Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе"

На правах рукописи

БАЙНАЗАРОВ А АННА НИКОЛАЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА ОГУРЦА ПОСЕВНОГО {CUCUMIS SA TIVUS L.) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГИБРИДНОСТИ СЕМЯН И МАРКИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К МУЧНИСТОЙ РОСЕ

Специальности: 03.00.23 - биотехнология, 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Москва-2009

003488107

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии и в центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Л.И. Хрусталева кандидат биологических наук Г.И. Карлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ф.С. Джалилов кандидат биологических наук В.В. Соболев

Ведущая организация: Государственное научное учревдение Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии

Защита состоится «23» декабря 2009 г. в 16 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан « 23» ноября 2009 г. и размещен на сайте университета http://www.timacad.ru

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

оС^У^-у Е.А. Калашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Огурец посевной (Cucumis sativus L.) - один из самых древних и популярных видов овощных культур в мире. В современных программах по селекции огурца большое внимание уделяют использованию гетерозисных гибридов с комплексной устойчивостью к наиболее вредоносным заболеваниям. Оценка уровня гибридности семян является важной задачей в семеноводстве гетерозисных гибридов. Наиболее удобными для этих целей являются молекулярные маркеры, их использование позволяет защитить авторские права и контролировать качество полученных семян.

Мучнистая роса - одна из наиболее распространенных болезней огурца. При поражении огурца мучнистой росой потери урожая достигают 40% (Нои & Ма, 1999). Создание устойчивых форм к этой болезни имеет ряд сложностей: 1) необходимость отбора на инфекционном фоне в больших выборках; 2) наличие нескольких видов грибов-возбудителей; 3) нет единого мнения о природе наследования устойчивости. Применение молекулярных маркеров значительно ускорит и упростит селекцию огурца на устойчивость к мучнистой росе. Выбор метода RGA-ПЦР с праймерами на основе консервативных последовательностей R-генов для маркирования устойчивости к мучнистой росе обусловлен характером устойчивости к этой болезни (Morishita, 2003).

В создании молекулярных маркеров ключевым моментом является поиск полиморфизма в геноме. С помощью RAPD и RFLP маркеров, широко применяемых в селекции растений, был выявлен низкий уровень внутривидового полиморфизма в геноме огурца (Kennard et al., 1994, Horejsi & Staub, 1999).

В поисках полиморфных маркеров мы остановились на таких маркерных системах, как ISSR и SSR, которые успешно были применены на различных сельскохозяйственных культурах (Deng et al., 2000, Cekic., 2001, Reddy et al., 2002, Tikunov et al., 2003, Staub et al, 2007).

Дели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus) с использованием ISSR-, SSR-, RGA-маркеров и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ полиморфизма межмикросателлитных последовательностей генома огурца с использованием ISSR-праймеров на сортах и селекционных линиях.

2. Провести анализ полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости методом RGA-ПЦР на сортах и селекционных линиях.

3. Изучить наследование устойчивости огурца к мучнистой росе.

4. Идентифицировать возбудителя мучнистой росы огурца на изучаемых популяциях с помощью микроскопического анализа клейстотециев гриба.

5. Провести RGA-анализ образцов огурца, различающихся по устойчивости к мучнистой росе.

6. Оценить эффективность STS- и SSR-маркеров, ассоциированных с локусами количественных признаков (QTL) устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, полученных на селекционной станции им. H.H. Тимофеева.

7. Разработать эффективную систему оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов Fb основанную на SSR-маркерах.

Научная новизна. Впервые проведен анализ генома огурца с использованием ISSR-ПЦР, позволивший выявить высокий уровень полиморфизма. Наиболее полиморфными оказались межмикросателлитные последовательности, выявляемые праймером К28 на основе динуклеотидного повтора [GT]8A (83%). Такие результаты дают нам основание предположить, что данные повторы ДНК наиболее подвержены изменениям в процессе эволюции огурца. В геноме огурца выявлен высокий полиморфизм как длины самих микросателлитов, так и межмикросателитных последовательностей ДНК. Полученные нами результаты расширяют современные представления об эволюции генома огурца.

Проведен анализ наследования устойчивости к мучнистой росе, вызываемой Podosphaera xanthii. Впервые на огурце применен метод RGA-ПЦР для маркирования признака устойчивости к мучнистой росе. С помощью RGA-праймеров XLLRf-r из LRR-группы был амплифицирован фрагмент, связанный с устойчивостью к фитопатогену.

На основе нуклеотидной последовательности полученного фрагмента сконструированы SCAR-праймеры, позволяющие выявлять растения огурца с различной степенью устойчивости.

Впервые был разработан простой и эффективный метод анализа уровня гибридности гетерозисных гибридов F, огурца, основанный на применении микросателлитных маркеров в агарозном геле.

Практическая значимость. В наших исследованиях ISSR-ПЦР зарекомендовал себя как хорошо воспроизводимый метод, позволяющий выявлять высокий уровень полиморфизма. Поэтому данный метод может быть

рекомендован для использования в селекции огурца при подборе пар для скрещиваний.

На основании оценки эффективности SSR- и STS-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе, на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, мы можем рекомендовать данные маркеры для выявления устойчивости исходного материала и сортов огурца к мучнистой poce: EACMCTG116STS - как доминантный маркер, EAAGMCAT280-282STS -как кодоминантный маркер.

Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов F, огурца на основе SSR- маркеров, которая рекомендуется для контроля качества полученных семян.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005; на международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают 37 рисунков, 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 221 наименований, из них 175 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал: 18 образцов огурца посевного, включая 14 селекционных линий, обозначенных в тексте Л1-Л14, гибриды Б] Белый ангел и Малыш, сорта На1зий18Ыпап и Феникс из коллекции компании «Гавриш»; 36 инбредных линий и 9 гибридов между ними, обозначаемых в тексте гибридными комбинациями под соответствующими номерами ГК1 - ГК9, а также гибриды Б, под номерами 46, 47, 49, 50, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 68, 98 и 99, предоставленные селекционно-семеноводческой фирмой «Манул»; гибриды Р^ Кураж, Атлет, Аббат, Циник, Амир, Раис, Аль-Бируни, Карим и Айкас, предоставленных компанией «Гавриш». 113 образцов популяции Р2 огурца посевного от скрещивания неустойчивого к мучнистой росе сорта Ива с

устойчивым гибридом Астерикс, а также 2 изогенные линии АРС 3-221 (ИЛ 1) и АРС 3-224 (ИЛ2), различающиеся по устойчивости к мучнистой росе (ИЛ1-полностью устойчивая линия, ИЛ2 - линия со средней устойчивостью) (селекционная станция им. H.H. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Растительный материал выращивали в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24°С.

Выделение ДНК. ДНК для ISSR- и RGA-анализа выделяли из молодых проростков по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями. ДНК для SSR-анализа выделяли по методам (1) - (Hong, 1992), (2) - (Chen Wen-ye, 2006) с модификациями, (3) - (Hemmer,1997) с модификациями, (4) - (de Micco Р, 1992, (5) - (Brunei, 1992) с модификациями.

ИЦК-анализ. Межмикросателлитный анализ (ISSR-ПЦР) выполняли с помощью следующих ISSR-маркеров: К13, К15, К16, К17, К18, К19, К 20, 21, К24А, К24В, К25, К 26, К27, К28, КЗО, К31, К32, КЗЗ, К34 (Tikunov et al., 2003).

Анализ полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости проводили методом RGA-ПЦР с использованием следующих пар праймеров: RLRRf-r, XL,LRf-r, CLLRf-r, ANOl-2, ASI-SI, AS3-S2, NBSf-r, PTOkinl-2, PTOkin3-4, PTOfen - s-as (Zhang et al., 2002).

Оценку эффективности STS- и SSR-маркеров осуществляли с помощью следующих пар праймеров: EAACMCAC391-395STS, EAAGMCAT280-282STS, EAAGMCTG171-179STS, EAAGMCAG154STS, EAACMCTG144-143STS, EACMCTG116STS, С31, С35, С80, С162 (Sakata et al., 2006).

Для микросателлитного анализа были использованы следующие пары праймеров: F03, 2AS, 1С, I2A, I2C, СТ23, LK02, AG01, IS, ASOl, FLK1, G06, AGT04, CT12Z, AG13C, СТЗЗ, GA09, TG10, АСС01 (Fazio, Staub, Katzir, 2002).

Все праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва).

Амплификацию осуществляли на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA). Продукты ISSR- и SSR-ПЦР разделяли в 2%-ом агарозном геле с буфером TBE при напряжении 6 В/см. Продукты RGA-ПЦР разделяли в 6%-ом полиакриламидном геле с буфером TBE при напряжении 6 В/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp DNA-Ladder» (Fermentas).

Клонирование ПЦР-продуктов. Клонирование ПЦР-продуктов проводили с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.

Секвенирование. Секвенирование осуществляли методом терминирующих дидезоксирибонуклеотидов на капиллярном сиквенаторе Applied Biosystems 3130 xl.

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright© by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6.00 (Sei Ed Central). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытых базах генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Определение гриба-возбудителя. Для определения гриба-возбудителя использовали метод, основанный на морфологических различиях клейстотециев, числе сумок и аскоспор. Наблюдения проводились с помощью микроскопа AXIOPHOT(Carl Zeiss).

