Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование соматического эмбриогенеза и мутагенеза для получения генетически измененных форм винограда

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование соматического эмбриогенеза и мутагенеза для получения генетически измененных форм винограда"

-- НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ

о ь ФЕВ *" 1нститут кл1тинно1 бЮлогИ та генетично! ¡нженерП

На правах рукииису

УДК 573.6 575 224.46 < 575.234.2 +■ 58?. 783

Белокурова Валер Iя Борис1вна

ВНКОРИСТАШМ СОМАТИЧНОГО ЕМБРЮГЕНЕЗУ ТА МУТАГЕНЕЗУ ДЛЯ ОТРИМАННЯ ГЕНЕТИЧНО ЗМ1НЕНИХ ФОРМ ВИНОГРАДУ

Спец1альн1сть 03.00.25 - кл!тинна б!олог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступени кандидата 61олог1чних наук

Ки1в - 1997

Роб:.'!у виконано У лабораторП цитотехнолог1й в1дд1лу k.iiiruHHoi селекцП 1нституту кл1тшшо1 61олог11 та генетич-!Pi 1нкенерП HAH Украйш

Науковий кер1вник - академ1к HAH Украйш

доктор 61олог1чних наук Глеба ЮрШ ЮрШович

0ф1ц1Пн1-опоненти - доктор 61олог1чних наук,

професор

Кунах В1ктор Анатол1йович

Пров!дна орган!зац!я - Гнститут ф1з1олог11 рослнн та

на зас1данн1 спец1ал1зовано1 ради Д.01.19.01 1нституту кл1-тинно! б1олог11 та генетнчно! 1нженерП HAH Укра!ни за адре-оою: 252143. Ки1в - 143, вул. Заболотного. 148.

3 дисертац1ею ножна ознайомитися в б1бл1отец1 1нституту к.п1тинно! 61олог11 та генетично! 1нженер11 HAH Укра1ни Автореферат роз1 слано " "__ 1997 р.

В. о. вченого секретаря спец1ал1зовано!

ради, доктор б1олог1чних наук —_ / Л. Ф. Горовий

кандидат б1олог1чних наук Банникова Мар1я 0лександр1вна

генетики HAH Укра1ни

/

/

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуалыпсть теми. Виноград культурний, VitiS Vinlferil (2n = 38). який належить до родини Vitaceae, е одн1ею з най-б1льш розповсюдженнх с1льеькогосподарських рослин. Технология його вирощування та селекцП залишалась практично нез-м!нною на протяз1 тисячолИь. Виноград розмножують вегетативно. при цьому 1нод1 виникають соматичн1 мутацП. як1 мо-жуть використовуватися як основа для клоново! селекцП. Най-б1льше значения серед спонтанних соматичних мутац1й у винограду мають геномн1 мутац11. а саме пол1пло!д1я (Дудник, 1979; Топалэ. 1983).

Ряд причин обмежують можливост1 максимально ефективного застосування в селекцП винограду традиЩйних метод1в. Висо-ка гетерозиготн1сть винограду, иол1г.енне успадкування еконо-м!чно важливнх ознак та дом1нантн1сть ген1в дикого типу обу-мовлюють низьку Пмов1рн1сть отримання бажаних комб1нац1й ге-н1в шляхом статево! г1бридизац11. В1дносно тривалнй генера-ц1йний перЮд винограду спов1льнюс селгкщйний процес. Тра-диц1йн1 методи вегетативного розмноження потребують багато часу, кошт1в та великих земельнпх площ.

Перел1чея! факгори св1дчать про необх1дн1сть впровад-ження в практику виноградарства нових п1дход1в. Широк1 мож-ливост1 в1дкривас застосування метод1в культури тканин та кл1тинних технолог1й in vitro. Зокрема. явище ссмаклонально! м1нливост1, яке широко розповсюджено серед рослин, отриманих в умовах In vitro, все част1ше застосовуеться для отримання генетично нових Форм с1льськогосподарських культур (Lorz К

Brown, 1986; Evans, 1989; Larklrietal.. 1989). Можливост! використанмя нетод1в культури тканин для винограду активно вивчаються. 1 деяк1 отриман1 результата вже знайшли практично застосування (Mouette, 1988).

Разом з тим нимало питань залишаються невир1шеними. Гак, Фрагментарними 1 часом суперечливими е дан! про факто-ри, що вшшвають на процеси морфогенезу винограду in vitro. ЕФектнвн1 охеми регенерац!1 розроблен! лише для деяких гено-тиШв винограду, Головины чином для м1жвидових г1брид1в. Практично невивченим е питания про генетичну м1нлив1сть (або, навпаки, стаб1льн1сть) рослин винограду, отриманих in vitro. Публ1каи11 стосовно сомаклонально1 м1нливост1 у винограду нечисленн! 1 мають лише попередн1й характер (Alleweldt & Posslngliam, 1988). Кр1м того, для винограду т1льки починаеться вивчення можливост! поеднання метод1в культури тканин та 1ндукованого мутагенезу з метою створення т'онетично зШнених Форм. В зв'язку з цим досл1д;кення гене-тично1 м1нливост1 винограду в культур1 in vitro викликас як теоретичний, так 1 практичний 1нтерес.

