Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы агрегации макромолекул белков в водных растворах, содержащих ионы тяжелых металлов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Процессы агрегации макромолекул белков в водных растворах, содержащих ионы тяжелых металлов"

На правах рукописи УДК 577.32

Тен Дмитрий Ильич

Процессы агрегации макромолекул белков в водных растворах, содержащих ионы тяжелых металлов

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Петрова Галина Петровна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Караваев Владимир Александрович

доктор биологических наук,

профессор Замятнин Александр Александрович

Ведущая организация: Институт биохимической физики

им. Н.М. Эммануэля РАН

Защита диссертации состоится ^^МА^Ь^Я 2003 года в на заседании диссертационного совета К 501.001.08 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Физический факультет, аудитория $Г~(Й • С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан ^сентября 2003 года. Ученый секретарь

диссертационного совета К 501.001.08, кандидат физико-математических наук j { Г.Б. Хомутов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также влияния внешних факторов на белковые системы представляет собой одну из наиболее актуальных проблем физики конденсированного состояния вещества. Меж молекулярные взаимодействия и динамика белковых макромолекул играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем. В условиях современной жизни особенно интересным представляется изучение неизбежного влияния на эти системы различных отрицательных факторов и токсических воздействий, среди которых особое внимание следует уделить воздействию тяжелых металлов (ТМ), т.е. металлических ионов, обладающих большими ионными радиусами.

Сравнительно недавно было обнаружено новое явление - образование макромолекулярных кластеров в растворах белка в присутствии солей тяжелых щелочных металлов ЯЬС1 и С?С/. Поведение белков в растворах, представляющих собой лиотропные жидкокристаллические системы, определяется сильным электростатическим взаимодействием между зарядами на поверхности макромолекул. Однако оказалось, что при определенных условиях (когда силы заряд-зарядового взаимодействия экранируются ионами ТМ) в таких системах, как и в термотропных жидких кристаллах, существенную роль начинают играть диполь-дипольные взаимодействия, что приводит к изменениям как статических, так и динамических параметров молекул. Таким образом, несомненный интерес представляло детальное исследование механизма подобного поведения белковых молекул при наличии в растворе ионов металлов с различными значениями заряда и ионного радиуса.

Исследуемая проблема появляется на стыке таких областей естествознания как физика, химия, биология, медицина и экология, а потому представляет интерес как для фундаментальной науки, так и для практического понимания механизмов патологических изменений в биологических объектах при токсических воздействиях. С другой стороны, именно поэтому исследования носят преимущественно поисковый характер, а полученные результаты пока весьма сложны для однозначной интерпретации в рамках существующих теорий или построения собственной последовательной теории.

Цели и задачи работы

Целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в жидких системах растворов белковых макромолекул, содержащих ионы тяжелых металлов. Для этого ставился ряд практических задач:

1. Исследовать экспериментально явление возникновения макромолекулярных кластеров в растворах яичного и сывороточных альбуминов, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов: свинца, меди и кадмия.

2. Изучить влияние концентрации ионов ТМ в растворе и величины поверхностного заряда белковых молекул на такие параметры системы как масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия.

3. Изучить влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, в области изоэлекгрической точки белка.

4. Показать, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе определенным образом связаны с величиной и знаком поверхностного зарада на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе.

5. Предложить физическую модель, объясняющую обнаруженное явление.

Научная новизна

С помощью метода светорассеяния впервые проведено систематическое исследование нового явления образования макромолекулярных кластеров в водных растворах яичного и сывороточных альбуминов в присутствии солей свинца, меди и кадмия при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, водородный показатель раствора (поверхностный заряд частиц) и ионная сила (концентрация ионов ТМ).

Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ.

Впервые показано, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе: электронная поляризуемость, оптическая анизотропия, коэффициент деполяризации, - существенным образом связаны с величиной и знаком поверхностного заряда на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе, и имеют экстремумы в изоэлекгрической точке.

Предложена физическая модель, объясняющая явление агрегации белковых макромолекул на основании модели сильных диполь-дипольных взаимодействий. Сделано предположение о том, что обнаруженный эффект обусловлен началом фазового перехода в упорядоченную мезофазу, связанного с преобладанием диполь-дипольных взаимодействий над силами кулоновского отталкивания.

Практическая ценность

Изученное в работе поведение биополимерных макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей позволяет установить молекулярный механизм патологических изменений в биологических объектах, связанный с токсическим воздействием тяжелых металлов на живые объекты. Материалы диссертации могут быть использованы при разработках способов контроля качества органических жидкостей и физических методов диагностики распространенных заболеваний, а также для создания диагностических приборов.

Защищаемые положения

1. Впервые обнаружено и детально исследовано явление возникновения макромолекулярных кластеров в растворах яичного и сывороточных альбуминов, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов: свинца, меди и кадмия.

2. Изучено влияние концентрации ионов ТМ в растворе и величины поверхностного заряда белковых молекул на такие параметры системы как масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия.

3. Гипотеза об аномальной сорбции металлов с большим ионным радиусом на заряженной поверхности белка подтверждена на основании физической модели агрегации макромолекул вследствие сильных диполь-дипольных взаимодействий.

4. Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру надмолекулярных агрегатов, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, и подтверждено существование температурного эффекта в области изоэлекгрической точки белка, связанного с процессом разрушения кластеров.

Апробация работы и публикации

Основные результаты работы были доложены на конференциях «Физические проблемы экологии» (Москва, 2001), «Ломоносовские чтения 2002» (Москва, 2002), «Conference on Lasers, Applications and Technologies IQEC/LAT2002» (Moscow, 2002), а также представлены на конференциях ALT-99, LALS-2002, ALT-02, ALT-03.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ: 7 статей и 8 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, приложения, выводов и списка литературы, содержащего 112 источников. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 39 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ дается общая характеристика работы,

обосновывается актуальность, новизна и практическое значение исследуемой проблемы, говорится об экспериментальном методе и объектах исследования, использованных в работе.

ГЛАВА 1 диссертации содержит общие сведения о химическом составе и строении белковых макромолекул, их физических свойствах и методах исследования.

Изложены основные положения теории Дебая-Хгоккеля, описывающей поведение полиэлектролитов в растворе в свете простейшей модели твердых сфер, погруженных в сплошную среду и взаимодействующих по закону Кулона. Согласно этой теории, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий.

Введены понятия ионной силы, водородного показателя среды и изоэлектрической точки, определена связь водородного показателя с поверхностным зарядом макромолекулы.

ГЛАВА 2 посвящена описанию метода исследования,

использованного в работе.

Приведены основные положения теории интегрального рэлеевского рассеяния света на флуктуациях плотности и флуктуациях концентрации растворенного вещества для растворов малых частиц. Освещены особенности влияния анизотропии рассеивающих частиц на деполяризацию рассеянного света и ослабления света в растворах.