Анализ расщепления. Расщепление в популяции F2 анализировали с использованием критерия с помощью программы AGROS 2.11 (автор С.П. Мартынов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus) с использованием ISSR- метода.

В данном исследовании мы изучили полиморфизм межмикросатедпитных последовательностей геномной ДНК огурца методом ISSR-PCR. Исследование проводили на 18 коллекционных образцах.

ISSR-анализ выявил, что 16 из 19 праймеров обеспечили воспроизводимые электрофоретические профили с общим количеством амплификационных фрагментов, колеблющимся от 5 до 17. 14 ISSR-праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов. Уровень полиморфизма варьировал в широких пределах: от низкого - 10% (К 16: 1 полиморфный фрагмент из 10 выявленных) до высокого - 83,3% (К28: 5 полиморфных фрагментов из 6 выявленных). Всего с использованием ISSR-ПЦР было получено 168 бэнда, из них 52 - полиморфных. Средний уровень полиморфизма составил 31%. Продукты амплификации, полученные при использовании праймера К28 на последовательность [GT]8A оказались наиболее полиморфными среди исследованных генотипов. Таким образом, можно предположить, что данный тип повтора подвергался наибольшей изменчивости в процессе эволюции генома огурца.

Рис. ]. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей образцов огурца, полученный при проведении ISSR-ПЦР с использованием праймера КЗЗ[СТ]8А: 1 -гибрид Fj Белый ангел, 2 - гибрид F¡ Малыш, 3 - сорт Феникс, 4 - сорт Natsufoshinari, 5 - Л1, 6 - JI2, 7- ЛЗ, 8- Л4, 9- Л5, 10- Л6, 11- Л7, 12- Л8, 13- Л9, 14- Л10, 15- ЛИ, 16-Л12, 17-Л13, 18-Л14,

2. Использование RGA-праймеров для маркирования признака устойчивости к настоящей мучнистой росе.

2.1 .Анализ расщепления.

Популяция F2, состоящая из 113 растений, была оценена на зараженность мучнистой росой. Было выявлено 91 - восприимчивых, 11 - устойчивых, 11 -с промежуточной степенью устойчивостью растений (по данным Г.Ф. Монахоса).

Было выдвинуто 9 гипотез о характере наследования данного признака. Достоверность каждой из них была проверена с использованием критерия х2-

Единственной достоверной гипотезой явилось расщепление 13 (ААВВ+ЛАВЪ+АаВЪ+ААЪЪ+АаЪЬ+ааЬЪу. 2 (aaBb): 1 (ааВВ) (13:2:1). Фактическое значение х,2 составило 2,894; при критическом - 5,990. Данная гипотеза предполагает наличие двух генов (А и В) с разным фенотипическим проявлением: полное доминирование между А и а, неполное доминирование по гену В и Ъ. Ген А подавляет В- и bb.

2.2. Идентификация возбудителя мучнистой росы.

Как известно, существует несколько возбудителей мучнистой росы, из которых (по литературным данным) на территории Московской области встречаются два: Golovinomyces cichoracearum (Erysiphe cichoracearum DC. ex MeratJ и Podosphaera (sect. Sphaerotheca) xantlii (Castagne) U.Braun &N.Shishkoff (также известная как Sphaerotheca fusca (Fr) и Sphaerotheca fuliginea Schlechtend.:Fr.) Pollacci) (Braun et al, 2002) из класса Аскомицеты.

В связи с этим нами была проведена работа по идентификации гриба-возбудителя на изучаемой популяции F2 и на территории селекционной станции им. H.H. Тимофеева. Было проанализировано более 400 различных образцов огурца посевного, пораженных мучнистой росой. В их число входили как растения восприимчивой к болезни изогенной линии (ИЛ2), так и другие образцы огурца из коллекции селекционной станции им. Н. Н.Тимофеева.

В результате микроскопического анализа листьев, пораженных мучнистой росой, мы выявили большое количество клейстотециев гриба с длинными светло-коричневыми придатками (рис.2). В каждом клейстотеции было обнаружено по одной сумке, в которой находились от 4 до 8 аскоспор.

W

в

Рис. 2. Анализ возбудителя: (А) - лист огурца, пораженный мучнистой росой; (В) -клейстотеции гриба Podosphaera xanthii. х250 .

Данные морфологические признаки характерны для вида Podosphaera xanthii.

2.3. Адаптация метода RGA-ПЦР для анализа генома огурца.

Анализ литературы показал, что метод RGA-ПЦР никогда не был использован на геноме огурца. Этот метод был использован лишь на близкородственном к огурцу виде - дыне (Cucumis meló L.) (Brotman, Silberstein, Kovalski. et al., 2002).

Было выявлено, что все 10 пар праймеров обеспечивают получение полиморфных электрофоретических профилей с общим количеством амплификационных продуктов в пределах от 6 до 28. Уровень полиморфизма варьировал от 10,5% (пара праймеров XLLRf-XLLRr - 2 полиморфных фрагмента из 19 полученных) до 68,7% (пара праймеров Plofen-s-Ptofen-as - 8 полиморфных фрагментов из 19 общих). Наибольшее число бэндов было получено при использовании пары праймеров AS-S1. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что LRR-, NBS- и PtoKin-содержащие последовательности обильно представлены в геноме огурца. Размер

полученных амплифицированных фрагментов варьировал от 50 до 1300 п.н. В общей сумме было получено 153 фрагмента (ПЦР-продукта), из них 66 -полиморфных. Среди этих фрагментов наибольшее число продуктов было произведено с использованием пары праймеров S1-AS1, наименьшее число -парой праймеров Ptokm3-Ptokin4. Праймеры, сконструированные на основе LRR и NBS - доменов амплифицируют большее общее число продуктов, чем праймеры на основе киназной области.

Средний уровень полиморфизма, полученный с использованием RGA-праймеров, составил 43,1%. Таким образом, выявленный высокий уровень полиморфизма позволил нам использовать этот метод для маркирования признака устойчивости к настоящей мучнистой росе.

2.4. Анализ RGA-ПЦР.

Популяция F2 была проанализирована с помощью изученных ранее 10 пар праймеров, сконструированных на основе различных групп аналогов генов устойчивости.

При использовании пары праймеров XLLRf-r из LRR-группы был амлифицирован фрагмент, специфичный для всех проанализированных растений огурца, как устойчивых так и с промежуточной устойчивостью к мучнистой росе (рис. 3). Анализ 91 растения, восприимчивых к заболеванию, не обнаружил наличия данного фрагмента.

........Т " ......I.............~ ЛИГ

неустойчивые образцы устойчивые образцы

Рис. 3. Полиморфизм последовательностей аналогов генов устойчивости образцов огурца, полученный при проведении 1ЮА-ПЦР с использованием пары праймеров ХЫЖ-г.

Клонирование и секвенирование позволило установить нуклеотидную последовательность этого фрагмента. Анализ в базе данных СепВапк не выявил

гомологии известным последовательностям ДНК. На основании данного сиквенса с использованием программы ОЬЮО 3.1. были сконструированы праймеры. Тестирование расщепляющейся популяции и образцов изогенных линий с помощью данных БСАк-праймеров выявило различия на электрофореграммах устойчивых и восприимчивых к мучнистой росе образцов огурца (рис. 4).

П.Н.

п.н.

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации SCAR-праймеров.

устойчивые образцы

промежуточной устойчивостью

м

неустойчивые образцы

Полученный нами SCAR-маркер был успешно применен лишь на одной расщепляющийся популяции. В связи с этим SCAR-маркер может быть рекомендован для использования в селекции огурца на устойчивость к мучнистой росе только после его масштабного тестирования.

3. Оценка эффективности SSR- и STS-маркеров ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F, и изогенных линиях.

Результаты анализа расщепления популяции F2 по устойчивости к мучнистой росе (глава 2.1.) дают основание предположить, что устойчивость к этой болезни контролируется локусами количественных признаков (QTL). Проведенный недавно QTL-анализ (Sakata с сотр., 2006, LIU LongZhou с сотр., 2008) также указывает на количественный характер наследования признака устойчивости. Для проверки этой гипотезы мы провели оценку эффективности STS- и SSR-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе (Sakata с сотр., 2006), на наших популяциях.

Продукты амплификации были получены для 7 из использованных 10 маркеров. Размер продуктов, амплифицируемых у изучаемых образцов, соответствовал литературным данным, кроме маркера EAAGMCAG154STS. Для этого маркера продукт амплификации должен составлять 134 п.н. Однако, в нашем эксперименте у всех образцов были амплифицированы два продукта размером 270 и 290 п.н.

Праймеры маркеров ЕААСМСАС391-3958Т8, С162, С31, С80 (рис.5) обеспечили амплификацию одного фрагмента размером 140 п.н., 269 п.н., 201 п.н. и 201 п.н. соответственно у всех изученных образцов.

...........

устойчивые образцы образцы с неустойчивые образцы

промежуточной устойчивостью

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера С80.

Маркер ЕАСМСТСПбБТЗ (рис.6) амплифицировал фрагмент размером 95 п.н. у образцов с полной и промежуточной устойчивостью. У неустойчивых образцов амплификация отсутствовала.