Мета та завдання роботи. Метою дано! роботи було вивчення оомаклонально1 м1нливост1 у роолин-регенерант1в винограду. отриманих in vitro шляхом соматичного ембр1огенезу, а також м1нливост1, 1ндуковано1 в культур1 in vitro винограду при використанн1 Ф1зичних i х1м1чних мутагеи1в. До конкретних завдань роботи входило: 1. Визначити оптимальн! умови ефективио1 perenepauiï рослин винограду з калуснпх тканин шляхом соматичного ембр1-огенезу та отримати рослшш-регенеранти.

2. Вивчити одержан1 рослшш-регенеранти за морфолог!ч-ними. цитогенетичними. иолекулярно-б1олог1чними та агроб1о-лог!чними ознаками.

3. Розробити методику 1ндукованого мутагенезу в культу-pi in vitro винограду та одержат рослини-регенеранти з ка-лусних тканин, що зазнали мутагенних обробок.

4. Пор1вняти ефективШсть сомаклонально! м1нливост1 та 1ндукованого in vitro мутагенезу для отворення нових геноти п1в винограду з точки зору 1х можливого використання в се-лекц1йн1й практиц!.

Наукова новизна. Вперше проведено комплексне вивчення рослин винограду, регенерованих з калусних тканин шляхом со-матичного ембр1огенезу. з метою виявлення серед них сомакло-нальних вар1ант1в.

Вперше показано, що у винограду в nponccl регенератi з .калусних тканин шляхом соматичного ембр!огенс-зу поряд з дип-ло1дними рослинами з невеликою частотою (2.5%) формуються тетрапло!дн1 регеиеранти.

Розроблено методику 1ндукованого ¡a vitro мутагенезу з використанням гамма-опром1нення (у-опром1нення) 1 визначен! меж1 рад1очутливост! калусних тканин та соматичних ембрЮ!-д1в винограду. Вперше показано, що к_опром1нення первинного калусу в доз1 10 Гр стимулюо соматнчшШ ембр1огенез у винограду, що дозЕоляе майже вдв1ч1 скоротити трнвал!сть часу в1д початку культивування експлантату до появи соматичних ембр1-о1д1в в калусн1й тканин1.

Показано, що Т(-опром1нення ембр1огенного калусу з сома-тичними ембр1о1дами дозволяе зб1лыиити в1дсоток тетрашшд-них регенерант1в 1 в цьому в1дношенн1 е б!льш ефективним.

н1ж культивуваннл в присутност1 колхЩшу. Встановлено, що частота регенерацП тетрапл01дних рослин залежить в1д дози К~опром1нення 1 е максимальною (42%) при опром1ненн1 ембр1о-гашого калусу в доз! 5 Гр.

Практична ц!нн1сть. Розроблена методика регенерацП рослин винограду з калусних тканин шляхом соматичного ембр1-огенезу дэе можлив!сть з високою ефективн!стю отримувати морфолог1чно нормальн! регенеранти 1 може бути застосована для тиражування генотлп1в винограду in vitго.

Розроблен1 способи стимулювання проростання соматичних ембр1о!д1в можуть бути використан! для вивчечня процес!в опокою соматичних ембр1о!д1в 1 застосован! для Шдвищення ефективност1 регенерацП рослин з калусних тканин винограду.

Розроблена методика штучного мутагенезу tri vitro з ви-користанням к-опром1нення в низьких дозах може бути рекомендована як ефективний зас1б отримання тетрашшдних форм винограду з метою Ix подальшого використання в селекцШйй практиц!.

Основн! положения, як! виносяться на захист:

1. Виникнення тетрапло]'дних рослин е формою прояву со-маклонально! м1нливост! у винограду при регенерацП шляхом соматичного ембр1огенезу.

2. Регенерац1я рослин винограду шляхом соматичного емб-р1огенезу запоб1гае формуванню цитогенетичних химер.

3. Поеднання соматичного ембрЮгенезу та 1ндукованого in vitro мутагенезу з використанням к-опром1нення дозволяс з високою ефективн1стю отримувати тетрапло!дн! форми винограду - ц!нний рослинний матер!ал для селекц1йно! практики.

Апробац1я роботи. Результата робота були представлен1 на М1жнародному симпоз1ум1 з виноградарства для молодих вче-них (м. Кечкемет, Угорщина, 8-12 вересня 1986 р.); М1жнарод-н1й конференцП "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (м. Новосиб1рськ, 2-6 серпня 1988 р.); Всесоюзн1й на-рад1 з метод1в в1дбору по комплексу ознак в селекцП рослин (м. Симферополь, 26-28 вересня 1989 р.); XI М1жнародному симпоз1ум1 "Embryology and seed reproduction" (м. Лен1нград. 3-7 липня 1990 р.); 2-му з'!зд1 Всесоюзного товариства Ф1з1-олог1в рослин (м. М1нск, 24-29 вересня 1990 р.) та М1жнарод-ному' симпоз1ум1 "In vitro culture and horticultural breeding" (м. Балт1мор, США. 28 червня- 2 липня 1992 р.).

Публ1каиН. OchobhI результата дисертац1йно! роботи в1-дображен1 у 8 друкованих працях, список яких наводиться в к1нц1 автореферату.

