Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование рибофлавинсвязывающего апобелка для биохимической оценки обеспеченности витамином В2 организма взрослых и детей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Использование рибофлавинсвязывающего апобелка для биохимической оценки обеспеченности витамином В2 организма взрослых и детей"
л
од
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ
На правах рукописи УДК 577.161.1:С543.867+ 543.866]+616.391
ВРЖЕСИНСКАЯ ОКСАНА АЛЕКСАНДРОВНА
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РИБОФЛАВИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО АЛОБЕЛКА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ ВИТАМИНОМ В2 ОРГАНИЗМА ВЗРОСЛЫХ И ДЕТЕЙ
(03.00.04 - биохимия)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 1995
Работа выполнена в лаборатории обмена витаминов и минеральных веществ Института питания РАМН
Научный руководитель
Официальные оппонеты:
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В.М.КОДЕНЦОВА
доктор медицинских наук, профессор Н.Г.Богданов
доктор биологических наук, профессор А.А.Познанекая
Ведущая организация:
Биологический факультет МГУ им. М.Ломоносова
Заищта диссертации состоится "1996 г. в на заседании Диссертационного совета (Д.001.02.01) при Институте питания РАМН по адресу: 109240 Москва, Устьинский пр., 2/14.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН
Автореферат разослан " 2 1995 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук
В.М.ЖМИНЧЕНКО
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Для оценки обеспеченности организма витамином В3 проводят определение экскреции рибофлавина с мочой, его концентрации в плазме крови и эритроцитах, а также используют функциональный тест - коэффициент активации ГР эритроцитов экзогенным ФАД (ФАД-эффект). Вопрос о том, как эти показатели коррелируют между собой и какому из них отдать предпочтение, продолжает дискутироваться (Horwitt M.K., 1984, 1986; Bates G.J., 1987; Chen H.Y., 1992). До сих пор не существует единого мнения о критериях, т.е. минимальных величинах каждого показателя, соответствующих нормальной обеспеченности организма рибофлавином (Bates С., 1993). По мнению одних авторов, об адекватной обеспеченности свидетельствуют величины ФАД-эффекта менее 1,2 (Bamji M.S., 1969; Sauberlich Н.Е. е.а., 1972; Belko A.Z. е.а., 1983; Хотимченко С.А. с соавт., 1987), других - менее 1,3 (Ross N.S., 1992), 1,4 (Glatzle D. е.а., 1970; Bates C.J. е.а., 1987, 1989) и даже 1,7 (Bayoumi H.A., 1976). Многостадийность, недостаточная специфичность методов определения рибофлавина в плазме крови (Burch H.B. е.а., 1948; Sanear D., 1978) послужили причиной того, что этот способ оценки рибофла-винового статуса организма не получил широкого распространения (Suvarnakich К. е.а., 1952; Lust J.E. е.а., 1954; Bessey O.A. е. а., 1956). Отчасти этим же объясняется и недостаточно широкое применение для этой цели величин экскреции рибофлавина с мочой. Появившиеся в последнее время методы определения рибофлавина в плазме крови и моче с помощью ВЭЖХ высокоспецифичны и чувствительны (Gatautls V.J. е.а., 1981; Botticher В., 1987; Straub R.H., 1993), но требуют дорогостоящего оборудования и особо чистых реактивов.
Таким образом, поиск и разработка новых специфичных, надежных и простых методов определения рибо^шавина, а также установление критериев нормальной обеспеченности организма этим витамином по-прежнему представляют собой чрезвычайно актуальную проблему.
Доступность сбора мочи, казалось бы, делает удобным проведение оценки рибофлавинового статуса по величине часовой экскреции витамина. Однако существенным препятствием для использования этого показателя является отсутствие общепринятых, критериев для детей различного возраста. Применение в этих целях критерия, принятого для взрослых, недопустимо в связи с существенными возрастными от-
Принятые сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хромато графия; ГР - глутатионредуктаза; РбСБ - рибофлавинсвязывающш апо-белок; ФАД - флавин-аденин-динуклеотид.
личиями в потребности, уровне потребления и степени утилизации витамина Bg у детей, и взрослых. Сведения о суточной экскреции витаминов у детей различного возраста носят фрагментарный характер (Ritcfiey S.W., 1966; Хмелевский Ю.В., Усатенко O.K., 1987) и имеются единичные данные о нормах часовой экскреции (Смирнов М.И., 1966). В связи с этим установление величин экскреции рибофлавина, характерных для нормальной обеспеченности организма детей различного возраста витамином В2, является весьма актуальной задачей.
Недавно появились сообщения о количественном определении рибофлавина в моче (Tillotson J.А. е.а., 1980, 1986) и молоке (botter S.E. е.а., 1982; Вржесинская O.A. с соавт., 1993) с помощью природного переносчика рибофлавина РбСБ из белка куриных яиц. В его основе леяит способность этого апобелка при связывании с высоким сродством в эквимолярном соотношении с рибофлавином полностью тужить его флуоресценцию (White H.B. е.a-, 1988). Кд комплекса РбСБ с рибофлавином (1,5 нМ) на 3-4 порядка ниже, чем для ФДЦ и ФМН (Becvar J. е.а., 1982; botter S.E. е.а., 1982; White Н.В., 1986). В связи с этим представлялось перспективным выделить и использовать препарат РбСБ для определения рибофлавина в моче и плазме крови, установить критерии нормальной обеспеченности витамином В2, что позволило бы выявлять недостаточность этого витамина у разных груш населения.
Исследования проводились в соответствии с планами НИР Института питания РАМН по темам 042: Разработка унифицированной системы критериев и методов оценки витаминной обеспеченности человека для диагностики гиповитаминозных состояний и нарушений витаминного обмена (I988-1992); и 083: Зависимость показателей витаминного статуса от обеспеченности организма рибофлавином и разработка возрастных показателей обеспеченности организма витаминами группы В в норме и при различных заболеваниях (I393-1995).
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в разработке на основе использования РбСБ биохимических методов оценки обеспеченности организма витамином В2, уточнении и установлении критериев нормальной обеспеченности им взрослых и детей.
В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие задачи:
I. Выделить РбСБ из белка куриного яйца и охарактеризовать его свойства. Разработать методы определения рибофлавина в плазме крови, органах и тканях животных с применением этого апобелка.
2. Сравнить разработанные методы определения рибофлавина с традиционными и ВЭЖХ.
3. Исследовать в эксперименте на крысах зависимость содержания рибофлавина в крови, экскреции с мочой от поступления с рационом, а также от степени насыщенности организма этим витамином. Используя корреляционный анализ оценить взаимозаменяемость показателей обеспеченности организма животных и человека витамином В2.
4. На основании разработанных методов установить критерии нормальной обеспеченности (концентрация рибофлавина в плазме крови и его часовая экскреция с мочой) взрослых и детей дошкольного и школьного возраста витамином В^.