НЕУСТОЙЧИВЫЕ УСТОЙЧИВЫЕ

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера ЕАСМСТГО1168Т8.

Маркер ЕААСМСАТ280-2828Т8 амплифицировал 2 полиморфных фрагмента размером 230 и 270 п.н. Фрагмент размером 230 п.н, амплифицировался у устойчивых, а фрагмент 270 п.н. - у восприимчивых к мучнистой росе образцов. У образцов с промежуточной устойчивостью амплифицировались оба фрагмента.

Наши результаты близки к результатам, полученным китайскими коллегами, которые использовали маркер ЕААСМСАТ280-2828Т8 на своей популяции (Ьоп^Ьои е1 а!., 2008). Авторами было показано, что ЕААСМСАТ280-2828Т8 входил в один из (}ТЬ.

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера ЕААСМСАТ280-2828Т8. 1 - ИЛ1, 2 - неустойчивая родительская форма популяции Бг, 3 - образец с промежуточной устойчивостью, 4, 5, 6 - неустойчивые образцы популяции ~Р2, 7- неустойчивая родительская форма популяции Р2, 8 - ИЛ2, 9 -устойчивая родительская форма популяции Р2; М - маркер молекулярных размеров.

Проанализировав все опубликованные маркеры из ()ТЬ-устойчивости (8ака1а с сотр., 2006), мы выявили, что только два из них, а именно ЕААСМСАТ280-2828Т8 и ЕАСМСТС1168Т8, пригодны для оценки на устойчивость к мучнистой росе. Причина этого, возможно, кроется в различии донора устойчивости, используемого 8ака1а с сотр. и нами, а также в различиях расового состава возбудителя.

Таким образом, на основании полученных результатов, мы можем рекомендовать выявленные маркеры для оценки устойчивости исходного материала и сортов огурца: ЕАСМСШ1168Т8 - как доминантный маркер устойчивости к мучнистой росе, ЕААСМСАТ280-2828Т8 - как кодоминантный маркер устойчивости к мучнистой росе.

4. Разработка эффективной системы оценки уровня гибридности гибридов на основе 88]1-маркеров.

Целью работы являлось создание эффективной системы оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов огурца на основе молекулярно-генетического полиморфизма микросателлитных локусов ДНК. Подобная система должна удовлетворять таким требованиям как воспроизводимость результатов, доступность методики, быстрое получение результатов, высокая пропускная способность и низкая себестоимость. Создание такой системы предусматривало решение следующих задач:

1. поиск надежного экспресс-метода выделения ДНК;

2. оптимизация условий амплификации 88Я-ПЦР;

3. поиск маркеров с кодоминаитным типом наследования, способных надежно определять гибридную природу образцов огурца.

4.1. Поиск надежного экспресс-метода выделения ДНК.

Поиск экспресс-метода выделения ДНК был основан на следующих принципах: процедура экстракции должна приводить к получению достаточного количества высокоочищенной ДНК; метод получения должен быть нетрудоемким, дешевым, и, по возможности, не включать опасных для здоровья человека химических реагентов.

Нами были протестированы 5 различных методик выделения ДНК.

В качестве наиболее пригодного растительного материала были выбраны семядольные листья 4-5-дневных проростков огурца, так как их получение возможно в лабораторных условиях в любое время года. Качество экстрагированной ДНК определяли спектрофотометрическим методом и по выходу ПЦР-продукта. В результате исследований установлено, что наиболее оптимальной методикой, удовлетворяющей заданным требованиям является метод предложенный Hong et al, 1992.

4. 2. Оптимизация условий амплификации SSR-ПЦР.

Был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий амплификации и подобрана оптимальная температура отжига для каждой из 19 пар праймеров.

4. 3. Анализ SSR-ПЦР.

В результате проведенной SSR-ПЦР было показано, что все 19 пар праймеров амплифицировали фрагменты ожидаемой длины у всех изученных 67 генотипов огурца. Профили электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК гибридов сравнивали с родительскими. Выбор праймеров для подобного анализа базируется на выявлении полиморфизма у исходных родительских форм и идентификации их потомства по сумме амплифицированных фрагментов. В нашем исследовании было выявлено 4 пары праймеров, которые обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов. Праймеры SSR-маркеров FLK01, F03, 1S, GA09 амплифицировали по 2 полиморфных фрагмента у различных гибридов. Так, с использованием праймеров SSR-маркера F03 у гибридов 49, 46, 54, 60, 99 бьши амплифицированы два фрагмента размером 230 и 260 п.н. Праймеры SSR-маркера FLK01 амплифицировали два фрагмента размером 300 и 320 п.н., у гибридов F, Кураж, Атлет, гибридов под номерами 47, 50, 57, 58, 59, 68, 98, а также у гибридов в комбинациях ГК1, ГК2, ГКЗ. У родительских форм гибридных комбинаций было получено по одному фрагменту. Праймеры SSR-маркера 1S амплифицировали по одному фрагменту размером 180 и 220 п.н. у родительских форм гибридных комбинаций ГК1, ГК2, соответственно, и оба

этих фрагмента у их гибридов. Праймеры ввЯ-маркера вА09 амплифицировали два фрагмента размером 300 и 330 п.н. у гибридов под номерами 60 и 61, а также у гибридов Б] Карим и Айкас.

Таким образом, показана эффективность применения БвЯ-маркеров РОЗ, РЬК01, 1Э, вА09 для оценки уровня гибридности 20 из исследованных 31 гибрида Р,.

(

ЭДШ^ «им» «ИМ* «Я*** * 5« * Яй

У У

РФ1 РФ2 ГИБРИД

Рис.8. Электрофореграмма продуктов амплификации маркера БЬЮ. РФ1 и РФ2 - исходные родительские линии ГКЗ.

На основе полученных данных, для вышеперечисленных гибридов Б) создана эффективная система оценки уровня гибридности, включающая в себя оптимизированные методы экспресс-выделения ДНК и ввЯ-ГИДР с визуализацией результатов в 2%-ом агарозном геле. Данные маркеры обладают кодоминантным типом наследования и способны надежно определять гибридную природу данных образцов.

выводы

1. Изучен полиморфизм межмикросателлитных последовательностей генома огурца. Уровень полиморфизма варьировал от 10% до 83%. Праймер К28 ([СТ]8А) обеспечил самый высокий уровень полиморфизма.

2. С использованием 1ША-ПЦР (праймеры ХЫЖ-Х1Х11г) амплифицирован фрагмент, специфичный для растений огурца с полной и промежуточной устойчивостью. На основе ДНК-последовательности этого фрагмента созданы ЗСАЯ-праймеры.

3. Микроскопический анализ особенностей анатомии и морфологии плодовых тел гриба (клейстотециев) показал, что все исследованные образцы были поражены только одним возбудителем мучнистой росы, а именно Род.о8ркаега хапЛи.

4. Анализ расщепления популяции Р2, полученной от скрещивания устойчивых и восприимчивых форм огурца, выявил, что устойчивость к мучнистой росе, вызываемой Рос1озр1гаега хапЛп обусловлена наличием доминантного гена и гена-супрессора.

5. Показана эффективность использования для оценки устойчивости исходного материала и сортов огурца двух БТБ- маркеров, ассоциированных с С)ТЬ устойчивости к мучнистой росе. (ЕАСМСТСПбБТЗ - как доминантного и ЕААСМСАТ280-2828Т8 - как кодоминантного).

6. Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов Р, огурца на основе ББК-маркеров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сахарова А. Изучение генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) с помощью ДНК-маркеров. / Системная биология и биоинженерия. Материалы международной школы-конференции молодых ученых, Москва: МАКС Пресс, 2005, С. 208.

2. Сахарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Изучение аналогов генов устойчивости к настоящей мучнистой росе у огурца. // Научный журнал «Вестник» Брянской ГСХА, 2006, С. 3 - 10.

3. Байназарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) с помощью ISSR-маркеров. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2007, № 1, С. 56-60.

4. Байназарова А.Н., Карлов Г.И., Хрусталева Л.И. Маркирование гена устойчивости огурца к мучнистой росе./ Материалы Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», 27 - 28 ноября 2007 г., М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2007, С. 138 - 139.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», ГК № 02.740.11.0286 и с использованием оборудования ЦКП.

Подписано к печати 20.11.2009 Формат 60x84/16. Печать трафаретная Уч.-изд. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 475

Отпечатано в издательском центре ФГОУ ВПО МГАУ

127550, Москва, Тимирязевская, 58

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Байназарова, Анна Николаевна

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ДНК-маркеры и их практическое использование

1.1.1. RFLP-маркеры

1.1.2. STS-маркеры

1.1.3. RAPD-маркеры

1.1.4. AFLP-маркеры

1.1.5. SSR-маркеры

1.1.6. ISSR-маркеры

I.1.7.RGA -маркеры

1.1.8. QTL-маркеры

1.2. Характеристика культуры: огурец (Cucumis sativus h.)

1.2.1. Краткая ботаническая характеристика

1.2.2. Хозяйственное значение

1.3. Молекулярно-генетическая характеристика генома огурца

1.3.1. Геномный состав и кариотип

1.3.2. Молекулярное маркирование

1.4. Роль гибридов F1 в селекции огурца.

