Использование молекулярных маркеров для картирования генов устойчивости (QTL) к ложной мучнистой росе у жемчужного проса

Колесникова, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование молекулярных маркеров для картирования генов устойчивости (QTL) к ложной мучнистой росе у жемчужного проса
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование молекулярных маркеров для картирования генов устойчивости (QTL) к ложной мучнистой росе у жемчужного проса"

¿.-Ъвесу

№ правах рукописи

КОЛЕСНИКОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ «гть> К ЛОЖНОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЕ У ЖЕМЧУЖНОГО ПРОСА

03.00.15 - Генетика

автореферат диссертация н» соискание ученой степени кандидата биололяческш наук

Москва - 2001

Работа выполнена в лаборатории генетики растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и в Международном центре по исследованию культурных растений полузасушливых тропиков (ЮИЗАТ), Индия.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

Доктор биологических наук, Профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор биологических наук, профессор

B. А. Пухальский

Г. Е. Сулимова

C. А, Гостимский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии РАН им. В, А. Энгельгардта

Защита состоится" " 2001 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.0i. при Институте общей генетики им. Н И.Вавилова РАН по адресу:

119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина 3. ФАКС : (095) 132-8962

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Автореферат разослан "_"_2001 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических наук

Г, Н. Полухина

Актуальность проблемы. Жемчужное просо \Peitnisetw» glaucum (L.) R. Br.] является одной из основных продовольственных культур полу-засушливых тропиков Индии к Западной Африки. Оно является ' основной сельскохозяйственной культурой, возделываемой в этих районах, адаптированно к условиям чрезвычайно низкого количества осадков н скльнонагреваешлх песчаных почв. Поэтому, улучшение питательных качеств, повышение продуктивности и устойчивости к различным заболеваниям является первостепенной задачей в селекции жемчужного проса для этой зоны.

Наибольший вред посевам жемчужного проса наносит Scierospora' grcmlnicola (Sacc.) Shrot. - облигатный биотропный гриб. Он! является возбудителем ложной мучнистой росы (J1MP), поражающей жемчужное просо, приводя к катастрофическим потерям урожая. В Индии, с началом возделывания в конце 60-х годов высокоурожайных гибридов ж0мчужного проса, созданных на основе восприимчивого сорта с мужской цитоплазматической стерильностью, случаи поражения ложной мучнистой росой приняли характер эпкфитотий, при хоторых потери урожая достигают' 70%. Устойчивость к заболеванию созданных позднее гибридных сортов также оказалась непродолжительное.

Можно выделить несколько причин, затрудняющих селекцию новых гнбрид иых сортов жемчужного проса на устойчивость к лажной мучнистой росе. Во-первых, степень устойчивости растения-хозяиПа постоянно варьирует,■ что может быть объяснено высокой степенью генетической изменчивости патогена, а также, зачастую, неполной гомозиготностью родительских сортов. Во-вторых, устойчивость носит территориальный характер, что' обуславливается в большей части генетическими различиями между популяциями патогена из разных районов. Теоретически, селекция на устойчивость гибридного материала к популяциям патогена нз разных районов может проводиться в одном исследовательском центре путем единовременного тестирования полным набором рас патогена. Однако, это не представляется возможным для селекционеров Африки и Индии, из-за жестких карантинных норм.

В последнее десятилетие, направленная селекция гс использованием различных типов молекулярных маркеров (MAS) получила широкое развитие в области создания сортов культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям, вредителям и неблагоприятным условиям внешней среды. При использовании данного подхода полностью исключаются эффекты, вызванные влиянием внешней среды, а также сцепленный дрейф генов, присутствующий обычно в традиционной селекции. Благодаря созданию полных генетических карт сцепления на основе молекулярных маркеров, стало возможным точное картирование генов, ответственных за изменчивость сложных количественных признаков, с целью использования их в различных селекционных программах. Молекулярные маркеры, сцепленные с генами устойчивости позволяют проводить селекцию на устойчивость к различным популяшгям патогена в одном исследовательском центре, в отсутствие патогена. Осуществимость такого подхода была показана в целом ряде работ по картированию локусов, контролирующих количественную изменчивость по устойчивости к болезням у таких культур, как

ЦНБ МСХА [

фонд HavHHOií литеоатуоы'

№

картофель ( цист-нематода н фитофторозХУал der Voott et al., 2000), кассия( бактериальна«, гниль) (Jorge et al., 2000), кукуруза ( серая пятнистость листьев) (Bubeck et al., 1993), капуста (кяла крестоцветных^аогапагеа-Ра^ецк et al., 2000, сосудистый бактериоз, А.Н.Игнатов и др. ,2000) и других.

Поэтому разработка новых подходов к интрогрессип генов устойчивости к этому патогену в новые сорта является чрезвычайно актуальной. Одновременно необходам постоянный контроль за быстро модифицирующимся патогеном н, соответственно, степенью устойчивости к нему различных сортов. Поиск новых источников устойчивости к патогену, детальное картирование генов устойчивости и их эффективный перенос в создаваемые сорта, является одним из главных направлений современных селекционных программ по жемчужному просу.

Цель данной работы состояла в локализации кластеров генов, детерминирующих

устойчивость жемчужного проса к ложной мучнистой росе.

Дня достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• Создать генетические карты сцепления дня сортов W 504-1-1 и Р 310-17-В ,

- Сравнить эта генетические карты сцепления с ранее опубликованными для данного вида картами сцепления с целью выяснения возможности использования одних н тех же маркеров при различных скрещиваниях.

• Провести картирование генов, контролирующих устойчивость к ложной мучнистой росе.

- Идентифицировать молекулярные маркеры, сцепленные с генами, контролирующим и устойчивость к ложной мучнистой росе.

Научная новизна Впервые было проведено сравнение генетических карт жемчужного проса, полученные при анализе пяти гибридных комбинаций, которое показало принципиальное единообразие- в-последовательности: расположения молекулярных маркеров на всех семи группах сцепленш. 'Это позволило считать выявленный порядок маркеров типичным для вида Pennbetum glaueum (L)R.Br, Впервые были картированы локусы генов устойчивости к ложной мучнистой росс в сортах W 504-1-1 и Р 310-17-В, происходящих соответственно из Индии и Африки. Впервые были картированы локусы генов устойчивости, имеющие широкий спектр действия и эффективные против как Индийских, так н Африканских популяций патогена.

Впервые были картированы локусы, контролирующие . специфическую устойчивость исключительно к нзолятам Индийского или Африканского происхождения.

Практическая ценность полученных результат«». С локализацией кластеров генов устойчивости к ложной мучнистой росе и идентификацией молекулярных маркеров, слепленных с ними, открывается возможность направленной селекции (MAS) на устойчивость к заболеванию. Отбор с использованием молекулярных маркеров дает возможность селекционерам создавать устойчивые к болезни сорта в отсутствии патогена, что, в свою очередь, позволит проводить селекцию в любой точке земного шара.

Наши данные значительно дополнили информацию о генетике устойчивости к ложной мучлистой росе у жемчужного проса. Используя результаты представлен ной работы, селекционеры получат возможность быстрого внедрения устойчивости широкого спектра в сорта, что также значительно увеличит время ев эффективности.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на

1. Международной конференции "Науки о жизни в следующем тысячелетни" (Хайдарабад, Индия, декабрь 1999).

2. Международном совещании по стратегии возделывания жемчужного проса ( Уэльс, Великобритания, ноябрь 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация'состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов н их обсуждения, выводов и списка литературы','включающего 143 наименования. Работа наложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 6 таблицами и 30 рисунками. ..

Материалы в методы.

Растительный материал. Материалом служили сорта , предоставленные Международным Институтом по Исследованию Культурных Растений ПолуЗасушливых Тропиков (ICR1SAT), Индия.

Сорта, использованные в скрещиваниях для картировали в; W504-1-1 -чистолинейный сорт, восприимчивый к ложной мучнистой росе, имеет семена белого цвета. Отобран из местных форм Северной Индии (регион Дели) и любезно предоставлен для исследований О.Р. Govila из отдела генетики Индийского сельскохозяйственного института. Р 310-17-В - чистолинейный сорт, устойчивый к ложной мучнистой росе, получен отбором из местных форм, первоначально происходящих из Мали (Западная Африка).

Патогенный материал. Для всех тестов на восприимчивость к ложной мучнистой росе, проводимых в условиях теплицы, был использован спорангиевый инокулюм. Источником инокулюма для каждой патогенной популяции служил сухой растительный материал, содержащий ооепоры. Районы происхождения популяций патогена, вовлеченных в тестирование, описаны в таблице 1, Популяция патогена ICR1SAT была собрана в питомнике ложной мучнистой росы в 1CRISAT (Индия), в то время, как остальные популяции были получены с

экспериментальных станций н фермерских полей. При отборе инфекционного материала ориентировались на наличие характерных коричневых пятен и полос на наружной поверхности листьев жемчужного проса , что указывало на наличие оослор патогена. Пораженные листья собирали с растений, высушивали, измельчали в тонкий порошок н смешивали с компостом, в (который затем высевали семена восприимчивого сорта 7042(8) дна получения' первоначального спораншевого инокуяюыа. На последующих стадиях этот 'инокулюм был размножен вегетативным путем для получения достаточного его количества

Таблица 1. Происхождение популяций патогена S. graminicofa, использованных в исследовании.., ' ,

Популяция патогена Место сбора патогена Сорт-хозяин. Страна Год сбора

ICRISAT JCRïSAT, Patancheru Сорта 7042 (S), НВЗ Индия 1994

MBH ПО MaHyCo, Jalna Сорт MBH 110 Индия 1997

Nokha CA2RI, Jodhpur Местный сорт Nokha Индия 1997

Jamnagar MRS, Jamnagar Местный сорт Jamnagar Индия 1997

Dirgapura ARS Durgapura, Jaipur Местный сорт Dureapum Индия 1997

Bamako Bamako, Местный сорт Bamako Мали 1996

Sadore ICRISAT, Sabelian Centre, Sadore, Местный сорт Sadore Нигер 1996

Nguru Nguru, Местный сорт Neuro Нигерия 1994

Kordofan Kordofan, Местный сорт Kordofan Судан 1997

Молекулярные пробы, использованные для получения данных

генотнпнровання. Молекулярный анализ был осуществлен с использованием RFLP маркеров (гомологичных пробам, описанным Liu et al., 1994), которые были любезно предоставлены M.D. Gale (Кэмбрнджская лаборатория, John Innés Centre, Норвнч, Великобритания). Для анализа были отобраны 34 ннзкокопийные пробы (1-3 копни). Кроме того, в этот набор были включены 2 многокопнйные пробы, так как в районах их локализации ннзкокопийные пробы отсутствовали (подробная информация по пробам была любезно предоставлена К.М. Devos из Кэмбриджской лаборатории John lunes Centre, Иорвич, Великобритания). В дополнение к полиморфизму популяций, критерий отбора проб для анализа базировался на копийности пробы и расстоянии до ближаШпих маркерных локусов (10-15 сМ). Все

пробы (пронумерованные с PgFSMl по PgPSMIOÖO и далее обозначаемые, как PSM**) принадлежали к Psd геномной библиотеке, созданной на основе суммарной ДНК жемчужного проса сорта 7042(S) в John limes Centre (Liu el si., 1994), Шшмидная Д1ПС выделялась no стандартной методике (Maniatis et at.,,19 ), после чего клонированные фрагменты амшшфицировались с помощью PCR-реакции. Полученные PCR-фрагменты были использованы в качестве зондов после мечеиия с BP-a-dATP (Feinberg и Vogelslein, 1983),

Стратегия скрещиваний. Родительские формы жемчужного проса самоопылялись на протяжении нескольких поколений для достижения практически гомозиготного состояния по большинству локусов, Растения Fi были использовании при сборе листового и стеблевого материала для выделения суммарной ДНК. Потомки растений Fi были сгруппированы по схеме, описанной Hash С.Т. et al. (1994) в семьи Fi, которые использовали в тестах на устойчивость к ложной мучнистой росе.

Тестирование на устойчивость к ложной мучнистой росе. Тестирование на устойчивость проводили в условиях теплиц в Бангоре (Великобритания) для популяций патогена африканского происхождения, н в 1CRISAT'(Hhahh) ~'для индийских. СпорангиевыЙ материал" дня инокуляции выращивали на восприимчивом сорте жемчужного проса 7042(5). Заражение растений семей F« проводили по ранее описанной методике (loses 1994). Данные по заражению оценивали, как процепт пораженных растений (общее число которых подсчктывалосьна момент инокуляции]!, На которых были обнаружены симптомы заболевания^

KFLP анализ. Анализ полиморфизма длин рестрикткых фрагментов представлял' собой ряд последовательных операций, включающих подготовку и сбор растительного материала, выделение суммарной ДНК, расщепление ДНК при помощи эндонуклеаз и последующее разделение ДНК-фрагментов в агарозиом геле, перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры и ее последующую гибридизацию со специфическими ДНК-зондами (Sharp et at .,1988). Перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры проводили по методу Reed and Mann (1985), Анализ сцепления. Анализ сцепления проводили с использованием программы Mapmaker/Exp 3.0, предоставленной E.S. Lander из Института биохимических исследований (Кембридж,США). Анализ с учетом множественных критериев применяли для установления групп сцепления с последующим определением относительного взаиморасположения маркеров в каждой из групп при значении числа LOD равным 2.5. (LOD- десятичный логарифм отношения величины вероятности при условии сцепленности двух генов к величине вероятности при отсутствии сцепления). Расстояния между маркерами вычисляли в сантиморганидах (сМ) с использованием функции Холдэйна. Картирование локусов количественных признаков (QTL). Данные оценки устойчивости к ложной мучнистой росе были усреднены для каждой семьи F, и внесены в базу данных вместе с данными гекотипировання соответствующих растений Fj, Размер экспериментальной выборки составил 175 индивидуумов. Картирование QTL проводили методом интервального картирования с использованием программы Mapmaker/QTL (Landerand Botstein, 1989). Число LOD

ассоциация между генотипом н количественными данными по устойчивости подсчитывали с использовав нем свободной модели для локусов количественных признаков(QTL). ' ' "'""

Результаты и их обсуждение.

Предварительный скрининг родительских сортов на полиморфизм. На

предварительном этапе исследования ДНК обоих родительских сортов, расщепленных четырьмя эндонуклеазами рестрикции (EcoRl, EcoRV, Hindi 11 , Dral), были скриннроваяны с большим количеством RFLP-яроб для нахождения полиморфных комбинаций проба/фермент для использования в дальнейшем анализе. D результате, было отобрано 38 полиморфных комбинаций. Анализ нарушения сегрегации ' локусов молекулярных маркеров. Данные сегрегации по всем полиморфным RFLP-маркерам, полученные для экспериментального поколения Fi, бьиш исследованы на отклонение от ожидаемого расщепления геиотипнческих классов 1:2:1 (А:Н:В, соответственно, где А и В - гомозиготы по родительским генотипам, а II - гетерозигота). С этой целью был использован тест х* ДО* каждого сегрегирующего маркерного локуса. Данные исследования представлены в табл.2. Из 38 проанализированных маркерных локусов, 28 показали сегрегацию в соответствии с ожидаемой. При этом вычисленные значения xJ находились ниже критических значений дм 1% и 5% уровней значимости. Остальные 10 маркерных локусов продемонстрировали различные степени нарушения сегрегации. Максимальное нарушение проявилось с. маркерными локусами XpsmStS?, Xpsm4I3, XpsmS58 (LOI); Xpsm473 (LG3); и Xpsm588 (LG<5) при значениях превышающих критические значения обоих уровней значимости. Маркерные локусы Xpsm322, Xpsm45S, Xpsm32i (LG2); Xpsm37 (LG3); и Xpsm305 (LG4) обнаружили средний уровень нарушения расщепления с величиной х*> превышающей только одну критическую величину в 5% уровня значимости.

Анализ распределения аллелей среди отдельных локусов со значительными нарушениями сегрегации выявил явные тенденции к превалированию одного родительского аялеля над другим. Для маркеров с нарушением сегрегации, локализованных в начале группы сцепления 1 (LG1) была обнаружена более высокая частота аллелей материнской родительской формы исследуемой популяции • W 504-1-1 (восприимчива к ложной мучнистой росе). Аналогичная ситуация наблюдалась для маркеров с нарушенной сегрегацией в группе сцепления LG2. Для маркеров с нарушенной сегрегацией, расположенных на LG3, ситуация была обратной - наблюдался значительный перевес аллелей мужской родительской

Таблица 2. Результаты теста х1 для данных по сегрегации генотипов в экспериментальной Fj популяции скрещивания W S04-1-1 х Р310-17-Впо всем семи группам сцепления и 38 RFLP маркерам.

Обозначение генотипов: А" гомозигота по родительскому аллыпо W 504-1-1, D " не В (т.е. Л или НХ H - гетеротгот», С - w А (т.е., В или Н). В = гоможгота по родительскоку шиклю Р 310-17-В

Груво* СвСШКИ МП MtpictpabiK Лйкус RFLr 'Vene [Mi** ■ TUtbB L* JkMFlUf (ll> CHftnUM1 Ожидаемая сегрегация П : 2 : 11 Значение X1 Гснпгмпи, наюляшнсся

A D (A или H) H С (В ™ в <«t »наш) A H В В «iGbftwt В ни«сп«к

LG1 Xpsm567 52 0 70 0 22 31 36 72 36 12.61 А В.