Согласно теории Дебая с помощью экспериментально измеренного коэффициента рэлеевского рассеяния

можно определить массу рассеивающих частиц М и коэффициент межмолекулярного взаимодействия В для неидеальных разбавленных

растворов с учетом вириального разложения осмотического давления по степеням концентрации с, поскольку в этом случае

сНК

К 90 J

— +2Вс + ... М

где коэффициент К - фактор Кабанна - связан с величиной коэффициента деполяризации рассеянного света в случае поляризованного по оси 2

возбуждающего луча д„ = — формулой К{Д „) = 3 + .

// 3-4Д„

Кроме того, соотношение Лорентц-Лоренца позволяет получить среднюю поляризуемость молекулы

1 / \ паМ ((1п Л

" " 2яЫА уас)

Коэффициент деполяризации можно связать с анизотропией тензора поляризуемости у, для вертикально поляризованного падающего света:

А =

45 а 2 + 4 у 2 '

Если предположить, что рассеивающие молекулы имеют только две различные компоненты тензора поляризуемости, то последние выражения позволяют рассчитать значения анизотропии тензора поляризуемости и его компонент.

ГЛАВА 3 представляет собой обзор литературных данных,

отражающий современные представления о трехкомпонентных растворах полиэлектролитов, и состоит из двух разделов.

В первом разделе изложены особенности взаимодействия макроионов в растворе, содержащем кроме низкомолекулярного растворителя еще и третью компоненту - сильный электролит. Согласно теории Скэтчарда, парные взаимодействия в таких растворах описываются вторым вириальным коэффициентом в разложении для свободной энергии, выражение для которого имеет вид:

в = -^Цг —— +

Уг { г2 , рг2 тз

М 2 V 4т з 2 А + 2ргътг;

Коэффициент взаимодействия меняется с ростом суммарного заряда на белке 2 по параболическому закону (эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке {2=0) и может принимать отрицательные значения при существенных взаимодействиях (@2з) между макроионом и ионом соли. При возрастании ионной силы (т3) вокруг заряженной молекулы белка в растворе возникает облако противоионов, экранирующее кулоновские взаимодействия; коэффициент В уменьшается и стремится к величине, характерной для полностью незаряженных молекул и определяемой ван-дер-ваальсовыми силами, однако параболический вид зависимости В (2) сохраняется.

Второй раздел освещает результаты работ, посвященных исследованию белковых растворов методами светорассеяния. Особое внимание уделено работе Эдсолла, подтверждающей теорию Скэтчарда и серии недавних работ, основным результатом которых стало открытие нового явления -формирования макромолекулярных кластеров в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых щелочных металлов. Отмечаются качественные изменения зависимости второго вириального коэффициента от поверхностного заряда белка и характерный скачок массы рассеивающих частиц в области изоэлектрической точки белка для растворов сывороточного и яичного альбуминов, содержащих соли рубидия и цезия. Приведены также результаты экспериментов по изучению анизотропии рассеивающих частиц, их средней поляризуемости и деполяризации рассеянного света.

ГЛАВА 4 содержит подробное описание эксперимента и результаты исследования водных растворов белков, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов, и включает в себя несколько разделов.

Объекты исследования и подготовка образцов

В работе были исследованы следующие белки (на базе препаратов "Sigma" и "Serva"): яичный альбумин (Egg), бычий сывороточный альбумин (BSA) и человеческий сывороточный альбумин (HSA). Сопутствующими ТМ-добавками послужили растворимые соли переходных металлов: хлорид меди (Си), ацетат свинца (РЬ) и сульфат кадмия (Cd). Приведены краткие характеристики физико-химических свойств использованных элементов и их соединений. Подробно изложена методика и условия приготовления исследуемых систем с заданными параметрами.

Описание экспериментальной установки

Измерения проводились на установке с He-Ne лазером ГН 25-1 и фотоэлектрической регистрацией рассеянного излучения, возможностью разделения его поляризованной и деполяризованной компонент и управления температурным режимом измерительной ячейки. В качестве эталонной жидкости использовался бензол, обеспыленный с помощью многократной перегонки и помещенный в стеклянную запаянную ампулу. Снятие сигнала, расчеты и обработка данных проводились в автоматическом режиме непосредственно в течение эксперимента, для чего было разработано специальное приложение.

Особенности межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых металлов

Обнаружено, что характер зависимости В(рН) существенно отличен от описанного в теории Скэтчарда, аналогично тому, что наблюдалось в случае щелочных ТМ. При малых ионных силах коэффициент взаимодействия В с ростом рН изменяется по параболическому закону с минимумом в области изоэлектрической точки, причем принимает отрицательные значения. Можно предположить, что это происходит за счет роста третьего члена в формуле Скэтчарда, характеризующего взаимодействия между макроионами и ионами соли. При дальнейшем увеличении ионной силы наблюдается рост В с ярко выраженным максимумом в области изоэлектрической точки, причем с увеличением ионной силы раствора происходит рост максимума.

-M

pH

4,0 4.2 4.4 4.« 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,0 (.0

Puc.l: Зависимость коэффициента взаимодействия В от поверхностного заряда BSA в растворе при различных концентрациях ацетата свинца 1 - без соли, 2 - ц=0,00075,3 - ц=0,00105,4 - ц=0,0012,5 - 1=0,0015 моль/л.

Зависимость эффективной массы рассеивающих частиц в водных растворах белков от поверхностного заряда макромолекул и ионной силы раствора

Обнаружено, что масса рассеивающих частиц не остается постоянной с изменением поверхностного заряда на белке, а имеет максимальную величину в окрестности изоэлектрической точки белка и увеличивается с ростом концентрации соли ТМ в растворе, что свидетельствует о формировании крупных молекулярных агрегатов.

4,0 4,2 4,4 4,6 4,0 5,0 5.2 5.4 5.6 5Л 6,0

Рис.1: Зависимость массы рассеивающих частиц M от поверхностного заряда BSÂ в растворе при различных концентрациях ацетата свинца: 1 - без соли, 2 - fi=0,00075,3 - //=0,00105,4 - (л=0,0015 моль/л.

Поляризационные свойства исследуемых растворов при изменении водородного показателя и ионной силы

При измерении коэффициента деполяризации для растворов BSA в присутствии хлорида меди и HSA в присутствии ацетата свинца были получены существенно нелинейные кривые, свидетельствующие об изменении оптической анизотропии рассеивающих частиц. При этом значения коэффициента деполяризации уменьшаются с ростом ионной силы, а его зависимость от концентрации свободных протонов приближается к линейной.