1.5. Настоящая мучнистая роса огурца

1.5.1. Возбудители болезни

1.5.2. Генетика устойчивости к настоящей мучнистой росе

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1. Растительный материал

II.2. Методы исследований

II.2.1. Выделение ДНК из растительного материала

Н.2.2. ПЦР-анализ

II.2.3. Клонирование ПЦР-продуктов

II.2.4. Секвенирование

II.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей

II.2.6. Анализ расщепления

II.2.7. Определение гриба-возбудителя

ГЛАВА III. Результаты и обсуждение

III.Г. Изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L) с использованием ISSR-метода

Ш.2.Использование RGA-праймеров для маркированин признака устойчивости к настоящей мучнистой росе

III.2.1. Анализ расщепления популяции F

III.2.2. Идентификация возбудителя мучнистой росы

III.2.3. Адаптация метода RGA-ПЦР для анализа генома огурца

III.2.4. Анализ RGA-ПЦР

III.3. Оценка эффективности SSR- и STS-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и иогенных линиях

IIT.4. Разработка эффективной системы оценки уровня гибридности гибридов F1 на основе SSR-маркеров.

III.4.1. Поиск надежного экспресс-метода выделения ДНК

III.4.2.Оптимизация условий амплификации SSR-ПЦР

III.4.3. Анализ SSR -ПЦР

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе"

Актуальность темы. Огурец посевной (Cucumis sativus L.) - один из самых древних и популярных видов овощных культур в мире. В современных программах по селекции огурца большое внимание уделяют использованию гетерозисных гибридов с комплексной устойчивостью к наиболее вредоносным заболеваниям. Оценка уровня гибридности семян является важной задачей в семеноводстве гетерозисных гибридов. Наиболее удобными для этих целей являются молекулярные маркеры, их использование позволяет защитить авторские права и контролировать качество полученных семян.

Мучнистая роса - одна из наиболее распространенных болезней огурца. При поражении огурца мучнистой росой потери урожая достигают 40% (Нои & Ма, 1999). Создание устойчивых форм к этой болезни имеет ряд сложностей: 1) необходимость отбора на инфекционном фоне в больших выборках; 2) наличие нескольких видов грибов-возбудителей; 3) нет единого мнения о природе наследования устойчивости. Применение молекулярных маркеров значительно ускорит и упростит селекцию огурца на устойчивость к мучнистой росе. Выбор метода RGA-ПЦР с праймерами на основе консервативных последовательностей R-генов для маркирования устойчивости к мучнистой росе обусловлен характером устойчивости к этой болезни (Morishita et al, 2003).

В создании молекулярных маркеров ключевым моментом является поиск полиморфизма в геноме. С помощью RAPD и RFLP маркеров, широко применяемых в селекции растений, был . выявлен низкий уровень внутривидового полиморфизма в геноме огурца (Kennard et al., 1994, Horejsi & Staub, 1999).

В поисках полиморфных маркеров мы остановились на таких маркерных системах, как ISSR и SSR, которые успешно были применены на различных сельскохозяйственных культурах (Cekic., 2001, Tikunov et al., 2003, Staub et al, 2008, Reddy et al., 2009).

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus) с использованием ISSR-, SSR-, RGA-маркеров и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ полиморфизма межмикросателлитных последовательностей генома огурца с использованием ISSR-праймеров на сортах и селекционных линиях.

2. Провести анализ полиморфизма последовательностей аналогов генов устойчивости методом RGA-ПЦР на сортах и селекционных линиях.

3. Изучить наследование устойчивости огурца к мучнистой росе.

4. Идентифицировать возбудителя мучнистой росы огурца на изучаемых популяциях с помощью микроскопического анализа клейстотециев гриба.

5. Провести RGA-анализ образцов огурца, различающихся по устойчивости к мучнистой росе.

6. Оценить эффективность STS- и SSR-маркеров, ассоциированных с локусами количественных признаков (QTL) устойчивости к мучнистой росе на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, полученных на селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева.

7. Разработать эффективную систему оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов Fb основанную на SSR-маркерах.

Научная новизна. Впервые проведен анализ генома огурца с использованием ISSR-ПЦР, позволивший выявить высокий уровень полиморфизма. Наиболее полиморфными оказались межмикросателлитные последовательности, выявляемые праймером К28 на основе динуклеотидного повтора [GT]sA (83%). Такие результаты дают нам основание предположить, что данные повторы ДНК наиболее подвержены изменениям в процессе эволюции огурца. В геноме огурца выявлен высокий полиморфизм как длины самих микросателлитов, так и межмикросателитных последовательностей ДНК. Полученные нами результаты расширяют современные представления об эволюции генома огурца.

Проведен анализ наследования устойчивости к мучнистой росе, вызываемой Podosphaera xanthii. Впервые на огурце применен метод RGA-ПЦР для маркирования признака устойчивости к мучнистой росе. С помощью RGA-праймеров XLLRf-r из LRR-группы был амплифицирован фрагмент, связанный с устойчивостью к фитопатогену.

На основе нуклеотидной последовательности полученного фрагмента сконструированы SCAR-праймеры, позволяющие выявлять растения огурца с различной степенью устойчивости.

Впервые был разработан простой и эффективный метод анализа уровня гибридности гетерозисных гибридов Fi огурца, основанный на применении микросателлитных маркеров в агарозном геле.

Практическая значимость. В наших исследованиях ISSR-ПЦР зарекомендовал себя как хорошо воспроизводимый метод, позволяющий выявлять высокий уровень полиморфизма. Поэтому данный метод может быть рекомендован для использования в селекции огурца при подборе пар для скрещиваний.

На основании оценки эффективности SSR- и STS-маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе, на расщепляющейся популяции F2 и изогенных линиях, мы можем рекомендовать данные маркеры для выявления устойчивости исходного материала и сортов огурца к мучнистой росе: EACMCTG116STS - как доминантный маркер, EAAGMCAT280-282STS — как кодоминантный маркер.

Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов Fi огурца на основе SSR- маркеров, которая рекомендуется для контроля качества полученных семян.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Байназарова, Анна Николаевна

выводы

1. Изучен полиморфизм межмикросателлитных последовательностей генома огурца. Уровень полиморфизма варьировал от 10% до 83%. Праймер К28 ([GT]8A) обеспечил самый высокий уровень полиморфизма.

2. С использованием RGA-ПЦР (праймеры XLLRf-XLLRr) амплифицирован фрагмент, специфичный для растений огурца с полной и промежуточной устойчивостью. На основе ДНК-последовательности этого фрагмента созданы SCAR-праймеры.

3. Микроскопический анализ особенностей анатомии и морфологии плодовых тел гриба (клейстотециев) показал, что все исследованные образцы были поражены только одним возбудителем мучнистой росы, а именно Podosphaera xanthii.

4. Анализ расщепления популяции F2, полученной от скрещивания устойчивых и восприимчивых форм огурца, выявил, что устойчивость к мучиистой росе, вызываемой Podosphaera xanthii обусловлена наличием доминантного гена и гена-супрессора.

5. Показана эффективность использования для оценки устойчивости исходного материала и сортов огурца двух STS- маркеров, ассоциированных с QTL устойчивости к мучнистой росе. (EACMCTG116STS - как доминантного и EAAGMCAT280-282STS - как кодоминантного).

6. Разработана эффективная система оценки уровня гибридности гетерозисных гибридов Ft огурца на основе SSR-маркеров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Байназарова, Анна Николаевна, Москва

1. Анискина Ю.В., Бирюкова В.А., Велишаева Н.С. ДНК-генотипирование растений родов Brassica и Solanum. 2005. Сельскохозяйственная биология. № 1 .С. 110-119

2. Бакланова О.В.Новинки селекции гетерозисных гибридов огурца Картофель и овощи, 2006; N 2. С. 8

3. Гавриш С.Ф. Состояние и перспективы селекции овощных культур защищенного грунта в России. Овощеводство и теплич. хоз-во, 2006; N4. -С. 7-10

4. Глазко В.И., Дубин А.В., Календарь Р.Н., Глазко Г.В., Шерепитко В.И., Созинов А.А. 1999.Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR маркеров. Цитология и генетика. Т.З., N5

5. Глазко В.И., Шульга В, ДыманьТ.Н, Глазко Г.В.ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих, 2001.

6. Гороховский В.Ф. Селекция пчелоопыляемых гибридов огурца Оценка гибридов в пленочной теплице и открытом грунте. Эффективное овощеводство в современных условиях, 2005. С. 61-64

7. Данилова Т.В., Тикунов Ю.М., G. Weber, Г.И. Карлов. Молекулярное маркирование пола у хмеля (Humulus lupulus L.) с использованием ISSR-ПЦР. Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. Том 2/Под редакцией Шевелухи B.C., 2001 с.27-40

8. Дютин К.Е.', Генетика и селекция бахчевых культур. М. 2000 / РАСХН 231 с.

9. Дютин, К.Е. Определение видов мучнистой росы тыквенных культур по конидиальной стадии. 1978. /К.Е. Дютин, Ю.В. Соколов//Сборник научных трудов ВНИИОБ.-Астрахань, -Вып.7.-С.11-14.

10. Календарь.!!., Глазко В.И. Типы молекулярно генетических маркеров и их применение .2002// Физиология и биохимия культурных растений.Т.34, №4

11. Круг Г. Овощеводство/Пер. с нем. В.И. Леунова. М: Колос. -2000.-570с.

