Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование остаточных диполь-дипольных взаимодействий для изучения структуры и динамики белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Использование остаточных диполь-дипольных взаимодействий для изучения структуры и динамики белков"

на правах рукописи

УДК 577.322.5

Крачковский Сергей Александрович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОСТАТОЧНЫХ ДИПОЛЬ-ДИПОЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИКИ

БЕЛКОВ.

03.00.02 -Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2006

Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии .МФТИ (ГУ).

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН

Официальные оппоненты: '

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН

кандидат физико-математических наук, директор Центра биофизики и физико-химии надмолекулярных структур МФТИ

Соболь Александр Григорьевич

Долгих Дмитрий Александрович

Горделнй Валентин Иванович

Ведущая организация:

ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоится " 18" октября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном университете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (государственного университета).

Автореферат разослан "15 й сентября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03

, . ,, л „ _ Брагин В.Е.

к.ф.-м.н., доцент - г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время уже продемонстрированы преимущества метода расчета структуры и динамических параметров белковых молекул, основанного на анализе констант диполь-дипольного взаимодействия (КДЦВ). Однако существующие методики все еще нуждаются в доработке. Так, например, при расчете динамических характеристик больших мультидоменных белков методом ЯМР данные о составе доменов приходится получать каким-либо другим способом. Это является существенным недостатком, так как не позволяет проводить независимые экспериментальные исследования.

Помимо методики, большой интерес представляет установление динамических характеристик барназы (одного из представителей класса небольших бактериальных рибонуклеаз). Определение взаимосвязи между структурой и внутренней динамикой рибонуклеаз вносит значительный вклад в изучение молекулярных основ ферментативного катализа. Кроме этого, оно дает возможность приблизиться к пониманию многих процессов клеточного метаболизма на молекулярном уровне. Из теоретических расчетов, проведенных раннее методом молекулярной динамики (МД), следует, что в барназе можно выделить высокоамплитудные коллективные (доменные) движения, которые приводят к существованию миллисекундной динамики в активном центре фермента Тем не менее это предположение до сих пор не нашло экспериментального подтверждения.

Цель и задачи исследования.

Целью данной диссертационной работы является установление динамических характеристик барназы при помощи методик спектроскопии ЯМР, основанных на анализе остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия. Для этого, во-первых, изучаются изменения в структуре белка, вызванные мутацией Е73А. Она препятствует образованию солевого мостика К27-Е73 и, как ожидается, исходя из молекулярно-динамических расчетов, должна приводить к стабилизации открытого состояния фермента А во-вторых, исследуются динамические характеристики барназы дикого типа

Методы исследования.

В работе использовался метод спектроскопии ЯМР, основанный на анализе остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия. Для того чтобы получить действительно независимое подтверждение результатов МД расчетов, был разработан алгоритм выделения в белке динамических доменов и определения параметров их движения друг относительно друга, исходя только из измеренных остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия.

В качестве объекта исследования и тестирования предложенных методик выбран белок барназа (110 аминокислотных остатков) - представитель класса небольших бактериальных рибонуклеаз.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В диссертационной работе предложен оригинальный алгоритм выделения динамических доменов в белках посредством анализа КДЦВ. Данный алгоритм не требует никаких знаний a priori о составе доменов. Эффективность представленной методики проверена на барназе и мальтоз-связывающем белке (МСБ). Отдельно следует отметить, что указанный алгоритм предназначен для работы с экспериментальными данными и, следовательно, является устойчивым по отношению к "плохим" (по той или иной причине выпадающим из общей модели) точкам. Предложенный алгоритм является составной частью разработанного диссертантом пакета программного обеспечения REDCAP (REsidual Dipolar Coupling Analysis Program), предназначенного для работы с КДЦВ.

Кроме того, в работе получена динамическая модель барназы. Выявлено, что барназа существует в виде двух различных состояний ("открытого" и "закрытого"), которые отличаются друг от друга поворотом одного динамического домена относительно другого на угол ~ 20°. Обе формы находятся в равновесии, и между ними осуществляется быстрый (-10"* сек.) переход. Продемонстрировано ключевое значение солевого мостика ЬуБ27-С1и73 и других слабых взаимодействий на поверхности между доменами для наносекундных ангармонических доменных движений.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях посвященных спектроскопии ЯМР (Санкт Петербург 2006, 2005); XV зимней международной молодёжной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва 2003); международной конференции по физико-химической биологии, посвященной памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва 2002); ХЬУ научной конференции МФТИ (ГУ) "Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук"; научных семинарах лаборатории структурной биологин ИБХ РАН (Москва 2003 - 2006).

Публикации.

Основные результаты диссертации изложены в 5 тезисах докладов, представленных на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, трех глав, включая литературный обзор, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 102 страницы текста, включая 29 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 101 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение.

Во Введении обоснована необходимость и актуальность разработки и совершенствования методик спектроскопии ЯМР, основанных на использовании остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия. Также кратко представлены данные известные о барназе в настоящий момент, и показано, что, несмотря на достаточно большое количество работ по изучению этого белка, требуется еще провести детальный экспериментальный анализ его динамических особенностей.

Глава 1. Обзор литературы.

Глава состоит из двух частей. В первой подробно обсуждаются сведения известные о барназе на сегодняшний день. В частности детально описываются структурные особенности белка, влияющие на его ферментативную активность. С этой целью приводятся кристаллографические структуры, как свободного белка, так и комплексов с различными аналогами субстрата Анализ имеющихся структур, помимо остатков, вовлеченных во взаимодействие с субстратом, позволил выявить еще и наличие консервативных интегрированных в барназу молекул воды. Соответствующие молекулы разделены на 3 класса в зависимости от их предполагаемой роли в стабилизации структуры белка н катализе.

Кроме того, разбираются имеющиеся динамические модели "поведения" барназы. Первая из них заключается в представлении её в виде твердого тела, т.е. в предположении,

что элементы вторичной структуры белка не вовлечены в заметные коллективные движения, а подвижностью обладают только петлевые участки, окружающие активный центр фермента. Такие результаты получены ранее для биназы (ближайшего гомолога барназы). Сопоставив имеющиеся данные с максимальной константой гидролиза, а также обнаружив, что характерные времена движения петель в свободном белке и в комплексе биназы с d(CGAC) совпадают, был сделан вывод, что это движение соответствует открытию активного центра фермента необходимому для высвобождения субстрата. Вторая модель основывается на молекулярно-динамических расчетах, согласно которым в барназе существуют высокоамплитудные коллективные (доменные) движения. При помощи анализа главных компонент движения были получены основные моды, описывающие поведение белка. Двум наибольшим собственным значениям соответствуют открытие/закрытие и твист двух доменов с амплитудами 19° и 16°, соответственно. Величина и амплитуды движений, описываемых в модели, указывают на ряд междоменных взаимодействий. Причем некоторые из остатков, вовлеченных в эти взаимодействия, непосредственно участвуют в каталитической реакции, например Lys27 и Glu73. Анализ МД траекторий показал, что в "закрытой" форме барназы присутствует солевой мостик между данными остатками, а в "открытой" его нет. Таким образом, диссертационная работа как раз направлена на проведение независимой экспериментальной проверки достоверности имеющихся моделей динамических особенностей барназы.

В качестве метода исследования выбрана методика спектроскопии ЯМР, основанная на анализе остаточных КДЦВ. Вторая часть Обзора литературы, как раз, посвящена описанию соответствующего подхода Показаны преимущества использования КДЦВ для уточнения структуры и анализа динамики больших белков по сравнению со стандартными методиками ЯМР, заключающимися в обработке ограничений на попарные расстояния между протонами, получаемых при анализе данных о ядерном эффекте Оверхаузера. Однако существующие методы работы с КДЦВ в случае мульти-доменных белков основаны на имеющейся a priori информации о составе доменов. Нам же, для подтверждения или опровержения результатов полученных га расчетов МД, требуется найти способ независимого определения динамических доменов молекулы. В этом смысле существующие методы нуждаются в совершенствовании и модификации. Поэтому в представленной диссертационной работе приводится оригинальный алгоритм проведения кластер-анализа, основанный исключительно на использовании КДЦВ.

Глава 2. Материалы н методы.

Во второй главе описаны способы измерения КДЦВ: приготовление ЯМР-образцов, получение анизотропной фазы, используемые импульсные последовательности. А также подробно разобран метод обработки полученных результатов: предложен алгоритм проведения кластеризации и описана структура разработанного программного продукта REDCAP (REsidual Dipolar Coupling Analysis Program).

2D,13C,l5N-меченная барназа и N-меченый мутант Е73А были получены и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории инженерии белка института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова- РАН (Д.С. Семенченко, E.H. Ткач, Л.И. Васильевой и A.A. Шульгой).

Все ЯМР — эксперименты проводились на ЯМР — спектрометре Varian Unity 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. В качестве жидкокристаллической фазы использовали билипидные мицеллы, состоящие из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и дигексаноилфосфатидилхолина (ДГФХ) в 10 мМ фосфатном буфере при pH 6.5. Остаточные константы диполь-дипольного взаимодействия получали из разности эффективных констант спин-спинового взаимодействия, измеренных в изотропной (t° = 20 С) и анизотропной фазах (t° = 30 °С).

Для проверки возможного существования взаимодействия барназы с бицеллами было проведено четыре эксперимента по измерению КДДВ "N-'H мутанта барназы Е73А, в которых 10 мг 15К-меченного белка растворяли в 550 мкл калий фосфатного буфера (pH = 6.7) и 50 мкл D20 с добавлением ДГФХ и ДМФХ. Молярное соотношение ДГФХ/ДМФХ поддерживали постоянным (1:2.9), а суммарная концентрация липидов менялась (7.7, 6.1, 4.7 и 4,4 весовых %). Полученные результаты сравнивали между собой, а также с имеющейся ЯМР-структурой барназы (код в базе данных PDB 1FW7).