Xpsm2S0 40 0 62 0 25 48 31,75 63.5 31.75 3.61 А в

Xfnm413 33 3 72 0 27 20 38 76 38 9.32 А в

XpsmSSS 36 0 45 1 11 82 23 46 23 13.63 А в

XfsmílS 25 0 42 0 19 89 21.5 43 21.5 0.88

Xpstn42S 39 2 74 1 31 28 36 72 36 1.00

XpsmS7.2 11 0 M 0 10 143 8 16 8 3.19 А, В ■ н

XpsmSSi 3 0 8 0 4 160 3.75 7.5 3.75 0.20

XpsmJS« 30 4 60 1 27 53 29.25 58.5 29.25 0.23

XpímS2 13 3 31 0 10 118 13.5 27 13.5 1.52

Xpsm 6ii 14 12 38 0 23 88 18.75 37,5 18.75 2.17 . А

Xpsm}47 7 1 13 0 4 148 6.5 13 6.5 1.31

LG2 Xpsmí22 37 3 39 1 21 74 24.25 48.5 24.25 9.00 А н,в

Xpsm4SS 37 0 64 4 17 33 29.5 59 29.5 7.63 А 8

Xpim2!4 5 2 6 0 5 157 L-í— 8 4 1.00

XpsmS2l 49 1 94 0 28 3 42.75 «5.5 42.75 6.85 Ai Н П

XpsmS92 a D 7 0 3 157 4,5 9 4.5 . 3 67 А Н, В

LG3 Xpsnti7 32 0 ¡3 1 56 3 42.75 85.5 42,75 6.88 В А

XpsmtOS 10 o 40 7 24 94 18.5 37 18.5 5.78 В А

Xpsm409.2 15 3 45 3 31 78 22.75 455 22.75 5.64 В А, Н

Xp$m473 12 0 61 0 26 76 24.75 49.5 24.75 9,30 Н А

lXpsm4J0 3 0 11 0 6 153 5 10 5 1.10

LC4 XpsmW.l 24 3 69 10 37 321 32.5 65 32.5 3.09 А

Xpsm464 34 0 73 3 32 31 35 ü 70,5 35.25 0.63

Xpsm64t 18 4 40 0 17 »6 18.75 37.5 18.75 03 fi

XpsmSOS 12 0 10 33 4 116 6.S 13 6.5 . 6.31 н,в

LGS XpsmStS 22 3 43 0 2« 79 23J25 46.5 23,25 1.30

XpsmSIS 35 4 68 i 41 26 36 72 36 0.94

Xpsm34S 7 0 16 1 13 138 9 i8_ 9 2.44 В

Xnsm735 23 0 52 0 35 65 27.5 55 27.5 2.95 в

LG6 Xpsm202 13 0 35 0 10 117 14.5 29 14.5 2.79 н А, В

XpsmSSt 20 1 SI 2 21 50 30.5 _j6J| 30.5 13.13 н А, В

XpsntJS7*I 14 0 26 0 13 122 13.2:5 26.5^ 13.25 0.06

Xpsm737 16 0 20 5 14 120 12.5 25 12.5 2.16

LG7 Xpsm269 19 0 49 l 27 79 23,75 47.5 23.75 1.44

Xpsmólt 13 0 32 I 19 МО 16 32 16 1.13

Xpsm»34 36 0 62 3 19 55 29.25 58.5 29.25 5.36 А В

Xpsm526 38 3 61 l 24 48 30,75 «1.5 30,75 320 А В

формы популящш . р 310-17-В ( устойчива к ложной мучнистой росе). Так как не все исследованные Fg растения достигали стадии выметывания метелки , и образования семян, имели меньшее количество листовой и стеблевой массы, то.одним из возможных объяснений нарушения сегрегации может быть то, что эти маркеры тесно сцеплены с генами, замедляющими развитие растения и вызывающими уменьшение частоты определенного генотипа в исследуемой популяции за счет снижения числа выживших особей данного генотипа (Tai «г а/., 2000).

Интересные результаты, касающиеся распределения аллелей, были получены для группы сцепления LQ6. Маркерный локус XpsmSSS, картированный в начале группы сцепления, »оказал высокий уровень нарушения с рассчитанным значением х1 равным 13.13 и уровнем сегрегации, приближающимся к 1:4:1, вместо ожидаемого 1:2:1. Столь существенные различия могут, по-видимому, объясняться тем, что процент выживших гетерозигот вдвое выше других классов родительских гомозигот, как это встречается при моногенном гетерозисе. Построение генетической карты саеалсння для скрещивания W 504-1-1 х Р 310-17-В. Для исследуемого скрещивания были определены семь групп сцепления (Рис.1), что соответствует гаплоидному набору хромосом жемчужного проса. Дня определения взаиморасположения маркеров в каждой отдельной группе сцепления был использован много то чковый анализ с пороговым значением LOD 2.S и максимальной степенью рекомбинации O.S.

Полученный в результате порядок маркеров внутри всех групп сцепления в основном остался таким же, как и в исходна опубликованной карте скрещивания LGD-1-B-10 х 1СМР 85410, в настоящее время основной генетической карты сцепления жемчужного проса (Liu et al., 1994). В нашем исследовании удалось разделить труппы сцепления LG1 и LG2, тогда, как в исходной карте было найдено псевдосцепление между этими двумя группами из-за значительного нарушения сегрегации в этом районе (Liu et al., 1994). По сравнению с основной картой для жемчужного проса в наших каргах наблюдалось общее увеличение частоты рекомбинации и, соответственно, генетических расстояний между выбранными маркерами в экспериментальном скрещивании. Для иллюстрации этого факта было проведено сравнение длин карт пяти скрещиваний жемчужного проса, включающих; каргу исследованного скрещивания W 504-Ы х Р 310-17-В, основной карты жемчужного проса в скрещивании LGD-ЬВ-Ю х ICMP 85410 и трех карт с комбинациями скрещиваний 841В х 863В, 81В-Р6 х ICMP 451-Р8 , РТ732В х Р1449-2, любезно предоставпеных доктором C.T.Hash (ICRISAT). Длина основной генетической карты жемчужного проса равнялась 287 сМ. Авторы (liu et al., 994) предположили, что общая длина генома жемчужного проса должна составить примерно 400 сМ, что является наименьшей данной среди геномов всех основных злаков, исследованных на данный момент. Liu et al. (1994) также предположили, что в дальнейших исследованиях карта жемчужного проса будет расширена поскольку в то время большинство ©писаных RFLP карт злаков основывались на данных, полученных в результате анализа одного (часто

Ю1

им«

1.« эм <к

с» да ш« де

И.1Л1 11М>М »»«4 №11«

Ми 1 (

11<Ч

г к*

Рисунок 1. Генетическая карта спенленн* , основанная на данных ЯИ-Р-анализа для скрещивания и' 504-1-1 ж Р 310-17-В жемчужного проса. Число групп сцепления (семь) соответствует гаплоидному набору хромосом вида. Величина под номером группы сцепления соответствует се общей длине. Цифры слева от каждой группы сцепления указывают на расстояний межау двумя близлежащими маркерами(названня указаны по правой стороне от группы сцепления) в сантнморганидах (сМ).

дальнеродственного) скрещивания, когда хорошо извстао, что один из основных факторов, влияющих на фактическую д лину карты — это скрещивание, выбранное для создания карты: Чем больше генетическая дивергенция скрещиваемых особей, тем меньше будет общая длина карты.

Данные по группам спепления и общей длине генома представлены в таблице 3. Как и было предсказано Ш « а1. О??4), общая длина картированного генома возросла. Однако, она до сих пор остается одной из самых малых среди культивируемых растений. Значительный вклад в увеличение длины карты сцепления внесли использование молекулярных маркеров, а также гетерологичных маркеров риса, сорго, кукурузы, овса и пшеницы.

Нами было проведено детальное сравнение карт сцепления пяти указанных скрещиваний по отдельным группам сцепления. Как было замечено из анализа, генетические расстояния между И-ЪР-маркерами, определенные в первой карте сцепления жемчужного проса, в целом, остались неизменными во всех Зити исследованных скрещиваниях. Увеличение длины было, а основном, вызвано новыми разработанными маркерами. Порядок маркеров остался постоянным, за исключением двух случаев инверсии в группах сцепления Ш2 и 1X35. Таким

Таблица 3. Длины полных картированных геномов и отдельных групп сцепления для пяти скрещиваний жемчужного проса. ;

Длины указаны в сантиморганидах (сМ) вычисленных по фунчцнн Холдойнз. Данные по опубликованной карге скрещивании ЬЗДМ-В'Юк 1СМР 85410 выделены жирным шрифтом.

1 1 2 1 3 4

Скрещиденнс Ю Й1Вх8Ш 81В-Р6 х 1СМР 451-Р8 [ХЮ-ЬВ-Ю X 1СМР85410 504-М х РЗКМ7-В РТ 732В * Р1449-2

1 104.9 77.3 73,4 113.8 162.6

2 179.0 175.8 36.2 31.6 80.4

3 15,4 52.2 38.2 24.2 19.0

4 64.3 132.4 63.2 116.6 81.0

5 26.9 102.5 30.9 37.5 26.8

6 113.1 58.3 32.5 57.6 77.1

7 Ш.8 96.9 133 39.7 35.1

О&щяя длння Генома 617.4 695.7 287,7 421.0 482.0

Число Растения а Г, 147 184 133 175 136

образом, может бьггь сделан вывод, что порядок расположения RFLP-маркеров в группах сцепления характерен для вида Pcrmicetum glaucum (L.)R-Dr,

За последние годы были осуществлены исследования но сравнительному картированию (Devos et al., 1992,1997,2000; Lagercrantz, 1998), которые позволили предположить, что первая опубликованная карта жемчужного проса (Liu et al., 1994) была неполной. Оказалось, что у жемчужного проса, как н у ряда других злаков, рекомбинации чаще всего происходят в днстальных участках, хромосом и в участках хромосом с наибольшей концентрацией генов (Gill et al.,1996), Для установления возможной корреляции между рекомбинацией и плотностью генов у жемчужного проса необходимо наличие данных физического картирования (Dcvos et al., 2000), которые в данный момент еще не получены.

Таким образом, в настоящее время генетическая карта сцепления жемчужного проса остается незавершенной. Однако, даже создание маломасштабной генетической карты жемчужного проса упростит его использование в селекционных программах. Например, для локализации генов в скрещиваниях, для которых не существует RPLP-карт, скелетные карты, разработанные для других скрещиваний, помогут решить эту проблему. Теоретически, для жемчужного проса требуется менее 40 молекулярных маркеров для создания скелетной карты, со средним расстоянием между маркерами менее 15 сМ, в то время, как для других злаковых культур необходимо гораздо большее число маркерных локусов). Трансформация карты сцепления скрещивания W 504-1-1 х Р 310-I7-B для картирования QTL, Для картирования локусов количественных признаков полученная полная генетическая карта скрещивания W 504*1-1 х Р 310-17-В была нами трансформирована в скелетную, после исключения ряда маркеров с целью уравнивания расстояний между оставшимися маркерами. Уменьшенный набор маркеров был снова проанализирован с помощью программы МарМакег/Ехр 3.0. Длина вновь полученной скелетной карты была незначительно меньше полной карты. Единственная большая разница в 31.1 сМ между LG4 обеих карт обусловлена длинным разрывом между маркерными локусами Xpsm464 и Xpsm648 в центральной частя группы сцепления, вызванным отсутствием маркеров в этом участке (фактически, длина разрыва сократилась до 29,8 сМ при исключении маркерного локуса Xpsm306). Расстояния между другими маркерами в LG4 остались, практически, неизменными на обеих картах. Полученная скелетная карта сцепления, построенная нами с меньшим набором маркерных локусов, бьспа использована для картирования устойчивости к ложной мучнистой росе. Локализация QTL устойчивости к ложной мучнистой росс при помощи метода интервального картирования. Интервальное картирование проводилось при помощи программы MapMaker/QTL (Lander ап4 Botstein, 1989). Число LOD ассоциации между генотипом и количественными данными по устойчивости к ложной мучнистой росе подсчитывали с использованием свободной модели QTL эффектов. Поскольку, использовалась карта с расстоянием между маркерами приблизительно 1S - 20 сМ, случаи неправдоподобно высоких значений LOD балла практически, исключены. Величина LOD балла, равная 2,0 была выбрана в качестве

порогового уровня значимости для локусов количественных признаков. Формула вычисления критического значения LOD балла для принятия моделей множественных QTL была:

LOD„ = LOD(n-i) + 2

где LODn - оценочный минимум величины числа LOD для принятия модели с nQTL, a LOD(b-d - наибольшее значение числа LOD для лучшей модели с (n-l)QTL. В случае нескольких моделей множественных локусов количественных признаков с одинаковым значением LOD балла, для выбора лучшей модели принимались во внимание значения -¿ к S2 среди сравниваемых моделей лучшими признавались модели с максимальным значением -¿ и минимальным значением 6г , В процессе анализа оценивали эффект локусов количественных признаков па фенотип, в результате замен аллелей отцовской родительской формы (Р 310-17-В) на аллели материнской формы (W 504-1-1). В экспериментальном скрещивании отцовская родительская форма была 'устойчива к заболеванию. Таким образом, если устойчивость наследовалась от устойчивого родителя , коэффициент степени зараженности экспериментальной популяции ложной мучнистой росой был негативен/Аналогично, там где устойчивость была доминантна, эффект вклада был положителен. Аддитивные взаимодействия 1 между значимыми локусами количественных признаков оценивали путем объединения пар значимых QTL и сравнением суммарного значения LOD балла с наибольшим значением индивидуальных чисел LOO. Общий вклад найденных локусов количественных признаков в фенопшнческую изменчивость ' оценивали одновременным измерением всех значимых QTL в одной модели.

В соответствие с методикой экспериментов, данные генотшшровання были получены на инднвидумах поколения Fi, а степень устойчивости растений к ложной мучнистой росе оценивали на соответствующих семействах F*. В таком случае сегрегация гетерозигот в двух дополнительных поколениях, полученных самоопылением, являлось причиной уменьшения эффективной доминантности в семействах F* по сравнению с поколением Fi, Данные экспериментов представлены в таблице 4.

В результате анализа были обнаружены два основных типа QTL, вносе тих вклад в устойчивость к ложной мучнистой росе. Первый тип, найденный впервые, характеризовался эффективностью прошв рада нзолятов патогена как нз Африки, так и нз Индии. Второй вид локусов количественных признаков имел более типичный штоген-специфичный характер н был аналогичен ранее обнаруженным QTL я исследовании Jones et al.(1995). К первому типу принадлежали два из основных локусов количественных признаков. Первый - наследуемый от материнской родительской формы W J04-1-1 и локализованный в центральной части группы сцепления LG4 (между маркерными л оку сам и Xpsm464 и Хр$т648), ,бьш эффективен против всех четырех исследованных африканских нзолятов патогена ( из Мали, Нигера, Нигерии .Судана) и трех индийских (ICRISAT, Durgapura, MBH 10) Второй - несущий аллели устойчивости от отцовской родительской формы Р 310-I7-B и локализованный на одном нз концов группы сцепления LO! (между маркерными локусами Xpsm52 и Хр$т34Т)> дыл эффективен против двух индийских рас (ICRISAT и Jamnagar) и трех африканских (из Мали,

Нигерии и Судана) популяций патогена. Фенотипическая изменчивость % реакции на заражение ложной мучнистой росой и объясненная вкладом эти* двух основных (¡"П. была высока и варьировала в пределах от 16% до 80% для первого локуса количественного признака и от 53% до 67% для второго (}ТЬ, Эти локусы вносят максимальный вклад в устойчивость к патогену среди всех обнаруженных <}ТЬ.

Таблица Результаты картирования (Щ. устойчивости к ложной мучнистой росе в скрещивании 1У504-1-1 хР 310-17-В жемчужного проса (Реппйетт %1аисит (Ь.) Я, Вг.) против девяти популяций патогена {Зскгозрога р-атШсо1а (5асс.) вЬт.) из разных районов происхождения.

- группа сиеплекк» на генетической карге, М*** - «очищенные названы лохусов молекулярных маркеров Хр$т*". Р • Отшнэскм родительская форма Р 310-17-В; V/ • мапрннеш родительски форма "V 504-1-1. Характер доминировали*, присущий отдельным ОТЬ: ОЭ - свермюминироаание, 6 • [фостое доминирование, Б(р) - частичное доминирование, Я • рецессивность. * • случаи различий в наследования или характере доминирования отдельного <}Т1. и модели со множественными С)ТЦ включающий данный <ЭТ1_

ис интервал Популяции патогена ]

Индия Африка |

■ 1С1ШЛТ Фиг^рип МВНШ |ыпм£аг ГЧокЬ» Ванька $«<й>гс КолШяв

_ 1

1 М425-М38б Р-ОО

1 М38б-М52 Р-ОЙ

1 М52-М347 Р-0О Р-ОО Р-ОО Р-ОО Р-00

М322-М458 Р-ОР Р-СГО*

2 М45«-М321 р-оа

1 1 ■1 1

3 М37-М10* № ■ СЮ \Ч . О(р) \V-OD №' . (Ои)

М473-М410 !\ • ОГр) 1С- О' 1 \V-fc

М409.2-М464 Р-Л*

М464-М64в Ш-00 Ш-ОЙ W-OD «Г-Ой* V - ОБ XV - ОЙ

М648-М305 ИГ-ОО Г-ОО гс - /) Р-Я*

М2Й9-М618 «-л*

М61Я-М834 Р-ОО

М834-М526 Р-ОО

Среди идентифицировалаъос локусов количественных признаков второго типа, характеризуемых патоген-специфическим действием, впервые QTL был обнаружен на одном нз концов группы сцепления LG3 в промежутке между маркерными локусами Xpsm37 и Xpsn/OS, Этот QTL отличался эффективностью только против всех популяции патогена индийского происхождения ([CRISAT, MBH 110, Jamnagar и Nokha). В тестах па устойчивость LOD балл этого локуса количественного признака был несколько меньше, чем для предыдущих QTL и контролировал гораздо меньшую часть наблюдаемой фенотшшческой изменчивости в ответ на заражение (8-40%),

Кроме этих основных локусов количественных признаков было обнаружено несколько малых QTL, имеющих разную локализацию (табл.4). В целом, в результате интервального картирования данных скрининга скрещиваний экспериментальной популяции жемчужного проса в присутствии девяти популяций патогена различной локализации, были обнаружены 13 локусов количественных признаков, контролирующих устойчивость к ложной мучнистой росе. Общий вклад всех QTL, обнаруженных в отдельном тесте, варьировал от 21% (единственный локус количественного признака, эффективный прошв патогена Jodbpur, Индия) до 93% ( три локуса, эффективные против изолята патогена нз Нигерии). Все локусы количественных признаков, обнаруженные в отдельном тесте с конкретной популяцией патогена, по всей вероятности взаимодействуют между собой. Один из вариантов взаимодействия был предложен Jones et al. (1995). Согласно ему, доля фенологической изменчивости пропорционально зависела от значимости каждого локуса количественного признака в механизме устойчивости ( в процессе узнавания патогена или ингибирования его роста ),

Таким образом, в настоящей работе приведены результаты использования молекулярных маркеров для создания генетических карт сцепления локусов устойчивости к ложной мучнистой росе у жемчужного проса. Показано, чп> гены, контролирующие устойчивость к заболеванию обладают различной специфичностью в отношении к'расам патогена. Показано также, что возможно использовать изученные молекулярные маркеры для направленной селекции на устойчивость к заболеванию а создавать устойчивые сорта в отсутствие патогена.