12. Пивоваров В.Ф.; Добруцкая Е.Г.; Балашова Н.Н. Экологическая селекция сельскохозяйственных растений (на примере овощных культур); Всерос.НИИ селекции и семеноводства овощных культур М., 1994, 248 с.

13. Пороховникова Е.А., Лутова Л.А. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости высших растений к патогенам//Сельскохозяйственная биология/,2000, №5,с.20-31.

14. Пыженков В.И.; Малинина М.И.; Пыженков В.И. 340. Тыквенные (огурец, дыня) [История происхождения и введения в культуру, биологические свойства, селекция, болезни и вредители] М.; Колос, 1994, -288 с. СЕР: Культурная флора Т.21.

15. Соболев В.В., Соболева А.Г., Андреева Г.Н., Карлов Г.И. Оценка межвидового и межсортового полиморфизма малины и маркирование признака ремонтантности с использованием ISSR-ПЦР-анализа. Известия ТСХА, выпуск 2, 2009 год

16. Солоденко А.Е., Саналапий А.В., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнечника с помощью микросателлитных маркеров.2004 .//Цитология и генетика.Том 38, N2.С. 15-19

17. Стройков Ю.М.,. Шкаликов В.В. Защита с/х культур от болезней,1998

18. Струнников В. А. Ред. Биология развития и управление наследственностью. М.: Наука, 1982

19. Сулимова Г.Е. ДНК маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения//Успехи современной биологии//2004, том 124, №3, с. 260-271.

20. Тикунов Ю.М., Хрусталева Л.И., Андреева Г.Н., Г.И. Карлов. Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК культурного и диких видов томата. Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. Том 2/Под редакцией Шевелухи B.C., 2001 с.27-40

21. Шамрай С.Н. Гены устойчивости растений: Молекулярная и генетическая организация, функция и эволюция//Журнал общей биологии//, 2003, том 64, с. 195-214.

22. Юрина О.В.; Пивоваров В.Ф.; Балашова Н.Н. Селекция и семеноводство тыквенных культур в России М., 1998, 424 с.

23. Abdel-Mawgood A.L., Ahmed М.М.М and АН В.А., 2006. Application of molecular markers for hybrid maize (zea mays L.) identification, journal of Food, agriculture & Evvironment. Vol. 4 (2): 176-178

24. Arwind K., Awasthi ea al. Genetic diversity and relationships in mulberry (genus Moms) as revealed by RAPD and ISSR marker assays.2004.// BMCGenetics.5:l

25. Areshchenkova, Т. & M. W. Ganal, 1999. Long tomato microsatellites are predominantly associated with centromeric regions. Genome 42: 536-544.

26. Areshchenkova, T. and M. W. Ganal, 2002. Comparative analysis of polymorphism and chromosomal location of tomato microsatellite markers isolated from different sources. Theor Appl Genet 104:229-235.

27. Asif M., Menboob-Ur-Rahman, Y.Zafar. 2006. Genotyping analysis of six maize (Zea mays L.) hybrids using DNA fingerprinting echnology. Рак. J. bot., 38 (5): 1425-1430

28. Balloux, F., Ii. Brunner, et al. .2000. Microsatellites can be misleading: An empirical and simulation study. Evolution 54(4): 1414-1422.

29. Baker В., Zambryski p., Staskawicz В., Dinesh-Kumar S.P. 1997. Signaling in plant-microbe interactions, science 276;726-733

30. Bahulikar, Rahul A,Stanculescu, Dominic,Preston, Catherine A,Baldwin, Ian T.2004. ISSR and AFLP analysis of the temporal and spatial population structure of the post-fire annual, Nicotiana attenuata, in SW Utah .BMCEcoI. 2004; 4: 12

31. Barnes, W.C., Epps, W.M.I956. Powdery mildew resistance in South Carolina cucumbers. Plant Dis. Rep. 40.P. 1093

32. Ben Amer I.M., Korzun V.,Worland A.J., Borner A. 1997. Genetic mapping of QTL controlling tissue-culture response on chromosome 2B of wheat (Triticum aestivum L) in relation to major genes and RFLP markers // Theor. Appl. Genet. Vol .94. P. 1047-1052

33. Bent A.F.1996. Plant disease resistance genes function meets structure". Plant Cell 8: 1757-1771

34. Bernatzky R., Tanksley S.D. Genetics of actin-related sequences in tomato. 1986. Theor. Appl. Genet. 72:P.314-324

35. Bradeen, J.M., J.E. Staub, C. Wyse, R. Antonise, and J. Peleman. Towards an expanded and intergrated linkage map of cucumber (Cucumis sativus L.). Genome 44:111-119:2001

36. Brotman Y., Silberstein L., Kovalski I., Perin C., Dogimont C., Pitrat M., Klinger J., Thompson, Perl-Treves. 2002. resistance gene homologues in melon are linked to genetic loci conferring disease and pest resistance. TheorAppl Genet 104: 1055-1063

37. Brown, P. & S. D. Tanksley. Characterization and genetic mapping in simple sequence repeats in the tomato genome. 1996.Mol Gen Genet 250: P.39 -49.

38. Brunei D. An alternative, rapid method of plant DNA extraction for PCR analyses. 1992 Nucleic Acids Research. Vol. 20, № 17

39. Buntjer J.B., Otsen M., Nijman I.J., Kuiper M.T.R., Lenstra J.A. 2002. // Heredity. V.88. N.l. P.46

40. Callen, D.F., Thompson A.D., Shen Y.,. Phillips H.A, Richards R.I., Mulley J.C. & Sutherland G.R., 1993. Incidence and origin of "null" alleles in the (AC)n microsatellite markers. Am J Hum Genet 52:922-927.

41. Cecelia M. Miles, Ph.D.&Marta Wayne, Ph.D.Nature Education Citation:Miles, C&Wayne, M. 2008 . Quantitative trait locus (QTL) analysis. Nature Education 1(1))

42. Cekic C., Battey N. H. and M. J. Wilkinson. The potencial of ISSR-PCR primer-pair combination for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus inFragaria as a model. 2001. Theor Appl Genet 103:P. 540-564

43. Chakraborty R., Kimmel M., Stivers D.N., Deka R., 1997. Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide microsatellite loci. Proc Natl Acad. Sci.USA 94: 1041-1046

44. Charters, Y.M., A. Robertson, M.J. Wilinkson & G. Ramsay, 1996. PCR analysis of oilseed rape cultivars (Brassica napus L. ssp. oleifera) using 5;-anchored simple sequence repeat (SSR) primers. Theor Appl Genet 92: 442-447.

45. Chen Wen-yue, Cui Hai-rui, Jin-song, Zhou Xiang-sheng, Shu Qing-yao. A simplified Rice DNA Extraction Protocol for PCR .2006.Analysis. Rice Science. 13 (l).P.67-70

46. Chen X., Line, F., and Leung, H. 2008.Genome scanning for resistance-gene analogs in rice, barley, and wheat by high-resolution electrophoresis. Theor. Appl. Genet.97.:P.345-355

47. Chakraborty R., Kimmel M., Stivers D.N., Deka R. Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide microsatellite loci.2007. Proc Natl Acad. Sci. USA 94. P:1041-1046

48. Chung, S.M., Decker-Walters D.S., and Staub J.E. 2003. Genetic relationships within the Cucurbitaceae as assessed by ccSSR marker and sequence analysis. Can. J. Bot. 81:814-832

49. Chung, S.M., Staub J.E., and Chen J.F. 2006. Molecular phylogeny of Cucumis species as revealed by consensus chloroplast SSR marker length and sequence variation. Genome 49:219-229

50. Collins, N.C., Webb, C.A., Seah, S., Ellis, J.G., Hulbert, S.H., and Baucombe, D.C. The isolation and mapping of disease resistance analogs in maize. Mol.Plant-Microbe Interact. 1998. 11:968-978

51. Condit. R., Hubbell.S.P. 1991.Abundance and DNA sequences of two-base repeat regions in tropical tree genomes. Genome 34.P.66-71.

52. Cuadrado, A. & T. Schwarzacher, 1998. The chromosomal organization of sequence repeats in wheat and rye genomes. Chromosoma 107: 587-594.

53. Dahin-Poleg. Y., Reis, S., Baudracco Amas, M. Pitrat, Staub, J.E. Simple sequence repeats in Cucumis mapping and map merging.2000. Genome 43:P.963-974.

54. Decker-Walters, D. S., J. E. Staub, S. M. Chung, E. Nakata, and H. D. Quemada. Diversity in free-living populations of Cucurbita pepo as assessed by random amplified polymorphic DNA. J. Exp. Bot. (accepted 5/2001)

55. Delia Vecchia P.T., C.A.R. da Silva: P.Terenciano-Sobrinho. 1998. Use of molecular marker techniques in seed testing by Brazilian seed companies. Sci. agric. vol.55

56. Devos, K.M., Gale. M.D. The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat. 1992.// Theor. Appl. Genet. Vol. 84. P. 567-572.

57. Devos K.M., Gale M.D. The genetic maps of wheat and their potential in plant breeding .1993.// Outlook Agric. Vol. 22. P. 93-99.