Структура та об'ем робота. Дисертац1я включае в себе вступ. огляд л1терагури, матер1али та методи, результата та обговорення. заключну частину, висновки та список цитовано! л1тератури. що м1стить 194 б1бл1ограф1чних посилання, з яких 167 1ноземн1. Роботу викладено на 162 стор1нках машинописного тексту, серед яких 13 малпнк1в та 14 таблиць.

- 6 -МАТЕР1АЛИ ТА ЫЕТОДИ Pocjiiihh винограду сорту Подарунок Магарача, створеного в 1нститут1 винограду 1 вина "Магарач" (м. Ялта), були вико-ристаШ як об'ект досл1джень. Сорт Подарунок Магарача, який с складним м1жвидовим г1бридом, було отримано в результат! схрещування сорту Г'кацител1 та Пбридно! ФорЪт Н 2-57-72, одержано!, в свою чергу. в!д схрещування сорт1в Мцване кахе-. тинський х Сочинський чорний. В1н характеризуеться ранн!м отроком дозр!вання та польовою ст1йк.1стю до низьких температур. ф1локсери TeVм1лд'ю (Голодрига и др.. 1986).

Для введения в культуру in vitro зелен 1 пагони винограду стерил1зува.пи в розчин1 дЮциду. Бруньки культивували в р1дкому поживному середовищ1 Н, (Harris & Stivenson. 1982). яке Mi стило бензилам1нопур1н (БАП), до утворення множинних iiaroiiiB. Отриман! рослини вирощували на твердому безгормональному модифисовамому середовищ1 Но (Harris & Stivenson, 1982) при 26-28°С та 16-годинному фотопер1од1. Листки асеп-тичио культивованих рослин використовували як експлантати в подальших досл1дах з 1ндукц1! соматичного ембр1огенезу.

Для в1дпрацювання умов, регенератi рослин винограду шляхом соматичного ембр1огенезу було застосовано модиф1кова-ну нами методику Марченко та 1н. (1987). Регенерац1я включала три етапи: 1) отримання первннного калусу ; 2) утворення соматичних ембр1о!д1в в калусн)й тканиШ: 3) проростання со-матичних ёмбр1о!д1в та розвиток рослин-регенерант1в.

1ндукц1ю перванного калусу проводили на середовищ1 MS (Murashige & Skoog. 1962) в присутност1 1-2 мг/л 2,4-дихлор-феноксиоцтово! кислоти (2,4-Д) та 0,1-5 мг/л БАП. Калусн1 тканини культивували в темнот! при 26-28°С. Через 2-3 м1сяц!

сформован1 калуси переносили на середовище MS, яке м1стило 1-2 мг/л нафтилоцтово! кислоти (НОК) та 0.1-5 нг/л БАП, 1 продовжували культивування в тих самих умовах до утворення соматичних ембр1о!д1в. СФормован1 ембр1о1ди культивували на безгормональному середовищ1 MS при 28°С в умовах 16-годинно-го фотопер1оду до формування рослин. Для зб1льшення ефектив-ност1 проростання соматичних ембрЮ1д1в було вивчено вплив деяких стимулюючих обробок (попередня 1нкубац1я ембр1о1д1в при 4°С на протяз! 2-8 тижн1в. культивування в присутност1 0,2 мг/л БАП або 0,4 мг/л г!ббереллово! кислоти (ГК3) та по-еднання цих фактор1в). Отриман! рослини-регенераити культивували на безгормональному середовищ! Н(.

Було проведено дв1 cepll експеримент1в з 1ндукованого in vitro мутагенезу. В nepuili? cepll деслШв у-опром1нення було використано як мутагенниЯ фактор. Опром1нення рослинно-го матер1алу проводили на установц1 "Исследователь", вико-ристовуючи 60Со з питомою яктивШстю Ю Гр/хв як лжерело оп-ром1нення. В першому вар1ант1 досл1ду оиромШювали первинний калус. в другому вар1ант1 - ембр!огешшй калус, якиП м1стив соматичн1 ембр1о!ди на р1зних стад1ях розвитку. Дози огтром!-нення становили 5-500 Гр.

В друг1й cepll експеримент1в з 1ндукованого мутагенезу вивчали вплив колх1цину (0,01%) на розвиток культивованих тканин винограду та пло!дн1сть отриманих з них рослин-реге-нерант1в. Розчин колх1цину стерил1зували ф1льтруванням через мембранний ф1льтр "Mlllpore" та додавали в роз1гр1те поживне середовище. В першому вар!ант1 досл1ду в присутност1 колх1-цину культивували первинний калус. в другому вар1ант1 - емб-рЮгенний калус з соматичними ембр1о!дами на р1зних стад1ях

розвитку. 3 метою оц!нки шю!дност1 рослин. регенерованих з калусних тканин, як1 зазнали мутагенуих обробок, було проведено Ix цитогене^ичний анал1з. Контрольним вважався досл1д по регенерацП рослин з калусних тканин без мутагенних обробок.

0ц1нку пло!дност1 отриманих регенерантГв зд1йснювали шляхом п!драхунку хромосом в тимчасових'давлени'х препаратах к.1нч1к1в кор1нц1в рослин, культивованих in vitro. OchobhI операцН по ф!ксацП рослинного матер!алу та приготуванню препарат!в проводили зПдно з модиф1кованими нами стандарт-ними методиками (Паушева, 1988). Препарата вивчали та фотог-рафували на м1кроскоп1 Reichert (АвстрШ.

