Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ ЦМС И ГЕНОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ РИСА {OTYZA SATIVA L.)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ ЦМС И ГЕНОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ РИСА {OTYZA SATIVA L.)"



На правах руко]

АХМАДИХАХ АСАДОЛЛАХ

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ ЦМС И ГЕНОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ РИСА (Oryza sativa L.)

03.00.23 - Биотехнология 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2006

Работа выполнена на кафедре сельскохозяственной биотехнологии и в центре молекутярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор В С Шевелуха кандидат биологических наук, Г И Карлов

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор С А Гостимский Кандидат биологических наук, А Н Игнатов

Ведущее предприятие ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

ОС'

Зашита диссертации состоится "5 " июня 2006 г в " часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ул Тимирязевская, д 49

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан /ЧаЪ 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Е А Калашникова

Актуальность проблемы. В настоящее время рис является важнейшей продовольственной культурой для более чем половины населения мира. Его значение в продовольственной безопасности увеличивается даже в тех странах, где он не является основной зерновой культурой (БАО, 2005). Среди различных видов растений, на которых коммерчески используются гибриды Б), рис занимает ведущее место. Коммерческое использование гибридной технологии является одним из самых важных применений генетики в сельском хозяйстве. Это имеет не только важное значение для продовольственной безопасности, но оказывает также пользу окружающей среде [Ушпаш й а1., 2003].

Так как рис — самоопылитель, гибридное семеноводство базируется на системе вдггоплазматической мужской стерильности (ЦМС) и использовании генов восстановления фертильности. Среди различных систем ЦМС риса, ЦМС \УА-типа наиболее распространена и используется в производстве приблизительно 90% гибрдиных семян риса [Утпат й а1., 2003]. Выявление различий линий с ЦМС и линий закрепителей, а также идентификация генов восстановления фертильности на основе ДНК маркирования — очень актуально, так как позволяет сократить затраты и ускорить создание таких линий. Идентификация молекулярных маркеров» сцепленных с ЦМС и с генами восстановления фертильности и изучение характерных особенностей, структуры генов восстановления фертильности также имеет очень большое значение.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы являлся поиск и идентификация новых молекулярных маркеров, сцепленных с ЦМС и с генами восстановления фертильности, создание генетической карты для локализации локусов восстановления фертильности ЦМС типа и изучение характерных особеностей, структуры этих генов. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать молекулярные маркеры, сцепленные с ЦМС и позволяющие различать линии с ЦМС и линии закрепители.

2. Идентифицировать новые молекулярные маркеры, сцепленные с геном (генами) восстановления фертильности.

3. С помощью молекулярных маркеров идентифицировать локусы количественных признаков (<ЗТЬ), контролирующих восстанавление фертильности в стрессовых условиях внешней среды.

4. Изучить структуру и организацию генов восстановления фертильности и определить возможный ген- кандидат восстановления фертильности ЦМС \УА -

• типа.

Научная новизна н практическая ценность работы. Идентифицированы ИАРБ - маркеры, сцепленные с ЦМС, которые преобразованы в специфичные ЗСАЫ-маркеры, эффективные при идентификации г°ттпттт"г ТТМГ I ' ' и II I "\й

■--"ргАУ-МСХА

„ О Тимирязева имени К- А- » Железнова

№

закрепителей Секвенирован участок митохондриального гена nad4L в ЦМС линии и тании закрепителя Анализ секвенированных последовательностей, позволяет слетать вывод о возможной роли митохондриального гена nad4L в проявлении ЦМС

Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры, сцепленные с геном R/3 на коротком плече 1-ой хромосомы риса

Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления фертильности R/5 на коротоком плече 10-ой хромосомы риса

Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры тесно сцепленные с геном Rf4 на длином плече 10-ой хромосомы риса Построена генетическая карта данного региона самая точная на настоящий момент

Установлена роль окражаюшей среды в экспрессии признака восстановления фертильности и локализованы два QTL- токуса на 1 -ой хромосоме риса, взаимодействующих друг с другом

Выдвинута гипотеза «необходимости наличия критического чиста (не менее 10) PPR- мотивов в генах восстановления фертильности для функционального проявлении данного признака»