- Выводы.

1. Построена новая генетическая карта сцепления на основе гибридной комбинации V 504-Ы х Р 310-17-В с использованием молекулярных маркеров. Общая длина карты составляет 421 сМ и превышает длину имеющейся основной карты жемчужного проса . Порядок расположения КН.Р маркеров сохранился прежним, что являетвя, вероятно, типичным для вида Рспп1$е1шп glaucum (1,.) 14,Вг.

2 Установлено, что молекулярные маркеры в группах сцепления 1-01, 1X32, 1X33, 1.04 и 1X36 демонстрируют статистически значимые отклонения от

теоретически ожидаемой сегрегацин-Это, вероятно, свидетельствует об их сцепленности с генами, препятствующими нормальному развитию растений жемчужного проса.

3. Создана скелетная генетическая карта сцепления с уменьшенным набором маркерных локусов для уравнивания расстояний между маркерами.

4. На основе созданной скелетной генетической карты сцепления были картировании 13 новых локусов количественных признаков, ответственных за устойчивость к ложной мучнистой росе у жемчужного проса.

5. Два локуса количественных признаков локализованы* в интервалах М52-М347 н М464-М648 а первой и четвертой группах сцепления .соответственно, контролируют устойчивость жемчужного проса к широкому спектру штаммов как Азиатского, так и Африканского происхождения,

6. Локус количественного признака, картированный в интервале М37-М108 в третьей группе сцепления, детерминирует устойчивость к популяциям патогена ложной мучнистой росы исключительно Азиатского происхождения.

Список публикаций,

Kolchinsky А„ Kolesnikova М., Ananiev П., "Portraying " of plant genomes using polymerase chain reaction amplification of ribosomal SS genes. Genome (1991) v. 34, pp. 1028-1031

Kolesnikova M., Seiiova A., Momdjan M. The organisation of 5S-rRNA genes in plants studied by PCR- In Abstracts: German-Russian Research Co-operation, Workshop On Plant Molecular Biology and Biotechnology, Moscow, Russia (1992)

Kolesnikova-AJlen M.A., Breese WJi„ Hash C.T., Shaw D.S., Govtla O.P„ Witcombe J.R. (1999) New quantitative trait loci (QTLs) for downy mildew resistance in peart millet In Abstracts: "Life Sciences in the Next Millennium". Hyderabad, India, p, 66

Hash C.T., Yadav R.S., Cavan G.P., Howarth C.J.. Liu H., Qi X.. Sharma A„ Kolesnifco va-Ailen MA, Bidinger F-R-, Witcombe J.R. Marker-assisted backcrossmg to improve drought tolerance in pearl millet. In Proceedings of "Strategic Planning Workshop on Molecular Approaches for the Genetic Improvement of Cereals for Stable Production in Water-Limiled Environments", International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT), El Batsn, Mexico, (2000) pp. 114-119

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01,12.99 г. Подписано к печати 16,03.2001 г. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 228. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891, 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колесникова, Мария Александровна

Обзор литературы

1.1. Биология и генетические характеристики жемчужного проса

1.1.1. Биология жемчужного проса и его хозяйственное значение

Жемчужное просо (РептяеШт glaucum (Ь.) Я. Вг.) (Рис. 1) - один из видов проса с максимально высокой фотосинтетической активностью. Это важная зерновая и фуражная культура для засушливых и полузасушливых тропических районов Азии и Африки, являющаяся шестой по значимости культурой в мировом масштабе после пшеницы, ячменя, риса, кукурузы и сорго. Жемчужное просо имеет высокие потенции, как культура, произрастающая в высокотемпературных зонах на почвах либо слишком песчаных и слабо структурированных, либо сухих, либо слишком

Рисунок 1. Жемчужное просо {РептяеШт %1ажит (Ь.) Я. Вг.) - культура бедных фермеров полузасушливых торопиков Индии и Африки

Моим родителям посвящается

Благодарности

В первую очередь я хочу выразить мою глубокую признательность и благодарность моему научному руководителю В. А. Пухалъскому за его неоценимую помощь на протяжении всего времени выполнения работы.

Особые слова благодарности моему научному консультанту Ч. Т. Хаш, кто был непосредственно вовлечен в анализ экспериментальных данных и чьи консультации помогли разрешить множество спорных вопросов.

Я хочу поблагодарить А. А. Поморцева и Б. А. Калабушкина за чрезвычайно полезное обсуждение результатов, за постоянную поддержку и оптимизм.

Выполнение данной работы протекало бы с большими проблемами без помощи и поддержки сотрудников лабораторий Генетики растений и Популяционной генетики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, чья энергия, энтузиазм и помощь были неоценимы.

Я искренне благодарна директору института общей генетики им . Н.И.Вавилова РАН академику Ю. П. Алтухову за предоставление возможности выполнения данной работы и защиты на данном Ученом Совете.

Я бесконечно благодарна Г. Н. Полухиной, с чьей энергичной помощью были преодолены все формальные процедуры.

Моя бесконечная признательность и глубокая благодарность Ричарду Аллену и Ольге Колесниковой.

Содержание

Благодарности.I

Список использованных сокращений.П

Список иллюстративного материала.Ш-У

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Биология и генетические характеристики жемчужного проса.

1.1.1. Биология жемчужного проса и его хозяйственное значение.

1.1.2. Таксономия и происхождение жемчужного проса.

1.1.3. Фенотипический и генетический полиморфизм жемчужного проса.

1.1.3.1. Биохимический полиморфизм.

1.1.3.2. Методы анализа полиморфизма ДНК.

1.1.3.2.1. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов ДНК (М-ЪР-маркеры).

1.1.3.2.2. Анализ полиморфизма ДНК с использованием полимеразной цепной реакции.

1.1.3.2.2.1. Полиморфизм длин продуктов амплификации (АРЬР-маркеры).

1.1.3.2.2.2. Полиморфизм случайно амплифицированных фрагментов ДНК (ЛАРВ-маркеры).

1.1.3.2.2.3. Амплификационное фингерпринтирование ДНК (БАБ-маркеры).

1.1.3.2.2.4. Амплификация районов ДНК с известной последовательностью (БСЛЫ-маркеры).

1.1.3.2.2.5. Полиморфизм уникальных фрагментов ДНК с известной последовательностью (ЗТБ-маркеры).

1.1.3.2.2.6. Полиморфизм уникальных экспрессирующихся фрагментов ДНК с известной последовательностью (ЕБТ-маркеры).

1.1.3.2.2.7. Полиморфизм рестрикционных фрагментов амплифицированной ДНК (САРБ-маркеры).

1.1.3.2.2.8. Полиморфизм повторов простых последовательностей ДНК (Микросателлитные маркеры - БвЯ (простые повторы), БТЯ (короткие тандемные повторы), У>Ш1 (варьирующее число тандемных повторов).

1.1.3.2.2.9. Полиморфизм одноцепочечной ДНК (88СР-маркеры).

1.1.3.3. Использование полиморфизма ДНК в анализе генетического разнообразия жемчужного проса.

1.2. Ложная мучнистая роса (JIMP).

1.2.1. Характеристика заболевания.

1.2.2. Патогенный организм.

1.3. Картирование локусов количественных признаков (QTL) у жемчужного проса.

1.3.1. Принцип анализа локусов количественных признаков (QTL).

1.3.2. Методы анализа и картирования QTL.

1.3.2.1. Анализ отдельного маркера или точковый анализ.

1.3.2.2. Интервальное картирование методом максимального правдоподобия.ЗЗ

1.3.2.3. Интервальное картирование посредством линейной регрессии.

1.3.2.4. Композитное интервальное картирование (СГМ).

1.3.3. Сцепление между генетическими маркерами и QTL.

1.3.4. Селекция с помощью маркеров (MAS).

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Использованные сорта растений-хозяев.

2.1.1. Родительские сорта, использованные в скрещивании для картирования.

2.1.2. Сорт, использованный для выращивания инокулюма.

2.2. Патогенный материал.

2.3. Молекулярные пробы использованные для получения данных генотипирования.

2.4. Постановка скрещиваний.

2.5. Тестирование на устойчивость к JIMP.

2.6. RFLP-анализ (получение данных генотипирования).

2.6.1. Выделение суммарной ДНК жемчужного проса.

2.6.1.1. Два альтернативных способа подготовки листового материала жемчужного проса для выделения ДНК.

2.6.1.2. Первый этап выделения ДНК.

2.6.1.3. Второй этап выделения ДНК.„^.

2.6.2. Измерение концентрации ДНК.

2.6.3. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2.6.4. Разделение рестрицированных фрагментов ДНК методом электрофореза.

2.6.5. Перенос ДНК на нейлоновые мембраны по Саузерну.

2.6.6. Гибридизационные процедуры.

2.6.6.1. Подготовка ДНК-проб жемчужного проса для гибридизации.

2.6.6.1.1. Амплификация клонированных фрагментов суммарной ДНК жемчужного проса с помощью реакции PCR.

2.6.6.1.2. Очистка амплифицированных фрагментов путем хроматографии в мини-колонках с сефарозой.

2.6.6.1.3. Мечение проб методом рассеянной затравки.

2.6.6.2. Предгибридизация.

2.6.6.3. Гибридизация.

2.6.6.4. Отмывки фильтров от невключившейся метки.

2.6.6.5. Отмывка фильтров от включившейся метки.>.

2.7. Анализ сцепления.

2.8. Картирование локусов количественных признаков (QTL).

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Анализ сцепления и создание генетических карт.

3.1.1. Предварительный скрининг родительских сортов на полиморфизм.

3.1.2. Анализ нарушения сегрегации локусов молекулярных маркеров.

3.1.3. Построение генетической карты сцепления скрещивания W 504-1-1 к Р 310-17-В.

3.1.4. Картирование локусов количественных признаков (QTL), контролирующих устойчивость к ложной мучнистой росе у жемчужного проса.

3.1.4.1. Трансформация полной генетической карты сцепления скрещивания W 504-1-1 х Р 310-17-В в скелетную для картирования QTL.

3.1.4.2. Локализация QTL устойчивости к ложной мучнистой росе методом интервального картирования.

3.1.4.2.1. Популяция патогена ICRISAT (Patancheru, Индия).

3.1.4.2.2. Популяция патогена МВН 110 (Jalna, Индия).

3.1.4.2.3. Популяция патогена Nokha (Jodhpur, Индия).

3.1.4.2.4. Популяция патогена Durgapura (Jaipur, Индия).

3.1.4.2.5. Популяция патогена Jamnagar (Индия).

3.1.4.2.6. Популяция патогена Nguru (Нигерия).

3.1.4.2.7. Популяция патогена Bamako (Мали).

3.1.4.2.8. Популяция патогена Sadore (Нигер).

3.1.4.2.9. Популяция патогена Kordofan (Судан).

Глава 4. Общая дискуссия.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование молекулярных маркеров для картирования генов устойчивости (QTL) к ложной мучнистой росе у жемчужного проса"

Актуальность проблемы. Жемчужное просо [Pennisetum glaucum (L.) R. Br.] является одной из основных продовольственных культур полу-засушливых тропиков Индии и Западной Африки. Оно является основной сельскохозяйственной культурой, возделываемой в этих районах, адаптированно к условиям чрезвычайно низкого количества осадков и сильнонагреваемых песчаных почв. Поэтому, улучшение питательных качеств, повышение продуктивности и устойчивости к различным заболеваниям является первостепенной задачей в селекции жемчужного проса для этой зоны.

Наибольший вред посевам жемчужного проса наносит Sclerospora graminicolo (Sacc.) Shrot. - облигатный биотропный гриб. Он является возбудителем ложной мучнистой росы (JIMP), поражающей жемчужное просо, приводя к катастрофическим потерям урожая. В Индии, с началом возделывания в конце 60-х годов высокоурожайных гибридов жемчужного проса, созданных на основе восприимчивого сорта с мужской цитоплазматической стерильностью, случаи поражения ложной мучнистой росой приняли характер эпифитотий, при которых потери урожая достигали 70%. Устойчивость к заболеванию созданных позднее гибридных сортов также оказалась непродолжительной.

Можно выделить несколько причин, затрудняющих селекцию новых гибридных сортов жемчужного проса на устойчивость к ложной мучнистой росе. Во-первых, степень устойчивости растения-хозяина постоянно варьирует, что может быть объяснено высокой степенью генетической изменчивости патогена, а также, зачастую, неполной гомозиготностью родительских сортов. Во-вторых, устойчивость носит территориальный характер, что обуславливается в большей части генетическими различиями между популяциями патогена из разных районов. Теоретически, селекция на устойчивость гибридного материала к популяциям патогена из разных районов может проводиться в одном исследовательском центре путем единовременного тестирования полным набором рас патогена. Однако, этоне представляется возможным для селекционеров Африки и Индии, из-за жестких карантинных норм.

В последнее десятилетие, направленная селекция с использованием различных типов молекулярных маркеров (MAS) получила широкое развитие в области создания сортов культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям, вредителям и неблагоприятным условиям внешней среды. При использовании данного подхода полностью исключаются эффекты, вызванные влиянием внешней среды, а также сцепленный дрейф генов, присутствующий обычно в традиционной селекции. Благодаря созданию полных генетических карт сцепления на основе молекулярных маркеров, стало возможным точное картирование генов, ответственных за изменчивость сложных количественных признаков, с целью использования их в различных селекционных программах. Молекулярные маркеры, сцепленные с генами устойчивости позволяют проводить селекцию на устойчивость к различным популяциям патогена в одном исследовательском центре, в отсутствие патогена. Осуществимость такого подхода была показана в целом ряде работ по картированию локусов, контролирующих количественную изменчивость по устойчивости к болезням у таких культур, как кассия (бактериальная гниль) (Jorge et al., 2000), кукуруза (серая пятнистость листьев) (Bubeck et al., 1993), капуста (кила крестоцветных) (Manzanarea-Dauleux et al., 2000) и других.

В молекулярном плане жемчужное просо является малоизученной культурой. Первые генетические карты на основе RFLP были опубликованы лишь в 1994 году и по сей день остаются основными в исследованиях жемчужного проса. Наличие карт сделало возможным картирование генов устойчивости к различным расам патогена, возбуждающих ложную мучнистую росу, и их последующее введение в элитные сорта жемчужного просаИсходя из перечисленных причин, разработка новых подходов к интрогрессии генов устойчивости к этому патогену в новые сорта является чрезвычайно актуальной. Одновременно, необходим постоянный контроль за быстро модифицирующимся патогеном и, соответственно, степенью устойчивости к нему различных сортов. Поиск новых источников устойчивости к патогену,детальное картирование генов устойчивости и их эффективный перенос в создаваемые сорта, является одним из главных направлений современных * селекционных программ по жемчужному просу.

Целью данной работы являлась локализация кластеров генов, детерминирующих устойчивость жемчужного проса к ложной мучнистой росе. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:- Создать генетические карты сцепления для сортов W 504-1-1 и Р 310-17-В,- Сравнить эти генетические карты сцепления с ранее опубликованными для данного вида картами сцепления с целью выяснения возможности использования одних и тех же маркеров при различных скрещиваниях,- Провести картирование генов, контролирующих устойчивость к ложной мучнистой росе,Идентифицировать молекулярные маркеры, сцепленные с генами, контролирующими устойчивость к ложной мучнистой росе.кислых и неплодородных для других культур. Кроме того, многочисленные свойства жемчужного проса, касающиеся его репродукции, роста и физиологии делают эту культуру важным компонентом агрономических систем сельскохозяйственного производства. К таким свойствам относятся рост растения, цветение, кормовые и зерновые качества, высокая скорость роста, адаптация к различным агро-экологическим условиям.