58. Dijkhuisen, A., Kennard W.C., Have M.J., and Staub, J.E. RFLP variability and genetic relationships in cultivated cucumber. 1996. Euphytica, 90: P.79-87

59. Dijkhuizen, A. and J. E. Staub. 1999. QTL conditioning yield and fruit quality traits in cucumber (Cucumis sativus L.); Cucurbit, Genetics Cooperative Rpt. 22:8-10. (Technical Bulletin)

60. Dijkhuizen, A. and Staub J.E. 2003. Effects of environment and genetic background on QTL affecting yield and fruit quality traits in a wide crossin cucumber Cucumis sativus L. x Cucumis hardwickii (R.) Alef. J. New Seeds 4:1-30

61. D Ellen К Tarr and Helen M Alexander. 2009. TIR-NBS-LRR genes are rare in monocots: evidence from diverse monocot orders. BMC Res Notes.; 2: 197.

62. Echt, C. S., May-Marquardt P, Hseih M. &Zahorchak R, 1996.Charactrization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39:P. 1102- 1108.

63. Ellis Jeffrey G; Rafiqi Maryam; Gan Pamela; Chakrabarti Apratim; Dodds Peter N. 2009. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens. Current opinion in plant biology .12(4). :P.399-405

64. Ellis J.,Dodds, P., Pryor T. 2000. Structure, function and evolution of plant disease resistance genes.Curr.Opin Plant Biol. 3(4).P.:278-84.

65. Fazio, G. and J. E. Staub. 2000. Method for the development and characterization of microsatellite markers in cucumber. Cucurbit Genetics Cooperative Rpt. 23:4-7. (Technical Bulletin)

66. Fazio G., Chung, S.M., Staub, J.E. 2002.Development and characterization of PCR markers in cucumber (Cucumis sativus L.). Journal of the American Society of Horticultural Sciences 127. :P.545-557.

67. Fazio G., Staub J.E., Stevens M.R.2003.Genetic mapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber (Cucumis sativus) using recombinant inbred lines. Theor. Appl. Genet 107: 864-874

68. Fazio, G., Chung S.M., and Staub J.E. 2003. Comparative analysis of response to phenotypic and marker-assisted selection for multiple lateral branching in cucumber (Cucumis sativus L.). Theor. Appl. Genet. 107: 875-883

69. Fanourakis N., Tsekoura, L., Nanou, E. 2000. Morfological characteristics mildew resistance of Cucumis melo land races in Greece.

70. Proceedings of Cucurbitaceae 2000. The 7 EUCARPIA Meeting of Cucurbit Genetics and Breeding. Acta Horticulturae 510, 241-246

71. Flor H.H. 1971.Current status of gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol. 9.P. 275-296.

72. Fluhr, R.2001. Sentinels of disease: Plant resistance genes. Plant Physiol., 127, 1367-1374.

73. Fujieda K., Akiya R., 1962. Inheritance of powdery mildew resistance and spine color of fruit in cucumber. J. Jpn. Soc. Hort. Sci., 31.P.30-32

74. Gortner, G., M. Nerino, K. Weising, D. Zink, W. Nagi & G. Kahl, 1998. Chromosomal localization and distribution of simple sequence repeats and the Arabidopsis-type telomere sequence in the genome of Cicer arietinum L. Chrom Res 6: 97-104

75. Grandillo, S. & S. D. Tanksley, 1996. Genetic analysis of RFLPs, GATA microsatellites and RAPDs in a cross between L. esculentum and L. pimpinellifolium. Theor Appl Genet 92: 957 965.

76. Garcia-Mas J.; Van Leeuwen H.; Monfort A.; de Vicente M. C. 2002.Cloning and mapping of resistance gene homologues in melon. Plant Science 161:165-172

77. Guo, P.G., Bai, G.H., and Shaner, G.E. 2003. AFLP and STS tagging of a major QTL for Fusarium head blight resistance in wheat. Theor. Appl. Genet. 106:1011-1017.

78. Gupta, P. К., H. S. Balyan, P. C. Sharma & B. Ramesh, 1996. Microsatellites in plants: a new class of molecular markers. Curr Sci 70.:P.45-54.

79. Gupta, P. К. and R. K. Varshney, 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analyses and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica 113:163-185.

80. Gupta P.K., Varshney R.K., Sharma P.C., Ramesh B.1999. Molecular markers and their applications in wheat breeding. // Plant Breed.Vol. 118. P. 369-407.

81. Han Y.H, Zhang Z.H., Lin J.H. , Lu, J.Y., Huang S.W, Jin W.W. 2008. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenetic genome research. Vol. 122,No. 1.

82. Hammond-Kosack, K., and Jones, J. 1997. Plant disease resistance genes. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 575-607

83. Hashemi S.H., Mirmohammadi-Maibody S.A., Nematzaden G.A., Arzani A. 2009. Identidication of rice hybrids using microsatellite and RAPD markers. African Journal of Biotechnology, Vol. 8 (10), pp. 2094-2101

84. Hou F, Lv S Z, Ma D FI. Powdery mildew of cucumber. 1999. In: Yin D, ed. Cucumber (in Chinese). Tianjin: Tianjin Technology Press.P. 756-778

85. Hong YK, Coury DA, Polne-Fuller M and Gibor A (Lithium chloride extraction of DNA from the seaweed Porphyra perforate. 1992. (Rhodophyta). J. Phycol. 28. P. 717-720.

86. Horejsi, Т., and Staub, J.E. Genetic variation in cucumber (Cucumis sativus) as assessed by random amplified polymorphic DNA. 1999. Genet.Res.Crop Evol. 46: P.337-350.

87. Horejsi Т., J.E. Staub and Thomas. Linkage of random polymorphic DNA markers to downy mildew resistance in cucumber (Cucumis sativus L.).2000. Euphytica 115.P:105-113

88. Horejsi, Т., J. Box and J. E. Staub. 1999. Efficiency of RAPD to SCAR marker conversion and their comparative PCR sensitivity in cucumber. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 124:128-135

89. Jarret R.L., Merrick L.C., Holms Т., Evans J., Aradhya MK. Simple sequence repeats in watermelon (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum &Nakai). 1997.//Genome 40.P:433-441

90. Joshi S.P. 2000.Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by ISSR polymorphism in the genus Oryza. Theor. Appl. Genet., 100.:P.1311-1320

91. Ju-Fen L., Guo-Bin M., Ling X. 2008. SSR markers for identification of purity of melon hybrids. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology, 5: 223-229

92. Kantety, R.V X. Zeng, J.L. Bennetzen & B.E. Zehr, 1995. Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification. Molecular Breeding 1: 365-373.

93. Kanazin V., Marek L.F., Shoemaker R.C. Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Oct 15; 93(21):11746-50.

94. Katzir,N., Danin-Poleg,Y., Karchi, Z., Lavi,U., and Cregan, P.B. 1996.// Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitaceae species. 1996. Theor. Appl.Genet.93.:P. 1282-1290.

95. Kennard, W.C., Poetter, K.,Dijkhuisen, A.,Meglic, V., Staub, J., and Havey,M. Linkages among RFLP, RAPD, isozyme, disease resistance, and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber. 1994. Theor. Appl. Genet. 89.:P.42-48

96. Kirkbride, J. H., Jr. 1993. Biosystematic monograph of the genus Cucumis (Cucurbitaceae). (Monog Cucumis) 40–41.

97. Kneir, L.D., J.E. Staub, D.J. Holder and B.P. May. Genetic diversity in Cucumis sativus L. assessed by variation at 18 allozyme coding loci. Theor. App. Gen. 78:119-128. 1989.

98. Knerr, L.D., and Staub, J.E. Inheritance and linkage relationships of isozyme loci in cucumber (Cucumis sativus).1992. //Theor. Appl. Genet.89.P.:42-48

99. Korzun V., Roder M.S., Worland A. J., Borner A. Intrachromosomal mapping of the dwarfing (Rhtl2) and vernalization response {Vml) genes in wheat by using RFLP and microsatellite markers. 1997. // Plant Breed .1. 116. P. 227-232

100. Kooistra, E. Powdery mildew resistance in cucumber. Euphytica, 1968.17, 236-244

101. Kuzuya, M., Hosoya, K., Masuya, y.H., Tomita, K., Esura, H.2000. Histological observations of powdery mildew resistance in diploid and haploid melons. The 7 EUCARPIA Meeting of Cucurbit Genetics and Breeding. Acta Horticulturae 510, 241-246

102. Lagercrantz U, Ellegren H, Andersson L, 1993. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. 1993. Nucleic Acids Res 21 .:P.l 111-1115

103. Lamkey K. L. and Staub J. E. (eds.). 1998. Concepts and Breeding of Heterosis in Crop Plants, 1998. CSSA Special Publication Number 25, 127 p.p. (Proceedings)

104. Li, X.; Liu, L.; Gong, Y.; Wang, Y.; Fu, В.; Hou, X.; Zhu, X.; Yu, F.; Shen, H., 2008. Molecular testing of cucumber hybrid genetic purity with RAPD marker. Seed Science and Technology, V.36, N2 pp.440-446

105. Lebeda, A&Kriskova, E.2000. Interactions between morphotypes of Cucurbita pepo obligate biotrophs. Proceedings of Cucurbitaceae 2000. The 7 EUCARPIA Meeting of Cucurbit Genetics and Breeding. Acta Horticulturae 510, 219-229

106. Leah McHale, Xiaoping Tan, Patrice Koehl and Richard W Michelmore. Plant NBS-LRR proteins: adaptable guards.2006 Genome Biology.7. P.212

107. Levin I., Gilboa, N., Yeselson, E., S. Shen & A. A. Schaffer, 2000. Fgr, a major locus that modulates the fructose to glucose ratio in mature tomato fruits. Theor Appl Genet 100: 256 262.

108. Leister, D., Ballvora, A., Salamini, F., and Gebhardt, C.1996. A. PCR-based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide applicationin plants. //Nat. Genet. 14.P:421-429

109. Li Ju Fen, Ma Guo-Bin and Xu Ling. 2008. SSR markers for identification of purity of melon hybrids. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology 5:223-229

110. LiulongZhou, CAI Run et al. 2008.QTL molecular marker location of powdery mildew resistance in cucumber (Cucumis sativus L.). Science in China Series C-life Sci. v.51 no 11

111. Marra G, Schar P. 1999. Recognition of DNA alterations by the mismatch repair system. Biochem J 338.P.1-13

112. Ma X.F., Wanous M.K., Houchins K., Rodriguez M.A., Goicoechea P.G., Wang Z., Xie M., Gustafson J.P. 2001. Molecular linkage mapping in rye (Secale cereale L)./Theor. Appl. Genet. Vol. 102. P. 517-523.

113. H*. K. Makari, H. S. Ravikumar Patil, M. Abhilash and H. D. Mohan Kumar. 2009. Genetic diversity in commercial varieties of chilli as revealed by RAPD method Indian Journal of Science and Technology Vol.2 No 4

114. Mago, R., Nair, S., and Mohan, M. 1999. Resistance gene analogues from rice: cloning, sequencing and mapping. Theor. Appl. Genet., 99:50-57

115. Meglic, V. and J. E. Staub. Inheritance and linkage relationships of allozyme and morphological loci in cucumber (Cucumis sativus L.). Theor. Appl. Genet. 92:865-872. 1996.

116. Menz M.A., Klein R.R., Mullet J.E., Obert J.A., Unruh N.C., Klein P.E. 2002.// Plant Mol Biol. V. 48. N.5-6. P.483

117. McGrath M. T. Fungicide resistance in cucurbit powdery mildew: experiences and challenges.2005// Plant Disease.Vol.85, No.3.P.236-245

118. Mingsheng W., Xihat J, Lei Т., Baochun Lv. 2006. Rapid and reliable prity identification of FI hybridsof maize (Zea mays L.) using SSR markers, molecular plant Breeding. Vol. 4, No 3, 381-384

119. Modrich P, Lahue R 1996. Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination and cancer biology. Annu Rev Biochem 65.:P. 101-133

120. Morishita M., Sugiyama M., Saito Т., Sakata Y. 2003. Powdery Mildew Resistance in Cucumber. JARQ, 37 (1), 7-14

121. Munger, H.M. et al.1979. Dominant genes for resistance to powdery mildew in cucumber. Cucurbit Genet. Coop. 2.P. 10

122. Muthusamy S, Kanagarajan S, Ponnusamy S (2008) Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) landraces. Electr J Biotech 11(3): 10 pp.

123. Nakata E., Staub J.E., Lopez-Sese A.I., and Katzir N. 2005. Genetic diversity in Japanese melon (Cucumis melo L.) as assessed by random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markers. Genet. Res. Crop Evol. 52:405-419

124. Nagaoka Т., Oginata Y. 1997. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers.// Theor. Appl. Genet., 97.:P.597-602

125. Nan P., Shi S., Peng S., ian C., Zhong Y.2003. Genetic Diversity in Primula obconica (Primulaceae) from Central and South-west China as Revealed by ISSR Markers.Annals of Botany 91: 329-333

126. Naqvi, N.I. and Chattoo.B.B. 1996. Development of a SCAR- based indirect selection method for a dominant blast- resistance gene in rice. Genome . 39: 26-30

127. Parsons B. J., Newbury H. J., Jackson M. T. and В. V. Ford-Lloyd. 1997. Contrasting genetic diversity relationship are revealed in rice (Oriza sativa L.) using different marker types. Mol Breeding 3:115-125.

128. Paetku, D. & C. Strobeck, 1995. The molecular basis and evolutionary history of a microsatellie null alleles in bears. Molecular Ecology 4: 519-520.

129. Pivoriene, O., Pasakinskiene, I., Brazauskas, G., Lideikyte, L., Jensen, L.B., Liibberstedt, T. 2008. Inter-simple sequence repeats (ISSR) loci mapping in the genome of perennial ryegrass. Biologica (in Revision)

130. Perry M.D., Davey M.R., Power J.B., Love K.C., Bligh H.F.J., Roach P.S., Jones C.1998. // Plant Molecular Biology Reporter. V. 16. N.l

131. Pedersen, С. & I. Linde-Laursen, 1994. Chromosomal' location of four minor rDNA loci and a marker microsatellite sequence in barley. Chromosome Res 2: 67-71.

132. Plaschke, J., M.W. Ganal & M.S. Roder, 1995. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers. Theor Appl Genet 91: 1001-1007.

133. Poetter, K., R. Fruth and J. E. Staub. 1992. RAPD analysis in cucumber map construction and breeding. In: Fifth EUCARPIA Cucurbitaceae

134. Powell, W., G.C. Machray & J. Provan, 1996. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends Plant Sci 1:P.215-222

135. Prasad, M„ R.K. Varshney, J.K. Roy, H.S. Balyan & P.K. Gupta, 2000. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theor Appl Genet 100: 584 592.

136. Onto S., Laosat N., Suksawat W., Popluechai S. 2008. Phylogenetic analysis of Cucumis sativus L usind RAPD molecular markers. Journal of Plant Sciences. 3 (1): 105-110

137. Qu L.-J., Foote T.N., Roberts M.A., Money T.A., Aragon-Alcaide L, Snape J.W., Moore G. 1998. A simple PCR-based method for scoring the phi deletion in wheat // Theor. Appl. Genet. —- Vol. 96. P. 371-375.

138. Prasad, M„ R.K. Varshney, J.K. Roy, H.S. Balyan & P.K. Gupta, 2000. The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theor Appl Genet 100:

139. Prevost A., Wilkinson M.J.A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. 1999. Theor. Appl. Genet. 98.:P.107-112

140. Rafalski, J. A.; Vogel J. M., Morgante W, Powell W., Andre C.and . Tingey.S.V. Generating and using DNA markers in plants. 1996 // Nonmammalian Genome Analysis. A Practical Guide. P. 75-134.

141. Rakoczy-Trojanowska, M., Bolibok H. 2004. Characteristics and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. //Cellular& Molecular Biology Letters, V.9.P.221-238

142. Rankovic, В. 2003. Powdery mildew fungi (order Erysipales) on plants in Montenegro (Chernogoria). Mycology and Phytopathology (Rus. Acad. Of Sci., Leningrad Sci. Publ.)37 (3), 42-52

143. Roder, M.S., J. Plaschke, S.U. Konig, A. Bomer, M.E. Sorells, S.D. Tanksley & M.W. Canal, 1995. Abundance, variability and chromosomal location of microsatellites in wheat. Mol Gen Genet 246: 327-333.

144. Romer P, Hahn S., Jordan Т., Straufi Т., Bonas U., Lahaye T. Plant Pathogen Recognition Mediated by Promoter Activation of the Pepper Bs3 Resistance Gene. Science 318 (5850): 645-648

145. Saiki R.K., Scharf S., Fallona F., Mullis K., Horn G. // Science. 1985. V.230. N.6. P.1350

146. Sakata Y.2006. QTL analysis of powdery mildew resistance in cucumber ((Cucumis sativus L.). Theor Appl Genet 112: P. 243-250

147. Sankar. A.A. 2001.Evaluation of ISSR analysis for mapping in Citrus and extension of the genetic linkage map// Theor. Appl. Genet. 102.P.206-214

148. Schlotterer C, Pemberton J 1998. The use of microsatellites for genetic analysis of natural populations a critical review. In. DeSalle R,

149. Schierwater В (eds) Molecular approaches to ecology and evolution. Birkhauser, Basel. P. 71-86

150. Schmidt, T. & J.S. Heslop-Harrison. 1996.The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet. Proc Nati Acad Sci USA 93 :P. 87618765

151. Seo Y. W., Jang C.S., Johnson J.W. 2001.Development of AFLP and STS markers for identifying wheat-rye translocations possessing 2RL // Euphytica. — Vol. 121. P. 279-287.

152. Serquen F.C., Bache, J., and Staub J.E. 1997. Mapping and QTL analysis of a narrow cross in cucumber (Cucumis sativus L.) using random amplified polymorphic DNA markers. Mol. Breed.3:P.257-268

153. Serquen, F. C. and J. E. Staub. Under estimation of detection of QTLs when using dominant gene markers: The case of RAPDs in cucumber. Cucurbit Genetics Cooperative Rpt. 19:13-16. 1996. (Technical Research Report)

154. Shanmugasundarum, S., P.H. Williams and C.E. Peterson. 1971. Inheritance of resistance to powdery mildew in cucumber. Phytopathology 61 .P: 1218-1221.)

