Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование приемов генетической инженерии и клеточной биологии для получения новых форм у видов из семейства бобовых и у некоторых других растений

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование приемов генетической инженерии и клеточной биологии для получения новых форм у видов из семейства бобовых и у некоторых других растений"

и ~

Нац1ональна Академж Наук УкраТни Ыститут кл)тинноТ 61ологи та генетичноУ Ыженерп

На прарах рукппису КУЧУК МИ КОЛА В1КТОРОВИЧ

УДК 575.22:577.21:581.143

ВИКОРИСТАННЯ ПРИЙОМ1В ГЕНЕТИЧНО! 1НЖЕНЕР11 I КЛГГИННОТ БЮЛОШ ДЛЯ ОТРИМАННЯ НОВИХ ФОРМ У В ИД) В 3 РОДИНИ БОБОВИХ I ДЕЯКИХ 1НШИХ РОСЛИН

03.00.22 «Клггинна бюлопя» 03.00.15 «Генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

дисертацП на здобуття наукового ступеня доктора бюлопчних наук

КиТв 1998

Дисертац1ею е рукопис.

Роботу виконано у вщдш! кШтинно! ¡нженерп та цитофЬюлогП рослин 1нституту штинно! бюлогм та генетично] ¡нженерп НАНУ та в Ботажчному 1нститул Уншерситету м. Мюнхена, ФРН.

Оф'вдйж опоненти доктор б'юлопчних наук, професор,

член-кор. НАНУ В.А.Кунах, Ыститут молекулярное б'юлоги i генетики НАНУ, зав. вщд1лом доктор б'юлопчних наук А.П.Галюн, Ыститут бюоргажчно! xiMii та нафтох'1МИ НАНУ, зав. лабораторию доктор бюлопчних наук П.А. Орлов, 1нститут цитолог» i генетики HAH Беларусь ст. наук. cnie. доктор бюлопчних наук

Провщна орган1'зац|'я Ыститут агроекологн i

б'ютехнологн УААН

Захист вщбудеться « » _» 199jj>. о ^ год, на

засданн! Спец1алгаовано1 Вчено! Ради Д.26.202.01 при ¡нституп штинноГ бюлогн та генетично! ¡нженерп HAH Украши за адресою 252143, Ки1в, вул. Заболотного 148.

3 дисертацюю можна ознайомитись в б1блютец| ¡нституту ыитинно! бюлогн та генетично! ¡нженерп HAH УкраЧни.

Автореферат розюланий « -3О » _199^р.

Ечений секретар Спец|'ал1'зовано! ради, кандидат бюлопчних наук

Л.В.Тарасенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальнють теми. Розвиток генетично] науки призвш до виникнення ново! сфери дшльносл людини, яка пов'язана 3i зм1'ною генетично! конституцп живих ютот за допомогою нових пщходав та технологий, що об'еднан! пщ загальною назвою генетична або генна ¡нженер!я. Уже зараз у мжробюлопчжй та фармацевтичн1'й промисловосл, в с!льському господарств) використовують штами бактерм, грибов, др!ждж!в, кл1тинн! Л1ни рослин та тварин, сорти рослин, яю було отримано за допомогою генно-шженерних прийомш. Для багатокжтинних ютот, як1 було змйено таким чином, нав1ть виникла окрема назва - трзнсгенж орган^зми. Трансгенн1 органами - це рослини, риби, тварини, та iHuii ¡стоти, що несуть в своему геном! генетичну ¡нформацга, яку було введено за допомогою метод1в генетичноТ трансформаци. Виникнення трансгених оргажзм'1в пов'язано як з розвитком методш власне ген но! ¡нженери, тобто технолог» рекомбинантних ДНК, так i розробкою методв уведення реконструйовано! ДНК у жив1 кл1тини та регенераци з них ф|ЗЮлопчно нормальних багатоштинних ¡стот.

Хоча з моменту опубл1кувания перших повщомлень про отримання генетично модифжованих еукарютичних оргашзм!в (англ. GMO) пройшло не бтыи н!ж п'ятнадцять pokib, за цей час даний науковШ напрямок дав основу для створення цшого ряду комерцШних ф|рм, основною метою яких е створення трансгених ¡стот, яю мають шлий ряд нових корисних ознак. Генетично модиф!коваш сорти рослин вже досл!джуються на експериментальних полях, а деяю вже складають значну частину у валовому сшьськогосподарському продукт! такл" крз!кн г.к США. Так, в 1S97p. трансгенш бавовна, соя i кукурудза зайняли 18%, 13% та 9% вщпош'дно ecix пос1вних площ, на яких вирощувалися ui культури в США. Сучасний розвиток технолопй генетично! шженерп дае можливють припустити, що вже до 2005 року св1товий ринок продажу тшьки насшня трансгених рослин буде складати близько 6.6 ммьярдш доларт для oflHiei компанн "Monsanto". Деяю mmi оцЫки ще бшьш оптимютичш.

Отримання генетично модифкованих рослин для вид!в з родини бобових завжди було в центр| уваги досл'гдниюв, яю працюють в галуз1 молекулярное та юнтинно! бюлог» рослин. Це визначаться рядом причин, серед яких слщ зазначити важливють цих видт для виробництва порвняно недорогого рослинного бтка. Захщна ввропа за рахунок власних pecypciB покривае cboi потреби в продуктах рослинного походження, що мютять бток, лише на 29%. 1нша частина ¡мпортуеться з США, Бразилп, Аргентини у вигляд соевих 6o6iB. Причому споживання таких продукт зб1льшуеться в середньому на 3% в р»к.

Помпне мюце в постачанн! в кражи ЕС матер'|алт ,що мгстять б'ток, займають Укра1на та Роая, чий сумарний експорт за оцжкою захщних експертш доходив до 1.14 млн. тонн зерна гороху. Але за останы роки ця цифра посптйно знижуеться до 321 тис. тонн в 1997р. Збтыиення виробництва бобових культур залежить вщ ряду умов, оджею з яких е широке використання бютехнолопчних пщход1в, зокрема генетичноТ ¡нженерм рослин для селекци нових високопродуктивних ( ст1йких до хвороб, шюдниюв та несприятливих чинниюв навколишнього середовища сортш рослин.

Таким чином, дослщження питань, як/ лов'язаж з вивченням проблем пере-иосу генетично! ¡нформацп у вищ| рос лини; оптимизация прийом'ю I методов отримання трансгених рослин у видв з родини бобових I в зв'язку з цим розв'язання деяких проблем культивування протопласте та регенерацн рослин з кл'пинних культур е певно актуальними I мають вахспиве значения як для кращого розумжня функцюнування живих оргажзмш, так 1 для практичного застосування.

робота виконувалась в рамках бюджетних тем вщцшу цитофююлопТ та клгсинноТ ¡нженерн 1КБГ1 НАНУ "Вивчення молекулярно-генетичних процес'ю у клкинних системах ,що реконструювалися, та трансгених рослинах" i "Вивчення молекулярно- бгалопчних процеав у трансгених та трансгеномних клкинних л!Н1ях та рослинах". Досл!дження також проводилися в межах наукових проектш пргоритетного напрямку 01.11. 00 Бютехнолопя, проекпв Державного фонду наукових дослщжень, проекту програми шдтримки наукових дослщжень у крашах колишнього СРСР М1жнародного наукового фонду (ISF), проекту Свропейського сгквтовариства INTAS, проекту Свропейського Ствтовариства "COPERNICUS".

та аналЬ генетично модифкованих рослин шляхом використання метод|'в генетично! i юитинно? (нженери.

Для досягнення поставлено! мети необхщно було вир1шити наступн'1

• Оптим1зувати методи ¡золювання та культивування протопласте як найзажлив1шо! умови отримання трансгених та трансгеномних форм рослин.

« Дослщити можлиають пщвищення регенерацмноТ здатност! у деяких вид1в з родини бобових.

• Оптим1зувати умови "прямого переносу renis" i генетично) трансформаци за допомогою Agrobacterium tumefaciens для вид^в з родини бобовЫх.

Наукова

Основною метою роботи було отримання

завдання:

• Оптимюувати методи соматично! пбридизацм для вид в з родини

бобових.

• За допомогою молекулярно-бюлопчних i бюхМчних методав довести присутн!сть чужинного генетичного материалу в геномах отриманих рослин.

було запропоновано та апробовано орипналььи способи культивування протопластт та протоколи регенерацП рослин з протокложв комерцмних coptíb люцерни та конюшини. Регекеращя рослин у конюшини може бути отримана як шляхом прямого, так i непрямого ембрюгенезу, що пщтверджено результатами пстолопчного анал1зу. Ц( робота ещкрили можливгсть отримання нових coptíb рослин за допомогою метода соматичноТ пбридизацм та прямого переносу гешв в протопласти рослин.

Незапежно вщ заруб1жних дослщниюв були розроблеы методи генетично! трансформацп шляхом електропорацн протопластов та отримаж трансгенн1 рослини люцерни та кл'ггинн'| лínii col. Молекулярно-бюлопчний аналЬ та анализ активное^ ферменту неомщннфосфотрансферази пщтвердив трансгенну природу отриманих лМй.

Вперше був запропонований та апробований метод, що пщвищуе регенерацШну здатнють у люцерни та гороху шляхом генетично! трансформацп "sh00ty"-MyraHT0M Agrobacterium tumefaciens pGV 2206. В результат! проведених експериментв були отриман! трансгенж регенерац|йн1 лМТ люцерни та гороху, що дозволило запропонувати процедуру "подвмно! трансформацн", що дае можлив'ють отримувати трансгенн'| лЫп цих бобових культур з генами, яю мають практичний ¡нтерес. Цей пщхщ складаеться з деюлькох етапю. Як перший крок пропонуеться отримати лши рослин, здатн! до регенераци в культур! in vitro, за рахунок трансформацп генами Т-ДНК A. tumefaciens. Другий етап - це трансформация отриманих л'/шй, здаты их до регенерацн, певним геном, використовуючи методи як агробактер1апьно? трансформацп, так i "прямого переносу reHie". Третм етап - вщновлення вихщного генотипу, що несе тшьки певний ген, що ц!кавить, за рахунок хромосомно! сегрегаци в наступних г"енерац1ях. Трет1Й етап визначаеться чисто статистичною можливютю ¡нтеграцн reHie Т-ДНК в p¡3Hi хромосоми, як! обумовлюють здатнють до регенерацй, i левних reHie, що цжавлять, шсля повторно! трансформацп. 3 використанням системи "подв1йноТ трансформацп" були отримаж трансгенж форми гороху, яю мютять Ds-елемент кукурудзи, ш,о транспозуеться. U¡ результати вщкривають ц!лком hob'i перспективи в класичнм генетиц'1 такого об'екту як горох та надають

В результат проведено! роботи

можливють для клонування унжальних reHiB ujei рослини за допомогою ¡нсерц1Йного мутагенезу.