Жемчужное просо - одна из самых важных культур некоторых районов Индии и западной Африки - культивируется более чем в 30 областях и занимает 24.2 млн га мировых посевных площадей. Из них 46.4% в Азии, где Индия является главной по выращиванию жемчужного проса (43.4% от мировых площадей). 45% мировых площадей относится к Африке (Нигер, Нигерия, Сенегал). Точно подсчитать посевные площади, урожай и урожайность не представляется возможным, так как жемчужное просо часто смешивают с другими видами проса или сорго. Хотя эта культура занимает только 3.5% от 697 млн га от посевных площадей хлебных злаковых культур и примерно 1% общей продукции злаковых (Dendy, 1995), она является культурой, произрастающей в экстремальных условиях и в зонах, где существуют значительные трудности в выращивании других зерновых культур.

Ежегодный мировой урожай жемчужного проса составляет около 16.5 млн т. В Азии большая часть продукции производится в Индии - 6.8 млн т зерна или 42% общего мирового урожая. Все районы Африки вместе дают 55.4% от мирового урожая. Более детальная информация по географическому расположению основных районов культивирования, посевным площадям и урожайности показана на Рисунках 2 и 3.

Жемчужное просо - главная пищевая культура для сухоземельных полузасушливых и засушливых тропических областей. Увеличение и стабилизация урожайности жемчужного проса необходимы для поддержания здоровья миллионов людей, живущих в наиболее бедных районах этих ареалов. Жемчужное просо употребляется, главным образом, в пищу и в качестве корма для домашней птицы, свиней, прудовой рыбы (Andrews and Kumar, 1992), а также является хорошим источником углеводов и азота для жвачных животных молочных и мясных пород -крупного рогатого скота и коз (Teare, 1995). Зерно, крупа и мука являются важнымикомпонентами традиционных видов питания населения полузасушливых тропиков. Улучшение цвета зерна, содержание белка и углеводов и под держание качества могут продвинуть жемчужное просо в элитный класс продуктов, таких, как, к примеру, хлебопродукты. В Индии и западной Африке, помимо зерна, используется и солома, которая идет на корм скоту. В развитых странах, таких, как США, Австралия и Южная Африка эта культура выращивается, преимущественно, на силос.

На величину урожая жемчужного проса существенное влияние оказывают абиотические и биотические факторы, прямым образом сказывающиеся на величине урожая. К основным абиотическим факторам относятся низкоплодородные и плохо структурированные почвы, неравномерное выпадение осадков и высокие температуры.

Главными биотическими факторами, ведущими к ограничению культивирования и уменьшению урожая зерна, являются различные болезни и вредители. Постоянной угрозой при возделывании высокоурожайных сортов и гибридов жемчужного проса является одно из самых распространенных заболеваний -ложная мучнистая роса (J1MP). Высокая степень сходства и продолжительности возделывания гибридов в одних и тех же областях приводит к инокуляции почвы и возможно к вирулентности биотипов и, в конечном результате, к увеличению заболеваемости.

Рисунок 2. Распределение районов культивирования жемчужного проса, посевные площади и производство зерна на территории африканского континента по статистическим данным ФАО (1980-81)2010"10203040503020101020<гл AFRICA30-30SAT boundarySAT boundary deurkatcd with insufficient data.«—»50,000 tettircs under ion;tax cultivation. tBelow 25,000 hectares under sorghat cultivation О201010203020 V. of Greenaic«i0102030 of treennich50Projection: KOIAWU S ADAHBase aap fro* The national Atlas of SenegalfKEFAKU И: K.t.i. 1М», KRISA7, pitancntru P.O., A.?. l№u.somas: ГАО HontU* Bulletin Ы Statistic! Vol.» - till «(12). wop.if мзишшаш aimsrwmss emrr-s of aatocummccr - iausar DK-ai.

Первые упоминания о жемчужном просе документированы в 1154 г ученым арабской школы Аль-Идрису (Al-Idrisu) в описании его путешествий по северной Африке и Испании. В его работе указаны два типа проса из Абиссинии (в верхнем течении Нила), один из которых оказался сорго, а второй - просо, которые возделываются до сих пор. В западной литературе первое описание жемчужного проса относится к 16 веку в работе Лео Африканского (Leo Africanus), опубликованной после его путешествия в Африку.

Основываясь на морфологических различиях многих групп зерновых, Корнике и Вернер (Koernicke and Werner, 1883) заключили, что жемчужное просо произошло из Африки. В классических работах Н.И. Вавилова (Vavilov, 1949/50) указывается, что жемчужное просо произошло из Эфиопии, как центра доместикации. Однако, существуют два аргумента, противоречащие данному утверждению и позволяющие считать, что эта культура была занесена в Эфиопию уже после одомашнивания. Во-первых, дикий предок (.Pennisetum glaucum подвид violaceum) редко встречается в районах восточнее Судана. Дикие предки адаптированы к песчаным, полупустынным условиям и не могут произрастать в высокогорных и увлажненных районах Эфиопии. Во-вторых, местные разновидности жемчужного проса в Эфиопии не отличаются большим морфологическим разнообразием, и в настоящее время эта культура возделывается там в минимальных масштабах.

Мёдок (Murdock, 1959) постулировал, что жемчужное просо произошло в одном из западно-африканских центров вблизи реки Нигер около 5000 - 4000 лет назад. Однако Бекер (Baker, 1962) опроверг эту теорию, указав, что в это время былпериод тропических ливней и, как результат, экстремальный подъем воды в Нигере, что препятствовало произрастанию жемчужного проса.

Харлан (Harlan, 1971) поддерживал идею третьего центра происхождения -диффузного пояса, протянувшегося от западного Судана до Сенегала. На это указывали два фактора: во-первых, в этих районах наблюдалось наибольшее морфологическое разнообразие, а во-вторых, были найдены дикие предки жемчужного проса. Таким образом, по его мнению, западная Африка, а точнее зона Sahel, является центром происхождения культуры (Sahel - район западной Африки, формирующий переходную зону между засушливой Сахарой на севере и влажными тропическими районами на юге. Среднегодовое количество осадков в этом поясе колеблется от 102 до 203 мм и выпадает, преимущественно, с июня по сентябрь. Довольно обычны периоды редких осадков и засух. Например, последняя продолжительная засуха в Saheí (с конца 60-х по ранние 80-е прошлого столетия) -самая жестокая за последние 150 лет, заставила исследователей рассматривать тенденцию перехода климата в этом районе от полузасушливого к все более засушливому.

Ряд данных по изозимному- и ДНК-полиморфизму свидетельствуют в пользу множественных центров происхождения жемчужного проса. В работах по изозимному анализу диких и культурных форм жемчужного проса из западной Африки были выявлены два существенных аспекта организации генетического разнообразия этого вида (Marchais and Tostain, 1985). Основываясь на частотах аллелей белков и ферментов, были определены три группы жемчужного проса - дикий тип, раносозревающий и поздносозревающий. Раносозревающий тип показал самый высокий уровень полиморфизма, тогда как поздносозревающий - самый низкий. Наблюдался восточно-западный градиент дифференциации среди генотипов диких и культурных форм жемчужного проса. Базируясь на этих данных, авторы предположили, что жемчужное просо произошло из многих центров в Западной Африке (Tostain and Marchais, 1989). Эти данные обнаруживают параллелизм с теорией о множественных центрах происхождения для сорго {Sorghum bicolor (L.)) и пальчикового проса (Eleusine coracana (L.) Gaertn.) (Purseglove, 1976).

В пользу предположений о множественных центрах происхождения говорят и результаты, полученные из анализа полиморфизма длин рестриктных фрагментов (RFLP) хлоропластной ДНК, ядерной рибосомной РНК (рРНК) и сиквенса гена алкогольдегидрогеназы (АДГ) в группе из 25 диких и 54 культурных вариантов жемчужного проса (Gepts and Clegg, 1989). На полиморфизм хлоропластной ДНК приходится 50% всего генома хлоропласта Гены ядерной рРНК тоже полиморфны, причем гены диких форм жемчужного проса оказались более полиморфными. Результаты исследования показали, что культурные формы более однородны. В сиквенсе генов АДГ также наблюдалось разнообразие, однако различие в частотах гаплотипов между культурными и дикими формами жемчужного проса отсутствовало.

Дикие формы жемчужного проса из районов Sahel (западная Африка) показали несколько вариантов RFLP-паттернов для ядерной рРНК, в то время, как культурные формы оказались мономорфными. Возможно, что высокий уровень перекрестного опыления жемчужного проса делает неясным происхождение паттернов генетического разнообразия среди структурных генов диких и культурных форм.

Обобщая данные из различных источников, можно заключить, что жемчужное просо происходит из западной Африки (около 4000 лет назад), откуда культура распространилась в восточную Африку и потом была перенесена в южную Африку и Индию около 2000 и 3000 лет назад соответственно (Рис. 4). Таким образом, Индия является вторичным центром разнообразия жемчужного проса.

Жемчужное просо - является идеальным объектом для научных исследований. Небольшое число хромосом, диплоид (2п = 14), короткий жизненный цикл (70-80 дней), легко само- и перекрестноопыляющаяся культура, пластичная для возделывания, высокое число семян в початке (Begg, 1965; Khairwal et al., 1990).

Жемчужное просо включает три морфологически различных подвида - подвид Pennisetum americanum (включает широкий спектр культивируемых форм), подвид Pennisetum monodii (происходит из Западной Африки и признан диким прародителем жемчужного проса), и подвид Pennisetum stenostachyum (морфологически находится между первыми двумя подвидами). Таким образом, часто используемое ботаническоеРисунок 4. Схематическое изображение районов окультуривания и дальнейших путей распространения жемчужного проса (РептзеТит glaucum (Ь.) Я. Вг.) по Африке и Индии (из Юшгоа! е( а!., 1999)I I Тур^ёея ШЯ СЬЬояиш ВР = Вей)ге ргаемназвание жемчужного проса Р. атеИсапыт не является таксономически правильным. Более таксономически корректным служит название Р. %\аисит.

Таксономическая классификация, используемая в настоящее время для жемчужного проса, следующая:Семейство - Роасеае Подсемейство - Ратсо1с1еаеГруппа Подгруппа Секция Род Вид- Ратсеае- Ротстав- РвтсШаНа- РептяеШт- glaucum1.13 Фенотипический и генетический полиморфизм жемчужного проса „Благодаря высокой степени перекрестного опыления, происхождению из нескольких независимых центров доместикации (Ponset et al., 1998) и широких вариаций стрессовых условий традиционного культивирования, у жемчужного проса наблюдается высокий полиморфизм как на фежшишческом, так и на генетическом уровнях (Liu et al., 1992, 1994), обеспечивая значительное разнообразие агрономически важных характеристик, и, тем самым, внося значительный вклад в адаптацию культуры к различным агроэкологнческим условиям. Генетическое разнообразие дает основы для улучшения возделываемых культур, так как открывает широкие возможности для естественной и искусственной селекции. Для жемчужного проса, исследования которого ведутся уже более 30 лет, известно много работ, в которых дается подробная характеристика генетического разнообразия морфологических признаков, количественных признаков, изозимного состава белков и ферментов и, в последнее десятилетие, полиморфизма ДНК.

Известно, что главные агрономически важные черты растений обладают непрерывной изменчивостью и не подчиняются законам менделевского наследования. Экспрессия основных генов слабо или совсем не зависит от факторов окружающей среды. Напротив, полигенные признаки подвержены сильному влиянию окружающей среды, что вносит наибольший вклад в разнообразие популяции. В результате этого, одной из задач исследований является разделение непрерывной фенотипической изменчивости на генетическую и средовую компоненты, используя принципы популяционной генетики, и ее инструмента - биохимической генетики.

1.1.3.1. Биохимический полиморфизмПод биохимическим полиморфизмом подразумевается наличие в одной и той же популяции различных молекулярных форм белков. Преимущества использования изоферментного анализа, в отличие от других типов маркеров (фенотипических, фотохимических и др.) в том, что ферменты и белки являются прямыми продуктамигена, а не продуктами, например, серии биосинтетических реакций. Для жемчужного проса иссследовано 14 изоферментных систем. Первой и наиболее изученной системой была алкогольдегидрогеназа (АДГ), которая образует три зоны активности, видимые на фореграмме, причем одна из них экспрессируется исключительно в анаэробных условиях обработки семян или их прорастании. Показано, что эти белки являются димерами и продуцируются двумя структурными генами АДГ] и АДГБолее подвижная зона это гомодимер АДГ], медленная зона - гомодимер АДГпромежуточная зона — гетеродимер, образованный между АДГI и АДГ?. Оба эти локуса сцеплены, но рекомбинации между ними не обнаружено (Baimett-Bourillon, 1982а, 1982Ъ). Считается, что система алкогольдегидрогеназы в жемчужном просе более примитивна, чем, например, в маисе. Во всех исследованиях были найдены только два варианта АДГ.

Другая детально изученная система - эстераза. В жемчужном просе присутствуют два типа эстераз. Один тип - димер с ко-доминантным типом наследования (Sandmeier et al., 1981; Tostein and Riandey, 1984). Второй - пять зон мономеров со сложным доминированием (Subba Rao et al., 1989), причем для эстераз от Естj до Ecni4 наблюдается моногенетическое наследование, тогда как Ест5 контролируется пятью независимыми локусами с дуплицированной генной активностью. Нулевые аллели определены для всех локусов. Ecmj, Естпз и Ест4 образуют одну группу сцепления. Хотя Естj была также включена в эту группу, до сих пор остается невыясненным, какой из её трех генов ассоциирован с этим блоком сцепления. Ест; представляет собой довольно сложную систему и возможно требует отношения, как к локусу количественного признака (QTL).

Хорошо изучена система малатдегидрогеназы (МДГ) (Tostain and Riandey, 1985). Показано, что этот фермент контролируется четырьмя структурными генами (A,B,CJD). Один из них {МДГ-D) кодирует катодные фракции, в то время, как остальные три - анодные фракции фермента. Малатдегидрогеназа -А и -В локализована в митохондриях, а МДГ-С - в цитоплазме и экстрагируется только в кислой среде при рН = 2.1.

Ряд работ по анализу изоферментов посвящен изучению устойчивости жемчужного проса к заболеванию ЛМР. Гупта (Gupta et ah, 1980), изучая пероксидазуи эстеразу, обнаружил восемь генотипов по этим локусам, при которых растения жемчужного проса отличались по степени устойчивости к ЛМР. Было обнаружено,, что подверженность к заражению и устойчивость определяется характером генотипа, количественными и качественными отличиями пероксидазы и эстеразы. Устойчивый генотип показывал большее число зон активности пероксидазы с низкой электрофоретической подвижностью и/или меньшим молекулярным весом эстераз.

Кумар (Kumar et al., 1987) установил связь степени резистенции ЛМР с присутствием или отсутствием катодной зоны С2- и анодной зоны А2- пероксидазы. Чахал с сотрудниками (Chahal et al., 1988) предположили вовлеченность трех зон пероксидазной активности в механизм устойчивости, а присутствие трех изозимов -критерием для характеризации резистентности к ЛМР.

Таким образом, белковые маркеры, включая запасные белки, структурные белки и изоферменты, были среди первой группы молекулярных маркеров, используемых для изучения генного разнообразия и составления генетических карт сцепления. Однако, главными лимитирующими факторами их использования является то, что анализ возможен только для экспрессирующихся генов, тогда как большая часть генома (более 90%), относится к некодирующим зонам и не подвергается эволюционным изменениям. Кроме того, многие белки подвержены посттрансляционным изменениям и могут маскировать уровень полиморфизма. Поэтому, несмотря на значимость, и, в то же время, относительную дешевизну и кажущуюся простоту работы с белковыми маркерами, идет постепенный переход к ДНК-маркерам и ДНК-технологиям.

1.1.3.2. Методы анализа полиморфизма ДНКИзвестно, что полиморфизм ДНК возникает как в результате точковых мутаций, затрагивающих сайты узнавания для эндонуклеаз, так и при тех или иных ошибках репликации ДНК, результатом которых являются делеции или инсерции, приводящие к различиям в длинах гомологичных фрагментов ДНК. Эти фрагменты с точки зрения классического генетического анализа могут рассматриваться как множественные аллельные формы локусов.

Молекулярные маркеры - это маркеры на основе нейтральных сайтов изменчивости на уровне ДНК-последовательности. Под "нейтральностью" понимают7то, что, в отличие от морфологических маркеров, эта изменчивость не проявлявляет себя в фенотипе и может быть охарактеризована различием гомологичных генов по единичной нуклеотидной замене или фрагменту повторов ДНК.

Анонимные ДНК-маркеры, полученные при использовании широкого ряда технологий, сильно различаются степенью адекватности, достоверности (повторяемости в экспериментах), сложностью исполнения и природой полиморфизма, который они выявляют. В результате этих различий появились огромные возможности варьировать применение тех или иных видов маркеров и использовать их в различных целях. Несколько обзоров дают практически полную картину использования молекулярных маркеров для картирования и изучения полиморфизма геномов растений в настоящее время (Gale and Witcombe, 1992; Karp et al., 1997; Mohan et al., 1997).

Наличие широкого спектра рестрицирующих эндонуклеаз и достаточно простого метода клонирования ДНК, привели к обнаружению ДНК—полиморфизма, уровень которого оказался гораздо выше, чем для белковых маркеров. Это позволило разработать целый ряд ДНК-маркеров, использование которых основано на использовании молекулярной гибридизации и/или полимеразной цепной реакции (PCR).

1.13.2.1. Полиморфизм длин рестриктных фрагментов ДНК (RFLP-маркеры)Эта техника маркирования основана на ДНК-гибридизации, с использованием библиотеки клонированных фрагментов ДНК. Основные этапы заключаются в выделении ДНК из различных тканей, гидролизе ее рестрицирующими ферментами, разделении полученных фрагментов в агарозном геле путем электрофореза, переносе фрагментов на мембранный фильтр, определении индивидуальных рестриктных фрагментов путем гибридизации с известной пробой из библиотеки клонов и, наконец, сканировании фрагментов путем авторадиографии.

