Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы биохимических критериев оценки обеспеченности организма человека витаминами группы В
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Разработка системы биохимических критериев оценки обеспеченности организма человека витаминами группы В"
российская академия медицинских наук
институт питания
На правах рукописи УДК 577.164.1:(543.867+543.866+ 577.15.081:616.379-008.64+616.391
коденцова вера митрофановна
разработка системы биохимических критериев оценки обеспеченности организма человека витаминами группы в
(03.00.04 - биохимия)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 1996
Работа выполнена в лаборатории обмена витаминов и минеральных веществ Института питания РАМН
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор В.Б.Спиричев
Официальные оппонеты:
доктор биологических наук, профессор Г.А.Яровая
доктор медицинских наук, чл-корр. РАМН, профессор Л.Ф.Панченко
доктор биологических наук, профессор Ю.В.Букин
Ведущая организация:
Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН
Защита диссертации состоится " " ^¿-со-^А, Х996 г. в 44 ч на заседании Диссертационного совета (Д.001.02.01) при Институте питания РАМН по адресу: 109240 Москва, Устьинский пр., 2/14.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН
Автореферат разослан " 6 " КО-^Л^Л^ 1993 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук
В.М.ЖМИНЧЕНКО
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Контроль за обеспеченностью населения витаминами и уточнение рекомендуемых норм потребления этих незаменимых пищевых веществ является одной из важнейших задач современной медицинской биохимии, решение которой может быть достигнуто на основе биохимических исследований обмена витаминов, их метаболической роли и взаимодействия в процессах осуществления обмена веществ.
В настоящее время для оценки обеспеченности организма витаминами группы В используют такие биохимические показатели, как концентрация этих витаминов и их коферментных форм в плазме крови и эритроцитах, экскреция с мочой, активность витаминзависимых ферментов эритроцитов, а также степень их активации добавленными in vitro кофер-ментиыми формами соответствующих витаминов. Однако единого мнения о критериях нормальной обеспеченности организма рибофлавином (Bates С.,1993; Ross N.S.,1992) и витамином Bg (Drlskell J.А., 1994) до сих пор не существует. Продолжает дискутироваться вопрос о том, как показатели крови и мочи коррелируют между собой (Ajayi O.A. е.а., 1983; Belko к. е.а.,1983) и какому из них отдать предпочтение. Не всегда обнаруживается соответствие между показателями обеспеченности и уровнями потребления витаминов с рационом (Horwltt М.К.,1984,1986; Bates С.J.,1987; Chen Н.Y.,1992). Определенный вклад в такое несоответствие может вносить использование неспецифических, морально устаревших и недостаточно надежных методов изучения обмена витаминов.
Успехи биохимии витаминов, углубление знаний об их обмене и метаболической роли открывают возможности к решению этой проблемы на новом уровне. В частности, развитие ВЭЖХ позволило селективно определять витамеры в микроколичествах крови (Lambert ff., 1985; Ubblnk J.B., 1985,1987; Botticher В., Bottlcher D.,1987; Lopes-Anaya A., 1987; Speek A.J.,1989; Pingo11 А.,1995). Особого внимания заслуживает аффинный метод определения рибофлавина в моче (Tillotson J., Ваз-hor М., 1980,1986) с помощью РбСБ из белка куриного яйца, принцип которого основан на способности этого апобелка с высоким сродством (Кд=1,5 нМ) избирательно (Кд комплексов РбСБ с ФМН и ФАД на 3-4 порядка ниже, чем с рибофлавином) связывать рибофлавин в эквимолярном соотношении и полностью тушить его флуоресценцию (Becvar J., Palmer
Принятые сокращения: АсАТ - аспартатаминотрансфераза; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГР - глутатионредуктаза; ИЗСД - инсулинзависимый сахарный диабет; I-MHA - 1-метилникотинамид; НАД(Ф) - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат) окисленный; ПАЛ(Ф) -пиридоксаль(фосфат); ПФО - пиридоксамин (пиридоксин)-фосфатоксидаза; 4-ПК - 4-пиридоксиловая кислота; РбСБ - рибофлавинсвязывающий белок; ФАД - флавинадениндинуклеотид; ФМН - флавинмононуклеотид.
G.,1982). В связи с этим представлялось целесообразным на основе использования РбСБ разработать метод определения рибофлавина в плазме крови. Внедрение доступного и надежного способа оценки рибофлавино-вого статуса организма имело бн исключительно важное значение в виду особой функциональной роли витамина В2 в метаболизме других витаминов группы В (Bender D.А.,1986; Shlbata К.,1990; Hercberg S., 1994).
Так, в метаболизме витамина Bg функционируют два витамин В2~ зависимых фермента: ФМН-зависимая ПФО, катализирующая превращение пиридоксамин (пиридоксин)-5-фосфата в ПАЛФ, и ФАД-содержащая альде-гидоксидаза, окисляющая ПАЛ до 4-ПК, экскретируемой с мочой (Букин Ю.В., 1975; Clements J.E., Anderson В.В., 1980; Donald E.S., 1986; Ebadl M., 1986; Adelekan et al., 1987).
В эндогенном биосинтезе никотинамидных коферментов из триптофана также принимают участие витамин В2~ и В6-зависимые ферменты: ФАД-зависимая кинуренин-3-монооксигеназа и ПАЛФ-зависимая кинурениназа, лимитирующие скорость окислительного метаболизма триптофана (Charconnet-Harding F., 1953; Mason M., 1953; Ефремов В.В., 1956; Horwltt M.K., 1956; Tryflates G.P., 1986; Bender D.A., 1986). Большая часть освобожденного в ходе катаболизма НАД и НАДФ никотинамида метилируется и выводится с мочой в виде I-MHA.
Алиментарный дефицит рибофлавина у крыс приводит к снижению на 50-85% активности ПФО во всех органах и эритроцитах (Rasmussen K.M., е.а., 1979; Säuberlich Н.Е., 1980). Активность ПФО эритроцитов и степень ее активации In vitro ФМН (ФМН-эффект) предложено использовать в качестве показателя рибофлавинового статуса (Rasmussen K.M., е.а., 1979). Недостаточность витамина В2, приводящая к снижению активности ФМН- и ФАД-зависимых ферментов, может существенным образом сказываться на обмене витамина Bg и ниацина и сопровождаться изменением концентрации этих витаминов и их коферментных форм в крови и тканях, а также экскреции их метаболитов с мочой. Данные о влиянии недостаточности рибофлавина на показатели обеспеченности организма витамином Bg и ниацином немногочисленны и противоречивы. Отмечается как уменьшение, так и возрастание концентрации ПАЛФ в печени (Chat-terjee А.К., Ghosh В.В., 1966). У людей с дефицитом витамина Во обнаружены более низкая скорость превращения пиридоксина в ПАЛФ и сниженный уровень ПАЛФ в крови по сравнению с людьми, обеспеченными этим витамином (Anderson B.B. е.а., 1976; Lakshmi A.V., Bamjl M.S., 1974-1976). Появились сообщения об уменьшении экскреции 4-ПК при недостаточности рибофлавина (Kant А.,1988). Имеются сведения об уменьшении экскреции I-MHA при дефиците витаминов В2 (Horwltt М.К., е.а.,
1956) и Bg (Shlbata К.,1990). Все это послужило основанием для некоторых авторов ввести понятие так называемого вторичного эндогенного или сопутствующего дефицита функционально связанных витаминов группы В (Борец В.М. с соавт.,1988; Островский Ю.М.,1987; Sauberlich Н.Е., 1980). Однако на практике при использовании концентрации ПАЛФ и НАД+ НАДФ в крови и экскреции 4-ПК и I-MHA с мочой в качестве биохимических показателей, отражающих обеспеченность организма пиридоксином и ниащшом, обеспеченность витамином В2 во внимание не принимается.
В связи с этим, представляло интерес выяснить степень влияния различной обеспеченности организма витамином В2 на метаболизм витамина В6 и ниацина, а также на параметры, используемые в качестве показателей обеспеченности этими витаминами, что имело бы как теоретическое, так и практическое значение.
Несомненным преимуществом методов оценки витаминной обеспеченности организма, основанных на определении величины суточной или часовой экскреции данного витамина или его метаболита с мочой, является их неинвазивность. Однако использование этих методов ограничивается отсутствием соответствующих критериев нормальной обеспеченности для детей различного возраста. Применение величин, принятых для взрослых, недопустимо в связи с существенными возрастными отличиями в потребностях, уровне потребления и степени утилизации витаминов у детей и взрослых. Сведения о суточной экскреции витаминов у детей различных возрастов носят фрагментарный характер (Ritchey S.W., 1966; Pearson W.N., 1966,1967; Пятницкая И.Н., Богданов Н.Г., 1985; Хмелевский Ю.В., Усатенко O.K., 1987), о нормах часовой экскреции имеются единичные данные (De Lange D., 1964; Смирнов М.И., I9G6, Нийт М.И., 1974). В связи с этим установление возрастных величин экскреции, характеризующих нормальную обеспеченность организма витаминами, представлялось весьма актуальной задачей.
Многие заболевания сопровождаются нарушениями некоторых метаболических функций организма, в том числе обмена витаминов (Подорожный П.Г., Березин П.К., 1972; Мойсеенок А.Г., 1974; Борец В.М., 1988; Спиричев В.Б., Рымаренко Т.В., 1990; Rogers К., 1994). Установлено, что при ИЗСД у крыс повышается экскреция рибофлавина с мочой (Redely A.S. е.а., 1990). Это обстоятельство, наряду с употреблением низкокалорийного рациона, который не всегда обеспечивает достаточное поступление витаминов с пищей (Srldhar G., 1994), может быть причиной повышенной частоты полигиповитаминозных состояний среди больных ИЗСД по сравнению со здоровыми (Подорожный П.Г. с соавт., 1977; Зелинский Б.А. с соавт., 1981; Чобитько И.Г., 1984; Straub R., 1993). Посколь-
ку дефицит витаминов может осложнять течение болезни и затруднять лечение, возникает необходимость контроля за витаминной обеспеченностью. Вместе с тем критерии оценки витаминного статуса больных ИЗСД и другими заболеваниями отсутствуют, а для оценки обеспеченности необоснованно используют критерии, принятые для здоровых людей. Подтверждение возможности их использования, а в случае необходимости установление особых критериев для разных категорий больных является одной из важных проблем клинической биохимии.
Все вышеперечисленное свидетельствует о том, что назрела необходимость разработки новых, специфичных и селективных методов оценки витаминной обеспеченности, внедрения методического подхода для изучения обмена этих нутриентов, позволяющего учесть межвитаминные взаимодействия, и на их основе уточнения или установления биохимических критериев адекватной обеспеченности организма витаминами.
Исследования проводились в соответствии с планами НИР Института питания РАМН по темам 042: Разработка унифицированной системы критериев и методов оценки витаминной обеспеченности человека для диагностики гиповитаминозных состояний и нарушений витаминного обмена (1988-92); 083: Зависимость показателей витаминного статуса от обеспеченности рибофлавином и разработка возрастных показателей обеспеченности витаминами группы В в норме и при различных заболеваниях (1993-95).
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении роли рибофлавина в обмене витаминов группы В в норме и при некоторых заболеваниях; установлении критериев адекватной обеспеченности витаминами группы В организма здоровых и больных взрослых и детей разного возраста с учетом межвитаминных взаимодействий на основе разработки новых и усовершенствования существующих методов определения витаминов и их метаболитов в крови и моче.
В соответствии с этим предполагалось решить следующие задачи:
1. Разработать высокочувствительный, специфический и точный метод определения рибофлавина в плазме крови, органах и тканях животных с использованием РбСБ, выделенного из белка куриного яйца. Провести сопоставление этого метода с методом ВЭЖХ.
2. Исследовать в эксперименте на животных зависимость между содержанием рибофлавина в крови, его экскрецией с мочой и поступлением с рационом, а также степенью насыщенности организма этим витамином. На основании анализа кривых, отражающих взаимосвязь между этими показателями, установить концентрацию рибофлавина в плазме крови, соответствующую адекватной обеспеченности витамином В9 и оценить ее
соответствие другим критериям оценки рибофлавинового статуса организма человека.
3. Провести сравнительный анализ методов оценки обеспеченности организма витамином В6 и ниацином.
4. На клиническом материале и в экспериментах на крысах исследовать влияние алиментарной недостаточности рибофлавина на обмен витамина В6 и ниацина и оценить возможность применения показателей, использующихся для оценки обеспеченности этими витаминами, в условиях дефицита витамина В^.
5. Разработать критерии нормальной обеспеченности витаминами группы В взрослых и детей дошкольного и школьного возраста.
6. Охарактеризовать и выявить особенности обмена витаминов группы В и установить биохимические критерии обеспеченности ими ор-
' ганизма при инсулинзависимом и инсулиннезависимом сахарном диабете, ишомической болезни сердца, гипертонической болезни и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Концентрация рибофлавина в плазме крови, определенная с помощью разработанного метода титрования апоРбСБ, является надежным показателем, отражающим обеспеченность организма витамином В2.