Запропоновано та апробовано метод генетично! трансформацп гороху за допомогою неонкогенних штам!в Agrobacterium tumefaciens. Отримаж трансгенж лшн, яю несугь ген спйкосп до гербщиду - фосфшотрщину. Для стабшьного отримання нащадюв у регенератщ гороху було розроблено метод Ыдукцп цвтння та утворення насшня у naroHiB гороху в культур! in vitro. У трансгених лМй гороху цим шляхом було отримано нащадетв. Молекулярно-бюлопчний анап'13 пщтвердив присутнють послщовностей ДНК перенесеного гену в |'енер?Ц1ях генетично модифжованого гороху. Таким чином отриман! лшП гороху, як) меють стмисть до гербщиду, що вщкривае нов1 можливост1 в селекцн такоГ культурно! рослини як горох. KpiM того, власне метод розмноження гороху в культу pi in vitro надое можливють використання методу М1кроклонального розмноження для uiel культури. Такий метод широко використоеуеться для розмноження декоративних та деяких сшьськогосподарських рослин. Використання цього методу для гороху дозволяе незалежно вщ кшматичних умов розмножити ушкальний селекцшний MaTepian без зм'1ни його генотипу 3i значно ошьш високим коефМентом розмноження. Так, розрахунки свщчть, що з одного нагону до кшця року можна отримати до 500 ООО генетично однорщних рослин при щомюячному коефвдент'! розмноження 3.

Отримано асиметричн! соматичш лбриди Mix видами з родини бобових. Показано можливють використання перенесеного гену неом'щинфосфо-трансферази як генетичного маркера для вщбору соматичних пбрид!в у вид'щ з родини бобових.

У сукупност1 ц| роботи, як1 проведено на pieHi cbitoboi новизни, вперше дозволили використати бютехнолопчн! методи для полшшення найважлив!ших сЛльськогосподарських вид'ш з родини бобових. KpiM того, ui дослщження е одними з перших по генетично! ¡нженери рослин, проведених як в УкраМ, так i на територн колишнього СРСР.

люцерни на основ/ сорту «Весело-Подолянська» використовуеться в наукових дослщженнях 1 селекщйжй практиц.1':

• 1нституту цитологи \ генетики СО РАН (м.Новосиб!рськ, РоЫя) -довщка, пщписана директором ¡нституту акад. Шумним В. К.

• Полтавським НПО «Ел'гга» (м.Полтава) - довщка, пщписана зам. директора Браженко I. П.I науковим сгивробаником Иопа А. А.

• ВНД! KopMio 1м. В. P. Втьямса (Московська обл., РоЫя) - акт передач! за шдписами МазЫа В. В. - зав вщдшом бютехнолог)! i клпинноТ селекцп, АгафодоровоТ М. Н., с.н.с. i СолодкоТ Л. А., с.н.с.

Пбридж штинш /liHiT використано в наукових дослдакеннях:

• Селекц1йно-генетичного ¡нституту (м.Одеса) - дов!дка, тдписана зам. директора Серпевим В. В., зав. вщдшом бютехнолоп! Лук'янюк С. Ф.

Модифковаж JiiHiT гороху передан! для випробувань в

• МСКП «Нива» (м.Полтава) - лист, га'дписаний директором д.б.н. професором М. М. Чекаш'ним.

• 1нститут рослинництва 1м. Юрьева (м.Харш) - лист, пщписаний директором [нституту Л. В. Бондаренко та зав. вщдшом селекцм гороху П. М. Чекрипним.

Особистий BHficoK пошукача. Автором виконано експерименти по оптим1зац|? умов культивування протопластов, регенерац» рослин, отриманню трасгенних та трансгеномних Л1н:й. Запропонована щея та здшснена схема «подвмно! трансформации Молекулярно-бюлопчний та цитолопчний анал1зи проведен! разом з сп'вавторами статей, наведеними в автореферат!.

Апробзц1я результата роботи. Результати роботи допов!далися на наступних м!жнародних конгресах, симпоз!умах i конференциях:

• Yllth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture; Amsterdam, The Netherlands, June 24-29, 1990 - стендове повщомлення

• 14 International Conference on Plant Growth Substances; Amsterdam, The Netherlands, July 21-26, 1991 - стендове повщомлення

• All-Union Conference on Trends in Plant Biotechnology; Pushino, Russia, November 20-22, 1991 - доповщь

• 1st Conference on Grain Legumes; Anger, France, June 1-3, 1992-стендове повщомлення

• Vlllth International Congress of Plant Tissue and Cell Culture; Firenze, Italy, June 12-17, 1994 - стендове повщомлення

• IVth European Congress of Cell Biology, Prague, Czech Republic, June 26-July 1, 1994 - стендове повщомлення

• Ith International Symposium on Plant Biotechnology and Genetic Engineering, Kiev, Ukraine, October 3-6, 1994 - доповщь

• Vth International Congress of Plant Molecular Biology, Singapore, 21-27 September, 1997 - стендове повщомлення

• VII International Conference In Vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation, Moscow, 25-28 November 1997 - доповщь

flyñoteauiL Науков! результати по TeMi дисертацп опублжовано в 45 друкованих роботах, що включае 1 монографию, 1 авторське свщоцтво СРСР, 1 брошура методичних рекомендацм ¡ 20 статей, виданих в м!Жнародних, укражських i росШських (колишжх центральних СРСР) журналах. Монограф1Я, яка мае об'ем 8.84 друкованих аркуша, та 3 стагп написаж без cnieaBTopiB.

рб'см та структура роботи. Дисертац1я, викладена на 284 стор|'нках машинописного тексту, складаеться ¡з вступу, двох глав огляду лггератури, трьох глав експериментальноТ роботи, заключения, висновкш, матер!ал1в i метод!в, списку використано! лггератури, шюстративного додатку. Робота мютить 6 таблиць, 29 комбЫованих малюнюв. Б1блюграф(чний список включае 581 лтературних джерел, i3 них 553 на ¡ноземних мовах.

ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦИЯ РОСЛИН - ПРЕДСТАВНИК1В РОДИНИ

БОБОВИХ.

родини бобових. В експериментах по вивченню переносу гежв шляхом елэктропорацп були використаж протопласти, яю вид!ляли з незрших зародив coi. Електропорац^ю проводили за допомогою вдосконаленого нами методу. Виживання протопластт гисля електропорацн склало 50-60%. Культивування протопласпв шсля електропорацн проводили за розробленою методикою (Кучук, 1989). В|дб('р трансформант!в здмснювали на поживному середовивд В5, яке ••¿¡стило 1 мг/л кшетину або БАПу з додаванням 50 мг/л канамщинсульфату. За таких умов було вадбрано 21 колоню, яю були здатж до подальшого росту та зпроможж зеленки при освтаенж. При подапьших пасажах на св!ж1 середовища такого ж складу здатнють до росту зберегли 5 коложй.

Анал1з активност! неомЦинфосфотрансферази показав присутнють цього ферменту у вЩселектованих кттинних лМях. Блотинг пбридизац|я за Саузерном заявила наявнють послщовностей гену неом^цинфосфотрансферази у юнтинних Л1'н1'ях, >iK¡ було проанал|'зовано. Ефективнють генетичноТ трансформацп склала 1 :; 10 е вщ числа протопласте, що було використано для генетичноТ трансформацм (Кучук та ¡нш., 1990).

В ¡нший cepií експериментш по електропорацн калусних протопласте конюшими лугово? були BUKopHCTaHi аналопчн! умови, що i для протопластш coi. При подалышй селекц» були вдабраж cím штинних лЫ1й, як1 зберегли активний

рют в присутност! канамщинсульфату. Анаш'з активное™ неом!цинфосфо-трансферази показав наявнють цього ферменту у в!д1браних кттинних лш!ях.

Проведен! експерименти довели принципову можливють отримання переносу гент у вид!в з родини бобових шляхом електропорацм протопластт. Надал! нам вдапося використати елекропорацю протопласте для отримання трансгених рослин люцерни.

Люцерна п!вжчна (МесНсадо ЬогеаНэ I-.), найближчий родич люцерни поавно!, е одним з культивованих представник'ш цього виду, особливо в зонах пом'|рного кл!мату. В одному дослщ! по електропораци використовували 1-2 х 105 протопластш люцерни гивжчноТ, видшених з листя асептично вирощених рослин лЫн 94, що була отримана з ВНД1 корм1в Тм. В. Р. Втьямса, п/о Лугова, Московська обл. Пюля переносу штинних коложй люцерни на агаризоване поживне середовище, що мютить 50 мг/л канам!цинсульфату, було ввдбрано 56 клошв, яю були здатн1 до подальшого росту та спроможш зеленки на св!тл1. Ц| колонн переносили на св^же поживне середовище такого ж складу, \ тшьки 15 клон1в продовжували активно рости. У вс!х проанал1зованих кл!тинних каложй була виявлена активжсть неом'щинфосфотрансферази. Надал! у п'яти цих кложв на поживному середовищ! В5, що мютить 0.5 мг/л кшетину I 50 мг/л канамщинсульфату, було ждуковано утворення ембрющт, а пюля цього I нормальних рослин (КисИик е1 а1., 1990).

Проведен! нами експерименти вперше показали можливють отримання трансгених рослин у люцерни шляхом електропораци протопластт. Ця робота дос1 залишаеться единою, що описуе отримання трансгених рослин цього виду за допомогою електропораци протопласта.

Цжаво вщзначити, що в ус!х проведених експериментах по електропораци протопласлв, ¡зольованих з рослин вид!в з родини бобових, юльюсть канамщинстшких кл!тинних клошв, що вщбираються спочатку, значно зменшуеться п!сля перенесения на св!ж1 поживж середовища того самого складу. Ц! результата свщчать про можливють нестабильно? ¡нтеграцн чужинних ген!в в геном рослин або ж про 1х ¡нактивацпо за рахунок р!зноман!тних механ!зм|'в, одним з яких може бути метилювання ДНК.