При выборе условий экспериментов по измерению динамических параметров барназы дикого типа исходили из результатов работы проведённой в нашей лаборатории: при помощи дипольных констант Dnh оценивали зависимость заселенности "открытого" состояния барназы от суммарной концентрации липидов ДМФХ и ДГФХ в растворе. Полученная кривая приведена на рисунке 1. Так как в расчёте использовали только 32 КДДВ "N-'H, а минимизировались одновременно 14 параметров, то эти данные следует расценивать исключительно как оценочные (из-за малого количества степеней свободы). Однако, основываясь на полученной кривой, можно ожидать, что при суммарной концентрации фосфолипидов = 4% равновесные заселенности "открытого" и "закрытого" состояний барназы будут примерно равны. Поэтому именно такую суммарную концентрацию липидов и выбрали для проведения экспериментов.

Рисунок 1. Зависимость заселенности открытого состояния барназы от суммарной концентрации липидов ДМФХ и ДГФХ в растворе.

Для измерений КДДВ 'ОмН, 'РноСа, 'Е>мс и 2Г>нмс барназы дикого типа 7.5 мг (2Н; 15Ы; 13С]-меченого белка растворяли в 450 мкл ЮмМ калий фосфатного буфера с рН = 6.7 и 50 мкл 020 с добавлением 3.8 мг ДГФХ и 16.6 мг ДМФХ. Таким образом, при молярном соотношении ДМФХ/ДГФХ равном 2.9 мы получили их суммарную концентрацию в растворе 4.1% по весу. КДДВ измеряли при помощи следующих экспериментов: }т-Н5(ЗС для измерения 'оын и 'Омс; (8,Д)-ЕС05У-ШС>С для одновременного измерения 'ОмН, *1>нс и 2Онмс; (53-Ь8)-Н5<ЗС для 'ОнаСи- Для того чтобы избежать ошибок, связанных с повышенной подвижностью аминокислотных остатков, лежащих в петлях, в работе

использовались экспериментальные данные только для остатков, принадлежащих элементам вторичной структуры (р-тяжам, а- и Зю-спиралям) или непосредственно прилегающих к ним.

В качестве исходной структуры барназы дикого типа было решено взять набор го 30 лучших структур, полученных Рейбархом М.Я. (код в базе данных PDB 1FW7) методом ЯМР высокого разрешения. Последовательное отнесение сигналов проводилось на основании 'Н-'Н TOCSY, 'H-^N HSQC, 'H-^N-'H TOCSY-HSQC, 'Н-'Н NOESY, и lH-"N-'H NOESY-HSQC.

Протокол уточнения структуры с использованием КДДВ состоит из определения аксиальной (А») и ромбической (Аг) составляющих тензора ориентации с помощью разработанной в лаборатории программы ORIENT и минимизации штрафной функции, учитывающей ограничения на межъядерные расстояния, торсионные углы и КДДВ в программе DYANA с фиксированными А* и А,.

Значения КДДВ lîN- Н, рассчитанные исходя из 30 лучших структур, полученных таким образом, хорошо согласуются с КДДВ, измеренными экспериментально для белка барназы при суммарной концентрации лнпидов 3.5 весовых % (х2=74). Данное значение х2 в дальнейшем применяли для оценки качества полученных результатов.

Для анализа имеющихся данных в программной среде Mathematica 4.1 (Wolfram Research) с использованием языка JAVA™ (Sun Microsystems) и MathCode С++ (MathSource) был разработан программный продукт REDCAP (REsidual Dipolar Couplings Analysis Program). REDCAP состоит из трёх основных модулей: оптимизация параметров тензора ориентации молекулы, выделение динамических доменов белка и сравнение различных наборов КДДВ. Также в программе предусмотрен ряд служебных возможностей: отображение корреляционных диаграмм КДДВ; расчёт осей движения доменов друг относительно друга; преобразование координат атомов, записанных в файле формата PDB, в соответствующие вектора, соединяющие эти атомы, и тому подобное. Входными данными для REDCAP служат пространственная структура белка в формате PDB и экспериментальные значения КДДВ.

Для сравнения экспериментальных и теоретически рассчитанных данных использовали статистику х2- В случае двухдоменной модели белка, сначала при помощи матрицы Эйлера осуществляли преобразование поворота векторов, соединяющих пары атомов, для которых измерено дипольное взаимодействие, принадлежащих одному домену. После этого вычисляли значения КДДВ для новой ориентации векторов. Из полученной в ходе оптимизации х2 матрицы Эйлера вычисляются угол и ось поворота одного домена относительно другого. Для рассмотрения равновесия состояний барназы дикого типа вводился параметр, отвечающий за заселенности "закрытой" и "открытой" форм.

Обычно оптимизация тензора ориентации молекулы сводится к минимизации функции х2- Однако в нашем случае это не подходит, так как неизвестен состав динамических доменов барназы. Следовательно, каждый остаток, в зависимости от того, находится ли он в том или ином домене, может давать различный вклад в штрафную функцию.

Разделение аминокислотных остатков на два домена подразумевает минимизацию функции:

X2-2>in(e5,4), (1)

---, (2)

где N — количество экспериментальных точек (х„ у,) с погрешностью измерения <з„ aj,...a\f — варьируемые параметры, a Y/x„ ai,...a^i), j = 1, 2 - функция, учитывающая

наличие двух доменов. Однако, формула (I) не подходит для проведения автоматической минимизации, так как производная от mm(x,y) не является непрерывной. Поэтому для проведения автоматической минимизации было необходимо найти "гладкую" функцию, аналогичную по смыслу min(x,y). В качестве такой функции было выбрано среднее гармоническое hm(x,y,...) = (х*1 + у*1 +...)"'. обладающее следующими свойствами:

1. hm(x,y) < min(x,у) для любых положительных хи у;

2. hm(x,y) ~ min(x,y) для х » у или х « у;

3. hm(x,y) бесконечно дифференцируема при всех х > 0 и у >0.

Таким образом, среднее гармоническое можно рассматривать как "сглаженный минимум".

Необходимо также учесть, что не все остатки можно однозначно отнести к тому или иному домену, например остатки, принадлежащие шарнирной области. Кроме того, нельзя исключать определенный процент "плохих" экспериментальных данных. Таким образом, некоторые точки, для которых значение^ отличается от рассчитанного по любой го двух моделей Yj больше чем на оЛ следует отбросить го рассмотрения. Тогда штрафная функция принимает следующий вид:

X2 = (3)

i-1

В этом случае, ни одна из точек не вносит в штрафную функцию вклад больше чем величина аг. Значение а = 2.326 позволит отбросить точки, не попадающие в 98% доверительный интервал соответствующих КДДВ. Таким образом, после минимизации функции (3) относительно параметров ait... ам, получаем разбиение остатков по доменам. Если минимумом (е^е^.а1) является то i* остаток принадлежит к первому домену, если el, то ко второму. В противном случае, соответствующий остаток лежит в шарнирной области или в деформированном из-за изменения структуры участке, либо используемые экспериментальные данные по той или иной причине плохи.

Также для улучшения сходимости минимизации, логично предположить, что аминокислотные остатки, находящиеся в одном элементе вторичной структуры, обычно принадлежат одному динамическому домену. Следовательно, это свойство тоже можно отразить в штрафной функции для сокращения времени счёта. Для этого разобьём молекулу белка на М неперекрывающихся участков {ki, ... км} с К, количеством элементов в участке с номером s и предположим, что каждый участок целиком принадлежит одному из доменов. Однако необходимо учесть, что из-за локальных деформаций структуры (например, в шарнирной области) не все остатки элемента вторичной структуры будут принадлежать домену. Следовательно, до В, (Bs < К,) остатков из 5го - набора могут быть отброшены (помещены в "плохие") в процессе минимизации.

Штрафная функция в таком случае принимает вид:

Х2= (4)

j.t

у = 1,2.

После минимизации по параметрам at,... ам распределение наборов к» по доменам осуществляется исходя из значений минимума (£/„ Ejs, 3a2Bs). Если значение К, для всех М наборов равно 1, то штрафная функция (4) идентична функции (3), Функцию (4) легко можно трансформировать на случай произвольного количества моделей (доменов).

Тестирование модуля автоматической кластеризации проводилось для мальтоз-связывающего белка (370 а.о.). В качестве исходной структуры использовалась кристаллографическая структура го базы данных PDB ЮМР (1.8 А). Состав доменов для данного белка известен. Входными данными, помимо структуры в формате pdb, служили

179 КДЦВ 1Е>цн, измеренных для остатков, входящих в элементы вторичной структуры белка и любезно предоставленных нам Н.Р. Скрынниковым

Глава 3. Результаты н обсуждение.

Третья глава посвящена применению разработанных методик для изучения динамики барназы.

3.1. Исследование изменений в структуре барназы вызванных введением мутации Е73А.

Анализ Н5(}С-спектров белка барназы дикого типа и мутанта Е73А, показал, что в структуре молекулы при замене глутаминовой кислоты 73 на аланин и, как следствие, разрыве солевого мостика К27-Е73 произошли некоторые изменения. Однако так как химические сдвиги кросс-пиков КН в данных спектрах поменялись незначительно (Д5н < 0.07 мд, за исключением остатков Ы2, Р56, К12, А74, 086, Ь89, Н102 и УЮЗ большинство из которых находятся близко к месту мутации), то можно предположить, что локальная структура белка не претерпела существенной деформации.

-10

-5

10

К

в!