Для анал!зу reniB рРНК рослин-регенерант1в методом блот-г1бр1ц1зацП за Саузерном (Southern, 1975) ДНК вид1ляли з листя рослин. що вирощували in vitro, зг1дно з методикою, запропонованою Shure et al. (1983). Отриману сумарну ДНК об-робляли рестриктазами EcoRI або BamHI; фрагмента фракц!ону-вали в агарозному гел1, переносили на н1троцелюлозн1*ф1льтри та г1бридизували з м1ченою плазм1дою pUL222, яка м1стила фрагмент 3'-к1нцево1 посл!довност1 гену 26S рДНК лимону дов-жиною 500 пн (Колоша та Фодор, 1986).

Анал1з МорфолоПчних та агроб1олог1чних ознак регене-рант1в винограду проводили через р1к п1сля Ix висадки у в1дкритий грунт. Агроб1олог1чне вивчення зд1йснювали зПдно з "Методическими рекомендациями по изучению сортов винограда в производственных условиях" (Грамотенко та 1н., 1982)'.

Статистичну обробку отриманих експериментальних даних'з метою оц1нки достов1рност! р!зниц1 м1ж контролем та досл1дом проводили зг1дно з монографию (Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТ!! ТА ОБГОЕОРЕННЯ

1. Регенерац1я рг.слин винограду з калусних тканин шляхом соиатичного ембр1огенезу.

В сво1х експериментах ми перевхряли вплив типу екснлан-тату (листки, черешни. м1швузля асептично культивоваиих рос-лин). ф1зичного стану наживного середовища (р1дке або агари-зоване), а також концентрацп! рослинних ригулятор1в росту з метою визначення найб1льш ефзктивних умов 1ндукцП соматич ного ембр1огенезу у винограду. Критер1ем ефективност1 кожного вар1анту поживного середовиша Сули к!льк1сть ембрЮШв, що сформувалися в калусн1п тканин!, а тако^ тривал!сть куль-тивування в1д експлантату до початку иоявп сома-гичних ембр!-о!д1в. СоматичниЯ ембр1огенез було стпмульовано в калусних .тканинах, отриманих з експлантат!в листк1в винограду сорту Подарунок Иагарача, на агаризованому поживному соредовищ! ИЗ при використанн! таких комб!нац1й регуляторов росту:

1) 2 мг/л 2.4-Д + 0,1 мг/л БАП для 1ндукц11 первинного калусу, а дал1 для 1ндуьн15 ссмагичних ембп!п1д!в 2 мг/л 110К + 0,1 мг/л БАП (середовища и'.„ НВ3);

2) 2 мг/л 2,4-Д + 1 мг/л БАП для шдукцП первинного калусу, а дал! 1 мг/л НОК + 1 мг/л БАП дли 1ндукп11 соматич-них ембр1о!д1в (сзредовища 0Вэ-НВ7).

В першому вар!ант! (БВЭ-МВ3) в калусн!й тканин1 Форму-валися лише псодинок1 кластери соматичннх с-мбр!о!д1в, а три-вал!сть культивувакня в1д експлантату до появн ембр1о!д1н складала 6-7 м1сян1в. В другому вар!ант1 (0Вд-1Ш7) ембр1о!ди починали формуватись через 3-4 м1сяц! на окрем!й д1лянц! ка-¡•1-31

лусно! тканини, а дал1 по вс1й площин1 калусу. Ембр1огенний потенц!ал калусно! тканини збер1гався на протяз! майже двох рок1в.

Соматичн1 ембр1о!ди на торпедовидн!й стадП розвитку переносили на безгормональне середовище МЗ 1 культивували при 26-28°С та 16-годинному фотопер1од1. В таких умовах по-чинався розвиток стеблевого та кореневого апекс1в, дал1 роз-вивалися корен1 та с1м'ядольн1 листки, а через 3-4 тижн! формувалися проростки. Разом з тим ефективн1сть проростання ембр1о!д1в була досить низькою - лише 10% з них сформували рослини. Б1льша частина ембр1о!д1в гинули або давали початок вторинним ембр1о!дам, що розвивалися в зон! г!покотилю.

Низький в1дсоток проростання ембр1о!д1в вважаеться од-н1ею з головних перешкод широкому практичному використанню соматичного ембр1огенезу у винограду (У11ар1апа & МиШпэ, 1989) 1 обумовлюе необх1дн1сть розробки способ!в п1двищення ефективност1 цього процесу. 0триман1 нами результата вивчен-ня впливу деяких стимулюючих обробок на проростання соматич-них ембр!о1д1в винограду наведено в Таблиц1 1. Серед вивче-них вар1ант1в досл1ду найб1льш ефективною була 1нкубац1я со-матичних ембр1о!д1в при 4°С з подальшим культивуванням на середовищ! МБ в присутност1 0,2 мг/л БАП. В цих умовах 54% ембр1о1Д1в формували рослин».

Таблиця 1. Ефективн1сть проростання соматичних ембр1о!д1в винограду сорту Подарунок Магарача в р1зних умовах культивування

Умови Загальне Уисло ЕфективнЮть td

культивування число ембр1о!д1в. проростання.