Проведен! експерименти по електропораци протопластш вид!в з родини бобових свщчзть про можливють застосування цього методу для генетично? трансформацп цих вид|'в, за умови наявност! розробленоТ методики культивування протопласт!в. Метод електропораци протопласта являе собою один з п!дходш генетичноТ трансформацп рослин ¡, хоча в!н мае обмежене застосування, одночасно у нього е I ряд переваг пор!вняно з трансформащею за

застосування, одночасно у нього е \ ряд переваг пор'шняно з трансформац!ею за допомогою АдгоЬайепит й1П^ас1епэ. Так, застосування цього методу не е видоспециф1чним, на вщмшу в'щ метод!в, що базуються на використанн! "обеззброених" штампе А. Юте1ааеп5, яю досить часто бувають ав1рулентними по в^дношенню до р1зноман1тних сорта I виде рослин. Окр1м трансформацй ядра, метод електропорацн протопласта можна застосовувати для генетично! трансформацн хлоропластно! ДНК, що вщкривае ц!лком нов1 перепекшей в отриманн! високого р!вня експресн чужинних ген!в в рослин!, I одночасно обмежуе безконтрольне розповсюдження цих генш з пилком.

В результат') перших на територП СРСР експеримент'ш по генетичжй трансформацн рослин, яю були проведен! в 1984-1985 роках у вщдМ цитоф!зюлоги та штинно? ¡нженерн 1нституту боташки, були вщпрацьован1 методи генетичноТ трансформацн тютюну, основан! на використанн! А. Шп^ааепэ (Кучук та Каневский, 1987).

LB

RB

5 7 2

4 6а 6Ь

Km insertion

t

pGV 2206

Рис 1. Схематична карта плазмщи рй\/ 2206. Гени 1-2 складають локус ! кодують ферменти синтезу ауксин!в. Ген 4 складае локус 1тг кодуе ген синтезу цитокМнш. Ген 3 кодуе октошнеинтетазу. Ген 6а кодуе фермент, який зизодить опти за меж1 рослинно? клггини. Ген 6Ь кодуе ознаку п1двищено7 регенерац!йно'| здатност! у рослин. Функци ген1в 5 та 7 остаточно не з'ясовано.

бобових. Проведен! до с л щи по регенераци рослин у кл1тинних л(Н1й Medicago sativa L. сорту "Веселоподолянская" на р1зноман!тних поживних середовищах були безрезультатними. Для ждукцм здатност: до регенераци у цього сорту люцерни було запропоновано спробувати використати "shooty''-мутант Agrobacterium tumefaciens pGV 2206. Цей мутант був отриманий наприюнц! 70-х poKiB в результат! ¡нсерцп ¡нактивуючо! послщовнооп, що мютить ген бактериально! ctíhkoctí до канамщину, в район геж'в синтезу ауксижв Т-ДНК OKToniHQBoro штаму В6 A. tumefaciens (Рис. 1). PaHiuie було встановлено, що пюля генетично! трансформацм тютюну з використанням цього агро-бактер|'ального штаму, вдалося отримати wiíthhhí лМТ, що активно утворювали пагони.

П|'сля спшьного культивування експлантш люцерни з "shaoty"-MyraHTOM А. tumefaciens pGV 2206, були ¡ндуковаж клггинж Л1нн на поживному середовииу В5, яке м!стить 0.2 мг/л 2.4 D i 0.5 мг/л кжетину, а також антибиотики - клафоран та карбежцишн - для ел1мшацм агробактерш. Kjiíthhhí лжи, як! утворилися, пересаджували на св|'же поживне середовище того самого складу i культивували протягом мюяця, а ш'сля цього переносили на безгормональне середовище В5. Через мюяць вирощування на цьому середовищ'| клггинж лМ! люцерни починали утворювати ембрюпод!бн! структури темно-зеленого кольору. Пюля пересадки цих структур на свЬке поживне середовище того самого складу з вадбраних 42 лМй проросли i дали нормальж рослини лише шють. При пересади! на С81Ж1 безгормонапьж' поживж середовища sepxisKH пагожв, що мютять боков! бруньки, були здатж утворювати кореж, але цей пронес був бшьш тривалим, жж при пересадц: narohíb вихщного генотипу. В контрольному експеримент! при дотриманн! Bcix умов вирощування, за винятком спшьного культивування з "shooty''-мутантом A. tumefaciens, на безгормональному поживному середовиицг miiTHHHi Л1нм люцерни жодних ембрюадв не утворювали, лише у деяких клошо спостер!гапи розвиток корежв.

ICniTMHHi культури, ¡ндукован! з рослин люцерни, отриманих пюля регенераци, також збергали здатжсть до ембрюгенезу. Одержан! рослини переносили в грунт, де вони цвши та утворювали життездатне насЫня, яке збер'гало при перенос!' !х в культуру in vitro здатжсть до регенераци рослин.

Для доказу присутност! послщовностей Т-ДНК плазмщи pGV 2206 в рослинах люцерни, яй були отримаж пюля регенераци, була проведена Саузерн-блот пбридизацт. Як зонд використовували ген ctíhkoctí до канамщину, структурна частина якого була присугня в Т-ДНК плазмщи PGV2206. В результат! проведених експеримент!в було показано присутжсть послщовностей Т-ДНК

плазмой рС/2206 в геном! вдабраних рослин люцернй, що доводить !х трансгенну природу (КисИик й а1., 1990).

Проведен! експерименти дозволили зробити висновок, що здатнють до регенерацм у трансгених рослин люцернй могла бути викликана генами Т-ДНК «з1юо1у»-мутанта А. tumefacieпs рвУ 2206.

Отриман1 результати дозволили сформулювати новий п'щхщ для пол!пшення регенерац(йно1 здатност у рослин з низьким регенерацшним потенц!апомполягае в наступному. Запропонований метод, ям було названо «1юдв;йн0ю трансформацию», був використаний для трансформацн такого взжливого сшьськогосподарського виду як горох.

В експериментах використовували лМю гороху 1288, що мала певний регенерац|'йний потенц!ал, але в систем! вщбору на безгормонапьному поживкому середовищ! не виявляла жодних ознак утворення пагонш. Пюля спшкультивування експлантш З! стебла та листа асептично вирощених рослин гороху лжн 1288 з " Б1юо1у" -мутантом А. tumefacieпs рв\/ 2206 на поживному середовищ1 В5, що мютить ф1тогормони {2.4 Д та БАП) було индуковано калус. Через один мюяць культивування калус, що утворився, був пересаджений на безгормональне поживне середовище. В деяких дшянках капусно! тканини почали утворюватися осередки регенерацм у вигляд1 темно-зелених крапок. При лодалышй пересади! Ц1 осередки утворили штинш лгтТ, яю стабшьно утворювали пагони. Таким чином вдапося вщ!брати 12 л|"н1й гороху, здатних до регензрацй, яга поопйно утворюють регенеранти на протяз! тривалого часу. Так, одна з цих первинно отриманих лшШ пщтримуеться без втрати регенерацтно! здатност! протягом восьм1 роив. Молекулярно-бюлопчний аналю з зикористанням блот-гШридизаци за Саузерном показав присутнють посл!довностей Т-ДНК у геном! вЩбраних регенеращйних лш!й гороху (Зубко та !нш„ 1990).

Дослщжуючи можливють застосування запропоновано! нами методики по ждукцм регенеращйноТ здатност: у гороху пюля сп!вкультивування з "зЬоо1у"-мутантом А. 1ите!ас1епз, в експериментах по генетичшй трансформацн були ви:;ористан'| вюм сортових Л1Н1И голландсько! селекц¡1, отриманих вщ ф!рми "ЫипИетБ Zaden" (Нщерланди). Пюля сп!вкультивування рослинних експлантш э "з1"юо(у"-мутантом А. ШтеТас'шпз рС\/ 2206 нам вдалося у трьох з восьми зразюв о тримати л!ни гороху з високою регенерацмною активнютю. Ц1 л ¡ни були назван! 312097-2206, 912074-2206 ! 911136-2206.

На наш погляд, незважаючи на ва обмеження, розроблений метод стримання здатних до регенерацм лМй у гороху та люцернй, дозволяв подолати

проблеми, пов'язаш з труднощами ¡ндукцн утворення рослин з дедифере-нцмованоТ тканини в культур! in vitro. Цей пщхщ був усп1шно застосований для отримання трансгенних рослин гороху, що несуть pi3HOMaHÍTHi генетичж конструкций як) представляють ¡нтерес як для фундаментально! науки, так i для практичного застосування.

кукурудзи* Одним з можливих п1дход:в для ¡золювання унжальних послщовностей ДНК е пошук i клонування ген'(в за допомогою транспозожв - генетичних елеметтв, що транспозуються (gene tagging). Серед рослинних транспозожв найбмьш вивченою е родина мобшьних Ac/Ds елеменлв кукурудзи. Тому, найчасп'ше вони використовуються як система гетеролопчних транспозожв в експериментах по клонуваннга renia.

Незважаючи на те, що коло рослин у яких працюе гетеролопчна система транспозожв Ac-Ds кукурудзи, послйно зростае, одночасно i дотепер немае публжашй, що описують подЮж експерименти у гороху. Необидно зазначити, що горох е одн!ею з сшьськогосподарських зернобобових культур, яю найбшыи широко використовуються, з добре вивченими i картованими хромосомами. Цей вид е представником родини бобових, що мають одну з унжальних генетичних систем симбютично! фксацй' азоту. Пошук i клонування унжальних ген!в гороху, зокрема reHie симбютично! фжсацп азоту, з використанням гетеролопчно? системи транспозожв е достатньо привабливим як з точки зору фундаментальна, так i прикладних дослщжень. KpiM того, у гороху i дотепер не описан! функцюнуюч! транспозони, хоча транспозонподабж послщовност) ДНК були виявлеж в його reHOMi при вивченн! "менделевськоГ мутацп -зморшкуватють насЫня. Як перший крок при клонуванж ужкальних reHie з використанням методу "gene tagging" необхщно було отримати трансгенж рослини гороху, що мютять Ds-елемент кукурудзи.

Для отримання трансгенних рослин гороху ми використовували pi3HOMaH¡THi шляхи введения ДНК в рослинж клггини. Одним з методов була електропорац!я протопласта гороху в присутност! плазмщи pSK3 (Рис. 2). Ця конструкщя була люб'язно надана Dr. J. Hille (Вшьний ужверситет, м. Амстердам). Спочатку на селективному середовищ'|, що мштить 50 мг/л канамщинсульфату, було вобрано 42 колонм, hkí зеленши при осв'нленж. При подальшому вирощуванж на поживному середовищь що мютить селективний агент, було вобрано 7 стабшьно стгйких до канамщинсульфату клонт.