2. Недостаточность витамина В2 влияет на показатели обеспеченности организма витамином В^ и ниацином, сопровождаясь уменьшением экскреции метаболитов этих витаминов до уровня, сопоставимого с таковым при алиментарном дефиците витамина В6 и ниацина.
3. Предложен оригинальный методический подход к исследованию обмена водорастворимых витаминов, позволяющий характеризовать особенности метаболизма при заболеваниях и устанавливать критерии достаточной обеспеченности организма витаминами.
4. Критерии адекватной обеспеченности витаминами группы В при некоторых заболеваниях могут отличаться от критериев для здоровых людей.
Научная новизна работы. Разработан новый метод быстрого определения рибофлавина в плазме крови и тканях, в основе которого лежит образование биоспецифичного аффинного комплекса с апоРбСБ, сопоставимый по специфичности и чувствительности с методом ВЭЗКХ, но более простой и производительный.
Проведено систематическое изучение влияния степени обеспеченности организма животных и людей рибофлавином на показатели пиридокси-ношго и ниацинового статуса. Установлено, что недостаточность витамина В£, нарушая обмен витамина В6 и ниацина, существенно изменяет показатели, используемые для оценки обеспеченности организма этими
витаминами, что затрудняет их применение в этих условиях для указанной цели.
Впервые предложен методический подход к исследованию обмена водорастворимых витаминов в норме и при различных патологических состояниях, основанный на изучении, с учетом межвитаминных взаимодействий, зависимости экскреции витамина или его метаболита с мочой от его содержания в крови. Это позволяет не только выявлять особенности обмена, но и устанавливать критерии обеспеченности организма исследуемым витамином. Дано биохимическое обоснование критериям нормальной обеспеченности организма витаминами группы В.
Установлены величины часовой экскреции рибофлавина, 4-ПК и 1-МНА с мочой, характерные для нормальной обеспеченности соответствующими витаминами детей 5-7, 9-11 и 12-14 лет.
Впервые выявлены особенности обмена рибофлавина при ИЗСД, проявляющиеся в его повышенном выведении с мочой и снижении его уровня в эритроцитах и тканях. Прослежена взаимосвязь между степенью изменения обмена рибофлавина и длительностью заболевания, а также уровнем гликемии. Установлены критерии обеспеченности витаминами группы В организма детей и взрослых, больных ИЗСД.
На основании сравнения кривых зависимости экскреция - содержание витамина в плазме и/или эритроцитах для больных и здоровых людей охарактеризован обмен витаминов В2, В6 и РР при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, ИБС, гипертонической болезни.
Научно-практическое значение работы. Высокочувствительный биоспецифичный флуоресцентный метод титрования рибофлавина в плазме крови с помощью РбСБ применяется в научных медицинских институтах России и Украины (рац. предложение "Метод количественного определения рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с помощью РбСБ" .№64/3-90).
В ходе сравнительного анализа проведены оптимизация и усовершенствование методов определения витаминов группы В и их метаболитов в крови и моче, которые могут применяться для диагностики гиповита-минозных состояний (рац. предложение "Использование при определении концентрации никотинамидных коферментов в биологических образцах в качестве внутреннего стандарта препарата НАД" № 65/4-90).
Разработанный методический подход (изучение кривых зависимости кровь-моча) был успешно применен для установления критериев обеспеченности витаминами С (Коденцова В.М. с соавт.,Вопр.мед.химии. 1995, Т.41,№1,С.53-57) и (Коденцова В.М. с соавт.,Вопр.мед.химии. 1994, Т.40,.№6,С.45-48) организма здоровых людей и детей, больных целиакией (Коденцова В.М. с соавт.,Вопр.мед.химии. 1995,Т.41,№4,С.41-45), под-
ход может быть рекомендован для установления критериев и выявления особенностей обмена водорастворимых витаминов при других заболеваниях.
Установлены величины часовой экскреции витаминов группы В, характерные для нормальной обеспеченности детей разного возраста соответствующими витаминами, что позволяет рекомендовать эти удобные и неинвазивные методы для оценки витаминного статуса детей.
Выявлены особенности обмена рибофлавина при ИЗСД. Установленные критерии обеспеченности организма при этом и других заболеваниях позволят проводить правильную оценку обеспеченности витаминами и корректировку рационов.
Полученная информация может быть использована в научно-исследовательской работе, медицинской и педагогической практике.
Разработанные методы и критерии использованы в массовых обследованиях витаминной обеспеченности различных групп взрослого и детского населения РФ, осуществлении и оценке эффективности мероприятий, направленных на коррекцию имеющихся витаминных дефицитов (поли-гшювитаминозов), оптимизацию витаминного статуса.
Совместно с кафедрой питания детей и подростков РМА ПО разработан и апробирован способ использования поливитаминных премиксов для обогащения готовых блюд с целью улучшения витаминного статуса детей, страдающих ИЗСД. Полученные результаты послужили основанием для разработки Информационного письма и инструкции "Профилактическая витаминизация детей в дошкольных, школьных, лечебно-профилактических учреждениях и домашних условиях" (Минздрав РФ, Москва,1994). .
Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на 8 и
9 Международных симпозиумах "Vitamin В6 and carbonyl catalysis"
(Япония, 1990; Кипр, 1994); Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991); республиканской научной конференции "Питание и здоровье" (Таллинн, 1991); I Конгрессе "Vitamins ana Bio-factors in Life Science" (Japan, 1991); V Национальном Конгрессе по питанию (Болгария, 1993); заседании секции "Витаминологии" МОИП (1992, 1993); конференции "Проблемы рационального питания детского и взрослого населения, проживающего на территориях, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС'' (Брянск, 1993); научно-практической конференции "Радиационно-экологические и медицинские аспекты последствии аварии на Чернобыльской АЭС" (Киев, 1993); симпозиуме "Витамины и здоровье" (Москва, 1994); международном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты" (Москва, 1994); научно-практической межреспубликанской конференции "Проблемы детского питания в условиях формирования рыночных отношений" (Екатеринбург, 1994); секции питания Московского городского общества детских врачей (Москва, 1995); выставке-семинаре диа-бетологического общества "Диабет: новые подходы к лечению" (С.-Петербург, 1995); 7 Европейской конференции "Over- and Undernutrition" (Австрия, 1995); международном симпозиуме "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов (Гродно, 1995); 2 Симпозиуме "Не-инвазивные методы диагностики" (Москва, 1995); 2 Конгрессе педиатров
России "Болезни органов пищеварения у детей. Питание здоровых и больных детей" (Н.Новгород, 1996); на заседании ученого совета Института питания РАМН (1993, 1996); 2 международном симпозиуме "Питание и здоровье: биологически активные добавки к пище" (Москва,1996); международной конференции "Лечебно-профилактическое и детское питание" (С.-Петербург, 1996); международном симпозиуме "Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы" (С.-Петербург,1996)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 работы.
Объем и структура работы. Диссертационная работа, общим объемом Д9Гетр., состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя (383 источника), содержит 35 таблиц и 52 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В опытах использовали половозрелых (80 штук) и отъемышей самцов (70 штук) крыс популяции Вистар.
При изучении влияния степени обеспеченности витамином В2 на параметры обеспеченности витаминами В2, В6 и РР использовали крыс (масса тела 120-150 г), получавших полноценный полусинтетический рацион (Bamjl M.S., Sharacla D., 1972), на основе казеина, отмытого от водорастворимых витаминов. Животные были разделены на 5 групп, получавших с рационом в течение 21 дня дробные количества рибофлавина (от 3 до 33 мкг/сут).
В опытах по моделированию алиментарной недостаточности витаминов В2 и В6 использовали крысят, получавших в течение 4 нед. полноценные полусинтетические рационы за исключением соответствующего витамина.
Исследование обмена витаминов группы В при диабете проводили на крысах (около 160 г), получавших рацион вивария Института. Сахарный диабет вызывали двукратным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (Serva, Германия) в 0,1 М цитратном буфере рН 4,5 в дозе 60 мг и 30 мг на I кг массы тела с интервалом в 3 дня. Животные предоставлены Р.Е.Садиковой. На 7-й день опыта в моче определяли глюкозу, I-MHA, ксантуреновую кислоту, 4-ПК, рибофлавин; на 35-й день крыс забивали декапитацией и определяли НАД+НАДФ, витамин Bg и рибофлавин в печени; рибофлавин, инсулин радиоиммунологическим, глюкозу глюкозоокси-дазным методом - в сыворотке крови.
В работе использовали венозную кровь после ночного голодания и утреннюю порцию мочи, собранную за I ч натощак, практически здоровых взрослых и детей обоего пола (доноры крови, добровольцы, отдыхающие в подмосковных санаториях им. А.И.Герцена и "Клязьма", посещающие детсад г. Запорожье), 17 больных язвенной болезнью двенадцатиперст-
ной кишки, 36 больных гипертонической болезнью, 40 больных ИБС, 9 больных ИЗСД и 41 больной сахарным диабетом II типа 18-50 лет (клиника лечебного питания Института питания РАМН), 74 ребенка 10-14 лет, страдающих ИЗСД (Эндокринологическое отделение детской городской клинической больницы № I г. Москвы). Подбор и диагностика больных проведены Г.Р.Покровской (Клиника лечебного питания), Л.С.Трофи-менко (кафедра питания детей и подростков РМА ПО), С.Н.Денисовой (Институт питания РАМН).
Для улучшения витаминной обеспеченности различных групп населения были использованы поливитаминные препараты "Ундевит", "Гекса-внт" (РФ), "Дуовит", "Пиковит" (KRKA, Словения), готовые 2-е и 3-е блюда, хлебобулочные изделия, обогащенные поливитаминными премиксами 730/4 и 986 (Рош, Австрия), безалкогольные напитки "Золотой шар" с витаминами и р-каротином ("Валетек-продимпекс", РФ).
Препарат РбСБ из белка куриного яйца (можно использовать коммерческий препарат) выделяли по компилятивной методике Tlllotson J.A., Bashor M.M. (1980, 1986), White H.В. (1986) путем последовательного высаливания NaCL, осаждения фенолом, ионообменной хроматографии на колонке (1,2x7 см) DEAE-Sephadex А-50 (Pharmacia, Швеция), уравновешенной 50 мМ трис-HCl буфером рН 7,5. Рибофлавин отделяли от апопротеина диализом против 6 мМ НС1 или хроматографией на колонке (1x10 см) КМ-целлюлозы (Reanal, Венгрия), уравновешенной 25 мМ Na-ацетатным буфером, рН 3,2. Кд комплекса РбСБ с рибофлавином, измеренная флуоресцентным методом Nishlkimi M. е.а. (1973), составила 1,5 нм. Чистота препарата РбСБ, определенная по стехиометрии связывания с рибофлавином (Nishlkimi M., е.а., 1973) и результатам электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmli U.K. (1970), достигала 75-80%. Кажущаяся молекулярная масса составила около 36 кДа.
Концентрацию рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с помощью РбСБ определяли в 0,6 мл нейтрализованного 0,3 мл 2,4 M KgHP04 су-пернатанта, полученного после добавления 0,1 мл 100% ТХУ к I мл плазмы и отделения белков (3000 g 5 мин), титрованием РбСБ до снижения интенсивности флуоресценции до постоянного уровня. Параллельно для обследования детей младшего возраста и новорожденных был разработан микрометод определения рибофлавина в 200 мкл плазмы.
Рибофлавин в моче определяли титрованием РбСБ (Tlllotson J., Bashor M., 1980,1986) и методом ВЭЖХ (Якушина Л.М. с соавт., 1993)*, в эритроцитах - люмифлавиновым методом (Чернышов В.Г., 1985). Активность ГР эритроцитов и ФАД-эффект измеряли по уменьшению экстинкции
за счет окисления НАДФН (Хотимченко С.А. с соавт., 1987)*.
ПАЛ и ПАЛ® в плазие крови и гидролизатах печени определяли методом обращеннофазовой ВЭЖХ (Ubbink J.В., 1985,1987) с предварительным превращением витамеров В6 в семикарбазоны*, 4-ПК в ыоче - с помощью ВЭЖХ* (Gregory J.Р., 1979). Активность АсАТ и ПАЛФ-эффект ге-молизатов эритроцитов (1:1) после их не менее 3-кратного замораживания-оттаивания определяли в системе, сопряженной с малатдегидрогена-зой, при 340 нм в среде, содержащей 100 мМ трис-HCI рН 7,4, 0,18 мМ НАДН, 10 мМ а-кетоглутарат, 200 мМ 1-аспартат, ± 3,4 мМ ПАЛФ, при конечном разведении гемолизата в 250 раз.
Концентрацию НАД+НАДФ в эритроцитах определяли методом Levltas N. (1947) с использованием в отличие от оригинальной методики внутреннего стандарта НАД, I-MHA в моче - флуоресцентным методом (Huff J. и Perlzwelg W., 1947) с использованием внутреннего стандарта I-MHA. Ксантуреновую кислоту в моче определяли колориметрическим методом (Wachestein М., 1952).
Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре "Perkln Elmer" MPF-43A (Япония). Концентрацию белка определяли биу-ретовым методом.