Научная новизна работы. Разработан принципиально новый биоспецифичный экспресс-метод определения рибофлавина в плазме крови и тканях, сопоставимый по чувствительности с методом ВЭЖХ, но менее трудоемкий и не требующий дорогостоящего оборудования, в основе которого лежит связывание РбСБ с рибофлавином в эквимолярном соотношении с высоким сродством.
Разработан подход для установления критериев обеспеченности организма витамином В^, основанный на математической обработке кривых взаимозависимости экскреции рибофлавина с мочой от его содержания в плазме крови, эритроцитах и величины ФАД-эффекта.
Продемонстрировано, что концентрация рибофлавина в плазме крови, его часовая экскреция с мочой, определенные титрованием РССБ, отражают поступление витамина В2 с рационом и степень насыщенности им организма, хорошо коррелируют между собой, а также с его содержанием в эритроцитах и величиной ФАД-эффекта, что позволяет надежно выявлять недостаточность этого витамина с помощью любого из этих биохимических показателей.
Установлена концентрация рибофлавина в плазме крови, характерная для нормальной обеспеченности организма здорового человека витамином В2, а также величины часовой экскреции рибофлавина с мочой для здоровых детей 3-4, 5-7, 9-11 и 12-14 лет.
Научно-практическое значение работы. Разработан новый высокочувствительный и специфичный флуоресцентный экспресс-метод титрования рибофлавина в плазме крови и тканях с помощью РбСБ, нашедший применение в медицинских институтах России и Украины. Получено удостоверение на рационализаторское предложение "Метод количественного определения рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с помощью рибофлавинсвязыванцего апобелка" Л 83/90-3.
Установленные критерии нормальной часовой экскреции рибофлавина у детей разного возраста используются для оценки рибофлавино-вого статуса детей.
Предложенные методы были применены при апробации обогащения готовых блюд на молочной основе поливитаминным премиксом 730/4 для улучшения витаминного статуса детей. Результаты использованы при разработке совместно с кафедрой питания детей и подростков ЦОЛИУВ Информационного письма и инструкции "Профилактическая витаминизация детей в дошкольных, школьных, лечебно-профилактических учреждениях и домашних условиях" (Минздрав РФ, Москва, 1994 г.).
Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на
Всесоюзном совещании "Реализация научно-технической программы "Витаминизация пищи" (Углич, 1990); Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991); республиканской научной конференции "Питание и здоровье" (Таллинн, 1991); Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок" (Киев, 1991); I Конгрессе "Vitamins and Biofactors In Life Science" (Japan, 1991); V Национальном Конгрессе по питанию (Болгария, 1993); заседании секции "Витаминологии" МОИП (1992, 1993); конференции "Проблемы рационального питания детского и взрослого населения, проживающего на территориях, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС" (Брянск, 1993); научно-практической конференции ^'Радиационно-экологические и медицинские аспекты последствий аварии на Чернобыльской АЭС" (Киев, 1993); международном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты" (Москва, 1994); научно-практической межреспубликанской конференции "Проблемы детского питания в условиях формирования рыночных отношений" (Екатеринбург, 1994); 7 Европейской конференции "Over- and Undernutrition" (Австрия, 1995); международном симпозиуме "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов (Гродно, 1995); 2 Симпозиуме "Неинвазивные методы диагностики" (Москва, 1995).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа, общим объемом 143 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя (207 источников), содержит IG табл. и 20 рис.
-(ГО-ДЕРЖ-А-НИ-Е—Р-А-БОТЫ-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте использовали крыс-самцов породы Вистар с исходной массой тела 120-150 г, получавших полноценный полусинтетический рацион (Bamjl M.S., Sharada D., 1972), на основе казеина, отмытого от водорастворимых витаминов. Животные были разделены на 5 групп, получавших в течение 21 дня с рационом дробные количества
рибофлавина (от 3 до 33 мкг/сут).
В работе использовали венозную кровь и утреннюю порцию мочи, собранную за I ч натощак, здоровых взрослых добровольцев, практически здоровых взрослых и детей (клиника лечебного питания Института питания РАМН и подмосковные санатории им. А.И.Герцена и "Клязьма", детский сад г. Запорожье).
Препарат РбСБ выделяли по компилятивной методике Tillotson J.A., Bashor M.M. (1980,1986), White H.B. (1986) путем последовательного высаливания NaCl, осаждения фенолом, ионообменной хроматографии на колонке (1,2x7 см) DEAE-Sephadex А-50 (Pharmacia, Швеция), уравновешенной 50 мМ трис-HCl буфером pH 7,5. Рибофлавин отделяли от апопротеина диализом против 6 мМ HCl или хроматографией на колонке (1x10 см)- КМ-целлюлозы (Reanal, Венгрия), уравновешенной 25 мМ Na-ацетатным буфером, pH 3,2. Кд комплекса РбСБ с рибофлавином, измеренная флуоресцентным методом Nlshikirni M. е.а. (1973), составила 1,5 нм. Чистота препарата РбСБ, определенная по стехиометрии связывания с рибофлавином (Nishlklml M., е.а., 1973) и результатам электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу Iaemmli U.K. (1970), достигала 75-80%. Кажущаяся молекулярная масса составила около 36 кДа.
Рибофлавин в моче определяли по изменению флуоресценции в ходе его восстановления дитионитом до дигидрорибофлавина по компилятивной методике (Burch H.B. е.а., 194-8; Bessey O.A. е.а., 1949; Morell D.S., Slater Е.С., 1946), разрушения в щелочной среде при кипячении (Гвоздова Л.Г., Смирнова А.Н., 1984; Хотимченко С.А. с соавт., 1987), а также методом ВЭЖХ (Якушина Л.М. с соавт., 1993)*. Общий рибофлавин в эритроцитах определяли люмифлавиновым (Чернышов В.Г., 1985) и дитионитовым методами (Burch H.B. е.а., 1948; Sharada D., Bamjl M.S., 1972; ВатД M.S. е.а., 1973).
Активность ГР эритроцитов и ФАД-эффект измеряли по уменьшению экстинкции, обусловленному окислением NADPH в ходе восстановления окисленного глутатиона (Хотимченко O.A. с соавт., 1987)*.
Концентрацию рибофлавина и РбСБ определяли спектрофотометри-чески с использованием коэффициента молярной экстинкции рибофлавина при 455 нм - I.25-I04 М-1см-1, для РбСБ при 282 нм - 4,9-Ю4 М^см-1. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуоримет-ре "Perkln Elmer MPF-43A" (Япония) для рибофлавина при длине
* Определение рибофлавина в моче с помощью ВЭЖХ проведено с.н.с. Института питания РАМН Якушиной Л.М., величины ФАД-эффекта -с.н.с. Алексеевой И.А.
волны возбуждающего света - 465 нм, испускаемого - 525 нм, для лю-мифлавина ^B03Ö = 430 нм, А,^ = 532 нм. Концентрацию бежа определяли биуретовым методом.