Подобно белковым маркерам, большинство RFLP-маркеров ко-доминантны.

Использование RFLP-маркеров основано на полиморфизме ДНК, возникающего в?результате ряда различных мутационных процессов, ведущих к замене отдельных нуклеотидов путем делений, инверсий, и/или транспозиций или ошибкок репликации ДНК. Кроме того, некоторые эндонуклеазы неспособны расщеплять ДНК, если последовательность узнавания содержит один или несколько метилированных цитозиновых остатков, что позволяет использовать RFLP-маркеры в случае наличия вариации в характере метилирования.RFLP-метод определения ДНК-полиморфизма достаточно груб, но надежен и результаты его сопоставимы между различными лабораториями. Лимитирующим моментом его использования являются трудоемкость, множество этапов, значительные количества исходной ДНК (50 - 200 мкг), причем высокополимерной и высокоочищенной.

1.13.2.2. Анализ полиморфизма ДНК с использованием полимеразной цепной реакции1.13.2.2.1. Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры)Эти маркеры, основанные на применении PCR, не требуют ни клонирования, ни секвенирования (Vos et al, 1995). Изменения в последовательности ДНК определяются также, как при RFLP-анализе, но степень полиморфизма гораздо выше. В AFLP-методе используется рестрицированная геномная ДНК в качестве основы для PCR-реакции с праймером, который имеет длинную фиксированную часть (15 нуклеотидов) и короткий фрагмент (2—4 нуклеотида). Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую повторяемость, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигиро ванных фрагментов, которые могут быть амплифицированны. Продукты амплификации разделяют электрофоретически в акриламидном геле. В основном, с каждой парой праймеров амплифицируются 75 — 150 фрагментов. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт,величина генома, анализируемая одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа ДНК. С одного геля, обычно, удается получить до 40 полиморфных локусов. Полиморфизм определяется, как присутствие/отсутствие полосы на фореграмме (эта интерпретация обычна для доминантного типа наследования). AFLP-маркеры часто наследуются, как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров.AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования картофеля (van Eck et al., 1995; Meksem et al, 1995), томатов (Thomas et al., 1995), a также при изучении популяционного полиморфизма и построения дендрограмм для таких видов как рис (Parsons et al., 1997; Aggarwal et al., 1999), картофель (Milbourne et al., 1997), различных видов травянистых (Devos and Gale, 1997; Zhang et al., 1999) и хвойных Pinus taeda (Remingthon et al, 1999).

1.1.3.2.2.2. Полиморфизм случайно амплифицнрованных фрагментов ДНК (RAPD-маркеры)Этот PCR-основанный маркер не требует клонирования и секвенирования ДНК. Для проведения реакции используют один короткий праймер (8-12 нуклеотидов) случайной последовательности с определенным соотношением ГЦ-пар (60%). Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках инвертированных повторов. Если эти сайты находятся на расстоянии 2000-5000 пар нуклеотидов друг от друга, то при амплификации образуется дискретный ДНК-продукт, причем величина его варьирует от 100 пар нуклеотидов до более чем 2000 пар нуклеотидов. Эти фрагменты представляют собой анонимную последовательность ДНК. заключенную между двумя другими инвертиртированными повторами. Различия в паттерне фрагментов детерминируются отличиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте. О полиморфизме судят по присутствию/отсутствию полосы в каждом паттерне при электрофоретическом разделении. Большинство RAPD-маркеров проявляют доминантный тип наследования (Williams et al., 1990).RAPD-анализ используется для изучения полиморфизма различных растений и животных. Некоторые RAPD-маркеры были ассоциированы с генами резистентности к различным болезням (Yoshimura et al., 1995; Naqvi et al., 1995). Хотя считается, что это легкий и быстрый метод обнаружения полиморфизма, есть большие проблемы в воспроизводимости и надежности данных из-за высокой чувствительности к условиям реакции (концентрации магния, концентрации и соотношению праймер-матрица).

1.13.2.2.3. Амплификационное фингерпринтирование ДИК (DAF-маркеры)Модификация RAPD-технюси, где один или более нуклеотидных праймеров используются для получения относительно сложных паттернов. Продукты амплификации разделяются электрофоретически и визуализируются после окрашиванием серебром. Гидролиз нативной ДНК с одной - тремя рестриктазами повышает уровень амплификационного полиморфизма ДНК, позволяя улавливать различия даже между изогенными линиями.

1.13.2.2.4. Амплификация районов ДНК с известной последовательностью (SCAR-маркеры)Это PCR-основанные вторичные маркеры, определяемые с двумя 24-нуклеотидными праймерами, гомологичнымими секвенированным концам ДНК фрагмента, идентифицированного как RAPD-маркер (Paran and Michelmore, 1993). Такие праймеры амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводства и могут напрямую использоваться для проверки библиотек. Многие маркеры ко-доминантны и их полиморфизм может быть увеличен путем гидролиза PCR-продукта рестриктазами.

1.13.2.2.5. Полиморфизм уникальных фрагментов ДНК с известной последовательностью (STS-маркеры)Эти PCR-основанные маркеры определяют один уникальный, определенный секвенированием район в геноме (Money et al., 1994). Для амплификации этих относительно коротких фрагментов используются праймеры длиной 18-20 парнуклеотидов. Обнаруживаемый уровень полиморфизма обычно ниже, чем при применении RFLP-метода, но его можно повысить добавлением этапа рестрикции PCR-продуктов для увеличения числа результирующих ДНК-фрагментов. Так как праймеры, используемые в этом подходе, длиннее, чем при RAPD-методе, и создаются на основе специфического сшсвенса амшшфицируемого фрагмента ДНК, STS-маркеры являются более надежными и широко применяются для картирования, селекции с помощью маркеров (MAS ) или для адекватной оценки полиморфизма.

1.1.3.2.2.6. Полиморфизм уникальных экспрессирукнцнхся фрагментов ДНК с известной последовательностью (EST-маркеры)Эти PCR-основанные маркеры аналогичны STS-маркерам, однако маркируют только экспрессирующиеся последовательности, и требуют предварительной информации по клонированию и секвенированию генов. В анализе используются праймеры длиной 18 -20 пар оснований, которые обеспечивают амплификацию уникальных последовательностей генов. Полиморфизм наблюдается в длинах продуктов амплификации. Это дорогостоящая технология, однако предпочитаема для картирования и обнаружения генов, сцепленных с QTL.

1.1.3.2.2.7. Полиморфизм рестрикционных фрагментов амплифицированной ДНК (CAPS-маркеры)Это, так называемые, вторичные маркеры, определяются с двумя олигонуклеотидными праймерами, синтезированными на основе известного сиквенса ДНК. Они специфически амплифицируют единичные фрагменты ДНК. Однако, полиморфизм обнаруживается при расщеплении амплифицированных фрагментов ДНК с несколькими рестриктазами.

1.13.2.2.8. Полиморфизм повторов простых последовательностей ДНК (Микросателлитные маркеры - ЯЯИ (простые повторы), 8ТК (короткие тандемные повторы), УШИ (варьирующее число тандемных повторов) ,Эти маркеры, базирующиеся на РСИ-амплификации, требуют значительных материальных затрат, однако высоко полиморфны и не требуют большого количества времени, вследствие чего используются для картирования и селекции с помощью маркеров (МАБ).

Известно, что существенная часть генома эукариот состоит из более или менее протяженных повторов - мини- и микросателлитов, транспозонов, псевдогенов и др. Микросателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся ди-, три-, тетра- и пентануклеотиды. Общей особенностью растительных геномов является преобладание АТ-повторов, таких как (А)л, (АТ)я или (ГА)п, где число п колеблется в пределах между 10 и 80. Важной особенностью микросателлитов является то, что они, подвергаясь мутациям, эволюционируют быстрее, чем остальная ДНК. В результате появляются аллели с различным количеством повторяющихся единиц и, как следствие, высокий уровень полиморфизма.

Эти маркеры состоят из коротких (2-5 пар нуклеотидов) высоко повторяющихся последовательностей и фланкируются уникальными ДНК последовательностями, определенными в результате сиквенса прилегающего участка генома. Повторы используются, как проба для геномной или кДНК библиотек для идентификации клонов, в которых они присутствуют. Эти клоны, затем, секвенируют по концам, фланкирующим район повторяемости, к ним создают праймеры, предназначенные для определения амплифицированной уникальной ДНК единичного локуса и выявляют гипервариабельный участок генома. Полиморфизм обычно вызван различиями в длине амплифицированных продуктов. Для маркирования доступны многожественные аллели большого числа локусов. Однако, при использовании праймеров, возможно получить множественный (3 — 15 нуклеотидов) маркер, ассоциированный с продуктами, амшшфицированными в множестве различных участков.

Первые симптомы заболевания появляются на 15 - 20 дневных растениях. Зараженность растения определяется бледными и хлоротичными листьями, а также белым мучнистым налетом, покрывающим внутреннюю поверхность листа (Рис. 5). Гриб лучше растет в ночное время и дождливые дни. Листья растения становятся морщинистыми и разделяются на волокна. Такие листья преждевременно становятся коричневыми и отмирают (Рис. 6). Основной стебель остается чувствительным к заболеванию до 26 дней со времени прорастания, а дифференцирующиеся побеги второго, третьего и четвертого порядков остаются чувствительными в течение всего периода роста. Таким образом, культура остается восприимчивой к ЛМР в течение всего периода роста из-за появления новых побегов, однако из-за этого же некоторые побеги остаются короткими, с редуцированными и искаженными листьями. Инфицированные растения остаются карликами из-за укороченных междоузлий и избыточного числа побегов. На второй стадии болезни вместо нормальных початков образуются характерные "зеленые головы", состоящие из маленьких скрученных листоподобных структур, из-за чего эту болезнь часто называют "зеленой щеткой".

Рисунок 5 (слева). Мучнистый налет, обнаруживаемый на 15-20 дневных растениях жемчужного проса и свидетельствующий о заражении ложной мучнистой росойРисунок 6 (справа). Взрослое растение жемчужного проса, в сильной степени пораженное ложной мучнистой росой, на поздних стадиях развития заболевания1.13.2.2.9. Полиморфизм одноценочечной ДНК (SSC Р-маркеры)нЭта техника основана на анализе отдельных цепей PCR-продуктов после их денатурации и разделении в денатурирующих условиях. Наличие замен в последовательностях комплементарных цепей приводит к изменению их электрофоретической подвижности и позволяет фиксировать такие изменения. Метод может использоваться только для относительно коротких фрагментов ДНК. С его помощью можно идентифицировать гетерозиготы ДНК-фрагментов по молекулярному весу и определять изменения в нуклеотидной последовательности. Этот метод используется в диагностике врожденных заболеваний у человека. Также предполагается его широкое использование его и для растительных культур.

В настоящее время опубликовано значительное количество работ по применению различных техник определения молекулярных маркеров в самых широких областях генетики и биотехнологии. Эти данные могут стать незаменимыми как в селекционном отборе родительских пар, так и в оценке уровня генетического разнообразия. В данном обзоре упоминаются лишь некоторые из них, касающиеся изучения растительных объектов, таких, как чай (Melaleuca alternifolia (L.)) (Rosseto et al., 1998), пшеница (Mingeot and Jacquemin, 1999; Paull et al., 1998), ячмень (Komatsuda et al., 1998), картофель (Bineli and Bucci, 1994), хвойные (Plomion et al., 1999). Также следует упомянуть обзор по более чем 12 видам растительных форм (Moham et al,1997).

1.1.3.3. Использование полиморфизма ДНК в анализе генетического разнообразия жемчужного просаИспользование ДНК-маркеров в исследованиях жемчужного проса началось с применения RAPD- и RFLP-методов в работах по изучению центров происхождения этой культуры и в мониторинге генов, тесно сцепленных с количественными и качественными хозяйственно-важными признаками (Gepts and Clegg, 1989).

В настоящее время наметались две основные области использования молекулярных маркеров в исследовании жемчужного проса - это изучение генетического разнообразия и картирование локусов количественных признаков, контролирующих экономически важные свойства и имеющих в своем фенотипическом проявлении большую компоненту генотип-среда.

Первые работы с использованием RPLP-техники для создания генетической карты сцепления жемчужного проса были опубликованы Лиу (Liu et al., 1992, 1994). Работа была выполнена с применением меченных дезоксинуклеотдтрифосфатов для визуализации различий. Позже, помимо RFLP-маркеров, в карту были включены некоторые изозимные локусы и несколько гетерологичных проб риса, ячменя и маиса. Таким образом, было картированно более 180 локусов и определено 7 групп сцепления, что соответствует гаплоидному набору жемчужного проса. Общая длина карты составила 350 сМ, а гипотетически более 400 сМ, с межлокусной дистанцией около 2 сМ. Впервые, эти данные были использованы для картирования QTL, ответственных за устойчивость к ложной мучнистой росе (Jones, 1994; Jones et al., 1995). В исследовании Джонс, результаты тестирования поколения F2, полученного от скрещивания резистентного и чувствительного к ЛМР сортов, на устойчивость к заболеванию были положены в основу определения локусов количественных признаков (QTL), контролирующих устойчивость к ЛМР. Было обнаружено четыре основных QTL. Два из них были эффективны против популяций патогена, происходящих из стран Африканского континента (Нигерии и Нигера), и были локализованны в группе сцепления 4 (LG4), один - эффективный против патогена из Индии был картирован в первой группе сцепления (LG1) и еще один -контролирующий устойчивость к патогену из Сенегала, во второй группе сцепления (LG2).

В дальнейшем, первоначальная карта генетического сцепления была трансформирована с учетом ряда пол-специфичных рекомбинаций в скрещивании двух культурных форм и дикой с культурной (Busso et al., 1995, Liu et al., 1996). Окончательная, на данном этапе, версия генетической карты для жемчужного проса включает широкий спектр различных типов молекулярных маркеров, как специфичных для жемчужного проса, так и заимствованных из других растительныхРисунок 7. Структуры, образуемые вместо початков в результате поражения жемчужного проса ложной мучнистой росой30 мин. (Singh and Gopinath, 1990). Зооспоры прорастают в области корней растения-хозяина и инфицируют его через корневой чехлик и мутовки. Корневая инфекция происходит через корневые волоски и клетки эпиблемы в зоне роста. Считалось,что спорангии играют незначительную роль во вторичном заражении, хотя они продуцируются в миллионных количествах. Также отмечалось, что спорангии не способны перемещаться на большие расстояния. Однако, оказано, что спорангии остаются переносчиками инфекции на расстояние до 300 м по ветру во время дождливого сезона и на расстояние более 80 м во время сухого сезона. Это еще раз показывает определенную роль спорангиев в распространении вторичной инфекции и определенную роль в эпидемиологии JIMP.

Ооспоры формируются внутри тканей растения-хозяина, главным образом, в листьях, попадают на землю и остаются способными к первоначальному заражению. Ооспоры могут быть перенесены на семена во время снятия урожая и молотьбы. Ооспоры имеют округлую форму и толстую стенку из трех слоев и при прорастании дают от одной до четырех проростковых трубок.видов, и составляет примерно 600 сМ. Эта карта позволила улучшить понимание сложных взаимосвязей между геномами жемчужного проса и другими злаковыми (Devos and Gale, 1997; Devos et al., 2000).

В настоящее время проводятся исследования по разработке набора STS-маркеров, основанных на PCR-реакдии, с ко-доминантным наследованием, которые могут быть использованы для генотипирования большого количества локусов внутри или между группами сцепления. Уже известны 50 STS-локусов и к ним синтезированны праймеры (Money et al., 1994).

1.2. Ложная мучнистая роса (JIMP)1.2.1. Характеристика заболеванияХотя известно более 111 болезней жемчужного проса, JIMP остается основной болезнью для большинства возделываемых культур проса в мире. В Индии впервые об этой болезни сообщили Батлер в 1907 г и Кул Ками в 1913 г. Болезнь не рассматривалась, как серьёзная, и не привлекала особого внимания до тех пор, пока урон урожая был велик только в областях плохо дренированных и низинных. С развитием агротехники и поиском высокоурожайных сортов жемчужного проса, JIMP стала главной болезнью проса в Индии и во всех просо-выращивающих областях мира. ЛМР является одной из основных болезней, влияющих на урожайность. Потери урожая жемчужного проса в мире достигают 20%, однако в регионах интенсивного выращивания этой культуры потери могут бьггь 30-40% и более. Это может быть связано с повторной культивацией единственного, генетически однородного сорта жемчужного проса в районе, где присутствует патоген ЛМР. Потери в таком районе могут достигать75% (Singh, 1994).

Первые симптомы заболевания появляются на 15 — 20 дневных растениях. Зараженность растения определяется бледными и хлоротичными листьями, а также белым мучнистым налетом, покрывающим внутреннюю поверхность листа (Рис. 5).

1.2.2. Патогенный организмОрганизм, вызывающий болезнь известную под названием JIMP или "зеленый початок", относится к виду оомицетов Sclerospora graminicolo (Sacc.) Schroet, является облигатным паразитом и поражает все виды тканей (Shaw, 1970). Жизненный цикл ЛМР включает как половую, так и бесполую стадии (Рис. 8). При половом цикле продуцируются ооспоры, которые, заражая почву или семена, являются источником первичной инфекции. В условиях поля, систематическая инфекция наблюдается через 6 дней после посева. Спорангии воздушным и водным путями вызывают вторичное заражение. Спорангиальное инфицирование лимитировано возрастом проростков, которые наиболее чувствительны от стадии прорастания до появления 1-2 листа (Singh and Williams, 1980).