Коэффициенты линейной корреляции, уравнения линейной регрессии и уравнения, описывающие ветви кривых зависимости между показателями обеспеченности организма витаминами, рассчитывали методом наименьших квадратов (ЛакинГ.Ф., 1990) с использованием программы "QuattroPro, v.1.0" (Borland). Для статистической обработки данных использовали t-критерий Стъюдента, доверительный интервал, медиану (Me), моду (Мо), среднюю величину (М) и среднеквадратичное отклонение (о) (Урбах В.Ю., 1975). Коэффициенты корреляции рангов (р) рассчитывали по Спирмену (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Определение рибофлавина в биологических жидкостях, основанное на образовании биоспецифического аффинного комплекса с рибофлавинсвязывапцим апобелкок.
Предположив, что отсутствие корреляции между показателями рибо-флавинового статуса и поступлением витамина В2 с пищей (Horwitt М.К., 1984,1986; Bates C.J., 1987) может быть следствием использования в этих работах неспецифических способов определения рибофлавина, на
* Определение с помощью ВЭЖХ рибофлавина в моче проведено с.н.с. Института питания РАМН Л.М.Якушиной, ПАЛФ в плазме крови и 4-ПК - н.с. Н.А.Бекетовой и м.н.с. Л.А.Харитончик, определение величины ФАД-эффекта - с.н.с. И.А.Алексеевой.
первом этапе был разработан метод его определения в плазме крови и моче, с помощью РбСБ, отличающийся от обычно принятых биоспецифичностью (Becvar J., Palmer G., 1982), проведено сравнение биохимических методов оценки рибофлавинового статуса и установлены критерии обеспеченности организма этим витамином.
I.I. Сравнение методов определения рибофлавина в моче с помощью рибофлавинсвязывающего апобелка и ВЭ1Х.
Адаптированный метод определения рибофлавина в моче титрованием РбСБ (Tlllotson J.A., Bashor М.М., 1980,1986) позволяет достоверно определять до 30 нг/мл рибофлавина в моче. Чувствительность может быть повышена в 2-3 раза за счет увеличения взятого на анализ количества мочи, т.е. сопоставима с наиболее корректными методами ВЭЖХ (10 нг/мл) (Gatautls V.J., 1981) и др. хроматографическими методами (50 нг/мл) (Huang S., 1993). Коэффициент вариации составил 6,4±1,7% (п=8), процент выявления рибофлавина - 98,8±3,5% (п=6). Проведено сравнение результатов определения рибофлавина с помощью РбСБ и ВЭЖХ в 51 образце мочи. Метод с использованием РбСБ дает результаты, хорошо совпадающие с полученными методом ВЭЖХ: коэффициент линейной корреляции R=0,96, линия регрессии (у=0,99х-0,01) проходит через нуль. Различий в определяемых этими методами величинах (по критерию Стьюдента 0,571), нет (tTa6j]=2,68, í=50, pscQ.OI).
Метод титрова1Шя рибофлавина с помощью РбСБ, являясь биоспецифичным, по чувствительности сопоставим с методом ВЭЖХ, но является более простым, производительным (определение рибофлавина в 10 образцах занимает не более 30 мин) и дешевым.
1.2. Разработка метода количественного определения рибофлавина в плазме крови с использованием рибофлавинсвязывающего апобелка.
Чувствительность разработанного метода определения рибофлавина в плазме крови (2 нг/мл) сравнима с таковой ВЭЖХ (I нг/мл) (Lopez-Anaya A., Mayersohn М. 1987), коэффициент вариации составил 8,7+2,9% (п=13), процент выявления рибофлавина - 107,3+8,0% (п=5). Результаты определения содержания рибофлавина в плазме титрованием РбСБ сопоставимы с полученными методом ВЭЖХ (Ohkawa Н. е.а.,1982; Lambert W.,1985; Botticher В., Botticher D., 1987; Lopez-Anaya А. е.а., 1987; Speek. A.J., 1989).
Таким образом, предложенный метод является достаточно простым, чувствительным, высокоспецифичным, определение рибофлавина в 10 образцах занимает не более 45-50 мин.
2. Биохимические показатели рибофлавинового статуса организма и их корреляция.
Для внедрения разработанных биоспецифичных и достаточно простых
флуоресцентных методов определения рибофлавина в плазме крови и моче с помощью РбСБ было необходимо подтвердить, что эти показатели отражают реальное потребление рибофлавина и степень насыщенности им организма; установить величины экскреции рибофлавина с мочой и его содержания в плазме крови, характеризующие адекватную обеспеченность организма витамином В2; проверить соответствие установленных критериев другим критериям, используемым для биохимической оценки обеспеченности организма человека этим витамином.
2.1. Зависимость показателей, используемых для оценки рибофлавино-вого статуса организма, от поступления витамина В2 с рационом.
На первом этапе в эксперименте на крысах, получавших с рационом дозированные количества витамина В2, была исследована зависимость концентрации общего рибофлавина в печени (рис.1а, кривая I) и в эритроцитах (2), рибофлавина в плазме крови (3) и активности ФАД-зависимой ГР эритроцитов (4) от содержания рибофлавина в рационе. Увеличение дозы рибофлавина в диете с 3 до 33 мкг на крысу в день приводило к монотонному возрастанию содержания этого витамина в плазме крови и эритроцитах, увеличению активности ГР. ФАД-эффект уменьшался с 1,96+0,15 до I,60±0,П (р < 0,10), однако не достигал величин 1,0-1,25, характерных для нормальной обеспеченности организма рибофлавином (рис. 16, кривая I). Во всем диапазоне исследованных доз рибофлавина его экскреция с мочой практически не увеличивалась (рис.16, кривая 2), поскольку она возрастает только при насыщении организма этим витамином (Ьес1егс .1., 1987).
Коэффициенты ранговой корреляции выявили четкую связь исследованных параметров с содержанием рибофлавина в рационе (табл. I).
Таблица I. Корреляция между показателями обеспеченности организма крыс витамином В2 и содержанием в диете.
Параметр р п
Статистическая значимость
Содержание в печени 0,770 39 р < 0,01
Содержание в плазме 0,386 37 р < 0,01
Содержание в эритроцитах 0,300 38 р < 0,05
Активность ГР эритроцитов 0,568 38 р ^ 0,01
ФАД-эффект_-0,368 38_р ^ 0,01
Таким образом, концентрация рибофлавина в плазме крови наряду с другими использованными параметрами может служить надежным показателем, характеризуюцим поступление витамина В2 с пищей.
2.2. Зависимость показателей, используемых в качестве критериев обеспеченности, от насыщенности организма крыс рибофлавином.
Изучение соответствия между концентрацией рибофлавина в плазме крови (кривая 3), эритроцитах (I), активностью ГР эритроцитов (2) и
. . ,---2
I______
О 10 20 30 40
рибофлавин, мкг/сутки на крысу
РисЛ. а - зависимость содержания общего рибофлавина в печени (I), концентрации рибофлавина в эритроцитах (2), плазме крови (3) и активности ГР эритроцитов (4) от дозы витамина В2 в рационе крыс.
б - зависимость величины ФАД-эффекта (I) и суточной экскреции рибофлавина с мочой (2) от содержания витамина В? в рационе
КрЫС. ' й
о Я
0°-
1 2
I 85
| 65
В 55
20
15
10
10Г
5А
10
20 30
рибофлавин, мкг/г сырой печени
¿2,0
1,5
1,0
10
20 30
рибофлавин, мкг/г сырой печени
Рис.2, а - зависимость между концентрацией общего рибофлавина в эритроцитах (I), активностью ГР эритроцитов (2), концентрацией рибофлавина в плазме крови (3) и содержанием общего рибофлавина в печени, б - зависимость между содержанием общего рибофлавина в печени крыс и величиной ФАД-эффекта.
степенью насыщенности организма крыс витамином В2, оцениваемой по содержанию общего рибофлавина в печени (рис.2а) показало, что все параметры плавно возрастали с увеличением уровня рибофлавина в печени, ФАД-эффект при этом снижался с 2,2 до 1,6 (рис.26).
Коэффициенты ранговой корреляции подтвердили наличие выраженной связи между биохимическими параметрами обеспеченности и насыщенностью организма (содержание в печени) витамином В2 (табл. 2).
Таблица 2. Корреляция между показателями обеспеченности организма крыс витамином В2 и его содержанием в печени.
~ I статистическая
Параметр
значимость
Содержание в плазме 0,277 39 р ^ 0,05
Содержание в эритроцитах 0,265 38 р < 0,05
Активность ГР эритроцитов 0,579 37 р < 0,01
ФАД-эффект_-0,371 37_р < 0,01
Таким образом, все параметры отражают насыщенность организма витамином В2, т.е. реальное содержание в органах крысы (печень). Более выраженное снижение уровня рибофлавина в плазме крови (на 56%) при недостаточном поступлении витамина В2 с пищей по сравнению с другими показателями, позволяет считать этот параметр одним из наиболее чувствительных для выявления дефицита этого витамина.
2.3. Взаимосвязь между показателями обеспеченности организма рибофлавином. Установление концентрации рибофлавина в плазме крови, характерной для адекватной обеспеченности
организма человека витамином В2< Для установления критериев адекватной обеспеченности организма человека витаминами были использованы традиционные подходы:
I. Изучение зависимости показателей витаминного статуса от содержания витамина в рационе;
2. Статистическая обработка данных, полученных при обследовании взрослых и детей после витаминизации (принимавших от 2 нед. до 3 мес. наряду с основным рационом поливитаминные препараты или продукты, обогащенные витаминами) и, по нашему мнению, с достаточной степенью допущения могущих считаться хорошо обеспеченными витаминами. За критерий обеспеченности принимали границу доверительного интервала для математического ожидания М. е.а., 1995), имея в виду, что в случае нормального распределения в этот интервал должны попадать показатели 68,3% обследованных, а с учетом заведомо обеспеченных витамином людей - около 84% (Урбах В.Ю., 1975);
Кроме того был разработан еще один подход, состоящий в выявлении и анализе взаимосвязи между различными показателями обеспечен-
ности организма людей витаминами и математической интерпретации получаемых кривых. Для этого был использован прием (Horwltt М.К., 1986; Bolsvert W.A. е.а., 1993), при котором близкие по величине значения (например, ФАД-эффекта) объединяли в группы и для каждой образовавшейся группы рассчитывали среднее значение (М±м) другого параметра (содержание в эритроцитах, экскреция с мочой и т.д.).
Для полученных таким способом кривых взаимосвязи между показателями обеспеченности витамином В2 характерно монотонное нелинейное изменение линии регрессии. Рассчитанные для зависимостей подобного типа коэффициенты корреляции рангов (Гублер Е.В., Генкин A.A., 1973) подтверждают наличие четкой взаимосвязи между всеми исследованными параметрами (табл.3). За исключением зависимости экскреции рибофлавина от его содержания в плазме крови (см. рис.13), все кривые имеют выраженный двухфазный характер. Математическая обработка таких кривых по методу наименьших квадратов позволяет определить точку перегиба, т.е. границу между двумя совокупностями точек, одна из которых отражает показатели обеспеченных витамином людей, а другая - показатели лиц с его недостаточностью. Координаты точки пересечения двух прямых, по-видимому, соответствуют нижнему пределу адекватной обеспеченности организма витамином.
Таблица 3. Коэффициенты ранговой корреляции между показателями обеспеченности крыс, детей и взрослых людей витамином Вп.
Параметр
Объект исследования
Статистическая значимость
от ФАД-эффекта
- содержание в крысы -0,635 37 Р 0,01
эритроцитах люди -0,500 35 Р < 0,01
- содержание в крысы -0,125 34 Р < 0,10
плазме люди -0,304 60 Р 0,01
дети 5-7 лет -0,462 34 Р < 0,01
- часовая экскреция люди -0,435 32 Р < 0,01
с мочой дети 5-7 лет -0,676 39 Р 0,01
1. от уровня в эритроцитах 0,735 36 0,01
- активность ГР крысы Р
содержание в крысы 0,288 35 Р 0,05
плазме люди 0,296 30 Р 0,05
• часовая экскреция люди 0,299 37 Р 0,05
с мочой
1. от уровня в плазме 0,01
- активность ГР крысы 0,395 34 Р <
• часовая экскреция люди 0,603 35 Р 0,01
с мочой дети 5-7 лет 0,297 29 Р < 0,05
дети 9-13 лет 0,603 31 Р < 0,01
дети 12-14 лет 0,571 22 Р < 0,01
1-ый линейный участок совокупности точек, мость между величиной ФАД-эффекта и содержанием
отражающих зависи-общего рибофлавина в
эритроцитах людей (рис.3,А), ФАД-эффектом и экскрецией рибофлавина с мочой (рис.3,Б), очевидно, отражает ситуацию, когда организм и, соответственно, ГР эритроцитов насыщены витамином В2, внесение ФАД In vitro не вызывает активации фермента. Содержание витамина В2 в эритроцитах и его экскреция с мочой при этом резко возрастают. 2-й участок соответствует недостаточной обеспеченности, когда ГР эритроцитов не насыщена коферментом, и внесение ФАД in vitro вызывает существенную активацию фермента. В диапазоне величин ФАД-эффекта 1,2 и выше уровень рибофлавина в эритроцитах и его выведение с мочой изменяются слабо. Согласно координатам точки перегиба, величина ФАД-эффекта $1,20 отражает нормальную обеспеченность организма рибофлавином, при этом его уровень в эритроцитах >119 нг/мл, экскреция >13 мкг/ч.
Координаты точки пересечения двух ветвей зависимости часовой экскреции рибофлавина от содержания витамина В2 в эритроцитах равны 129 нг/мл и 13 мкг/ч (рис.4), что близко к полученным выше критериям.
Следующим этапом было установление величины нижней границы нормы концентрации рибофлавина в плазме крови, собранной утром натощак, а также проверка соответствия этого критерия величинам нижних границ норм других показателей обеспеченности организма витамином В2.
Зависимость концентрации общего рибофлавина в эритроцитах от его уровня в плазме крови представляет собой общую для взрослых и детей 9-13 лет монотонно возрастающую кривую, стремящуюся к плато (рис.5). Исходя из координат точки пересечения двух прямых, из которых одна отражает показатели людей, обеспеченных витамином В2 (2), а другая - с дефицитом этого витамина (I), минимальная концентрация рибофлавина в плазме крови, соответствующая адекватной обеспеченности организма этим витамином, составляет 7,3 нг/мл, а его концентрация в эритроцитах - 135 нг/мл.
Совокупность точек, отражающая зависимость между концентрацией рибофлавина в плазме крови и величиной ФАД-эф£екта, также является общей для взрослых и детей 5-7 лет (рис.6). Нормальной обеспеченности организма рибофлавином по данным этой зависимости соответствует величина ФАД-эффекта ниже 1,25, а содержание рибофлавина в плазме выше 5,3 нг/мл.
Кривая зависимости часовой экскреции рибофлавина с мочой от его содержания в плазме не имеет выраженной точки перегиба (рис. 13, кривая I), поэтому концентрация рибофлавина в плазме крови, характерная для нормальной обеспеченности организма этим витамином, была оценена графически по соответствию экскреции с мочой 13 мкг/ч и составила 5,2 нг/мл.
о к
хЗ »
1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25
ФАД-эффект
ь 35
. 30
« »
Ш
^ 20
о я 15
и,
10
5
0
1.0 1.1 1.2 1.1 1.* 15 1.6 1.7
ФАД-эффект
Рис.3. Зависимость между величиной ФАД-эффекта и содержанием общего рибофлавина в эритроцитах (А) и его часовой экскрецией (Б) для взрослых здоровых людей. На всех рисунках в скобках рядом с точкой указано количество обследованных.
[рибофлавин], нг/мл
Рис.4. Зависимость между содержанием общего рибофлавина в эритроцитах и его часовой экскрецией для взрослых здоровых людей.
5 10 15 20 25
[рибофлавин], нг/мл плазмы
Рис.5. Зависимость между содержанием рибофлавина в плазме и эритроцитах для взрослых здоровых людей (■) и детей 9-13 лет (а).
Мо-
1.2 1.4 1.6
ФАД-эффект
Ме М
[рнбэаптжн! кг/ил шттад
Рис.6. Зависимость между величи- Рис.7. Распределение частот ной ФАД-эффекта и содержанием встречаемости (в %) данной рибофлавина в плазме крови концентрации рибофлавина в
для здоровых взрослых (■) и плазме крови для 221 человека
детей 5-7 лет (о). после Ва-витаминизации.
В качестве еще одного подхода был проведен анализ частот встречаемости (в %) данной концентрации рибофлавина в плазме крови взрослых и детей после В2-витаминизации. Гистограмма представляет собой ассиметричное распределение Максвелла (рис.7). Поскольку у людей, получавших в день 2 мг витамина В2 и более (что превышает физиологическую потребность), концентрация рибофлавина в плазме крови была более 10 нг/мл (М=Н,4), и маловероятно, что дополнительный прием этого витамина привел к повышению содержания рибофлавина в плазме крови до нормального уровня только у половины обследованных (Ме=9,5 нг/мл), то, по-видимому, эта величина и может быть принята в качестве критерия оптимальной обеспеченности организма. Если предположить, что в результате витаминизации содержание рибофлавина в крови повысилось до нормального уровня не менее, чем у 80% обследованных, то в качестве критерия в соответствии с гистограммой следует принять величину 4-5 нг/мл плазмы крови.
Как будет показано далее, у людей, концентрация рибофлавина в плазме крови которых ниже 5 нг/мл, наблюдаются нарушения витамин В2-зависимого обмена витамина Вц и ниацина, проявляющиеся в снижении экскреции с мочой 4-ПК и 1-МНА при нормальном содержании в рационе витаминов В6 и РР, что можно рассматривать как дополнительный довод в пользу принятия этой величины в качестве критерия.
В табл. 4 суммированы полученные значения показателей нормальной обеспеченности организма взрослого человека рибофлавином. На основе их сопоставления мы склонны принять с некоторым запасом в качестве критерия адекватной обеспеченности организма витамином В2
Таблица 4. Критерии нормальной обеспеченности организма взрослого человека витамином В2.
Зависимость, используемая для расчетов ФАД-эффект Рибофлавин
плазма, нг/мл эритроциты, нг/мл экскреция мкг/ч
ФАД-э$фект - эритроциты ФАД-эффект - плазма ФАД-эффект - экскреция Эритроциты - экскреция Плазма - эритроциты Плазма - экскреция Частоты распределения показателя после В2-витаминизации
Нарушение метаболических функций Содержание витамина В9 в рационе_
1,19 1,25 1,22
1,25
5,3
7,3 5,2
5,0
« 5,0 6-9
119
130 135
13 13
13
< 14 12-17
Критерий нормальной обеспеченности
$1,25
6,0
130
13
концентрацию рибофлавина в плазме крови, равную 6 нг/мл. Это значение совпадает с параметрами, определенными ВЭЖХ (Botticher В., 1987), и находится в согласии с данными, полученными другими методами (4,9-8,4 нг/мл) (Suvarnaklch К. е.а., 1952; Lust J.E. е.а.,1954; Bessey O.A. е.а.,1956; Gatautis V.J., Nalto Н.К.,1981; Lambert W.E. е.а.,1985; Straub R.H. е.а.,1993) при определении концентрации рибофлавина в плазме крови у хорошо обеспеченных этим витамином людей.
Минимальная концентрация рибофлавина в эритроцитах, соответствующая нормальной обеспеченности организма витамином В2, составила в среднем 128 нг/мл, что совпадает с принятой в литературе (Чернышов В.Г., 1985); величина экскреции рибофлавина с мочой - 13 мкг/ч, величина ФАД-эффекта в диапазоне 1,00-1,25 (табл.4).
Таким образом, при условии применения высокоспецифичных методов определения рибофлавина (титрование РбСБ, ВЭЖХ и люмифлавиновый) любой из использованных критериев можно применять для выявления дефицита витамина В2, так как все параметры хорошо коррелируют между собой (табл.3), отражая поступление витамина В2 с пищей и насыщенность организма этим витамином, а величины нижних границ, характерных для нормальной обеспеченности организма рибофлавином, соответствуют друг другу. Высокая производительность метода титрования РбСБ делает его наиболее приемлемым для массовых обследований обеспеченности населения витамином В2.
3.Сравнительный анализ методов оценки обеспеченности организма витамином Bg и ниацином.
Прежде чем приступить к исследованию роли рибофлавина в обмене пиридоксина и ниацина необходимо было подобрать надежные и специфичные методы для исследования их обмена. С этой целью были проведены сравнительный и коррелятивный анализ, усовершенствование методов определения некоторых параметров, использующихся для оценки обеспеченности организма витамином Bg и ниацином.
3.1. Сравнение методов определения 4-ПК в моче.
При сопоставлении методов определения 4-ПК (24 образца суточной мочи крыс и 86 образцов мочи людей) было показано, что метод ВЭЖХ является более надежным и специфичным по сравнению с традиционным флуоресцентным, дающим значительно завышенные результаты в области низких концентраций (y=0,94x-t-0,55; R=0,66).
3.2. Стандартизация условий определения активности АсАТ эритроцитов и величины ПАЛФ-эффекта.
Было обнаружено, что форма кривых зависимости активности АсАТ от концентрации субстратов (наличие субстратного ингибирования) раз-
личается при недостаточном и нормальном потреблении крысами витамина В6, что может быть обусловлено изменением олигомерного состояния фермента вследствие снижения при дефиците витамина Bg концентрации АсАТ в тканях (Lumeng L., 1985). Действительно, при увеличении степени разведения гемолизатов эритроцитов человека наблюдалось повышение удельной активности АсАТ, что согласуется с данными о том, что при диссоциации димера образуется более активный мономер (Никифоров В.Н., 1986; Ковлер М.А., 1986). Величина ПАЛФ-эффекта также зависела от степени разведения гемолизата и условий его хранения (количество замораживаний-оттаиваний), что является типичным для аллостерических ферментов (Курганов Б.И., 1978). 3-кратное повторение этой процедуры сопровождалось уменьшением ПАЛФ-эффекта до минимальной постоянной величины.
Таким образом, величина ПАЛФ-эффекта для одного и того же гемолизата может изменяться в зависимости от условий его хранения, разведения, концентрации субстратов, природы используемого буфера. По-видимому, именно этим объясняются разногласия в том, какое значение ПАЛФ-эффекта соответствует нормальной обеспеченности организма витамином Bg (Cinnamon A.D., 1970; Пятницкая И.Н., 1982). Выходом из этой ситуации может служить жесткая стандартизация условий определения активности АсАТ и установление именно для них величины ПАЛФ-эффекта, соответствующей адекватной обеспеченности организма витамином Bg, на что указывают и другие авторы (Bitsch R., 1993).
3.3. Сравнение методов определения I-MHA в моче и окисленных никотинамидных коферментов в эритроцитах.
В исследованиях на 96 образцах мочи было показано, что поскольку процент выявления добавленного к моче I-MHA варьирует в диапазоне от 84 до 195%, необходимо использовать внутренний стандарт определяемого соединения, что согласуется с выводом других авторов (Carpenter K.J., 1950; Bender D.А.,1980,1982). Аналогичный вывод был сделан при сравнении различных вариантов метода определения НАД+НАДФ в крови. 4. Влияние обеспеченности рибофлавином на обмен витаминов Bg и PP.
4.1. Влияние различной обеспеченности витамином на обмен пиридоксина и ниацина у крыс
В 1-ом эксперименте были исследованы некоторые параметры метаболизма витаминов Bg и ниацина у половозрелых крыс в зависимости от содержания витамина Bg в рационе. При глубоком дефиците витамина Bg (около 3 мкг рибофлавина на крысу в день) происходило достоверное увеличение содержания в печени ПАЛ на 28% и пиридоксамина на 52%, а экскреция 4-ПК имела тенденцию к снижению, что, по-видимому, обусло-
влено снижением активности ФАД-зависимой альдегидоксидазы. Расчет коэффициентов ранговой корреляции выявил наличие выраженной обратной связи между уровнем витамеров В6 в печени животных и содержанием рибофлавина в их рационе или печени (табл.5).
Таблица 5. Коэффициенты ранговой корреляции между показателями обеспеченности крыс витаминами группы В.
Параметр р п Статистическая
значимость
1.от содержания витамина В2 в рационе
- содержание витамина В6 в печени
- содержание НАД+НАДФ в печени
- содержание НАД+НАДФ в эритроцитах 2.от содержания витамина В2 в печени
- содержание ПАЛ в печени
- содержание НАД+НАДФ в эритроцитах З.от содержания витамина В6 в печени
- содержание НАД+НАДФ в печени_
-0,356 35 р < 0,05
0,441 0,496 35 32 р ^ 0,01 р < 0,01
-0,199 0,489 35 32 р ^ 0,10 р < 0,01
-0,302 34 р ^ 0,05
При уменьшении дозы рибофлавина в рационе ниже 13 мкг/сут даже при нормальном поступлении никотиновой кислоты уровень НАД+НАДФ в эритроцитах снижался на 36% по сравнению с крысами, получавшими 33 мкг/сут рибофлавина, при параллельном уменьшении экскреции 1-МНА, по-видимому, за счет падения активности ФАД-зависимой кинуренин-3-монооксигеназы. Снижение концентрации НАД+НАДФ в печени на 27% наступало уже при потреблении 23 мкг/сут рибофлавина. Показатели ниаци-нового статуса обнаруживали положительную корреляцию с содержанием рибофлавина в диете и печени и отрицательную с содержанием витамина В6 в печени (табл.5).
4.2. Влияние недостаточности витамина В2 на экскрецию метаболитов витамина и ниацина у крыс Лишение растущих крыс в течение 23 дней витамина В2 приводило к снижению суточной экскреции с мочой рибофлавина до 0,06% по сравнению с контрольными животными, получавшими 100 мкг/сут рибофлавина. При этом несмотря на нормальное содержание пиридоксина и ниацина в рационе, экскреция 4-ПК снижалась на 50%, 1-МНА - на 75%.