Коэффициенты линейной корреляции, уравнения линейной регрессии и уравнения, описывающие ветви кривых зависимости между показателями обеспеченности организма рибофлавином, рассчитывали по методу наименьших квадратов (Лакин Г.Ф., 1990) с использованием программы "Quattro-Pro, v. 1.0" (Borland). Для статистической обработки данных использовали t-критерий Стъюдента, доверительный интервал, медиану, моду и среднеквадратичное отклонение (Урбах В.Ю., 1975). Коэффициенты корреляции рангов рассчитывали по Спирмену (Гублер Е.В., Генкин A.A., 1973).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Подбор и разработка методов определения рибофлавина в биологических объектах. По данным некоторых авторов, между показателями рибофлавино-вого статуса и поступлением витамина В2 с рационом не всегда обнаруживается корреляция (Horwitt M.K., 1984,1986; Bates C.J., 1987). Предположив, что это может быть следствием использования неспецифических способов определения рибофлавина, на первом этапе работы с целью выбора наиболее надежных, специфичных и чувствительных было проведено сравнение .. :„-ющихся и разработан принципиально новый метод определения рибофлавина в плазме крови.
1. Определение рибофлавина в иоче с помощью рибофлавинсвязывапцего апобелка и его сравнение с друпши методами В основу определения рибофлавина в моче была положена методика Tillotson J.A., Bashor М.М. (1980,1986) с рядом модификаций. К 0,1 мл мочи добавляли 3 мл 50 мМ трис-HCl буфера pH 7,5, измеряли интенсивность флуоресценции (А), добавляли 30 мкл стандартного раствора рибофлавина (I мкг/мл), измеряли флуоресценцию (С), затем добавляли по 30 мкл раствора РбСБ, перемешивали, изме-
_ряя_флуоресценцию_после_каждой_добавки_белка__Добавление-белка—
продолжали до тех пор, пока интенсивность флуоресценции переставала снижаться (В). Концентрацию рибофлавина (мкг/мл) рассчитывали по разнице интенсивности флуоресценции исходной мочи и мочи с добавленным РбСБ (А - В) с учетом разведения по формуле: (А - В') • 0,03
- , где 0,03 - количество рибофлавина, внесенное
0,1 • (С' - А) в пробу, мкг;
0,1 - объем мочи, взятой на анализ, мл. Метод позволяет достоверно определять до 30 нг рибофлавина в
t 7
Л мл мочи. Чувствительность может быть повышена в 2 и более раз за счет увеличения взятого на анализ количества мочи, т.е. сопоставима с ВЭЖХ (10 нг/мл) (Gatautis V.J., Naito H.K., 1981) и др. хро-матографическими методами (50 нг/мл) (Huang S. е.а., 1993). Коэффициент вариации метода составил 6,4±1,7Х (п=8), правильность -97,1±1,0% (п=8), процент выявления рибофлавина - 98,8±3,5% (п=6).
Для дальнейшего подтверждения корректности и специфичности предлагаемого метода было проведено сопоставление результатов определения рибофлавина в 54 образцах мочи с помощью РбСБ и арбитражного метода ВЭЖХ, а также дитионитовым и щелочным методами.
Метод с использованием РбСБ дает результаты, хорошо совпадающие с данными, полученными методом ВЭЖХ: коэффициент линейной корреляции R=0,96, линия регрессии проходит через нуль, подтверждая отсутствие систематической погрешности у этого метода по отношению к ВЭЖХ (рис.1а). Различий в величинах, определяемых этими методами по критерию Стьюдента (t=0,57I), нет (tTa6jI=2,68, 1=50, р$0,01).
Процент открытия добавленного рибофлавина в моче с использованием традиционных флуоресцентных методов составлял 91-129%. Т.е. интенсивность флуоресценции одинакового количества рибофлавина, добавленного к разным образцам мочи, различалась. Таким образом, использование внутреннего стандарта является обязательным.
Коэффициенты линейной корреляции для результатов, полученных дитионитовым и щелочным методом с внутренним и внешним стандартом, несколько ниже, чем для ВЭЖХ и составляют 0,86-0,95 (рисЛб-г).
Дитионитовый метод дает сильно завышенные результаты в области низких концентраций рибофлавина (линия регрессии пересекает ось ординат значительно выше нуля) (рис.16), что, по-видимому, обусловлено способностью дитионита гасить флуоресценцию других соединений мочи, флуоресцирующих при тех же длинах волн, что и рибофлавин (Morell D.S., Slater Е.С., 1946). Следствием этого является наличие статистических различий между результатами, полученными дитионитовым методом и титрованием РбСБ, а также методом ВЭЖХ.
Подобная картина наблюдается при измерении рибофлавина щелочным методом как с внешним, так и внутренним стандартом (рис.1в,г).
Таким образом, по специфичности и чувствительности метод титрования РбСБ сопоставим с ВЭЖХ, но является более простым, быстрым и дешевым. Все добавки вносятся в одну кювету, в которой и производится измерение флуоресценции; определение рибофлавина в 10 образцах занимает не более 30 мин, моча не требует предварительной
а
б
титрование
£
2 мкг/мл титрование РбСБ
г
2 мкг/мл3 титрование РбСБ
мкг/мл титрование РбСБ
Рис. I. Корреляция между методами определения рибофлавина в моче. На рис. а-г по оси абсцисс - концентрация рибофлавина в моче, определенная титрованием РбСБ. По оси ординат: а - концентрация рибофлавина,в моче, определенная методом ВЭЖК; б - дитионитовым методом;
-в~--щелочным-методом~с-использованием-внут—
реннего стандарта; г - щелочным методом с использованием внешнего стандарта. Каждая точка является средней по результатам 2-3 определений.
а
обработки. Дитионитовый и щелочной метод с использованием внешнего и внутреннего стандартов дают резко завышенные результаты в области низких концентраций рибофлавина.
2. Разработка метода количественного определения
рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с использованием рибофлавинсвязываадего апобелка.
Концентрацию рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с помощью РбСБ определяли в 0,6 мл нейтрализованного 0,3 мл 2,4 М KgHPO^ су-пернатанта, полученного после добавления 0,1 мл 100% ТХУ к I мл плазмы и отделения белков (3000 g 5 мин). Титрование рибофлавина и расчет его содержания проводили как и в случае мочи. Параллельно был разработан микрометод (с применением микрокювет) определения рибофлавина в 200 мкл плазмы крови за счет 5-кратного уменьшения количества реагентов, что дало возможность определять его в небольших количествах крови у детей младшего возраста и новорожденных.
Чувствительность метода (2 нг/мл) сопоставима с таковой метода ВЭЖХ (I нг/мл) (Lopez-Anaya А., Mayersohn М. 1987), коэффициент вариации составил 8,7+2,9% (п=13), правильность - I0I,9±2,I% (п=6), процент выявления рибофлавина - 107,3+8,0% (п=5). Результаты определения содержания рибофлавина методом титрования РбСБ совпадают с данными литературы, полученными методом ВЭЖХ (Ohkawa Н. е.а., 1982; Lambert W.E. е.а., 1985; Botticher В., Botticher D., 1987; Lopez-Anaya А. е.а., 1987; SpeekA.J., 1989).