4,0 4,2 4.4 4,6 4,8 5,0 5,2 5.4 5,6 5,8

Рис.2: Зависимость коэффициента деполяризации Д, поверхностного заряда BSA в растворе при различных концентрациях ацетата свинца: 1 - /.¡=0,00075, 2 -ц=0,00105,Т>-ц=0,0012,А-ц=0,0015 моль/л.

Были рассчитаны значения квадрата анизотропии тензора поляризуемости и средней поляризуемости частиц от поверхностного заряда на белке при различных ионных силах. Эти величины также приобретают существенно нелинейную зависимость от концентрации свободных протонов растворе, причем их значения растут с увеличением концентрации соли тяжелого металла в растворе, а в области изоэлектрической точки наблюдается экстремум. По всей видимости, кластеры представляют собой крупные надмолекулярные образования, которые менее симметричны и более анизотропны по сравнению с отдельными молекулами (по крайней мере, с точки зрения их поляризационных свойств).

i 5 4 3 2 1 в -I -2 -3 -4 -5 -«

4,0 4,2 4,4 4,6 44 5,0 5.2 5,4 5.6 5,8 6.0

Puc.i: Зависимость квадрата анизотропии тензора поляризуемости "f от поверхностного заряда BSA в растворе при различных концентрациях ацетата свинца: 1 - ц=0,00075,2-М=О,00Ю5,3 - ц=0,0015 моль/л.

Влияние температуры на свойства рассеивающих частиц в растворах, содержащих ионы тяжелых металлов

В серии экспериментов с водными растворами яичного и сывороточного альбуминов, содержащими ацетат свинца в малых концентрациях (ц=0,00105 моль/л), было получено, что кривые зависимостей В(рН) при изменении температуры раствора в интервале от комнатной до 42°С расположены очень близко друг к другу, существенное различие наблюдается, как и следовало ожидать, только в области изоэлектрической точки.

Исследования показали, что при фиксированном значении водородного показателя, близком к изоэлектрической точке, коэффициент межмолекулярного взаимодействия увеличивается с повышением температуры и имеет максимум вблизи температуры порядка 30°С (вследствие увеличения сил кулоновского отталкивания), а далее после максимума начинается спад, который может быть обусловлен необратимым свертыванием белка (денатурации). Такое поведение было характерно для всех исследованных систем.

Рис.4: Температурная зависимость коэффициента взаимодействия В для сывороточного альбумина (Н8А) вблизи изоэлектрической точки (рН=5,5) в растворе ацетата свинца (¡1=0,00105 моль/л).

Показано также, что эффективная масса рассеивающих частиц уменьшается примерно на порядок с ростом температуры. Этот эффект связан, скорее всего, с разрушением надмолекулярных комплексов — кластеров, т.к. тепловая энергия становится больше энергии диполь-дипольного взаимодействия.

Рис.5: Температурная зависимость массы рассеивающих частиц М для яичного альбумина (Egg) вблизи изоэлектрической точки (рН=4,9) в растворе ацетата свинца (¡л=0,00105 моль/л).

ГЛАВА 5 посвящена обсуждению полученных результатов и

освещает два момента.

Особенности процесса адсорбции ионов металлов с различными ионными радиусами на поверхности белковых молекул

Взаимодействие иона с поверхностью белка происходит, как правило, с участием их гидратных оболочек. Если энергия связи иона с дипольной молекулой воды Еп, которая зависит от ионного радиуса, меньше тепловой энергии кТ, то на поверхности ионов вода не будет удерживаться:

2 „ 2

Е - 4 1

РЧ 11 „ 4 1гТ

12 ле г0" кТ •

Взаимодействуя с поверхностью белка непосредственно, ион металла с большим ионным радиусом более прочно связывается с отрицательно заряженной группой на белке и может образовывать кулоновский комплекс на макромолекуле белка с общей гидратной оболочкой. В этом случае металлические ионы полностью компенсируют локальный поверхностный заряд белковой молекулы.

Рис.6: Модель взаимодействия металлов с различными ионными радиусами с заряженной поверхностью белка.

Изменение характера межмолекулярного взаимодействия в растворах белков при наличии ионов тяжелых металлов. Образование дипольных кластеров

Сближению макромолекул альбуминов препятствует кулоновское отталкивание, энергия которого в случае сильно заряженных молекул Ечч обычно больше кТ\

Е -«1

44 е1'

Эффективное уменьшение поверхностного заряда белка, происходящее в результате прочного связывания ионов тяжелого металла на поверхности макромолекулы, может привести к тому, что основным видом взаимодействия между макромолекулами станет диполь-дипольное, поскольку белки имеют аномально высокие значения дипольных моментов:

рр 6 л£ кТ 16

Очевидно, что поверхностный заряд макромолекулы будет быстро убывать с увеличением концентрации ионов ТМ. В этом случае характер взаимодействия белковых макромолекул определяется конкуренцией сил диполь-дипольного притяжения и сил кулоновского отталкивания. Если эффективный поверхностный заряд 2 —>0, что наблюдается в области изоэлектрической точки, то белковые макромолекулы могут сблизиться на предельно малые расстояния. Это значит, что создаются такие условия (минимум свободной энергии), что молекулам выгоднее объединиться в комплексы - кластеры.

Исследуемый процесс обратим: с возрастанием суммарного заряда на белке силы кулоновского отталкивания вновь начинают преобладать, и кластеры разрушаются, причем эффективная масса рассеивающих частиц приближается к величине молекулярной массы белка.

Рис.7: Модель макромолекулярного кластера

Появляющиеся в растворе макромолекулярные комплексы можно рассматривать как зародыши жидкокристаллической фазы. С этой точки зрения исследуемое явление представляет собой начальный этап фазового перехода в упорядоченную мезофазу, дальнейшее развитие которого возможно при больших концентрациях белка и соли.

В ЗАКЛЮЧЕНИИ подведены основные итоги диссертационной работы, обсуждается научное и практическое значение экспериментального исследования молекулярно-динамических процессов, происходящих в жидких системах растворов оптически анизотропных заряженных макромолекул, обладающих жесткой глобулярной структурой и имеющих аномально высокие дипольные моменты.

ПРИЛОЖЕНИЕ определяет экологическую значимость материалов диссертации и включает три раздела.

Первый представляет собой общий обзор антропогенных факторов загрязнения окружающей среды токсичными веществами, в том числе тяжелыми металлами.

Второй содержит более подробную информацию об использованных в работе ТМ, их практическом применении, содержании в природе и человеческом организме, а также влиянии на здоровье человека и экологию окружающей среды в целом.

Третий раздел касается темы экологического контроля за состоянием окружающей среды и содержит некоторые справочные материалы.