1.3, Картирование локусов количественных признаков (QTL) у жемчужного просаИзвестно, что изменчивость в природе носит количественный характер. Различия между особями не составляют дискретные классы, а, как показано в ряде исследований, непрерывно варьируют между определенными значениями. Изменчивость признаков, определяемая несколькими локусами и влиянием окружающей среды, называют "количественной", полигенной, комплексной или мультифакторной, а индивидуальные локусы, влияющие на подобную изменчивость -локусами количественных признаков (QTL). Так как изменчивость проявляется у потомства, то очевидно существует генетическая компонента, определяемая изменчивостью ряда локусов.QTL (локус количественного признака) - это район локализации гена/генов, которые влияют на признак и измеряются по линейной количественной шкале. QTL идентифицируются статистическими процедурами и интегрируют генотипические и фенотипические данные. Основываясь на позиции маркера на карте сцепления, можно локализовать локус количественного признака на определенном участке хромосомы, согласно уровню статистической вероятности.

Картирование QTL стало реальным в последние 10 лет, преимущественно, благодаря развитию и применению техники молекулярного маркирования, так каквыявление сцепления локусов количественных признаков и молекулярных маркеров обеспечило новый и достоверный метод идентификации QTL.

Молекулярные маркеры сегрегируют, как единичные гены, и не подвержены влиянию внешних условий. При наличии полиморфных молекулярных маркеров и карты сцепления, картирование QTL становится вопросом формирования и оценки достаточно больших популяций растений и животных и применения адекватных статистических методов.

За последнее время был предложен ряд методов картирования и исследования QTL (Edwards et ah, 1987; Haley and Knott, 1992; Lander and Botstein, 1989; Jansen and Stam, 1994; Zeng, 1994). Основная стратегия - это определение основных уровней общей генетической изменчивости, которая вносит основной вклад в разнообразие признаков. Относительно растений, существует большая потребность в оценке QTL, контролирующих большинство важных агрономических признаков.

Развитие техники исследования молекулярно-генетических маркеров и использование их в QTL-анализе стали одним из главных подходов в изучении наследования сложных признаков (Edwards et aL, 1987; Paterson et al., 1988). Как только эти признаки определены и картированы, становится возможным использование селекции с помощью маркеров (MAS) для введения этих признаков в широкий спектр гибридных сортов. MAS может как уменьшить размеры селекционных популяций, так и сократить время, требуемое для создания гибридных сортов с заданными признаками и для постоянного процесса их скрининга на сохранение данных признаков.

1.3.1. Принцип анализа локусов количественных признаков (QTL)Хотя не существует фундаментальных различий между типами генов, регулирующих количественные и качественные признаки, метод генетического картирования используется для качественных (менделевских) факторов и не может быть сразу применен для количественных признаков, так как индивидуумы в потомстве не могут быть разделены на дискретные фенотипические классы.

Картирование - это размещение маркеров (генов, QTL) в порядок, выявляющий относительные расстояния между ними и определяющий группы,, сцепления на основе величины рекомбинации всех возможных пар маркеров. Известно, что для картирования необходимы условия сегрегации и рекомбинации, как основных генетических концепций.

Основная идея картирования QTL была известна более 30 лет назад со времени публикации работы Тодей (Thoday, 1961). Принцип состоял в том, что если генетические маркеры рассредоточены по всему геному изучаемого организма, то сегрегация этих маркеров может быть использована для оценки эффектов, сцепленных с QTL, при этом делая возможным картирование и характеристику отдельных QTL. Метод включает поиск ассоциаций между сегрегирующими молекулярными маркерами и изучаемым признаком в экспериментальной популяции, для определения сцепления между маркерами и QTL. Необходимым условием для выявления сцепления маркер-QTL и его картирования является наличие сегрегирующей популяции. В качестве такой популяции могут выступать экспериментальные поколения F2, генерации возвратных скрещиваний (ВС), наборы рекомбинантных имбредных линий (RIL), полученные из единственного семени F2 и близкие к гомозиготности после 5-6 поколений самоопыления, а также, серии двойных гаплоидных линий (DHL).

С практической и генетической точек зрения, эти популяции неэквивалентны. DHL и RIL, которые могут быть репродуцированы при помощи самоопыления, являются, так называемыми, "бессмертными" популяциями, и, поэтому, чрезвычайно полезны для накопления маркеров в течение времени. Эти линии могут быть сформированы в любое удобное для эксперимента время, с целью получения ДНК, измерения фенотипических количественных признаков и для завершения молекулярно-генетического картирования. Помимо этого, растения данных линий могут быть помещены в различные условия для анализа взаимодействия генотип-среда.DHL линии могут быть быстро получены (всего одна генерация), когда генотип способен к регенерации. Получение самоопыляемых RIL популяции, как наиболее подходящих для исследований такого рода, занимает более продолжительное время(5-6 поколений). Однако ни DHL, ни RIL не могут быть использованы для оценки эффекта доминирования, тогда как простое поколение F2 и потомки возвратных скрещиваний (быстро получаемые в течение 2 генераций) легко позволяют изучать данный эффект.

В случае картирования популяций F2, Р2-растения обычно используются для определения генотипа, a F4- семьи - для фенотипического скрининга интересующего количественного признака. Почти изогенные линии (NIL) используются для тонкого картирования и изучения специфических QTL эффектов. Рекомбинантные имбредные линии (RIL) и двойные гаплоидные линии (DHL) позволяют проследить эволюцию фенотипа и используются для картирования признаков, которые трудно измерить.

1.3.2. Методы анализа и картирования QTL1.3.2.1. Анализ отдельного маркера или точковый анализТрадиционный метод определения QTL в непосредственной близости от маркера прибегает к помощи отдельного генетического маркера. Следуя методике, сравниваются фенотипические средние для каждого сегрегирующего класса в поколении. Различия между двумя средними дают оценку фенотипического эффекта, добавляя аллель в районе QTL. Для определения, отличается ли этот фенотипический эффект от нуля, применяются простые статистические тесты такие как t-критерий или F-тест. Определенная величина показывает, локализован ли QTL поблизости от маркера или нет. Метод отдельного генетического маркера не требует сложных карт молекулярного сцепления. Чем дальше QTL расположен от маркера, тем меньше вероятность, что он будет определен статистически, вследствие возможного кроссинговера между маркером и геном.

Самый простой случай картирования QTL - это изучение двух и#бредных линий. Посколько каждая линия гомозиготна по одному аллелю, то для маркера, отличающегося по разным линиям, возможны два аллельных состояния, из чего следует, что все особи будут гетерозиготны по этому локусу, и будут иметьодинаковую степень сцепления. Если QTL в F2 расположен на некотором расстоянииот маркера, то может иметь место рекомбинация. Это приводит к тому, что, вчзависимости от расстояния между маркером и QTL, наследуется аллельное состояние маркера в сцеплении с конкретным QTL. Чем больше расстояние между маркером и QTL, тем меньше вероятность наследования. Для QTL, значимо влияющего на признак, фенотшшческие различия разных генотипов маркеров будут тем меньше,чем больше расстояние между маркером и QTL. Если расстояние велико, то корреляция между маркером и QTL пропадает, а вместе с ней и фенотипические различия генотипов маркера. При близком расположении, влияние QTL аналогично влиянию удаленного QTL с существенным влиянием. Таким образом, вклад локусов количественного признака в расстояние до маркера и признак взаимосвязаны. На основе отдельного маркера возможно оценить суммарный эффект его влияния на признак и положение QTL и разделить оценки влияния и локализации QTL на основе распределения внутри класса маркеров. Расхождение маркера внутри одного генотипа будет тем сильнее,чем дальше QTL расположен от маркера, таким образом, ген, значительно влияющий на выраженность признака внутри класса маркеров, обеспечивает их ассиметричное распределение.

Необходимо отметить, что QTL объясняет лишь генетическую компоненту изменчивости, которая несет в себе лишь малую часть фенотипической изменчивости. Влияние средовых факторов вносит значительно больше изменчивости, чем генетические. Поэтому значения признака у особей с различными генотипами по разным маркерам могут значительно перекрываться.

1.3.2.2. Интервальное картирование методом максимального правдоподобияИнтервальное картирование QTL является наиболее общим методом анализа локусов количественных признаков. В 1993 г группой ученых (Lincoln et al., 1993) была разработана программа MapMaker/QTL, основной принцип которой заключался в тестировании гипотетических моделей, когда QTL присутствует во многих позициях между двумя маркерными локусами. Эта программа наиболее адекватна и ее преимущества определяются использованием метода максимального правдоподобия.

Метод максимального правдоподобия заключается в следующем: если предположить, что QTL расположен между двумя маркерами, то каждый двухлокусный маркерный генотип (т.е. ААВВ, ааВВ, ААвв, аавв для поколения двойной гаплоидной линии) будет содержать смесь QTL-генотшгов. Метод максимального правдоподобия включает поиск параметров QTL, которые предоставят наилучшее приближение для распределения количественного признака, наблюдаемого для каждого маркерного класса. Модели оцениваются посредством вычисления правдоподобия наблюдаемых распределений с или без учёта QTL эффекта. Позиция QTL на карте определяется, как максимум правдоподобия из распределения значений правдоподобия, т. е. подсчитывают десятичный логарифм (LOD - это отношение величины вероятности наблюдаемой при условии, что два гена сцеплены, к величине вероятности при отсутствии сцепления). Если значение LOD = 3, гены локализованы в одной хромосоме, причем наиболее тесное сцепление между генами соответствует максимальному значению LOD. При значениях LOD = 2 гены не сцеплены, т.е. локализованы в разных хромосомах.

13.23. Интервальное картирование посредством линейной регрессииИнтервальное картирование посредством линейной регрессии (Haley and Knott, 1992) первоначально было разработано, как упрощенный вариант метода максимального правдоподобия. В его основе лежит тот же самый метод основного QTL анализа (регрессия некодирующих маркерных генотипов) за тем исключением, что фенотипы регрессируют на QTL генотипы. Пока QTL генотипы неизвестны, они замещаются вероятностью, вычисленной по близлежащим фланкирующим маркерам. В большинстве случаев, картирование с использованием регресии дает оценки QTL-позиции и их эффекта почти идентичными со значениями, полученными методом максимального правдопообия. Приближение расходится только в случаях, когда имеются слишком большие промежутки или большая смесь генотипов.

13.2.4. Композитное интервальное картирование (СЕМ)Композитное интервальное картирование было предложено в 1994 г, как способ решения некоторых проблем интервального картирования (Jansen and Stam, 1994; Zeng, 1994), а именно, когда QTL находится в единственном месте локализации. СЩ дает более правдоподобную оценку и точность, чем простое интервальное картирование, поскольку включает эффекты сопряженной изменчивости других QTL.

В настоящее время имеются более 100 пакетов компьютерных программ для анализа генетического сцепления и QTL-картирования. Вот только некоторые, наиболее широко распространенные из них:- MapMaker/QTL (http://genome.wi.mlt.edu/pub/mapmaker3) - оригинальная программа для IBM, используется для анализа простых F2 и возвратных скрещиваний путем простого интервального картирования;- QTL Cartographer (http://statgen.mcsu.edu/qtlcart/cartographer.html) - пакет для картирования QTL, написан для UNIX, Macintosh, Windows. Работает с исппользованием всех типов анализа: на регрессии отдельного маркера, на интервальном и композитном интервальном картировании. Программа позволяет проводить исследования F2 и возвратно скрещиваемых популяций;- Qgene (Nelson, 1997) - программа для QTL картирования и селекционных программ с использованием маркеров. Программа имеет легкоиспользуемую графическую часть и дает выводы в графическом варианте. QTL картирование проводят либо путем одномаркерной регрессии, либо интервальной регрессией.

1.3.3. Сцепление между генетическими маркерами и QTLПосле открытия явления генетического сцепления, важным для генетического анализа в сельскохозяйственном производстве стало изучение многофакторной гипотезы наследования количественных признаков. Большинство характеристик сельскохозяйственной продуктивности (таких как, размер, форма, урожайность или качество) контролируется от многих генов. Эти признаки относятся кколичественным, они не выделяются в дискретные классы, и проявляют изменчивость фенотипов между родительскими фенотипами. Долгое время не было понятным почему менделевские дискретные факторы могли давать начало индивидумам, чьк фенотипы (рост, вес, урожайность и др.) были средними, по сравнению с таковыми у родителей. Эксперименты с бобами, пшеницей, табаком показали, что такая постоянная изменчивость фенотипов может быть объяснена посредством независимого действия многих дискретных факторов, где каждый фактор в отдельности имеет довольно малый эффект. Такие полигены назвали локусами количественных признаков QTL, предположительно мало отличающихся от генов, влияющих на просто наследуемые признаки, т.е. ожидалось, что они будут отвечать фундаментальным менделевским условиям сегрегации и рекомбинации, и таким образом возможно будет определить сцепление между генетическим маркером и QTL и определить локализацию индивидуального QTL.

Сцепление между генетическими маркерами и локусом количественного признака было впервые описано Саксом в 1923 году который показал ассоциации между окраской и размером. Связь маркеров с различными фенотипическими признаками была найдена на многих видах культурных растений (табак, томат, маис и др.). Позднее, связь отдельных изозимов и RFLP-маркеров со многими количественными признаками была продемонстрирована у томатов (Tanksley et al., 1982; Weiler et al., 1988; Martin et al., 1989), у маиса (Edwards et ah, 1987) и других видах.

С приходом генетических карт, включающих большое число маркеров, стало возможным локализовывать QTL, изучая маркеры на хромосомах. Тодей (Thoday, 1961) сказал, что "главное практическое ограничение для локализации QTL - это вероятность найти соответствующие маркеры".

Основная масса работ по картированию QTL с применением молекулярных маркеров посвящена изучению резистентности к различным видам болезней самых разных культур растений: пшеница (Robert et al1999; Keller et al., 1999), ячмень (Zhu et al., 1999; Мало et al, 1999; de la Репа et al., 1999), рис (Huang et al, 1997), рожь (Borner et al, 1999), маис (Welz et al, 1999; Agrama et al., 1999), бобы (Men et al., 1999), чечевица (Ferguson et al., 1998).QTL, ответственные за устойчивость к JIMP для жемчужного проса былиописаны Джонс (Jones et al., 1995; Jones, 1994). Были обнаружены QTL устойчивостинпротив патогенных популяций из Западной и Центральной Африки, Южной Азии, локализованные в "устойчивых" сортах Р 7-3-10 и ICMP 85410.Далее было показано независимое наследование устойчивости к патогенным популяциям ЛМР из Индии, Снегала, Нигера и Нигерии. При каждом скрининге выявляли QTL со большим эффектом, вносящих значительную долю изменчивости в реакцию заболеваемости для каждой из исследованных популяций. Были обнаружены также QTL с меньшим и меняющимся эффектом.Но не было найдено ни одного QTL, который был бы эффективным одновременно против всех изученных патогенных популяций, что поддерживало положение, что патотип-специфичность устойчивости является основным механизмом устойчивости к ЛМР для жемчужного проса. Для большинства QTL устойчивости наблюдается наследование от "устойчивого" родителя по доминантному или сверхдоминантному типу. Подобные результаты были получены при скринировании нескольких картированных популяций жемчужного проса, основанных на родительских линиях (ICMP 451, H 77 833-2, PRLT 2-89-33, Р 1449-2, РТ 732В). Таким образом, были идентифицированы несколько QTL с патоген-специфичной устойчивостью к JIMP. Большинство из них обладало доминантным или сверхдоминантным типом наследования, но ни один их них не проявлял полной устойчивости к тестируемым популяциям патогена.

Вторым по распространенности заболеванием жемчужного проса является ржавчина, чаще всего встречающаяся в США. Аналогичными, как для JIMP, методами были скринированы несколько популяций жемчужного проса и с помощью молекулярных технологий картированы гены устойчивости к ржавчине (Morgan et al., 1998; Wilson et al., 1993).

Таким образом, картирование и анализ QTL служат важными моментами для получения новой информации о действии и взаимодействии отдельных генов, помогают улучшить оценки эффективности скрещивания и, в конечном счете, являются основой для селекции при помощи маркеров (MAS), при которой наиболее эффективным способом осуществляется перенос желательных генов от одной линии к другой.

13.4. Селекция с помощью маркеров (MAS)7MAS является мощным инструментом селекционеров и характеризуется использованием маркеров, имеющих высокий индекс наследования, а также генетически связанных с участками генома, контролирующими интересующие признаки (Melchinger, 1990; Edwards, 1992). Эти маркеры могут быть разных типов: морфологическими, белковыми, включая изоферменты, ДНК-маркерами. MAS является не более, чем скринирующим методом, который может быть использован в составлении и анализе родословных, в возвратных скрещиваниях или других селекционных мероприятиях. Однако, MAS предоставляет отличную возможность уменьшить затраты времени, занимаемого тестированием. MAS и графические карты, базирующиеся на маркерах, могут помочь селекционерам в более быстром восстановлении рецессивного родителя в серии возвратных скрещиваний (Laude and Thompson, 1990; Hospital et al, 1992), а также в более эффективном определении искомых рекомбинантов в родословных программах. MAS может давать результаты даже при двух генерациях, если известны локализация и расстояния между маркерами (Hospital et al., 1992). Для реалистичной оценки MAS необходимо высокоточная и аккуратная локализация QTL, а также его достоверная оценка. Молекулярные маркеры, тесно сцепленные с экономически важными моногенными и полигенными признаками, имеют значительный потенциал для немедленного использования их в процессе улучшения культур. Однако, основная проблема состоит в том, что если маркер находится на значительном расстоянии от интересующего гена, то вероятен кроссинговер между маркером и геном.