Таким образом, разработанный метод является достаточно простым, чувствительным, высокоспецдфичным экспресс-методом (определение рибофлавина в 10 образцах занимает не более 45-50 мин).
II. Оценка рибофлавинового статуса организма (корреляционный анализ).
Разработка новых высокоспецифичных и достаточно простых флуоресцентных методов определения рибофлавина в моче и плазме крови с помощью титрования РбСБ дала возможность исследовать соответствие между критериями, используемыми в качестве биохимических показателей обеспеченности этим витамином организма человека, и реальным потреблением рибофлавина с рационом, степенью насыщенности им организма, а также оценить взаимозаменяемость этих параметров. 1. Зависимость показателей, использующихся в качестве критериев обеспеченности организма крыс рибофлавином, от его поступления с рационом.
На первом этапе работы в эксперименте на крысах, получавших с
рационом различные количества витамина В2, была исследована зависимость концентрации общего рибофлавина в печени (кривая I), в эритроцитах (кривая 2), рибофлавина в плазме крови (кривая 3) и активности ФАД-зависимой ГР эритроцитов (кривая 4) от содержания рибофлавина в рационе (рис.2а). Увеличение дозы рибофлавина в диете от 3 до 33 мкг на крысу в день приводило к монотонному возрастанию содержания этого витамина в плазме крови, эритроцитах и активности ГР. ФАД-эффект уменьшался с 1,96 ± 0,15 до 1,60 ± 0,11 (р < 0,10), однако не достигал величин 1,0-1,25, характерных для нормальной обеспеченности организма рибофлавином (рис. 26, кривая I). Во всем диапазоне исследованных доз рибофлавина его экскреция с мочой практически не увеличивалась (рис.26, кривая 2), что согласуется с данными Ledere J. (1987) о том, что экскреция рибофлавина возрастает только при насыщении им организма.
Коэффициенты ранговой корреляции выявили четкую связь исследованных параметров (табл.1) с содержанием рибофлавина в рационе. Таблица I. Коэффициенты корреляции между показателями обеспеченности витамином В2 и его содержанием в рационе крыс.
Параметр р п
Статистическая значимость
Содержание в печени 0,770 39 р ^ 0,01
Содержание в плазме 0,386 37 р ^ 0,0!
Содержание в эритроцитах 0,300 38 р ^ 0,05
Активность ГР эритроцитов 0,568 38 р < 0,01
ФАД-эффект_-0,368 38_р < 0,01
Таким образом, любой из использованных параметров может служить надежным показателем поступления рибофлавина с пищей.
2. Зависимость показателей, использующихся в качестве критериев обеспеченности, от насыщенности организма крыс рибофлавином. На следующем этапе работы было изучено соответствие между .коадентрацией-рибофвавина-в-плазме-крови-(кривая-3}-и-эритроцит: axil), а также активностью ГР эритроцитов (2) и степенью насыщенности организма крысы витамином В2, оцениваемой по содержанию общего рибофлавина в печени (рис.За). Все три параметра плавно изменялись с уменьшением концентрации рибофлавина в печени, ФАД-эффект при этом возрастал с 1,60 до 2,23 (рис.36).
Коэффициенты ранговой корреляции (табл.2) подтвердили наличие выраженной взаимосвязи между биохимическими показателями обеспе-
и о н
ю
2 с*
о
С4
Ы 60
а
со
'50
Й40
хэ
а
.см.
о и
>15
110
■о
а
01 5
со со
14 V 12 10 8,
■о
й Оч
¡1" я \о л н
-а
л о, н о
Ю §й
—<-.---- I '—• I о
10 20 30 40
рибофлавин, мкг/ сутки на крысу
ы
м го -=с к
1.01-
2
■о
а
Сц
0 10 20 30 40
рибофлавин, мкг/сутки на крысу
Рис. 2. а - зависимость содержания общего рибофлавина в печени (I), концентрации общего рибофлавина в эритроцитах (2), свободной его формы в плазме крови (3) и активности глутатионредуктазы эритроцитов (4) от дозы витамина в рационе крыс.
6 - зависимость величины ФАД-эффекта (I) и суточной экскреции рибофлавина с мочой (2) от содержания витамина В2 в рационе крыс.
А 2
а
3
(Ц о н
8 85
о о* ь
н р>
75
65
13 55
о.
1_I
20
15
10
10
20 30
рибофлавин, мкг/г сирой печени
н «
1.5
-1;о
10
20 , 30
рибофлавин, мкг/г сырой печени
Рис. 3. а _ зависимость между содержанием общего рибофлавина в печени и концентрацией общего рибофлавина в эритроцитах (I), активностью глутатионредуктазы эритроцитов (2) и концентрацией рибофлавина в плазме крови крыс (3). • б - зависимость между содержанием общего рибофлавина в печени и величиной ФЛД-эффекта.
ченности и насыщенность» организма крысы витамином В2-Таблица 2. Коэффициенты корреляции между показателями обеспеченности витамином В2 и его содержанием в печени крыс.
Пяпямртг) n п Статистическая
параметр р п значимость
Содержание в плазме 0,277 39 р ^ 0,05
Содержание в эритроцитах 0,265 38 р < 0,05
Активность ГР эритроцитов 0,579 37 р < 0,01
ФАД-эффект -0,371 37 р « 0,01
Таким образом, все используемые параметры отражают насыщенность организма витамином В2, то есть реальное его содержание в органах крысы (печень), а более выраженное снижение концентрации рибофлавина в плазме крови при недостаточном поступлении витамина В2 с пищей по сравнению с другими показателями, позволяет считать этот параметр одним из наиболее чувствительных для выявления дефицита этого витамина.
3. Взаимосвязь между показателями обеспеченности организма рибофлавином. Установление концентрации рибофлавина в плазме крови, характерной для нормальной обеспеченности организма человека витамином В2. Для выявления взаимосвязи между различными показателями обеспеченности организма людей витамином В2 был использован подход (Horwitt М.К., 1986; Bolsvert W.A. е.а., 1993), при котором близкие по величине значения (например, ФАД-эффекта) объединяли в группы и для каждой, образовавшейся группы рассчитывали среднее значение (М ± т) другого параметра (содержания рибофлавина в эритроцитах, экскреции рибофлавина с мочой и т.д.).
Выло установлено, что величина ФАД-эффекта и содержание общего рибофлавина в эритроцитах, а также ФАД-эффект и экскреция рибофлавина отрицательно коррелируют между собой (рис.4а,б; табл.4). Через совокупности точек методом наименьших квадратов можно провести две прямые. Первый линейный участок, очевидно, отражает ситуацию, когда организм и, соответственно, ГР эритроцитов насыщены витамином В2, внесение ФАД in vitro практически не вызывает активации фермента. Содержание общего рибофлавина в эритроцитах и его экскреция с мочой при изменении величины ФАД-эффекта в диапазоне от 1,20 до 1,00 резко возрастают. Второй участок, вероятно, соответствует недостаточной обеспеченности организма витамином В2,
когда ГР эритроцитов не насыщена кофе^ментом, и внесение ФАД in vitro вызывает ее существенную активацию. В диапазоне величин ФАД-эффекта от 1,2 до более высоких концентрация рибофлавина в эритроцитах и его выведение с мочой практически не изменяются. Точки пересечения этих прямых, по-видимому, соответствуют нижнему пределу адекватной обеспеченности организма витамином В2- Т.е. величина ФАД-эффекта ниже 1,20, содержание рибофлавина в эритроцитах более 119 нг/мл, экскреция более 13 мкг/ч характерны для нормально обеспеченного этим витамином организма взрослых.