7,5 5

-1.5

3 -3

4> О

т' -7,5

• 10 10

я

а

8

-5

-10

: (а) 90 * Ж Т39

ее Ж* • 2-1 99 ; ^г : ч^ .* Т

97 ^^гЖ*1

ия агу 40^ Л*

.10 .5 О 5

КДДВ (весовая доля липидов 4.4 %) [Гц]

ю

Рисунок 2, Корреляционные диаграммы КДЦВ, полученных экспериментально для мутанта барназы Е73А при суммарной концентрации липидов 4.4 весовых % и КДДВ (а) полученных при концентрации липидов 7.7% и (б) 4.7% по весу.

Для детального анализа произошедших изменений были измерены остаточные константы диполь-дипольных взаимодействий 'H-liN для барназы дикого типа и её мутанта Е73А.

Для проверки возможного существования взаимодействия барназы с бицеллами было проведено четыре эксперимента с Е73А, в которых молярное соотношение ДГФХ/ДМФХ поддерживалось постоянным (1:2.9), а суммарная весовая доля липидов менялась: 7.7, 6.1, 4.7 и 4.4 %. В результате выяснилось, что набор КДДВ, соответствующий весовой доле 7.7 %, плохо коррелирует с остальными наборами (на рис. 2а показана корреляция КДЦВ при суммарной весовой доле липидов 7.7 и 4.4 %, а на рис. 26 — 4.7 и 4.4 %). По всей видимости, различия в наборах констант вызваны деформацией структуры белка из-за взаимодействия с липидами (аналогичные деформации наблюдаются и при упаковке молекул в кристалл). Поэтому в дальнейшем работа велась с КДЦВ, полученными из эксперимента с наименьшим содержанием липидов (4.4%). При данной концентрации расщепление сигнала DiO в 2Н-спектрах ЯМР, характеризующее анизотропность среды, составляло приблизительно б Гц.

Анализ КДЦВ 'Dnh барназы дикого типа и мутанта Е73А (рис. За) показал, что между данными наборами существует некоторая корреляция, однако большое значение х2 (X2 = 1709), не может быть объяснено погрешностью эксперимента Поэтому было решено проверить, не изменился ли тензор ориентации молекулы. С этой целью рассчитали значение %2 для КДДВ, измеренных для мутанта и рассчитанных исходя из 30 ЯМР-структур барназы дикого типа с оптимизацией по параметрам тензора. Данная оптимизация позволила существенно улучшить корреляцию. Однако, и в этом случае различие между теоретически рассчитанными и измеренными КДДВ (рис. 36, %2 ° 426) нельзя объяснить экспериментальной погрешностью. Следовательно, в структуре барназы действительно произошли какие-то изменения. Одним из вариантов такой деформации, с учетом сохранения локальной структуры белка, может быть переориентация доменов барназы, что предсказывалось на основании молекулярно-динамических расчетов. Если это действительно так, то КДДВ, измеренные для мутанта и рассчитанные в предположении существования двух динамических доменов, должны хорошо согласоваться друг с другом.

Разбиение по доменам (какой аминокислотный остаток к какому домену относится) a priori не известно. Более того, некоторые остатки не могут быть отнесены ни к одному из доменов из-за локальных деформаций структуры или в силу их принадлежности шарнирной области. Более того, некоторые экспериментальные точки по той или иной причине могут оказаться "плохими". Для кластеризации можно использовать "карту согласованности дипольных констант", но для этого требуется знание ромбической и аксиальной составляющих тензора ориентации молекулы. Необходимые параметры можно оценить из имеющихся значений экспериментальных КДДВ. Качество такой оценки зависит от полноты и однородности распределения в пространстве межъядерных векторов соответствующих изучаемым КДЦВ. Барназа - это достаточно маленький белок (110 аминокислотных остатков), и набора измеренных КДДВ 1H-ISN недостаточно для точной оценки компонент тензора. Поэтому было решено использовать другой подход. Состав доменов, параметры тензора и относительную ориентацию доменов определяли одновременно при помощи разработанного алгоритма.

Рисунок 3. Корреляционные диаграммы КДДВ, полученных экспериментально для мутанта барназы Е73А и КДДВ (а) полученных экспериментально для барназы дикого типа; (б) рассчитанных теоретически исходя из структуры белка дикого типа с оптимизацией параметров тензора ориентации; (в) рассчитанных в предположении существования двух динамических доменов. Показаны данные только для остатков, вошедших хотя бы в один из двух доменов.

Тестирование модуля автоматической кластеризации проводилось для мальтоз-связывающего белка (370 а.о.). В результате работы модуля автоматической кластеризации программы REDCAP из 31 элемента вторичной структуры белка неверное отнесение получили только 2 спирали: а5 (91-97), «9 (210-218) и 2 Р-тяжа р7 (114-117) и

р9 (167-171). При этом тяж р7 непосредственно примыкает к шарнирной области, включающей в себя остатки 110-113. Важно ещё раз отметить, что в работе использовалась только одна структура, причем полученная методом рентгенеструктурного анализа. Такие структуры не содержат координат протонов, и поэтому для расчета КДЦВ приходится достраивать амидные протоны, используя стандартную геометрию пептидной связи. Известно, что достраивание амидных протонов по координатам тяжелых атомов с использованием плоской геометрии пептидной группы вместо реальной может привести к ошибке в ориентации Н-Ы-вектора на величины порядка 5°. Принимая во внимание, что неопределенность в положениях тяжелых (С, Ы, О) атомов для кристаллографической структуры с разрешением 2 А составляет 0.2 А, вариацией положений атомов пептидной связи можно оценить, что неопределенность в ориентации Н-ЬГ-вектора при этом составляет 7й в плоскости пептидной связи и 15° в направлении, перпендикулярном этой плоскости. Таким образом, погрешность в ориентации Н-Ы-вектора для кристаллографической структуры с разрешением 2 А может достигать ~20а. Исходя из этого, полученные результаты было решено считать успешными и использовать в дальнейшем предложенный алгоритм.

В результате в тот или иной домен удалось включить 32 остатка из рассматриваемых 44. При учёте доменных движений значение %2 стало равно 74 (рис. Зв). С одной стороны улучшение качества вписывания экспериментальных точек в предложенную модель можно объяснить увеличением числа независимых параметров, т.е. уменьшением степеней свободы системы (добавление трёх параметров поворота одного домена относительно другого). Поэтому для проверки результата нужно использовать статистические методы оценки. Так, например, согласно Р-стаггистике если сравнить двухдоменную модель, с моделью, в которой молекула рассматривается как единое целое (X2 = 426), то уровень достоверности последней составит лишь 4,6*10'5 %. Следовательно, усложнение модели (переход к двум независимым доменам) статистически оправдан. Дальнейшие же попытки улучшить модель не имеют физического смысла, так как в данном случае качество корреляции экспериментальных и теоретически рассчитанных КДЦВ определяется качеством исходной структуры.

Первый домен состоит из 21 остатка (рис. 4). В него вошли: остатки а|-спирали, р4-, р5-, и ре-тяжей, а также некоторые остатки рг и р3-тяжей. Во второй домен вошли 11 остатков, находящихся в а2-, аз-, Зю-спиралях и частично в р2-тяже. Двенадцать остатков не вошли ни в один из доменов (рис. 4). Три из них (11е25,11е51 и С1у53) можно отнести к шарнирной области, на том основании, что найденная ось вращения доменов проходит на расстоянии менее чем 3 А от С" атомов каждого из этих остатков. Ещё шесть остатков, так или иначе, связаны с Р;-тяжем (106-108, 110 — остатки, принадлежащие р7, и взаимодействующие с ним водородными связями остатки 196 и К98 из рб). А оставшиеся три (Уа136, 11е76 и ТЬгЮО) находятся на концах элементов вторичной структуры, следовательно, их подвижность может отличаться от подвижности остальных остатков, включённых в рассмотрение.

Из полученных углов Эйлера задающих поворот одного домена относительно другого, нашли угол (21° ± 2°) и ось поворота Такое изменение среднего положения доменов можно представить как раскрытие на 17° ± 2° и твист на 12° ± 2°. Данное разбиение остатков на домены, а также параметры доменных движений устойчивы, в том смысле, что произвольное отбрасывание одного или двух остатков не влияет на результат в пределах погрешности. Кроме того, оно устойчиво и к варьированию измеренных значений КДЦВ в пределах погрешности.

Рисунок 4. Схематическое изображение структуры барназы, полученной на основании данных ЯМР. Показано разбиение на два домена: первый домен выделен красным цветом, второй - зелёным. остатки не участвующие в рассмотрении обозначены серым цветом, синим показаны остатки лежащие в шарнирной области, а жёлтым — остатки, поведение которых не удалось описать при помощи данной модели. Также показаны оси, характеризующие изменение среднего положения доменов друг относительно друга при введении мутации Е73А: голубым - ось твиста, а чёрным — ось открытия/закрытия доменов. Боковые цепи остатков, формирующих солевые мостики (К27, В54 и Е73) показаны фиолетовым.

3.2. Исследование динамических особенностей барназы при ломощн остаточных КДДВ.

В качестве динамических моделей барназы было решено ограничиться рассмотрением двух простейших. Первая из них заключается в представлении белка в виде твердого тела, т.е. в предположении, что элементы вторичной структуры белка не вовлечены в заметные коллективные движения. Такие данные получены ранее для биназы (ближайшего гомолога барназы). Вторая модель основывается на молекулярно-динамических расчётах, согласно которым в барназе существуют высокоамплитудные коллективные (доменные) движения.

Для остатков принадлежащих элементам вторичной структуры белка было получено 177 КДДВ (51 'Рмн. 49 'Омс, 48 2С>нмс и 29 'Онас«)- Из-за малой дисперсии химических сдвигов кросс-пиков НаСа, наблюдается перекрывание ряда сигналов в спектре (83-128)-Н5рс, при помощи которого измерялись КДДВ 'ОноСа- Кроме того, данный эксперимент не позволяет проводить измерения соответствующих КДДВ для

глицинов. Из-за указанных причин значения КДЦВ 'ОноСи удалось измерить для меньшего количества аминокислотных остатков, чем КДЦВ других типов. Диапазон значений КДДВ различных типов, а также средняя погрешность измерения данных КДДВ приведены в таблице 1.

Ощш! Нг АО, Нг

-12,9 8,5 0,3

-1,6 1,8 0,15

Ошчс - -4,1 3,3 0,5

ОноСо -25,8 17,0 1.0

Табл.1. Минимальные и максимальные значения КДЦВ различных типов и погрешности их измерения.

Для удобства одновременной работы со всеми четырьмя типами полученных КДЦВ они были. приведены домножением на соответствующий коэффициент к КДДВ '1>мн- Подразумевалось, что среднее значение длин всех межъядерных векторов каждого типа одинаково, и . параметры порядка, характеризующие внутримолекулярную подвижность этих векторов, также одинаковы. Однако известно, например, что длина связи Н-Ы может меняться в пределах ± 0.003 А. Это может приводить к ~1%-ной ошибке для теоретического значения КДЦВ. Для барназы эта ошибка в 3-4 раза меньше ошибки измерения КДЦВ. Поэтому эффектами, связанными с изменениями длины связи векторов, можно пренебречь. Средние значения межъядерных расстояний, а также вычисленные и полученные в результате минимизации множители приведены в таблице 2.

гт,,п,А к* к641

1чГС' 1,32 9,2 9.3

Н*С' 2,05 3,5 3.5

НаС° 1,09 0,52 0,52

Табл.2. Средние значения межъядерных расстояний, используемые для расчета коэффициента привидения полученных КДДВ к КДДВ 'Ош> а также полученные теоретически и экспериментально коэффициенты перевода.

В ходе выполнения 1000 случайных стартов кластеризации, для барназы удалось получить 2 решения со значениями штрафной функции х2 равными 242 и 328, соответственно (рис. 5а). На рисунке 56 показано разбиение по доменам. Из данного рисунка видно, что решению с меньшей штрафной функцией (х2 = 242) соответствует двухдоменная модель белка, а с большей (х = 328) - модель жесткой молекулы. При переходе от модели жесткой молекулы к двухдоменной модели добавляется 4 параметра (3 угла Эйлера, определяющие вращение одного домена относительно второго, и весовая функция, определяющая заселённости открытого и закрытого состояний). Следовательно, в нашем случае число степеней свободы изменяется со 171 (жесткая структура) до 167, при этом х2 падает на 86. Это означает, что переход к двухдоменной модели статистически оправдан (уровень достоверности модели твердого тела составляет согласно Р-статистике всего 2,5%). 200 случайных стартов с "зашумлением" используемых значений констант дипольного взаимодействия показали устойчивость данного решения.

а)

X 320

1000

200

400

600 800 1000 колличество стартов

Рисунок 5. По оси х отложено количество случайных стартов, а по оси у а) значение х; б) заштрихованная область соответствует количеству КДДВ отнесенных в один домен, чёрная - во второй и серая - количеству "плохих" констант.

Получившееся разбиение молекулы на домены представлено на рисунке б. Большой домен составили остатки 7-12, 14, 23, 24, 53, 55, 56, 71-76, 88-92, 95, 97-100 и 106-108, а в малый вошли остатки 26, 27, 29, 31-33, 35, 39, 41-46, 49, 50. Основным отличием от результатов, полученных для мутанта Е73А, является то, что остатки седьмого р-тяжа вошли в один из доменов. Это можно объяснить либо изменением его ориентации относительно первого домена при введении мутации, либо тем, что добавление в расчет новых типов КДЦВ позволяет более полно описывать пространственное распределение межъядерных векторов и получать, тем самым, более точные результаты. Остатки Ие25, Не51 можно отнести к шарнирной области на том основании, что найденная ось вращения доменов проходит на расстоянии менее чем 3 А

от Са атомов каждого из этих остатков. С - концевые остатки Ие109 и А^110, по всей видимости, имеют большую подвижность, и их КДДВ не вписываются в общую модель. Для данного разбиения и данных условий эксперимента и начальной структуры белка определены параметры поворота доменов друг относительно друга. Выяснилось, что в барназе происходят переходы между "открытым" и "закрытым" состояниями. Угол открытия/закрытия доменов составил 14.8 ± 1.7°, твист 1.2 ± 0.8° (оси и направление поворота малого домена относительно большого при "открытии" представлены на рис. 6). Равновесная заселенность открытого состояния при суммарной концентрации фосфолипидов в растворе 4,1 весовых % равна 66 ± 8%. Проведена оценка точности полученных результатов, учитывающая наличие погрешности измерения КДДВ.

Рисунок 6. Схематическое изображение структуры барназы, полученной на основании данных ЯМР, Показано разбиение на два домена: первый домен выделен красным цветом, второй — зелёным. Также показаны оси, характеризующие изменение положения первого домена относительно второго, при переходе из "закрытого" состояния в "открытое".

3.3. Сравнение динамических доменов, полученных при помощи ЯМР и МД.

Так как разбиение на динамические домены получено независимым путем, основываясь только на КДДВ, то будет интересно сравнить его с результатами молекулярно-динамических расчетов. Соответствующие данные приведены в таблице 3.

Как мы видим данные, полученные независимо друг от друга, очень хорошо коррелируют, единственное исключение — это остатки, связанные с последним (1-тяжем в мутанте Е73А. По всей видимости, модель изменения взаимной ориентации двух доменов является вполне достаточной для описания внутренней динамики барназы. Однако, исходя из того, что в барназе существуют три гидрофобные области, можно было бы ожидать, что

потребуется более сложная модель. К тому же и анализ МД траекторий показал, что динамика барназы сводится не только к твисту и открытиюбакрытию двух доменов. Существует еще ряд основных мод с большими амплитудами (большими собственными значениями). Однако, в отличии от цитохрома С, для которого энергия распределена практически равномерно среди сотен мод, первые две гармоники с наибольшей амплитудой в барназе вносят самый существенный вклад в свободную энергию белка (до 6.6 ккаМлоль для открытия^акрытия и твиста). "Блокирование" именно этих мод (при помощи мутаций, специфического окружения и т.п.) может существенно влиять на стабильность и функционирование фермента.

МД ЯМР (барназа дикого типа) ЯМР (Е73А)

Домен I 7-17(а,)> 53-56 фз), 71-75 (р4), 87-92 (р5), 95-99 (р*), 107-110 (р7) 7-12,14 (а,), 23,24 (Р0, 53, 55, 56 (рз), 71-76 (Р0. 88-92 (р5), 95, 97-100 (р6), 106-108 (р7) 7-12 (а,), 23, 24 (Р0, 55, 56 (Рз), 71,72, 75 (рД 88-92 (Рз), 95, 97, 99 (рл)

Домен II 26-34 (а2), 36-39 (Зю), 41-46 (а3), 49-51 (р2) 26, 27, 29,31-33 (а2), 35,39(3,о), 41-46 (а3), 49, 50 (р2) 26, 29,32,33 («!), 35,39(3)0), 41,43, 46 (аД 49, 50 (Рг)

Шарнирная область 24, 50-52 25,51,52 25,51,53

Открытиебакрытие -19° 14,8 ± 1.7° 18*1.5°

Твист -16° 1.2 ±0.8° 12±3°

Табл. 3. Сравнение состава доменов и амплитуд движений барназы, полученных методами МД и ЯМР.

3.4. Анализ соответствия КДДВ 'б^н барназы дикого типа известным кристаллографическим структурам барназы.

Было интересно посмотреть, а как соотносятся полученные нами КДДВ с известными структурами барназы в кристалле. Качество соответствия кристаллографических структур экспериментальным КДДВ обычно ограничивается расхождениями в структурах белка, полученных в кристалле и в растворе, а также "структурным шумом". "Структурный шум" происходит из-за различий между несколькими молекулами в элементарной кристаллической ячейке и неопределенностей координат тяжелых атомов. Эти неопределённости приводят к дисперсии ориентации межьядерных векторов, необходимых для расчета КДДВ.

При непосредственном сравнении имеющихся структур и измеренных КДДВ 'н-получилась достаточно слабая корреляция, которую нельзя объяснить только экспериментальными ошибками и/или "структурным шумом" (значения %г и С?-фактора) для кристаллографических структур 1А2Р, 1В2Х, 1ВЫ1 и 1ВШ приведены в таблице 4). Скорее всего, данное расхождение является следствием различия в структурах барназы, полученных в кристалле н в растворе. Аналогичная ситуация наблюдалась для лектнпа ячменя, МСБ, лизоцима и Са2+-кальмодулина. Для Са2+-кальмодулина были обнаружены деформации в структуре доменов, в то время как для остальных белков менялась, в основном, только взаимная ориентация доменов. Предположив, что кристаллографические и ЯМР — структуры барназы также отличаются переориентацией

доменов, была проведена оптимизация их взаимной ориентации в кристаллографических структурах с целью добиться наилучшего согласования с экспериментальными КДДВ 'Н-15Ь1. Для этого использовали данные о кластеризации, полученные ранее для структуры барназы дикого типа. Результаты оптимизации, приведенные в таблице 4, показывают, что кристаллографические структуры барназы дикого типа, так же как и мутант Е73А, раскрыты (15 — 18°) по сравнению со структурой барназы в растворе. Это соответствует наблюдению о том, что кристаллографические структуры барназы представляют собой "открытую" форму, найденную в МД траекториях.

Код в базе данных РОВ Разрешение х№/0 Угол закрытия доменов

1А2Р 1.8 А 295/0.34 167/0.27 17°

1В2Х 1.5 А 236/0.35 118/0.26 16°

ты1 2.1 А 258/0.38 84/0.28 15°

1ВШ 2.1 А 283/0.38 95/0.26 18°

Табл. 4. Величины штрафной функции "£¡<2-фактора полученные в результате оптимизации взаимной ориентации доменов различных кристаллографических структур барназы с целью добиться наилучшего согласования с экспериментальными КДДВ 'И- N. а также величина угла закрытия доменов. "Оптимизация только тензора ориентации (5 параметров) бДвухдоменная модель (8 параметров).

Различия между кристаллографическими и ЯМР - структурами, выявленные в ходе работы, характеризуют конформационное пространство взаимных ориентации доменов барназы. Все кристаллографические структуры соответствуют "открытой" форме, а структура барназы в растворе соответствует "закрытой" форме. Стоит отметить, что для лизоцима наблюдалась обратная ситуация: 90% кристаллографических структур отражали "закрытую" конформацию белка, а структуры в растворе - "открытую".

3,5. Доменные движения как возможный источник ферментативной активности барназы.

Все известные рентгеновские структуры барназы (так же как и биназы - её ближайшего гомолога), включая мутанты и комплексы с аналогом субстрата или ингибитором барстаром, представляют собой "открытую" форму фермента. В тоже время, использующаяся в данной работе ЯМР - структура барназы дикого типа - "закрытая". При переходе из "открытого" состояния в "закрытое" и обратно активный центр барназы, расположенный на интерфейсе между двумя доменами, претерпевает значительные изменения. Отличительной особенностью "открытой" формы является наличие полости в активном центре фермента (рис. 7а). Края полости образованы необходимыми для катализа остатками (Ьуз27, Абп54, С1и73, А^83, А^87), в то время как в ее основании находится остаток 01у52, относящийся к шарнирной области. Полость заполнена двумя консервативными молекулами воды (входящими в число пяти молекул, расположенных в непосредственной близости от сайта щепления субстрата из (1(ССАС), структура 1В1Ш). Поворот доменов барназы друг к другу при переходе из "открытого" состояния в "закрытое" приводит к уменьшению размеров полости, тем самым, вытесняя воду или способствуя ее участию в формировании солевого мостика Ьуз27-С1и73 (рис. 76). Существует еще одна пора, заполненная консервативной молекулой воды (рис. 7а, данная молекула воды расположена рядом с фосфатной группой Рг аналога субстрата в структуре 1В1Ш). Объем данной поры изменяется как во время перехода из "открытого" состояния в

"закрытое", так и при движении петли 76 - 86. Вода - это важная часть активного центра рибонуклеаз и связывающих эпитопов. Молекулы воды в порах, упоминавшиеся выше, могут играть роль в стабилизации "открытого" состояния барназы и катализе, хотя нельзя исключать, что высвобождение и поглощение вода может коррелировать со связыванием субстрата и освобождением продукта.

Рисунок 1, Изображение активного центра барназы (а) кристаллографическая структура (IB2X), (б) ЯМР — структура. Остатки активного центра показаны различным цветом: магента — Lys27жёлтый - Asp54, красный — G 1и73, светло зеленый — Arg83, оранжевый — Arg87, голубой — Hisl02. Молекулы воды изображены шариками цвета циан.

Существенная роль консервативных молекул воды в барназе показана на рисунке 8. Не останавливаясь подробно на классификации шестнадцати консервативных интегрированных в барназе молекул воды, отметим, что 11 из них находятся на поверхности между двумя доменами. Данное наблюдение также верно и для биназы (ближайшего гомолога барназы). Это имеет огромное значение для доменных движений, обеспечивая низкоэнергетический переход между различными ориентациями доменов. Кроме того, "частичная сольватация" доменов барназы может быть тесно связана с существованием промежуточных состояний в процессе сворачивания/разворачивания белка

Рнсунок 8. Виды барназы "спереди" (а,в) и "справа" (б, г). Показано распределение консервативных молекул воды на поверхности между доменами (а, б) и соответствующая вторичная структура (в, г). (а,б): первый домен (1-24, 54-110) выделен жёлтым, второй (26-50) - прозрачным красным, основная цепь шарнирной области (25, 51-53) - синим, консервативные молекулы воды показаны голубыми шариками, (в, г): элементы вторичной структуры выделены жёлтым, красным и синим цветом для домена 1, домена 2 и шарнирной области соответственно.

Выводы.

1. Методики и алгоритмы, предложенные в данной работе, могут успешно использоваться для регистрации и детального анализа структурных изменений в белках. Данные методики уникальны в том смысле, что не требуют знания a priori о составе доменов, и применимы для анализа равновесных состояний белков в растворе.

2. Выявлено, что барназа существует в виде двух различных состояний ("открытого" и "закрытого"), которые отличаются друг от друга поворотом одного динамического домена относительно другого на угол ~ 20°. Обе формы находятся в равновесии, и между ними осуществляется быстрый (-10** сек.) переход.

3. Состав полученных динамических доменов и параметры их движения хорошо согласуются с результатами, молекулярно-динамических расчетов представленными ранее.

4. Так как "дно" активного центра барназы расположено на поверхности между двумя полученными доменами, то доменные движения играют существенную роль в активности фермента. Изменение взаимной ориентации доменов и подвижность боковых петель могут дополнять друг друга при рассмотрении полной картины функциональной динамики ферментов. Из-за существенного различия в характерных временах движения доменов (-10"* сек.) и петель (-I0"4 сек.) в барназе, по всей видимости, имеют различное функциональное значение.

5. Два солевых мостика (Lys27-Asp54 и Lys27-Glu73) и другие слабые взаимодействия на поверхности между доменами необходимы для наносекуидных ангармонических доменных движений. Смещение равновесной заселённости в сторону открытой формы из-за введения мутации в барназе Н73А показывает ключевое значение солевого мостика Lys27-GIu73 для стабилизации "закрытого" состояния,

6. Для анализа экспериментальных данных разработан и успешно протестирован пакет программного обеспечения REDCAP (REsidual Dipolar Coupling Analysis Program), одним из основных модулей которого является автоматическое проведение кластер-анализа.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. S.A. Krachkovskii. A.G. Sobol, M.Ya. Reibarkh, M.A. Dubinnyi, E.N. Tkach, L.I. Vasilieva, A.A. Schulga, A.S. Arseniev. Open/Closed Equilibrium of Barnase from NMR Residual Dipolar Couplings II Book of Abstracts of the International Symposium and Summer School in Saint Petersburg Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter 3M Meeting "NMR in Heterogeneous Systems" Saint Petersburg, 2006, p. 74.

2. E.V. Bocharov, A.G. Sobol, K.V. Pavlov, S.A. Krachkovskii. A.V. Zhuravlyova, D.M. Lesovoj, E.N. Lyukmanova, A.V. Schukin, Ya.S. Ermolyuk, E.N. Tkach, A.S. Arseniev. Functional dynamics of proteins revealed by NMR study of L7/L12, TGF-3, barnase and neurotoxin II ft Book of Abstracts of the International Symposium and Summer School in Saint Petersburg. Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter. 2nd Meeting "NMR in Life Sciences" Saint Petersburg, 2005, p. 33.

3. C.A. Крачковский. E.B. Антропов, Д.С. Семенченко, А.Г. Соболь, A.A. Шульга, A.C. Арсеньев. Ипользование остаточных констант дипольного взаимодействия для исследования изменений во взаимной ориентации динамических доменов барназы, вызванных точечными мутациями // Тезисы докладов и стендовых сессий XV зимней международной молодёжной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", ИБХ РАН, Москва, 2003 г., стр. 45.

4. А.Г. Соболь, С.А. Крачковский. ДС. Семенченко, Е.В. Антропов, С.Б. Нольде, A.A. Шульга, М.П. Кирпичников, A.C. Арсеньев. Реориентация динамических доменов барназы, обусловленная точечными мутациями // Тезисы докладов и стендовых сообщений VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, ИБХ РАН, Москва, 2002 г., стр. 69.

5. Е.В. Антропов, С.А. Крачковский. А.Г. Соболь Исследование изменений во взаимной ориентации динамических доменов барназы на основании остаточных

констант диполь-дипольного взаимодействия // Тезисы докладов ХЬУ научной конференции МФТИ (ГУ) "Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук", факультет молекулярной и биологической физики, МФТИ (ГУ), Москва —Долгопрудный, 2002 г., стр 62.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Крачковский, Сергей Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Барназа.

Начальные сведения.

Ферментатнвная активность барназы.

Структурные исследования барназы.

Внутримолекулярная подвижность в барназе.

Применение остаточных дипольных констант для анализа структуры и динамики белков.

Остаточные диполь-дипольные взаимодействия.

Матрица порядка Саупе.

Механизмы ориентирования белка.

Применение остаточных дипольных констант для уточнения пространственной структуры.

Распознавание структур и вписывание гомологичных моделей.

Определение взаимной ориентации доменов белка при помощи дипольных констант.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование остаточных диполь-дипольных взаимодействий для изучения структуры и динамики белков"

В настоящее время при изучении структур биологических макромолекул методом ЯМР основным источником структурной информации являются ограничения на попарные расстояния между протонами, получаемые при анализе данных о ядерном эффекте Оверхаузера (ЯЭО) [ 1 ]. Кроме того, используются константы скалярного спин-спинового взаимодействия (КССВ), дающие ограничения на двугранные углы [2], и информация о внутримолекулярных водородных связях, получаемая из экспериментов по обмену протонов NH на дейтерий растворителя или из спин-спиновых взаимодействий, передаваемых через водородные связи [3]. Большинство из перечисленных выше ограничений являются локальными по своей физической природе. С их помощью удается с хорошей точностью установить локальную структуру макромолекулы и получить набор пространственных структур, хорошо согласующихся с экспериментальными данными. Тем не менее, часто остаются неопределенности в строении отдельных участков молекулы и/или взаимной ориентации элементов вторичной структуры, обусловленные недостаточным количеством ограничений "дальнего порядка", т.е. ограничений на взаимное положение атомов остатков, находящихся далеко друг от друга в первичной структуре и/или в пространстве. Другим осложнением при данном подходе является проблема отнесения большого количества сигналов в области спектра, соответствующей боковым группам аминокислотных остатков, в случае больших белков. Поэтому при работе с мультидоменными белками описанный метод не столь эффективен.