Для использования MAS в усовершенствовании устойчивости жемчужного проса к J1MP необходимы следующие условия:1. Устойчивый донор с фиксированными маркерами к некоторым из его генов устойчивости,2.1.2. Сорт растения-хозяина, использованный для выращивания инокулюма7042(S) - чистолинейный, сестринский сорт от 7042(S)-1 и 7042(S>11. Этот сорт очень редко демонстрировал какую-либо устойчивость к JIMP во всех Международных Станциях по Тестированию Жемчужного Проса на Восприимчивость к ЛМР (DPMDMN), что позволило считать его универсально восприимчивым к JIMP.

Рисунок 9 (слева). Родительский сорт жемчужного проса W 504-1-1, использованный в качестве женской особи для создания экспериментальной популяции для картированияРисунок 10 (справа). Родительский сорт жемчужного проса Р 310-17-В, использованный в качестве мужской особи для создания экспериментальной популяции для картирования2. Элитный родитель с неадекватной устойчивостью, с отсутствием аллелей специфической устойчивости, сцепленных с марерами в геноме устойчивого донора,3. Эффективная система определения генотипа иле, по крайней мере, фенотипа в районе маркерных локусов в индивидуальных сарегантах.

При наличии всех этих условий MAS программа становится возможной. На сегодняшний день маркеры идентифицированы для №■ различных предполагаемых локусов устойчивости к ЛМР в жемчужном просе. (Jones, 1994; Jones et ah, 1995).

С тех пор, как MAS на устойчивость к ЛМР стала постоянно тестируемой, появились возможности размышлять о применении мошх генов устойчивости к ЛМР, которые ранее практически не употреблялись. Возможности включают пирамидные гены устойчивости в гибридах, базирующихся на родительских линиях, полученных из одного семени; гибриды, основанные нацитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) (родители которых - почти изогенные производные от односеменного родителя, в который были внесгяы гены устойчивости с использованием MAS и возвратных скрещиваний), а также тройные гибриды, основывающиеся на скрещивании гетерозиготы F] с шнией с ЦМС. Из всех трех новых типов гибридов, последние имеют наиболыже преимущества (Hash and Witcombe, 1996).

Таким образом, MAS предлагает селекционерам ключ для преодоления конфликтных комбинаций в некоторых условиях производства жемчужного проса для получения однородности сельскохозяйственных признаков и изменчивости по устойчивости к ЛМР. Если это внесет существенны! вклад в стабильно высокие урожаи зерна и соломы, то MAS станет обычным инструментом для использования селекционерами.

Таким образом, основываясь на рассмотренном выше материале, можно утверждать, что изучение особенностей биологии жемчужного проса, построение генетических карт сцепления и установления связей между количественными признаками и генотипом является актуальной проблемой. Стратегическое значение этой зерновой культуры, как основы пищевой безопасности в ряде беднейших регионов мира, становится очевидным фактором и требует самых современных подходов в решении селекционных задач.

Глава 2Материалы и методыМатериалы и методы описанные в этой главе относятся ко всем разделам данной работы. Любые модификации ранее опубликованных методик описаны в соответствующих разделах.

2.1. Использованные сорта растений-хозяевВсе сорта растений-хозяев были предоставлены Международным Институтом по Исследованию Культурных Растений Полу-Засушливых Тропиков (ICRISAT) Patancheru, Andhra Pradesh, 502 324, India.

Прежде всего, необходимо отметить, что термины "устойчивость" и "восприимчивость", использованные в данном исследовании, являются относительными. "Устойчивый" генотип не обязательно подразумевает 100%-ое отсутствие пораженных растений в опытных заражениях с одним (или всеми) вариантами патогена. "Восприимчивый" генотип также может не показать 100%-ого заражения в эксперименте.

2.1.1. Родительские сорта, использованные в скрещивании для картированияW 504-1-1 - чистолинейный сорт, "восприимчивый" к JIMP, имеющий семена белой окраски и базирующийся на генофонде из Северной Индии (регион Дели) был любезно предоставлен для исследований Dr. O.P. Govila (Отдел Генетики Всеиндийского Сельскохозяйственного Института, Нью-Дели, 110 012, Индия), (Sheoran and Govila, 1996) (Рис. 9).

Р 310-17-В - чистолинейный, "устойчивый" к JIMP сорт, полученный из генофонда, первоначально происходящего из Мали (Западная Африка) (Рис. 10).использованы в качестве зондов после мечения с "P-a-dATP (Feinberg and Vogelstein, 1983).

2.5. Тестирование на устойчивость к JIMPТестирование на устойчивость к различным популяциям патогена JIMP проводились в контролируемых условиях теплицы Университета Уэльса (Бангор, Великобритания) под руководством Dr. W.A. Breese и в ICRISAT под руководством Dr. R.P.Thakur.

Стандартная процедура тестирования показана на Рис. 13. Популяции патогена поддерживали на воспримчивом сорте жемчужного проса 7042(S). Инфицированные листья с 2-х месячных растений собирали, тщательно очищали и помещали в пластиковые ёмкости с влажной фильтровальной бумагой на 6-8 часов для инкубации. По истечении времени инкубации из свежевырагценных спорангиев готовили водную суспензию, которой опрыскивали растения F4, находящиеся к этому моменту на стадии колеоптиля или одного листа. После инокуляции, сосуды с растениями помещали под пленку на 16 часов, для поддержания относительной влажности в районе 100% и для создания благоприятных условий для развития инфекции. По истечении срока инкубации пленку удаляли и сосуды с сеянцами переносили в стандартные условия теплицы, которые были описаны ранее. Данные по заражению собирали двумя неделями позже и оценивали, как процент сеянцев, на которых были обнаружены симптомы заболевания, от их общего числа на момент инокуляции.

Все экспериментальные данные по тестам на устойчивость изучаемой популяции к JIMP были получены и любезно предоставлены для анализа Dr. W.A. Breese (для Африканских популяций патогена и ICRISAT из Индии) и Dr. R.P.Thakur (для всех Индийских патогенных популяций, кроме ICRISAT). Более детально процедуры тестирования на устойчивость описаны в Jones (1994) и Jones et al. (2001) (в печати).

2.6. RFLP-анализ (получение данных генотипирования)RFLP-анализ представляет собой ряд последовательных операций, включающий подготовку и сбор растительного материала, выделение суммарной ДНК, расщепление ДНК при помощи эндонуклеаз и последующее разделение ДНК-фрагментов в агарозном геле, перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры и их последующая гибридизация со специфическими ДНК-зондами (Рис. 14). Все эти этапы подробно описаны в данном разделе.

Для более длительного хранения необходима процедура лиофилизации растительных образцов.

2.6.1.1. Два альтернативных способа подготовки листового материала жемчужного проса для выделения ДНК

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Колесникова, Мария Александровна

Выводы 7

1. С использованием молекулярных маркеров построена новая генетическая карта сцепления на основе гибридной комбинации 504-1-1 х Р 310-17-В. Общая длина карты превышает длину имеющейся основной карты жемчужного проса и составляет 421 сМ. Порядок расположения Ш^ЪР маркеров сохранился прежним, что являетвя, вероятно, типичным для вида РептзеШт glaucum (Т.) И.Вг.

2. Установлено, что молекулярные маркеры в группах сцепления 1Х}1, \Хз2, 1ХгЗ, Ьй4 и Ылб демонстрируют статистически значимые отклонения от теоретически ожидаемой сегрегации. Это, вероятно, свидетельствует об их сцепленности с генами, препятствующими нормальному развитию растений жемчужного проса

3. Создана скелетная генетическая карта сцепления с уменьшенным набором маркерных локусов для уравнивания расстояний между маркерами

4. На основе созданной скелетной генетической карты сцепления были картированны 13 новых локусов количественных признаков, ответственных за устойчивость к ложной мучнистой росе у жемчужного проса

5. Локализованы два локуса количественных признаков (в интервалах М52-М347 и М464-М648) в первой и четвертой группах сцепления соответственно, контролирующие устойчивость жемчужного проса к широкому спектру популяций патогена как Азиатского, так и Африканского происхождения

Однако, несмотря на многочисленные предположения о хозяин-специфической природе различных популяций патогена, Джонс, опираясь на результаты своего исследования (Jones, 1994), предположила, что такие выводы могут быть предварительными. В своей работе Джонс обнаружила, что на генетических картах сцепления, полученных при исследовании популяций патогена из Сенегала (Doffane/Dimbetaba) и Индии (ICRISAT) существовало несколько QTL малых размеров, эффективных против обеих популяций. Однако, из-за недостаточного объема выборки популяций патогена в исследовании, результаты сравнения данных тестирования на устойчивость и выводы, сделанные по ним, могли считаться только предварительными. В то время, как результаты большинства тестов приводят нас к заключению, что растение-хозяин и патоген ко-эволюционировали в географически разделенных районах, что привело к четким различиям между популяциями патогена, данные настоящего исследования и работы Джонс (Jones, 1994) противоречат этому мнению. Например, родительские сорта исследуемого скрещивания происходили из разных стран: W 504-1-1 - из северной Индии, и Р 310-17-В - из Мали (Западная Африка). В тестах с семью из девяти разных популяций патогена был обнаружен один QTL, который отличался эффективностью как против индийских, так и против африканских изолятов. Этот QTL располагался в интервале между маркерными локусами Xpsm464 и Xpsm(A% в группе сцепления 4 (LG4) и привносил устойчивость к ложной мучнистой росе в тестах с гремя индийскими популяциями патогена (ICRISAT, Durgapura и МНВ 110) и со всеми четырьмя африканскими изолятами. Согласно результатам моделирования отдельных QTL, данный локус количественного признака вносил наибольший вклад в устойчивость ко всем исследованным популяциям патогена. В разных тестах величина объясняемой данным QTL фенотипической изменчивости исследуемого признака варьировала от 16.3% до 76.9% (Таблица 5), ставя этот QTL в разряд наибольших (наряду с QTL в группе сцепления 3 (LG3), эффективным к индийским изолятам патогена) для каждой популяции патогена. Индивидуальный анализ данных отдельных тестов показал наследование данного QTL от материнской родительской формы W 504-11 и присущее ему сверх-доминирование во всех тестах. Все вышеописанные наблюдения позволили сделать заключение о широком спектре устойчивости данного QTL против большинства популяций патогена из географически различных районов, тестированных в настоящем исследовании.

Сходный вывод может быть сделан относительно QTL, идентифицированного в группе сцепления 1 (LG1) между маркерными локусами 7

Xpsm52 и XpsnßAl. Величина объясненной этим QTL изменчивости в моделях с единственным QTL отличалась малой степенью варьирования, по сравнению с предыдущим QTL в LG4, и находилась в пределах от 52.8% до 66.7%. Индивидуальный анализ определил наследование этого QTL от отцовской родительской особи Р 310-17-В с эффектом сверх-доминирования.

В анализе модели множественных QTL эти два локуса в группах сцепления LG1 and LG4 проявили наибольший вклад в устойчивость к патогенным популяциям различного происхождения. Таким образом, эта пара QTL устойчивости может быть рекомендована, как наиболее перспективная в создании новых сортов жемчужного проса с повышенной устойчивостью к ложной мучнистой росе.

На основании сравнения данных настоящего экспериментального исследования и роботы Джонс (Jones, 1994)), можно сделать два заключения. Во-первых, учитывая, что популяции патогена из разных районов локализации, как правило, четко различаются, популяционная структура, несомненно, может быть очень гибкой за счет адаптивной природы S. graminicola, которая является причиной высокой генетической вариабельности , которая, в свою очередь способствует быстрому приспособлению патогена к изменяющимся условиям среды. Во-вторых, сочетание двух родительских сортов из разных районов происхождения в одном скрещивании приведет к объединению QTL, эффективных против популяций патогена из этих районов в потомках данного скрещивания, и высокоустойчивые гибриды от такого скрещивания могут с успехом возделываться в обоих регионах. Разумеется, вопрос о возможности создания подобных гибридов, их практической значимости или резонности самой цели их создания, открыт для дискуссии. Однако это ни в какой степени не препятствует созданию гибридных сортов жемчужного проса с необходимой повышенной устойчивостью.

Результаты анализа интервального картирования выявили существование более одного QTL устойчивости к популяциям патогена ICRISAT (в группах сцепления LGI и LG4), Duigapura (LG4), Sadore (LG4) и Nguru (LG4). Если множественные пики QTL не были ложными, то концентрация QTL в пределах этих групп сцепления может быть результатом тандемной дупликации.

Исследователи предположили, что тандемная дупликация, транслокация и внутри-аллельная рекомбинация являются основными составляющими эволюции множественных генов устойчивости у растений (Crute, 1992). Сцепление7 и аллелизм, наблюдаемые для устойчивости к ложной мучнистой росе у жемчужного проса, часто наблюдаются и в других системах «хозяин - патоген». Например, ряд генов устойчивости к ложной мучнистой росе у салата-латука картированы в группе сцепления LG1 (Crute, 1992), у кукурузы гены устойчивости к ржавчине картированы в коротком плече LG10 (Hooker, 1985), а у ячменя гены устойчивости к настоящей мучнистой росе картированы в хромосоме 5 (Jorgensen, 1992). Tanksley и Rick (1980) обнаружили свидетельства тандемной дупликации у томатов и предположили, что диплоидные высшие растения используют тандемную дупликацию, в отсутствии естественной плоидности, для увеличения размера генома.

Наследование многих локусов устойчивости растений-хозяев носят различный характер. Большинство предыдущих исследований по генетике устойчивости к ложной мучнистой росе жемчужного проса показали, что доминантность является важной составляющей устойчивости (Appadurai et al, 1975; Gill et al, 1978; Pethani et al, 1980; Basavaraju et al, 1981b; Shinde et al, 1984; Mehta и Dang, 1987). В нашем исследовании большинство локусов устойчивости к ложной мучнистой росе оказались сверхдоминантными. Сверхдоминантность была также обнаружена и в предыдущих исследованиях (Jones et al, 1995; Singh et al, 1978; Basavaraju et al, 1981b; Dass et al, 1984) и может объясняться буферными эффектами гетерозиготности. Однако, скорее всего, сверхдоминантность является не подлинной, а, скорее, видимой. Например, наряду со значительным уменьшением доминантности при получении фенотипических данных по семействам поколения F4, значительное осложнение было вызвано тем, что сегрегация многих маркерных аллелей была значительно искажена. Это означало, что умножение доминантного фактора на четыре для обеспечения сегрегации гетерозигот не являлось адекватным методом для установления характера наследования. Искаженная сегрегация F2 гетерозигот (Таблица 3), в результате которой в F4 доминантный аллель устойчивости был представлен в избытке, как в гомозиготах, так и гетерозиготах, приводила бы к явной сверхдоминантности устойчивости. Избыток аллеля устойчивости достаточно обычен, поскольку восприимчивые к заболеванию родительские сорта агрономически слабее устойчивых родительских сортов. В своей работе Jones (1994) сделала попьгпсу оценить доминантность, основываясь на предположении, что сегрегация маркерных генотипов в F2 поддерживалась на таком же уровне и в двух последующих поколениях. К сожалению, несмотря на эту установку, сверхдоминантность все еще наблюдалась во многих случаях, что могло быть вызвано дальнейшим искажением сегрегации маркеров при увеличивающемся инбридинге. Другое объяснение состоит в том, что в F3 и F4 поколених выявлялось нарушение пропорции фенотипических классов [за счет подавления инбридинга гомозигот, которые не выживали (в случае F3) или не прорастали (в случае F.*)]. Таким образом, умножение эффекта доминантности на 4 в F4 явно завышало уровень эффекта доминантности в поколении F2.

Видимая сверхдоминантность может быть, также, следствием сцепления RFLP маркерных локусов с более чем одним доминантным, или частично доминантным, локусами устойчивости, тесно сцепленных в положении отталкивания. Такие сцепленные QTL должны вносить вклад в разные пропорции изменчивости устойчивости, чтобы позволить определить исходное их сцепление с RFLP-маркером.

Характер наследования устойчивости к ложной мучнистой росе в некоторых случаях варьировал. Было обнаружено несколько частично доминантных и рецесивных локусов устойчивости. Один из рецессивных QTL с устойчивым наследованием был локус, определенный в группе сцепления LG3 против популяции патогена Kordofan, другие - против популяции патогена MBH 110 в LG4 и изолята патогена Sadore в LG7. В одной из ранних работ по изучению наследуемости устойчивости к ложной мучнистой росе у жемчужного проса также была обнаружена один рецессивный ген устойчивости (Singh et ah, 1978), а также найдены гены рецессивной устойчивости в других системах растительных патогенов (Day, 1974; De Wit, 1992).

Необходимо отметить, что для некоторых QTL локусов характер наследования устойчивости различался для различных популяций патогенов. Например, локусы устойчивости в LG3 против Kordofan изолята были ад дитивны или рецессивны, в то время, как характер QTL устойчивости, расположенных в тех же позициях для популяций патогенов из Индии, был сверхдоминантный или частично доминантный. Аналогичная ситуация наблюдалась в случае изолята патогена из Nguru (Нигерия), где устойчивость наследовалась от Р 310-17-В и была рецессивна (или, точнее, наблюдался гетерозис чувствительности), в то время как другие опыты показали доминантность или сверхдоминантность устойчивости от W 504-1-1, картированной в этой позиции в LG4. Первое логичное и наиболее возможное объяснение этого эффекта заключалось в том, что эти различия наблюдались между мнимыми и значимыми QTL .Оценка характера наследуемости, показанная для мнимых QTL ( Таблица 5) может быть иной для модели с одним QTL. Другая теория объясняет этот факт ошибкой в оценке QTL с небольшим эффектом, эффектами прочно сцепленных генов или разных аллелей в одном и том же локусе, а также межаллельным взаимодействием, влияющими на видимую наследуемость устойчивости (Jones, 1994).