Зо
W
S"
СО
m «5
Х> Si
l3
, SO
о ,
я 1 ft
l.OO 1.25
t.TS 1.00 2.25
ФАД-эффект
1.0 1.1 1.2 1-3 г.* 1.5 1.6 1.7
ФАД-эффект
Рис.4. Зависимость между величиной ФДД-эффекта и содержанием общего рибофлавина в эритроцитах (А) и его часовой экскрецией (Б) для взрослых здоровых людей. Пунктирная линия - данные, полученные щелочным методом с внутренним стандартом. На всех рисунках в скобках рядом с точкой указано количество обследованных.
Между экскрецией рибофлавина с мочой, измеренной щелочным методом с внутренним стандартом (рис.4а, пунктир), и величиной ФАД-эффекта корреляция отсутствует (р = -0,053). Аналогичный результат дает определение рибофлавина в моче с использованием дитионита. Таким образом, эти метода неприемлемы для выявления дефицита витамина В2, что может объяснять полученные с их помощью данные о зна-~чительной-экскреции~с-мочой-рибофлавина_у_людей__с высокими значениями ФАД-эффекта (Bates C.J., 198Т).
Координаты точки пересечения двух ветвей зависимости часовой экскреции рибофлавина, измеренной титрованием РбСБ, от содержания витамина В2 в эритроцитах равны 129 нг/мл и 13 мкг/ч (рис.5), что близко или совпадает с полученными выше критериями.
Следующим этапом работы было установление величины нижней границы нормы концентрации рибофлавина в плазме крови, собранной натощак после ночного голодания, определенной титрованием РбСБ, а
также оценка соответствия этого критерия величинам нижних границ норм других показателей обеспеченности организма рибофлавином.
Зависимость концентрации общего рибофлавина в эритроцитах от его концентрации в плазме крови представляет собой общую для взрослых и детей 9-13 лет монотонно возрастающую кривую, стремящуюся к плато (рис.6). Координаты точки пересечения двух прямых, из которых одна отражает показатели людей, обеспеченных витамином В2 (ветвь 2), а другая - с дефицитом этого витамина (ветвь I), равны 7,3 и 135. Исходя из этого, минимальная концентрация рибофлавина в плазме крови, соответствующая адекватной обеспеченности организма этим витамином, составляет 7,3 нг/мл, а его концентрация в эритроцитах - 135 нг/мл.
40
1ч
п л
о
КЗ N
а,
ч 170
* 140
150
г—1
В 140
я
СП
и 130
чэ (51 120
о,
1_1 110
100-
ьи си 1«л> л ей _ . 1би
Грибофлавин], нг/мл Рис.5. Зависимость между содержанием общего рибофлавина в эритроцитах и его часовой экскрецией для взрослых здоровых людей.
0.0 5.0 1О.0 15.0 -20.0 25.0
[рибофлавин], нг/мл
Рис.6. Зависимость между содержанием рибофлавина в плазме и эритроцитах для взрослых здоровых людей (•) и детей 9-13 лет (о).
Совокупность точек, отражающая зависимость между концентрацией рибофлавина в плазме крови и величиной ФАД-эффекта, также является общей для взрослых и детей 5-7 лет и может быть представлена двумя линейными участками (рис.7). Увеличение величины ФАД-эффекта от 1,07 до 1,25 сопровождается снижением содержания рибофлавина в плазме с 11-12 до 5 нг/мл. Дальнейшее изменение величины ФАД-эффекта вплоть до 1,55 ведет к более медленному снижению содержания рибофлавина в плазме. Точка пересечения этих прямых равна 1,25 и 5,3. Это означает, что нормальной обеспеченности организма рибофлавином соответствует величина ФАД-эффекта ниже 1,25, а содержание рибофлавина в плазме выше 5,3 нг/мл.
Поскольку кривая зависимости часовой экскреции рибофлавина с мочой от его содержания в плазме не имеет выраженной точки переги-
О -1---1-----1-
1.0 1.1 1.2 1.Э 1.4- 1.5 1.« 1.Г
2 V»
ФДЦ-эффект
Рис.7. Зависимость между величи- Рис.8. Взаимосвязь между кон-
ба (рис.8, кривая I), использовать математическую обработку этих данных для установления концентрации рибофлавина в плазме крови, характерной для нормальной обеспеченности организма этим витамином, оказалось невозможным. Оцененная графически минимальная концентрация рибофлавина в плазме, соответствующая его экскреции с мочой 13 мкг/ч, равна 5,2 нг/мл.
В качестве еще одного подхода для установления этой величины был проведен анализ данных по обследованию взрослых и детей, принимавших в течение от 2 недель до 3 месяцев наряду с основным рационом поливитаминные препараты или продукты, обогащенные витами-'нами ^включая -рибофлавин. -Эти-люди,-по_цашему_мнению,_с___достаточной степенью допущения могут быть приняты за хорошо обеспеченных витамином В2. Гистограмма частот встречаемости (в %) различных концентраций рибофлавина в плазме крови этих людей представляет собой ассиметричное распределение, описываемое законом Максвелла (рис.9). Средняя величина по всей группе составляет 11,4 нг/мл. Медиана (величина, относительно которой вся совокупность делится на 2 равные части) равна 9,5 нг/мл. Поскольку у людей, получавших в день 2 мг витамина В2 и более (что превышает физиологическую потребность), концентрация рибофлавина в плазме крови была более 10
ной ФАД-эффекта и содержанием рибофлавина в плазме крови для здоровых взрослых (о) и детей 5-7 лет (о).
взр<
5-7
в плазме крови и его часовой экскрецией с мочой для взрослых и детей 12-14 лет (I), детей 9-11 (2) и 5-7 лет (3).
центрацией рибофлавина
нг/мл, и маловероятно, что дополнительный прием этого витамина привел к повышению содержания рибофлавина в плазме крови до нормального уровня только у половины обследованных, то, по-видимому, эта величина и может быть принята в качестве критерия оптимальной обеспеченности организма. Если предположить, что в результате витаминизации содержание витамина В2 в крови повысилось до нормального уровня не менее, чем у 80% обследованных, то в качестве минимальной нормы в соответствии с представленной гистограммой следует принять величину 4-5 нг/мл. Любопытно, что концентрация, равная 4,9 нг/мл (мода), наиболее часто встречается в данной популяции.