Предтожен комплексный подход классификации генов на основе первичной структуры белковой последовательности На его основе выявлен наиболее вероятный ген - кандидат восстановления фертильности ЦМС WA-типа в ток\се Rf4 - постедовательность ДНК, обозначеннная как RflB Секвенирован участок гена - кандидата RflB в ЦМС линии и линии восстановителя Обнаружено наличие мутации у ЦМС линии и выявлена возможная роть даннаго гена в контроте признака восстановления фертильности ЦМС WA-типа

Апрабации результатов работы. Материалы диссертации были представлены на 4-ой конференции 'Iran-Russian conference on agriculture and natural resources" (Иран, 2004), 3-ем конгрессе по биотехнологии "Biotechnology the state of the art and tuture perspectives" (Москва, 2005), научном конгрессе in \itro biology' (США, 2005), 8-ой научной конференции ' Plant variations and plant genome dynamics" (Германия, 2005), 4-ой конференции " regional biotechnology" (Иран, 2005), 1-ом международном конгрессе 'biotechnology" (Иран, 2005), 13-ои коференции иранских исследователи в Европе (IRCE) (Вликобритания, 2005), 2-ой межд> народной конференции "qPCR" (Германия, 2005), 2-ой коференции "Biotechnology and bioinformatics" (США, 2005), международной конференции ' Bioscience from genes to systems" (Шоттандия, 2005), Международной научной конференции, посвященной 140-тепло Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева (Москва, 2006), научном конгрессе in vitro biology' (США, 2006), 9-ом когрессе ' Genetics" (Иран, 2006)

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликованы 15 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Материалы диссертации изложены на 161 страницах машинописного текста и включает 35 рисунков и 24 таблицы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Список литературы включет 253 наименований, из них 224 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе был использован следующий растителный материал: ЦМС линии риса Neda-A, IR67017-180-2-1-2-A, Usen-A, IR68897-A и их соответствующие фертильные аналоги (линии закрепители) Neda-B, IR67017-180-2-1-2-В, Usen-B, IR68897-B, 7 линий восстановителей фертильности IR24, IR28, Amoll, Amol2, IR36, IR62030 и IR60966, и F2 популяции скрещиваний 7 линий восстановителей фертильности с ЦМС лин^й Neda-A.

Растительный материал выращивали в полевых условиях (на севере Ирана) или в пленочной теплице (селекционой станции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева) в 2003-2005 гг.

Фертильность пыльцы оценивали методом окрашивания пыльцы. ДНК выделяли из молодых листев по методу Saghai-Maroof и др. (1984) с некоторыми модификациями.

Для маркирования ЦМС и картирования генов восстановления фертильности и изучения их структуры использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В работе были использованы 39 SSR- маркеров и 34 RAPD-маркера (Operon, USA). Праймеры, использованные для картирования были подобраны на основе микросателитной карты риса (McCouch et al., 2002). Новые праймеры (32 праймера) разрабатывали при помощи компьютерной программы РптегЗ.О. Амллификацю проводили на амплификатере «Терцик» ("ДНК-технология", Москва).

Клонирование ДНК фрагментов проводили по инструкциям фирмы Promega (USA). Секвенирование фрагментов было проведено фирмой Силекс-М (Москва).

Обработку данных по расщеплению и расчет генетических расстояний проводили с помощью пакета MapMaker/EXP 3.0 (Lincoln et al., 1992). Для анализа сцепления по отдельным маркерам, частота рекомбинации между маркером и Rf локусом была рассчитана, используя метод максимального правдоподобия (Allard, 1956).

Картирование QTL - локусов проводили методами картирования по отдельным маркерам и множественно-интервального картирования при помощи компьютерной

программы Win QTL Cartographer 2 5 (Wang et al, 2005)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Идентификация молекулярных маркеров, сцепленных с цитоплазматической мужской стерильностью WA- типа риса

Для идентификации молекулярных маркеров различающих генотипы ЦМС линий и линий закрепителей, были разработаны 4 специфичных праймера (SCARmtOlF и R, SCARmt02F и R), на основе учатков митохондриальной последовательности АY187000 и AY181205 (Yang et al, 2002) Одна пара специфичных праймеров SCARmtOlF и R при ПЦР дала ко-доминантные фрагменты, различающие генотипы ЦМС линии и линии закрепителя (рис 1)