Введение в рацион лишенных рибофлавина животных недостающего витамина уже через 8 дней приводило к возрастанию экскреции рибофлавина, 4-ПК и 1-МНА, однако эти величины оставалиь сниженными по сравнению с контролем соответственно на 61, 45 и 58%. Введение в рацион витамина В2 в течение следующих 5 дней приводило к полному восстановлению экскреции 1-МНА, при этом выведение рибофлавина и 4-ПК оставалось сниженным на 48 и 40%. Динамика и последовательность вое-
становления экскреции с мочой рибофлавина, 4-ПК и 1-МНА у крыс с дефицитом витамина В2 после его введения в рацион находится в соответствии с представлением о том, что экскреция 4-ПК может возрасти только после нормализации обмена витамина В6, нарушенного при недостаточности витамина В2, и, таким образом, введение в рацион лишенных витамина В2 животных рибофлавина должно приводить в первую очередь к восстановлению экскреции 1-МНА и лишь затем 4-ПК и рибофлавина. 4.3. Зависимость показателей обеспеченности взрослых и детей витамином и ниацином от рибофлавинового статуса организма.
Результаты, полученные на крысах, нашли подтверждение при обследовании здоровых детей и взрослых обоего пола, которые были разделены на 2 группы: обеспеченных витамином В2 (уровень рибофлавина в плазме крови > 6 нг/мл) и с его недостаточностью.
Высокая степень корреляции между содержанием ПАЛФ в плазме крови и экскрецией 4-ПК с мочой обнаруживалась только при адекватной обеспеченности (рис.8, кривая I) организма взрослых (р=0,5П, п=20, Р<0,01) и детей (р=0,469, п=22, Р<0,01) рибофлавином. При дефиците витамина В2 экскреция 4-ПК (кривая 2) практически не зависела от содержания ПАЛ+ПАЛФ в плазме крови (р = 0,041 (п=П) и 0,049 (п=18).
Аналогичная картина наблюдалась в случае ниацина: экскреция I-МНА монотонно увеличивалась с повышением концентрации НАД+НАДФ в эритроцитах (рис.9, кривая I) только при нормальной обеспеченности организма витамином В2 (р=0,404, п=17, Р<0,05 и р=0,420, п=14, Р<0,05). При недостаточности рибофлавина выведение 1-МНА было снижено и практически не зависело от содержания НАД+НАДФ (кривая 2).
Таким образом, результаты обследования людей и данные, полученные в опытах на крысах, свидетельствуют о том, что недостаток в питании рибофлавина приводит к снижению экскреции 4-ПК и 1-МНА на 5060%, уменьшению концентрации пиридоксалевых и никотинамидных кофер-ментов в крови (на 20-30%), причем степень изменения этих показателей (особенно для мочи) сопоставима по величине с изменениями при истинных пищевых дефицитах витамина В6 и/или РР. Т.е. по этим признакам пищевой дефицит рибофлавина может быть ошибочно принят за пищевой дефицит витаминов В6 и/или РР. Это может быть одной из причин, почему недостаточность этих витаминов у человека в изолированном, "чистом" виде практически не встречается, и, как правило, носит характер сочетанного полигиповитаминоза (Ефремов В.В., 1956; Смирнов М.И., 1966). Полученные данные отчасти могут также объяснять описанное в литературе отсутствие корреляции между концентрацией витамеров в крови и экскрецией с мочой (Бсйг^уег «I., 1981; НотсШ М.К.,
Рис.8. Взаимосвязь между содержанием ПАЛ+ 1Ш1Ф в плазме и экскрецией 4-ПК с мочой. I - кривая для здоровых детей (о) и взрослых (#), обеспеченных витамином Во, 2 - для здоровых детей (д) и взрослых (а) с недостаточностью рибофлавина, 3 - для больных ИЗСД детей (в).
« о ____>__
" 30 5 0 70 90 .
' 1КШШЕФ1, НКГ/Ш1 эритроцитов
Рис.9. Взаимосвязь мевду содержанием НАД+ НАДФ в эритроцитах и экскрецией 1-МНА с мочой в норме и при ИЗСД.
> 200 н
о И
Й о
2 1 в • 10 12
[пллф], нг/мл
Рис. 10.Зависимость меаду концентрацией ПАЛФ в плазме крови и часовой экскрецией 4-ПК с мочой для здоровых взрослых людей (о) и детей 9-13 лет (о).
3/ 7,6 (ПАЛФ1, нг/мл
а 5 ю 13
[ПАЛФ]. нг/ил
Рис.II. Взаимосвязь мевду содержанием ПАЛФ в плазме крови и величиной ПАЛФ-эффекта для взрослых здоровых людей.
12 3 ПАЛФ-эффект
Рис.12. Распределение частот встречаемости (в %) данной концентрации ПАЛФ в плазме крови (а) для 40 человек и данной величины ПАЛФ-эффекта (0) для 30 человек после В6-витаминиза-
ции. Сплошной вертикальной линией отмечены средние по группе величины, пунктирными - доверительный интервал.
1986; Пятницкая И.Н., 1987; Bates C.J.,1987), так как не во всех исследованиях учитывалась степень обеспеченности рибофлавином.
5. Установление критериев обеспеченности витамином Bg и ниацином здоровых взрослых людей с учетом роли рибофлавина в их метаболизме.
5.1. Витамин Bg.
Учитывая, что показатели обеспеченности организма витамином Bg зависят от рибофлавинового статуса, при установлении критериев обеспеченности этим витамином и выявления коррелятивных связей между параметрами обеспеченности этим витамином принимались во внимание только показатели, полученные у лиц, адекватно обеспеченных витамином Bg.
Зависимости между концентрацией ПАЛФ в плазме крови и экскрецией 4-ПК с мочой, а также между концентрацией ПАЛФ в плазме и величиной ПМФ-эффекта у здоровых взрослых людей и детей 9-13 лет характеризуются высокой степенью ранговой корреляции (табл.6) и имеют дву-фазный характер (рис.10,II). По точке пересечения прямых нижнему пределу адекватной обеспеченности организма витамином Bg соответствуют концентрация ПАЛФ в плазме выше 7,8-9,2 нг/мл, величина ПАЛФ-эффекта ниже 2,1, экскреция 4-ПК - более 71 мкг/ч. Последний показатель находится в пределах величин, измеряемых методом ВЭЖХ (54-86 мкг/ч) у хорошо обеспеченных витамином Bg людей (Plngoli А., 1995), но превышает принятое в отечественной литературе значение нижней границы нормы, равное 40 мкг/ч (Пятницкая И.Н., 1987). Это различие может объясняться тем, что традиционный метод определения 4-ПК, как показано выше, дает результаты, заниженные до 70% от фактических.
Таблица 6. Коэффициенты ранговой корреляции между показателями обеспеченности витамином Bg.
ПаРаметРы р п Дш
Концентрация ПМФ в плазме - активность АсАТ 0,356 25 Р<0,05
Концентрация ПАЛФ в плазме - ПАЛФ-эффект -0,445 20 Р<0,05
Активность АсАТ - ПАЛФ-эффект -0,361 21 Р<0,05 Концентрация ПАЛФ в плазме - экскреция 4-ПК
здоровые взрослые 0,557 20 Р^0,01
здоровые дети_0,514 25 Р<0,01
Гистограмма частот встречаемости концентраций ПАЛФ в плазме крови у людей после Bg-витаминизации имеет вид нормального распределения Гаусса (рис.12а), для величин ПАЛФ-эффекта - правой его части (рис.126). В соответствии с характеристиками этих гистограмм в качестве нижней границы нормальной обеспеченности организма витамином Bg следует принять концентрацию ПАЛФ в плазме крови ^ 6 нг/мл, величины ПАЛФ-эффекта в диапазоне от 1,0 до 3,0.
Точка перегиба сигмоидальной кривой зависимости базальной
удельной активности АсАТ эритроцитов от концентрации ЛАЛФ в плазме крови одних и тех же людей наблюдается при 8,5 нг/мл, что служит дополнительным аргументом в пользу принятия в качестве критерия нормальной обеспеченности витамином Bg концентрации ПАЛФ, близкой к 8 нг/мл плазмы. Кроме того, у людей с уровнем ПАЛФ в плазме крови менее 8 нг/мл и экскрецией 4-ПК менее 60 мкг/ч наблюдалось нарушение метаболизма ниацина, проявляющееся в снижении экскреции I-MHA при его нормальном содержании в рационе. Наконец, при потреблении около 2 мг и более витамина Bg в сутки содержание ПАЛФ в плазме крови превышало 9,5 нг/мл, а экскреция 4-ПК - 79 мкг/ч.
На основе сопоставления результатов определения критериев обеспеченности организма витамином Bg (табл. 7) концентрацию ПАЛФ в плазме крови более 8 нг/мл, по-видимому, можно рассматривать как норму для этого показателя, что согласуется с величиной, рекомендуемой в качестве нормы другими авторами (Drlskell J.A., 1984; Donald Е.А., 1986; Plngoll А, 1995). Адекватной обеспеченности витамином Bg соответствуют измеренные в конкретных условиях нашей лаборатории значения ПАЛФ-эффекта в диапазоне 1,0-2,5, часовая экскреция 4-ПК для взрослых и детей старше 9 лет - более 70 мкг. Таблица 7. Критерии обеспеченности организма витамином Bg.
Зависимость, используемая для расчетов (возраст)___
ПАЛФ-эффект
ШШ> в)Экскреция плазме! 4-ПК, нг/мл мкг/ч
Плазма-экскреция (взрослые, дети 9-13 лет) - 7,8 "71
Плазма-экскреция (дети 5-7 лет) - 7,9 65
ПАЛФ-эффект-плазма (взрослые) 2,1 9,2
ПАЛФ-эффект-экскреция (дети 5-7 лет) 2,9 - 57
Активность АсАТ - плазма (взрослые) - 8,5 Частоты распределения показателей
после В6 витаминизации 1-3 6,1
Нарушение метаболических функций - <8,0 <60
Содержание витамина В6 в рационе (взрослые) - 9,5-13 70-200
Критерий нормальной обеспеченности
(взрослые)_< 2,5 8,0_70
При условии нормальной обеспеченности рибофлавином концентрация ПАЛФ в плазме крови, удельная активность АсАТ эритроцитов, ПАЛФ-эфЗэект, экскреция 4-ПК с мочой обнаруживают между собой хорошую корреляцию (табл.6) и могут применяться в качестве взаимозаменяемых показателей обеспеченности витамином В6.
5.2. Витамин РР (ниацин). Учитывая, что показатели обеспеченности организма ниацином зависят от рибофлавинового и пиридоксинового статуса, при установлении
норм использовали показатели людей, адекватно обеспеченных витаминами В2 и Bg.
Кривая зависимости экскреции I-MHA от содержания НАД+НАДФ в эритроцитах, общая для взрослых и детей 9-13 лет, не имеет выраженных точек перегиба (рис.9). В связи с этим были приняты во внимание данные о том, что минимальное содержание НАД+НАДФ в эритроцитах у здоровых людей, получавших ниацин (за счет триптофана, никотинамида и никотиновой кислоты) в дозах, обеспечивающих физиологическую потребность, равно 40 мкг/мл (Bender D.A., 1986). Оцененная графически минимальная экскреция I-MHA, соответствующая этой концентрации НАД+ НАДФ, составила 400 мкг/ч.
6. Установление критериев обеспеченности витаминами группы В организма здоровых детей дошкольного и школьного возраста. При установлении возрастных критериев обеспеченности витаминами детей имели в виду, что, по нашим результатам (рис.5,6) и данным литературы (Donald Е.А., 1986; Bamjl M.S., 1987), критерии нормального содержания витамеров В2 и Bg в крови и величины ФАД- и ПАЛФ-эффектов для детей не зависят от пола и не отличаются от таковых для взрослых.
6.1. Установление величин часовой экскреции рибофлавина, характерных для нормальной обеспеченности организма детей разного возраста витамином В2-Как видно из рис.13, при одном и том же содержании рибофлавина в плазме крови его часовая экскреция с мочой у детей младше 12 лет снижена по сравнению со взрослыми. Эти кривые не имеют точек перегиба. Исходя из того, что концентрация рибофлавина в плазме крови при нормальной обеспеченности превышает 6 нг/мл, можно считать, что норма часовой экскреции этого витамина с мочой для детей 5-7 и 9-1I лет ниже, чем для взрослых, и равна 8,5 и 10 мкг, соответственно. Совокупность точек, характеризующих экскрецию и содержание рибофлавина в плазме крови, для детей 12-14 лет и взрослых ложится на одну кривую, что означает, что критерии обеспеченности витамином В2 детей этого возраста не отличаются от аналогичных показателей для взрослых.
Часовая экскреция рибофлавина с мочой для детей 5-7 лет, соответствующая координатам точки пересечения ветвей зависимости этого показателя от величины ФАД-эффекта (рис.14), равна 10 мкг.
При потреблении около 2 мг рибофлавина в день (рекомендуемое -1,6 мг) экскреция у детей 9-II лет составляла 11,2+1,6 мкг/ч.
Рекомендуемое суточное потребление витамина В2 для детей 5-7 лет составляет 65% от величины рекомендуемого потребления для взрослых, 9-1I лет - 86%, а для детей 12-14 лет оно практически совпадает
Рис.13. Взаимосвязь между концентрацией рибофлавина в плазме крови и его часовой экскрецией с мочой для взрослых (•) и детей (а) 12-14 лет (I), детей 9-11 (2) и 5-7 лет (3).