155. Shan X., Blake Т.К., Talbert L.E. Conversion of AFLP markers to sequence-specific PCR markers in barley and wheat // Theor. Appl. Genet. -1999. Vol. 98. - P. 1072-1078

156. Sitterly, W.R. 1978. Powdery mildews of cucurbits. In: D. M. Spencer, ed., The Powdery mildews, pp. 359-371. Academic, New York

157. Smith (Smith P.G. Powdery mildew resistance in cucumber. 1948. Phytopathology. 39.P. 1027-1028)

158. Speulman, E., Bouchez, D., Holub, E.B., and Beynon, J.L. Disease resistance gene homologs correlate with disease resistance loci of Arabidopsis thaliana.l998.//Plant J. 14.P. 467-474

159. Staub, J. E. Inheritance of RAPD markers in Melon (Cucumis melo L.). 2001. Cucurbit Genetics Cooperative Rpt. 24:29-32: (Technical Research Report)

160. Staub, J. E., J. Box, V. Meglic, T. F. Horejsi, and J. D. McCreight. 1997. Comparisons of isozyme and random amplified polymorphic DNAs for determining intraspecific relationships in Cucumis. Genet. Res. Crop Evol. 44:257-269.

161. Staub, J. E. and T. Horejsi. 1998. Theoretical expectations of the potential use of genetic markers in marker-assisted selection. In: Cucurbitaceae 98 Evaluation and enhancement of cucurbit germplasm. p. 342-349. (Proceedings)

162. Staub, J. E. 1999. Intellectual property rights, genetic markers, and hybrid seed production. J. New Seeds 1:39-65.

163. Staub J.E., Chung S. M, Fazio G. 2005.Conformity and genetic relatedness estimation in crop species having a narrow genetic base: the case of cucumber (Cucumis sativus L.).// Plant Breeding, V.124.P.44-53

164. Staub, J.E., J. Bacher and K. Poetter. 1996. Sources of potential errors in the application of random amplified polymorphic DNAs in cucumber (Cucumis sativus L.). HortScience 31:262-266.

165. Staub, J. E., Y. Danin-Poleg, G. Fazio, T. Horejsi, N. Reis, and N. Katzir. 2000.Comparative analysis of melon (C. melo L.) germplasm using random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markers. Euphytica 115:225-241

166. Staub J.E., Fazio G, Horejsi T. 2000. Comparative analysis of cultivated melon groups (Cucumis melo) using RAPD and SSR markers.

167. Staub J.E, Dane F.,., K.Reitsma, G. Fazio, A.Lopes-Sese. 2002. The formation of test arrays and a core collection in cucumber using phenotypic and molecular marker data. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127 (4): 558-567

168. Staub, J. E., F. Serquen and M. Gupta. 1996a.Genetic markers, map construction and their application in plant breeding. HortScience 31:729-741.

169. Staub, J. E., F. С. Serquen, and J. Bacher. 1996b. Genetic map construction and map merging in cucumber (Cucumis sativus L.). In: Sixth EUCARPIA Cucurbitaceae Symposium. Malaga, Spain. May 28-30. p. 163-171. (Proceedings)

170. Staub, J. E. 2003. Marker-assisted selection for multiple traits in cucumber. Proceedings of the 3rd Congress of the Genetics Society of Slovenia, Bled, Slovenia, May 30-June 3, 2003, p. 29-33

171. Staub, J.E., Fanourakis N., and Lopez-Ses<3 A.I. 2004. Genetic diversity in melon (Cucumis melo L.) landraces from the island of Crete as assessed by random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markers. Euphytica 136:151-166

172. Staub, J.E., Chung S.M., and Fazio G. 2005. Conformity and genetic relatedness estimation in crop species having a narrow genetic base: The case of cucumber (Cucumis sativus L.). Pit. Breed. 124:44-53

173. Staub J.E., Robbins M.D., S.M. Chung, and Z. Sun. Cucurbitaceae 2006. History and application of molecular markers for cucumber improvement. Proceedings of the Cucurbitaceae 2006, Charlotte, North Carolina, September 30-October 4, p. 197-205

174. Staub, J. E., Z. Sun, S. M. Chung, and R. L. Lower. 2007. Evidence for colinearity among genetic linkage maps in cucumber. HortScience 42:20-27

175. Sun Z., Lower R.L., Chung S.M, and Staub J.E. 2006. Identification and Comparative Analysis of Quantitative Trait Loci (QTL) Associated with Parthenocarpy in Processing Cucumber. Pit. Breed. 125:281-287

176. Suwabe et.al. Isolation and characterization of microsatellites in Brassica rapa L. 2002. Theor Appl Genet 104 P. 1092-1098

177. Takken F. L. W. and. Tameling W. I. L 2009. To Nibble at Plant Resistance Proteins. Science 8 May 2009:.Vol. 324. no. 5928, pp. 744 746

178. Tanksley, S. D.; N. D. Young; A. H. Paterson and M. W. Bonierbale. RFLP mapping in plant breeding: New tools for an old science .1989.// Bio/Technology.V. 7. P. 257-264

179. Tatlioglu, 1993. Cucumber (Cucumis sativus). In Genetic improvent of vegetable Crops. Tarrytown, 197-234

180. Tautz, D. & M. Renz. M. 1989. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. 1984. Nucl Acids Res 12:.P.4l27-4138.

181. Tautz, D.,1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucl. Acids. Res. 17.P.:6463-6471

182. Tikunov Yu.M., Khrustaleva L.I., Karlov G.I., 2003. Application of ISSR markers in the genus Lycopersicon. Euphytica 131: 71-80

183. Tsumura Y., Ohba K., Strauss S. H. 1996. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphism in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theor Appl Genet 92:40-45

184. Vienne D. 2003. Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology. Enfi eld, NH, USA: Sci. Publ. Inc.,. 239 p

185. Vos P., Hogers R., Reijans M., Van de Lee Т., Homes M., Friters A., Pot J., Peleman J., Kupier M., Zabeau M 1995.AFLP: a new technique for DNA fingerprinting /. // Nucl. Acids Res. — Vol. 23. P. 4407-4414.

186. Vosman, B. & P. Arens, 1997. Molecular characterization of GATA/GACA microsatellite repeats in tomato. Genome 40: 25-33.

187. Wang, Y.-H., Thomas, C.E., and Dean, R.A. 2001. A genetic map of melon (Cucumis melo L) based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. 1997. Theor. Appl. Genet. 95:P.791-798.

188. Walters S.A.,. Shetty N.V, Wehner T.D. Segregation and linkage of several genes in cucumber. Amer. Soc. Hort. Sci. 126 (4): 442-450

189. Waugh, R. and Powell, W. Using RAPD marker for crop improvement.Trends Biotechnol. 10(1992) 186-19

190. Waugh R., Powell W. //Trends Biotechnol. 1992. V.10. P. 186.

191. Weber, J.L., Wong, C. Mutation of human short tandem repeat. 1993.Hum. Mol. Genet.2: P.l 123-1128

192. Weber J. L. and May P. E. 1989.Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction.Am J Hum Genet 44.P.388-396.

193. Wenkai,X. Genome-wide isolation of resistance gene analogs in maize (Zea mays L.).2006. Theor Appl Genet. Jun;l 13(l).P:63-72

194. Wehner, Т. C. and D.N. Maynard. Cucurbitaceae (vine crops). In: Encyclopedia of Life Sciences. 2003. Nature Publishing.

195. Wilson, J.D. 1956. Two foreign cucumbers resistant to bacterial wilt and powdery mildew. Plant Dis. Rep, 40. P.437-438213. http://www.fbb.msu.ru/Sitefiles/aboutfbb/aboutbioinformatic.htm

196. Wolff, К., E. Zietkiewicz & H. Hofstra, 1995. Identification of chrysanthemum cultivars and stability of fingerprint patterns. Theor Appl Genet 91:439-447

197. Yeboah M. A, Xuehao C., Feng C. R., Liang G. and Gu M. 2007.A genetic linkage map of cucumber (Cucumis sativus L) combining SRAP and ISSR markers African Journal of Biotechnology Vol. 6 (24), pp. 2784-2791

198. Yu, Y.G., Buss, G.R., and Maroof, M.A.S. 1996. Isolation of superfamily of candidate disease-resistance genes in soybean based on conserved nucleotide-binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(11).P.751-756

199. Zeitkewicz E., Rafalski A., Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR) anchored polymerase chain reaction. Genomics 20.P:176

200. Zhang P., A. Khan, D. Nino-Liu, M.R. Foolad. 2002.A molecular linkage map of tomato displaying chromosomal locations of resistance gene analogs based on L. esculentum X L. hirsutum cross.2002 // Genome 45.P.133-146

201. Zhuang, F.Y., Chen J.F., Staub J.E., and Qian C.T. 2004. Assessment of genetic relationships in Cucumis species by SSR and RADP analysis. Pit. Breed. 123:167-172.

202. Zijlstra S., Jansen R.C. & S.P.C. Groot. The relationship between powdery mildew (Sphaerotheca fuliginea) resistance and leaf chlorosis sensivity in cucumber (Cucumis sativus) studied in single seed descent lines. 1995. Euphytica 81-.P.193-198.