Ctíííkí до канамщинсульфату клони перев1ряли на наявжсть неом'щинфосфотрансферази за допомогою антитш, специф^чних до цього бтку,

використовуючи стандартний Ha6ip для ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay), отриманий вщ компанм '3'-5'" (США). Отримаж даж показали наявнють бшку NPTII у клонив гороху, вадбраних пюля елекропорацм протопластш.

Ds element

|—-1 Km I-1 GUS -—I

LB 4N NPTII )—IH HPTII T-fH TmS-2 |—RB

pSK3

Рис 2. Схематична карта плазмщи pSK3. Плазмща мютить ген спикост! до канамЩинсульфату NPTII для вщбору трансгенних рослин. Mix промотором i структурною частиною гена стШкост; до пгромщинсульфату (HPTII) вбудована послцювнгсть ДНК, що обмежена Ds повторами i метить ген р-глюкуронщази (GUS). Ексциз>я посл'щоаност! ДНК, обмежено!' Ds повторами, повинна приэводити до появи рослинних клпин, як1 мають сттмсть до пгромщину. Для швидко! детекц|1 первинних трансформант1в служить репортерний ген ß-глюкуронщази (GUS).

Подальший анализ трансформаттв проводили за допомогою анализу пол!меразно1 ланцюгово! реакцп (ПЛР - PCR). Bei вивчен1 трансгенн! клони давали в результат) ампл1ф1кацм фрагменти ДНК необхщного po3Mipy (189 п.н.), при використанн) праймерш, специфЫних до 35S промотору.

Для подальшого доказу ¡нтеграцп ДНК плазмщи pSK3 в геном гороху проводили блотинг-пбридизацго за Саузерном. Даж, отримаж нами, служать доказом ¡нтеграци в геном гороху гена NPTII, що входить до складу плазмщи pSK3. До того у Bcix семи вадбраних кложв ген входить до складу фрагменту

розмфом приблизно 7 тис. п.н. Жодних смуг пбридизацм не було виявлено у ДНК контрольно? нетрансформовано? рослини (Рачек и др., 1994).

Проте одночасно анал!з активное^ GUS гена у вдобраних клонах не виявив присутност! активное^ ß-глюкуроншази. Для перев!рки можливого ¡нпбування активносп цього гену за рахунок метилювання запишив цитоз!'ну в ДНК трансформованих кл'ггин, вщселектован! калуси вирощувапися протягом 2 тижжв на поживному середовищ!, що мютить 5'-азацитщ1н. Пюля цього калус, який формувався на середовищ1 з 5'-азацитщшом, мав GUS позитивну реакцто. Таким чином було встановлено, що додавання в поживне середовище деметилюючого агента, яким е 5'-азацитдон, вщновлюе активнють перенесених ген!в. Цей факт свщчить про можливють ¡нпбування активносп перенесених гежв за рахунок метилювання залишюв цитоз1ну в ДНК ядра.

Отримаж результати по вщбору трансгених л;н1Й гороху вперше показали можливють використання канам!цинсульфату як селективного агента для вщбору трансформант1'в у цього виду.

Трансгенж пагони гороху,як! мали вбудований Ds-елемент кукурудзи, були отримаж шляхом генетично! трансформацП' за допомогою А. tumefaciens. Плазмща pSK3 була ¡ммобМзована в А. tumefaciens, що несе плазмщу рМР 90 з Vir - областю. Отриманим агробактер1альним штамом було трансформовано лЫ|'ю гороху 1288-2206-12 з високим регенерацмним потенщалом, яка була ¡зольована нами ражше гпсля генетично? трансформацп "shooty''-мутантом A.tumefaciens pGV 2206 (Зубко та ¡нш., 1990). Июля трансформацн було вщШрано 23 клтанних л)нн, ст>йких до канамщину. Згодом на безгормональному поживному середовищ! було отримано 5 регенерантт.

Проведений молекулярно-бюлопчний aHani3 з використанням noni-меразно? ланцюгово! реакцм, Саузерн-блот пбридизацм та ¡муно-ферментного анал!зу накопичення бтку NPTII повн'ютю довели трансгенну природу отриманих канам!цинст1йких регенерантт гороху. Також була показана присутнють мобшьного Ds-елементу в renowi встбраних рослин шляхом Саузёрн-блот пбридизацм з використанням лослщовностт ДНК самого Ds-елементу як зонду (Рачек та ¡нш., 1995).

Пщсумовуючи викладене вище, можна стверджувати, що вперше доведена можпивють отримання трансгених naroHie гороху з Ds-елементом кукурудзи. Також, була показана можливють використання канамщинсульфату як селективного агенту для вщбору трансгених рослин гороху.

Зджснеш експерименти вщкривають hobí перспективи в генетии,!' такого об'екту як горох та дозволяють клонувати ужкальш гени за рахунок використання методу "gene tagging".

експериментш було отримання трансгенних coptíb гороху, що несуть ген ctíhkoctí до фосф'шотр'щину - нового гербщиду вдомого також п'|д назвою BASTA або глюфозшат аможю. Для uieí роботи були використаж здатж до pereHepauii лжи 912097-2206, 912074-2206 i 911136-2206, отримаж ражше у copTiB голландсько! селекцп шляхом трансформаци штамом A. tumefaciens pGV 2206. На основ! вектору pGA472 була сконструйована плазмща рКЗ, яка несе як ген ctíííkoctí до канамщинсульфату, так i ген ctíükoctí до фосфжотрщину. KpiM того, надал1, ми також використовували конструкцп A. tumefaciens рНое 106/рЕНА 101 i A. tumefaciens рНое200/рЕНА101, як1 несуть лише ген ctíhkoctí до фосфшотрщину. Bei ui конструкцп були перенесен! в штам А. tumefaciens С58С1, яка мютила плазмду рМР 90. Отриманими бжарними векторами були проведен! експерименти по трансформаци вищенаведених л!жй гороху.

Пюля генетично! трансформаци з використанням цих конструкцм у л!н!й гороху 912074-2206 i 912097-2206 були вадбраж трансформанти гороху, яю ростуть та зепешють в присутнооп 10мг/л фосф'шотр'щину. За допомогою погшеразно? ланцюгово! реакци (ПЛР), де як праймери використовувались як посл'|доаност1, яю специфнно вшзнають 35S промотор, який входить до складу химерного гену ctmkoctí до фосфжотр'щину, так i праймери, специф!чж власне до синтетичного гену ctíükoctí до фосфжотрщину, була показана присутжсть nocfliflOBHOCTi ДНК перенесеного гена у вцубраних юнтинних лж!ях. 3 цих лМй були отримаж регенеранти, апе процес утворення корежв у них був ускладкений, що не давало можливост! отримати наежня шляхом висадки в г'рунт вЦубраних рослин.

Проблему отримання нащадюв з насшня у трансгених naroHÍB гороху ми виршили шляхом, вщмжним вщ описаного будь-де. Виявилося, що при вирощуванж Тх на безгормональному поживному середовиий в культуральних банках об'емом 250 мл за умов газообмжу з навколишжм повггрям, вони починають цв1сти безпосередньо в культур! in vitro без утворення корежв. У подальшому з цих kbítok зав'язуеться невелике, але цшком повноцшне наежня, г.кэ можна як переносити в фунт, так i висаджувати знов в асептичнш культур! на пожиэних середовищах, як! мютять селективний агент для переварки ctíhkoctí до фоофжотрщину. За допомогою цього методу ми отримали нащадюв у трансформованих л1н1й гороху. Анашз успадкування ознаки ctíhkoctí до

фосф|'нотрщину показав, що частина нас1ння, яке було отримано у одьш з трансформованих лМй 912074-2206, стабшьно збергала його до друго! Генерацп включно (Табл. 1). Ц1 результата переконливо доводять можливгсть отримання трансгенного настня у гороху, яке несе ознаку стЮкост1 до герб!циду. Таким чином були отримаш генетично змжен! рослини гороху та Тхн! нащадки з використанням орипнально! системи переносу генш, що була названа нами "подвмна трансформация".

Таблиця 1. Успадкування ознаки спйкосп до фосфЫотрщину у трансгенних рослин гороху.

Т2 генерац!я, переварено настня

ЛМя Т, генерация, Висаджено Проросло Збер1гало Кшьюсть

гороху кшьюсть насЫня з на середо- здатшсть рости ПЛР-

наання кожно! Т, ВИЬЩ 3 на середовииу позитивних

рослини ВАБТА з ВАБТА*

912074 4 (1 не 12 10 3 2

-2206 проросло) 23 19 6 6

12 7 5 3

Всього: 47 36 14 11

*ПЛР анал!з ва'х рослин, ям втратили здатнють рости в присутнооп фосфЫотрщину, не дав позитивного сигналу у жодноТ з них.

Запропонований метод "подвмно! трансформацм" дозволяе з високим ступенем ефективност) отримувати генетично змшен1 рослини гороху. Кр!м того, вобран! трансгенн! рослини збергають високу регенерацмну здатнють, що дозволяе використовувати 1х в лодальших генно-мженерних експериментах. Таким чином, орипнальж розробки по генетично трансформаци гороху з достатньо великим ступенем надйност1 дозволяють проводити генетичну трансформац1ю гороху, а отриман! стШю до гербщиду рослини можуть бути використаж в практиц! сшьського господарства.

1 2 3

12 s i a « t

4

5

6

Рис. 3. Схема отримання трансгенних рослин гороху - «подв!йна трансформация. 1 - лш)я гороху, здатна до регенерацн; 2 - селекшя Л1Н[й, опйких до фосфЫотр'щину; 3 - регенерац1Я пагону трансгенно'| л!нм гороху; 4 -цвЫння отриманих л!жй в культур! in vitro; 5 - насшня гороху, отримане в культур! in vitro; 6 - молекулярно-бюлопчний анализ (ПЛР) рослин друга? генераци.

зикоркстанням Ri плазмщи з A. rhizopenes. 3 метою вивчення впливу renie плазм'уди Ri, вид'тенсн з A. rhizogenes, на органогенез у вид'т з родини бобових буз проведений ряд експериментю по трансформацп гороху i люцерни хлшлевыдно! штамом A. tumefaciens С58С1, ям м'ютять плазмщу pRiA4, а також плазмщу pGA 472, що забезпечус епйысть до канам1цинсульфату у отриманих трансгенних рослинних л!н!й.