ЦяЯЬапшн! вг/мх ичии
Рис.9. Гистограмма распределения частот встречаемости (в %) данной концентрации рибофлавина в плазме крови для 221 человека после В2-витаминизации тем или иным способом. Сплошной вертикальной линией отмечена средняя по группе обследованных величина. Пунктирными вертикальными линиями отмечены медиана (I) и мода (2).
Дополнительным доводом в пользу принятия в качестве критерия
нормальной обеспеченности организма витамином В2 его концентрацию в плазме крови более 5 нг/мл, являются полученные нами данные о нарушении у людей с его более низкими концентрациями витамин В2-зависимого обмена витамина В6 и ниацина, проявляющемся в существенном снижении экскреции с мочой 4-пиридоксшювой кислоты и 1-метилникотинамида при нормальном содержании в рационе витаминов В6 и РР (Коденцова В.М. с соавт., 1992,1993).
В табл. 3 суммированы полученные нами с помощью описанных зы-ше подходов^начения основных показателей нормальной обеспеченности организма взрослого человека рибофлавином. На основе их сопоставления мы склонны принять в качестве критерия адекватной обеспеченности организма витамином В2 концентрацию рибофлавина в плазме крови, равную 6 нг/мл (средняя величина составляет 5,7+0,7 нг/мл). Это значение совпадает с параметрами, определенными методом ВЭЖХ
(Botticher В., Botticher D., 1987), и находится в согласии с данными, полученными другими методами (4,9-8,4 нг/мл) (Suvarnakich К. е.а., 1952; Lust J.E. е.а., 1954; Bessey O.A. е.а., 1956; Gatautis V.J., Naito H.K., 1981; Lambert W.E. e.a., 1985; Straub H.H. e.a., 1993) при определении концентрации рибофлавина в плазме крови у хорошо обеспеченных этим витамином людей.
Таблица 3. Критерии нормальной обеспеченности организма взрослого человека витамином В0.
Зависимость, используемая для расчетов
ФАД-эффект
рибофлавин
плазма, нг/мл
эритроциты, нг/мл
экскреция, мкг/ч
ФАД-эффект - эритроциты 1,19
ФАД-эффект - плазма 1,25 5,3
ФАД-эффект - экскреция 1,22
Эритроциты - экскреция
Плазма - эритроциты - 7,3
Плазма - экскреция - 5,2
Частоты распределения показателя после
В2-витаминизации 1,25 4,9
Нарушение метаболических функций_::_^ 5,0
119
130 135
13 13
13
i 14
Критерий нормальной обеспеченности (взрослые)_
$1,25
6,0
130
13
Минимальная концентрация рибофлавина в эритроцитах, соответствующая нормальной обеспеченности организма витамином В2, составила в среднем 128 нг/мл, что хорошо согласуется с ветчиной, определенной люмифлавиновым методом в качестве нижней границы нормы (130 нг/мл) (Чернышов В.Г., 1985). Величина экскреции рибофлавина
"с мочой; соответствующая—нормальной—обеспеченности_____организма
взрослого человека этим витамином, составила 13 мкг/ч, величина ФАД-эффекта в диапазоне 1,00 - 1,25 (табл.3).
Расчет коэффициентов ранговой корреляции между каждой из пар показателей рибофяавинового статуса подтвердил их полную взаимозаменяемость (табл.4).
Таким образом, любой из использованных критериев можно
применять для выявления дефицита витамина В^, так как все параметры хорошо коррелируют между собой, отражая
витамина В2 с пищей и насыщенность организма этим витамином
поступление а
Таблица 4. Коэффициенты корреляции между показателями обеспеченности крыс, детей и взрослых людей витамином В2-
Параметр
Объект исследования
Статистическая значимость
I. от ФАД-эффекта
- содержание в крысы -0,635 37 Р 0,01
эритроцитах люда -0,500 35 Р 0,01
- содержание в крысы -0,125 34 Р <с 0,10
плазме люди -0,304 60 р 0,01
дети 5-7 лет -0,462 34 Р 0,01
- часовая экскреция люда -0,435 32 Р < 0,01
с мочой дети 5-7 лег -0,676 39 Р < 0,01
2. от содержания в эритроцитах
- активность ГР
- содержание в плазме
- часовая экскреция с мочой
3. от концентрации рибофлавина в плазме
- активность ГР
- часовая экскреция с мочой
крысы 0,735 36 Р 0,01
крысы 0,288 35 Р 0,05
ЛЮДИ 0,296 30 Р < 0,05
люди 0,299 37 Р 0,05
крысы люди
дети 5-7 лет дети 9-13 лет дети 12-14 лет
0,395 34
0,603 0,297 0,603 0,571
35 29 31 22
Р /А 0,01
Р < 0,01
Р < 0,05
Р < 0,01
Р < 0,01
величины нижних границ, характерных для нормальной обеспеченности организма рибофлавином, соответствуют друг другу. Необходимым условием для этого является применение таких высокоспецифичных методов определения рибофлавина, как титрование РбСБ, ВЭЖХ и люми-флавиновый. В то же время высокая производительность метода титрования РбСБ делает его наиболее приемлемым для массовых обследований обеспеченности населения витамином В2-
II. Установление величин часовой экскреции рибофлавина, характерных для нормальной обеспеченности организма рибофлавином детей разного возраста. С целью определить величины часовой экскреции рибофлавина с мочой, характерные для нормальной обеспеченности этим витамином детей различного возраста, были исследованы зависимости между экскрецией рибофлавина с мочой и содержанием витамина В2 в крови, величиной ФАД-эффекта, а также между уровнем потребления этого витамина, концентрацией его в плазме крови и часовой экскрецией.
Как видно из рис.6-7, критерии нормального содержания рибофлавина в плазме крови для детей и взрослых, совпадают.
Часовая экскреция рибофлавина с мочой для детей 5-7 лет, соответствующая координатам точки пересечения ветвей зависимости
Рис.10. Зависимость между величиной ФАД-эффекта и часовой экскрецией рибофлавина с мочой для детей 5-7 лет.
Исследование зависимостей экскреции рибофлавина от его содержания в плазме крови для детей 5-7, 9-II и 12-14 лет, в ряде случаев существенно отличающихся от таковой для взрослых (рис.8), послужило еще одним подходом к установлению возрастных критериев часовой экскреции. Исходя из того, что концентрация рибофлавина в плазме, соответствующая нормальной обеспеченности как взрослых, так и детей одинакова и превышает 6 нг/мл, можно считать, что часовая экскреция этого витамина с мочой для детей 5-7 и 9-II лет ниже, чем для взрослых, и равна 8,5 и 10 мкг. Величина экскреции для детей 5-7 лет близка к полученной при исследовании взаимосвязи между величиной ФДЦ-эффекта и экскрецией рибофлавина. Совокупность точек, характеризующих экскрецию и содержание рибофлавина в плазме крови, для детей 12-14 лет и взрослых ложится на одну кривую. Это Ъзнача¥т7~что^критерш^обеспеченности-витам1шом-В2-детей--этоЕо_вог^ зраста не отличаются от соответствующих показателей для взрослых.