Рис.14. Зависимость между величиной ФАД-эффекта и часовой экскрецией рибофлавина с мочой для детей 5-7 лет.
о-
0 2 4 & е 10 12. [пмф], нг/мл Рис.15. Зависимость между концентрацией ПАЛФ в плазме крови и часовой экскрецией 4-ПК с мочой для детей 5-7 лет.
Рис.16. Взаимосвязь между величиной ПАЛФ-эф-фекта и часовой экскрецией 4-ПК с мочой для детей 5-7 лет.
Рис.17. Взаимосвязь между параметрами обеспеченности витамином В2 здоровых (2) и больных
ИЗСД детей (I):
а - зависимость между концентрацией рибофлавина в плазме крови и его экскрецией с мочой; б - зависимость между содержанием общего рибофлавина в эритроцитах и его концентрацией в плазме крови. (•) - здоровые взрослые, (о) -здоровые дети, (в) - больные ИЗСД дети.
с таковым для взрослых (Нормы физиологических потребностей в пищевых веществах и энергии, 1991>. Установленные нормы экскреции рибофлавина для этих возрастных групп составляют соответственно 69, 85 и 100% от величин, принятых в качестве нормы для взрослых. Таким образом, величины нормальной часовой экскреции увеличиваются с возрастом, при этом обнаруживается определенная пропорциональность между установленными нормами экскреции и рекомендуемым потреблением.
6.2. Витаиин В&.
Минимальные величины экскреции 4-ПК, отражающие адекватную обеспеченность организма детей 5-7 лет витамином В6, полученные путем математической обработки зависимостей этого показателя от концентрации ПАЛФ в плазме крови (рис.15) и величины ПАЛФ-эффекта (рис.16), хорошо совпадают между собой (65 и 57 мкг/ч (табл.7), что составляет около 85% от величины, принятой в качестве нормы для взрослых. Рекомендуемое суточное потребление витамина В6 для детей этого возраста составляет около 75% от величины для взрослых. Итак, и в этом случае имеется некоторая пропорциональность между величинами экскреции и рекомендуемым суточным потреблением.
В целом полученные данные свидетельствуют о том, что часовая экскреция витаминов группы В и их метаболитов коррелирует с их содержанием в рационе, крови и степенью насыщенности соответствующими коферментными формами (ФАД, ПАЛФ) витамин-зависимых ферментов (табл. 3,6), что подтверждает обоснованность применения этого показателя для оценки витаминного статуса организма детей (табл.8).
Таблица 8. Возрастные критерии часовой экскреции витаминов группы В организма взрослых и детей разного возраста.
Витамин
Возраст детей
5-7 лет 9-1I лет 12-14 лет
Взрослые
Рибофлавин, мкг/ч 9 10 13 13 4-ПК, мкг/ч 60 70 70 70 I-MHA, мкг/ч__400 400_400
7. ОБМЕН ВИТАМИНОВ ГРУППЫ В И КРИТЕРИИ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ ИМИ ОРГАНИЗМА ПРИ ИНСУЛИНЗАВИСИМОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ. 7.1. Обиен витаминов В2, Bg и ниацина при стрептозотоциновоы диабете у крыс.
У крыс со стрептозотоциновым диабетом при одинаковом с интакт-ными крысами содержании витамина В2 в сыворотке крови и печени экскреция рибофлавина с мочой увеличивалась в 5 раз, 4-ПК - на 35%, кса-нтуреновой кислоты на 44%, а экскреция I-MHA уменьшалась на 42% по сравнению с контрольными животными, что согласуется с данными лите-
ратуры (Sanada Н., 1980; IkedaS., 1986; Shibata К., 1987; Reddy F.S., 1990). В отличие от результатов Reddy F.S. (1986, 1990), это не приводило к изменению содержания витамина Bg и активности ФАД-зависимых сукцинатдегидрогеназы и ГР в печени. Полученные данные ставят вопрос о возможности использования величин экскреции, принятых в качестве нормы для здоровых людей, для оценки обеспеченности витаминами группы В пациентов, страдающих сахарным диабетом. 7.2. Особенности обмена рибофлавина и функционально связанных с ним витаминов при инсулинзависимоы сахарном диабете у детей.
Зависимость между уровнем ри-бо(£лавина в плазме крови и его содержанием в рационе для больных ИЗСД детей (рис.18), представляет собой кривую (б) насыщения, причем во всем диапазоне доз витамина В2 эта кривая расположена выше кривой (а) для здоровых детей. Экскреция рибофлавина с мочой при одинаковом потреблении витамина В2 у больных в 2-2,5 раза превышает его выведение у здоровых детей, а содержание витамина в эритроцитах (в основном представленного ФАД и ФШ) снижено на 30%.
Экскреция рибофлавина у детей, страдающих ИЗСД, хорошо коррелирует с его концентрацией в плазме крови (р=0,398, n=35, P^O.OI), однако кривая (2, рис.17а) этой зависимости во всем диапазоне существенно (в 3-7 раз) выше, чем у здоровых детей (I). Повышенное выведешь рибофлавина с мочой при одинаковом потреблении, по-видимому, может приводить к снижению его содержания в тканях, в частности в эритроцитах. Зависимость между содержанием рибофлавина в эритроцитах и плазме крови для больных детей также обнаруживает выраженную корреляцию (р=0,293, п=31, Рф,05), однако отражающая эту зависимость кривая (2, рис.176) несколько снижена и сдвинута вправо по сравнению с кривой (I) для здоровых детей.
Сниженная концентрация общего рибофлавина в эритроцитах при ИЗСД, должна была бы приводить к снижению насыщешюсти апоГР ФАД, тем не менее активность этого фермента у больных людей оказалась почти в 1,5 раза выше, чем у здоровых, что согласуется с данными др. авторов (Long W.К., 1961, SomS., 1981). Дополнительная активация
%-*-н-г-1-и
Витамин В2, мг/сут • " Рис.18. Зависимость концентрации рибофлавина в плазме крови (а,б) и его экскреции с мочой (в,г) от содержания витамина В? в рационе для здоровых (•,*) и больных ИЗСД (о,д) детей.
фермента In Yltro ФАД не обнаруживалась, что свидетельствует о его полном насыщении коферментом, несмотря на сниженный уровень витамина В2 в этироцитах. Выло установлено, что это обусловлено увеличением почти в 40 раз сродства ГР к ФАД (Какаж. = 0,040 ± 0,007 нМ против 1,58 ± 0,50 иМ у здоровых). В силу этих причин величина ФАД-эффекта при ИЗСД не отражает обеспеченность организма рибофлавином.
Совокупность полученных данных свидетельствует о существенном изменении метаболизма витамина В2 при этом заболевании.
В дальнейшем на основании сравнения кривых зависимости экскреции 4-ПК и I-MHA от концентрации коферментных форм витаминов в крови, полученных для больных ИЗСД и здоровых детей и взрослых, обеспеченных витамином В2 и с его дефицитом, предполагалось косвенно оценить, существует ли тканевой дефицит рибофлавина при ИЗСД.
В отличие от здоровых людей с недостаточностью витамина В2 (рис.8, кривая 2), зависимость экскреции 4-ПК от содержания ПАЛ+ПАЛФ в плазме крови при ИЗСД хорошо выражена (р=0,460, п=41, Р<0,01) и не отличается от зависимости для обеспеченных витамином В2 здоровых детей и взрослых (кривая I). Это можно трактовать как доказательство отсутствия снижения активности при диабете по крайней мере двух витамин В2-зависимых ферментов обмена пиридоксина: ФАД-зависимой аль-дегидоксидазы и ФМН-зависимой ПФО.
Кривая (3, рис.9) зависимости экскреции I-MHA от концентрации НАД+НАДФ в эритроцитах у больных ИЗСД детей снижена по сравнению с кривой (I) для здоровых детей, обеспеченных витамином В2, характеризуется хорошей корреляцией между этими параметрами (р= 0,489, п=26, Р<0,01), но отличается от кривой (2) для здоровых людей с недостаточностью рибофлавина. Возможно это обусловлено переводом метаболизма ниацина на путь, минующий образование I-MHA (Shibata К., 1987).
Зависимости концентрации витамеров Bg и ниацина в крови и экскреции их метаболитов с мочой от содержания этих витаминов в рационе больных и здоровых детей также имеют некоторые отличия.
При увеличении потребления витамина Bg с 2 до 6 мг в день уровень ПАЛФ у здоровых оставался практически неизменным (рис.19, кривая а), у больных этот показатель в диапазоне от I до 8 мг/сут монотонно возрастал с 8 до 25 нг/мл (кривая б). Во всем диапазоне суточных доз витамина В6 выведение 4-ПК с мочой у больных выше (г), чем у здоровых детей (в), причем сама кривая имеет другой характер. Так, если у здоровых детей максимальная концентрация ПАЛФ редко превышает 20 нг/мл плазмы крови, то у 25% больных детей она выше этой величины.
Совокупности точек, отражающие зависимости между уровнем НАЦ+
Витамин Вк, мг/сут Рис.19. зависимости5 концентрации ПАЛФ в плазме крови (а,б) и экскреции 4-ПК с мочой (в,г) от содержания витамина Вс, в рационе для здоровых (•,*) и больных изсд (о,д.) детей.
&
Витамин РР, мг/сут Рис.20. Зависимость уровня НАД+НАДФ в эритроцитах (а,б) и экскреции 1-мНА с мочой (в,г) от содержания ниацина в рационе для здоровых (•,*) и больных ИЗСД (о,л) детей.
дается у детей с впервые выявленным ИЗСД
НАДФ в эритроцитах и содержанием ниацина в рационе как для здоровых детей (кривая а, рис.20), так и для больных (б), имеют одинаковый характер и представляют собой кривые насыщения, причем кривая для больных детей лежит несколько выше. Экскреция 1-МНА при потреблении до 30 мг ниацина в день у детей, страдающих ИЗСД (г), существенно снижена по сравнению с его выведением у здоровых (в), что подтверждает полученные ранее данные (рис.9).
7.3. Влияние длительности заболевания, его тяжести и степени нарушения обмена веществ на метаболизм витаминов группы В у больных ИЗСД детей.
Нарушение обмена рибофлавина, проявляющееся в его повышенном выведении с мочой, прогрессирует с увеличением срока заболевания, обнаруживая зависимость в виде тенденции с уровнем гликемии и глюко-зурии. Минимальное отклонение от нормального уровня экскреции наблю-У всех болеющих в течение
5-7 лет экскреция сильно повышена. Таким образом, повышенное выведение рибофлавина является характерным признаком ИЗСД.
У всех детей в состоянии комы, при кетоацидозе и при глюкозу-рии, превышающей 20 г/сут, при нормальном содержании НАД+НАДФ в эритроцитах обнаруживалась в 2-2,5 раза сниженная экскреция 1-МНА. У детей с повышенным уровнем холестерина дефицит витамина В6 встречался чаще, чем у детей с его нормальным уровнем.
Таким образом, изменения обмена рибофлавина и ниацина при ИЗСД, наблюдаемые на модели диабета у крыс и при обследовании больных детей, носят однонаправленный характер. Представленные данные подтверждают, что для оценки обеспеченности больных ИЗСД пользоваться нормами для здоровых людей нельзя, что диктует необходимость установления специальных критериев для этой категории больных.
7.4. Установление критериев обеспеченности витаминами группы В
организма детей, больных инсулинзависимым сахарным диабетом.
Для установления критериев адекватной обеспеченности витаминами В2 и В6 организма детей обоего пола 10-14 лет, больных ИЗСД в течение 3-5 лет, использовали подходы, примененные для здоровых.
В случае витамина В2 математической обработке были подвергнуты кривые зависимости между содержанием рибофлавина в эритроцитах и плазме крови (рис.21), экскрецией рибофлавина с мочой и его концентрацией в эритроцитах (рис.22), а также статистическая обработка показателей после витаминизации.
Концентрация рибофлавина в плазме крови и его часовая экскреция с мочой, характерные для достаточной обеспеченности больных ИЗСД детей (табл.9), почти в 2 раза превышают критерии, установленные нами для здоровых детей того же возраста (табл.8), а уровень витамина В2 в эритроцитах, наоборот, на 30% ниже (табл. 4,9). Таким образом, применение критериев обеспеченности витамином В2 для здоровых детей при оценке рибофлавинового статуса больных ИЗСД детей давало бы ложное представление.
В случае витамина В6 математическому анализу была подвергнута кривая зависимости экскреции 4-ПК от концентрации ПАЛФ в плазме крови (р=0,800, п= 43, Р<0,01), имеющая сигмоидальную форму, и, таким образом, характеризующаяся не двумя, а тремя линейными участками (рис.23), из которых первые два совпадают с таковыми для здоровых. Также бы-
б 10 1В 20 25
[рибофлавин], нг/мл плазмы
Рис.21. Зависимость между содержанием общего рибофлавина в эритроцитах и его концентрацией в плазме крови для больных ИЗСД детей 10-14 лет.
[рибофлавин], нг/мл
Рис.22. Зависимость экскреции рибофлавина от его содержания в эритроцитах для больных ИЗСД детей 10-14 лет.
Э а»
о 5 (» « ля
1ЛАЛФ], нг/мл плазмы Рис.23. Зависимость экскреции 4-ПК от концентрации ПАЛФ в плазме крови для больных ИЗСД детей 10-14 лет.
Таблица 9. Критерии адекватной обеспеченности витаминами В2 и Вк организма детей 10-14 лет, больных сахарным диабетом.
Зависимость, исполь- Рибофлавин Витамин В6
зуемая для расчетов плазма нг/мл эритроциты, нг/мл экскреция мкг/ч плазма нг/мл экскреция, мкг/ч
Эрнтроциты-экскреция Плазма - эритроциты Плазма-экскреция Частоты распределения показателя после 10,4 96 97 27 8,4 64
витаминизации Содержание витамина в рационе 8,4 10 - 27 7,2
Критерий адекватной обеспеченности 10 100 27 8,4 65
ли проанализированы частоты встречаемости концентрации ПАЛФ в плазме крови у детей после витаминизации. Полученные величины (табл.9) не отличаются от таковых для здоровых людей.
Величина экскреции 1-МНА, соответствующая уровню НАД+НАДФ в эритроцитах, равному 40 мкг/мл, принятому в качестве нормы при адекватной обеспеченности ниацином, превышает 400 мкг/ч и, следовательно, также не отличается от величины, принятой для здоровых людей (рис.9).
7.5. Обмен витаминов группы В у взрослых больных инсулинзависимой и инсулиннезависимой формами сахарного диабета.
Для решения вопроса о возможности оценки обеспеченности витаминами группы В взрослых людей, больных сахарным диабетом I и II типа, с помощью критериев, принятых для здоровых людей, были проанализированы зависимости экскреции витамина от его содержания в крови и сопоставлены с таковыми для здоровых людей.
У взрослых людей, страдающих ИЗСД, так же, как и у больных детей, наблюдаются существенные изменения обмена витамина В^, проявляющиеся в его повышенном выведении с мочой и изменении содержания в эритроцитах. При достаточной обеспеченности рибофлавином взрослых людей, страдающих ИЗСД, его концентрация в плазме крови должна быть ^ 10 нг/мл, а выведение с мочой > 50-60 мкг/ч. Критерии обеспеченности при сахарном диабете II типа совпадают с таковыми для здоровых. Поскольку кривые зависимости экскреции 4-ПК и 1-МНА от содержания соответствующих коферментных форм в крови для больных инсулиннезави-симым сахарным диабетом и ИЗСД совпадают с кривыми для здоровых людей, критерии обеспеченности витаминами В6 и ниацином не отличаются от параметров для здоровых взрослых.
8. Характеристика обмена витаминов группы В при язвенной болезни
двенадцатиперстной кишки, гипертонической болезни и ИБС.
Совпадение кривых зависимости экскреции рибофлавина, 4-ПК и I-МНА от уровня соответствующих витаминов или коферментных форм в крови, а также кривых зависимости этих показателей от содержания витамина в пище, полученных для взрослых больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, гипертонической болезнью, ИБС и здоровых людей свидетельствует о том, что обмен витаминов В2, В6 и ниацина при этих заболеваниях не имеет принципиальных отличий от обмена у здоровых людей. Таким образом, для оценки обеспеченности больных указанными заболеваниями людей применимы критерии, принятые для здоровых. 9. Использование разработанных методов и критериев для оценки витаминного статуса и эффективности витаминизации населения.
Усовершенствованные методы определения витаминов и их метаболитов в крови и моче, а также установленные биохимические критерии были использованы для оценки витаминной обеспеченности разных возрастных групп здоровых и больных людей (около 1500 чел.) из различных регионов Российской Федерации и Украины. Относительное количество людей с выраженным дефицитом рибофлавина составило 33-66% среди мужчин и 28-51% - среди женщин. Таким образом, женщины обычно обеспечены витамином В2 несколько лучше мужчин. Выраженный дефицит рибофлавина обнаруживается приблизительно у 30% обследованных беременных женщин и детей. Доля лиц с недостаточностью витамина Вц составила 52-84% среди мужчин и 39-98% - среди женщин. У большинства обследованных выявлялась сочетанная недостаточность витаминов группы В. В 1992-93 гг. наметилась тенденция к ухудшению обеспеченности этими витаминами населения промышленных городов.
Недостаточность рибофлавина у больных детей (48-80% обследованных) встречалась чаще, чем у здоровых (0-33%). Дефицит витамина Ве несколько чаще обнаруживался среди здоровых детей (53-95%), чем среди больных (20-90%). Заметного ухудшения обеспеченности витаминами группы В больных детей в 1991-94 гг. не произошло.
С использованием предложенных методов была проведена оценка эффективности витаминизации (около 350 человек) путем обогащения готовых блюд и продуктов поливитаминными премиксами и приема поливитаминных препаратов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Совокупность данных, полученных в экспериментах на крысах и на клиническом материале, позволила сделать вывод о том, что концентрация рибофлавина, определенная титрованием РССБ в плазме крови, со-
оранной утром натощак, является надежным показателем обеспеченности организма витамином В2- Редкие случаи использования этого показателя объясняются отсутствием до недавнего времени достаточно простых и в то же время специфичных и чувствительных методов определения рибофлавина и критериев адекватной обеспеченности им организма.
Недостаток рибофлавина в питании приводит к нарушению обмена витамина В6 и ниацина. Корреляция между показателями обеспеченности этими витаминами и их поступлением с пищей наблюдается только при условии достаточной обеспеченности организма витамином В2. При дефиците рибофлавина такая коррелятивная взаимосвязь полностью исчезает.
Изучение и математическая обработка кривых взаимосвязи между содержанием витамина в крови, активностью витамин-зависимых ферментов и экскрецией витамина или его метаболитов с мочой, имеющих двухфазный характер, дает возможность определить границу между показателями обеспеченных витамином людей и лиц с его недостаточностью. Таким образом, изучение подобных зависимостей с учетом межвитаминных взаимодействий обосновывает биохимические критерии адекватной обеспеченности организма витаминами и позволяет установить конкретные величины каждого показателя, характеризующие нормальную обеспеченность организма тем или иным витамином. Сравнение аналогичных кривых, полученных для взрослых и детей разного возраста, дает возможность установить возрастные нормы экскреции витаминов с мочой.
- Если обмен того или иного витамина при конкретном заболевании не претерпевает изменений по сравнению с таковым в здоровом организме, то в этом случае будет наблюдаться совпадение кривых зависимости экскреции витамина с мочой от его концентрации в крови и содержания в рационе. Это будет означать, что для оценки обеспеченности больных людей применимы критерии, принятые для здоровых. Использование такого подхода не обнаружило отличий в обмене витаминов В2, В6 и РР у больных инсулшшезависимым сахарным диабетом, больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, гипертонической болезнью и ишеми-ческой болезнью сердца, но в то же время выявило существенные изменения метаболизма витамина В2 при ИЗСД. Установленные критерии адекватной обеспеченности организма больных этим заболеванием существенно отличаются от показателей для здорового человека.
Таким образом, предлагаемый способ исследования взаимосвязи между содержанием витамина в крови и его экскрецией с мочой является эффективным методическим подходом для выявления особенностей обмена водорастворимых витаминов (если таковые имеются) при различных патологиях, а также для установления возрастных критериев адекватной
обеспеченности организма здоровых и больных людей витаминами.
Полученные в работе результаты показывают, что определение концентрации витамина (рибофлавина или ПАЛФ) в плазме крови является более препочтительным по сравнению с так называемыми функциональными тестами, так как в отличие от последних не имеет ограничений и позволяет оценить обеспеченность организма витамином даже в том случае, когда абсолютное значение критерия при некоторых заболеваниях отличается от такового для здорового человека. В то же время ФАД-эффект "не срабатывает" при ИЗСД и некоторых других заболеваниях (Prentice A.M., Bates C.J., 1981; Fldanza F. е.a., 1989; Anderson B.B., 1993), а величина ПАЛФ-эффекта в значительной мере определяется условиями ее определения.
В целом полученные данные позволяют обосновать биохимическую концепцию о том, что вследствие существенных изменений метаболизма витаминов группы В при некоторых заболеваниях конкретные величины критериев, применяемых для оценки обеспеченности витаминами организма больных людей, могут отличаться от таковых для здоровых.
ВЫВОДЫ
1. Разработан биоспецифичный, сопоставимый по чувствительности с ВЭЖХ, метод быстрого определения рибофлавина в плазме крови с помощью рибофлавинсвязываицего апобелка, основанный на уникальном свойстве последнего связывать с высоким сродством и избирательностью эквимолярное количество рибофлавина и полностью тушить его флуоресценцию.
2. Показано, что определенные с помощью рибофдавинсвязывающего апобелка концентрация рибофлавина в плазме крови и его часовая экскреция с мочой, наряду с содержанием витамина В2 в эритроцитах и величиной ФАД-эффекта хорошо коррелируют между собой, отражают поступление витамина В2 с рационом и степень насыщенности им организма, что позволяет использовать эти биохимические показатели для оценки рибофлавинового статуса организма.
3. Установлено, что концентрация рибофлавина в плазме крови, соответствующая оптимальной обеспеченности организма витамином В2 одинакова для взрослых и детей и должна превышать 10 нг/мл. Снижение содержания рибофлавина до величины менее 6 нг/мл указывает на выраженный дефицит витамина В2.
4. В ходе сравнительного анализа проведено усовершенствование методов определения витаминов группы В и их метаболитов в крови и моче; сделан выбор методов, позволящих объективно оценивать обеспеченность организма этими нутриентами.
5. Проведено систематическое изучение влияния степени обеспеченности организма животных и людей рибофлавином на показатели обес-печешюсти витамином В6 и ниацином. Установлено, что нормальная ранговая корреляция между содержанием пиридоксалевых и никотинамидных ко^рментов в крови и экскрецией с мочой соответствующих продуктов их метаболизма обнаруживается только при нормальной обеспеченности организма витамином Вп. В то же время на фоне недостаточности рибофлавина наблюдается снижение экскреции с мочой 4-пиридоксиловой кислоты и 1-метилникотинамида даже при нормальном содержании пиридокси-на и ниацина в рационе.
6. Разработан новый методический подход к исследованию обмена витаминов в норме и при различных патологических состояниях, основанный на изучении (с учетом межвитаминных взаимодействий) корреляционной зависимости между экскрецией витамина или его метаболитов с мочой и содержанием соответствующих соединений в крови, позволяющий с помощью математической обработки устанавливать критерии обеспеченности организма исследуемым витамином и выявлять особенности его обмена при различных заболеваниях. Дано биохимическое обоснование минимальных величин показателей, характерных для нормальной обеспеченности организма витаминами группы В.
7. Установлены величины часовой экскреции с мочой рибофлавина, 4■ииридоксиловой кислоты и 1-метилникотинамида, характеризующие нормальную обеспеченность соответствующими витаминами детей 5-7, 9-11 и 1л 14 лет, что позволяет рекомендовать эти неинвазивные методы для оценки витаминного статуса детей.
8. Выявлены особенности обмена рибофлавина при инсулинзависи-мом сахарном диабете, проявляющиеся в его повышенном выведении с мочой и снижении уровня в эритроцитах и тканях, что, однако, не приводит к возникновению тканевого дефицита этого витамина, поскольку не сопровождается снижением экскреции продуктов метаболизма ниацина и ппридоксина до уровня, характерного для здоровых людей с недостаточностью витамина В?, и не вызывает уменьшение активности ФАД-зависимой глутатионредуктазы, так как ее сродство к коферменту при этом существенно возрастает. Степень изменения обмена рибофлавина прогрессирует с увеличением срока заболевания, обнаруживает определенную связь с уровнем гликемии и глюкозурии. Установлены критерии адекватной обеспеченности витаминами группы В больных сахарным диабетом детей и взрослых, существенно отличающиеся от таковых для здоровых людей, что позволяет проводить правильную оценку обеспеченности этими нутриентами и корректировку рационов.
9. В ходе исследования кривых зависимости экскреция с мочой -содержание витамина в плазме и/или эритроцитах, а также зависимости этих показателей от содержания витамина в рационе охарактеризован обмен витаминов В2, В6 и ниацина при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни. На основании сопоставления этих зависимостей для больных и здоровых людей установлено, что критерии достаточной обеспеченности перечисленными витаминами при этих заболеваниях не отличаются от таковых для здоровых людей.
10. Разработанный метод определения рибофлавина в плазме крови и установленные биохимические критерии оценки витаминного статуса организма взрослых и детей успешно применены для выявления недостаточности витаминов группы В, для коррекции рационов и оценки эффективности витаминизации различных групп населения в ходе эпидемиологических обследований.
Выражаю глубокую благодарность коллективу лаборатории обмена витаминов и минеральных веществ Института питания РАМН за создание благоприятных условий работы, О.А.Вржесинской и Л.А.Харитончик, а также другим сотрудникам, в разное время принимавшим участие в работе.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Глинка Е.Ю., Сокольников A.A., Коденцова В.М. Об использовании ПАЛФ-эффекта как показателя обеспеченности витамином Вк. // Вопр. мед. химии. - 1989.-Т. 35.-* 2.-С.52-59. D
2. Коденцова В.М., Глинка Е.Ю. Изменение кинетических свойств пири-доксальзависимых ферментов при алиментарной недостаточности витамина Bg у крыс.//Укр. биохим. журнал.- 1990.- Т.62.I.-С.44-49.
3. Коденцова В.М., Алексеева И.А., Сокольников A.A., Бендер Е.Д., Якушина Л.М, Спиричев В.Б. Определение рибофлавина в моче (сравнительный анализ методов).//Вопр. питания.-I99I.-J& 3.-С.59-64.
4. Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Сравнение флуоресцентных методов определения витамина В9 в крови. // Вопр.питания.-I99I.-JM.-С.67-72. ¿
5. Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Алексеева И.А., Спиричев В.Б. Сравнение биохимических критериев обеспеченности организма человека рибофлавином.// Вопр. мед. химии.- 1991.-* 5.-С.76-79.
6. Kodentsova V.M., Alekaeeva I.A., Khotlmtchenko S., Vrsheslnskaya O.A., Splrlchev V.B. Influence of riboflavin and Iron provision on the vitamin В group metabolism.// Abstr. I Сопят. '''Vitamins and Blofactors In Life Science".- Japan, 1991.- P.108.
7. Коденцова B.M., Вржесинская O.A., Спиричев В.Б. Об использовании величин экскреции витаминов и их метаболитов в качестве показателей обеспеченности витаминами В0, Вс и ниацином.// Вопр. мед. химии.-1992. -М. -С. 22-24. ¿ ь
8. Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Забуркина
Т.Г., Бендер Е.Д., Спиричев В.Б. Определение 1-метилникотинамида и никотиновых коферментов в биологических образцах флуоресцентным методом.// Вопр. питания.-1992.-J6 2.-С.62-67.
9. Алейник С.И., Коденцова В.М., Митин И.Е., Сокольников A.A., Вржесинская О.А, Исаева В.А., Терехина Т.А., Строганова A.C., Эржен К., Цибульская O.A., Скирко А.З., Спиричев в.Б. Витаминная обеспеченность детей, посещающих детский сад, и влияние на нее приема поливитаминного препарата "Пиковит" (KRKA, Югославия).// Вопр. питания.- 1992.- К 3.- С.14-19.
Ш.Бекетова H.A., Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Забуркина Т.Г, Бендер Е.Д., Якушина Л.М. Сравнение методов определения 4-пири-доксиловой кислоты в моче.//Вопр. питания.-1992.-Ä4.-С.67-69.
I].Коденцова В.М., Алексеева И.А., Спиричев В.Б. Особенности обмена рибофлавина при сахарном диабете.// Укр. биохнм. журнал.-1992.-№ 4.- С.105-108.
12.Коденцова В.М. Экскреция с мочой витаминов и их метаболитов как критерий обеспеченности витаминами организма человека. // Вопр. мед. химии.-1992. - Л 4.-С.33-37.
13.Коденцова В.М., Садыкова P.E., Древаль A.B., Вржесинская O.A., Сокольников А. А, Бекетова H.A. Влияние уровня белка в рационе крыс на обмен водорастворимых витаминов при стрептозотоциновом диабете. // Пробл. эндокринол. - 1992. - Т.38.-№ 6. - С.56-57.
IА.Алейник С.И., Цибульская O.A., Эржен К., Коденцова В.М., Блажее-вич Н.В., Исаева В.А., Сокольников A.A., Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Спиричев В.Б. Влияние приема поливитаминного препарата "Дуовит" на витаминную обеспеченность населения, пострадавшего при аварии на Чернобыльской атомной электростанции. // Новые лекарственные препараты,- 1993. 2.- С.II-15.
15.Садыкова P.E., Коденцова В.М., Сокольников А.А, Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Древаль A.B., Спиричев В.Б. Обмен водорастворимых витаминов при стрептозотоциновом диабете у крыс. // Проблемы эндокринолог™. - 1993. - * 3. - С. 40-42.
16.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Денисова С.Н., Сокольников A.A., Бекетова H.A., Нетребенко O.K., Спиричев В.Б. Нормы часовой экскреции с мочой витаминов группы В для детей 9-13 лет.// Вопр. мед. химии.- 1993.- JJ4.- С.27-31.
17.Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Блажеевич Н.В., Исаева В.А., Харитончик Л.А., Алейник С.И., Укадер М.С., Фризен И.Д., Султанова М.И. Обеспеченность витаминами различных групп населения республики Башкортостан. // Вопр. питания.- 1993.- J6 5.- С.36-40.
Ib.Коденцова В.М., Якушина Л.М., Вржесинская O.A., Бекетова H.A., Спиричев В.Б. Влияние обеспеченности рибофлавином на метаболизм витамина Bg.// Вопр. питания.- 1993.- № 5.- С.32-36.
19.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Бекетова H.A., Спиричев В.Б. Влияние обеспеченности рибофлавином на обмен водорастворимых витаминов.//Вопр. мед. химии.-1993.-Т.39,Ж>.-С.29-33.
20.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Бекетова H.A., Трофименко Л.С., Дронова В.И., Трофименко Е.Б., Голубкина H.A., Алейник С.И., Исаева В.А., Спиричев В.Б. Эффективность использования обогащенных витаминными премиксами фирмы "Рош" (Австрия) готовых блюд в питании больных инсулинзависимым сахарным диабетом детей.// Вопр. питания.- 1993.- № 5.- С.40-45.
21.Коденцова В.M., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Харитончик JI.A., Спиричев В.Б. Обмен витаминов группы В у больных инсулинза-висимой и инсулиннезависимой формами сахарного диабета. // Вопр. мед. химии. -1993.-Т.39, № 5.-С.26-29.
22.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Сокольников A.A., Алексеева И.А., Спиричев В.Б. Обмен рибофлавина и функционально связанных с ним витаминов группы В при инсулинзависимом сахарном диабете. // Вопр. мед. химии. - 1993. -Т.39, № 5.-С.33-36.
23.Коденцова В.М., Бекетова H.A., Рисник В.В., Сокольников A.A., Вржесинская O.A., Спиричев В.Б. К выбору наиболее адекватных критериев обеспеченности организма человека витамином Вк.// Клин, лаб.диагн.-1993. -J66. -С. 22-27. D
24.Садыкова P.E., Коденцова В.М., Древаль A.B. Ниациновый статус организма при экспериментальном сахарном диабете: влияние уровня белка в рационе.//Пробл. эндокринол.-1994.-Т.40.-Ш.-С.4I-43
25.Коденцова В.М., Осинская Л.Ф., Вржесинская O.A., Медведенко Г.Ф. Витаминный статус новорожденных от здоровых и страдающих гипертонической болезнью матерей. // Укр. биохим. журнал.- 1994.- Т.66,
* I.- С.106-109.
26.Коденцова В.М., Сокольников A.A., Алексеева И.А., Вржесинская O.A., Харитончик JI.A., Бекетова H.A., Спиричев В.Б. Нормы часовой экскреции с мочой витаминов группы В для детей 5-7 лет. // Вопр. питания.- 1994.- » 1-2.- С. 18-21.
27.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Трофименко Е.В., Сокольников A.A., Бекетова H.A., Блажеевич Н.В., Исаева В.А., Алейник С.И., Трофименко Л.С., Дронова В.И., Спиричев В.Б. Витаминный статус детей, страдающих сахарным диабетом.// Вопр. мед. химии. - 1994.» 2.-С. 45-48.
28.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Харитончик Л.А., Спиричев В.Б. Обмен витаминов группы В при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, гипертонической болезни и ишемической болезни сердца. // Вопр. мед. химии. -1994.- Т.40, Л 2.- С.41-45.
29.Блажеевич Н.В., Спиричев В.Ь., Алейник С.И., Коденцова В.М., Сокольников A.A., Вржесинская O.A., Исаева В.А., Алексеева И.А., Голубкина H.A., Бекетова H.A., Шагова М.В., Федоров П.Н., Щеглова E.H. Обеспеченность витаминами, железом и селеном различных групп населения республики Мари Эл (декабрь 1991 г.) // Вопр. питания.-1994.- № 3.- C.I2-I5.
30.Трофименко Л.С., Дедов И.И., Дронова В.И., Трофименко Е.В., Шаба-ев C.B., Коденцова В.М. Клинико-биохимические критерии коррекции полигиповитаминозов у детей, больных сахарным диабетом // Педиатрия.- 1994.- * 3.- С.23-25.
31.Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Рисник В.В., Сокольников A.A., Спиричев В.Б. Выделение рибофлавинсвязывающего апобелка из бежа куриных яиц и его использование для определения рибофлавина в биологических образцах.// Приклад, биохимия и микробиол.- 1994.-Т.ЗО, № 4-5.- С.603-609.
32.Вржесинская O.A., Коденцова В.М., Спиричев В.Б., Алексеева И.А., Сокольников A.A. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов. // Вопр. питания.- 1994.-
# 6.- С.9-12.
33.Коденцова В.М., Харитончик Л.А., Вржесинская O.A., Абрамова Е.И., Шумилова С.Л., Спиричев В.Б. Уточнение критериев обеспечености
взрослых и детей 12-14 лет витаминами Вт и Во. // Вопр. мед. химии. -1994. -Т. 40.Я6. -С. 45-48. 1
34.Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Харитончик Л.А., Алексеева И.А., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Уточнение критериев обеспеченности организма витамином Bg.// Вопр. мед. химии.-I994.-Т.40,JK5.-С.41-44.
35.Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б. Биодоступность витамина В~ из продуктов растительного и животного происхождения. //Физиол.журнал.-1995.-М.-С.39-48.
36.Харитончик Л.А., Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Уточнение критериев обеспечености организма витамином В&. // Вопр. мед. химии.- 1995.- Т.41, № 3.- С.46-50.
37.Спиричев В.Б., Коденцова В.М., Блажеевич Н.В., Алейник С.И., Сокольников А.А., Вржесинская О.А., Исаева В.А., Алексеева И.А., Переверзева О.Г., Голубкина Н.А., Бекетова Н.А., Шагова М.В. Витаминный и микроэлементннй статус персонала ЧАЭС и детей дошкольного возраста г.Славутича.//Физиол. журнал.-1995.-Л 3-4.-С.38-49.
3«.Vrshesinskaya О., Kodentsova V., Splrichev V. Riboflavin plasma level as a criteria Tor vitamin B-2 status evaluation In healthy people and in some diseases. // Abstr. 7Th Europe Nutr. Conf.-1995, Vienna.- P.117.
39.Kodentsova V., Vrshesinskaya 0., Kharitonchik L., Yakushina L., Splrichev V. The use of blood and urinary vitamin levels for nutritional status evaluation in children with diabetes mellltus. // Abstr. 7Th Europe Nutr. Conf.- 1995, Vienna.- P.123.
40.Вржесинская O.A., Коденцова B.M., Харитончик Л.А., Трофименко Л.С., Спиричев В.Б. Критерии обеспеченности организма детей, больных инсулинзависимым сахарным диабетом, витаминами Вт, В9 и Bg.//Вопр. мед. химии. -1995. -Т. 41, J6G. -С. 58-62. 1 ^
f1.Kodentsova V.M., Vrshesinskaya О.А., Splrichev V.B. Fluorometric riboflavin titration In plasma by riboflavin-bindlng apoprotein as a method for vitamin B, status assessment. // Ann Nutr. Metab.-1995.-V.39,N6.-P.355^360.
42.Пустограев H.H., Коденцова В.М., Харитончик Л.А., Вржесинская О.А., Переверзева О.Г., Якушина Л.М., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Обеспеченность витаминами С, Bj, Bg, Bg и ниацином детей, страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом. // Педиатрия.- 1996.- № 4.- С.33-34.
43.Коденцова В.М., Пустограев Н.Н., Вржесинская О.А., Харитончик Л.А., Переверзева О.Г., Якушина Л.М., Трофименко Л.С., Спиричев В.Б. Сравнение обмена водорастворимых витаминов у здоровых и страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом детей в зависимости от содержания витаминов в рационе.// Вопр.мед.химии.- 1996.-Т.42, Л 2. -С.153-158.
Личный вклад диссертанта состоял в выборе направления исследования, литературном поиске, определении задач, разработке основных подходов и методов исследования, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала. В работах, выполненных в соавторстве , соискатель участвовал на всех этапах исследования, от постановки задачи и эксперимента до обсуждения и оформления результатов.
-
Коденцова, Вера Митрофановна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1996
-
ВАК 03.00.04
- Использование рибофлавинсвязывающего апобелка для биохимической оценки обеспеченности витамином В2 организма взрослых и детей
- Влияние разного уровня витамина Е на продуктивность и воспроизводительную способность баранов-производителей
- Влияние рибофлавинового статуса организма на обмен и биохимические показатели обеспеченности витамином В-6
- Влияние экологических факторов на содержание жирорастворимых витаминов в растениях и организме крупного рогатого скота
- Физиологическая потребность норок в основных витаминах и их нормирование