Люцерна хмелевидна (Medicago lupuiina) - один з дикорослих в и Ai а люцерн - представляв особлизий ¡нтерес як можливий донор ознаки самозапилення, яка вщсутня у культурних вид1в люцерн. 8 той же час цей вид не схрэщуеться звичайним статевим шляхом з культурними видами люцерни. О творения трансгенних л'жш у цього виду - люцерни хмелевиднсй, що несуть ■¿злективн! ознаки в культур! in vitro,е безперечно цжавим для експеримент!в по „оматичжй пбридизацн з ¡ншими видами люцерни, що використовуються в .~'1льському rocnoflapcTBi.

Таблиця 2. Трансгенн1 wiíthhhí л'жн i рослини вид!в з родини бобових, отримаж в 1КБП

Рослинний Вектор Селективна Cnoc¡6 Форма

вид- лМя ознака трзнсформацм трансгенно! лЫп

Medicago pGV2206 Здатнють до Agrobacterium Фертильн!

sativa- Весело- регенераци tumefaciens рослини

Подолянська

Pisum sativum

-1288 pGV2206 Здатнють до Agrobacterium Фертильн'|

регенераци tumefaciens рослини

-911136 PGV2206 Здатнють до Agrobacterium Фертильн1

регенераци tumefaciens рослини

-912074 PGV2206 Здатнють до Agrobacterium Фертильж

регенераци tumefaciens рослини

-912097 PGV2206 Здатнють до Agrobacterium Фертильн1

регенераци tumefaciens рослини

Pisum sativum pSK3 CTMXiCTb до Agrobacterium Пагони

-1288-2206-12 Ds-element канам!цину tumefaciens

Pisum sativum

-912074-2206 pK3 Ст|йк|сть до Agrobacterium Фертильж

BASTA tumefaciens рослини

-912097-2206 pK3 CriHKiCTb до Agrobacterium Фертильн1

BASTA tumefaciens рослини

Medicago pRiA4# Сп'йюсть до Agrobacterium Культура

lupulina pGA472 канамщину tumefaciens коренш

Medicago pGA472 Ст1йк1сть до Електролорацш

borealis - 94 канамщину протопласт'^ Рослини

Giycine max pGA472 Стмюсть до Електропорац1я

канамщину протопласте Кал ус

Pisum sativum pSK3 СпЙЮСТЬ до Електропорац|я

-1288-2206-12 Ds-element канамщину протопласте Калус

В результат! проведених експериментш по кокультивуванню експлантш гороху 1 пюцерни хмелевидноТ з А. 1ите(ас1епэ рИ|А4 рвА 472 на безгормональному поживному середовищ!, що м!стить 50 мг/л канамщинсульфату були виубраж юитинж л1н(7, ям активно росли. При подальших пересадках на поживж середовища того же складу частина цих лш[й

активно утворювапа корень характера по морфологи для захворювання "бородавчаст! корен!", що звичайно викликаеться А. гЫгодепез. Частина отриманих канамщинстмких кложв лгоцерни I гороху росли у вигляд неорган!зовано| юнтинно! маем. ВщЮраж культури кореж'в у обох вид(в не утворювали ембрющщ або пагон!в як на безгормонапьних поживних середовищах, так ! при додаванн! цитомшжв. Анал!з активност! неомщин-фосфотрансферази показав присутн!сть активност! цього ферменту в отриманих юптинних л1жях.

Ц! експерименти дозволили нам встановити, що види з родини бобових так! як горох \ люцерна хмелевидна пюля трансформаци плазм!дою №А4 утворюють корен!, що активно ростуть ! е типовими для трансформашчв, отриманих з використамням А. гЫгодепеБ. ВщШраж лшп культури корежв у обох вид'|в мали неом!цинфосфотрансферазну активнють, що пщтверджуе Тх транс-генну природу. ЖодноТ ознаки органогенезу або ембр!огенезу у отриманих л!жй виявлено не було.

КУЛЬТИВУВАННЯ ПРОТОПЛАСТ1В, КЛ1ТИННИХ Л1Н1Й I РЕГЕНЕРАЦ1Я

п ласта найважлив1ших с!льськогосподарських видв, що належать до родини бобозих, завжди було в центр! уваги дослщникш, akí працюють в галуз! клгтинно! бюлогп рослин.

В експериментах, що розпоналися в 1985 pou¡, основну увагу було придшено розробц! cnoco6ie культивування протопласте, ¡зольованих з тканин Ытактних рослин coi. Отримання достатньо велико! ктькост! протопласт!в з рослинних тканин s одн!ею з основних проблем, з якими стикалися дослщники П1Д час розробки способ!в культивування протопласта у coi. Використання лиош& рослин, що виросли в асептичних умовах, як джерела для вид1лення протопласте, не дозволяло виршити цю проблему. Проте така можливють мае .viicue у багатьох вид!в з ршоманиних родин, серед яких е i види з родини бобозих. Незалежно вщ аналопчних повщомлень ,що з'явилися згодом, був оозроблений метод культивування протопласта coi, який полягае в використанж (!3зр:лих зародюв як експлант. В експериментах були використаж незрим заредки coi розм1ром вщ 2 до 10 мм.

Июля очищения протопласти з незрших зародк!в coi культивували в í юдифжованому поживному середовиищ КМ8Р. Перше дшення протопласта шдбувалося на 2-3 добу культивування. На п'яту добу культивування суспензию

РОСЛИН У ДЕЯКИХ РОСЛИННИХ ВИД1В,

Видшення i культивування прото-

протопласта розбавляли разним об'емом поживного середовища В5 з 0.35 М мантолом як осмотика i фтогормонами: 0.2 мг/л 2.4 Д i 0.5 мг/л юнетину або БАПу. В и>й cywiiiii протопласти продовжуаали дшитися i утворювали мжроколони з 5-10 Ытин. Через 2-3 тижн! пюля першого розведення мкроколонн со? розводили ртним об'емом того ж середовища С з 0.25 М мажтолом i такими ж самими ф!тогормонами. В цих умовах м1кроколон1? продовжувапи розвиватися, утворюючи 50-100 ioiíthhhí колони. U¡ колони за допомогою nactepiscbkoí шпетки нашаровували на щшьне поживне середовище С, що мютить 1 мг/л БАПа або юнетин, i переносили на свггло (4000лк) з 16 годинним свгаовим периодом. В таких умовах ioiíthhhí коло nil со? продовжувапи розвиватися i набували темно-зеленого забарвлення. Отриманий препарат протопласта соТ вщр1знявс< високою здатнютю до подшу, що дозволило використати ц! протопласти дгя ¡ндивщуального культивування в м!крокаплях обемом 100 нл, з найвищою в nop¡bh«hh¡ з ¡ншими видами, що дослщжувалися, ефективнютю подшу , «а досягала 46% (Кириченко та ¡нш., 1990)

Для видтення протопласте у деяких ¡нших вид'ш з родини бобов'ix як експланти брали листки рослин, що росли в асептичних умовах. Для ферм' нтаци як осмотик використовували сумки píbhhx об'емт розчину W5 i модифкг ваного поживного середовища КМ 8р з тим же складом пекто- i целю/нтичних фермента, яка добре себе зарекомендувала дня видшення протопласт!// со?.

Культивування проводили на тому ж поживному середо/Чищ(, що використовували i для протопласта coi. Перше дшення протоплас/ в гороху, люцерни i конюшини вщзначали на 2-3 добу культивування. У протопласта люпину i "голубиного" гороху Cajanus cajan nepuii дтяння спосте/Лгали на 5-6 добу культивування.

Ефективнють висюу протопласта у р1зних в ид! в з родин/« бобових була неоднаковою. Найбшьш активно дшилися протопласти coi, i з досить низькою ефективнютю протопласти люпину. При культивуванш на пожи^них середовищах

з пщвищеним bmíctom umtokíhíhíb wiíthhhí культури "голубино' о" гороху ¡ люпину

i

утворювали зелет колон», з яких не роэаивалися пагони, а у люпину спонтанно виникали структури, схож! на корени У калусних л!н1й /ороху, отриманих з протопласта з дуже низькою ефективнютю, вдавалося ¡ндукувати утворення naroHiB (Кучук, 1989; Sarangi et al., 1992).

У вид1в з родини бобових, що належать до групи фуражних або пасовищних, вдалося отримати стабшьну регенграцто рослин з протопласта. Так, у люцерни на поживному середовищ! J з 0.5 мг/л юнетину у 20%

висаджених колон!й було ¡ндуковано утворення ембрю^в, що в подальшому формували нормально рослини на безгормональних поживних середовищах.

Таким чином, нам вдапося розробити методи видклення ! культивування протопласте для в ид ¡в з родини бобових. Повнютю була виршена проблема отримання достатньоТ ктькост! кл!тинних колоний. Разом з тим питания Ыдукци високо! ефективност! регенерацм рослин у отриманих клонив вимагае додаткових зусиль.

В сп|'вр0б|тництв1 з Боташчним 1нститутом Уншерситету м. Мюнхена був розроблений метод культивування протопластов i регенераци рослин для Oenothera hookeri (Kuchuk et al., 1998). В иди цього роду мають ряд унжапьних генетичних ознак, серед яких двубатькшське успадкування цитоплазматичних ген'|в, можливють отримання мЬквидових пбридш, феномен комплексно! гетерозиготност). Система культивування протопласта Oenothera грунтуеться на швидкому эниженж концентрацй осмотика в поживному середовищь де культивувалися 4-5 - денш м!кроколони. Ц'| експерименти в'щкрили можливють для дослщження ядерно-цитоплазматЫних взаемод1й з використанням метод1в соматичноТ пбридизацн i трансформаци хлоропластно! ДНК у такого модельного об'екта як Oenothera.

рэгенерацн рослин в культур! in vitro у тако! широко розповсюджено! кормовоТ рослини з родини бобових як конюшина лугова було проведене пстололчне вивчення утворених регенеранпв.

В po6oTi були використан! мезофшьш протопласти конюшини як первинн! одноюитинн! структури, що дозволило моделювати систему регенераци рослини з oflHiei клпини. В npoueci культивування мезофтьних протопластов, видтених за розробленою нами методикою, було виявлено, що при ефективност утворення ш'тинних коложй, що досягав 30% вщ юлькост! видлених протопласта, лише t ,5% вщ 1х кшькост! були здатж до подальшого розвитку з утворенням соматичних ембрющ|'в. Ц! структури не утворювали жодного пром!жного калуса, i ембрю'щи безпосередньо розвивалися в пагони. Отримаш результати стали свщоцыом можливост! ¡ндукцн прямого ембргогенезу з протопласта конюшини, що гедтзерджуе ппотезу про можливють ¡снування проембрюнальних кл!тин в согиатичних тканинах листа конюшини. Надал!, пряме отримання повноц!нних рослин з проростюв стикнулося з ускладненнями, i цей процес здйснювався d-'яяхом ¡ндукцм вторинного соматичного ембрюгенезу.