выводы

Методом интегрального рэлеевского рассеяния света проведены систематические исследования явления агрегации макромолекул в лиотропных системах - водных растворах белков (альбуминов), содержащих ионы ТМ (свинца, меди и кадмия), - при изменении различных параметров среды (таких как концентрация макромолекул, водородный показатель раствора, концентрация ионов ТМ, температура раствора). Для исследованных систем впервые показано, что:

1. Масса кластеров имеет максимальную величину в окрестности изоэлектрической точки белка и увеличивается с ростом концентрации соли ТМ в растворе.

2. Характер межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих соли ТМ, качественно меняется по сравнению с растворами, содержащими ионы легких металлов: при малых ионных силах коэффициент взаимодействия принимает отрицательные значения, сохраняя параболическую зависимость от поверхностного заряда белка, а при увеличении концентрации соли ТМ резко возрастает в области изоэлектрической точки со сменой знака зависимости.

3. Подтверждена гипотеза об аномальной сорбции металлов с большим ионным радиусом на заряженной поверхности белка. Предложена физическая модель, объясняющая явление агрегации белковых макромолекул на основе сильных диполь-дипольных взаимодействий.

4. Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ. Получены температурные зависимости коэффициента взаимодействия с максимумом, соответствующим 1-30° С. Обнаружено, что при нагревании на 8-10"эффективная масса рассеивающих частиц уменьшается примерно на порядок, что может быть связано с процессом разрушения надмолекулярных комплексов.

18

5. Показано, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе: электронная поляризуемость, оптическая анизотропия, -существенным образом связаны с величиной поверхностного заряда на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе, и имеют экстремумы в изоэлекгрической точке. С увеличением концентрации соли ТМ величина коэффициента деполяризации уменьшается, а его зависимость от поверхностного заряда белка приближается к линейной.

6. Полученные результаты указывают на то, что эффект формирования кластеров обусловлен началом фазового перехода в упорядоченную мезофазу, связанного с преобладанием диполь-дипольных взаимодействий над силами кул о но веко го отталкивания. При этом кластеры можно рассматривать как зародыши жидкокристаллической фазы.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.Н., Батюк В.А., Тен Д.И. «Физические методы мониторинга токсических тяжелых металлов» // Сб. Физическая экология (Физические проблемы экологии) №5, МГУ, физический фак-т. 1999 г, с.172-181.

2. Petrova GP., Petrusevich Yu.M. Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Laser Investigation Of Metal Ions Adsorption On Protein Charge Surface» // Proceedings of SP IE (Advanced Laser Technologies), vol.4070 (2000), p. 430 -437.

3. Petrova GP., Petrusevich Yu.M. Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Optical Diagnostics of Toxic Heavy Metal Ions Effect on Plasma Blood Proteins" // Proceedings of SP IE, vol.4263 (2001),p.l50-160.

4. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. «Образование дипольных комплексов в растворах белков с малой концентрацией ионов тяжелых металлов: диагностика методом лазерного светорассеяния» // Квантовая электроника, 32, № 10,2002,с.1-5.

5. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Ten D.I. "Formation OfDipole Complexes In Protein Solutions With Low Concentrations OfHeavy Metal Ions: Diagnostics By The Method OfLaser Radiation Scattering"// QuantumElectronics, 32(10), 2002,p.897-901.

6. Petrova GP., Petrusevich Yu.M., and Ten D.I., Boiko A.V., Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostics of Blood Protein Solutions" // Proceedings о f Int. Conf. Advanced laser Technologies ALT-02,2002, SP IE. (В печати)

7. A.H. Евсеевичева, Г.П. Петрова, Ю.М. Петрусевич, Д.И. Тен «Токсическое воздействие ионов тяжелых металлов на белки плазмы крови» // Вестник МГУ. (В печати)

Тезисы докладов на конф еренциях:

1. Petrova GP., Petrasevich Yu.M., Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Laser Investigation of Metal Ions Adsorption on Protein Charge Surface» // International conference ALT-99 (Italy, 1999), Book of abstracts, №20.

2. Евсеевичева A.H., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. «Токсическое воздействие ионов свинца и меди на белки плазмы крови» // III Всероссийская научная конференция Физические проблемы экологии, МГУ, физический фак-т. 2001 г.

3. Петрова Г.П., Тен Д.И., Пшеничная ИЛ., «Взаимодействие ионов тяжелых металлов с макромолекулами белков в водных растворах» // Сб. расширенных тезисов докладов Ломоносовские чтения. Секция физики. (Апрель 2002) с.5-9.

4. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N., and Ten D.I." Laser light scattering study of superroolecular structures in blood protein solutions in the presence of heavy metal ions"// LAT2002, Moscow, Technical digest JsuF 19, p.173.

5. Petrova GP., Petrasevich Yu.M., and Ten D.I. "Temperature Effect on Submolecular Dipole Structures in Aqua Albumin Solutions in Presence ofPb Ions" // LAT2002, Moscow, Technical digest, JsuF 36, p.181.

6. Petrova GP., Petrusevich Yu.M., Ten D.I., Pshenichnaya I. "Laser Light Scattering Diagnostics of Blood Protein Solutions with Small Concentration of Toxic Metal Ions" // IX International conference on Laser Applications in Life Sciences (LALS 2002), Vilnius, Lithuania, 7-11 July, 2002, p.72.

7. Petrova GP., Petrusevich Yu.M., Ten D.I., Evseevicheva A.N., Boiko A.V., Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostic of Blood Proteins Solutions" // International conference ALT-02 (Switzerland, Adelboden, 2002), Technical digest, p.138.

8. Petrova GP., Petrusevich Yu.M., Sokol N.V., Ten D.I. "Protein aggregation processes in solutions in presence of heavy metals and chelate ions studied by laser light scattering and polarized fluorescence" // International conference ALT-03.

2<р оз-(\ ИИ 8 5 3 0

Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102 Тираж 100 экз. Заказ №72

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Тен, Дмитрий Ильич

Введение.

Глава I Основные свойства белковых молекул.

§ 1. Состав и строение белков.

§2. Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля.

Глава II Рассеяние света в растворах биополимеров.

§ 1. Основные положения теории рассеяния света.

§2. Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц.

Глава III Трехкомпонентные лиотропные системы

Обзор литературных данных).

§1. Поведение коэффициента межмолекулярного взаимодействия в трехкомпонентных растворах.

Теория Скэтчарда.

§2. Исследования рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы.

Глава IV Экспериментальное исследование растворов альбуминов, содержащих ионы меди, свинца и кадмия.

§ 1. Объекты исследования и подготовка образцов.

§2. Описание экспериментальной установки.

§3. Особенности межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых металлов.

§4. Зависимость эффективной массы рассеивающих частиц в водных растворах белков от поверхностного заряда макромолекул и ионной силы раствора.