ембр1- як1 сформу- %

о!д1в вали рослини

1.Безгормональна MS 415 42 10.12

(контроль)

2. MS + 0.2 мг/л БАП 191 31 16.2» 2,03

3.MS + 0,4 мг/л ГК3 111 14 12.6 0.75

4.4°С. безгормональна MS 114 22 19. 3* 2,25

5. 4°С. MS +0.2 мг/л БАП 194 105 54,1*** 11.32

6. 4° С. MS + 0,4 мг/л ГКЭ 139 28 20.1** 2.71

* р1зниця достсз1рна при р05 ** р1зниця достов1рна при р01 *♦* р1зшщя достов1рна при p00i '

2. 1ндукований in vitro мутагенез у винограду.

В наступн!й cepli експеримент1в ми лоеднали систему ре-генерацП шляхом сомачичного ембр1огенезу та 1ндукований мутагенез In vitro з метоя вивчення можливост1 розширення ге-нетично! м1нливост1 серед ррспин-регенерант1в. Ц1кавою була також можлив1сть пор1вняти за частотою та спектром вар1ант1в власне сомаклональну вар!абельн1сть (ч1нлив1сть серед рос-лин, регенеровзних без будь-яких мутагенних обробок) та м1н-лив1сть. 1ндуковэну штучним мутагенезом-в умовах in vitro.

Були обрач1 мутагени. що найчаст1ше використовуються в селекц11 винограду: ¥~<шром1нення ха колхЩин. Вар1анти дос-7*

л!д1в в!др!знялисл 1) характером мутагенного фактору (у-оп-poMlnemm або колхЩин) та 2) стад1ею, на як1й культивован1 тканини Шдлягали д1! мутагену (первинний калуо або ембрю-генний калус з соматичними ембр1о!дами). Таким чином, було проведено чотири незалежних експерименти з штучного мутагенезу in vitro.

Тндуковании мутагенез з використанням у-опром!нення.

Зг)дно з отринашши нами результатами, у-опром1нення в дозах, що не перевищували 100 Гр. не припичувало розвиток культивованих In vitro калусних тканин та соматичних ембр1-о!д1в винограду. Доза 500 Гр була детальною - вс! опром1нен1 калуси та ембр1о1ди втрачали здатн1сть до росту та гинули на протяз1 к1лькох тижн1с п1сля опром!неыня.

П1сля у-опром1ненпя первинного калусу в доз1 10 Гр та його подальше! пересадки на середовище NB-, соматичн! ембр!-о1ди починали з'являтися в калусн1й тканин! не через 2-3 м1-сяц1, як в контрольному експеримент1, а вже через 16-25 дн1в. В той же час к- опром!нення в дедал! зростаючих дозах приводило до б1льш п1зньо1 1ндукц11 ембрЮШв пор!вняно з контрольним досл!дом. Таким.чином, опром!нення в доз! 30 Гр стимулювало соматичний ембр!оген-.з у винограду. Разом з тим життездатн1с.ть соматичних ембр!01д1в, що сформувалися в оп-ром1неному калус1. та ефективн!сть регенерац11 рослин були значно нижчими. н1ж в контрольному експеримент!. Ефектив-н1сть проростання ембрЮШв в р!зних вар1 антах досл!ду по у-опром1ненню складала в1д 5 до 20 %.

Тндукований мутагенез з використанням колхШину.

Культивування на поживних середовищах, як! м1стили 0,01% колхЩин, не справляло значного негативного впливу на

характер росту калусу та Пого злати1сть до регенерат 1. Це може пояснюватися невеликою тривал1стю перебування калусних тканин на середовпщ! з колх!цином (3-5 дн1в). Кр1м того, ни вибрали доснть низьку концентраЩю колхШину (0,01%), вихо-дячи з того, що вона не е сублетальною 1 не повинна була негативно впливати на життездатн1сть ембр!оШв та знизити в1дсоток рослин. що регенерують. В той же час така концентрат я повинна була бути достатньою для 1ндукц11 пол1пло1ди-зац11 калусних кл1тин.

В результат! проведених експеримент!в було отримано 242 рослини-регенеранти в контрольному дос-лШ (без мутагенних обробок) та 441 регенерапт в досл1дах по 1ндукованому мутагенезу. Дал! вони бул.ч вивчен! за рядом параметр1в.

3. Анал1з роолин-регенерант1в винограду

Иктогенетичний анзл!з рослин-регенерант!в.

Шдрахунок хромосом в давленнх препаратах кор1нц1в показав. що з 242 регенерант1в, отриманих.в контрольному дос-л1д1, ш1сть рослин були тетрапло!дними (2п = 4х = 76), а вс1 1нш1 - дншшдними (2п = 2х = 38). Таким чином, сомаклональ-на м1нлив1сть при регенерацП рослин винограду шляхом сома-тичного ембр1огенезу проявилася на цитогенетичному р1вн1. На Малюнку 1 показано хромосомн1 набори дипло!дного та тетрап-ло1дного регенерант1в винограду. Серед отриманих рослин-ре-генерант1в не було знайдено жодно! анеушкпдно! форми. Цей факт св1дчить на корпеть уявлень про Юнування селективних переваг для калусних кл1тин з1 збалансованим набором хромосом (БвоГт & СаЩаг!, 1991) при регенерацП рослин в умо-

- % «*

* I * 1 "-л. i* ' «•/

/ • .л - А , &&

Малюнок 1. ХрмиисомШ набори диплошюгс (2п = 2л -- 38) та те'1рапло$дного (2п = 4х = 76) регенерант1в винограду

вах in vitro. Кр1и того, серсд вивчених нами рослпн-регене-рант1в не було хнмфних (м1ксопло1дних) рослнн, що. ни нашу думку, е ненрлмим п1дтвердженням однокл1тинного походження соматичних ембр1оШв в умовах in vitro (William? &. Maheswaran, 1986).