Процес утворення вторинних eM6pioifliB у конюшини був також вивчений за допомогою пстолопчного анализу. Проведен! спостереження показали, що

утворенню ембр^садв передуе виникнення проембрЮгенних труп юптин, як! розвивалися з oflHiei або багатьох сусщських великих, дуже вакуолюованих клггин. Проембрюнальж групи юнтин являли собою дрЮнокл!тинж структури з щтьною цитоплазмою i досить великими ядрами i ядришками. Соматичж ембрющи виникали з одже! або декшькох кл!тин цих структур. 1жц!апьж юитини ембр!ощ1в в!др(знялися вщ навколишжх wi'ithh потовщеною оболонкою, що простежувалося у подальшому на дуже ранжй стадм 1хнього розвитку. Стадн розвитку соматичних ембрюцув конюшини схож! з класичними, описаними як для зиготичного ембрюгенезу, так i для соматичного ембрюгенезу моркви. Цшком ч!тко видшяються глобулярна, серцевидна, торпедовидна стад!!, а також стад ¡я проростання. В результат! утворюються бтолярж структури 3i стебловим i кореневими апексами.

Разом з тим в розвитку соматичних ембр'юадв конюшини спостер1гався ряд вщммностей в!д процесу утворення зиготичних ембркадв. Так, ембрющи, що сформувалися з оджеТ клггини, мапи бшьш витягнуту базальну частину, що закртлюе Тх в материнськШ тканиж ембрюнального комплексу. Можливо, ця структура виконуе роль пгдвюка, i П багатоклаинна структура виникла вже гид час найперших стад|й соматичного ембрюгенезу конюшини. У зиготичних ембрющш конюшини пщвюок також багатокл'ггинний, але формуеться BiH на ni3Hiujifl глобуляржй стадм. В той же час в формуванж соматичних ембр'юдав спостер|'галася повна диференц1ац1я за часом утворення пщвкжа. Частина з них, так як i зиготичж, формувала багатоклпинний гадвюок на ni3Hiii глобуляржй стадп, i BiH простежувався в торпедовиджй стадм i flani в перюд проростання. По Mipi розвитку ембрюща кл'ггини шдвюка залишалися др!бними i щшьноплазменними, в той час як клггини власне ембрюща ставали бшьшими i дедал1 сильжше вакуолКзованими, що характерно для соматичних ембрющш, як! розвиваються в умовах in vitro. 1Мж зоною багатоынтинного пщвюка i власне ембрющом виникала невелика ¡нвапнащя, характерна i для зиготичних зародюв.

Деяк1 соматичж ембрющи мапи широку зону приеднання до ембр¡огенного комплексу, що пщтверджуе ?хне багатокл1тинне походження. Таю зародки виникали спочатку у вигляд так званих випинань, що складалися з дрЮних клпин на поверхж ембрюнального комплексу, згодом вони диференцгавалися в бтолярж структури.

Проростання (органогенез) у соматичних ембрюдов конюшини вщбува-лося не так 4iTKO, як у зиготичних. Найчасп'ше заЫзиювалося утворення кореня, TOfli як с1М'ядол1 розвивалися нормально, i в них закладалася провщна система. 1нколи розвиток кореневого апексу пригжчувався майже повн'ютю, про що

св!дчив досить вузький базальний ы'нець ембрюща. Але в ряд1 випадюв, бшьш розвиненою виявлялася коренева частина ембргозда I менш розвиненими С1м'ядол|'. Спостер1галося також нертном1рне угворення обох с1м'ядолей. Досить часто виникали фасцийоваж ембрющи, певно завдякн щтьному розташуванню ТХН1Х ¡жц'юлей. Нер'щюсними були випадки вторинного ембр'югенезу, коли закладка нових ембрюцув вщбувалася в тканинах попереджх, що знаходилися на тзнших стадях розвитку, але за якимось причинами зупинивших св|й рют. Зторинж ембрющи також мали як одно-, так I багатоюитинне походження. В багатьох випадках ембрющи зупиняли свй розвиток на глобуляржй або торпедовиджй стадиях. Тх клггини збшьшувалися, вакуолкзувалися \ давали почато;-' новому ембрюгенному калусу.

Наш1 досл(дження свщчать про значну аналопю в стадях розвитку зиготичного I соматичного ембрюгенезу конюшини. Отримаш з соматичних ембр10Щ1в рослини конюшини устшно вирощували як в умовах теплищ, так ! !хж нащадки - в умовах вщкритого фунту без псмпгних вщмЫ в'щ рослин вихщного генотипу (Радионенко та ¡нш., 1994; ЯасИопепко е1 а1., 1994).

зивчення засобш регенераци у вщув з родини бобових була використана клггинна лЫ!я гороху, що стабтьно утворюе регенерацмноздатний калус. При пстолспчному вивченж процесу регенерацп у отриманих лмй гороху не було виязлено чггких фаз розвитку, як це мае мюце у випадку соматичного ембрюгенезу. В той же час вщзначено розвиток проембр'югенних д'тянок, що складалися з дрЮних юнтин з пульною цитоплазмою, що оточен! калусними .<л!тинами значно бшьшого розм1'ру. Ц| проембрюнальж групи кл'ггин при культивуванн! ?х на безгормональних поживних середовищах давали початок чтаоренню бруньок, I подальший розвиток вщбувався по шляху органогенезу з утворенням пагожв. Однак, якщо ц1 юнтинж л|'нп на протяз! короткого часу (3-5 доби) культивувати в присутност1 2.4 Д, а пюля цього перенести на безгормональне поживне середовище, то школи в^дм'шалося утворення структур, схожих з глобулярними.

Зуряк - одна з найважливших сшьськогосподарських культур. Вивчення процессе регенерацп у ц!е! культури мае велике значения для розробки бютехнолопчних метода 5 застосування 1х для полтшення районованих в УкраТж сортов. Як жспланти використовували черешки листюв, що культивували на поживному ;;оэедовищ| МБ, яке мютить 1мг/л БАП. Пюля перебування у цих умовах з кл1тин пгренжми зникали включения. Клггини розпочинали дшення, в яких спочатку

брали участь тшьки деюлька шарш клпин пареными. Дшення вщбувалося по типу дробления, в результат чого утворюеться зона др1бних кл1тин, з бшьш щшьною цитоплазмою I бшьшими ядрами. Утворюються зони, подбж до рашше описаних нами для конюшини \ гороху. Надал) процес вщбуваеться по типу органогенезу. В окремих дтянках меристематичних зон, що утворюються, починають випинатися бугорки. Центральна частина бугорка згодом диференцюеться в апекс пагона, а в перифермшй зож апекса в результат! периклинальних подтш кл1тин I деякого Ьснього розтягу утворюються листов! бугорки. Таким чином формуються бруньки. По довжин1 черешка водночас закладаеться деюлька бруньок (Банникова та ¡нш., 1995)

3 проведених експеримештв можна зробити висновок, що процес регенераци як шляхом органогенезу у гороху ! цукрового буряка, так I шляхом соматичного ембрюгенезу у конюшини бере свШ початок на стадм утворення др!бнокл1Тинних структур, що визначаються як проембрюнальний комплекс, де очевидно I вщбуваеться актив!зац1я певних гент, що вщповщають за мехашзми морфогенезу. Саме на щй фаз! повинно вщбуватися накопичення специф!чних матричних РНК, яю можуть бути ключем для пошуку генпв, залучених до процесу регенераци. Тобто процеси, що приводять у подальшому до утворення нормально! рослини з соматичних клггин, в'щбуваються голоеним чином на стадм утворення проембрюнальних груп кл!тин. Надал!, розвиток цих кл1тин може йти як по шляху соматичного ембрюгенезу, так ! по шляху органогенезу в запежност! вщ генетичних ! ф!знэлопчних чинниюв.

АСИМЕТРИЧНА СОМАТИЧНА ПБРИДИЗАЦ1Я ЯК ОДИН 13 СПОСОБ1В ПЕРЕНОСУ ГЕНЕТИЧНО! 1НФОРМАЦ11 М1Ж РОСЛИНАМИ.

Отримання соматичних пбрид1в видами з родини бобових з вико-

час генетична ¡нженер1я як шдад, заснований на методах введения в рослинну юнтину спец|'ально створених векторних молекул ДНК, не можна недооцшювати можпивостей клггинно! ¡нженерм рослин. Разом з тим необхщно вщзначити, що подш на генетичну клггинну шженерто рослин е досить умовним, I в световм науков1й практик вони розглядаються як цшюна система нових пщходв пщ загальною назвою генетична ¡нженер|'я рослин.

В наших експериментах по асиметричшй соматичшй пбридизацм м!ж видами з родини бобових, що розпочалися в 1987 роц1, були розроблен! методи соматично! пбридизацм з використанням гамма-опромження одного з партнера, I як результат були ввдбраж пбридн! клони \ регенерован! п'бридж рослини.

Незважаючи на усшхи, яких досягнула в останшй

Для ¡ндукцм злиття протопласта мЬк р1зноманпними видами з роду Medicago, а також м;ж конюшиною (Trifolium pratense L.) i люцерною мЫливою (M. varia L.) за основу було взято метод, розроблений для злиття мезофшьних протопласта у N. piumbaginífolia зпдно якому сум:ш протопластов обробляеться на протяз'| 20 хв розчином 40% ПЕГа 4000, що мютить високу концентрацию íohíb Са2+* i pH piBHHH 9.5-10. Застосування цього методу сприяло як отриманню в достатнм кшькост! продукта злиття так i достатнього вщсотку виживання reTspoKapioHlB i батьювських протопласта.

В результат проведених експеримента, п1сля злиття мезофшьних протопласте М. sativa, сорт "Веселоподолянська" з опромЫеними дозою ЗООГр мезофшьними протопластами M. varia, що несуть ген ctíükoctí до канамщинсульфату, були вдЮраж пбридн! клнинж клони. У деяких з цих kjiohíb вдалося ¡ндукувати утворення ембр!опод1бних структур, а в одному випадку були отримаж рослини-регенеранти (Кучук та ¡нш., 1991). Можна припустити, що отримаж пбридж клони мютять в своему геном! гени M. varia, що обумовлюють регенерац!йну здатнють, адже для коложй, отриманих з протопласте люцерни сорту "Веселоподолянська", жодноТ регенерац1йно1 поди отримати не вдалося. Проведений хромосомний анал13 показав, що ввдбраний пбрид несе октоплощний Ha6ip хромосом з 3-4 додатковими хромосомами.