При сравнении методов QTL картирования было показано, что, фактически, разницы в полученных QTL картах нет (Stuber et al., 1992; Paterson et al., 1988; Bubek et al, 1993; Pé et al., 1993).Это, вероятно, было следствием распределения данных для картирования таким образом, что оценки, полученные методом максимального сходства уменьшились до оценок, полученных методом наименьших квадратов Dudley (1993). В работе Jones (1994) было обнаружено четыре значительных различия между QTL картами, полученными с помощью MapMaker/QTL и с использованием анализа линейной регрессии. Было показано, что использование метода линейной регрессии лучше выявляет множественные сцепленные QTL и QTL с малыми эффектами. Отсюда был сделан вывод, что анализ с одним маркером лучше подходит для выявления QTL, вовлеченных во взаимодействия. Таким образом, для получения более совершенных QTL карт рекомендуется использовать несколько типов анализа картирования.

Пока еще рано делать предположения о специфичных типах взаимодействий, встречающихся в этой системе «хозяин-патоген», но, скорее всего, здесь имеет место взаимодействие по типу ген-на-ген, впервые описанному Flor (1942). Системы ген-на-ген характеризуются несовместимым фенотипом, наблюдаемым, когда доминантный хозяйский ген устойчивости сочетается с соответствующим доминантным геном авирулентности патогена. Гомозиготность по рецессивным чередующимся аллелям патогена или растения-хозяина влечет за собой реакцию совместимости и инвазии патогена в ткань растения хозяина. Однако, исходная гипотеза ген-на-ген была признана слишком упрощенной

Michelmore et al., 1988). В поздних исследованиях для различных систем хозяин -патоген были обнаружены неполная доминантность устойчивости и авирулентности, рецессивная устойчивость и гены-модификаторы, влияющие на взаимодействия хозяйского фенотипа (Llott et al., 1989). В случае ложной мучнистой росы салата (единственная система хозяин - патоген ложной мучнистой росы, которая была наиболее детально охарактеризована относительно ген-на-ген взаимодействий) гипотеза ген-на-ген выдержала жесткое тестирование, но все же были найдены исключения описаного выше типа (Michelmore et al., 1988). В данном обсуждении, хотя это и не обязательно тот случай, патоген-специфичная устойчивость была признана типичным случаем взаимодействия ген-на-ген с присутствием аллелей авирулентности в популяции патогена, что приводило к выявлению соответствующих доминантных или сверх-доминантных QTL устойчивости. Аллели вирулентности в гомозиготной форме не способны различать устойчивые и чувствительные родительские генотипы, что, таким образом, препятствует выявлению QTL устойчивости.

В рамках отдельных тестов, вклад индивидуальных QTL в степень устойчивости был различным. Величина изменчивости признака, объясненная конкретным QTL, могла быть пропорциональна значимости генов устойчивости в предотвращении или снижения восприимчивости растений-хозяев к конкретному патотипу, частоте соответствующих авирулентностей в популяции патогенов или обратно пропорциональна агрессивности индивидуальных изолятов. Например, QTL с большим эффектом может участвовать в узнавании специфического патотипа, в то время как, QTL с меньшим эфффектом может быть результатом генов-модификаторов, которые влияют на рост грибов и проявление симптомов заболевания. Все эти факторы могут быть значимы. Но поскольку генеративная фаза S. graminicola является важной частью его жизенного цикла и ооспоры, как правило, являются единственным способом вегетации, по всей видимости, существует большая вариабельность авирулентности внутри одной популяции патогена. В ранней работе Jones (1994) было сделано предположение, что фенотипическая изменчивость признака, обусловленная каждым из QTL, может быть пропорциональна частоте соответствующего гена авирулентности в популяции патогена. Однако, последующие сообщения Jones опровергли это предположение. Несмотря на это, необходимо отметить, что QTL с малым эффектом не должны игнорироваться селекционерами, поскольку они могут вносить вклад в увеличение пропорции устойчивости в присутствии популяций патогенов с высокой частотой соответствующих авирулентностей.

QTL картирование рассматривается как предварительный этап в определении QTL. Присутствие и эффект генов устойчивости должны быть подтверждены введением индивидуальных QTL в универсально чувствительный сорт путем возвратных скрещиваний. На этом генетическом фоне могут быть исследованы характер наследуемости генов устойчивости, их вклад в устойчивость в различных условиях окружающей среды, а также их специфическое фенотипическое проявление. Отдельные генотипы с единичными устойчивостями могут быть легко скрещены для более подробного выяснения межаллельных взаимодействий. В действительности, могут будут созданы почти изогенные линии (NIL), в которых гены устойчивости могут быть охарактеризованы относительно соответствующих генов авирулентности и использованы затем как различительные линии, для наблюдения за авирулентностью в популяциях патогенов. Такие NIL могут, также, использоваться в качестве хранилищ генов устойчивости, которые могут использоваться селекционерами.

Использование методов селекции, основанных на использовании молекулярных маркеров, является первостепенным в создании NIL. Наряду с возможностью точного переноса сегмента хромосомы устойчивого донора, маркеры, перекрывающие остальной геном, позволяют с уверенностью сказать об отсутствии любых других сегментов генома устойчивого донора, поскольку наличие таких сегментов, содержащих гены устойчивости, значительно помешало бы дальнейшим исследованиям (Zeven et ah, 1983).

Экспериментальные данные, полученные в настоящей работе, показали, что наследуемость устойчивости жемчужного проса к различным популяциям ложной мучнистой росы была достаточно высока. Несмотря на то, что селекция при помощи молекулярных маркеров (MAS) признана наиболее эффективной для селекции признаков с низким уровнем наследования (Paterson, 1991а), оценки сравнительной эффективности MAS и традиционной селекции основаны на числе поколений, необходимых для получения требуемого генотипа. Поэтому, даже для признаков с высокой степенью наследуемости, MAS может предоставить привлекательную альтернативу традиционной селекции. Дополнительное преимущество работы с признаком с высокой степенью наследуемости состоит в том, что он с меньшей вероятностью дает вариабельные эффекты на различных

•у генетических фонах и в различных условиях внешней среды (Gale и Witcombe, 1992).

Коммерческие семена жемчужного проса в настоящее время производятся как для перекрестно-опыляемых сортов, так и для гибридов первого поколения. MAS обеспечит значительный прогресс за счет внедрения устойчивости в элитные гибриды, которые зачастую более высокоурожайные, чем лучшие перекрестно-опыляемые сорта, но не отличаются долгосрочностью эффективности устойчивости к заболеваниям. Такие гибриды одного скрещивания, как правило, становятся вновь восприимчивыми к ложной мучнистой росе в течение пяти лет их широкого культивирования из-за их генетической однородности. В последние несколько лет были выведены более вариабельные гибриды, полученные в результате скрещивания инбредных линий с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) с генетически гетерогенной устойчивой популяцией-опылителем, которые давали больший урожай, однако оставались зависимыми от генетически однородных линий с ЦМС. Работа с линиями с ЦМС чрезвычайно сложна, в результате чего только небольшое число гибридов было запатентовано для широкого использования. Во время продолжительного использования таких гибридов любая устойчивость, включенная исходно, становится неэффективной. Это не только сокращает длительность устойчивости гибридов, но и значительно затрудняет производство посевного материала. С появлением новых успешно выведенных линий появляется необходимость в экономических целях продлить ее жизнь путем введения дополнительных устойчивостей (Gale и Witcombe, 1992). Наиболее эффективно это может быть осуществлено при помощи MAS и, по всей вероятности, именно в этой области результаты данной работы могут иметь наибольшее значение.

Наибольшее значение для селекционеров имеет продолжительность устойчивости. Как правило, она присуща полигенной или патотип-неспецифичной устойчивости (Johnson, 1984). Впервые, в настоящей работе был обнаружен ряд локусов устойчивости к ложной мучнистой росе, которые обладали широким спектром действия и являлись, вероятно, патотип-неспецифичными. Это может способствовать продолжительной устойчивости в ряду поколений, не позволяя патогену преодолеть барьер устойчивости. Для патотип-специ фичных локусов устойчивости, которые имеют тенденцию к снижению продолжительности устойчивости вследствие преодоления ее патогеном, могут быть применены стратегии скрещивания, которые предотвращают снижение эффективности этих локусов устойчивости, через пирамидирование, последовательно разблокируя гены устойчивости во времени, или, создавая сорта, которые генетически гетерогенны (Witcombe and Hash, 2000).

В процессе пирамидирования, несколько генов устойчивости включаются в одну линию с цитоплазматической мужской стерильностью и ее гибриды. Однако, использование определенных технологий возделывания проса в данном регионе приводит к тому, что в результате рекомбинации при ауткроссинге отдельные локусы устойчивости могут становится доступными для патогена, что в итоге может снизить длительность устойчивости. Кроме того, пирамидированные гены устойчивости могут привести к жесткой селекции сложных патотипов с множественной вирулентностью, которые не обязательно слабее изолятов с одной или несколькими вирулентностями. Отбор на множественную вирулентность наиболее эффективен в тех случаях, когда патоген является облигатным биотрофом, может размножаться половым путем и когда болезнь быстро распространяется переносимыми по воздуху спорами (Day, 1974). S. graminicola обладает всеми тремя характеристиками. Кроме того, в ранних исследованиях была показана быстрая селекция на хозяин-специфичную вирулентность в гетерогенной полевой популяции (Thakur et ah, 1992). В результате этого, пирамидированные гены устойчивости могут оказаться нестабильными в такой хозяин-специфичной системе и могут стимулировать появление сложных патотипов, против которых необходим будет поиск новых локусов устойчивости.

Альтернативой пирамидированию генов является последовательное разблокирование генов устойчивости. Однако, для жемчужного проса такой подход невозможен из-за особенностей возделывания этой культуры в данном регионе.

Наиболее многообещающая возможность - это получение генотипов, гетерогенных по генам устойчивости, и, таким образом имитирующих долгосрочную устойчивость к болезням перекрестно-опыляемых растений. Это будут гибридные эквиваленты набора сортов, которые успешно противостояли ржавчине овса, истинной мучнистой росе ячменя и желтой ржавчине пшеницы

Wolfe, 1985). Поставленная цель может быть достигнута путем использования метода обратного скрещивания для получения набора поддерживающих линий, отличающихся одним геном устойчивости, для сортов с ЦМС, и позоволяя этим линиям рекомбинировать в процессе получения семян гибридов. Отбор комбинаций вирулентности может затем происходить медленнее, поскольку они не первостепенны для заражения отдельных растений-хозяев. Если гибриды предполагается выращивать в разных странах, возможно включение в линии устойчивости к популяциям патогенов из каждой страны или универсальные устойчивости, эфективные против широкого спектра патотипов из разных стран, используя метод возвратных скрещиваний.

Как только выбрана наиболее подходящая стратегия скрещивания, встает необходимость выявления наиболее эффективных средств переноса локусов устойчивости на необходимый генетический фон. Метод обратных скрещиваний является наиболее подходящим для переноса генов устойчивости в сортовую или гибридную родительскую линию, которая вовлечена в процесс улучшения. Маркеры могут способствовать этому процессу посредством селекции гена или генов устойчивости, снижая величину донорного сегмента, вносимого с каждым интрогрессированным геном устойчивости или путем селекции реципиентных родительских аллелей в хромосомах, не связанных с устойчивостью.

Компьютерное моделирование выявило, что с использованием MAS, реципиентные родители мотут быть реконструированы в течение трех поколений, по сравнению с шестью при использовании традиционных обратных скрещиваний. Кроме этих очевидных преимуществ, было также показано, что с использованием MAS, снижение сопряженного переноса донорной ДНК, окружающей интересующий ген, до 2 сМ, требует только двух поколений по сравнению со 100 поколениями при использовании традиционных методов скрещивания (Young и Tanksley, 1989b).

Эти впечатляющие открытия показали, что маркеры будут вносить большой вклад, если будут использоваться для отбора донорного гена устойчивости и против фланкирующей донорной ДНК. Несколько маркеров необходимы для селекции реципиентного генома в не-переносящих хромосомах. В компьютерной имитации Hospital et al. (1992) установили, что увеличение плотности маркеров выше 3 на 100 сМ дает незначительное увеличение эффективности селекции реципиентного родителя. Там, где ресурсы MAS ограничены, фенотипическая селекция реципиентных родителей, при селекции донорного гена с использованием MAS, как правило, дает удовлетворительные результаты. 1

Преимущества MAS были показаны в работе Young и Tanksley (1989b), где измерялся размер сегментов донорной ДНК, фланкирующих ген устойчивости к табачной мозаике, который был интрогрессирован в несколько сортов томатов с использованием традиционных методов селекции. Они показали, что отбор растений, содержащих желаемую рекомбинацию вблизи гена устойчивости, происходил редко и возвратные скрещивания были неэффективны при попытках уменьшения размера фланкирующей ген устойчивости ДНК. В некоторых случаях обратные скрещивания требовали нескольких поколений и нескольких лет без особого снижения сопряженного переноса генетического материала. Только там, где для селекции устойчивости использовались сцепленные морфологические маркеры сопряженный перенос снижался.

Стратегия селекции на продолжительность устойчивости может требовать переноса более одной устойчивости. Gale и Witcombe (1992) предположили, что более чем один ген может быть включен в одной серии скрещиваний без изменения низкого числа тестируемых растений. Однако, селекция двух и более устойчивостей требует увеличения размера потомства, с тем чтобы получить отдельных дочерних особей, содержащих желаемые комбинации генов и приемлемую пропорцию донорной ДНК.

За последние несколько лет в селекции жемчужного проса применялось несколько альтернативных процедур переноса QTL, ответственных за ряд количественных признаков, таких как устойчивость к болезням и засухе, методом обратных скрещиваний при помощи маркеров (МАВСТ) (Hash el al., 2000) от донора к элитным реципиентным родителям. Три основных метода - это традиционные МАВС программы, "прыжковые" обратные скрещивания при помощи маркеров и наборы линий с заменами соседних сегментов. Первые продукты MAS в селекции жемчужного проса были получены в 1999, в ICRISAT. Улучшенный гибрид жемчужного проса - первый продукт селекции устойчивости к ложной мучнистой росе при помощи маркеров, завершенной за 3 года, -продемонстрировал снижение заболеваемости ложной мучнистой росой (в жестких условиях скрининга сеянцев в теплицах, аналогичных использованным в данной работе) по сравнению с исходными элитными родителями (чистолинейный сорт-опылитель "Н77/833-2" из Haryana Agricultural University (Hissar, Индия)) на 60%.

Столь значительные изменения устойчивости широко культивируемых гибридов принесут от 1,5 до 15 миллионов американских долларов дохода индийской экономике в первый же год возделывания этих новых гибридов (Hash С.Т., Sharmia А., 2000, в печати).

Прежде чем использовать MAS, необходимо оценить все преимущества и сложности данного подхода. Для разработки и внедрения подходящей стратегии необходимо тесное сотрудничество селекционеров и молекулярных биологов.

Несмотря на то, что молекулярные технологии будут способствовать воплощению идей селекционеров, они никогда до конца не заменят подходов традиционной селекции (Paterson et al., 1991b). Использование ДНК маркеров может быть дорогостоящим, требующим относительно много времени, а также требующим надежную и достаточно сложную лабораторную систему (Gale и Witcombe, 1992). В то время, как новые технологии, такие как автоматизированное выделение ДНК и различные варианты PCR- (полимеразная цепная реакция) маркеров значительно облегчают эти трудности, остается проблема, связанная со стабильностью экспрессии генов в различных генетических средах и в разных условиях окружающей среды. Tanksley и Hewitt (1988) показали, что фенотипическое проявление сегмента хромосомы Lycopersicon chmielewskii было прямо противоположно в различных генетических фонах X. esculentum. У кукурузы Guffy et al. (1989) наблюдал высокую степень взаимодействий между QTL признаков урожайности и генетическим фоном. В целом ряде исследований также было показано значительное влияние условий окружающей среды на QTL урожайности (Stuber et al., 1987; Paterson et al., 1991a; Beavis et al, 1991; Bubeck et al., 1993). Эти усложняющие факторы наряду с множеством других характеристик, по которым должен идти отбор, гарантируют, что полевые испытания и опытный взгляд селекционера останутся крайне важны для оценки новых сортов.

Генетические маркеры скорее тесно сцеплены с геном устойчивости, чем гомологичны ему. В результате этого, маркеры, сцепленные с геном устойчивости, в одном генотипе не обязательно дадут такую же RFLP картину в другом генотипе, будучи сцепленными с тем же геном. Следовательно, селекция или скрининг устойчивости с маркерами не может быть завершен без наличия предварительной информации по сегрегации RFLP-паттерна с геном устойчивости в исследуемом скрещивании. Однако, нет сомнений, что развитие биотехнологии позволит решить эту проблему. Если ген устойчивости, сам по себе, может быть клонирован, специфический клон может быть затем использован для скрининга гена устойчивости в любом генотипе. За последние несколько лет был клонирован ряд генов устойчивости (Martin et al., 1993; Jones et al., 1994; Lawrence et al., 1994). По всей видимости гомология последовательностей некоторых генов устойчивости в сочетании с данными QTL картирования позволят клонировать гены, кодирующие устойчивость к ложной мучнистой росе у жемчужного проса. Как только будет определена первичная последовательность клонов, появится возможность создания PCR-праймеров, позволящим селекционерам быстро и эффективно выявлять и отобирать гены устойчивости с использованием ограниченных технологий.

Информация о работе

Колесникова, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2001
ВАК 03.00.15

Диссертация

Использование молекулярных маркеров для картирования генов устойчивости (QTL) к ложной мучнистой росе у жемчужного проса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы