® напряжения на скачок температуры (рис. 3.2) Если ступенчатые деформации давать после скачка температуры, то комплексный ответ напряжения легко раскладывается на механический и температурный ответы без какого-либо взаимодействия между ними (рис. 3.5).

Основной результат этого раздела состоит в том, что кинетика переходных процессов

напряжения, вызванных температурой и деформацией, различна и что зги два процесса не взаимодействуют друг с другом Такой результат предполагает, что и молекулярные механизмы, лежащие в основе д вух типов переходных процессов, различны.

4. Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК

Миозиновые мостики мышечных клеток генерируют силу, взаимодействуя с актином. Однако отделил, силогенерирующий процесс присоединённых мостиков от эффектов их присоединения в мышечном сокращении достаточно трудно Доказательства быстрого присоединения мостиков три ступенчатом изменении дтины сокращающегося волокна получены как из механических (ЬошЬапй и др., 1992), так и регпгенодифракционных (Каиея и др., 1995) экспериментов.

Чтобы отделил, долю миозиновых мостиков, присоединенных к актину и участвующих в механическом ответе мышцы, волокна в состоянии ритора обрабатывали 1-(-3-димегиламшопропил)-3-згпткарбодиимидом (ЭДК) - нуль-мерным молекулярным линкером, который ковалешно «пришивает» к актину часть присоединённых к тонким нитям миозиновых головок, а затем заменяли раствор на высокосолевой расслабляющий (ВСРР) с ионной силой 0,6 М, чтобы отсоединил, от актина неприпппые головки. В таком растворе только прилитые головки дают вклад в механические свойства волокна. Та\га(1а и Кштига (1986) показали, чш ЭДК сначала сшивает стволы миозиновых нитей, так что ионная сила (ИС) раствора вплоть до 1 М не ведёт к их растворению, а также, что сшитые волокна производят работу в ВСРР три приложении малоамплитудных изменений длины. При переносе таких волокон в ригорный раствор, они развивают напряжение (Таижк и др, 1989) Однако, изучать силогенерацию сшитых волокон в механических экспериментах достаточно непросто.

Мл исследовали механические свойства пришлых мостиков и их способность генерировать силу быстрыми изменениями длины волокна и скачками температуры с 6-9°С до 3040°С. При частичной сшивке, когда мгновенная жёсткость волокон в ВСРР была 2540% ригорной, механическое поведение волокон - кинетика ответов напряжения на скачок температуры и характеристики фазы быстрого частичного восстановления напряжения на ступенчатое укорочение волокна - было близко к таковому в нормальном сокращении в скинированных сокращающихся мышечных волокнах Под контролем обратной связи по силе волокна укорачивались на величину вплоть до 4 нм (пс.)-1 (нанометры на полсаркомера) в ответ на скачок температуры Работа пришитого мостика в ответ на скачок температуры составила 30x1 От21 Дж. При увеличении степени сшивки жёсткость волокон в ВСРР приближалась к ригорной и они теряли вязкоупругие свойства и способность генерировать силу в ответ на рост температуры.

Скачок температуры (Бершицкий, Цатурян, 1989; ВегзЬйзку, Тэайлуап, 1992, 2002), инициирует силогенерирующий процессы) в изометрически сохраняющемся мышечном волокне, что ведёт к росту напряжения в нём в несколько раз и, таким образом, может использоваться для возбуждения силогенерации в пришитых мостиках. Для измерения их жёсткости и вязкоупругих характеристик, исследовали ответы напряжения на ступенчатые деформации волокон до и после обработки ЭДК

Таблица 4.1. Состав растворов (в мМ)

РЕАКТИВЫ РАСТВОРЫ

Б\фершй Ритор Высокосолевой расслабляющий Екдокосспзой ригорый Актирующий

NajATd) - - 5 - 5

ЭГГА - - 10 - -

ЭДГА - 5 - 10 -

ка 50 - - - -

Са-ЭГТА - - - - 10

Mga2 - - 6,5 - 6,5

Крешин фосфат - - 15 - 15

Креашн фосфскисва - - 100-150 мг-мл"1 - 100-150 мг-мл

Какодиловая кислота - - 100 100 100

Имидазол 80 80 - - -

Пропионат калия - 50 435 480 -

Ионная сила расслабляющего и активирующего растворов 200 мМ, рН всех растворов титрован до 7,0 при 25°С с помощью КОН и НС1.

4.1. Сшивка с помощью ЭЛК Процедура, опжантя Tawada и Ютша (1986) использовалась с некоторыми модификациями. Мыпкчное волокно ригорюовали при 0"С в эксперимэпальнсй камере. Ригорный раявор (табл. 4.1) заменяли 2-3 раза и выдерживали в нём волокно не менее 10 мин, после что температуру под нимали до lS^C. Ригсрныйрасгарменяш ещё раз и выдерживали в нш всшкно ещ£ Ю мин Такая процедура ригорюации минимизировала разброс дайн саркомеров. Ригорный раствор заменяли на буферный (тайн 4.1) т 10-15 мин, а затем m сшивающий (юг же буфер с 15 мМ ЭДК) ш 15-120 минут Втокж при этом п^иодачески растягивали и отпускали ш 0,5% дайны каждаг 3 сек, чтобы предотвратил. возможность сшивки не мостиксиых структур. Процесс сшивки осташвливали 2-3-х кратным промыванием камгры буферным раствором.

Экк7Е|Я1менп>1(юсшип>1мивол(1сшмиделашв{жх]р№Ж1ирасслаблякш|емрас1ворахс1^=0,6 М В качестве рН буфера использовали какодаловую кислоту из-за ей ниясой температурной чувствшельносга (¿рКв'ДТ1 = -0,0045-КГ1; Berdiitsky, Tsaturyan, 1992) Степень сшивки оценивали по жёсткости волокна в ВСРР по сравнению с жёсгкосшо в риторе. АТФазу в вотоиих, обработанных ЭДК памяти методам Glyn и Sleep (1985) при 15°С. Ячейку объёмом 100 мкл заполняли ВСРР с 0,1 мМНАДД 10 мМ фосфоэналпирувапа, 1 мг-мл4 Ьлакгаг дещорагедаы из мышц кролика (тип П; 950ед-мг-1)и 10 мг-мл-1 пирувагт ишы из мышц кршика (тип П; 500ед-мг-1) МыпЕЧНое валокнэ выдерживали 1 *ис в этом растворе, после чего раствор из ячейки сманивали с 400 мкл таксго же раствора, измеряли псгжвдние света в нём ю 340 нм и сравнивали с псглощенион в контрольном растворе.

Степень сшивки оценивалась путём сравнения мгновенной жёсткости волокна в ВСРР и ригорном растворе, поскольку в ВСРР вое пяришигые шлевки миозина отсоединены от актина и тот!Ж)пришип>юда^вк1ад в жёсткость (Tavvada,Kimui^ 1986) Для юмерения жёсткости валокш растягивали на 5 нм m пслсаркомера (нм п с "') за 0,12 мс и регистрировали реакцию гепряжЕНие в волокне и гомегения длины саркомеров (рис. 4 L4) Жёсткость определяли как апюшэшгиэдгнения

амплитуды напряжения к изменению длины саркомеров во время рывка Обработка ЭДК вела к повышению ригорной жёсткости, примерно пропорциональному продолжительности обработки Однако, если во время обработки волокно циклически растягивали, прирост жёсткости не превышал 10% даже после 2-х часовой сшивки и пренебрежимо мал после 20-40 минут. При увеличении ИС ригорного раствора с 0,1 до 0,6 М жёсткость сшитых волокон не менялась Ригорная жёсткость снижалась с температурой с коэффициентом (7,5±2)х10"3К~1, что совпадает с ранее найденной величиной (Бершицкий, Цатурян, 1986; Bershitsky, Tsaturyan, 1989). Таким образом, скачок температуры с 6°С до 30°С вызывал —20% падение ригорной жёсткости.

Жёсткость активированных волокон при 5"С перед сшивкой составляла 60-70% ригорной. После скачка температуры жёсткость волокна возрастала на 25-30% и при физиологической температуре достигала >90% ригорной при той же температуре Это означает почти полное присоединение миозиновых головок к тонким нитям.

После сшивки жёсткость волокон в активирующем растворе с ИС 0,2 М слегка снижалась против той, что была до обработки ЭДК. Расслабление при 0,2 М ИС снижало жёсткость, а повышение ИС до 0,6 М (ВСРР) роняло её до минимальной величины, которая зависит от степени сшивки Поскольку дальнейшее повышение ИС расслабляющего раствора не ведёт к снижению жёсткости (Tawada, Kimura, 1986), величина в 0,6 М использовалась как стандартная для оценки числа мостиков, пришитых к тонким нитям. Жёсткость волокон с температурой падала так же, как и в риторе. Таким образом, отношение жёсткостей в ВСРР и в риторе, SN, не зависело от температуры и могло служить мерой степени сшивки. Рис. 4.1 показывает зависимость SN от продолжительности обработки ЭДК. При непрерывной обработке 15 мМ ЭДК при 15°С полувремя прироста жёсткости составляло 40±3 мин (М±о, рис. 4.1 Б). После 2-х часовой обработки ЭДК SN достигал 0,93-0,98. Однако, если обработка прерывалась 2-3 расслаблениями, полувремя возрастало до 60±5 мин (рис. 4 1Б пунктир) и SN был ¿0,8 даже после 2-х часов экспозиции в растворе ЭДК.

Рис 4.1. Жёсткость волокон, обработанных ЭДК. А Пример экспериментальной записи. Изменения длины саркомеров (верхняя кривая) и напряжения (нижняя кривая) в ответ на ступенчатое растяжение волокна в ригорном растворе (1) и в ВСРР (2) после 35 минут сшивки 15 мМ ЭДК. Длина саркомеров 2,5 мкм, размеры волокна 1,96 ммх4160 мкм2, 5"С. Б. Жёсткость в ВСРР, нормализованная на жёсткость в риторе, Sn, от продолжительности обработки ЭДК. □, волокна, обработанные ЭДК непрерывно; О, волокна, в которых обработка с помощью ЭДК два или три раза прерывалась расслаблениями. Сплошная и пунктирная линии - экспоненциальная аппроксимация для непрерывной и прерывистой обработки, соответственно

4.2. Скорость АТФазы в волокнах, обработанных ЭДК. В контрольном эксперименте скорость АТФазы мышечного волокна после 30-и минут обработки ЭДК (SN = 32%) была измерена в ВСРР при 15°С. За час из сегмента волокна объёмом 10 нанолитров в

100 мкл камере высвободилось 2,4x1с-9 моль Mg-АДФ Таким образом, скорость АТФазы в волокне составила ~67 мкМ-с-1. При концентрации головок миозина в волокне кролика 154 мкМ (Ferenczi, Homsher, Trentham, 1984) получаем АТФазу -0,45 с"1 на одну головку. Эта -20-25% того, что получили Glyn и Sleep (1985), а также Potma и др (1994) при изометрическом сокращении волокна при 15°С (1,78+0,24 с-1 и 2,3±0,05 с-1, соответственно). При SN = 20%, от 17% до 32% головок пришиты и способны взаимодействовать с актином в ВСРР. Следует помнить, что количественная оценка числа пришитых головок зависит от относительной податливости структурных элементов в саркомере. В любом случае, АТФазная активность в расчете на присоединённую головку после сшивки с точностью в +30% совпадает с активностью при нормальном изометрическом сокращении. Вклад в АТФазу непршшпых головок в ВСРР <20% полной АТФазы, так как даже при нормальной ИС скорость гидролиза АТФ отсоединёнными головками меньше 0,1 с"1 (Ferenczi и др., 1984), а возможно, ниже 0,04 с"1 (Potma и др., 1994).

4 3 Механические ответы в сшитых волокнах. В риторе (рис. 4 1А) рывок волокна вызывает почти чисто упругий ответ Напряжение меняется одновременно с длиной саркомеров, а медленная релаксация мала по амплитуде. Наоборот, после короткой сшивки (SN <0,4) релаксация напряжения, вызванного рывком волокна в ВСРР, происходит намного быстрее и гораздо больше по величине Этот ответ похож на быстрое частичное восстановление напряжения (Huxley, Simmons, 1971) в интактных мышечных волокнах. С увеличением степени сшивки ответы становятся более ригороподобными. Поэтому мы исследовали механические свойства сшитых мышечных волокон, у которых SN лежал в диапазоне 0,25-0,4.

Рис. 4.2. Механические ответы на ступенчатые изменения длины в мышечных волокнах, обработанных ЭДК, в ВСРР при 5°С. А. Записи изменения длины саркомеров (верхние кривые) и напряжения (нижние кривые) после сшивки в течение 20 мин 15 мМ ЭДК Начальная длина саркомеров 2,55 мкм, размеры волокна: 1,92 ммх6350 мкм2. Б. Зависимость кажущейся константы скорости быстрого частичного

восстановления напряжения на ступенчатое изменение длины, к^ от величины ступеньки Открытые символы относятся к различным спппым волокнам в ВСРР с ¿N = 0,25-0,4. Крестики - неспппые волокна в активирующем растворе с ионной силой ОД M

Основной признак переходных процессов напряжения в волокне, описанных Huxley и Simmons'ом, это зависимость их кинетики от знака и величины ступенчатой деформации (Huxley, Simmons, 1971, Ford и др., 1977). Для проверки способности пришитых мостиков отвечать таким же образом, мы исследовали зависимость механических переходных процессов волокон, обработанных ЭДК, в ВСРР. После сшивки напряжение в волокне может быть выбрано его вытяжением или укорочением. В механических экспериментах волокна вытягивали так, чтобы шкалировать напряжение с жёсткостью до величин, близких к таковым в активированных

» «■ ï

» м-t

Констомп скорости, мс1

И - Я -•!

-4 2 0 2 ¿SL, mifltf

несшитых волокнах Среднее напряжение на мостик выбирали было примерно таким, как во время сокращения при той же температуре Ответы напряжения на ступенчатые деформации от +1,6 до -4 пм-(п.с.)4 при 5°С показаны на рис. 4.24 Амплитуда частичного восстановления напряжения возрастает с величиной ступенчатого укорочения. Зависимость кажущейся константы скорости, к.т, от амплитуды ступенчатого изменения длины волокна показана на рис 4 2Б Она ведйт себя так же, как и в переходнике Huxley-Simmons'a в интактных волокнах и как в сокращающемся несшитом волокне (рис 4 2Б) Естественно, в сшитых волокнах в ВСРР отсутствует фаза медленного восстановления напряжения (фаза 4, Huxley, Simmons, 1971), так как перецепление мостиков в них невозможно (рис. 4.2/1).

Медленное восстановление напряжения, вызванное циклированием непришитых головок миозина, было неполным из-за сопротивления пришитых головок, неспособных отсоединяться Мы не обнаружили никаких заметных изменений кинетики быстрого частичного восстановления напряжения в активированном волокне по сравнению с кинетикой ответов в ВСРР.

Рис. 43. Ответы длины саркомеров (верхние кривые) и напряжения (нижние кривые) на ступенчатые изменения длины в ВСРР при 20°С Волокно было обработано 15 мМ ЭДК в течение 20 мин, 0,25. Начальная длина саркомеров 2,4 мкм, размеры волокна 2,05 ммх6400 мкм2.

Рис. 4.4. Ответы длины саркомеров (верхние кривые) и напряжения (нижние кривые) на ступенчатые изменения длины в активирующем растворе после обработки ЭДК (рСа=4,5; ионная сила 0,2 М; 20°С). То же волокно, что на рис. 4.3.

4 4. Ответы напряжения на скачок температуры в сшитых волокнах. Как было показано, высокоамплитудный скачок температуры в волокнах вызывает многократный рост напряжения в активированных мышечных, который не

сопровождается заметным повышением жёсткости волокон (Бершицкий, Цатурян, 1988; ВегеИаяку, Твайпуап, 1989, 1992, 2002) Мы использовали этот метод, чтобы исследовать силогенерирующую способность пришитых поперечных мостиков На рисунке 4 5А показаны ответы напряжения, вызванные скачками температуры с 5-9°С до 28-31 "С до и после сшивки.

Перенос частично сшитых волокон = 0,25-0,4) из ВСРР в активирующий раствор с ИС 0,2 М вызывал прирост как напряжения, так и жёсткости (рис. 4.3 и 4.4), которые, однако, не достигали своего уровня до сшивки. Увеличение жёсткости и напряжения указывают на то, что при Са2+-активации существенная доля непришгаых мостиков вовлекается во взаимодействие между толстыми и тонкими нитями.

Скачок температуры в волокне до сшивки вызывал небольшое мгновенное падение напряжения из-за теплового расширения волокна, за которым следовал двукратный рост напряжения (кривая 1, рис. 4.5). Жёсткость волокна во время роста напряжения возрастала примерно на -25% и достигала 98% ригорной при высокой температуре. В риторе скачок температуры вёл лишь к мгновенному падению напряжения (кривая 3, рис. 4.5). Ригорные ответы не менялись после сшивки и не зависели от ИС В частично сшитых волокнах = 0,25-0,4) скачки температуры в ВСРР вели к росту напряжения, подобно тому, что и до сшивки (кривая 4, рис. 4.5) С увеличением степени сшивки волокна утрачивали способность к силогенерации и ответы напряжения на скачок температуры становились всё более ригороподобными. Амплитуда ответов на скачок температуры в активированном состоянии также возрастала по сравнению с ответами в ВСРР, хотя менее выраженно, чем до сшивки (рис. 4.5).

г "и

Рис. 4.5. Ответы напряжения на скачки температуры с 9°С до 28-ЗГС до (1 и 3) и после (2 и 4) 20 минутной обработки ЭДК, Хк = 0,28. Слева записи напряжения в активном состоянии (1 и 2), ригоре (3) и ВСРР (4). Справа те же записи, что в А, но изменение напряжения после скачка температуры, ДТ, нормировано на жёсткость волокна, 5, в тех же растворах при 30°С. Размеры волокна: 1,94 мм х 4600 мкм2, длина саркомеров 2,4$ мкм.

8рмя,мс

Вр«я.ис

Чтобы сравнить ответы напряжения с разным числом участвующих в них мостиков, изменения напряжения после скачка температуры пронормировали на жёсткость волокон при конечной температуре (рис 4 5Б) Видно, что в присутствии АТФ нормализованные ответы в сшитых волокнах подобны тем, что были до сшивки Кинетика роста напряжения в ВСРР несколько быстрее, чем в несшитых волокнах При Са2+-активации сшитых волокон как амплитуды ответов, так и кинетика были промежуточными. В любом случае кинетика температурных ответов существенно медленнее, чем кинетика ответов, вызванных ступенчатыми деформациями волокна.

Время мс

Рис. 4.6. Ответы изменения длины саркомеров (верхние кривые) и напряжения (нижние кривые) на скачки температуры с 9°С до 37,5-38,5°С при разном начальном натяжении волокна, приложенные в момент времени 0. Волокно было обработано 15мМ ЭДК в течение 30 мин, после чего раствор был заменен на ВСРР, 0,28. Длина

саркомеров 2,5 мкм, размеры волокна 1,84 ммх4200 мкм2.

Для минимизации возможного влияния начального растяжения спштых волокон, мы исследовали зависимость температурных ответов напряжения от начального напряжения На рис 4 6 показаны ответы напряжения и длины саркомеров в волокне в ВСРР на скачки температуры с 9°С до 37-38,5°С при разных начальных растяжениях Обнаружилось, что растяжение было оптимальным, когда длина саркомеров оставалась практически неизменной во время роста напряжения. В этом случае амшппуда роста напряжения была максимальной (кривые 2 и 3, рис. 4.6). Вне этого диапазона саркомеры либо укорачивались, либо вытягивались, а прирост напряжения был меньше. Кинетику роста напряжения аппроксимировали одной экспоненгой, констант скорости которой (250-300 с"1) не зависела от начального растяжения (рис. 4.7Б). При оптимальной длине отношение напряжения к жёсткости составляло 1,2-1,5 того, чш наблюдалось в несшитых волокнах при 5-6°С. Пользуясь этим критерием, в экспериментах со скачком температуры в волокнах, обработанных ЭДК, их начальную д лину устанавливали в оптимальном д иапазоне.

®1

1» Р ° ■

I 4 О

ъ 2- ■

эоо- о В

» . « ■ ■

1 200-

0 г 1 100-

1

| 50 100 150

Начально* имряжми* кН*г2

Рис. 4.7. А. Амплитуда роста напряжения (ДТ, равная стационарному напряжению после скачка температуры минус его минимальное значение сразу после скачка), нормализованное на жёсткость волокна, 5. Б. Константа скорости роста напряжения как функция начального напряжения. Данные из эксперимента, показанного на рис. 4.6.

Используя обратную связь по силе, мы проверили способность пришитых мостиков укорачивался в ответ на скачок температуры в ВСРР (рис. 4.8). Видно, что прирост напряжения на 38 кНм-2 может быть скомпенсирован укорочением на 2,6 нм-(пс.)~'. Временной ход укорочения такой же, как и роста напряжения. Такая же величина укорочения, ДКЬ = 2,6 нм-(пс.)_1, может бьпъ получена делением амгоплуды роста напряжения, ДТ = 38 кНм-2, на жёсткость волокна, Б = 15х1012 Н(п.с.}м~3 при 30°С. Таким образом, амплитуда роста напряжения, нормализованная на жёсткость волокна, действительно характеризует способность пришитых мостиков укорачиваться

Рис. 4.8. Огееты длины саркомеров (верхние кривые) и напряжения (нижние кривые) на скачки температуры с 10°С до 32,1-32,5°С, приложенные в момент времени 0 под контролем обратной связи по полной длине волокна (1 и 2) и по силе (3). Волокно обработано ЭДК в течение 40 мин, а затем раствор был заменён на ригорный (1) или ВСРР (2 и 3), & = 0,34. Начальная длина саркомеров 2,5 мкм, размеры волокна 1,96 ммх41б0 мкм2. Вертикальные метки показывают укорочение саркомеров (АЯ, = 2,6 нм-(п.с.)-1) при постоянной силе и прирост напряжения (ДГ= 38 кН-м~2) при постоянной длине саркомеров.

На рис 4.9 показан нормализованный рост напряжения, вызванный скачком температуры, от нормализованной жёсткости, Видно, что способность развивать напряжение и укорачиваться снижается со степенью сшивки. Когда > 90%, ответы становятся ригороподобными (рис 4.10) Чтобы установить, является ли потеря силогенерирующей способности следствием именно степени сшивки мостиков или иными эффектами длительней обработки ЭДК, мы сравнили ответы на скачки температуры волокон после 120 минут непрерывной сшивки с ответами волокся, обработанных ЭДК 4 раза по 30 мин. Оказалось, чш обработка, прерванная расслаблениями волокна, ведёт к снижение 5м. На рис. 4.10 видно, что при одинаковой суммарной экспозиции, рост напряжения на скачок температуры заметно

более выражен после прерывистой сшивки и нормализованный рост напряжения в этом случае скорее похож на тот, что дают волокна при 60 мин непрерывной сшивки

4.5. Генерация силы ковапентно пришитыми поперечными мостиками. Как мы видим, высокоамплшудный скачок температуры вызывает генерацию силы или укорочение, которые производят коваленпю пришише мостики Рост напряжения в ответ на скачок температуры, нормализованный на жёсткость, использовался как количественная мера силогенерирующей способности мостиков. При оптимальном начальном растяжении нормализованный рост напряжения в ВСРР был несколько меньше по амшппуде, но быстрее, чем в сокращающемся волокне до сшивки (рис. 4 5Б) Ускорение кинетики может быть объяснено тем, что в сшитых волокнах в ВСРР нет перецетшения мостиков В несшитых волокнах гсерецепление, как мы показали ранее, участвует в механических ответах на скачок температуры (ВегзЪйзку, Твайлуал, 1992). Кажущаяся константа скорости роста напряжения в ответ на скачок температуры составляет 200-300 с-1 при 30-38°С

Рис. 4.9. Зависимость укорочения саркомеров (ЛУД, х) или роста напряжения (ДГ, нормализована на жёспсосп>, О) после скачка температуры как функция степени сшивки, оцененной по жёсткости волокна в ВСРР, нормализованной на жёсткосп. в риторе, /5ч.

о

ъ 1 - с! V

О ч °© \

ч •

% о О

о 0 0,5 1 Нормализованная жесткость,

Рис. 4.10. Ответы напряжения на скачки температуры с 9°С до 32-35°С, приложенные в момент времени 0 в ВСРР (1) и ригоре (2). А: После 30-и минутной обработки ЭДК, волокно было промыто и расслаблено в ВСРР. Эта процедура была повторена 4 раза с тем, чтобы полная экспозиция в ЭДК составила 120 мин (Як - 0,75). Длина саркомеров 2,5 мкм, размеры волокна 1,96ммх4100 мкм2. Б: Волокно было обработано ЭДК в течение 120 мин непрерывно = 0,95), размеры волокна 1,64 ммх6700 мкм2, длина саркомеров 2,5 мкм.

При постоянной сипе пришитые мостики способны укорачивать волокно в ответ на скачок температуры (рис. 4.8) После частичной сшивки, когда 0,25-0,4, наблюдаемое укорочение достигает 4 нм<пс.) . Количественно оцененная в изометрических условиях по амплшуде роста напряжения, нормализованного на жёсткость (рис. 4.8, 4.9), величина укорочения

составляет 5,5 hm-(rc.)_1 (рис. 4ПА). Обе величины в 4 и 5,5 нм (п.с.)-1 являются недооценкой величины шага мостика: во-первых, часть мостике® не совершает шаг и, значит, препятствует укорочению. Доля таких 'мешающих' мостике» растёт со степенью сшивки (рис. 4.9), но их число может бьпъ значительным даже при низкой SN. Во-вторых, в наших экспериментах волокна укорачивались под нагрузкой, сравнимой с изометрической. Принимая во внимание эти два фактора, мы полагаем, что наши данные находятся в соответствии с величиной шага в 11-15 нм, полученной в in vitm экспериментах (Finer и др., 1994).

Сила и работа пришитого мостика, могут бьпъ оценены следующим образом. При частичной сшивке SN составляет 0,25-0,4, а степень сшивки составляет 0,1 -0,4. Напряжение перед скачком температуры при огпимальном растяжении - 40-100 кН м"2. При длине саркомеров 2,4 мкм и концентрации миозина в волокне 150 мкМ (Ferenczi и др., 1984), величина силы на пришитую головку миозина - 1,5-2,5 пН, если считал, толстые и тонкие филамешы жёсткими и если в каждой головке есп> свой упругий элемент, или 4-5,5 пН, если суммарные податливости нитей и мостиков равны и две головки имеют один упругий элемент. Умножая злу силу на укорочение полусаркомера в 4-5,5 нм, получаем работу в 6,5-30х1(Г21 Дж, или 1,6-7,5 кТ (где к - константа Больцмана, а Т - абсолютная температура), которую производит головка миозина в ответ на скачок температуры щи оптимальном растяжении.

Весьма вероятно, что не все пришитые головки участвуют в механическом ответе на скачок температуры, а растяжимость филаменгов не пренебрежимо мала (Н Huxley и др., 1994; Wakabayashi и др., 1994). Тогда работа мостика будет ближе к верхней границе этого диапазона (5-7,5 кТ). Это означает, что эндотермический процесс, ответственный за механический переходный процесс, вызванный скачком температуры, связан с существенным производством работы, а эта работа - значительная часть свободной энергии гидролиза АТФ (90х 1(Г21 Дж, или 22 кТ).

Наиболее интригующей чертой ответов напряжения, показанных на рис. 4.6, является кажущаяся независимость кинетики роста напряжения от величины растяжения волокна. Константа скорости меняется на величину <20%, когда начальное напряжение увеличивали в шесть раз, а работа возрастала с нуля до > 5 кТ (рис 4 7) Мы не могли дать сколь-либо разумное объяснение этому результату в рамках существующих моделей, основанных на теории абсолютных скоростей реакций (Huxley, Simmons, 1971). В соответствии с этими моделями константа скорости силогенерирующего процесса является экспоненциальной функцией работы мостика, нормированной на кТ, и должна меняться в 2,7 раза, когда работа мостика возрастает на 1 кТ= 4х10~2' Дж

5. Кинетика структурных изменений при развитии напряжения в мышечных волокнах кролика в ответ на скачок температуры.

Для детального исследования механизма силогенерации нам представлялось важным зарегистрировать временной ход изменения интенсивности как первой актиновой слоевой линии, так и других рефлексов на рентгенограмме мышцы, меняющихся с механическим напряжением вследствие, в частности, изменения температуры. С этой целью в реиптенодифракционных исследованиях со скачком температуры переключились с мышечных волокон лягушки на волокна кролика. Температурная чувствительность напряжения в диапазоне от 5°С до 35°С у холоднокровных животных ниже, чем у теплокровных Максимальный прирост напряжения в экспериментах на волокнах лягушки (Bershitsky и др., 1996,1997; Tsaturyan и др., 1999) -70% при повышении температуры с 5°С до 30°С, тогда как в кролике в этом

диапазоне напряжение растёт в 2,5-3 раза (ВегвИквку, ТБаШгуап, 2002). Естественно ожидать, что, если интенсивность актиновых слоевых линий связана с напряжением, то и её изменения на рентгенограмме тоже более выражены в мышцах кролика по сравнению с лягушкой. Кроме того, поскольку мышцы теплокровных при температуре ~5°С развивают едва ли треть максимального для них напряжения, то активация при такой температуре в меньшей степени разупорядочивает саркомеры и это позволяет либо совсем избежать искусственной стабилизации саркомеров сшивкой с помощью ЭДК, либо существенно снизить степень сшивки. Имеется серьёзный недостаток мышечных волокон кролика при использовании их в рентгенодифракционных экспериментах - они примерно вдвое тоньше волокон лягушки. Это значит, что при равной интенсивности и размере рентгеновского луча (который всегда больше диаметра волокна) количество рассеянных фотонов будет примерно в 4 раза меньше из-за уменьшения дифрагирующей массы. По этой причине для рентгенодифракционных экспериментов на мышцах кролика мы использовали не одиночные волокна, а пучки из трёх-четырёх волокон, связанных вместе либо самими волокнами, либо волосом. Такой препарат сравним по диаметру с одиночными волокнами лягушки и при примерно вдвое меньшей степени сшивки с помощью ЭДК, чем та, что использовалась в волокнах лягушки, показал себя достаточно удобным объектом. Длина саркомеров в нём, регистрируемая с помощью лазерной дифракции, остаётся вполне стабильной в течение длительной активации, максимальное развиваемое напряжение такое же, как в одиночных волокнах, и в течение эксперимента, длящегося порой несколько часов, падает не более чем на 10% начального.

5.1 Эксперименты высокого пространственного разрешения: трёхкадровый протокол. Для детального пространственного разрешения структурных изменений, сопровождающих рост напряжения в ответ на скачок температуры, мы сделали эксперименты на станции ГО02 синхротрона ЕвЮ7 (Гренобль, Франция), луч которого в диаметре значительно меньше, чем на вЯв и гораздо лучше коллимирован. Однако используемый на этом синхротроне двумерный детектор РЯеЬоК на основе ПЗС, обладающий высоким пространственным разрешением, но относительно низким быстродействием не позволяет регистрировать быстрые структурные изменения на рентгенограмме. По этой причине протокол регистрации был адаптирован к ПЗС детектору и представлял собой 3 кадра, снятые на плато силы при 5°С перед скачком температуры, во время роста силы в мышечном пучке, когда среднее напряжение составляет примерно половину между начальным и максимальным, и на плато силы при ~30°С с длительностями 15 мс, 6 мс и 15 мс, соответственно. Протокол эксперимента и разностные рентгенограммы показаны на рис. 5.1. На разности между "горячим" и "холодным" состояниями ясно видно повышение интенсивностей всех актиновых и актин-миозиновых слоевых линий, а также меридиональных рефлексов. Однако разница между «средним» и «холодным» состояниями показывает заметное отклонение от монотонности- прирост интенсивности меридионального рефлекса МЗ к этому моменту, когда напряжение и интенсивность первой актиновой слоевой линии достигают примерно полумаксимума, существенно ниже ожидаемой половины того, который достигается при высокой температуре. Из профилей интенсивности, показанных на рис. 5.2, видно, что прирост /А1 в промежуточном состоянии составляет -50% максимального, тогда как прирост /ш к этому моменту - только 10-15%!

Рис. 5.1. А: 3-кадровый протокол, использовавшийся для регистрации рентгенодифракционных изменений в пучках мышечных волокон в ответ на скачок температуры на станции ID02 синхротрона ESRF с помощью ПЗС детектора Длительность 'холодного' (X, ~5°С) и 'горячего' (Г, в среднем 32°С) кадров на плато напряжения при низкой и высокой температуре составляла 15 мс, а среднего кадра (С) во время роста напряжения - 6 мс Б: разностные рентгенограммы, полученные 150 повторениями 3-кадрового протокола на 5 пучках мышечных волокон и приведённые к одному времени Верхняя половина -разность между 'горячим' и 'холодным' кадрами Хорошо виден весь набор актиновых и актин-миозиновых слоевых линий, а также миозиновые рефлексы Нижняя половина - разность между промежуточным и 'холодным' кадрами Слоевые линии, кроме 1-й актиновой, почти не видны, слабо заметен рефлекс МЗ

Таким образом, результаты "трёхкадрового протокола" позволили выявить отличия в поведении первой актиновой слоевой линии и рефлекса МЗ и дали основание полагать, что процессы, ответственные за эти различия, имеют разную природу, а изменения интенсивносгей рефлексов требуют более детального исследования их временного хода

5.2. Измерение временного хода рефлексов• эксперименты высокого временного разрешения Первая серия экспериментов по исследованию кинетики изменения интенсивносгей наиболее ярких рефлексов дифракционной рентгенограммы тонких пучков скинированных волокон скелетной мышцы кролика в ответ на скачок температуры с 5°С до 30°С была сделана на станции 16.1 источника рентгеновского излучения Дасберийского синхротрона (см. Towns-Andrews и др., 1989). Оптика станции не позволяет сфокусировать относительно толстый луч этого источника таким образом, чтобы измерить малые пространственные изменения на рентгенограмме (см. рис. 6.3 и 6.4), однако временное и пространственное разрешение установленного на станции двумерного газонаполненного детектора RAPID (Lewis и др., 1997) таково, что позволило реализовать запланированные нами эксперименты. В результате нескольких сот повторений экспериментального протокола было достигнуто разрешение временного хода изменения интенсивносгей наиболее ярких рефлексов и слоевых линий достаточно высокое для того, чтобы говорить о кинетике структурных событий, происходящих в мышечном волокне после скачка температуры.

Нам удалось зарегистрировать с 1 мс временным разрешением изменения интенсивностей 1-й (/д)) и 6-й (1А6) слоевых линий актина, а также меридионального рефлекса МЗ (/мз), сопровождающие рост силы в мышечных пучках в ответ на скачок температуры На рис. 7.4 показан протокол эксперимента, усреднённые данные изменения напряжения в мышечных пучках и интенсивностей рефлексов. Видно, что интенсивности актиновых слоевых линий повышаются сразу же вслед за скачком температуры и растут примерно с той же кинетикой, что и напряжение в мышечных пучках. Повышение /А1 и, возможно, /Аб даже слегка опережает рост силы. Кажущееся

полувремя роста этих ингенсивностей составило -4,6 мс и -2,5 мс (константы скорости -160 с"1 и -300 с"1), соответственно, а полувремя роста напряжения было 3,4 мс Однако полувремя роста /ш составляло 5.1 мс (константа скорости -145 с'1) и, кроме того, рост /ш начинался на несколько миллисекунд позднее роста напряжения. Это достаточно ясно видно на суперпозиции временного хода напряжения, /А| и /ш, показанной на рис. 5.4.

Таким образом, результаты этой серии экспериментов полностью подтверждают те, что были получены в экспериментах с трёхкадровым протоколом: видимое теперь отставание временного хода интенсивности рефлекса МЗ к росту напряжения и интенсивности слоевых линий на статических кадрах проявлялось как 'недостаточный' рост интенсивности рефлекса МЗ в промежуточном кадре. Однако, результаты ни 'статической', ни 'динамической' серий экспериментов так и не прояснили вопрос о природе задержки роста интенсивности рефлекса МЗ. Основной проблемой оказалось пространственное разрешение на Дасберийском источнике излучения, которое из-за высокого уровня шума не позволило увидеть существенных деталей временного хода рефлексов. Ясно, что экспериментальный протокол по регистрации временного хода рефлексов нужно было повторять с лучшим пространственным разрешением, то есть на ЕвШ7, но с регистрацией на быстром детекторе, то есть ИАРГО'е.

Рис. &2. Профили ишшсивностей актиновых и акпш-миозиновых слоевых линий (А) и мисвиновых рефлексов (В) на решгенограмме (рис. 4.1Б) сокращающихся мышечных пучков при (вменении температуры в 3-кадровом цхлоколе (рис. 5.L4). Интенсивности слоевых линий проинтегрированы вдоль экватора во внемеридиональной области. Интенсивности миовиновых рефлексов проинтегрированы вдоль экватора в меридиональной облает На А показана суперпозиция слоевых линий во время сокращения на шито при низкой и высокой температуре, в промежуточном кадре (чёрный) и в риторе (серый), где все головки миозина присоединены к тлям амина. Верхний набор кривых содержит фоновую интенсивность, на нижнем наборе те же кривые показаны после вычитания фона. Видно, что интенсивности всех аюиновых линий прирастают. интенсивность 1 -й акгановой слоевой линии в промежуточном кадре находится примерно посередине между 'горячим' и 'холодным' значениями. Из профиля рефлекса МЗ на Б видно, что его интенсивность в промежуточном кадре существенно ниже серединл между амплитудами пиков при низкой и высокой температуре.

1

, Ригор

I \ Горячий

Среднии Холодный

500 600

Номер пиксела

Рис. S3. Изменения напряжения и интенсивностей наиболее ярких

рентгеновских рефлексов в пучках волокон скелетной мышцы кролика в ответ на скачок температуры во время сокращения. Данные из рентгенограмм, полученных 675 повторениями экспериментального протокола в 22 мышечных пучках зарегистрированных двумерным детектором RAPID с временным разрешением 1 мс на станции 16.1 Дасберийского синхротрона. А: Протокол эксперимента и временной ход напряжения в мышечных пучках. Б: Временной ход интенсивностей 1-й (1м) и 6-й (/«) аюиновых слоевых линий. Пунктиром показано усреднённое напряжение. В: Временной ход изменения интенсивности рефлекса МЗ и напряжения в мышечных пучках. Сплошными линии - усреднение по всем повторениям протокола, пунктир - по первым в каждом пучке, где кинетика роста напряжения была выше средней.

Рис. 5.4. Суперпозиция временного хода изменения напряжения (чёрная линия) и интенсивностей первой актиновой слоевой линии (/а1, синяя линия) и третьего миозинового рефлекса (/мз, красная линия) дифракционной рентгенограммы пучков мышечных волокон кролика в ответ на скачок температуры во время сокращения. Данные усреднены по всем повторениям протокола во всех мышечных пучках (рис. 5.3).

5.3. Измерение временного хода vedmexcoe с высоким временным и пространственным разрешением. Нам посчастливилось сделать серию экспериментов по регистрации временного хода изменений /А1 и /мз в пучках мышечных волокон кролика в слвег на скачок температуры с 5°С до ЗО^С на станции ID02 синхротрона ESRF с помощью детектора RAPID (Lewis и др., 1997). Длина камеры в згой серии была 10 м, что позволило получить наряду с временным, ещё и высокое пространственное разраншие интересующих нас рефлексов. Всего было сделано 150 повторений экспериментального протокола на 5 пучках мышечных »

волокон по три волокна в каждом, что позволило зарегистрировать временной ход изменения интенсивностей рефлексов с разрешением в 1 миллисекунду. На рисунке 5.5 показаны результаты этой серии экспериментов. Качество данных позволило аппроксимировать временной ход наиболее ярких рефлексов экспонентами. На рис. 4.6 изменения напряжения и /мз и /А] показаны в нормализованном виде для сравнения их кинетики. Видно, что временной ход роста интенсивности /А1 однофазный и опережает

развитие напряжения, его константа скорости 235 с"1 (ЬА = 3,0 мс), а изменение двухфазное - в момент скачка температуры /мз падает на -25% исходного уровня

Рис. 5.5. Временной ход механических и структурных ответов на скачок температуры. Сверху вниз, усреднённая температура, типичная запись изменения длины саркомеров, усреднённое напряжение, /мз, /дь I\,i (квадратики) и /i,o (кружочки), полученные 150 повторениями экспериментального протокола на 5 пучках из трёх мышечных волокон каждый на станции ID02 синхротрона ESRF детектором RAPID в 1 мс временных интервалах, интенсивность луча 1013 фотонов в секунду. Интенсивность рефлексов показана на графиках в килофотонах в миллисекунду.

Рис. 5.6. Усреднённый временной ход напряжения (чёрная линия) в мышечных пучках в ответ на скачок температуры с 5°С до 30*С и интенсивностей 1-й акпшовой слоевой линии (7М) и рефлекса МЗ (До) в нормализованном виде. Те же данные, что на рис. 4.5. Ломаными линии экспериментальные данные, гладкие -экспоненциальные аппроксимации данных. Временной ход 1М представляет собой одноэкспоненциальный процесс с константой скорости 400 с"1, временной ход 1ув описывается двумя фазами: снижение интенсивности и её последующий рост с константами скорости 1200 с"1 и 240 с"1, соответственно. Константа скорости роста напряжения 195 с!. Пунктиром показана фаза роста /мз, сдвинутого к моменту скачка температуры для её сравнения с кривой роста напряжения.

с константой скорости -1200 с'1, а потом растёт с константой скорости -240 с'1 (Ъл = 2,9 мс), достигая при высокой температуре 160% того уровня, что имел место при низкой.

Таким образом, мы получили детали временного хода интенсивности основных рентгеновских рефлексов в мышечном волокне при росте напряжения в ответ на скачок температуры полностью совместимых с тем, что мы наблюдали в экспериментах на 81У> с

худшим пространственным разрешением и в 3-кадровом протоколе на КЯУ7 Становится понятой кажущаяся задержка в росте интенсивности МЗ по отношению к напряжению и А1 Естественно, что нам хотелось бы понять обнаруженное поведение рефлексов рентгенограммы в терминах тех структурных изменений в миозиновых мостиках, которые происходят в них во время силогенерации

б. Структурно-кинетическая модель двухшагового механизма работы поперечного мостика

Основные результаты экспериментов по исследованию рентгеноструктурных событий, сопровождающих силогенерирующий процесс в сокращающихся мышечных волокнах, можно суммировать в виде следующих трёх пунктов (Регеш^ и др., 2005).

1. Рост интенсивности первой акгиновой слоевой линии, /АЬ и рост напряжения в ответ на скачок температуры происходят одновременно (рис. 5.4-5.6). Независимость жёсткости волокна от температуры (Твайнуап и др., 1999; ВегеЫЬку, ТваЬпуап, 2002; Р1аггея и др., 2003) и отсутствие изменений интенсивности рефлекса 1,1 после скачка температуры (рис. 5.5) указывают на то, что рост напряжения с температурой происходит при постоянстве числа миозиновых мостиков, присоединённых к тонким нитям Это означает, что рост ишшсивносш актиновых и акпш-миозиновых слоевых линий после скачка температуры (рис. 5.1, 5.24) вызывается изменением конфигурации взаимодействия мостиков с актином, а именно, их переходом из нестереоспецифического присоединения в стереоспецифическое связывание. Синхронный рост напряжения и контрастирования акгиновой спирали головками миозина показывает, что стереоспецифическое 'застегивание' головок на акгане является необходимой фазой силогенерации мостика. Падение /)>0 при относительном постоянстве также свидетельствует в пользу перехода нестереоспецифически присоединённых головок в стереоспецифически связанное состояние, поскольку когда каталитический домен нестереоспецифически присоединённой головки встраивается в спирать актина, то хвостовой домен головки миозина отходит от ствола толстой нити, снижая тем самым хотя общая масса, связанная с тонкой нитью, а следовательно и 1ух, не меняется (Твайлуап и др., 1999).

2. Интенсивность первой акгиновой слоевой линии, /А1, зависит от механического напряжения (рис. 5.1,5.3Д 5.4,5.6).

3 Изменение интенсивности рефлекса МЗ, /щ, при росте напряжения в ответ на скачок температуры носит двухфазный характер (рис 5 6) Быстрое падение 1т начинается в момент 1 мс скачка температуры, то есть происходит на той же временной шкале, что и в ответ на ступенчатую деформацию мышечного волокна. Кажется неожиданным, что это падение интенсивности не сопровождается реакцией силы. Это наблюдение предполагает, что часть ответа /ш связана со структурными переходами в присоединённых головках миозина, которые находятся в пре-силогенерирующем состоянии или состояниях. Вклад «присоединённых головок в 1Ш кажется несущественным (Хлпап и др, 2000), хотя и не может быть полностью исключён.

Кинетика роста напряжения и изменений 1А1 и /щ в мышечном волокне в ответ на скачок температуры (рис. 5.4,5.6) в несколько раз медленнее, чем изменения напряжения, /А1 и /мз,

наблюдаемые в ответ на быстрые изменения длины (рис 3 1А, 3.3A; Irving и др, 1992,2000; Lombardi и др, 1995) Кроме того, кинетика переходного процесса напряжения, вызванного ступенчатыми изменениями длины является зависимой от напряжения (Huxley, Simmons, 1971), тогда как переходный процесс в ответ на скачок температуры выглядит не зависящим от напряжения (гл. 3, 4; Bershitsky, Tsaturyan, 1995, 2002). В то же время силогенерирующий переход обязан зависеть от напряжения в силу вклада упругой энергии в энергию активации такого перехода (Huxley, Simmons, 1971). Ответы на скачок температуры кажутся не зависящими от напряжения, хотя увеличение силы при высокой температуре и постоянство числа присоединённых мостиков явно указывает на то, что средняя сила, приходящаяся на один мостик, растёт. Такие наблюдения заставляют полагать, что время-лимитирующие шаги в молекулярных событиях, вызванных быстрыми изменениями температуры и длины, различны. Это различие может быть объяснено тем, что в ответ на скачок температуры быстрый, зависящий от напряжения силогенерирующий процесс маскируется более медленным скорость-лимитирующим и не зависящим от напряжения кинетическим шагом (или несколькими шагами), предшествующим силогенерации.

Структурно-кинетическая модель. Для интерпретации результатов мы предлагаем структурно-кинетическую модель (Ferenczi и др., 2005), показанную на рис. 6.1 и основанную на следующих предположениях:

1 Силогенерирующий процесс миозиновых головок происходит в два шага: а) вращение нестереоспецифически присоединённых головок и их застегиванием как целого в стереоспецифически связанное состояние (переход 3 -> 4 на рис. 6.1) и б) последующий поворот шейного домена вокруг моторного домена (переход 4 —> 5). Первый шаг не сопровождается изменениями в субфрагменге-1, тогда как второй связан с открытием фосфат-связывающего кармана (сопряжённого с движением рычага, то есть, шейного домена), способствующего высвобождению фосфата и АДФ (Geeves, Holmes, 1999);

2. Оба шага силогенерации быстрые (-1,000 с'1), обратимы и зависят от механического напряжения, как предполагается моделями типа Huxley и Simmons'a (Huxley, Simmons, 1971; Piazzesi, Lombardi, 1995). При низкой нагрузке каждый из этих шагов может переместить нити на 4-5 нм. Если скольжение нитей невозможно, энергия шага сохраняется в виде упругой энергии изгиба шейного домена субфрагмента-1 (рис. 6.1 ; Dobbie и др, 1998);

3. Переход 'вращение-застёгивание' (3 —» 4 на рис. 6.1) может происходить только после гидролиза АТФ;

4 Как показывают кинетические эксперименты (Malnasi-Csizmadia и др., 2001; Urbanke, Wray, 2001), гидролиз АТФ происходит в две стадии: быстрого перехода (Г -> 2') из открытой в закрытую конформацию (закрытие АТФ-связывакяцего кармана и движения конвертора и хвостового домена в противоположном силогенерирующему шагу направлении), за которым следует собственно гидролиз, более медленный и термозависимый (2 —► 3,2' —> 3');

5. Открытый и закрытый М-АТФ и пре-силогенерирующий М-АДФ-Р, комплексы связывают актин слабо, обратимо и нестереоспецифически, видимо через электростатические контакты между лизин-содержащей петлёй 2 на субфрагменге-1 и положительно заряженой N-терминалыо актина (Rayment и др , 1993). Эти комплексы обладают существенной осевой, или продольной,

жёсткостью, но головки в таких комплексах присоединены к актину под разными азимутальными и осевыми углами, как предполагалось в ряде публикаций (Bershitsky и др., 1997; Tsaturyan и др., 1999; Huxley, 2000) и наблюдалось с помощью электронной микроскопии в сокращающихся летательных мышцах насекомых (Taylor и др., 1999) и в растворе актин-субфрамент-1 (Walker и др., 1999). Вклад нестереоспецифически присоединённых головок в актиновые и актин-миозиновые слоевые линии низок, поскольку распределение их дифрагирующей массы в пространстве саркомера примерно однородно и не следует спиральной симметрии актина;

6. Обращение силогенерирующего шага (переход из 'открытого' в 'закрытое' состояние; Г —> 2') может происходить только в отсоединённой от актина головке миозина. Такое предположение исключает отрицательный шаг, то есть обратный шаг головки.

В соответствии с кинетической схемой (рис. 6.1 Б) система обыкновенных дифференциальных уравнений, описывающих изменение относительных концентраций с, (т.е. вероятностей пребывания миозиновых головок в состоянии i) имеет вид:

^ = ' = и,...,5,г,2-,з- (1),

"» J*t jm

где ЩТ) - константа скорости перехода из состояния « в состояние j, зависящая от абсолютной температуры Т. Мы полагали, что зависимость ЩТ) имеет стандартный вид

А!/(Г) = ^ехр(-Я!/(1/Г-1/7'0)),

где Aj/Го) - значение при температуре То, а H - параметр, характеризующий температурную зависимость. Значения констант модели при То = 5°, и Т\ = 30° приведены в табл. 6.1. Из них можно найти Ни. Константы, отсутствующие в таблице, полагали равными нулю.

Условие нормировки £ С, = 1 , дополняющее систему, означает, что в любой момент i

времени каждая головка миозина находится в одном из возможных кинетических состояний.

В качестве начальных условий выбирали стационарную точку системы (1) при То = 5°, которая соответствует стационарному изометрическому сокращению при этой температуре. Для этого приравнивали нулю все производные в левой части (1) и решали соответствующую систему линейных алгебраических уравнений. В начальный момент времени ? = 0 задавали скачок температуры по закону

Т(/)= Г„ +(Г, -Г0Х1-соз(я//г))/2, 0</<г' Г„ />г,

где т = 1 мс - длительность скачка температуры в наших экспериментах. Систему (1) решали численно на персональном компьютере методом Рунге-Кугта. Временной ход всех с,(Г) в ответ на скачок температуры от 5° до 30° при выбранных значениях к^ показан на рис. 6.2.

Рис. 6.1. Структурная и кинетическая схема механизма генерации силы головками молекулы миозина. А: Различные состояния (1-S) головки миозина (показаны серь™ и синим цветом), присоединённой к шли актина (зелёный цвет) показаны в двух проекциях* в верхнем ряду ось актиновой ниш перпендикулярна, в нижнем - параллельна плоскости рисунка. В нижнем раду Z-линия саркомера находится справа. Б: Кинетическая схема биохимического цикла мостика, используемая в модели. Пре- и пост-гидролизные состояния 2 и 3 структурно идентичны, но отличаются биохимически В состояниях 1, 2 и 3 головки в осевом направлении жёсткие и могут присоединялся к актину под разными углами в осевом и азимутальном направлении. Полный диапазон азимутальных и осевых углов ±60° и ±30°, соответственно; на рисунке показаны центральное и крайние положения головок Распределение по азимутальным и осевым углам случайное во всём телесном секторе Сила или перемещение создаются как переходом 'вращение-засгёгивание' (шаг 3 -> 4 кинетической схемы) со средним осевым вращением субфрагмента 1 как твёрдого тела на 26°, так и при повороте шейного домена (шаг 4 5), со средним осевым вращением на 50° по отношению к моторному домену. Ненапряжённые формы головок в силогенерирующих состояниях 4 и 5 показаны серым цветом (правое положение в паре, нижний ряд на А), напряжённые - синим (левое положение) А, М, АТФ, АДФ и Р, на кинетической схеме (Б) обозначают актин, субфрагмент 1 миозина, аденочин-трифосфат, аденозин-дифосфат и неорганический фосфат, соответственно Головки могут обратимо отсоединяться из состояний 1,2 и 3 в состояния 1', 2' и 3', соответственно. Константы скоростей приведены в Таблице 6.1.

Динамическую жесткость 5(f) и развиваемую силу F{t) вычисляли следующим образом Жесткость присоединенного мостика полагали не зависящей от того, присоединен ли он к актину стерео-специфически или нестерео-специфически, то есть,

S(t) = ¿с, W

где S(t) имеет смысл отношения динамической жёсткости к ее максимальному значению в состоянии ритора, в котором оно принято за единицу. Мы полагали, что средняя сила, развиваемая поперечным мостиком в каждом их нестереоспецифически связанных с

актином состояний равна нулю. Кроме того, полагали, что средняя сила, развиваемая мостиком в состоянии 5 в 2 раза больше, чем в состоянии 4. Последнее предположение связано с тем, что в отсутствие внешней силы осевое перемещение 'шейки' миозиновой головки при переходах 3—И и 4—>5 примерно одинаково и составляет 4-5 нм. В силу этого предположения относительная сила имеет вид: F[t) = c{t)+2c£t).

Интенсивности основных рентгеновских рефлексов А1 и МЗ вычисляли следующим образом. Как показали модельные расчеты (Koubassova, Tsaturyan, 2002), вклад миозиновой головки, стерео-специфически присоединенной к актину, в интенсивность первой актиновой слоевой линии не зависит от поворота 'шейного' домена относительно каталитического. Напротив, вклад в интенсивность этой слоевой линии миозиновых головок, нестерео-специфически связанных с актином, мал и им можно пренебречь (Н Кубасова, неопубликованные данные) Поэтому относительную интенсивность /А1 (нормализованную на ее максимальное значение в состоянии ритора) считали пропорциональной сумме концентраций миозиновых головок в стерео-специфически связанных с актином состояниях 4 и 5 и вычисляли по формуле: /А1 = c4(i) + c5(f). Интенсивности рефлекса МЗ вычисляли как квадрат взвешенной суммы преобразований Фурье F(14,5 нм) электронной плотности миозиновых головок в каждом из присоединённых состояний, F = I&,(t)Fh«= 1-5.

Результаты моделирования механических и структурных ответов на скачок температуры с 5°С до 30°С показаны на рис. 6.2. Консташы скоростей кинетических шагов, использованные для моделирования приведены в таблице 1. Консташы при 5°С и 30°С для двух фаз гидролиза АТФ взяты из экспериментов со скачком температуры в раствором субфрагмента-1 (Urbanke, Wray, 2001) Для упрощения предполагается, что прямая и обращая консташы скорости для перехода 'вращение-застегивание' (3 ->4) и поворота шейного домена (4 —> 5) имеют одинаковую температурную зависимость (табл. 6.1X так что равновесие между этими тремя состояниями не зависит от температуры, тогда как переходы ускоряются с температурой, как это было установлено для переходных процессов напряжения в мышечных волокнах лягушки в ответ на ступенчатые деформации (Ford и др., 1977, Piazzesi и др., 2003). Для того, чтобы обеспечил» температурную независимость жёсткости в стационарных состояниях, предполагалось, что скорость отсоединения для несгереоспецифически присоединённых состояний 1-3 возрастает с температурой (Berehitsky, Tsaturyan, 2002; Piazzesi и др., 2003). Для простоты консташы скоростей присоединения и отсоединения были одинаковыми для всех трёх несгереоспецифически присоединённых состояний 1,2иЗ(рис 61 ;табл 61)

Ответ модели на скачок температуры показан на рис. 6.2. В стационарном сокращении при низкой температуре большинство присоединённых головок миозина находятся в 'открытом' состоянии 1 поскольку равновесие перехода из 'открытого' в 'закрытое' состояние (Г —> 2') направлено в сторону Г, а гидролиз АТФ (2 —» 3,2' —> 3') происходит медленно. Напряжение производится малой долей головок (14.5%) в состояниях 4 и 5, тогда как общее число присоединённых головок составляет -50%. После скачка температуры равновесие перехода между 'открытым' и 'закрытым' состояниями (Г -> 2') сдвигается в сторону 2' и доля головок в 'закрытых', пре-гидролизных, состояниях 2' и 2 возрастает Гидролиз, кроме того, ускоряется с температурой, так что пост-гидролизные состояния 3' и 3-5 с некоторой задержкой становятся более заселёнными. Преходящее уменьшение числа присоединённых головок сразу после скачка температуры происходит из-за ускорения отсоединения из состояний 1-3 и задержки их 'застегивания'. В стационарном сокращении

при высокой температуре -65% присоединённых головок, или -36% их общего числа, находится в силогенерирующих стереоспецифически связанных состояниях 4 и 5, но общее число присоединённых головок остаётся тем же, что при низкой температуре. Это распределение состояний мостиков, вероятно, близко к тому, что имеет место в изометрическом сокращении при физиологической температуре (ТваШуап и др., 2001).

Таблица 6.1. Константы скоростей биохимических и структурных переходов, использованные в модели.

•Прямая/обратная константы скорости переходов между состояниями при 5°С и 30°С; номера состояний в левой колонке соответствуют номерам на рис. 6.1.

ПЕРЕХОД 'Константа скорости, s"1

5 "С 30°С

1'->1 / 1->1' 800/1000 800/1800

2'—>2 / 2—>2' 800/1000 800/1800

3'->3 / 3->3' 800/1000 800/1800

1->2/2->1 0/0 0/0

2->3 / 3—>2 50/30 1150/700

Г-*2' / 2'-»Г 200/2000 2680/2900

2'—>3" / 3'—»2' 50/30 1150/700

3->4 / 4->3 750/500 1500/1000

4—>5 / 5-й 250/500 500/1000

5-И 30 60

Модель воспроизводит временной ход напряжения, Тм и /мз (рис. 6.2) так же как и преходящее падение жёсткости волокна после скачка температуры (рис. 2.5Б) обнаруженное нами экспериментально Рост числа стереоспецифически связанных головок (состояния 4 и 5 на рис 6.1 и 6.2) следует гидролизу АТФ, а его кинетика представляет собой временной ход 1М (рис. 5.4, 5.6) Различия В урОВНЯХ в 'холодном' и 'горячем' состояниях происходит из осевого беспорядка миозиновых головок в нестереоспецифически присоединённых состояниях 1-3. Вклад головок в этих состояниях в /мз меньше, чем в состояниях 4 и 5. Кроме того предполагается, что головки в состоянии 1 находятся в 'анги-ригорной' ориентации и поэтому дают меньший вклад в в эту интенсивность, чем более перпендикулярные головки в состояниях 2-3 (рис. 6.1). Падение 1Ш сразу после скачка температуры (рис. 5.5-5.6) происходит в основном из-за преходящего падения доли связанных головок (видно на модельной кривой жёсткости на рис. 6.2), а также из-за нелинейности зависимости /Мз от числа головок в разных присоединённых состояниях 1-5.

Предлагаемый нами двухшаговый механизм силогенерации хорошо соответствует результатам электронно-микроскопической томографии на летательных мышцах насекомых (Taylor и др., 1999), где миозиновые головки наблюдаются в конфигурациях, соответствующих состояниям 1-5 нашей модели. А именно, у части головок шейные домены повёрнуты под разными осевыми и азимутальными углами по отношению к их каталитическим доменам, которые находятся в фиксированном на актине положении. Однако другие головки присоединены к актину в широком диапазоне осевых и азимутальных углов между каталитическими доменами и

Существование по крайней мере двух силогенерирующих шагов предполагалось ещё в статье Huxley и Siimnons'a в 1971, поскольку одношаговый механизм не может количественно объяснить переходные процессы напряжения в ответ на ступенчатые изменения длины сокращающегося мышечного волокна.

Модель

Температура

Эксперимент

Температура

Интенсивность МЗ

Напряжение Интенсивность А1

Напрпмние

|/ Модель

j

■VdT У^Ч"'

Интенсивность МЗ

10 20 '0 40

Время мс

Интенсивность А1

Время, МС 50

Рис. 6.2. Результаты моделирования механических и структурных ответов на скачок температуры Кривые сверху вниз: 1 мс скачок температуры с 5°С до 30°С; вычисленный временной ход населённости присоединённых 1-5 (сплошные линии) и отсоединённых состояний 1-3' (пунктирные линии); доля присоединённых головок (сумма населённостей состояний 1-5) примерно пропорциональная жёсткости мышцы, напряжение, 1М и /мз- Константы скоростей переходов между состояниями при 5°С и 30°С приведены в Таблице 6.1.

Модификация двухшаговой модели Huxley и Simmons'a (Piazzesi, Lombardi, 1995; Piazzesi и др., 2003) способна объяснить механические переходные процессы, вызванные быстрыми изменениями длины при разных температурах. Однако такая модель не воспроизводит относительно медленную и не зависящую от напряжения кинетику роста напряжения в ответ на скачок температуры (Bershitsky, Tsatuiyan, 1995, 2002) Кроме того, в этой модели нет прямых связей между механическими и структурными изменениями в миозиновых головках и, следовательно, те структурные события, которые сопровождают переходные процессы напряжения не могут быть в ней интерпретированы. Предлагаемый нами механизм 'вращения-застёгивания' и основанная на нём модель количественно описывают как механическое, так и структурное поведение миозиновых головок в экспериментах со скачком температуры и определяет структурные и кинетические характеристики двухшагового механизма генерации силы миозином П.

Основные результаты работы можно сформулировать в следующем виде:

1 Разработан метод высокоамплитудного джоулева скачка температуры для одиночных демембранизированных волокон и тонких пучков волокон скелетных мышц и технология измерения механических характеристик этих препаратов с субмиллисекундным временным разрешением при одновременной регистрации молекулярных структурных событий в них с помощью рентгеновской дифракции на синхротронных источниках рентгеновского излучения;

2. Впервые исследованы механические и термомеханические характеристики сокращающихся волокон скелетных мышц теплокровных (кролика) в широком диапазоне температур вплоть до физиологической и получена температурная зависимость изометрической силы теплокровных под контролем длины саркомеров;

3 Впервые показано, что жёсткость сокращающихся волокон при полной Са2+-активации не зависит от температуры. Этот результат означает независимость числа поперечных мостиков, соединяющих тонкие и толстые нити саркомера, от температуры;

4. Проведено систематическое исследование и сравнение характеристик механических переходных процессов напряжения в мышечных волокнах, вызванных скачком температуры и быстрыми ступенчатыми изменениями длины сокращающихся волокон. Показано, что механизмы, лежащие в основе этих двух типов переходных процессов, имеют различную природу;

5. Исследованы свойства отдельных миозиновых мостиков в мышечных волокнах, изолированных при помощи их сшивки с актином тонкой нити этил-диметил карбодиимидом (ЭДК). В таких условиях с использованием техники скачка температуры обнаружена кажущаяся независимость силогенерирующего шага миозиновых мостиков от напряжения.

6 Зарегистрирован временной ход изменения интенсивностей наиболее ярких рефлексов рентгенограммы сокращающихся мышечных волокон во время переходного процесса, вызванного скачком температуры, с временным разрешением в 1 миллисекунду. Обнаружено, что рост интенсивности первой актиновой слоевой линии, отражающей степень стереоспецифического связывания головок миозина с тонкой нитью, происходит одновременно с развитием механического напряжения, тогда как изменение интенсивности меридионального рефлекса МЗ, которые в экспериментах с быстрыми деформациями интерпретируются как междоменные конформационные изменения в головке миозина, имеет двухфазный характер;

7. Предложена структурно-кинетическая модель двухшагового силогенерирующего процесса в поперечном мостике, которая интегрирует механические, структурные и биохимические данные о механизме работы мостика.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях.

1. Беннетт ПМ, Цатурян А.К., Ференцзи М.А., Кубасова НА, Шестаков ДА., Бершицкий СЮ Переход порядок-беспорядок в расслабленных толстых нитях мышц кролика, вызванные скачком температуры и зарегистрированные электронной микроскопией и рентгеновской дифракцией // В сб.: Докл. П Международного симпозиума по биологической подвижности. Пущино. 2001. С. 14-15.

2. Бершицкий СЮ. Гаерация сипы в мышце: достижения и проблемы. // В сб.: Докл. П Международшзжсютспщж№б(ююг№шжйподе1жшхш1. Пущино. 2001. С.15-17.

3. Бершицкий С.Ю., Бершицкая О.Н. Гусев Н.Б. Цатурян А.К. Скачок концентрации кальция, вызванный скачком температуры. //В сб.: Докл. VIII Всесоюзн. Симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности ". Пущино. 1987. С.68.

4. Бершицкий С.Ю., Кубасова НА, Ференцзи МА, Цатурян АК, Шестаков ДА Влияние растяжимости белковых нитей на механические и структурные свойства сокращающихся мышц // В сб.: Докл. VIII Всероссийского съезда по теоретической и прикладной механике. Пермь. 2001. С.99.

5. Бершицкий С.Ю., Цатурян АК О характере анизотропии мышечной ткани // Доклада Академии наук СССР. 1981.Т.259.С.53-56.

6. Бершицкий С.Ю., Цатурян АК Действие субмиллисекундного скачка температуры на механическое напряжение демембранизованных волокон скелетной мышцы лягушки в состоянии ритора //Биофизика. 1985. Т.30. С.868-872.

7. Бершицкий СЮ., Цатурян АК Исследование термоупругих свойств одиночных волокон скелетной мышцы методом скачка температуры. // В сб.: Докл. VI Всесоюзного съезда по теоретической и прикладной механике. Ташкент. 1986. С. 102-103.

8 Бершицкий СЮ, Цатурян АК Термоупругие свойства поперечных мостиков в демембранизованных волокнах скелетной мышцы лягушки в состоянии ритора // Биофизика 1986. Т.31. С.532-533.

9. Бершицкий С.Ю., Цатурян АК Реакция напряжения демембранизованных волокон скелетной мышцы лягушки на субмиллисекундный скачок температуры. // В сб.: Докл. Междунар. конф. "Достижения биомеханики в медицине и хирургии". Рига. 1986. Т.1, С.74-79.

10. Бершицкий СЮ., Цатурян АК Скачок температуры в активированном волокне скелетной мышцы лягушки. //В сб.: Докл. МП Всесоюзн. Симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности". Пущино. 1987. С.82.

11. Бершицкий С.Ю., Цатурян АК Реакция напряжения на скачок температуры в волокнах скелетной мышцы кроли-ка, укорачивающихся с постоянной скоростью. // В сб ..Докл. IX Всесоюзного Симпозиума "Биофизика и биохимия биологической подвижности". Тбилиси. 1987. С.72.

12. Бершицкий СЮ., Цатурян АК Двухфазь1йотвегна1фяженияшасачжтемгернтурь1вСа-активированных волокнах скелетной мышцы лягушки. // Биофизика 1988. Т.ЗЗ. С.156-158.

13. Бершицкий СЮ., Цатурян АК Температура и мышечное сокращение. // В сб.: Докл. II Конгресса Российских биофизиков. Москва. 1999. Т. 1, С. 315-316.

14 Бершицкий С Ю, Цатурян А.К, Кубасова НА, Ференизи MA Структурные изменения высокого временного разрешения, сопровождающие рост напряжения в ответ на скачок температуры в мышечных волокнах кролика. // В об : ДоклШ Международного симпозиума по биологической подвижности. Пущино. 2004. С.3-4.

15. Бершицкий С.Ю., Цатурян АК, Шесгаков ДА, Беннег И Структурные изменения в мышечных юл окнах, вызываемые скачком температуры' электронная микроскопия. // В сб '.Докл. VBcepocc. конф. по биомеханике H Новгород 2000 С. 9.

16 Цатурян АК и Бершицкий С.Ю. Реакция напряжения в демембранизированных Са-актвированных волокнах скелетной мышцы лягушки на скачок температуры после ступенчатого изменения длины. //Биофизика. 1988. Т.ЗЗ. С.570-572.

17. Цатурян АК, Кубасова НА, Бершицкий С.Ю., Ференцзи MA Модель 'застйивания-вращяшя' генерации силы в мышце. // В сб.: Докл. ШМеждународного симпозиума по биологической подвижности. Пущино. 2004. С. 19.

18. Bennett РМ, Beshitsky S.Y., Ferenczi MA, Koubassova N.A, Shestakov D.A and Tsaturyan AK Temperature induced disorder in the filament lattice in relaxed rabbit muscle is caused by loss of interaction of myosin heads with actin. // J. Muscle Res. Cell Modi. 2002. V.23.5. P. 11.

19. Bennett P.M, Tsatuiyan AK. and Bershitsky S. Y. Rapid cryofixation of rabbit muscle fibres after a temperature jump. //J. Microscopy. 2002. V.206.2. P.152-160.

20. Bershitsky, S. Y. and Tsaturyan AK. Effect of Joule temperature jump on tension and stillness of skinned rabbit muscle fibers. // Biophys. J. 1989. V.56. P.806-816.

21. Bershitsky, S Y and Tsaturyan AK- Joule temperature jump in skeletal muscle fibres //J Muscle Res. Cell Motil. 1990. V.11.P.72.

22 Bershitsky, S Y. and Tsaturyan AK Effect of Ca*" on tension response to (he Joule temperature jump in skinned muscle fibres from the frog. // J Physiol 1990. V.420.115P.

23. Bershitsky, S. Y and Tsatuiyan AK Myosin crossbridge: two heads or a pair of legs? // J. Muscle Res. Cell Motil. 1992. V.13. P.223.

24. Bershitsky, S.Y. and Tsatuiyan AK Tension responses to the Joule temperature jump in skinned rabbit muscle fibres. //J.Physiol. 1992. V.447. P.425-448.

25 Bershitsky, S.Y. and Tsatuiyan AK Force generation and wok production by covalently cross-linked actin-myosin cross-bridges in rabbit muscle fibers. // Biophys.J. 1995. V.69. P.1011-1021 .Bershitsky, S.Y. and Tsatuiyan AK Slight EDC cross-linking stabilizes sarcomere structure and preserves mechanical properties ofpermeabilized muscle fibres of the frog. // JPhysioL 1995. V.483. P.76P.

26. Bershitsky S Y and Tsatuiyan АКТЪе demenlaiy force generation process probed by temperature and length perturbations in muscle fibres from the rabbit // J. Physiol. 2002. V.540 3 P971-988

27 Bershitsky S Y, Tsaturyan AK, Bums R. and Ferenczi MA Structural changes in permeabilised from muscle fibres following flash photolysis of DMB-caged ATP and DMB-caged ADP // J Muscle Res Cell Motil. 1998. V.19.P.282

28 Bershitsky S.Y., Tsaturyan AK., Koubassova N.A, Geeves MA, Z.-H He and Ferenczi MA (2001). A myosin peptide reduces strong binding to actin by native myosin heads in muscle fibres //J. Muscle Res. Cell Motil. V.22. P.586.

29. Beishitsky S.Y., Tsatuiyan AK, Koubassova N, Helsby W.L, Narayanan T., Parane P., Roessle M, Siththanandan V. and Ferenczi MA X-ray evidence for two-step force generation by myosin heads in muscle. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2003. V.24(4-6). P.334-335.

30. Bershitsky S.Y., Tsaturyan AK Benhitskaya O.N Mashanov G.L, Brown P. Webb M and Ferenczi MA Mechanical and structural properties underlying contraction of dceletal muscle fibers aller partial 1 -eAyl-3[3<dimeAylamino)pr(çyl]carbodiiniide cross-linking. // Biophys.J. 1996. V.71. P.1462-1474.

31. Bershitsky S.Y., Tsaturyan AK., Bershitskaya O.N., Mashanov, GI, Brown, P, Burns, R, Ferenczi MA Muscle force is generated by myosin heads stereospecifically attached to actin. // Nature. 1997 V. 388. P.186-190.

32. Bershfcky S.Y., Tsaturyan AK BeniiMajfc O.N, Madianov G.L, DoHàe I, frving M, Tôrok K, Brown P and Ferenczi MA The mechanical and structural properties of penreabifeed fkeletal muscle fibers ofthe fiog after partial EDC cross-linking. //J. Muscle Res. Cell Motfl. 1996 V17.P156.

33 Ferenczi MA, Bershitsky S Y, Koubassova N.A and Tsaturyan AK Stereo-specific binding of myosin heads to actin occurs synchronously wifli face development induced by T-jump in rabbit muscle fibres. //J. Muscle Res. CellMbtiL 2002. V.23(5) P.ll.

34. Ferenczi MA, Bershitsky S.Y., Koubassova N., Siththanandan V, Helsby W.L, Panine P., Roessle M, Narayanan T. and Tsaturyan AK Hie 'roll and lock' mechanism of force generation in muscle. // Structure. 2005. B nesam

35. Koubassova NA, Bershitsky S.Y., Ferenczi MA, Tsaturyan AK Quantitative interpretation of the 2D x-ray diffraction patterns from skeletal muscle using direct modelling. // Fibre Diffraction Review. 2003. V.ll.P.131-132.

36. Koubassova N.A, Tsaturyan AK, Bershitsky S. Y. and Ferenzri MA Strong binding of myosin heads stretches and twists actin filaments. // J. Muscle Res. Cell MotiL 2001. V.22. P.587.

37. Tsaturyan, AK and Bershitsky S.Y. Force generation and shortening initiated by temperature jump in cross-linked muscle fibres isolated from the rabbit // J. Physiol. 1995. V.483. 76P.Tsaturyan, AK and Bershitsky S.Y. Tension transients initiated by Joie temperature jump during steady shattering of skinned muscle fibres. // to: Muscle and Motility (Eds. G. Maréchal andU. Carrara) Intercept Pbl. 1990. V2. P277-281.

38 Tsaturyan, AK and Bershitsky S Y Tension transients initiated by the Joule temperature jump during steady shortening of skinned muscle fibres //J Muscle Res. Cell Mbtil. 1991. V.12 C84

39. Tsaturyan, AK and Bershitsky S Y. Joule temperature jump in skinned muscle fibres with compressed myofilament lattice //J Muscle Res. Cell Motil. 1992 V.13,P245.

40 Tsaturyan AK., Bershitsky S.Y, Bums R, Ferenczi MA Structural changes accompanying force generation induced by temperature jump in permeabilised frog muscle fibres. // J. Muscle Res Cell Motil. 1997. V.19.C.281.

41 Tsaturyan AK, Bershitsky S.Y., Bums R. and Ferenczi MA Structural changes in the actin- * myosin cross-bridges associated with force generation induced by temperature jump in permeabilized frog muscle fibers. //Biophys. J. 1999. V.77 P.354-372.

42. Tsaturyan AK, Berdùtdcy S. Y., Ferenczi MA and Koubassova NA Direct modelling as a tool for intopretation of the x-ray diffiaction pattern from dcdetal muscle. // J. Muscle Res. CellMbtiL 2001. V.22. P.584-585.

43. Tsaturyan AK, Bershitsky S.Y, Koubassova N, Narayanan T, Panine P, Roessle M and Ferenczi MA X-ray interference measurement of movement of myosin heads during tension rise in muscle fibres upon temperature jump. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2003. V.24(4-6). P 332

44. Tsaturyan AK, Koubassova N, Ferenczi MA, Narayanan T, Roessle M and Bershitsky S.Y. Strong binding of myosin heads stretches and twists the actin helix. // Biophys. J. 2005. B nenam

г il л

г I

I >

'I \

РНБ Русский фонд

2005-4 45434

!

X 0

Л -> s г Г ' <

I ' г J \

# , i / J ■ щ у

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бершицкий, Сергей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Объект и методы исследования

ГЛАВА 2. Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры

ГЛАВА 3. Сравнение переходных процессов напряжения, вызванных изменениями длины и температуры

ГЛАВА 4. Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК

ГЛАВА 5. Генерация силы и производство работы ковалентно пришитыми поперечными мостиками в мышечных волокнах кролика

ГЛАВА 6. Рентгенодифракционные исследования струюурных изменений, сопровождающих силогенерирующий процесс в мышце

ГЛАВА 7. Кинетика структурных изменений при развитии напряжения в мышечных волокнах кролика в ответ на скачок температуры

ГЛАВА 8. Интерпретация результатов: структурно-кинетическая модель двухшагового механизма работы поперечного мостика

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизма генерации силы в мышце"

Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из интереснейших проблем биофизики. Согласно предложенным в середине 50-х годов теории скользящих нитей и мостиковой теории мышечного сокращения (Н. Huxley, Hanson, 1954; A. Huxley, Niedergerke, 1954; A. Huxley, 1957; Н. Huxley, 1969; A. Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие миозиновых головок, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами актина, составляющими основу тонких нитей. Это взаимодействие ведёт к укорочению саркомера, а длина самих нитей остаётся постоянной. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, создание атомных трехмерных реконструкций актина, миозиновой головки и актин-миозинового комплекса (Holmes и др., 1990, 2004; Rayment и др., 1993а, б; Houdusse и др., 1999, 2000), многие важные детали механизма работы поперечных мостиков остаются неизвестными. По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие силы или укорочения мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу. Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновый мостик может переместить акгиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др.,

1995; Simmons и др., 1996; Ishijima и др., 1998; Linari и др., 1998; A. Huxley, 2000).

Проблема изучения молекулярного механизма мышечного сокращения состоит, главным образом, в том, что механическая функция актин-миозинового мотора может быть реализована лишь при сохранении надмолекулярной структуры мышцы, а исследование изолированных сократительных белков даже с использованием всех средств современной биохимии и молекулярной биологии способно дать лишь косвенную информацию об их механической функции. С другой стороны, изучение конформационных изменений актин-миозинового комплекса в структурированных системах, способных совершать механическую работу, таких как мышечное волокно или миофибрилла, сопряжено с большими трудностями в интерперетации результатов и определении механических параметров отдельных компонентов системы.

Таким образом, представляется актуальным исследовать взаимосвязи между макроскопическими механическими процессами сокращающения мышцы и молекулярными структурными событиями в сократительных белках, которые, как представляется, лежат в основе механической функции мышцы, в демембранизованных мышечных волокнах, где состав среды, окружающей сократительные белки, полностью контролируется экспериментатором, а механическая функция сохранена. Использование клеток с проницаемой мембраной позволяет применить такие современные методы нестационарной кинетики, как импульсный фотолиз веществ и скачок температуры для синхронизации процессов, происходящих в отдельных миозиновых молекулах. Малоугловая дифракция рентгеновских лучей представляет собой один из наиболее продуктивных методов исследования структурных изменений в мышце на молекулярном уровне (Н. Huxley, 1996). Благодаря использованию мощных синхротронных источников рентгеновского излучения и быстродействующих электронных детекторов изменения интенсивностей самых ярких рефлексов от одиночных интактных клеток лягушки были измерены с субмиллисекундным временным разрешением (Irving и др., 1992; Dobbie и др., 1998). Результатом этих исследований явилось структурное подтверждение правильности мостиковой теории мышечного сокращения, предложенной А. Huxley и Simmons'oM в 1971 году. Прогресс, достигнутый в применении техники рентгеновской дифракции высокого временного разрешения к одиночным интактным мышечным волокнам, делает актуальным её применение для изучения структурных изменений в волокнах с проницаемой мембраной. В таких волокнах можно, в частности, использовать для инициализации силогенерирующего процесса в активном состоянии метод скачка температуры как альтернативу методу механических деформаций. В этом случае силогенерация происходит в изометрических условиях, то есть без относительного смещения толстых и тонких нитей. Результаты исследования механических характеристик переходных процессов в одиночных сокращающихся мышечных волокнах, вызванных высокоамплитудным скачком температуры показали, что эти характеристики существенно отличаются от таковых, вызванных механическими деформациями (Bershitsky, Tsaturyan, 1992;

Bershitsky, 2001). Более того, по нашим данным, переходные процессы напряжения, вызванные ступенчатыми деформациями и скачком температуры имеют различную природу (Bershitsky, Tsaturyan, 2002). Поэтому представляется о актуальным детально исследовать механические характеристики отдельных мостиков и структурные события, сопровождающие цикл работы мостиков, используя эти два типа воздействий. Комбинация разных методов возбуждения силогенерирующего процесса в мостиках может помочь понять основы молекулярной природы мышечного сокращения.

Цели и задачи исследования: изучить термомеханические и кинетические характеристики элементарных молекулярных генераторов силы мышечного сокращения - поперечных мостиков - во время силогенерирующего процесса в мышце, а также рентгеноструктурные изменения в мышечных волокнах теплокровных (кролика), сопровождающие этот процесс, а именно:

1. Разработать метод скачка температуры для одиночных волокон скелетных мышц с одновременным измерением их механических характеристик в субмиллисекундном и структурных изменений в миллисекундном временном диапазоне;

2. Разработать экспериментальную модель демембранизованных клеток скелетных мышц теплокровных со стабилизированной структурой саркомеров, способных к длительной (десятки минут) активации, необходимых для механических и рентгеноструюурных исследований в различных физиологических состояниях;

3. Исследовать кинетику и термодинамику силогенерирующего шага мостиков при физиологической температуре;

4. Изучить механические реакции мышечных волокон кролика на скачок температуры и выяснить, с какими процессами в поперечных мостиках связаны эти реакции;

5. Сравнить переходные процессы силы в одиночных мышечных волокнах кролика, вызванные субмиллисекундными изменениями длины и температуры;

6. Зарегистрировать и исследовать рентгеноструктурные изменения в одиночных активированных мышечных волокнах с временным разрешением 1 мс, сопровождающие силогенерирующие процессы, вызванные быстрыми изменениями длины и температуры.

Методы исследования: микромеханика одиночных мышечных волокон высокого (~0,1 мс) временного разрешения; лазерная дифракционная регистрация длины саркомеров и управляемая изометрия с использованием длины саркомеров для обратной связи; джоулев скачок температуры; частичная ковалентная сшивка миозина с актином в мышечном волокне; рентгеновская дифракция высокого (1 мс) временного разрешения с использованием источников синхротронного излучения.

Объект исследования: одиночные химически демембранизированные (скинированные) волокна скелетных мышц кролика.

Научная новизна. В ходе работе:

- Впервые разработана экспериментальная техника и модель одиночных волокон скелетных мышц теплокровных с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной ковалентной сшивкой, пригодная для исследования механических и структурных изменений методом рентгеновской дифракции высокого временного разрешения при физиологических условиях.

- Впервые разработан и реализован метод джоулева скачка температуры в одиночных клетках (волокнах) скелетных мышц кролика, превосходящий по своим характеристикам и возможностям известные в настоящее время методы.

- С помощью джоулева скачка температуры впервые получено независимое доказательство существования быстрого силогенерирующего шага в мостиках, присоединенных к тонким нитям, т. е. подтвержден один из главных постулатов мостиковой теории мышечного сокращения.

- Впервые показано, что силогенерирующий "шаг" мостиков может происходить без смещения толстых и тонких нитей в саркомерах и в условиях, исключающих отсоединение и присоединение миозиновых мостиков к тонким нитям.

- Впервые исследована кинетика механических ответов одиночных волокон скелетных мышц кролика на быстрое изменение температуры.

Впервые показано и доказано, что увеличение напряжения в мышце при повышении температуры происходит за счёт увеличения силогенерирующей способности мостиков, а не их числа.

Впервые получен временной ход изменения интенсивностей основных рефлексов рентгенограммы волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры.

Впервые показано, что реакция напряжения в мышце теплокровных в ответ на повышение температуры сопровождается значительным увеличением интенсивности первой акгиновой слоевой линии на рентгенограмме, свидетельствуя о переходе присоединённых мостиков в стерео-специфически связанное с актином состояние.

Впервые показано, что кинетика роста интенсивности первой акгиновой слоевой линии на рентгенограмме волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры с временным разрешением в 1 мс совпадает с кинетикой роста силы.

Впервые показано, что силогенерирующие процессы в мышце, вызванные механическими деформациями и скачком температуры имеют разную природу.

Найдены новые и уточнены известные детали механизма работы актин-миозинового мотора, что расширяет и дополняет знания о мышечном сохфащении и ведёт к пересмотру существующих представлений о механизме генерации силы в мышце.

Практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - силогенерации в мышце, то есть того молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе биологической подвижности. Методы и подходы, разработанные в работе могут быть применены в во многих прикладных исследованиях особенностей сокращения скелетных и сердечных поперечно-полосатых мышц. К ним относятся: экспериментальная модель одиночных мышечных клеток с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной ковалентной сшивкой; метод скачка температуры в одиночных клетках, позволяющий исследовать механическое поведение мышечных клеток с проницаемой мембраной при физиологической температуре и в изометрических условиях,; метод регистрации и контроля длины саркомеров мышечных волокон в воздухе; метод регистрации рентгенограмм одиночных клеток в воздухе, то есть с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные подходы и методы могут быть использованы для анализа особенностей работы актин-миозинового мотора в клетках различных типов в норме и при патологии, а метод джоулева скачка температуры потенциально применим и к другим биологическим объектам.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 39 публикациях в научных журналах и сборниках конференций, а также в научных отчётах.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на Международной конференции по медицинской биомеханике (Рига, 1986); на VI и VII

Всесоюзных съездах по теоретической и прикладной механике (Ташкент, 1986; Москва 1991); на VIII и IX Всесоюзных симпозиумах "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Пущино, 1987; Тбилиси, 1990); на Выездном заседании секции биологической подвижности Научного совета по проблемам биофизики АН СССР (Ереван, 1988); на Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); на собрании Национального комитета СССР по теоретической и прикладной механике (Москва, 1986); на Всесоюзных школах по биологической подвижности (Лосево, 1985; 1989) и по физиологии и биофизике миокарда (Свердловск, 1981, 1984, 1987); на Всесоюзных семинарах "Биомеханика-84, -87, -90, -91" (Москва, 1984, 1990; Ленинград, 1987; Санкт-Петербург, 1991, 1999, 2001); на II и III Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004); на XVIII, XIX, XXIV, XXVI, XXVIII, XXX, XXXI, XXXII и XXXIII Европейских мышечных конференциях (Лунтерен, Нидерланды, 1989; Брюссель, Бельгия, 1990; Флоренция, Италия, 1995; Шневердинген, Германия, 1997; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Лунтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на IV Международной конференции по мышечной энергетике (Сиена, Италия, 1992); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 1998, 2001, 2004); на восьми ежегодных конференциях получателей грантов Медицинского Института им. Ховарда Хьюза (HHMI; Прага, Чехия, 1996; Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998; Москва, Россия, 1999; Вашингтон, США, 2000; Ванкувер,

Канада, 2001; Керне, Австралия, 2002; Таллинн, Эстония, 2004); на собраниях Физиологического общества Великобритании (Эдинбург, 1989; Бирмингем, 1994); на семинарах Лондонской мышечной серии (London Muscle Series) в 1992 и 2002, а также на других научных конференциях и семинарах.

Часть экспериментов была выполнена в Отделе биофизики (Randall Institute) Королевского колледжа Лондонского университета (King's College London) при финансовой поддержке фонда Wellcome Trust; в Отделе физической биохимии Национального Института медицинских исследований Совета по медицинским исследованиям Великобритании (National Institute for Medical Research, MRC, Лондон); в Отделе биомедицинских наук Империал Колледжа Лондона (Biomedical Sciences Division, Imperial College London), и Лаборатории Дасбери, Чешир (Daresbury Laboratory, Cheshire); на Европейском синхротроне ESRF, Гренобль, Франция. Исследования, вошедшие в работу, были поддержаны грантами РФФИ, Wellcome Trust, HHMI, INTAS, MRC, Daresbury Laboratory, NATO, ESRF, EMBL, Royal Society, Международного научного фонда ISF (фонд Сороса) и совместным грантом ISF и Правительства России.

Автор считает своим долгом почтить память своего первого учителя профессора В Л. Изакова, который побудил в нём интерес к биофизике и стоял у истоков настоящего проекта. Автор хотел бы выразить благодарность своим учителям и наставникам: профессорам A.F. Huxley и R.M. Simmons'y и доктору D.R. Trentham'y, в немалой степени содействовавшем выполнению этой работы. Автор признателен своему другу и коллеге А.К. Цатуряну за многолетнее и плодотворное сотрудничество. Автор благодарит также профессора B.C. Мархасина за его благожелательные и настойчивые усилия, подвигнувшие автора к написанию настоящей диссертации.

Реализация метода скачка температуры в одиночных мышечных волокнах и все механические и рентгеновские эксперименты, проводившиеся в течение более, чем 20 лет и представленные в данной работе, были сделаны совместно с А.К. Цатуряном (Институт механики МГУ); все эксперименты на источниках синхротронного излучения в Daresbury (Великобритания) и Grenoble (Франция) были выполнены совместно с М.А. Ferenczi (Imperial College, Лондон), значительная часть этих экспериментов была сделана в сотрудничестве с Н.А. Кубасовой (Институт механики МГУ); на разных этапах в работе принимали участие О.Н. Бершицкая, Г.И. Машанов, P. Brown, R. Burns, Z.-H. Не, М. Webb и V. Siththanandan; всем им автор глубоко признателен за сотрудничество.

ВВЕДЕНИЕ

Скелетная мышца в силу своей почти идеально правильной организации на всех структурных уровнях - от волокна до саркомера - является излюбленным объектом исследователей как собственно механизма мышечного сокращения, так и взаимодействия актина и миозина, которое лежит в основе многих видов немышечной подвижности. На рис. В.1 показана иерархическая схема организации сократительного аппарата скелетной мышцы. Мышца состоит из мышечных клеток, или волокон, лежащих параллельно друг другу, каждое волокно заканчивается на обоих концах сухожилиями. Диаметр волокон у разных видов животных находится в диапазоне 50 -200 мкм, число волокон в мышце составляет от нескольких сот до нескольких тысяч. Каждое волокно в свою очередь состоит из «нескольких тысяч миофибрилл диаметром ~1 мкм. Вдоль длины миофибриллы разделены на регулярные сегменты - саркомеры, ограниченные Z-линиями, длина покоя которых составляет в мышцах лягушки 2,2 мкм, а в мышцах теплокровных - 2,4 мкм. От Z-линий внутрь саркомера идут тонкие нити, или тонкие филаменты, представляющие собой спираль белка актина. В пространстве между тонкими нитями лежат толстые нити, или толстые филаменты, состоящие из моторного белка миозина. В участке перекрытия эти нити упакованы в гексагональную решётку, тогда как вне перекрытия акгиновые нити имеют квадратную упаковку. Перекрывающиеся и неперекрывающиеся участки называются А- и I-зонами (анизотропная и изотропная), соответственно, по ориентации двулучепреломления в них (Brttcke, 1858; Kiihne, 1864). Миофибриллы в волокне и волокна в мышце лежат в регистре, так что их Z-линии, а также А- и I-зоны совпадают и представляют собой чередующиеся тёмные и светлые полосы, идущие поперёк мышцы, что и определило название мышц - поперечно-полосатые, в отличие от гладких, не имеющих такой упорядоченной организации клеток. Поперечную исчерченность мышц можно видеть в световой микроскоп, предпочтительно интерференционный или фазово-контрастный. В силу регулярности саркомеров, их длину можно также измерять дифракционными методами, наиболее часто для этого используются гелий-неоновые или полупроводниковые лазеры.

Строение скелетной мышцы. В основе сокращения всех типов мышц и подвижности немышечных клеток лежит взаимодействие двух белков - актина и миозина. Актин - весьма консервативный белок с молекулярной массой 42 кД. В присутствии АТФ глобулярный актин (G-актин) полимеризуется с образованием нитей F-актина длина которых может достигать 20 мкм. Акгиновая нить представляют собой левую спираль (~6 оборотов на 13 субъединиц ) с осевым шагом между мономерами 2,75 нм (Holmes и др., 1990). Моторный белок миозин обладает большим разнообразием. В настоящее время описано более 15 видов миозинов и определены аминокислотные последовательности более чем 100 представителей этого супер-семейства белков (Соре и др., 1996). Все миозины содержат одну или две тяжелых полипептидных цепи и несколько легких цепей. На N-конце каждой тяжелой цепи находится глобулярная головка миозина или субфрагмент-1 (S1), которая способна связываться с актином и гидролизовать АТФ. В результате гидролиза АТФ выделяется свободная химическая энергия, которая в ходе актин-миозинового взаимодействия превращается в механическую работу (Энгельгардт и Любимова, 1939). Миозиновая головка переходит в 'шейку' - длинный а-спиральный участок тяжелой цепи, с которым ассоциированы легкие цепи. Их количество в миозинах разного типа варьирует в широких пределах. Мышечный миозин или миозин II содержит две тяжелые и четыре легких цепи. С-терминали каждой из тяжелых цепей соединены в супер-а-спиральный субфрагмент-2 (S2), переходящий в длинный стволовой и также супер-а-спиральный участок молекулы, называемый легким меромиозином (ЛММ). При физиологической ионной силе окружающего раствора (250 мМ) стволовые участки молекул миозина агрегируют и образуют миозиновые нити. В скелетных мышцах эти нити обладают спиральной симметрией и представляют собой трехзаходную правую спираль с периодом около 43 нм и осевым расстоянием между ярусами выступающих миозиновых головок ~14,3 нм. На один период миозиновой спирали приходится 9 молекул миозина или 18 миозиновых головок. Длинные суперспирализованные части молекул миозина (ЛММ) образуют ствол толстой миозиновой нити диаметром около 15 нм. Схема строения скелетной мышцы, ее клетки или волокна и основной структурной единицы - саркомера показана на рис. В.1.

Рис.В, 1. Структура скелетной мышцы.

Исследование молекулярного механизма, лежащего в основе генерации мышечного сокращения - одна из важнейших и интереснейших проблем биофизики и физиологии мышц. Начало современной истории этих исследований восходит к концу XIX века, но реальный прогресс в понимании механизма сокращения мышцы начался в 30-50-х годах XX века и связан с именами таких выдающихся учёных как A.V. Hill, A. Huxley и Н. Huxley (Gasser, Hill, 1924; Hill, 1938; A. Huxley, 1957; H. Huxley, 1952, 1953, 1957; A. Huxley,

Simmons, 1971). Сначала на целых мышцах, а затем на одиночных интактных волокнах скелетных мышц был обнаружен целый спектр механических и энергетических феноменов сокращающейся мышцы. Всё детальней исследуется структура мышечной клетки и организация её сократительного аппарата, для чего привлекаются методы фазовой и интерференционной оптической микроскопии, электронной микроскопии и рентгеновской дифракции. Анализ накопленых к тому времени данные позволил сформулировать в середине 50-х годов так называемую "мостиковую" теорию мышечного сокращения. В основе этой теории лежит циклическое взаимодействие "поперечных мостиков" -головок молекул миозина, выступающих из ствола толстой нити и взаимодействующих во время сокращения с тонкими, актиновыми, нитями. В 1971 году, была предложена механическая модель поворачивающегося, или катящегося, мостика, позволявшая описать большинство известных к тому времени экспериментальных феноменов мышечного сокращения (A. Huxley и Simmons, 1971). Использовавшийся авторами метод состоял в том, что к сокращающемуся одиночному мышечному волокну прикладывали быстрые (-0,2 мс) продольные деформации и регистрировали ответ силы в волокне на такое воздействие. Смысл такого подхода состоит в том, чтобы, нарушив равновесные условия, в данном случае микроскопических механических событий в отдельных мостиках, синхронизовать эти события в макроскопически измеримый ответ силы целого волокна и интерпретировать этот ответ в терминах «среднего» мостика. Из предположений, что мостик, соединённый с толстой нитью упругим элементом (по умолчанию предполагалось, субфрагментом 2), катится по поверхности тонкой нити через ряд дисьфетных состояний не меняя при этом формы и что жёсткость как толстых, так и тонких нитей много выше жёсткости мостиков, авторы получили модель, которая вполне удовлетворительно описывала результаты механических экспериментов.

Реакция напряжения соьфащающегося мышечного волокна в ответ на ступенчатое укорочение на величину <0,5% состоит из следующих компонентов (рис. В.2): упругое падение напряжения (фаза 1), быстрое частичное его восстановление (фаза 2), временное «плато» (фаза 3) и, наконец, относительно медленное восстановление напряжения к исходному уровню (фаза 4). В модели Huxley и Simmons'a субфрагмент-1 (S1) миозина, присоединившись к тонкой нити, может находиться в нескольких дискретных состояниях. Поворот S1 и его переход из одного состояния в другое ведёт к растяжению упругого элемента (в модели — субфратент 2, или S2), соединяющего S1 со стволом толстой нити. Энергия перехода сохраняется в виде растяжения упругого элемента. Кинетика этого перехода соответствует кинетике быстрого частичного восстановления напряжения в ответ на ступенчатое укорочение.

Позднее в механических экспериментах с одновременной регистрацией рентгеновской дифракции в целой мышце (Н. Huxley и др., 1983) и в одиночных мышечных волокнах (Irving и др., 1992) были получены данные в пользу осевого движения мостиков во время фазы 2 механического ответа, подтверждающие модель Huxley и Simmons'a. Доказательством этого служило преходящее падение интенсивности меридионального рефлекса МЗ, соответствующего периоду 14,3 нм, то есть осевому периоду мостиков, синхронное с фазой быстрого частичного восстановления напряжения после ступенчатого изменения длины. Модель, объясняющая этот результат (Irving и др., 1992; Piazzesi и др., 1995), состоит в следующем: мостик, длина которого больше его ширины, после укорочения волокна оказывается в менее перпендикулярном по отношению к оси волокна положении и, соответственно, его вклад в дифракцию уменьшается. Во время силогенерирующего шага мостик опять принимает перпендикулярное положение и интенсивность рефлекса восстанавливается. Проблема такой интерпретации заключается, однако, в том, она основана на изменении интенсивности одного единственного рефлекса, и такое её поведение может объясняться также изменением формы мостика во время силогенерирующего шага (Dobbie и др., 1998; Irving и др., 2000).

Другой аргумент в пользу изменения положения S1 во время переходного процесса силы после деформации волокна был получен в экспериментах с использованием флуоресцентно-меченых лёгких цепей S1 миозина (Irving и др., 1995). Положение ковалентно присоединённых к лёгким цепям бифункциональных меток, зарегистрированное в поляризованном свете, также показывает изменение их углового положения, синхронное с быстрым восстановлением напряжения. Угол, однако, меняется всего примерно на 3°, что при длине S1 ~18 нм никак не соответствует требуемой по данным механических измерений величине шага мостика в 12-15 нм. Авторы объясняют

А

Length -1 ]

Tent ion У

XX) m»

В

Length 1 ]

Tension 1- >"----- 5 тис ---

HIHM.M.M PtMM 2 — — Phasa 3 — Ph*» 4

Рис. В.2. Ответ напряжения одиночного интактного волокна скелетной мышцы лягушки во время тетанического сокращения на ступенчатое укорочение (из A. Huxley и Simmons, 1970). На А и В показаны изменения длины и напряжения при двух временных масштабах. Т0, Ti и Тг на А обозначают уровни напряжения: начальный, в конце фазы 1 и в фазе 2, соответственно. Линии разного типа на В соответствуют фазам 1-4. такое несоответствие малым, порядка 5%, числом мостиков, участвующих в силогенерирующем шаге. Такое объяснение, в свою очередь, противоречит данным механических и рентгеновских измерений. Следует отметить однако, что та же группа исследователей нашла изменение угла поляризации вплоть до 45° вдоль оси тонких филаментов с такими же флуоресцентными метками на лёгких цепях

SI в экспериментах на in vitro подвижной системе с миозином V (Forkey и др., 2003). Это, скорей всего, указывает на то, что в мышечном волокне, в отличие от in vitro подвижной системы, существуют какие-то не обнаруженные ещё условия, препятствующие корректному измерению движения флуоресцентных меток. Однако даже этот результат не отвечает на вопрос, каким образом происходит силогенерирующий шаг мостика, так как разрешение метода не позволяет отличить движение S1 как целого от изменения относительного положения хвостового и моторного доменов (см. ниже).

В начале 90х годов были получены кристаллы глобулярного актина (Kabsch и др., 1990) и субфрагмента-1 миозина в "ригорной" конфигурации (Rayment и др., 1993а) и сняты их рентгенограммы высокого пространственного разрешения (2,8 А). На основе этих рентгенограмм были сделаны реконструкции глобулярного (Kabsch и др., 1990) и филаментарного актина (Holmes и др., 1990; Mendelson и Morris, 1994), субфрагмента-1 (Rayment и др., 1993а) и акто-миозинового комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson и Morris 1997). Впоследствии были получены 1фисталлы гладкомышечного миозина (Dominguez и др., 1998) и миозина моллюска (Houdusse и Cohen, 1996; Houdusse и др., 1999; Houdusse и др., 2000), а также ряд комплексов миозина с АДФ и негидролизуемыми аналогами нуклеотида, которые показывают разные конформации миозина, соответствующие, по мнению авторов, разным стадиям силогенерирующего шага (Houdusse и Sweeney, 2001). Реконструкции миозина показывают существование "шейного" домена (остатки 770-843 первичной последовательности миозина цыплёнка) в структуре S1, который и является упругим элементом мостика, постулированным в модели Huxley и Simmons'а 1971 г.

На основе этих реконструкций миозина и акто-миозинового комплекса была выдвинута гипотеза (Uyeda и др., 1996; Howard и Spudich, 1996; Anson и др., 1996; Holmes, 1997), согласно которой 'шейка' играет роль 'рычага', приводимого в действие 'конверторным' доменом (остатки 711-781 в аминокислотной последовательности миозина Dictyostelium discoideum; Holmes, 1997). В соответствии с этой гипотезой акгин-связывающий, или моторный, домен миозина к моменту силогенерирующего шага прочно и неподвижно связан с актином, а всё движение производится только "шейным" доменом. Например, было экспериментально показано (Uyeda и др., 1996), что скорость движения филаментарного актина по поверхности, покрытой миозином, линейно связана с числом IQ мотивов а-спирального «хвостового» участка субфрагмента 1 миозина, иначе говоря, его длиной.

В настоящее время результаты изменения интенсивности рефлекса МЗ рентгеновской дифракции на мышечном волокне, синхронные с фазой быстрого частичного всстановления напряжения после ступенчатой деформации, также интерпретируются в рамках этой гипотезы (Irving и др., 2000).