Нажаль у люцерни важко диференцгавати хромосоми батька, однак результати, опублжоваж стосовно асиметричио! соматично! пбридизацП у вид!в роду Nicotiana, а також Mix Nicotiana i Atropa, свщчать, що в таких комбЫацшх здебюышго вщбираються пбриди з подвоеним набором хромосом реципгента i дсяким числом хромосом донора. В наших експериментах ми використапи ösTbKiBCbKi види з тетраплощним числом хромосом 2п=32, що призвело до отримання пбриду з октоплоТдним набором з додатковою кшькютю хромосом танора.

Морфолог1я отриманих рослин ¡стотно вщр1знялася вщ обох батьюв. Так, бтышсть листюв була ненормально? редуковано? форми. Рослини мали сильно укорочен! М1жвузля, i у них спостергалося ускладнення коренеутворення в культур! in vitro. Такий фенотип Mir бути результатом як певноТ HecyMicHocTi reHOMiB рецип1ента i опромшеного донора, так, можливо, i слщством тривапого Еирощування пбридних юитинних культур перш жж вдалося ¡ндукувати рзгенерацто у отриманого пбридного кгитинного клону.

3 практично! точки зору бшыи шкавою була друга пбридна комб!нац1я Mix »«ыими видами з роду Medicago. Один з представниюв цього роду - люцерна хмелевидна (M. lupulina) здатна до самозапилення, що е дуже корисною ознакою

з точки зору селекцп люцерни за гидвищеною продуктивжстю наання. В той же час люцерна хмелевидна взагал! не здатна до статевого схрещування з окультуреними видами люцерни, що не дозволяв запучати ïî до звичайних селекцмних програм.

В проведених експериментах пюля злиття мезофшьних протопласт М. borealis л!н1я 94 з опромженими протопластами M. lupulina RiA4, ¡зольованими з отримано! pahilue трансгенно? канамщинспйкоТ wiîthhhoî лЫ{Т, вдапося вщбрати клггинн! л1'н1'Т в дажй пбриднЖ комбжацн. Необхщно вщзначити, що морфология одержаних кложв була схожа cKopiuie на морфолопю кл1тинних лМй M. borealis. Отримаж асиметричж соматичж пбриди розвивалися у вигляд1 зелених клп"инних. л'!Н1и без будь-яких ознак коренеутвореня. Регенерация рослин у пбридних колон1й була сильно ускладнена i нам не вдалося отримати у них нормалью пагони.

Вивчення за допомогою блотинг пбридизацм за Саузерном успадкування рибосомальшх reHie у отриманих пбридних штинних лш(й Mix M. borealis i M. lupulina показало, що y асиметричних соматичних п'бридт ui гени присутн! вщ обох napTHepiB.

Аналопчний анал!з був проведений для комбмацм M. sativa+ M. varia. У випадку використання ендонуклеази рестрикци EcoRV не було визначено жодних в'[дм!нностей в спектрах пбридизаци у цих двох в ид! в. Проте у пбридних клон!в вщмиалося виникнення нових смуг пбридизац^. Це явище може бути пояснене виникненням нових клаа'в рибосомальних повтор/в у соматичних пбрид1в, що вжэ вщзначалося раньше у соматичних пбрид!в М1ж N. plumbaginifolia i Atropa belladonna.

Припущення про можливють перенесения генш, що регулюють здатнють до регенераци в культур) in vitro, шляхом соматично! пбридизаци мЬк piaHo-ман!тними видами з роду Medicago пщтверджуеться також результатами, отриманими при пбридизаци протопласт!в конюшини лугово?, ¡зольованих з тривало культивованих юйтинних культур, що втратили як здатнють до регенераци, так i до синтезу хлорофшу, з опромЫеними мезофшьними протопластами M. varia, ям мають ознаку ст1йкост! до канамщинсульфату, або без ц1е? ознаки. У пбридних лжш, позначених номерами 3 i 4, що були отримаж пюля злиття протопласта конюшини з опромЫеними мезофшьними протопластами люцерни, як! не несуть селективних ознак, було ¡ндуковано утворення ембрюнопод1бних структур, а пюля цього i naroHiB.

Певно гени, що визначають здатнють до регенераци у люцерни, не зчеплеж з генами ctmkoctî до канамщинсульфату, тому що п1сля пбридизаци

протопластов конюшими з мезофшьними канам!цинспйкими протопластами люцерни були отримаж як зелен!, так I хлорофшдефектн! клони,ст!йк! до канамщинсульфату, В той же час немае даних про вплив дози опромження на сегрегацга цих ознак. Як при доз1 опромшення потопласт!в люцерни в 1000 Гр, так ! при доз1 в 25 Гр були отримаж канамщинсттйк! пбридж клони М1ж конюшиною 1 люцерною, здатн! до позеленжня.

Таблиця 3. Асиметричш соматичн! пбриди, отриман! в 1КБГ1 мЬк видами род!в Medicago i Trifolium.

Рослина-рецишент Опромшений донор Селективна ознака Тип пбридних Л1Н)Й

Medicago sativa М. varia Ст(йкють до Пагони з коренями

(мезофш) (мезофш) канамщину

Medicago borealis М. lupulina Стмкють до Зелений калус

(мезофш) (калус) канамщину

Medicago borealis М. varia Стшюсть до Зелений калус

(мезофш) (мезофш) канамщину

Trifolium pratense М. varia Здатн!сть ДО Пагони i ембрю-под!бж

(бший калус) (мезофш) позелен!ння структури

Trifolium pratense М. varia Стшкють ДО Зелений i бший

(бтий калус) (мезофш) канамщину калус

Необхщно вщзначити, що здатнють до регенераци у асиметричних ооматичних пбридв в значжй Mipi була знижена у портнянж з клаинами донора а5о рецип!ента. Так, в експериментах пюля злиття мезофшьних протопластов М. borealis, л|н!я 94, з опромЫеними мезофшьними протопластами М. varia, що яесуть ген ctmkocti до канамщинсульфату, вщЮраж пбридж клони не утворюзали ембр!опод|бних структур. В той же час отримаж з протопласт батьюв клггинж лши з достатньо високою ефективжстю формували там структури i утворювали нормальж рослини.

В результат! проведених експерименлв були розроблеж методи злиття Г1ротопласт1в у вид1в Medicago i Trifolium з застосуванням ¡нактивацп одного з партнерш за допомогою гамма-опромшення. Також була показана можливгсть

переносу при асиметричнм соматичмй пбридизацн у виде Medicago i Trifolium ознаки стшкост< до канамщинсульфату, вбудованого в геном донора шляхом генетично! жженерм. KpiM того, була показана можливють переносу ознаки регенерац|'йно! здатност! при асиметричнм соматичжй пбридизацн у цих вид!в.

Отримаж результати по асиметричнж соматичжй пбридизацн у видга з род!в Medicago i Trifolium вщкривають HOBi перспективи в селекци цих важливих с/льськогосподарських культур. Вони дозволяють одержувати новий вихщний селевдйний матер!ап з корисними генами, перенесеними з род1в i вид!в, у яких звичайне схрещування обмежене або взагал! неможливо. KpiM того, вщкриваеться можливють використати даж тдходи для отримання цибрадв у цих

ВИД1В.

висновки

1. Апробовано систему генетично? трансформаци шляхом електролораци протопласп'в. Отримано канамщинстмм рослини люцерни i клггинж лжи со? та гороху. Молекулярно-бюлопчний анал!з i анагнз активност! ферменту неом'щинфосфотрансферази подтвердив трансгенну природу отриманих лж!й.

2. Запропоновано i апробовано метод, що пщвищуе регенерацмну здатжсть у люцерни i гороху шляхом генетично! трансформаци мутантом "shooty" Agrobacterium tumefaciens pGV 2206. Отримано регенерацмж niHii люцерни i гороху, що дозволяе використовувати ix для генетично! трансформаци ¡ншими генами.

3. JliHiH трансгенного гороху з пщвищеною здатжстю до регенераци була використана для наступно! трансформаци векторними конструкщями, що несуть селективний ген ctwkoctI до канам'щинсульфату. Отримано трансгенш пагони гороху, що несуть мобтьний Ds-елемент кукурудзи. Показано можливють використання "подв'|йно! трансформаци" для отримання трансгенних л(н!й гороху з генами ,що цжавлять.

4. Запропоновано i апробовано метод генетично! трансформащ! гороху за допомогою неонкогенних штам1в Agrobacterium tumefaciens. Отримано трансгенж лжи, що несуть ген стшкост! до фосф^нотрщину.

5. Розроблено cnociö утворення насжня у гороху в асептичжй культу pi. Запропоновано методику м'кроклонального розмноження гороху, що дозволить клонувати до 500 ООО генетично однорщних особин в piK.

6. У трансгенних л!н!й гороху шляхом ¡ндукци утворенння насжня в культу pi in vitro отримано потомство. Молекулярно-бюлопчний анал'13 пщтвердив

присутшсть посл!довностей ДНК перенесеного гена в поколениях генетично модифжованого гороху.

7. Протопласти видв рослин з родини бобових, таких як конюшина, люцерна, соя, горох, люпин, голубиний горох, при використанж розроблених методе культивування з дат Hi до утворення юптинних колоний з високим ступенем ефективности

8. Запропоновано i апробовано протоколи регенерацп рослин з кппинних лмй, отриманих з протопласта, що були видшеж з комерцмних coptîb люцерни i конюшини. Регенерац1я рослин у конюшини може бути отримана як шляхом прямого, так i непрямого ембрюгенезу, що пщтверджено результатами пстолопчного aHani3y.

9. Розроблено методику культивування протопласта i регенерацп рослин у Oenothera hookeri - модельного об'екту для молекулярно-генетичних дослцркень.

Ю.Отримано асиметричж соматичж пбриди Mix видами з родини бобових. Показано можливгсть використання перенесеного гена неомщинфосфо-трансферази як генетичного маркера для вщбору соматичних пбрид1в у вид!в з родини бобових.

СПИСОК ПУБЛ1КАЦ1Й

1. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений.// КиТв "Наукова думка".-1997.-152С.

2. Банникова М.А., Головко А.Э. Хведынич O.A., Кучук Н.В. Регенерация растений у сахарной свеклы (Beta vulgaris) в культуре in vitro, гистологическое изучение процессов регенерации.// Цитология и генетика.-1995.-23, N 6.-С. 14-22.