Дополнительную структурную информацию можно получить из спектров ЯМР высокого разрешения при помощи создания анизотропии ориентации растворённых молекул [4,5]. Целый ряд взаимодействий, проявляющихся в спектрах ЯМР, являются анизотропными и описываются тензорами второго ранга, которые в изотропных условиях вырождаются в скалярные величины. Слабое анизотропное распределение ориентации молекул делает эти взаимодействия настолько значительными, что их можно легко детектировать методом ЯМР при условиях стандартных для изучения биологических макромолекул. Частичной ориентации молекулы можно добиться, используя анизотропию ее магнитной восприимчивости (ориентирование во внешнем магнитном поле [5,6,7]) или наличие у нее электрического дипольного момента (ориентирование во внешнем электрическом поле [8]). Однако анизотропия магнитной восприимчивости большинства белков мала и не позволяет достигать достаточной для практического применения степени их ориентирования (в магнитных полях современных ЯМР-спектрометров), а проблемы экспериментального плана затрудняют использование внешнего электрического поля для частичного ориентирования белков. Поэтому обычно белок ориентируют, используя анизотропию его взаимодействия с упорядоченной внешней средой (жидкокристаллической матрицей) [9,10,11].

Таким образом, можно измерить дипольные взаимодействия между ядрами, обладающими магнитным моментом, анизотропию химического сдвига, и квадрупольные взаимодействия. Эффект анизотропного распределения положения молекул удобнее всего описывать при помощи ряда параметров, называющихся тензором ориентации или матрицей порядка Саупе (the Saupe order matrix) [12]. Величина остаточных тензорных взаимодействий является функцией тензора ориентации и направления в пространстве отдельных химических групп по отношению к главным осям тензора, таким образом, неся в себе информацию о структуре молекулы. Одной из таких величин является константа диполь-дипольного взаимодействия (КДЦВ).

Преимущество остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия заключается в том, что они позволяют ввести так называемые дальние ограничения, т.е. несут информацию о взаимной ориентации удалённых или слабо взаимодействующих химических групп. Данные, полученные из КДЦВ, могут быть использованы для уточнения структуры молекулы, рассчитанной при помощи ЯЭО и констант спинспинового взаимодействия [13,14]. Также можно получить структуру и непосредственно из КДДВ, т.е. без использования ЯЭО и КССВ [15,16]. Эксперименты по измерению констант дипольного и спин-спинового взаимодействия проводятся гораздо быстрее, чем эксперименты по измерению ЯЭО и могут применяться к большим белкам, следовательно, они являются очень эффективными при определении структуры молекул методом ЯМР. Поэтому, в настоящее время для расчета структур больших мультидоменных белков и для оценки их динамических параметров часто пользуются ЯМР-методиками, основанными на измерении КДДВ [17,18,19].

Однако, по ходу выполнения работы, в имеющихся методиках были выявлены некоторые существенные недостатки, связанные с необходимостью наличия определенных знаний о структуре исследуемой молекулы (в частности о наличии и составе динамических доменов). Для устранения указанных трудностей был предложен и реализован алгоритм независимого выделения в белке динамических доменов и определения параметров их движения друг относительно друга. Разработанный алгоритм подробно описывается в главе "Материалы и методы", а его тестирование - в "Результаты и обсуждения".

В качестве объекта исследования и тестирования предложенных методик нами была выбрана барназа - представитель класса небольших бактериальных рибонуклеаз.

Часто каталитическая активность ферментов регулируется их конформационными изменениями, которые возникают в ответ на взаимодействие с лигандом или ковалентные модификации, например фосфорилирование [20,21]. Обычно эти изменения можно представить как переходы между определенными устойчивыми (энергетически выгодными) состояниями молекулы белка. Благодаря этим переходам осуществляется связывание/высвобождение субстрата или ингибитора, достигается "правильное" расположение каталитических групп, а также аллостерическое регулирование [ 22,23,24,25,26,27 ]. Помимо этого, изменения конформации белка могут приводить к изменению электрического поля в активном центре фермента [28,29]. Взаимосвязь между внутренней динамикой белка в микро- и миллисекундном временном диапазоне и ходом каталитической реакции была показана для циклофилина А [23] и биназы [25].

Один из наиболее изученных классов ферментов - это рибонуклеазы. Они встречаются в любом живом организме, от прокариот до млекопитающих. Рибонуклеазы в рамках своей функциональной активности - гидролиза молекул РНК - оказываются задействованными в широком спектре метаболических процессов. Изучение взаимосвязи между структурой, внутренней динамикой и функциями этих белков вносит значительный вклад не только в изучение молекулярных основ ферментативного катализа, но, кроме этого, дает возможность приблизиться к пониманию многих процессов клеточного метаболизма на молекулярном уровне.

Один из представителей класса небольших бактериальных рибонуклеаз - барназа -внеклеточный фермент, секретируемый Bacillus amyloliquefaciens. Барназа является хорошо изученным белком, исследованию ее структуры и функций посвящено большое количество работ [30,31,32,33]. К настоящему моменту выполнено много работ по клонированию барназы и ее мутантов, подробно исследованы их каталитические свойства, получено множество данных по термодинамике белка [33,34,35]. Кроме того, при помощи метода молекулярной динамики (МД) показано большое значение доменных движений для энтропийной стабилизации барназы [36]. Выявлено, что в барназе можно выделить два динамических домена, а также получены амплитуды основных коллективных мод, на которые можно разложить внутренние движения белка. Представленная динамическая модель хорошо согласуется с данными, полученными при помощи сайт-специфического мутагенеза [33,34,37,38,39]. Тем не менее, результаты МД исследований требуют независимого экспериментального подтверждения.

Целью данной диссертационной работы является установление динамических характеристик барназы при помощи методик спектроскопии ЯМР, основанных на анализе остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия. Для этого, во-первых, изучаются изменения в структуре белка, вызванные мутацией Е73А, которая препятствует образованию солевого мостика К27-Е73 и, как ожидается, должна приводить к стабилизации открытого состояния фермента [36]. А во-вторых, исследуются динамические характеристики барназы дикого типа.

Работа выполнена в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и является составной частью проводимых в институте исследований структуры и функции биологических макромолекул.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Крачковский, Сергей Александрович

Выводы.

1. Методики и алгоритмы, предложенные в данной работе, могут успешно использоваться для регистрации и детального анализа структурных изменений в белках. Данные методики уникальны в том смысле, что не требуют знания a priori о составе доменов, и применимы для анализа равновесных состояний белков в растворе.

2. Выявлено, что барназа существует в виде двух различных состояний ("открытого" и "закрытого"), которые отличаются друг от друга поворотом одного динамического домена относительно другого на угол ~ 20°. Обе формы находятся в равновесии, и между ними осуществляется быстрый (~10~8 сек.) переход.

3. Состав полученных динамических доменов и параметры их движения хорошо согласуются с результатами молекулярно-динамических расчетов, представленными в работе [36].

4. Так как "дно" активного центра барназы, расположено на поверхности между двумя полученными доменами, то доменные движения играют существенную роль в активности фермента. Изменение взаимной ориентации доменов и подвижность боковых петель [23,25] могут дополнять друг друга при рассмотрении полной картины функциональной динамики ферментов. Из-за существенного различия в характерных временах, движения доменов (~10"8 сек.) и петель (~1СГ4 сек.) в барназе, по всей видимости, имеют различное функциональное значение.

5. Два солевых мостика (Lys27-Asp54 и Lys27-Glu73) и другие слабые взаимодействия на поверхности между доменами необходимы для наносекундных ангармонических [36,97] доменных движений [98]. Смещение равновесной заселённости в сторону открытой формы из-за введения мутации в барназе Е73А показывает ключевое значение солевого мостика Lys27-Glu73 для стабилизации "закрытого" состояния [36].

6. Для анализа экспериментальных данных разработан пакет программного обеспечения REDCAP (REsidual Dipolar Coupling Analysis Program), одним из основных модулей которого является автоматическое проведение кластер-анализа.

Заключение.

Полученные в диссертационной работе результаты демонстрируют удобство и эффективность применения остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия для уточнения пространственной структуры и анализа динамических параметров мультидоменных белков. Тестирование разработанного алгоритма кластеризации на МВР и барназе показало, что метод, основанный на анализе КДДВ является самодостаточным в том смысле, что он не требует данных о составе доменов, полученных a priori какими-то другими способами (необходимо только знание структуры белка).

При помощи предложенной методики было проверено основанное на теоретических расчетах методом молекулярной динамики предположение о наличии в барназе высокоамплитудных коллективных (доменных) движений и, как следствие, существовании миллисекундной динамики в активном центре фермента [36]. В итоге выявлено, что в барназе можно выделить два динамических домена. При этом в растворе белок существует в виде равновесия двух различных форм ("открытого" и "закрытого" состояний). Между ними осуществляется быстрый переход (вероятно ~10"8 сек.). Так как при этом активный центр барназы претерпевает значительные структурные изменения, то данное движение может иметь существенное значение для её ферментативной активности. Также в работе показано ключевое значение солевого мостика Lys27-Glu73 для стабилизации "закрытого" состояния белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Крачковский, Сергей Александрович, Москва

1. J.H.Noggle and R.E.Schrimer, The Nuclear Overhauser Effect. New York: Academic Press,1971.

2. V.F.Byslrov "Spin-spin coupling and the conformational states of peptide systems". Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1980.10. 41-81.

3. Florence Cordier, Marco Rogowski, Stephan Grzesiek & Ad Bax "Observation of Through-Hydrogen-Bond 2hJHC' in a Perdeuterated Protein". J. Magn. Reson. В 1999.140. 510-512.

4. Nico Tjandra, Ad Bax "Direct Measurement of Distances and Angles in Biomolecules by NMR in a Dilute Liquid Crystalline Medium". Sciense 1997. 278. 1111-1113.

5. Nico Tjandra, James G.Omichinski, Angela M.Gronenborn, G.Marius Clore & Ad Bax "Use of dipolar 'H-15N and 'H-13C couplings in the structure determination of magnetically oriented macromolecules in solution". Nat. Struct. Biol. 1997. 4. 732-738.

6. J.R.Tolman, J.M.Flanagan, M.A.Kennedy & J.H.Prestegard "Nuclear magnetic dipole interactions in field-oriented proteins: information for structure determination in solution". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. 92. 9279-9283.1.^

7. L.Huis, F.J.J.de Kanter & C.MacLean "Chemical shielding anisotropy of С in CH3 *CN determined by NMR spectroscopy of the dielectrically oriented molecule". Molecular Physics 1991.73. 1077-1083.

8. J.F.Trempe, F.G.Morin, Z.Xia, R.H.Marchessault & KGehring "Characterization of polyacrylamide-stabilized Pfl phage liquid crystals for protein NMR spectroscopy". J. Biomol. NMR 2002. 22. 83-87.

9. Marcel Ottiger, Ad Bax "Characterization of magnetically oriented phospholipids micelles for measurement of dipolar couplings in macromolecules". J. Biomol. NMR 1998.12. 361372.

10. A.Saupe "Recent results in the field of liquid crystals". Angew. Chem. 1968. 7. 97-112.

11. G.Marius Clore, D.S.Garrett "R-factor, free R and complete cross-validation for dipolar coupling refinement of NMR structures". J. Am. Chem. Soc. 1999.121. 9008-9012.

12. Frank Delaglio, G.Kontaxis & Ad Bax "Protein structure determination using molecular fragment replacement and NMR dipolar couplings". J. Am. Chem. Soc. 2000.122. 21422143.

13. C.A.Fowler, F. Tian, H.M.Al-Hashimi & J.H.Prestegard "Direct measurement of 1H-1H dipolar couplings in proteins: a complement to traditional NOE measurements". J. Mol. Biol. 2000. 304. 447-460.

14. Ad Bax "Weak alignment offers new NMR opportunities to study protein structure and dynamics". Protein Science 2003.12.1-16.

15. J.R.Tolman "Dipolar couplings as a probe of molecular dynamics and structure in solution". Current Opinion in Structural Biology 2001.11. 532-539.

16. J.H.Prestegard "New techniques in structural NMR anisotropic interactions". Nat. Struct. Biol. NMR Suppl 1998. 5. 517-522.

17. Alan Fersht, Structure and mechanism in protein science. A guide to enzyme catalysis and protein folding. New York: Freeman, 1999. 44-51.

18. N.A. Temiz, I.Bahar "Inhibitor binding alters the directions of domain motions in HIV-1 reverse transcriptase". Proteins: Struct. Funct. Genet 2002. 49. 61-70.

19. J.R.Schnell, H.J.Dyson & P.E. Write "Structure, dynamics, and catalytic function of dihydrofolate reductase". Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004.33. 119-140.

20. E.Z.Eisenmesser, D.A.Bosco, M.Akke & D.Kern "Enzyme dynamics during catalysis". Sciense 2002. 295. 1520-1523.

21. O.Miyashita, J.N.Onuchic & P.G. Wolynes "Nonlinear elasticity, proteinquakes, and the energy landscapes of functional transitions in proteins". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003. 100. 12570-12575.

22. L. Wang, Y.Pang, T.Holder, J.R.Brender, A. V.Kurochkin & E.R.P.Zuiderweg "Functional dynamics in the active site of the ribonuclease binase". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. 98. 7684-7689.

23. B.F. Volkman, D.Lipson, D.E. Wemmer & D.Kern "Two-state allosteric behavior in a single-domain signaling protein". Sciense 2001. 291. 2429-2433.

24. M.Revington, Т. Holder & E.R.P.Zuiderweg "NMR study of nucleotide-induced changes in the nucleotide binding domain of Thermus Thermophilus Hsp70 chaperone DnaK: implication for the allosteric mechanism". J. Biol. Chem. Papers in Press 2004.

25. B.M.P.Huyghues-Despointes, R.L.Thurlkill, M.D.Daily, D.Schell, J.M.Briggs, J.M.Antosiewicz, C.N.Pace & J.M.Scholtz "pK values of histidine residues in ribonuclease Sa: effect of salt and net charge.". J. Mol. Biol. 2003. 325. 1093-1105.

26. Y.Mauguen, R.W.Hartley, EJ.Dodson, G.G.Dodson, G.Bricone, C.Chothina & A.Jack "Molecular structure of a new family of ribonucleases". Nature 1982. 297. 162-164.

27. D.E.Mossakowska, K.Nyberg & A.R.Fersht "Kinetic characterization of the recombinant ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and investigation of key residues in catalysis by site-directed mutagenesis". Biochemistry 1989. 28. 3843-3850.

28. E.M.Meiering, L.A.Serrano & A.R.Fersht "Effect of active site residues in barnase on activity and stability". J. Mol. Biol. 1992. 225. 585-589.

29. F.Khan, J.I.Chuang, S.Gianni & A.R.Fersht "The kinetic pathway of folding of barnase". J. Mol. Biol. 2003.333.169-186.

30. S.B.Nolde, A.S.Arseniev, Vladislav Yu.Orekhov & M.Billeter "Essential domain motions in barnase revealed by MD simulations". Proteins: Struct. Funct. Genet 2002. 46. 250-258.

31. D.D.Axe, N. W.Foster & A.R.Fersht "An irregular beta-bulge common to a group of bacterial RNases is an important determinant of stability and function in barnase". J. Mol. Biol. 1999. 286. 1471-1485.

32. D.D.Axe, N. W.Foster & A.R.Fersht "A search for single substitutions that eliminate enzymatic function in abacterial ribonuclease". Biochemistry 1998. 37. 7157-7166.

33. L.A.Serrano, J.T.Kellis, P.Cann, A.Matouschek & A.R.Fersht "The folding of enzyme. 2. Substructure of barnase and the contribution of different interactions to protein stability". J. Mol. Biol. 1992. 224. 783-804.

34. R. W.Hartley "Homology between prokaryotic and eukaryotic ribonucleases". J. Mol. Evol. 1980.15.355-358.

35. C.Hill, G.Dodson, U.Heinemann, W.Saenger, Y.Mitsui, KNakamura, S.Borisov, G.Tischenko, K.Polyakov & S.Pavlovsky "The structural and sequence homology of a family of microbial ribonucleases". Trends. Biochem. Sci. 1983.14. 1-6.

36. K. Takahashi, S.Moore "Ribonuclease Tl". Enzymes 1982.15. 435-468.

37. S.Nishimura, M.Nomura "Ribonuclease of Bacillus subtilis". J. Biochem. 1959. 46. 161-167.

38. N.E. Welker, L.L.Campbell "Comparsion of the б-amylase of Bacillus subtilis and B. amyloliquefaciens". J. Bacteriol. 1967. 94. 1131-1135.

39. R. W.Hartley "A reversible thermal transition of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens". Biochemistry 1968. 7. 2401-2408.

40. G. W.Rushizky, A.E.Greco, R. W.Hartley & H.A.Sober "Studies on the characterization of ribonucleases". J. Biol. Chem. 1964. 239. 2165-2169.

41. H.L.Osterman, F.G.Jr. Waltz "Subsites and catalytic mechanism of ribonuclease Tl: Kinetic studies GpA, GpC, GpG and GpU as substrates". Biochemistry 1978.17. 4124-4130.

42. P.C.Fitzgerald, R. W.Hartley "Polyethenoadenosine phosphate as a fluorogenic substrate for barnase". Anal. Biochem 1993. 214. 544-547.

43. M.Saunders, A. Wishina & J.G.Kirkwood "The nuclear magnetic resonance spectrum of ribonuclease". J. Am. Chem. Soc. 1957. 79. 3285-3290.

44. F.M.Richards, H. W. Wyckoff"~QoVm.Q pancreatic ribonuclease". Enzymes 1971. 4. 647-805.

45. V.Guillet, A.Lapthorn & Y.Mauguen "3-Dimensional structure of abarnase-3'-GMP complex at 2.2-angstrom resolution". FEBS Lett. 1993. 330. 137-140.

46. E.M.Meiering, M.Bycroft, M.J.Lubienski & A.R.Fersht "Structure and dynamics of barnase complexed with З'-GMP studied by NMR spectroscopy". Biochemistry 1993. 32. 1097510987.

47. J.Sevcik, E.J.Dodson & G.G.Dodson "Determination and restrained least-squares refinement of the structures of ribonuclease Sa and its complex with З'-quanylic acid at 1.8 E resolution". ActaCryst. 1991.47. 240-253.

48. M.Bycroft, S.Ludvigsen, A.R.Fersht & F.M.Poulsen "Determination og the three-dimensional solution structure of barnase using nuclear magnetic resonance spectroscopy". Biochemistry 1991.30. 8697-8701.

49. S.Baudet, J.Janin "Crystal structure of barnase-d(GpC) complex at 1.9 E resolution". J. Mol. Biol. 1991.219. 123-132.

50. A.A.Schulga, F.Kurbanov, M.P.Kirpichnikov, I.I.Protasevich, V.M.Lobachov, B.Renjbar, V.Chekhov, K.M.Polyakov, Y.Engelborn & A.A.Makarov "Comparative study of binase and barnase: experience in chimeric ribonucleases". Protein Eng. 1998.11. 775-782.

51. M.Gochin, H.Roder "Protein structure refinement based on paramagnetic NMR shifts: applications to wild-type and mutant forms of cytochrome c". Nat. Struct. Biol. 1995. 4. 296305.

52. Charles R.Sanders II, B.J.Hare, K.P.Howard & J.H.Prestegard "Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules". Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1994. 26. 421-444.

53. M.R.Hansen, L.Mueller &A.Pardi "Tunable alignment of macromolecules by filamentous phage yields dipolar coupling interactions". J. Nat. Struct. Biol. 1998. 5. 1065-1074.

54. J.Sass, Florence Cordier, A.Hoffman, A.Cousin, J.G.Omichinski, H.Lowen & Stephan Grzesiek "Purple membrane induced alignment of biological macromolecules in the magnetic field". J. Am. Chem. Soc. 1999.121. 2047-2055.

55. R.Tycko, F.Blanco & Y.Ishii "Alignment of biopolymers in strained gels: a new way to create detectable dipole-dipole couplings in high resolution biomolecular NMR". J. Am. Chem. Soc. 2000.122. 9340-9341.

56. V. V.Klochkov, A. V.Klochkov, C.M.Thiele & S.Berger "A novel liquid crystalline system for partial alignment of polar organic molecules". J. Magn. Reson. 2005.178. 41-46.

57. Keiran Fleming, Derek Gray, Sunil Prasannan & Stephen Matthews "Cellulose Crystallites: A New and Robust Liquid Crystalline Medium for the Measurement of Residual Dipolar Couplings". J. Am. Chem. Soc. 2000.122. 5224-5225.

58. Ad Bax, Nico Tjandra "High-resolution heteronuclear NMR of human ubiquitin in an aqueous liquid crystalline medium". J. Biomol. NMR 1997.10. 289-292.

59. M.Zweckstetter, Ad Bax "Prediction of Sterically Induced Alignment in a Dilute Liquid Crystalline Phase: Aid to Protein Structure Determination by NMR". J. Am. Chem. Soc. 2000.122. 3791-3792.

60. C.A.Beweley, G.Marius Clore "Determination of the Relative Orientation of the Two Halves of the Domain-Swapped Dimer of Cyanovirin-N in Solution Using Dipolar Couplings and Rigid Body Minimization". J. Am. Chem. Soc. 2000.122. 6009-6016.

61. G.Cornilescu, J.L.Marquardt, Marcel Ottiger & Ad Bax "Validation of Protein Structure from Anisotropic Carbonyl Chemical Shifts in a Dilute Liquid Crystalline Phase". J. Am. Chem. Soc. 1998.120. 6836-6837.

62. G.Cornilescu, Ad Bax "Measurement of Proton, Nitrogen, and Carbonyl Chemical Shielding Anisotropics in a Protein Dissolved in a Dilute Liquid Crystalline Phase". J. Am. Chem. Soc. 2000.122.10143-10154.

63. Marcel Ottiger, Nico Tjandra & Ad Bax "Magnetic Field Dependent Amide 15N Chemical Shifts in a Protein-DNA Complex Resulting from Magnetic Ordering in Solution". J. Am. Chem. Soc. 1997.119. 9825-9830.

64. J.J.Chou, S.Li, C.B.Klee &AdBax "Solution structure of Ca2+-calmodulin reveals flexible hand-like properties of its domains". Nat. Struct. Biol. 2001. 8. 990-997.

65. M.Ikura, S.Spera, G.Barbato, Lewis E.Kay, M.Krinks & Ad Bax "Secondary structure and side-chain and 13C resonance assignments of calmodulin in solution by heteronuclear multidimensional NMR-spectroscopy". Biochemistry 1991. 30. 9216-9228.

66. M.A. Wilson, A.T.Brunger "The 1.0 A crystal structure of Ca2+-bound calmodulin: an analysis of disorder and implications for functionally relevant plasticity". J. Mol. Biol. 2000. 301. 1237-1256.

67. J.J.Chou, S.Li & Ad Bax "Study of conformational rearrangement and refinement of structural homology models by the use of heteronuclear dipolar couplings". J. Biomol. NMR 2000.18.217-227.

68. M.Levitt "Accurate modeling of protein conformation by automatic segment matching". J. Mol. Biol. 1992. 226. 507-533.

69. W.F.Mark, M. W.Fisher, J.A.Losonczi, J.L. Weaver & J.H.Prestegard "Domain orientation and dynamics in multidomain proteins from residual dipolar couplings". Biochemistry 1999. 38. 9013-9022.

70. N.KGoto, N.R.Skrynnikov, F. W.Dahlquist & Lewis E.Kay "What is the average conformation of bacteriophage T4 lysozyme in solution? A domain orientation study using dipolar couplings measured by solution NMR". J. Mol. Biol. 2001. 308. 745-764.

71. Richard R.Ernst, Geoffrey Bodenhausen, and Alexander Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions. Oxford: Clarendon Press, 1987.

72. Nico Tjandra, Stephan Grzesiek & Ad Bax "Magnetic Field Dependence of Nitrogen-Proton J Splittings in 15N-Enriched Human Ubiquitin Resulting from Relaxation Interference and Residual Dipolar Coupling". J. Am. Chem. Soc. 1996.118. 6264-6272.1 2

73. J. Wirmer, H.Schwalbe "Angular dependence of J(N/,ca;) and J(N/,ca(;-/j) coupling constants measured in J-modulated HSQCs ". J. Biomol. NMR 2002. 23. 47-55.

74. K.Ding, A.M.Grohenborn "Sensitivity-enhanced E.COSY type HSQC experiments for accurate measurements of one- bond 15N-'Hn and 15N-13C' two-bond 13C'-'HN residual dipolar couplings in proteins". J. Magn. Reson. 2002.158. 173-177.

75. Marcel Ottiger, AdBax "Determination of Relative N-HN, N-C', С-С', and C-H Effective Bond Lengths in a Protein by NMR in a Dilute Liquid Crystalline Phase". J. Am. Chem. Soc. 1998.120.12334-12341.

76. P.Permi "A spin-state-selective experiment for measuring heteronuclear one-bond and homonuclear two-bond couplings from an HSQC-type spectrum". J. Biomol. NMR 2002. 22. 27-35.

77. M.Ya.Reibarkh, D.E.Nolde, L.I.Vasilieva, E.V.Bocharov, A.A.Schulga, M.P.Kirpichnikov & A.S.Arseniev "Three-dimensional structure of binase in solution". FEBS Lett. 1998. 431. 250254.

78. P.Guentert, C.Mumenthaler & K. Wuthrich "Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA". J. Mol. Biol. 1997. 273. 283-298.

79. N.R.Skrynnikov, Lewis E.Kay "Assessment of molecular structure using frame-independent orientational restraints deraved from residual dipolar couplings". J. Biomol. NMR 2000.18. 239-252.

80. G.Marius Clore, Angela M.Gronenborn & Ad Box "A Robust Method for Determining the Magnitude of the Fully Asymmetric Alignment Tensor of Oriented Macromolecules in the Absence of Structural Information". J. Magn. Reson. 1998.133. 216-221.

81. Matthias Buck, Martin Karplus "Internal and Overall Peptide Group Motion in Proteins: Molecular Dynamics Simulations for Lysozyme Comared with Results from X-ray and NMR Spectroscopy". J. Am. Chem. Soc. 1999.121. 9645-9658.

82. G.Basu, A.Kitao, A.Kuki & N.Go "Protein electron transfer reorganization energy spectrum from normal mode analysis. 2. Application to Ru-modified cytochrome C". J. phys. Chem. 1998.11.2085-2094.

83. J.Evenas, V.Tugarinov, N.R.Skrynnikov, N.KGoto, R.Muhandiram & Lewis E.Kay "Ligand-induced structural changes to maltodextrine-binding protein as studied by solution NMR spectroscopy.". J. Mol. Biol. 2001.309. 961-974.

84. A.T.Brunger, C.L.Brooks 3rd & M.Karplus "Active site dynamics of ribonuclease". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985. 82. 8458-8462.

85. D.G.Covell, A. Wallquist "Analysis of protein-protein interactions and effect of amino acid mutations on their energetics. The importance of water molecules in the binding epitope.". J. Mol. Biol. 1997. 269. 281-297.

86. Alan Fersht "A kinetically significant intermediate in the folding of barnase". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. 97. 14121-14126.

87. A.Kitao, N.Go "Investigating protein dynamics in collective coordinate space". Current Opinion in Structural Biology 1999. 9. 164-169.

88. K.-C.Chou "Low-frequency collective motion in biomacromolecules and its biological functions". Biophys. Chem. 1988. 30. 3-48.

89. M.R.Pelizzo, A.Toniato, A.Piotto & P.Bernante "Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions". J. Biomol. NMR 1992. 2. 661-665.

90. D.Marion, M.Ikura, R. Tschudin & Ad Bax "Rapid recording of 2D NMR spectra without phase cycling. Application to the study of hydrogen exchangein proteins". J. Magn. Reson. 1989. 85. 393-399.

91. D.J.States, R.A.Haberkorn & D.J.Ruben "A two-dimensional nuclear Overhauser experiment with pure absorption phase in four quadrants". J. Magn. Reson. 1982. 48. 286292.