Движение хвостового домена субфрагмента 1 молекулы миозина относительно моторного домена было также показано с помощью резонансного переноса флуоресценции (Suzuki и др., 1998). Для этого в аминотерминаль моторного домена был встроен GFP (зелёный флуоресцентный белок), возбуждаемый источником света, а в его карбоксильную терминаль - BFP (голубой флуоресцентный белок), возбуждаемый флуоресценцией GFP. По интенсивности вторичной флуоресценции BFP было обнаружено, что карбоксильная терминаль меняет угол относительно аминотерминали в шаге изомеризации цикла гидролиза АТФ, а затем возвращается назад предположительно в момент сброса неорганического фосфата.

Разработанная в 80-х годах акто-миозиновая in vitro подвижная система (motility assay; Sheetz и Spudich, 1983; Harada и др., 1987) позволила визуализовать движение одиночных флуоресцентно меченых нитей актина по поверхности, покрытой миозином, с помощью флуоресцентной микроскопии и измерять скорость движения при различных экспериментальных условиях, но не исследовать механизм взаимодействия. В середине 90 годов на основе in vitro подвижной системы был создан метод оптической ловушки, который позволил с помощью флуоресцентной микроскопии в комбинации с достаточно мощным инфракрасным лазером регистрировать величину и силу шага одиночных взаимодействий актина и миозина (Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995). Однако, измеренные таким методом параметры взаимодействия белков противоречивы и не дают величин, согласующихся с результатами механических измерений на волокне. Это, видимо, объясняется некоторой неопределённостью механических характеристик, присущих самой методике, в частности, наличием неучтённой податливости при фиксации молекул миозина к подложке и нитей актина в манипуляторе. Кроме того, результаты, полученные методом оптической ловушки, позволяют получать количественные характеристики механических параметрах силогенерирующего шага мостика, но не дают детальных представлений о механизме взаимодействия актина и миозина. Следует, однако, заметить, что методика исследования взаимодействия актина и миозина на уровне одиночных молекул весьма активно развивается и совершенствуется в последние годы и результаты таких измерений становятся всё более ясными и определёнными (см., например, Veigel и др., 2003). Кроме того, такой подход не ограничивает исследователя в выборе объекта и позволяет использовать как нативные миозины различных классов, так и модифицированные молекулы со свойствами, не встречающимися в природе, но удобными для тех или иных экспериментальных целей.

Томограммы электронно-микроскопических срезов летательных мышц насекомых, полученных быстрым замораживанием (Taylor и др., 1999), показывают серьёзные отличия в конфигурации моторного домена по сравнению с реконструкциями акго-Sl комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson и Morris, 1997).

Таким образом, из всего сказанного следует очевидный вывод: несмотря на огромный прогресс в изучении механизма мышечного сокращения, на целый ряд гениальных догадок, развитие и разработку уникальных методов исследования, природа генерации силы в мышце остаётся в значительной мере неизвестной. Сама модель Huxley и Simmons'a 1971 года, а также экспериментальный подход, на результатах которого она была основана, стимулировали развитие целого ряда подходов к изучению механизма мышечного сокращения, так называемых методов нестационарной кинетики. Кроме упомянутого метода быстрых деформаций, для исследования силогенерирующего процесса были разработаны метод скачка давления с целью повлиять на термодинамические параметры в сокращающейся мышце; метод импульсного фотолиза искусственно инактивированных участников биохимического цикла мостика, таких как АТФ, АДФ, неорганического фосфата и свободного кальция. Был также разработан и использован метод лазерного скачка температуры, который позволяет увеличивать температуру в экспериментальной камере объёмом в несколько десятков микролитров на 4-8°С за время порядка долей миллисекунды.

Нами был разработан метод джоулева скачка температуры для одиночного скицированного волокна скелетной мышцы. Принцип метода состоит в следующем: через волокно, подвешенное в воздухе на одну-две секунды, пропускается импульс переменного электрического тока и это ведёт к выделению в волокне джоулева тепла. Метод позволяет увеличить температуру волокна с ~5°С (то есть, от температуры воздуха в экспериментальной камере) вплоть до 35-40°С за десятые доли миллисекунды. Быстрое повышение температуры сокращающегося волокна ведёт к значительному росту силы, зависящему от величины скачка температуры. Такой подход позволяет исследовать силогенерирующий процесс в мышце и сравнивать его с переходным процессом, вызванным ступенчатыми деформациями.

Используя метод скачка температуры мы зарегистрировали и исследовали механические характеристики вызванного им переходного процесса напряжения в одиночных мышечных волокнах лягушки и кролика. Механические эксперименты были сделаны с параллельной регистрацией длины саркомеров по дифракции света He-Ne лазера на волокне, что несомненно повышает возможности контроля качества волокна и достоверности результатов, так как даёт возможность судить о влиянии укорочения саркомеров на силу и, главным образом, на кинетику переходных процессов силы. В некоторых экспериментах длина саркомеров поддерживалась постоянной при помощи обратной связи по положению первого максимума дифракции, что позволяет исключить неоднородность укорочения саркомеров вдоль волокна, которая может влиять на результаты измерений. Действительно, было найдено, что неоднородность укорочения саркомеров замедляет кинетику переходного процесса силы после скачка температуры, практически не влияя при этом на максимальное напряжение. С использованием обратной связи по длине саркомеров была зарегистрирована температурная зависимость максимального изометрического напряжения в мышце кролика. С коррекцией на увеличение площади поперечного сечения мышечных волокон в результате разрушения наружной мембраны (скинирования), максимальное напряжение при физиологической температуре достигает 400 кН м".

Было показано, что рост напряжения в ответ на скачок температуры не сопровождается сколь-либо заметным увеличением жёсткости волокон и, стало быть, рост силы с повышением температуры связан не с увеличением числа миозиновых мостиков, присоединённых к тонким нитям, а с увеличением силогенерирующей способности мостиков.

Переходный процесс напряжения в ответ на скачок температуры сравнивали с механическим, вызванным ступенчатым изменением длины в одних и тех же волокнах. Оказалось, что кинетика температурного ответа даже при скачках температуры в 30-35°С всегда медленнее кинетики механического ответа даже при нулевой температуре.

Позднее метод скачка температуры был адаптирован для одновременной регистрации рентгеноструктурных событий, происходящих во время силогенерирующего процесса, вызванного быстрым повышением температуры. С помощью такого подхода на дифракционной рентгенограмме сокращающегося мышечного волокна были обнаружены изменения, не наблюдавшиеся ранее, а именно: рост напряжения, вызванный скачком температуры, сопровождается значительным повышением интенсивности первой актиновой слоевой линии, причём это повышение, как нам удалось показать, происходит синхронно с ростом напряжения. Такой результат противоречит чисто «рычажному» механизму силогенерации в молекуле миозина, где только поворот «хвостового» домена относительно моторного полагается активным процессом. Найденные изменения интенсивности 1-й и ряда других слоевых линий актина, как показано в настоящей работе, свидетельствуют о том, что взаимодействие молекулы миозина с поверхностью актина является не менее важной фазой силогенерирующего процесса.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бершицкий, Сергей Юрьевич

Основные результаты работы можно сформулировать в следующем виде:

1. Разработан метод высокоамплитудного джоулева скачка температуры для одиночных демембранизированных волокон и тонких пучков волокон скелетных мышц и технология измерения механических характеристик этих препаратов с субмиллисекундным временным разрешением при одновременной регистрации молекулярных структурных событий в них с помощью рентгеновской дифракции на синхротронных источниках рентгеновского излучения;

2. Впервые исследованы механические и термомеханические характеристики сокращающихся волокон скелетных мышц теплокровных (кролика) в широком диапазоне температур вплоть до физиологической и получена температурная зависимость изометрической силы теплокровных под контролем длины саркомеров;

3. Впервые показано, что жёсткость сокращающихся волокон при полной Са2+-активации не зависит от температуры. Этот результат означает независимость числа поперечных мостиков, соединяющих тонкие и толстые нити саркомера, от температуры;

4. Проведено систематическое исследование и сравнение характеристик механических переходных процессов напряжения в мышечных волокнах, вызванных скачком температуры и быстрыми ступенчатыми изменениями длины сокращающихся волокон. Показано, что механизмы, лежащие в основе этих двух типов переходных процессов, имеют различную природу;

5. Исследованы свойства отдельных миозиновых мостиков в мышечных волокнах, изолированных при помощи их сшивки с актином тонкой нити этил-диметил карбодиимидом (ЭДК). В таких условиях с использованием техники скачка температуры обнаружена кажущаяся независимость силогенерирующего шага миозиновых мостиков от напряжения;

6. Зарегистрирован временной ход изменения интенсивностей наиболее ярких рефлексов рентгенограммы сокращающихся мышечных волокон во время переходного процесса, вызванного скачком температуры, с временным разрешением в 1 миллисекунду. Обнаружено, что рост интенсивности первой актиновой слоевой линии, отражающей степень стереоспецифического связывания головок миозина с тонкой нитью, происходит одновременно с развитием механического напряжения, тогда как изменение интенсивности меридионального рефлекса МЗ, которые в экспериментах с быстрыми деформациями интерпретируются как междоменные конформационные изменения в головке миозина, имеет двухфазный характер;

7. Предложена структурно-кинетическая модель двухшагового силогенерирующего процесса в поперечном мостике, которая интегрирует механические, структурные и биохимические данные.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бершицкий, Сергей Юрьевич, Екатеринбург

1. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. О характере анизотропии мышечной ткани. //Доклады Академии наук СССР. 1981. Т.259, С.53-56.

2. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Действие субмиллисекундного скачка температуры на механическое напряжение демембранизованных волокон скелетной мышцы лягушки в состоянии ригора. // Биофизика. 1985. Т.ЗО. С.868-872.

3. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Термоупругие свойства поперечных мостиков в демембранизованных волокнах скелетной мышцы лягушки в состоянии ригора. // Биофизика. 1986. Т.31. С.532-533.

4. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Скачок температуры в активированныхмышечных волокнах лягушки. // Тезисы VIII симпозиума (СССР) 'Биофизика и биохимия биологической подвижности'. Пущино. 1987. С.82.

5. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Двухфазный ответ напряжения на скачок температуры в Са-акгивированных волокнах скелетной мышцы лягушки. // Биофизика. 1988. Т.ЗЗ. С.156-158.

6. Бэгшоу К. Мышечное сокращение. // М.: Мир. 1985. 127 с.

7. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. // М.: Наука. 1982.161 с.

8. Цатурян А.К., Бершицкий С.Ю. Реакция напряжения в демембранизированных Са-акгивированных волокнах скелетной мышцылягушки на скачок температуры после ступенчатого изменения длины. // Биофизика. 1988. Т.ЗЗ. С.570-572.

9. Энгельгардт В.А., Любимова М.Н. Аденозинтрифосфотаза и миозин мышц //Биохимия. 1939. Т.4. С.716-736.

10. Anson М., Geeves М.А., Kurzawa S.E., Manstein D. Myosin motors with artificial lever arms. // EMBO J. 1996. V.15. P.6069-6074.

11. Berger C.L., Svensson E.C., Thomas D.D. Photolysis of a photolabile precursor of ATP (caged ATP) induces microsecond rotational motions of myosin heads bound to actin. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V.86. P.8753-8757.

12. Berger C.L., Thomas D.D. Rotational dynamics of actin-bound myosin heads in active myofibrils. // Biochemistry. 1993. V.32 P.3812-3821.

13. Bershitsky S.Y. Force generation in muscle: progress and problems. // Abstracts of International symposium. Biological motility. Pushchino. 2001. P.15-17.

14. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K. Effect of joule temperature jump on tension and stiffness of permeabilized rabbit muscle fibers. II Biophys. J. 1989. V.56. P.809-816.

15. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K. Tension responses to joule temperature jump in skinned rabbit muscle fibres. // J. Physiol. 1992. V.447. P.425-448.

16. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K. Force generation and work production by covalently cross-linked actin-myosin cross-bridges in rabbit muscle fibres. // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 1011-1021.

17. Bershitsky S.Y., Tsaturyan, A.K. Comparison of tension transients induced by fast changes in length and temperature in rabbit muscle fibres. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1999. V. 20. P. 819-820.

18. Bershitsky S.Y, Tsaturyan A.K. The elementary force generation process probed by temperature and length perturbations in muscle fibres from the rabbit. // J. Physiol. 2002. V. 540. P. 971-988.

19. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K., Bershitskaya O.N., Mashanov G.I., Brown P., Burns R., Ferenczi M.A. Muscle force is generated by myosin heads stereospecifically attached to actin. //Nature. 1997. V. 388. P. 186-190.

20. Bertrand R., Chaussepied P., Audemard E., Kassab R. Functional characterization of skeletal F-actin labeled on the NH2-terminal segment of residues 1-28. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. P. 747-754.

21. Bertrand R., Chaussepied P., Kassab R., Boyer M., Roustan C., Benyamin Y. Cross-linking of the skeletal myosin subfragment 1 heavy chain to the N-terminal actin segment of resides 40-113. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 57285736.

22. Bordas J., Svensson A., Rothery M., Lowy J., Diakun G.P., Boesecke P. Extensibility and symmetry of actin filaments in contracting muscles. // Biophys. J. 1999. V. 77. P. 3197-3207.

23. Brenner В., Eisenberg E. Rate of force generation in muscle: correlation with actomyosin ATPase activity in solution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3542-3546.

24. Brticke E. Untersuchungen tiber den Bau der Muskelfasern mit Htilfe des polarisirten Lichtes. // Denkschr. Akad. Wiss. Wien. math.-naturwiss. Kl., 1858. V. 15. P. 69-84.

25. Burmeister-Getz E., Cooke R., Selvin P.R. Luminescence resonance energy transfer measurements in myosin. // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 2451-2458.

26. Burton K., Huxley A.F. Identification of source of oscillations in apparent sarcomere length measured by laser diffraction. // Biophys. J. 1995. V. 68. P. 2429-2443.

27. Chiu Y.L., Karwash S., Ford L.E. A piezoelectric force transducer for single muscle cells. // American J. Physiol. 1978, V. 235. P. 143-146.

28. Combeau С., Didry D., Carlier M.-F. Interaction between G-actin and myosin subfragment-1 probed by covalent cross-linking. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 14038-14046.

29. Cooke R., Crowder M.S., Wendt C.H., Barnett V.A., Thomas D.D. Muscle cross-bridges: do they rotate? //Adv. Exp. Med. Biol. 1984. V. 170. P. 413-427.

30. Cooke R., Franks K. All myosin heads form bonds with actin in rigor rabbit skeletal muscle. // Biochemistry. 1980. V. 19. P. 2265-2269.

31. Davis J.S., Harrington W.F. Force generation by muscle fibers in rigor: a laser temperature-jump study. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987a. V84. P. 975-979

32. Davis J.S., Harrington W.F. Laser temperature-jump apparatus for the study of force changes in fibers. //Anal. Biochem. 1987b. V. 161. P. 543-549.

33. Davis J.S., Harrington W.F. A single order-disorder transition generates tension during the Huxley-Simmons phase 2 in muscle. // Biophys. J. 1993. V. 65. P. 1886-1898.

34. Davis J.S., Rodgers M.E. Indirect coupling of phosphate release to de novo tension generation during muscle contraction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995a. V. 92. P. 10482-10486.

35. Davis J.S., Rodgers M.E. Force generation and temperature-jump and length-jump tension transients in muscle fibers. // Biophys. J. 1995b. V. 68. P. 20322040.

36. Dobbie I., Linari M., Piazzesi G., Reconditi M., Koubassova N., Ferenczi M.A., Lombardi V., Irving M. Elastic bending and active tilting of myosin heads during muscle contraction. //Nature. 1998. V. 396. P. 383-387.

37. Dominguez R., Freyzon Y., Trybus K.M., Cohen C. Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. // Cell. 1998. V. 94. P. 559-571.

38. Duong A.M., Reisler E. Binding of myosin to actin in myofibrils during ATP hydrolysis. //Biochemistry. 1989. V. 28. P. 1307-1313.

39. Ferenczi MA., Bershitsky S.Y., Koubassova N., Siththanandan V., Helsby W.I., Panine P., Roessle M., Narayanan Т., Tsaturyan A.K. The 'roll and lock' mechanism of force generation in muscle. // Structure. 2005. In press.

40. Ferenczi M.A., Bershitsky S.Y., Koubassova NA., Tsaturyan A.K. Stereo-specific binding of myosin heads to actin occurs synchronously with force development induced by T-jump in rabbit muscle fibres. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2002. V.23(5). P. 11.

41. Ferenczi M.A., Homsher E., Trentham D.R. The kinetics of magnesium adenosine triphosphate cleavage in permeabilized muscle fibers of the rabbit. // J. Physiol. 1984. V. 352. P. 575-599.

42. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. // Nature. 1994. V. 368. P. 113-119.

43. Ford L.E., Huxley A.F., Simmons R.M. Tension responses to sudden length change in stimulated frog muscle fibers near slack length. // J. Physiol. 1977. V. 269. P. 441-515.

44. Ford L.E., Huxley A.F., Simmons R.M. The relation between stiffness and filament overlap in stimulated frog muscle fibers. // J. Physiol. 1981. V. 311. P. 219-249.

45. Ford L.E., Huxley A.F., Simmons R.M. Tension transients during steady shortening of frog muscle fibres. // J. Physiol. 1985. V. 361. P. 131-150.

46. Forkey J.N., Quinlan M.E., Shaw M.A., Corrie J.E., Goldman Y.E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. //Nature. 2003. V.422. P. 399-404.

47. Gasser H.S., Hill A.V. The dynamics of muscle contraction // Proc. Roy. Soc. 1924. V. B96. P. 398-437.

48. Geeves M.A., Holmes K.C. Structural mechanism of muscle contraction. // Annual Rev. Biochem. 1999. V. 68. P. 687-728.

49. Glyn H., Sleep J. Dependence of adenosine triphosphate activity of rabbit psoas muscle fibres and myofibrils on substrate concentration. // J. Physiol. 1985. V. 365. P. 259-276.

50. Godt R.E., Maughan D.W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Experimental observations. //Biophys. J. 1977. V. 19. P. 103-116.

51. Goldman Y.E., Huxley A.F. Actin compliance: are you pulling my chain? // Biophys. J. 1994. V. 67. P. 2131-2136.

52. Goldman Y.E., McCray J.A., Ranatunga K.W. Transient tension changes initiated by laser temperature jump in rabbit psoas muscle fibres. // J. Physiol. 1987. V. 392. P. 71-95.

53. Goldman Y.E., Simmons R.M. Control of sarcomere length in skinned muscle fibres of Rana temporaria during mechanical transients. // J. Physiol. 1984. V. 350. P. 497-518.

54. Goldman Y.E., Simmons R.M. The stiffness of frog skinned muscle fibres at altered lateral filament spacing. // J. Physiol. 1986. V. 378. P. 175-194.

55. Grabarek Z., Gergely J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters.//Analyt. Biochem. 1990. V. 185. P. 131-135.

56. Harada Y., Noguchi A., Kishino A., Yanagida T. Sliding movement of single actin filaments on one-headed myosin filaments. // Nature. 1987. V. 326. P. 805808.

57. Heaphy S., Tregear R. Stoichiometry of covalent actin-subfragment 1 complexes formed on reaction with a zero-length cross-linking compound. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 2211-2214.

58. Herrmann C., Sleep J., Chaussepied P., Travers F., Barman T. A structural and kinetic study on myofibrils prevented from shortening by chemical cross-linking. //Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7255-7263.

59. Higuchi H., Yanagida Т., Goldman Y.E. Compliance of thin filaments in skinned fibers of rabbit skeletal muscle. // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 1000-1010.

60. Hill A.V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. // Proc. Roy. Soc. Lond. 1938. V. B126. P. 136-195.

61. Holmes K.C. The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. R112-118.

62. Holmes К. C. A molecular model for muscle contraction. // Acta Crystallogr. A. 1998. V. 54. P. 789-797.

63. Holmes K.C., Geeves M.A. The structural basis of muscle contraction. // Philos. Trans. Royal Soc. Lond. В Biol. Sci. 2000. V. 355. P. 419-431.

64. Holmes К. C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. Atomic model of the actin filament//Nature. 1990. V. 347. P. 44-49.

65. Horiuti К., Higuchi H., Umazume Y., Konishi M., Okazaki O., Kurihara S. Mechanism of action of 2,3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1988. V. 9. P. 156-164.

66. Houdusse A., Cohen C. Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2A resolution: implications for regulation. // Structure. 1996. V. 4. P. 21-32.

67. Houdusse A., Kalabokis V.N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. // Cell. 1999. V. 97. P. 459-470.

68. Houdusse A., Sweeney H.L. Myosin motors: missing structures and hidden springs. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 182-194.

69. Houdusse A., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. Three conformational states ofscallop myosin SI. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 11238-11243.

70. Howard J. Molecular motors: structural adaptations to cellular functions. // Nature. 1997. V. 389. P. 56 -57.

71. Howard J., Spudich J.A. Is the lever arm of myosin a molecular elastic element? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. V. 93. P. 4462-4464.

72. Huxley A.F. Muscle structure and theories of contraction. // Prog. Biophys. Biophys. Chem. 1957. V. 7. P. 255-318.

73. Huxley A.F. Reflections on muscle. // Liverpool Univ. Press, Liverpool. 1980. Ill P.

74. Huxley A.F. The mechanical properties of cross-bridges and their relation to muscle contraction. // Adv. Physiol. Sci. 1981. V. 5. P. 1-12.

75. Huxley A.F. Biological motors: energy storage in myosin molecules. // Curr. Biol. 1998. V. 8. P. R485-R488.

76. Huxley A.F. Mechanics and models of the myosin motor. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 2000a. V. 355. P. 433-440.

77. Huxley A.F. Cross-bridge action: present views, prospects, and unknowns. // J. Biomech. 2000b. V. 33, P. 1189-1195.

78. Huxley A.F., Niedergerke R. Interference microscopy of living muscle fibres. // Nature. 1954. V. 173. P. 971-973.

79. Huxley A.F., Simmons R.M. A quick phase in the series-elastic component of striated muscle, demonstrated in isolated fibres from the frog. // J. Physiol. 1970. V. 208. P. 52P-53P.

80. Huxley A.F., Simmons R.M. Mechanical properties of the cross-bridges of frog striated muscle. // J. Physiol. 1971a. V. 218. P. 59P-60P.

81. Huxley A.F., Simmons R.M. Proposed mechanism of force generation in striated muscle. //Nature. 1971b. V. 233. P. 533-538.

82. Huxley H.E. X-ray analysis and the problem of muscle. // Proc. R. Soc. B. 1952. V. 141. P. 59-62.

83. Huxley H.E. Electron microscope studies of the organisation of the filaments in striated muscle. // Biochem. Biophys. Acta. 1953. V. 12. P. 387-394.

84. Huxley H.E. The double array of filaments in cross-striated muscle. // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1957. V. 3. P. 631-648.

85. Huxley H.E. The mechanism of muscular contraction. // Science. 1969. V. 164. P. 1356-1365.

86. Huxley H.E. A personal view of muscle and motility mechanisms. // Annu. Rev. Physiol. 1996. V. 58 P. 1-19.

87. Huxley H.E. Past, present and future experiments on muscle. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. 2000. V. 355. P. 539-543.

88. Huxley H.E., Brown W. The low-angle X-ray diagram of vertebrate striated muscle and its behaviour during contraction and rigor. // J. Mol. Biol. 1967. V. 30, P. 383-434.

89. Huxley H.E., Hanson J. Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their interpretation. // Nature. 1954. V. 173. P. 973976.

90. Huxley H.E., Simmons R.M., Faruqi A.R., Kress M., Bordas J., Koch M.H. Changes in the X-ray reflections from contracting muscle during rapid mechanical transients and their structural implications. // J. Mol. Biol. 1983. V. 169. P. 469-506.

91. Irving M., Lombardi V., Ferenczi M.A., Piazzesi G. Myosin head movements are synchronous with the elementary force-generating process in muscle. // Nature. 1992. V. 357. P. 156-158.

92. Irving M., Piazzesi G., Lucii L., Sun Y.-B., Harford J.J., Dobbie I.M., Ferenczi M.A., Reconditi M., Lombardi V. Conformation of the myosin motor during force generation in skeletal muscle. //Nature Struct. Biol. 2000. V.7. P. 482-485.

93. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F., Holmes K.C. Atomic structure of the actin DNAase I complex. // Nature. 1990. V. 347. P. 37- 44.

94. Kawai M., Kawaguchi K., Saito M., Ishiwata S. Temperature change does not affect force between single actin filaments and HMM from rabbit muscles. // Biophys. J. 2000. V. 78. P. 3112-3119.

95. King R.T., Greene L.E. The conformation of cross-linked actin-S-1 in the presence and absence of ATP. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 6128-6134.

96. Kishino A., Yanagida T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. // Nature. 1988. V. 334. P. 74-76.

97. Koubassova N.A., Bershitsky S.Y., Ferenczi M.A., Tsaturyan A.K. Quantitative interpretation of the 2D x-ray diffraction patterns from skeletal muscle using direct modelling. //Fibre Diffraction Review. 2003. V.ll. P.131-132.

98. Koubassova, N.A., Tsaturyan, A.K. Direct modeling of X-ray diffraction pattern from skeletal muscle in rigor. // Biophys. J. 2002. V. 83. P. 1082-1097.

99. Klihne W. Untersuchngen liber das Protoplasma und die Contractilitat. // Leipzig. Engelmann. 1864.

100. Linari M., Aiazzi A., Dolfi M., Piazzesi G., Lombardi V. A system for studying tension transients in segments of skinned muscle fibres from rabbit psoas. // J. Physiol. 1993. V. 473. P. 8.

101. Linari M., Dobbie I., Reconditi M., Koubassova N., Irving M., Piazzesi G., Lombardi V. The stiffness of skeletal muscle in isometric contraction and rigor: the fraction of myosin heads bound to actin. // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 24592473.

102. Lombardi V., Piazzesi G., Ferenczi M.A., Thirlwell H., Dobbie I., Irving M. Elastic distortion of myosin heads and repriming of the working stroke in muscle. //Nature. 1995. V. 374. P. 553-555.

103. Lombardi V., Piazzesi G., Linari M. Rapid regeneration of the actin-myosin power stroke in contracting muscle. // Nature. 1992. V. 355. P. 638-641.

104. Lovell S.J., Knight P.J., Harrington W.F. Fraction of myosin heads bound to thin filaments in rigor fibrils from insect flight and vertebrate muscles. // Nature. 1981. V. 293. P. 664-666.

105. Lymn R.W., Taylor E.W. Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomyosin. //Biochemistry. 1971 V.10. P. 4617-4624.

106. Mendelson R.A., Morris E.P. The structure of F-actin. Results of global searches using data from electron microscopy and X-ray crystallography. // J. Mol. Biol. 1994. V. 240. P. 138-154.

107. Mendelson R.A., Morris E.P. The structure of the acto-myosin subfragment 1 complex: results of searches using data from electron microscopy and x-ray crystallography. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 8533-8538.

108. Molloy J.E., Burns J.E., Kendrick-Jones J., Tregear R.T., White D.C. Single-molecule mechanics of heavy meromyosin and SI interacting with rabbit or Drosophila actins using optical tweezers. //Nature. 1995. V. 378. P. 209-212.

109. Molloy J.E., Kendrick-Jones J., Veigel C., Tregear R.T. An unexpectedly large working stroke from chymotryptic fragments of myosin II. // FEBS Letters. 2000. V. 480. P. 293-297.

110. Mornet D., Bertrand R., Pantel P., Audemard E., Kassab R. Structure of the actin-myosin interface. //Nature. 1981. V. 292. P. 301-306.

111. Pate E., Wilson G.J., Bhimani M., Cooke R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. //Biophys. J. 1994. V. 66. P. 1554-1562.

112. Piazzesi G., Lombardi V., Ferenczi M.A., Thirlwell H., Dobbie I., Irving M. Changes in the x-ray diffraction pattern from single, intact muscle fibers produced by rapid shortening and stretch. // Biophys J. 1995. V68. P92S-98S.

113. Piazzesi, G., Reconditi, M., Koubassova, N., Decostre, V., Linari, M., Lucii, L., Lombardi V. Temperature dependence of the force-generating process in single fibres from frog skeletal muscle. // J. Physiol. 2003. V. 549, P. 93-106.

114. Piazzesi G., Reconditi M., Linari M., Lucii L., Sun Y.-B., Narayanan Т., Boesecke P., Lombardi V., Irving M. Mechanism of force generation by myosin heads in skeletal muscle. // Nature. 2002. V. 415. P. 659-662.

115. Potma E.J., Stienen G.J.M., Barends J.P.F., Elsinga G. Myofibrillar ATPase activity and mechanical performance of skinned fibres from rabbit psoas muscle. // J. Physiol. 1994. V. 472. P. 303-317.

116. Provencher S.W. A Fourier method for the analysis of exponential decay curves. // Biophys. J. 1976. V. 16. P. 27-50.

117. Ranatunga K.W. Temperature sensitivity of isometric tension in glycerinated mammalian muscle fibres. // In: Muscle and Motility (eds. G. Marechal and U. Carraro, Intercept Ltd., Andover, UK). 1990. V. 2. P. 271-276.

118. Ranatunga K.W. Endothermic force generation in fast and slow mammalian (rabbit) muscle fibers. // Biophys. J. 1996. V. 71. P. 1905-1913.

119. Ranatunga K.W. Effects of inorganic phosphate on endothermic force generation in muscle. // Proc. Royal Soc. Lond. В Biol. Sci. 1999. V. 266. P. 1381-1385.

120. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. // Science. 1993a. V. 261. P. 50-58.

121. Rayment I., Holden H.M., Whittaker M., Yohn C.B., Lorenz M., Holmes K.C., Milligan R.A. Structure of the actin-myosin complex and its implication for muscle contraction. // Science. 1993b. V. 261. P. 58-65.

122. Reedy M.C. Visualizing myosin's power stroke in muscle contraction. // J. Cell Sci. 2000. V. 113. P. 3551-3562.

123. Reedy M.K., Holmes K.C., Tregear R.T. Induced changes in orientation of the cross-bridges of glycerinated insect flight muscle. // Nature 1965. V. 207. P. 1276-1280.

124. Sheetz M.P., Spudich J.A. Movement of myosin-coated fluorescent beads on actin cables in vitro. //Nature. 1983. V. 303. P. 31-35.

125. Shih W.M., Gryczynski Z., Lakowicz J.R., Spudich J.A. A FRET-based sensor reveals large ATP hydrolysis-induced conformational changes and three distinct states of the molecular motor myosin. // Cell. 2000. V. 102. P. 683-694.

126. Simmons R.M., Finer J.T., Chu S., Spudich J.A. Quantitative measurements offorce and displacement using an optical trap. // Biophys J. 1996. V.70. P. 18131822.

127. Stephenson D.G., Williams D.A. Temperature-dependent calcium sensitivity changes in skinned muscle fibres of rat and toad. // J. Physiol. 1985. V. 360. P. 1-12.

128. Sutoh K. Identification of myosin-binding sites on the actin sequence. // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 3654-3661.

129. Sutoh K. Mapping of actin-binding sites on the heavy chain of myosin subfragment 1. //Biochemistiy. 1983. V. 22. P. 1579-1585.

130. Suzuki Y., Yasunaga Т., Ohkura R., Wakabayashi Т., Sutoh K. Swing of the lever arm of a myosin motor at the isomerization and phosphate-release steps. // Nature. 1998. V. 396. P. 380-383.

131. Svensson E.C., Thomas D.D. ATP induced microsecond rotational motions of myosin heads cross-linked to actin. // Biophys. J. 1986. V. 50. P. 999-1002.

132. Tawada K., Huang Y.-P., Emoto Y. Force production by covalently fixed cross-bridge heads in permeabilized fibers // In: Muscle Energetics (Alan R. Liss, Inc.). 1989. P. 37-43.

133. Tawada K., Kawai M. Covalent cross-linking of single fibers from rabbit psoas increases oscillatory power. // Biophys. J. 1990. V. 57. P. 643-647.

134. Tawada K., Kimura M. Stiffness of carbodiimide-crosslinked glycerinated muscle fibers in rigor and relaxing solutions at high salt concentrations. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1986. V. 7. P. 339-350.

135. Towns-Andrews E., Beny A., Bordas J., Mant G.R., Murray P.K., Roberts K., Sumner I., Worgan J.S., Lewis R. Time-resolved x-ray diffraction station: x-ray optics, detectors and data acquisition. // Rev. Scient. Instrument. 1989. V. 60. P. 2346-2349.

136. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y. Force generation and shortening initiated by temperature jump in cross-linked rabbit muscle fibres. // J. Physiol. 1995, V. 483, P. 92-93P.

137. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y., Burns R., Ferenczi M.A. Structural changes accompanying force generation induced by temperature jump in permeabilised frog muscle fibres. //J. Muscle Res. Cell Motil. 1997. V.19. C.281.

138. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y., Burns R., Ferenczi M.A. Structural changes in the actin-myosin cross-bridges associated with force generation induced by temperature jump in permeabilized frog muscle fibers. // Biophys. J. 1999. V. 77. P. 354-372.

139. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y., Ferenczi M.A., Koubassova N.A. Direct modelling as a tool for interpretation of the x-ray diffraction pattern from skeletal muscle. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2001. V. 22, P. 584-585.

140. Urbanke C., Wray J. A fluorescence temperature-jump study of conformational transitions in myosin subfragment 1. // Biochem. J. 2001. V. 358, P. 165-173.

141. Uyeda T.Q., Abramson P.D., Spudich J.A. The neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 4459-4464.

142. Veigel C., Coluccio L.M., Jontes J.D., Sparrow J.C., Milligan R.A., Molloy J.E. The motor protein myosin-I produces its working stroke in two steps. // Nature. 1999. V. 398. P. 530-533.

143. Veigel C, Molloy J.E., Schmitz S., Kendrick-Jones J. Load-dependent kinetics of force production by smooth muscle myosin measured with optical tweezers. // Nat. Cell Biol. 2003. V.l 1. P. 980-986.

144. Wakabayashi К., Sudimoto Y., Tanaka H., Ueno Y., Takezawa Y., Amemiya Y. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. // Biophys. J. 1994. V. 67. P. 2422-2435.

145. Woledge R.C., Curtin N.A., Homsher E. Energetics aspects of muscle contraction. // Academic Press Inc. (London) Ltd. 1985.357 P.

146. Zhao Y., Kawai M. Kinetic and thermodynamic studies of the cross-bridge cycle in rabbit psoas muscle fibers. //Biophys. J. 1994. V. 67. P. 1655-1668.