3. Зубко Е.И., Кучук Н.В., Туманова Л.Г., Виконская Н.А, Глеба Ю.Ю. Генетическая трансформация гороха, опосредованная Agrobacterium tumefaciens// Биополимеры и клетка.-1990.-£, N 3.-Р.77-80.

4. Кириченко И.В., Кучук Н.В., Сахно Л.А., Глеба Ю.Ю. Индивидуальное культивирование растительных протопластов и клеток.// Докл. АН Украины,-1990.- N З.-С. 63-65.

5. Кучук Н.В., Каневский И.Ф. Методы генетической трансформации растений.// Биотехнология.- 1987.- 3, N 3. - С. 365-369.

С. Кучук Н.В. Выделение и культивирование протопластов пяти видов семейства бобовых// Физиология растений,-1989.-3, N 4, -С.821-824.

7. Кучук Н.8., Шаховский A.M., Комэрницкий И.К., Глеба Ю.Ю. Получение генетически трансформированных клеточных клонов сои путем электропорации протопластов.// Биотехнология.- 1990,- N 5.- С. 30-31.

8. Кучук Н.В., Шаховский A.M., Воронин В.К., Глеба Ю.Ю. Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago.// Биополимеры и клетка.-1991.-2, N 4.- С. 54-60.

9. Кучук М.В., Глеба Ю.Ю. ЦитофЫолопя та штинна ¡нженер1я рослин.// Укр. бот. журнал.- 1992.-49, N 2,- С. 89-92.

Ю.Кучук Н.В. Генетическая трансформация высших растений, опосредованная бактериями из рода Agrobacterium. //Усп. совр. биол.-1997. - HZ, N 6-С. 645658.

11.Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Применение трансгенных растений для целей практической селекции.// Цитология и генетика,-1997.- 31, N 4.-С. 102-114.

12.Кучук М. Генетична ¡нженер1я - входження в бюлопчну еру.// BiCH. HAH Украши.-1998.-1Ч 3-4,- С. 28-34.

13.Сорочинский 5.В., Прохневский А.И, Гродзинский Д.М., Кучук Н.В. Иммунофлгооресцентная микроскопия компонентов цитоскелета в клетках растений.// Цитология и генетика.-1990.-24, N 3. -С. 64-65.

14.Радионенко М.А., Хведынич О.А., Гудзь В.Н., Банникова В.П., Кучук Н.В. Развитие соматических зародышей в каллусной культуре клевера лугового (Trifolium pratense L.)// Цитология и генетика.-1994.- 28, N 5.- С. 15-20.

15.Рачек Л.И., Стороженко С.В., Кучук Н.В. Генетическая трансформация гороха конструкцией, содержащей Ds-элемент кукурузы, методом электропорации.// Цитология и генетика.-1994.-28, N 6.- С. 49-54.

16.Рачек Л.И., Стороженко С.В., Кучук Н.В. Получение и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений гороха (Pisum sativum L.), содержащих Ds-элемент кукурузы.// Биополимеры и клетка.-1995.-11, N 3-4.-С. 82-87.

17.Kuchuk N., Komarnitski I., Shakhovsky A., Gieba Y. Genetic transformation of Medicago species by Agrobacterium tumefaciens and electroporation of protoplasts.// Plant Ceil Rep.-1990.- 8.-P. 660-663.

18.Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. The development of biotechnological approaches for improvement of grain legume species.// In: Proc. of 1 Eur. Conference on Grain Legumes.- France, Anger, 1-3 June 1992,- P. 121-122.

19.Kuchuk N.. Herrmann R.G., Koop H.U. Plant regeneration from leaf protoplasts of evening primrose (QfiaolfaanaLiiQ£jkeii).//Plant Cell Rep. - 1998,- 1Z, No. 8. - P. 601-604.

20.Radionenko M. A., Kuchuk N.V., Khvedynich O.A., Gleba Y.Y. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from protoplasts of red clover (Trifolium pretense L.)// Plant Sci.-1994.- 2Z. - P. 75-81. 21.Sarangi B.K., Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. Isolation and culture of protoplasts of

pigeonpea (Cajanus cajan I.).// Plant Cell Rep. -1992.-Ц.-Р. 462-465. 22-A.c. 1549995 СССР oi 15.11.89. Кучук H.B., Глеба Ю.Ю. Способ выделения и

культивирования протопластов из растительных тканей сои. 23.Момот В.П., Кучук Н.В., Пастернак Т.П. Методы клеточной иненерии растений. - Препринт 88.2, г. Киев "Комиссия УССР по делам ЮНЕСКО", 1988, 23с.

Кучук М.В. Використання лрийом!В генетично! ¡нженерп i кл!тинно1 бюлогп для отримання нових форм у вид в з родиии бобових i деяких жших рослин. Дисертац!я у вигляд) рукопису на здобуття наукового ступеня доктора бюлопчних наук за специальностями 03.00.22 «Кл!тинна бгалопя», 03.00.15 «Генетика». Ыститут кл!тинно1 бйлогн та генетично! ¡нженерп, Ки?в 1998. Розроблено методику культивування протопласт i регенерацп рослин у люцерни, конюшини, гороху i у Oenothera hookeri. Протопласти col, люпину, голубиного гороху при використанн! розроблених метод!в культивування здатж до утворення кл'ггинних колошй з високим ступеней ефективностК Отримано канамщинспйк! рослини люцерни i кштинн! л(нП coi та гороху шляхом електро-порацп протопласта. Запропоновано метод, що пщвищуе ефективнють транс-формацм у гороху та люцерни - «подвмна трансформация», що включае 1) отри-мання лши рослин, яю эдатн! до регенерацп в культур! in vitro, за рахунок транс-формацп мутантом «shooty» A. tumefaciens pGV2206; 2) - трансформащя л!н1й, яю здатж до регенерацп, селективним геном. Таким шляхом було отримано регене-рацмж л!н!Т люцерни i гороху i дал! трансгенж рослини гороху з Ds транспо-зоном кукурудзи та з геном ст!йкост! до фосфжотрицину. Присутн!сть ген!в в геном! рослин було доказано за допомогою методов пол!меразно5 ланцюгово! реакцн, блот- пбридизацн за Саузерном, NPT II анал!зу, анализу GUS активносп', ¡муноферментного анализу (ELISA). МЬквидов!' соматичн! пбриди Medicago sativa_+M.varia i M.borealis+ M.lupuiina були отриман! за допомогою асиметрично! пб-ридизацп. Хромосомний анал!з та блот-г!бридизац!я рибосэмально! ДНК пщт-вердили пбридну природу отриманих лж!й. Було гфоведено пстолопчний анал!з процесу регенерацп у конюшини, гороху та цукрового буряка.

Ключозг слова: бобов!, цукровий буряк, Oenothera, протопласт, регенерацт рослин, генетична трансформац!я, соматична пбридизащя.

Кучук Н.В. Использование приемов генетической инженерии и клеточной биологии для получения новых форм у видов из семейства бобовых и у некоторых других растений.

Диссертация в виде рукописи на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальностям 03.00.22 «Клеточная биология» и 03.00.15 «Генетика», Институт клеточной биологии и генетической инженерии, Киев 1998.

Разработаны методы культивирования протопластов и регенерации растений у люцерны, клевера, гороха и у Oenothera hookeri.Протопласты сои, люпина, голубиного гороха способны с высокой эффективностью образовывать клеточные колонии при использовании разработанных методов культивирования. Путем электропорации протопластов получены канамицин-устойчивые растения люцерны и клеточные линии сои и гороха. Предложен метод, повышающий эффективность трансформации у гороха и люцерны -двойная трансформация. Суть метода заключается в следующем 1) получение регенерационноспособных линий путем трансформации мутантом «shooty» А. tumefaciens; 2) трансформация регенерационных линий селективным геном. Таким образом были получены регенерационные линии люцерны и гороха и в дальнейшем трансгеные растения гороха, как с Ds транспозоном кукурузы, так и с геном устойчивости к фосфинотрицину. Присутствие генов в геноме растений было доказано с использованием методов полимеразной цепной реакции, блот-гибридизации по Саузерну, анализа активности NPTII, анализа GUS активности, иммуноферментного анализа (ELISA). Межвидовые соматические гибриды Medicago sativa+M.varia и M.borealis+ M.lupullna были получены с помощью асимметричной гибридизации. Хромосомный анализ и блот-гибридизация рибо-сомальной ДНК подтвердили гибридную природу полученных линий. Был проведен гистологический анализ процесса регенерации у клевера, гороха и сахарной свеклы.

Ключевые слова: бобовые, сахарная свекла, Oenothera, протопласт, регенерация растений, генетическая трансформация, соматическая гибридизация.

Kuchuk N.V. «Application of genetic engineering and cell biology approaches to produce new forms of species from Leguminosae family as well as of some other plants.»

Dissertation thesis as manuscript is presented for academic degree the doctor of biological sciences in fields 03.00.22 «Cell biology» and 03.00.15 « Genetics». Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, Kiev, 1998.

Methods of protoplast cultivation and plant regeneration have been developed for alfalfa, clover and pea and for Oenothera hookeri. Protoplasts isolated from soybean, lupine and «pigeonpea» have been cultivated with high efficiency. But, only callus has been obtained. Protoplast electroporation has been successfully applied to produce transgenic alfalfa plants as well as soybean and pea calli by using kanamycine as selectable agent. To produce transgenic alfalfa and pea plants double transformation system has been developed. The adopted approach involves two transformation steps: 1) production of regenerable legume lines through transformation with "shooty" mutant of A.tumefaciens pGV2206; 2) transformation of these regenerable legume lines with the gene construct containing selectable genes. Regenerable transgenic alfalfa and pea lines have been obtained using the developed approach. Transgenic pea plants carried of maize Ds trasposon as well as phosphinotricine resistant plants have been produced. The presence of transferred genes in the genomes of produced plants has been confirmed by PCR, Southern blot hybridization, NPTII activity analysis, ELISA analysis, GUS activity analysis. Interspecific hybrid Medicago sativa+M.varia plants and M.borealis+ M.lupulina calli have been developed using the asymmetric somatic hybridization. Chromosome number analysis and Southern blot hybridization of ribosomal DNA have confirmed the hybrid nature of lines developed. Processes of plant regeneration of clover, pea and sugar beet have been studied with histological analysis.

Kay words: legumes, sugarbeet, Oenothera, protoplast, plant regeneration, genetic transformation, somatic hybridization,