¿71 Ьр '266 Ьо

Рис 1 Образцы ПЦР - амплификации праймером SCARmtO 1 (S- ЦМС, N-Закрепитель)

Амплифицированные фрагменты с использованием SCARmtO 1 на ДНК линий Neda A, IR68897-A и IR68897 В были успешно секвенированы Результаты секвенирования показывают, что фрагмент ДНК у линий закрепителей на 6 7 п н длинее чем у ЦМС линий (рис 2) Сравнение секвенированнои последовательности локуса SCARmtO 1 у ЦМС линии * Neda-A с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что данная последовательность почти польностью (96%) гомологична участка митохондриальной последовательности риса линии 93-11 (подвида indica) и линии Vipponbare (подвида japónica), а также участку (42 п н) митохондриальнои последовательности пшеницы (Tnticum aestivum), участку (42 п н) митохондриальной последовательности гена tRNA-Asp (tmD-GLC) Ehtngia elongate и участку (45 п н) митохондриальной последовательности табака (\icotiana tabacum)

Neda А 1 AGAGGGAGCAGCTAAAGCAACTGATGCGGTTAATACAATAGTAGTGATACCCACATACCC 60

II III 1 II 1 1 1 II I! II 1 III III 1 1 1 III 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1111 111 1 111 1 11 1 1 1 1

IR63897 А 1 AGAG3GAGCAGCTAAAGCAACTGATGCGGTTAAT-CAATAGTAGTGATACCCACATACCC 59

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1 II 1 II 1 И 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

IR68897 В 1 AGAGGGAGCAGCTAAAGCAACTGATGCGGTTAAT-CAATAGTAGTGATACCCACATACCC 59

Neda А 61 TGCCCCTATGCTTTATGCCAA—GGAAGTGAGAGCACCTGGTTTGAATAT3TAGGTTCGAT 119

1 1 II 1 1 II 1 1 1 1 II 1 1 II 1 1 1 III 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II III 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1

IR68897 А 60 TGCCCCTATGCTTTATGCCCAAGGGAAGTGAGAGCACCTGGTTTGAATATGTAGGTTCGAT 123

III II 1 1 1 11111111 II 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 III 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1

IR68897 В 60 TGCCCCTATGCTTTATGCCAA—GGAAGTGAGAGCACCTGGTTTGAATATGTAGGTTCGAT 118

Neda А 120 AGG-ACCTGG-AAGCAGCAG-ATAGGTTT-TAG-TGAAAG-ATGGGCTTGT—TTTCCAA 171

III 11 1 1 1 11 II 1 1 II 1 III 1 11 1 1 III 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111111 1 1 1 1 1 1 1

IR68 8 97 А 121 AGG-ACCTGGAA-GOAGCAG-ATAGGTTT-TAG-TGAAAGA-TGGGCTTGT—TTTCCAA 172

III 1 II 1 11 II 11111 1 1 1 1 1 1 1 1 II III 1 1 1 1 1 1 1 III 1 1 1 1 1 II III

IR68897 В 119 AGGTACCTGGAAAGCAGCAGTATAGGTTTGTAGTTGAAAGAATGGCCTTGTCTTTCACAA 178

Neda А 172 TAAGTTCTATTGCTTTGACACATTTAGTATATAACTGAATAGAAAACGGAATAAAAGCGGA 232

1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

IR68 8 97 А 173 TAAGTTCTATTGCTTTGACACATTTAGTATATAACTGAA7AGAAAACGGAATAAAAGCG3A 233

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

IR688 97 В 179 TAAGTTCTA'EJTGCTTTGACACATTTAGTATATAACTGAATAGAAAACoGAATAAAAGCGGA 239

Neda А 233 TAAGATAGCGTATTAGGCCGACAAGTAGGAAGCA 266

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 II II 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 11

IR68897 А 234 TAAGATAGCGTATTAGGCCGACAAGTAGGAAGCA 267

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

IR68897 В 240 T AAGATAGCGTATTAGGCCGACAAGTAGGAAGCA 27 3

Рис. 2. Сравнение митохондриальных фрагментов 2-х ЦМС линий (Neda-A и IR68897-A) и линии закрепителя (IR68897-B), амплифицированных парой SCAR-праймеров SCARmtOl. »>: прямой праймер; «<: обратной праймер.