Обоснованность принятия в качестве критерия нормальной обеспеченности рибофлавином детей 9-II лет выведения 10-11 мкг/ч находит подтверждение при исследовании показателей рибофлавинового статуса в зависимости от содержания витамина В2 в рационе. Если зависимость концентрации рибофлавина в плазме крови от дозы витамина представляет собой кривую насыщения, увеличиваясь при потреблении 8,5 мг рибофлавина (рекомендуемое суточное потребление -1,6
мг) лишь на 30%, то его экскреция при этом возрастает более, чем в 2 раза. При потреблении около 2 мг рибофлавина в день часовая экскреция составляла II,2±I,6 мкг.
Рекомендуемое суточное потребление витамина Bg для детей 3-4 лет составляет 50% от величины рекомендуемого потребления для взрослых, для детей 5-7 лет - 65%, 9-II лет - 86%, а для детей 1214 лет оно практически совпадает с таковым для взрослых (Нормы физиологических потребностей в пищевых веществах и энергии, 1991). Установленные нормы экскреции рибофлавина для этих возрастных групп составляют соответственно 46, 69, 85 и 100% от величин, принятых в качестве нормы для взрослых. Таким образом, обнаруживается определенная пропорциональность между критериями экскреции и рекомендуемым потреблением рибофлавина.
В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что часовая экскреция рибофлавина коррелирует с его содержанием в крови, в рационе и величиной ФАД-эффекта, что подтверждает обоснованность применения величин часовой экскреции для оценки рибофлавинового статуса организма детей (табл.4). Минимальные величины, соответствующие нормальной обеспеченности этим витамином, составляют для детей 3-4 лет - 6 мкг/ч, для детей 5-7 лет - 9 мкг/ч, для детей 9-II лет - 10—II мкг/ч, для детей 12-14 лет - 13 мкг/ч рибофлавина.
III. Оценка рибофлавинового статуса и эффективности витаминизации различных групп населения
Определение рибофлавина в крови и моче с помощью РбСБ было использовано для оценки обеспеченности витамином В2 1500 человек из разных возрастных групп людей, проживающих в различных регионах Российской Федерации и Украины, и оценки эффективности витаминизации обогащенными витаминами продуктами, готовыми блюдами и поливитаминными препаратами (около 350 человек). Относительное количество людей со сниженным уровнем рибофлавина в плазме крови составило 89-93% среди мужчин, 75-86% - среди женщин, с выраженным дефицитом - 33-66% и 28-51%, соответственно. Т.о., женщины обычно обеспечены витамином В2 несколько лучше мужчин. Выраженный дефицит рибофлавина обнаруживается приблизительно у 30% обследованных беременных женщин и детей. В 1992-93 гг. наметилась тенденция к ухудшению обеспеченности этим витамином населения промышленных городов.
ВЫВОДЫ
I. Выделен рибофлавинсвязывающий апобелок из белка куриного яйца. По данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутст-
вии додецилсульфата натрия и стехиометрии связывания с рибофлавином препарат белка содержал около 80% пептида с кажущейся молекулярной массой 36 кДа. Константа диссоциации с рибофлавином составила 1,5 нМ.
2. Разработан новый, биоспецифичный, сопоставимый по чувствительности с методом ВЭЖХ метод быстрого определения рибофлавина в плазме крови и тканях с помощью рибофлавинсвязывающего апобелка, основанный на его способности тушить при связывании флуоресценцию рибофлавина.
3. Показана неспецифичность традиционных дитионитового и щелочного методов определения рибофлавина и неадекватность получаемых с помощью этих методов результатов.
4. Концентрация рибофлавина в плазме крови, его часовая экскреция с мочой, определенные титрованием рибофлавинсвязывакщим Сел-ком, наряду с его содержанием в эритроцитах и величиной ФАД-эффекта отражают поступление витамина В2 с рационом и степень насыщенности им организма, хорошо коррелируют между собой, что позволяет использовать любой из этих биохимических показателей для оценки рибофлавинового статуса организма.
5. Концентрация рибофлавина в плазме крови, соответствующая оптимальной обеспеченности организма витамином В2 детей и взрослых, одинакова и превышает 10 нг/мл. Снижение содержания рибофлавина ниже 6 нг/мл указывает на выраженный дефицит витамина В2, сопровождающийся нарушением зависимых от него ферментативных процессов (его метаболических функций).
6. Установлены величины часовой экскреции рибофлавина с мочой, характерные для нормальной обеспеченности витамином В2 здоровых детей 3-4, 5-7 и 9-П лет, равные 6, 9 и 10-1I мкг, соответственно, а для детей старше 12 лет и взрослых - 13 мкг.
7. Разработанные метода определения рибофлавина в плазме кро-"ш"и"моче"и"устшовленные-биох11м1иеские-критврш1-оцвшси.рибрфлаш1::_ нового статуса организма взрослых и детей успешно применены для выявления недостаточности витамина В2, коррекции рационов и оценки эффективности витаминизации различных групп населения в ходе эпидемиологических обследований.
Практические рекомендации.
Определение рибофлавина в плазме крови и моче с помощью РбСБ предложено использовать в качестве теста на обеспеченность организма витамином В2-
Выражаю глубокую, искреннею благодарность руководителю лаборатории обмена витаминов и минеральных веществ д.б.н., профессору
В.Б.Спиричеву за постоянное внимание, консультации, обсуждение и
замечания, а также подцер&ку данной работы.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Коденцова В.М., Алексеева И.А., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Спиричев В.В.Определение содержания рибофлавина в моче методом титрования рибофлавинсвязывающим апобелком.// Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Реализация научно-технической программы "Витаминизация пищи", Углич, 1990.- С.198-199.
2. Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Сравнение флуоресцентных методов определения витамина В2 в крови.// Вопр. питания.- 1991.- Jê 4.- С.67-72.
3. Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Алексеева И.А., Спиричев В.Б. Сравнение биохимических критериев обеспеченности организма человека рибофлавином.// Вопр. мед. химии.- 1991.-* ь.-С.76-79.
4. Коденцова В.М., Алексеева И.А., Вржесинская O.A. Использование величины экскреции витаминов и продуктов их метаболизма в качестве критерия обеспеченности витаминами.// Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология". - М.,1991.-С.138-139.
5. Вржесинская O.A. Об использовании флуоресцентных методов определения в моче рибофлавина, 4-тшидоксиловой кислоты и 1-метилникотинамида.// Там же.- С.149-150.
6. Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Алексеева И.А., Рисник В.В. Новый метод определения рибофлавина в моче и плазме крови с помощью рибофлавинсвязывающего апопротеина.// Там же.- С.153-154.
7. Алексеева H.A., Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Хотимченко O.A. Влияние алиментарной недостаточности железа и рибофлавина на метаболизм витаминов В2, В6 и PP. // Тезисы докладов республиканской научной конференции "Питание и здоровье". Таллинн, 1991.- T.I, Ч.1.- С.13-15.
8. Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Рисник В.В., Сокольников A.A., Алексеева И.А., Спиричев В.Б. Новый метод определения рибофлавина в биологических жидкостях и продуктах с помощью рибофлавинсвязывающего апобелка.// Там же.- С.65-66.