§5. Поляризационные свойства исследуемых растворов при изменении водородного показателя и ионной силы.

§6. Влияние температуры на свойства рассеивающих частиц в растворах, содержащих ионы тяжелых металлов.

Глава V Обсуждение экспериментальных результатов.

§1. Особенности процесса адсорбции ионов металлов с различными ионными радиусами на поверхности белковых молекул.

§2. Изменение характера межмолекулярного взаимодействия в растворах белков при наличии ионов тяжелых металлов. Образование дипольных кластеров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Процессы агрегации макромолекул белков в водных растворах, содержащих ионы тяжелых металлов"

Человек и окружающая его живая природа состоят из различного рода сложных многокомпонентных систем, таких как клетки, мембраны, ткани и т.д. К таким системам относятся и растворы заряженных биополимеров (белков), которые при определенных параметрах могут быть использованы в качестве моделей биологических жидкостей, таких как кровь или лимфа.

С точки зрения физики конденсированных сред макромолекулы белков и биополимеров являются уникальными для изучения методами молекулярной оптики. Поверхность белковой молекулы является заряженной, причем можно изменять ее заряд в широких пределах, кроме того молекулы белка обладает значительным дипольным моментом (порядка нескольких сотен единиц D). При этом размеры и масса макромолекулы строго определены для данного вида белка. Электростатическое взаимодействие между молекулами полярного растворителя и заряженными поверхностными группами белка оказывает существенное влияние на характер броуновской динамики мол. .ул.

Актуальность темы исследования связана тем, что межмолекулярные взаимодействия и динамика белковых макромолекул играют чрезвычайно важную роль в функционировании различных биосистем. В условиях современной жизни особенно интересным представляется изучение неизбежного влияния на эти системы различных отрицательных факторов и токсических воздействий, среди которых особое внимание следует уделить воздействию тяжелых металлов, т.е. металлических ионов, обладающих большими ионными радиусами.

Металлы необходимы для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Более 5% веса человеческого тела составляют натрий, калий, кальций и магний {Таб.1). Другие металлы, такие как железо, кобальт, медь, молибден, цинк и др., присутствуют в организме в связанном состоянии (гемоглобин, ферменты), а их содержание составляет менее 1% веса тела [8,12,13,24]. Тем не менее, превышение допустимой концентрации металлов в окружающей среде создает серьезную угрозу здоровью человека. Особенно опасны тяжелые металлы (ТМ). Попадая в кровь и другие биологические жидкости, они даже в небольших концентрациях способны серьезно нарушить нормальное течение физиологических процессов в организме.

Таб.1:

Элемент Состояние в организме Содержание на 70 кг человеческого тела, г

Na Свободное 70

К частично свободное 250

Mg частично свободное 42

Са частично свободное 1700

Мп Связанное <1

Fe Связанное 7

Со Связанное <1

Си Связанное <1

Мо Связанное <1

Zn Связанное <1

В основу настоящей работы положены исследования молекулярных процессов, протекающих в водных растворах биополимеров, содержащих ионы ТМ, при изменении ряда физико-химических параметров среды.

Сравнительно недавно в работах [76,77,78,79,81] было обнаружено новое явление - образование макромолекулярных кластеров в растворах белка в присутствии солей тяжелых щелочных металлов RbCl и CsCl.

Поведение белков в растворах определяется сильным электростатическим взаимодействием между зарядами на поверхности макромолекул. Однако оказалось, что при определенных условиях (когда силы заряд-зарядового взаимодействия экранируются ионами ТМ) в таких системах, как и в термотропных жидких кристаллах, существенную роль начинают играть диполь-дипольные взаимодействия, что приводит к изменениям как статических, так и динамических параметров молекул. Таким образом, несомненный интерес представляет детальное исследование механизма подобного поведения белковых молекул при наличии в растворе ионов металлов с различными значениями заряда и ионного радиуса.

Основной целью данной работы является экспериментальное исследование эффекта возникнования макромолекулярных кластеров в растворах альбуминов, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов. В связи с этим в работе ставился ряд конкретных задач:

- изучить влияние концентрации ионов ТМ в растворе и величины поверхностного заряда белковых молекул на такие параметры системы как масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия;

- изучить влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, в области изоэлектрической точки белка;

- показать, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе определенным образом связаны с величиной и знаком поверхностного заряда на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе.

- предложить физическую модель, объясняющую обнаруженное явление.

Существует большое число физических методов исследования как коллективных форм теплового молекулярного движения, так и динамики отдельных молекул или их фрагментов. Ультразвуковая спектроскопия, ядерный магнитный резонанс, рассеяние медленных нейтронов, спектроскопия диэлектрической релаксации, а также оптические методы — рэлеевское и комбинационное рассеяние света, люминесцентная спектроскопия, - позволяют получать сведения о взаимодействиях и движениях молекул в конденсированных средах.

В рамках преследуемых в работе целей наиболее информативным и удобным для решения поставленных задач является метод интегрального рэлеевского рассеяния света. С помощью этого метода определялись массы и поляризационные свойства рассеивающих частиц, исследовался характер межмолекулярного взаимодействия при изменении концентрации ионов ТМ в растворе и зарядовых свойств поверхности белковой молекулы, а также при изменении температуры раствора.

В качестве объектов исследований были использованы белки группы альбуминов: яичный альбумин (Egg), бычий сывороточный альбумин (BSA) и человеческий сывороточный альбумин (HSA). ТМ-добавками являлись растворимые соли наиболее распространенных металлических ядов: меди (См), свинца (РЬ) и кадмия (СУ).

Научная новизна диссертации обусловлена рядом экспериментальных результатов, впервые полученных в данной работе. В качестве основных результатов на защиту выносятся следующие положения:

1. Впервые обнаружено и детально исследовано явление возникновения макромолекулярных кластеров в растворах яичного и сывороточных альбуминов, содержащих ионы тяжелых нещелочных металлов: свинца, меди и кадмия.

2. Изучено влияние концентрации ионов ТМ в растворе и величины поверхностного заряда белковых молекул на такие параметры системы как масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия.

3. Гипотеза об аномальной сорбции металлов с большим ионным радиусом на заряженной поверхности белка подтверждена на основании физической модели агрегации макромолекул вследствие сильных диполь-дипольных взаимодействий.

4. Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру надмолекулярных агрегатов, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, и подтверждено существование температурного эффекта в области изоэлектрической точки белка, связанного с процессом разрушения кластеров.

Практическая ценность предлагаемого исследования заключается в том, что изученное в работе поведение биополимерных макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей позволяет установить молекулярный механизм патологических изменений в биологических объектах, связанный с токсическим действием ТМ на живые объекты. Материалы диссертации могут быть использованы в экологии и медицине при разработках способов контроля качества органических жидкостей и физических методов диагностики распространенных заболеваний, в том числе онкологических, а также для создания диагностических приборов [62,67,68,69].

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тен, Дмитрий Ильич

Выводы

Методом интегрального рэлеевского рассеяния света проведены систематические исследования явления агрегации макромолекул в лиотропных системах - водных растворах белков (альбуминов), содержащих ионы ТМ (свинца, меди и кадмия), - при изменении различных параметров среды (таких как концентрация макромолекул, водородный показатель раствора, концентрация ионов ТМ, температура раствора). Для исследованных систем впервые показано, что:

1. Масса кластеров имеет максимальную величину в окрестности изоэлектрической точки белка и увеличивается с ростом концентрации соли ТМ в растворе.

2. Характер межмолекулярного взаимодействия в белковых растворах, содержащих соли ТМ, качественно меняется по сравнению с растворами, содержащими ионы легких металлов: при малых ионных силах коэффициент взаимодействия принимает отрицательные значения, сохраняя параболическую зависимость от поверхностного заряда белка, а при увеличении концентрации соли ТМ резко возрастает в области изоэлектрической точки со сменой знака зависимости.

3. Подтверждена гипотеза об аномальной сорбции металлов с большим ионным радиусом на заряженной поверхности белка. Предложена физическая модель, объясняющая явление агрегации белковых макромолекул на основе сильных диполь-дипольных взаимодействий.

4. Впервые экспериментально исследовано влияние температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ. Получены температурные зависимости коэффициента взаимодействия с максимумом, соответствующим t~30 °С. Обнаружено, что при нагревании на 8-10° эффективная масса рассеивающих частиц уменьшается примерно на порядок, что может быть связано с процессом разрушения надмолекулярных комплексов.

5. Показано, что поляризационные свойства макромолекул белков в растворе: электронная поляризуемость, оптическая анизотропия, -существенным образом связаны с величиной поверхностного заряда на белке и концентрацией ионов ТМ в растворе, и имеют экстремумы в изоэлектрической точке. С увеличением концентрации соли ТМ величина коэффициента деполяризации уменьшается, а его зависимость от поверхностного заряда белка приближается к линейной.

6. Полученные результаты указывают на то, что эффект формирования кластеров обусловлен началом фазового перехода в упорядоченную мезофазу, связанного с преобладанием диполь-дипольных взаимодействий над силами кулоновского отталкивания. При этом кластеры можно рассматривать как зародыши жидкокристаллической фазы.

Заключение

В работе проведены экспериментальные исследования молекулярно-динамических процессов, происходящих в жидких системах оптически анизотропных заряженных макромолекул, обладающих жесткой глобулярной структурой и имеющих аномально высокие дипольные моменты.

С помощью метода светорассеяния впервые обнаружено и детально исследовано новое явление возникновения макромолекулярных кластеров в водных растворах белков, содержащих ионы металлов с большим ионным радиусом. Проведено систематическое исследование растворов яичного и сывороточных альбуминов, содержащих соли тяжелых нещелочных металлов - свинца, меди и кадмия, - при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, их поверхностный заряд (водородный показатель раствора) и ионная сила (концентрация ионов ТМ). Изучено влияние этих факторов на такие параметры системы как коэффициент межмолекулярного взаимодействия, масса рассеивающих частиц, а также их поляризационные свойства.

Сделано предположение о влиянии температуры на структуру макромолекулярных кластеров, формирующихся в белковом растворе, содержащем ионы ТМ, в области изоэлектрической точки белка. Впервые экспериментально подтверждено существование температурного эффекта.

На основании проведенного исследования подтверждена гипотеза об аномальной сорбции металлов с большим ионным радиусом на заряженной поверхности белка, а также сделано предположение о том, что обнаруженный эффект представляет собой начальный этап фазового перехода, обусловленного конкуренцией кулоновских и диполь-дипольных взаимодействий.

Необходимо отметить, что результаты экспериментов с растворами биополимеров имеют важное значение для понимания механизмов молекулярных процессов, происходящих при воздействии соединений тяжелых металлов на биологические системы.

Современная промышленность использует огромный арсенал химических веществ, многие из которых весьма опасны для человека. Токсичные элементы попадают в окружающую среду с газовыми выбросами, твердыми отходами и сточными водами предприятий, удобрениями и пестицидами, загрязняют почвенный покров, воды и воздух, накапливаются в подстилке и донных отложениях. Концентрируясь в растениях и взаимодействуя с живыми организмами, они вовлекаются в биологический круговорот, передаются по цепям питания и вызывают целый ряд заболеваний у животных и человека.

Систематические исследования молекулярных механизмов патологических изменений в биологических объектах (например, в сыворотке крови при воздействии токсичных ионов) могут быть использованы для предотвращения отрицательных последствий антропогенной деятельности различного рода, но это тема отдельного исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Тен, Дмитрий Ильич, Москва

1. Cabannes J. "La Diffusion Moleculaire de La Lumiere " //Paris, 1929.

2. Debye P. "Light Scattering in Solutions" //J. App. Phys., 1944, V.15, P.338-349.

3. Debye P.J. "Molecular-weight determination by light scattering" // Appl. Phys., 15, P.338-349, 1946.

4. Scatchard G.J., Batchelder A.C., Brown A. "Osmotic equilibrium in solution of serum albumin and sodium chloride" //J. Am. Chem. Soc. 68, P.2315-2323.1946.

5. Scatchard G. J. "The attraction of protein for small molecules and ions " //Ann. N.Y. Acad. Sci., 1949, V.51, P.2315.

6. Edsall J.T. et al. "Light Scattering in Solutions of Serum Albumin: effects of charge and ionic strength " // J. of American Chem. Soc., 1950, V. 72, P.4641.

7. Волькенмтейн M.B. "Молекулярная оптика"//ГИТТЛ, M.JI., 1951.

8. Leeper R. W., Summers L., Gilman H. // Chem. Revs. 1954, 54, №1, 101.

9. K.R.Stacey. "Light Scattering in Physical Chemistry" //Acad.Press. New York, 1956.

10. Heupam Г., Бейли К. "Белки " //Изд. ИЛ, М.Л., 1958.

11. Tanford Ch. "Physical Chemistry of Macromolecules" // Willey, New York, 1961.

12. Lyman T. "Metals handbook"//V.l. Ohio, 1961

13. Лебедева K.B. "Техника безопасности в металлургии свинца и цинка" // Москва, 1963.

14. Реми Г. "Курс неорганической химии " // под ред. Новоселовой А.В., Москва, ИЛ, 1963.

15. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С.Я. "Структура макромолекул в растворах" // Изд. Наука, 1964.

16. Фабелинский И.Л. "Молекулярное рассеяние света" // М. Наука, 1965.

17. Тенфорд Ч. "Физическая химия полимеров" // Изд. Химия, Москва, 1965.

18. Эйнштейн А. "Собрание научных трудов" // М. Наука, 1966.

19. Мартин Р. "Введение в биофизическую химию " // М. Мир, 1966.20. "Популярная медицинская энциклопедия" // М., Советская энциклопедия, 1966, 1040 е.

20. BierJ. "Electrophoresis"//N.Y., 1968.

21. Perrin D.D. "Dissociation constants of inorganic acids and bases" // Butterworths, London, 1969.

22. Shannon R.D., Prewitt C.T. //Acta Crystallogr., V.B26, 1046, 1970.

23. Williams A.P. "The Metals of Life"//NewYork, Willey,1971.

24. Steinhard J., Zaiser E.M. //Adv. Protein Chem., V.10. P. 152.

25. Эскин B.E. "Рассеяние света растворами полимеров " // Изд. Наука, Москва, 1973.

26. ЛенинджерА. "Биохимия"//М., 1974.28. "Краткий справочник физико-химических величин" // под ред. Мищенко К.П., Равделя А.А., Л., Химия, 1974.

27. Вукс М. Ф. "Рассеяние света в газах, жидкостях и растворах " //Л., 1977.

28. Пилипенко А. Т. "Справочник по элементарной химии " // М., 1977.31. "Вредные вещества в промышленности. Справочник для химиков, инженеров и врачей. Неорганические и элементоорганические соединения "// 7-е изд. т.З, Л., Химия, 1977, 608 е.

29. HabbardJ.В., WolymzP.G. //J. Chem. Phys., 1978, V.69, N.3, P.998.

30. Уайт Л. и др. "Основы биохимии" // М., 1981, Т.1.

31. Madden P., Kivelson D. //J. Chem. Phys., 1982, V.38, N.21, P.4244.

32. Дэвид P. "Введение в биофизику"//M, 1982.

33. Флайгер У. "Строение и динамика молекул " // М. Мир, 1982.

34. Вукс. М.Ф. "Электрические и оптические свойства молекул и конденсированных сред " //Л. ЛГУ, 1984.

35. Блументалъ Г. и др. "Анорганикум" // Т.1, под ред. Кольдица Л., Москва, Мир, 1984.

36. Долин П.А. "Справочник по технике безопасности" // М., Энергоатомиздат, 1985, 824 е.

37. Barlow D.J. Thornton J.M. "The distribution of charged groups in proteins"//Biopolimers, 25, P. 1717-1733, 1986.

38. ДебайП.П. "Избранные труды"//Москва, 1987, С.363.

39. Дебай П. "Определение молекулярного веса методом рассеяния света"//Л., Наука, 1987.

40. ЛенинджерА. "Биохимия"//Мир, 1987.

41. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Ширкова И.И., Ревокатов О.П. "Взаимодействие сывороточного альбумина с водой при различных концентрациях водородных ионов по данным рэлеевского рассеяния" //Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр, 1987, Т.28, №2, С.59-63.

42. Petrova G.P. Petrusevich Yu.M. "Interaction of serum albumin with water in various concentrations of hydrogen ions investigated by light scattering" //Moscow University Physics Bulletin 28, P. 59-63, 1987.

43. Волькенштейн M.B. "Биофизика"//Изд. Наука, Москва, 1988.

44. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Borisov B.A. "Anisotropic Polarisability and Diffusion of Proteins in Water Solution Studied by Laser Light Scattering" // SPIE, 1990, Vol.1403 Laser Applications in Life Sciences, P.387-389.

45. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М. "Способ определения изоэлектрической точки белка" // Авторское свидетельство №1578597, 15.03.1990 (приоритет 01.06.1988).

46. Лебедев Ю.А. "Второе дыхание марафонца" // М., Металлургия,1990, 144 е., С.65.

47. Давыдова C.JI. "О токсичности ионов металлов" // Химия, №3,1991.51. "Справочникбиохимика"//Москва, Мир, 1991.

48. ЭмслиДж. ""Элементы"//Москва, Мир, 1991.

49. Петрусевич Ю.М. "Взаимодействие биополимеров в растворе" // Докт. ducc. М., 1992.

50. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P. "Electrostatic Interaction in Biopolymer Solutions Investigated by NMR and Laser Light Scattering" //SPIE, 1993, Vol.1884, P.70-76.

51. Эйхлер В. "Яды в нашей пище"//М., Мир, 1993, 189 е., с.60-62.

52. ЭмслиДж. "Элементы"//М., Мир, 1993, 256е.

53. Левшин Л.В., Салецкий A.M. "Оптические методы исследования молекулярных систем" // Изд. Московского университета, 1994.

54. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М. "Электростатические взаимодействия в растворах биополимеров по данным рэлеевского рассеяния света" //Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр., 1994, Т.35, №3, С. 45-50.

55. Petrova G.P. Petrusevich Yu.M. "Electrostatic interactions in biopolymer solutions studied by Rayleigh light scattering" // Moscow University Physics Bulletin 49, P.41-46, 1994.

56. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. "Anomalous Depolarization of Light Scattering in Dilute Solutions of Blood Proteins" // European Biomedical Optics Week BIOS EUROPE '95, Barcelona, Spain, 1995, N.2629-09.

57. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. "Optical Parameters of Blood Serum Aqueous Solutions" // European Biomedical Optics Week BIOS EUROPE '95, Barselona, Spain, 1995, N.2628-08.63. "Химия и общество " // Москва, Мир, 1995.

58. Суворов А.В., Никольский А.Б. "Общая химия" //Москва, Высшая школа, 1995.65. "Общая химия в формулах, определениях, схемах" //Минск, 1996.

59. Бриллиантов Н.В., Ревокатов О.П. "Молекулярная динамика неупорядоченных сред " // МГУ, 1996.

60. Petrusevich Yu. М., Petrova G.P. "The method of light scattering measurement in tumour diagnostics" // SPIE, The Int. Soc. for Opt. Engineering, CIS Selected Papers, Laser Use in Oncology. 1996. Vol. 2728. P.2-9.

61. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., S.G.Alexeev,A.V.Ivanov "The method of light scattering in the investigation of plasma blood proteins" // LALS-96 (6-Int. Conf on las. Appl. in life Sci.) Jena, 1996, P.2-7.

62. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева A.H. "Роль тяжелых металлов в образовании белковых кластеров в водных растворах" // Физические проблемы экологии. Всероссийская научн. конф., Москва, 1997. Тезисы докладов. Т.1. С.58-59.

63. Evseevicheva A.N., Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. "Laser Identification of Macromolecule Nanosize Dipole Clusters" // ALT-97, Limoge, France. 1997, Book of Abstracts., P.36.

64. Лидин P.A. "Справочник no общей и неорганической химии" // Москва, Просвещение, 1997.

65. Velev O.D., Kaler E.W., Lenhoff A.M. "Protein Interactions in Solution Characterized by Light and Neutron Scattering: Comparison of Lysozyme and Chymotrypsinogen" // Biophysical J., V.75, December1998, P.2682-2697.

66. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. "Molecular Clusters in Water Protein Solutions in The Presence of Heavy Metal Ions" // General Physiology and Biophysics, 1998, V.17(2), 97-104, Bratislava, Slovakia.

67. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P., Evseevicheva A.N. "Instability of Proteins in The Solution at The Presence of Toxic Heavy Metals" // Ecology of Cities. Int. Conf. Proceedings, Rhodes, Greece, 1998, P.304-313.

68. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева A.H. "Роль тяжелых металлов в образовании белковых кластеров в водных растворах " //Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр., 1998, № 4, С.71-76.

69. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.Н. "Физические методы мониторинга токсических тяжелых металлов" // II Всероссийская научная конференция: Физические проблемы экологии, Москва, 1999, Тезисы докладов, Т.1.

70. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.Н., Батюк В.А., Тен Д.И. "Физические методы мониторинга токсических тяэ/селых металлов" // Сб. Физическая экология (Физические проблемы экологии), № 5, МГУ, физический ф-т, 1999, С. 172-181.

71. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. "The Role of Heavy Metals in The Formation of Protein Clusters in Aqueous Solution" // Moscow University Phys. Bulletin, V.53, N.4, P.91-97, 1999, Allerton Press.

72. Петрусевич Ю.М, Петрова Г.П. "Сильные электростатические взаимодействия в растворах заряженных биополимеров" //

73. Всероссийский съезд биофизиков, Август 1999, Москва, Тезисыдокладов, T.l, С.71.

74. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Laser Investigation of Metal Ions Adsorption on Protein Charge Surface" // International Conference ALT-99 (Italy, 1999), Book of Abstracts, №20.

75. Петрова Г.П. "Молекулярная подвижность и межмолекулярные взаимодействия в оптически анизотропных жидких системах" // Докт. диссертация, 1999.

76. Liu Y., Ma C.Q., Li К.А., Xie F.C., Tong S.Y. "Rayleigh light scattering study on the reaction of nucleic acids and methyl violet" // Anal Biochem., 268(2), 187-92 (1999 Mar 15).

77. Mukherjee A., Lutkenhaus J., "Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations " // J. Bacteriol, 181(3), 823-32 (1999 Feb).

78. Kartel M.T., Kupchik L.A., Veisov B.K., "Evaluation of Pectin Binding of Heavy Metal Ions in Aqueous Solutions" // Chemosphere, V.38, N.ll, P.2591, 1999.

79. Reedijk J. "Medicinal Applications of Heavy-metal Compounds" // Chem. Biology, 3, 1999, P.236.89. "Экология, охрана природы, экологическая безопасность" // под ред. Никитина А. Т., Степанова С.А., Москва, МНЭПУ, 2000.

80. Ершов Ю.А, Попков В.А., Берлянд А.С. и др. "Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов" // Учеб. для вузов, 2-е изд., М., Высш. шк., 2000, 560 е., с.288-295.

81. Petsev D.N., Thomas B.R., Yau S.T., Vekilov P.G. "Interactions and Aggregation of Apoferritin Molecules in Solution: Effects of Added Electrolytes "//Biophysical J„ V. 78, April 2000, P.2060-2069.

82. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Laser Investigation of Metal Ions Adsorption on Protein Charge Surface» // Proceedings of SPIE (Advanced Laser Technologies), V.4070 (2000), P.430-437.

83. Евсеевичева A.H., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. "Токсическое воздействие ионов свинца и меди на белки плазмы крови" // III Всероссийская научная конференция Физические проблемы экологии, МГУ, физический ф-т, 2001.

84. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Ten D.I. "Formation Of Dipole Complexes In Protein Solutions With Low Concentrations Of Heavy Metal Ions: Diagnostics By The Method Of Laser Radiation Scattering" //Quantum Electronics, 32(10), 2002, p.897-901.

85. Петрова Г.П., Ten Д.И., Пшеничная И.А. "Взаимодействие ионов тяжелых металлов с макромолекулами белков в водных растворах" // Сб. расширенных тезисов докладов: Ломоносовские чтения. Секция физики. (Апрель 2002) С. 5-9.

86. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. and Ten D.I. "Laser Light Scattering Study of Supermolecular Structures in Blood Protein Solutions in The Presence of Heavy Metal Ions" // LAT 2002, Moscow, Technical Digest JsuF 19, P. 173.

87. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. and Ten D.I. "Temperature Effect on Submolecular Dipole Structures in Aqua Albumin Solutions in Presence of Pb Ions" //LAT2002, Moscow, Technical Digest, JsuF 36, P.181.

88. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Ten D.I., Evseevicheva A.N., Boiko A.V., Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostic of Blood Proteins Solutions" // International Conference ALT-02 (Switzerland, Adelboden, 2002), Technical Digest, P. 138.

89. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. "Образование дипольных комплексов в растворах белков с малой концентрацией ионов тяжелых металлов: диагностика методом лазерного светорассеяния"//Квантовая электроника, 2002, 32, №10, С. 1-5.

90. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., and Ten D.I., Evseevicheva A.N, Boiko A. V., Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostics of Blood Protein Solutions" // Proceedings of Int. Conf. Advanced Laser Technologies ALT-02, 2002, SPIE. (В печати)

91. Евсеевичева A.H., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. "Токсическое воздействие ионов тяжелых металлов на белки плазмы крови " // Вестник МГУ, 2003 (В печати).

92. Интернет: "Эковестник Дубны. Геоэкологическая обстановка и оценка геоэкологической опасности детских дошкольных учреждений города Дубна", 1998-1999: http://eco. dubna. ru/proiect/dou/c. html.

93. Интернет: "Экологическая ситуация по г. Сургуту", 1991-2003: http://priroda.admsursut.ru/mon ned.

94. Интернет: Загорский В.В. "Лекции по общей и неорганической химии для студентов биологического фак-та (биофизика)", 2001/2002: http://www. chem.msu.su/rus/teaching/general.

95. Интернет: Авторский коллектив МГУПБ "Химия для всех", 1999: http:/'/school-sector, relarn. ru/nsm/chemistry/Rus/chemy. html.

96. Ш.Интернет: "Офиц.сервер Госкомэкологии России", 1999-2000: http://www, ecocom. ru/archiv/ecocom/index. html.

97. Интернет: "Общественный экологический Internet-npoeKm EcoLife", 2001: http://www.ecolife.org.ua/data/tdata/td2-19.html.