1.1. RAPP-анализ

В RAPD- анализе, 4 из 34 праймеров выявили полиморфизм между линией ЦМС Neda-A и ее фертильным аналогом закрепителя Neda-B. Праймеры ОРА09, ОРА14, ОРС02 и ОРС05, с высокой воспроизводимостью выявляли полиморфные фрагменты между двумя изогенными линиями. ОРА09 и OPA 14 амплифицировали специфичные фрагменты для стерильной линии, длинной ~200 п.н и -800 п.н, соответственно. Однако ОРС02 и ОРС05, амплифицировали один полиморфный фрагмент (~270 нп и -500 нп) только у ЦМС линии Neda-A. Для идентификации RAPD маркеров и их ассоциации с цитоплазмой мужской стерильностью, ДНК от стерильных линий и их линий закрепителей была амплифицирована с 4 полиморфными RAPD -праймерами. Только один RAPD-праймер (ОРС05) амплифицировал фрагмент, размером ~500 п.н, специфичный для 4-х линий ЦМС (рис. 3).

Рис 3 Образцы ПЦР- амлификации RAPD-праймером ОРС05 PI Neda-А и В РЧ IR67017-180-2-1 -2-А и В, PIO Usen-A и В, PI 1 IR68897-A и В Стреткой показан потаморфный бэнд

При амлификации ДНК 4-х ЦМС линий и таний закрепитетей с использованием комбинации RAPD- праймеров серии А (ОРАО 1-04) и серии В (ОРВ02 04), всего 12, пара праймеров ОРА01-ОРВ04 выявита полиморфизм между ЦМС 'шниями и линиями закрепите 1ями Комбинация ОРА01-ОРВ04 амппифицировала полиморфный фрагмент размером ~370 п н, специфичный для ЦМС линий (рис 4)

Рис 4 Образцы ПЦР- амлификации комбинации RAPD-праймеров ОРА01-ОРВ04 1 2 Создание SCAR- маркеров

Полиморфные RAPD- маркеры ОРС05<оо и А01-В043-, были испочьзованы дтя ктонирования Только RAPD- маркер А01-В043-э быт успешно клонирван и секвенирован(рис 5)

Сравнение секвенированной последоватетьности токуса А01-В043- , специфичного для ЦМС линии с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что данная последоватетьность почти польностью (372 376

99%) гомологична участку митохондриальной последовательности риса линии 9311 (подвида indica) и линии Nipponbare (подвида japónica), а также участку 5'-конца митохондриального гена nad4L риса (347/350 п.н; 99%), участку (351/376 п.н; 93%) митохондриальной последовательности псевдогена rpsl9-nad4L пшеницы и участку (36 п.н) митохондриальной последовательности кукурузы (Zea mays).

1 CAGGCCCTTC AATGCCTCCC TCCGGTATCC ACTAACTCGG AAGAGCTATT CATAAGGTTT 61 TCTGGCTGAC TGTGAGGACA CCTCTGCATC CCAGGGAGCA GACCGCTCCC CCGGAAGCTG 121 TGGTCAGTCA AGAGCGGCAT CCGAATCCCG CTCCAATCCC TGGAGCGGCC GCGGAAGCAG 181 CAGAACCCTC CTTCTTTTTC TTGGGAGGGA AACGACCTCT CTCTCTTTGA AAGGAAAGTT 241 CTCTACAAAA GGCCCGCGCC TGTCACGCCC AGATTCTGGA CACATTGCGT GATATTACTC 301 GAAGAATGGA GAGGAGCTCC ATGAAGAAGA TCTATCGCAC CATGCTTGAT TTCATGTTGA 361 GCCGACTCCA GTCCAA

Рис. 5. 5'-3" последовательность RAPD- фрагмент A01-B0437o.

На основе секвенированной последовательности локуса А01-В04370 и фланкирующих ее митохондриальных последовательностей (линии 93-11), были разработаны 6 специфичных праймеров: три прямых- и три обратных. Возможные комбинации синтезированных SCAR- праймеров показали различную эффективность при идентификации ЦМС линий и линий закрепителей (рис. 6).