9. Kodentsova V.M., Alekseeva I.A., Khotlmtchenko S., Vrzhesinskaya O.A., Splrlchev V.B. Influence of riboflavin and Iron provision on the vitamin В group metabolism.// Abstracts of the Iai7 Congress "Vitamins and Blofactors in Life Science".-Kobe, Japan, 1991.- P. 108.
Ю.Алейник С.И., Коденцова В.М., Митин И.Е., Сокольников A.A., Вржесинская О.А, Исаева В.А., Терехина Т.А., Строганова A.C., Эржен К., Цибульская O.A., Скирко А.З., Спиричев В.Б. Витаминная обеспеченность детей, посещающих детский сад, и влияние на нее приема поливитаминного препарата "Пиковит" (КБКА, Югославия).// Вопр. питания.- 1992.- 1 3.- С.14-19.
II.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Денисова С.Н., Сокольников A.A., Бекетова H.A., Нетребенко O.K., Спиричев В.Б. Нормы часовой экскреции с мочой витаминов группы В для детей 9-13 лет.//
Вопр. мед. химии.- 1993.- JJ4.- С.27-31.
12.Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Блажеевич Н.В., Исаева В.А., ""аритончик JI.A., Алейник С.И., Укадер М.С., Фризен И.Д., Султьгюва М.И. Обеспеченность витаминами различных групп населения республики Башкортостан. // Вопр. питания.- 1993.- J6 5.- С.36-40.
13.Алейник С.И., Цибульская O.A., Эржен К., Коденцова В.М., Блажеевич Н.В., Исаева В.А., Сокольников A.A., Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Спиричев В.Б. Влияние приема поливитаминного препарата "Дуовит" на витаминную обеспеченность населения, пострадавшего при аварии на Чернобыльской атомной электростанции. // Новые лекарственные препараты.- 1993. -№ 2.- C.II-I5.
14.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Блажеевич Н.В., Спиричев В.Б. Обогащение готовых блюд поливитаминны.ми премиксами - эффективное средство улучшения витаминного статуса детей, больных сахарным диабетом.// Тезисы докладов V Национального Конгресса по питанию,- Пловдив, Болгария, 1993.- С.99.
15.Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Нетребенко O.K., Денисова С.Н., Исаева В.А., Сокольников A.A. Витаминная обеспеченность детей, проживающих в регионах, пострадавших от аварии на ЧАЗС, и ее коррекция поливитаминными препаратами "Дуовит1', "Ундевит" и поливитаминным премиксом 730/4 фирмы "Рош".// Тезисы докладов конференции "Проблемы рационального питания детского и взрослого населения, проживающего на территориях, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС.- Брянск, 1993.- С.7,4,13.
16.Коденцова В.М., Сокольников A.A., Алексеева И.А., Вржесинская O.A., Харитончик Л.А., Бекетова H.A., Спиричев В.Б. Нормы часовой экскреции с мочой витаминов группы В для детей 5-7 лет. // Вопр. питания.- 1994.- № 1-2.- С. 18-21.
17.Коденцова В.М., Осинская Л.Ф., Вржесинская O.A., Медведенко Г.Ф. Витаминный статус новорожденных от здоровых и страдающих гипертонической болезнью матерей. // Укр. биохим. журнал.-1994.- Т.66, № I.- С.106-109.
18.Блажеевич Н.В., Спиричев В.В., Алейник С.И., Коденцова В.М., Сокольников A.A., Вржесинская O.A., Исаева В.А., Алексеева ¡i.A., Голубкина H.A., Бекетова H.A., Шагова М.В., Федоров П.Н., Щеглова E.H. Обеспеченность витаминами, железом и селеном различных груш населения республики Мари Эл (декабрь 1991 г.) // Вопр. питания.- 1994.- № 3.- С.12-15.
19.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Рисник В.В., Сокольников A.A., Спиричев В.Б. Выделение рибофлавинсвязывающего апобелка из белка куриных яиц и его использование для определения рибофлавина в биологических образцах.// Приклад, биохимия и микробиол. - 1994. - Т.30, № 4-5.- С.603-609.
20.Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Спиричев В.Б., Алексеева И.А., Сокольников A.A. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов. // Вопр. питания.-1994.- № 6.- С.9-12.
21.Коденцова В.М., Харитончик Л.А., Вржесинская O.A., Абрамова Е.И., Шумилова С.Л., Спиричев В.Б. Уточнение критериев обеспечености взрослых и детей 12-14 лет витаминами Bj- и Bg. //
Вопр. мед. химии. - 1994.- Т.40, № 6.-ЛС.45-48.
22.Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Харитончик Л.А., Алексеева
И.А., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Уточнение критериев обеспечености организма витамином Bg. // Вопр. мед. химии. -
1994.- Т.40, X 6.- С.41-44.
23.Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Спиричев В.Б. Биодоступность витамина В2 из продуктов растительного и
животного происхождения. // Физиол. журнал.- 1995.- № I.-С.39-48.
24.Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Блажеевич Н.В., Алейник С.И., Сокольников A.A., Вркесинская O.A., Исаева В.А., Алексеева И.А., Переверзева О.Г., Голубкина H.A., Бекетова H.A., Шагова М.В. Витаминный и микроэлементный статус персонала ЧАЭС и и детей дошкольного возраста г. Славутича. // Физиол. журнал.-
1995.- М 3-4.- С.38-49.
25.Vrzhesinskaya 0., Kodentsova V., Splrlchev V. Riboflavin plasma level as a criteria ior vitamin B-2 status-evaluation in healthy people and in some diseases. // Abstr. TTh Europe Nutr. Conf.-1995, Vienna.- P.117.
26.Коденцова B.M., Вржесинскаа O.A., Якушина Л.М., Харитончик Л.А., Спиричев В.Б. Диагностика гиповитаминозных состояний у детей ра зного возраста по часовой экскреции витаминов с мочой.//Тез.2-го симп. по неинвазивным методам диагностики.- Москва, 1995.- С.77.
27.Kodentsova V.M., Vrzheslnskaya O.A., Splrlchev V.B. Fluorometric riboflavin titration in plasma by rlboflavln-binding apoprotein as a method for vitamin B2 status assessment. // Ann Nutr.
Metab.- в печати.
Заказ ii 34 üü тир.100 экз. РАМН РФ
- Вржесинская, Оксана Александровна
- кандидата биологических наук
- Москва, 1995
- ВАК 03.00.04
- Разработка системы биохимических критериев оценки обеспеченности организма человека витаминами группы В
- Влияние рибофлавинового статуса организма на обмен и биохимические показатели обеспеченности витамином В-6
- Оценка спонтанного и индуцированного мутагенеза в клетках человека в зависимости от витаминной обеспеченности
- Возрастная и сезонная динамика витаминов A и E у песцов (Alopex lagopus L.) и лисиц (Vulpes vulpes L.)
- Физиологические особенности обеспеченности организма водо- и жирорастворимыми витаминами в диаде "мать-дитя"