Результата цигигенетичного анал1зу рослпи-регенерапПв винограду, очриманих з калусних тканин, щп зазнали мутаген-них обробок, наведено в ТаблшЦ 2. Виявилось, що у-опром!-нення культшюьаних in vitro калусних тканин винограду приводило до з01льшення в1дсотку тетраплошшх регенерант1в, при цьому в1дпои1дь культури залежала в1д дози гамма-опром1-нення.

Дан1, нансден1 в Таблиц! 3, св1дчать, що |-онром1нення в доз1 5 Гр дозволяло зб1льшиги в1дсоток тетрапло1дннх реге-неранПв до 41,66% (р1зниця з контролем е статистично досто-в1рною). 31 зб!льшенням дози опром1нення в1дсоток регенера-ц!1 тетраплошшх рослин зменшувався.

Тэблиця 2. Результата цнтогенетичного анал1зу рослнн-регенерант1в винограду

BapianT досл1ду Загальне Число % тетра- td

число тетра- пло!д1в

регене- плоШв

рант!в

1. Соматичний ембр1огенез без мутагенних обробок

(контроль) 242 6 2,48

2. Y - опром1нення

первинного калусу 71 5 7,04 1.43

3. Y - опром1нення ембр1о-генного калусу з сома-

тичними eMeploUaMU1 158 12 7,59* 2. 17

4. Культивування первинного калусу в присутност!

колх1цину 98 1 1.02 1.04

5. Культивування ембр1оген-ного калусу з соматичними ембр1о!дами в присутност!

колх!пину 114 4 3,51 0.52

1 Результати досл1ду в залежност1 в1д дози К-опром1нення

наведен 1 в Таблиц1 3. * р1зннця достов1рна при р05

Серед рослин, регенерованих з соматичних ембр1о!д1в, що зазнали к-опром1нення в доз1 40 Гр, значну частину (67%) складали рослини. як1 в умовах in vitro в1др1знялися в1д нормальннх дипло1д1в'др1бним л1стям, б1льшою довжиною м1ж-вузл!в, спов1льненини темпами росту та н1зькою життездатнЮ-тю в ц1лому. Попередн1й цитогенетичний анал1з деяких з них показав 1х анеупло!дну природу.

Таблиця 3. ЗалежнЮть к1лькост! тетраплошшх рослин-регенерант!в винограду в!д дози у-опром!нення.

Доза Загальне Число to

опром1непня. число рослин- тетраплоШв1

Гр регенерант1в

0 242 6 ( 2,48)

5 12 5 (41,66) 2.63*

10 49 3 ( 6, 12) 1.01

40 43 3 ( 6,98) 1. 13

100 54 1 ( 1.80) 0,32

1 В дужках - % тетраплогдннх регенерант!в

* р1зниця достов1рна при р05

Культивування калусних тканин винограду на поживних се-редовищах, що м1стили колхЩин, було менш ефективним для от-римання тетрашшдних рослин. Хоча в!дсоток 1х регенерацП П1сля культивування ембр!огенного калусу в присутност1 кол-Х1цину незначнс зростав, але статистично не в1др!знявся в!д контрольного експерименту. Можна припустити. що культивування соматичних ембр1о!д1в на р!дкому середовищ! та викорис-тання б1льш BHcoKoi концентрацП колх1цину дозволило б зб1льшити ефективн1сть досл1ду.

Серед рослин, отриманих з культивованих in vitro тканин винограду, що зазнали мутагенних обробок, як i в контрольному дослШ. також не знайдено м1ксоплохдних Форм.

- 17 -

Анал1з ген!в рРНК у рослин-регенерант1в.

Цю частину роботи було проведено з метою пошуку можли-вих зм1н на р1вн1 ДНК, як1 могли б в1дбутися при культиву-ванн! в умовах in vitro. Анал1з рДНК за допомогою блот-г1б-ридизацП за Саузерном показав, що регенеранти мали однакову конституц1ю повтор1в рпбооомальних ген1в, яка не в!др1зняла-ся в1д вих1дних рослин н1 за р1внем ампл1ф1кац11. н1 за структурою noETopiB. Таким чином, на в1дм1ну в1д ряду опуб-л1кованих даких про зм1ни структури ген1в рРНК у деяких культивованих in vitro вид!в рослин (Larkln. 1987), в наших досл1дах в процес! регенерат I рослин винограду шляхом сома-тичного ембр!огенезу таких зм1н не знайдено.

Анал1з морФолог!чних ознак рослин-регенерант!в.

Морфолог1Чно вс! днпло1дн! регенеранти були 1дентичн1 вих1дним рослинам за морфолог1ею листя та загальним габ1ту-сом. В той же час тетрапло!дн1 рослини-регенеранти мали сут-тев1 морфолог!чн! в!дм1нност1. Вони в1др1знялися морфолог1ею листово! пластинки, м1цн1шим габ!тусом куща, короткими м1ж-вузлями, б!льш 1нтенсивним антоц1ановим забарвленням м!жвуз-л!в та черешк1в. Варто в!дзначити'ix значно нижчу швидк!сть росту пер1вняно з дипло1дними регенерантами.'

Агроб1олог1чна характеристика рослин-регенерант!в.

Сп1льно з! сп1вроб1тниками ' 1нституту винограду 1 вина "Магарач" було проведено агроб1олог1чне вивчення 31 дипло!д-но1 рослини-регенеранту починаючи з другого року п1сля ix висадки в поле. Деяк1 отриман1 результата узагальнен! в Таблиц! 4.

Тривал!сть вегетац1йного пер1оду у рослин винограду сорту Подарунок Магарача становить 125-130 дн!в (ранньо-се-

редн1й строк визр1вання). За цим показником 61льш1сть реге-нерант1в практично не в1др1знялась в1д вих1дного сорту 1 мо-же бути в1днесена до рослин раннього та ранньо-середнього строку визр1вання.

При оц1нц1 потенц1йно! продуктивност1 вивчали розрахун-ков1 показники, так1 як в1дсоток пагон1в. що розвилися, в тому числ1 плодоносних naroHlB. та. в1дпов1дно, коеф1ц1енти плодоношения та плодоносност!. За цими показниками регене-ранти 1CTOTHO в1др1знялися один в1д одного.

Коливання максимально! цукристост1 у вивчених регене-рант1в в1дбувалися в межах. • характерних для сорту Подарунок Магарача (21-24%).

В польових умовах було зд1йснено оц1нку рослин-регене-рант1в на ст1йк1сть до м1лд'ю (Plasmopara vitícola) та cipo! гнил1 (Botrytis cinerea). Виявлено диференц1ац1ю вивчених рослин за ст1йк1стю до м1лд'ю в1д 1 до 4 бал1в, а до cipoi гнил1 - в1д 2 до 4 бал1в.

Так1м чином, коливання б1лыиост1 агроб1олог1чних показ-ник1в у рослин-регенерант!в в1дбувалися в межах, характерних для вих1дного сорту. В той же час на б1льш1сть з них досить 1CTOTHO впливають конкретн1 погодно-кл1матичн! умови поточного року спостережень. тому для отримання статистично дос-тов1рних результат1в необх1дно вести спостереження на протя-з1 3-5 poKlB.

Габлиця 4. Лгроб1олог1чна характеристика деяких рослин-регенерант1в винограду сорту Подарунок Магарача

1ндекс Характер Строк Ст1йк1сть. бал

рослини росту визр1вання

пагону Plasmopara Botrytis

viticola cinerea

Е 17 середн1й ранн1й 1 2

Е 28 слзбкий - раннШ 1 2

Е 32 сильний ранн1й 3 2

Е 53 сильний ранн1й 2 3

Е 67 сильний ранньо-середн1й 2 '' 3

Е 83 середн1й ранньо-середн1й 2 3

Е 90 сильний ранньо-середн1й 2 4

Е 92 середнШ ранньо-середн1й 2 4

Е 93 сильний ранШй 3 4

Е 96 сильний ранн1й 2 2

Е 99 сильний ранньо-середн1й 2 2

Е 100 середнШ ранн1й 2 3

Е 111 середШй ранньо-середн1й 3 2

Е 114 сильний ранн1й 4 4

Е 118 слабкий ранн1й 3 3

Е 131 сильний ранньо-середн1й • 2 3

Е 134 луже сильний ранньо-середн1й 2 3

Е 137 середн1й ранньо-середн1й 3 ■ 4

Е 140 силышй ранньо-середнШ 2 4

Е 146 сильний ранн1й 3 3

Е 149 середнШ ранн1й 1 3

Е 160 сильний ранньо-середн1й 3 3

Е 161 сильний ранн1й 3 3

Е 169 середн1й ранн1й 2 2

Е 171 середн1й ранн1й 2 3

Е 175 сильний ранн1й 2 3

Е 185 середн1й ранньо-середн1й 3 4

Е 194 сильний. ранньо-середн1й 3 3

Е 199 сильний ранн1й 2 4

- 20 -висновки

1. Визначен! оптимальн1 умови регенерат I рослин з ка-лусних тканин винограду сорту Подарунок Магарача шляхом со-матичного ембр1огенезу. Розроблен! способи гИдвищення ефек-тивност1 проростання соматичних ембр!о!д1в винограду.

2. Система регенерацП рослин винограду шляхом соматич-ного ембр1огенезу може бути використана як один з метод1в тиражування рослинного матер1алу in vitro, що п1дтверджуеть-ся результатами' вивчення морфолог1чних та агроб1олог1чних ознак дипло!дних регенерант1в в польових умовах. Разом з тим у винограду в npouecl соматичного ембр!огенезу з невеликою частотою (2,5%) виникають сомаклональн1 вар1анти. а саме тетрапло1дн1 форми.

3. Мутагенн1 обробки калусних тканин дозволяють зб1ль-шити Частоту регенерацП тетрапло!дних форм винограду. При цьому к-опром1нення в низьких дозах (5-40 Гр) е б1льш ефек-тивним, н1ж культивування в присутност1 колх1цину.

4. Доза "1(-опром1нення ембр1огенного калусу впливае на частоту формування тетраштдних форм винограду. К1льк1сть тетрапло!д1в е максимальною п1сля опром1нення в доз! 5 Гр i зменшуеться з подальшим п1двищенням дози опром1нення.

5. В ц1лому використання як само! сомаклонально! м1нли-BocTl, так i II поеднання з 1ндукованим in vitro мутагенезом, дозволяе розширити генетичну р1зноман!тн1сть вих1дного селекц1йного матер!алу винограду. Отриманий рослинний матерел (236 дипло!дних та 28 тетрапло!дних регенерант!в) передано для подалыного вивчення в 1нститут винограду 1 вина "Магарач".

СПИСОК РОБ1Т. ОПУБЛШОВЛНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАЦП:

1. PlvenH.M.. Marchenko А.О., Kuksova Belokurova) V.В. Somatic embryogenesis and plant regeneration of Vitis viniSera in vitro. In: Int. Symp. on viticulture, enology, economy and related basic subjects for young researchers, 8-12 Sept., 1986, Kecskemet, Hungary, p. 48.

2. Пивень H.M., Куксова (Белокурова) В.Б., Юзефович Л.В., Марченко А.О. Биотехнологические аспекты культуры ткани винограда. Международная конференция "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск. 2-6 августа 1988. Тезисы докладов. - Новосибирск, 1988, т.2, с. 275-276.

3. Пивень Н.М., Куксова (Белокурова) В.Б. Отбор полиплоидных Форм среди растений-регенерантов in vitro как возможный путь селекции на продуктивность. - "Методы отбора гю комплексам признаков в селекции растений" Тез. докл. Всесоюзного совещания, Симферополь, 26-28 сент. 1989. Ялта, 1989, С. 79.

4. Piven N.М., Kuksova (Belokurova) V.B.. Felaliev A,S. Somatic embryogenesis in vitro of woody plants: problems and perspectives. In: XI Int. Symp. "Embryology and seed reproduction" Llningrad, July 3-7. 1990. Abstracts, p. 126.

5. Пивень Н.М., Куксова (Белокурова) В.Б., Юзефович л.В., Рубежняк И.В. Физиолога-генетические особенности создания технологий клеточной селекции у винограда. 2 съезд Всес. общества физиологов растений. Минск, 24-29 сент. 1990. Тезисы докладов. Ч. 2. - М., 1992, с.162.

- 22 -

6. Куксова (Белокурова) В. Б. Регенерация тетраплоидных растений в культуре in vitro винограда. "Современные методи и подходы в селекции растений" Ин-т генетики АН Респ. Молдова. - Кишинев. 1991. с. 56-61.

7. Пивень Н.М.. Куксова (Белокурова) В.Б., Юзефович Л.В.. Махорина O.K. Использование некоторых клеточных технологий в селекционном процессе винограда. Биополимеры и клетка. 1991. т. 7. N 4. с. 66-72.

8. Plven N.M.. Kuksova (Belokurova) V.В.. Volynkln V. А.. Gleba Yu.Yu. Somaclonal variants of grapevine obtained by somatic embryogenesls. In: "In vitro culture and horticultural breeding" Int. symp, June 28 - July 2. 1992. Baltimore, USA.

ANNOTATION

Belokurova V.B. The use of somatic embryogenesls and mutagenesis for obtantion of genetically altered forms of grape.

Thesis for a degree of Candidate of biological sciences, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, Kiev, 1997.

The thesis deals with investigation of grape plants regenerated in vitro. Methods of somatic embryogenesls induction In callus tissue and stimulation of somatic embryo germination have been elaborated. The population of plants regenerated via somatic embryogenesls contained diploid and tetraploid (2,5%) plants. Irradiation of embryogenlc callus and somatic embryos with low doses of gamma-rays Increased the rate of tetraploid plant formation up to 41,7%. Somaclonal variation and/or tn vitro induced mutagenesis can be used to increase genetic variability of plant material for breeding.

АННОТАЦИЯ

Белокурова В.Б. Использование соматического эмбриогенеза и мутагенеза для получения генетически измененных форм винограда.

. Диссертация на соискание ученой степени кандаията биологических наук по специальности 03.00.25 - клеточная биология. Институт клеточной биологии и генетической инженерии. Киев. 1996.

Диссертационная работа посвящена изучению растений-ре-генерантов винограда, полученных в культуре in vitro. Разработаны методы регенерации растений винограда путем соматического эмбриогенеза и методы искусственного мутагенеза с применением физических и химических мутагенов в условиях in vitro. Сомаклональная изменчивость у растений-регенерантов проявлялась на цитогенетическом уровне как появление тетраплоидных форм с частотой примерно 2,5%. Y-облучение эмбрио-генного каллуса с соматическими эмбриоидами в низких дозах (5 Гр)' позволяло увеличить частоту регенерации тетраплоидных растений до 41,7%. В целом использование как самой сомакло-нальной изменчивости, так и ее сочетание с мутагенезом в условиях in vitro, позволяет расширить генетическое разнообразие исходного селекционного материала винограда.

Ключов1 слова: виноград, гамма-опром1нення. сомакло-нальна м1нлив1сть, соматичний ембр1огенез. тетрапло!дн1 рос-