Пара специфичных праймеров SCARmt03F - R при ПНР дала ко-доминантные фрагменты, различающие генотипы ЦМС линии и линии закрепителя (рис. 6). Амплифицированный фрагмент праймерами SCARmt03F - R у всех ЦМС линий был длинее, чем у линий закрепителей (рис. 6).

03F-R 04F-R 05F-R

CMS N CMS N CMS N

Рис. 6. Образцы ПЦР - амплификации SCAR- праймерами, разработанными на основе последовательности локуса А01-В04370. (N- линии закрепителя).

Фрагменты, амплифицированные парой SCARmt03F-R у ЦМС линии Neda-А и линии закрепителя Neda-B былы использованы для прямого секвенирования (рис. 7). Сравнение секвенированной последовательности этого локуса с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что фрагмент ЦМС линии гомологичен участку 5'- конца митохондриального гена nad4L риса (349/354 п.н; 98%), а фрагмент линии закрепителя - также гомологичен участку

5 - конца митохондриального гена nad4L риса (353'354 п н, 99%)

0PAQ1

K.d«S 1 CCCCCCTCCCA-TCGCTCCGJlTGCGCaLCCA.CCCCCTTCJUirCCCTCCCTCCCI>-41CCA lllllllllll Hill II II I IIIIII I II II IIIII I II II II 1 II II 1 in Hill W.d»A l tK0CC0tCC5iCT(ratCl^iara0ILCCACCCCCITCJUlI(^TCCCTCCCCTIl.ICCJl

H»d>B S9 CTAACTCCGAJüGAGCTATTCA-AACÄTTTTCTGGCTGACTGTCAGGACACCTCTGCATCC 11 11 111 111 II II II I 11 II II IUI I II II I 11 11 I II 11 II I II 11 I 11 II I 11 II M»dmA «1 CTAACTCGGAACA£C7ATTCATAAGGTTTTCTGGCTkA.CTCTGACCAnACC'rCTGCATCC

Hftd&B US CA CG AjSCAGJ^CGCTCCCCCGGAJU^CTGTCCTCAGTCAAGAGCGGCArcCGAATCCCGc II II II 11 I II 11 II I 11 II I IUI II I II II I II 111 II Ii I II II 11 I 11 IM 11 11 N.d»A 121 UKCACCAGAECCCTCCCCCGGJLJLC-CTSTCCICAGTCJLAIACCJÜCATCCÍAAICCCa:

N»c!»B 177 ТССЛ>ТСССТСОАЕССССССССЫии;САСААСАСАА.!;ССТССТТСТТТГГСТТОО<;АЕа;

lili I II II I II II II I lili I II II II III II III II I IUI II I IUI I II II lllll HedJÜL 181 TCCAATCCCTCGAGrcGCCGCGCAA£CACAACACAACCCTCC7TCTTTTTCTTGCCA£GG

H«S»B ¿.37 >£GACCTCTCTCTCTTTGAAAGCAAACTTCTCTACAAAAGCCCCGÍ GCCTGTCACGCCCA 11 11 I II II I II II 111 II II I II II II 111 11 I 11 11 I 11 11 II I 11 11 I 11 II I 11 11 N«d»A ¿41 »CCiCCTCrCICTCTrtC^JAGOlÜUlCITCTCTXCJLIJLACKCCCCCOCCTOICJlCCCCCA

N.daß ¿37 CACTCTC^CACATrGCGTGATATTACTCTGJ^GAATCG^AGGJiGCTCCATGAAGAAGA 11 II I II II I 11 II II I II II I 1111 II 1 И 11 I II II I 11 I I II I I И I I II II I II 11 NcdaA 301 GArrCTÜGACAJrATTCCCTCATATTACTCTGAAGAATCGACACCAGCTCCATCAAGAAGA

H«d*S 3S7 CTATCGCACCATGCTTCATTTCATGTTGACCCATCCCCAGTC^GACCr*CAATCCCCGGGC II II I II II I II II II I II II I II II II I II I I lllllll I I II II II III I II II »•<ил 361 CTATCGCA£CATC£TTGATrTCATCTTGAGCCCACTCCAGTCCAACGTCAATCCCCGGGC

ОРВСИ

H.d»ß 417 ССТСЛ 421 II II 1

H«d*A 421 CCTGA 42S

Рис 7 Сравнение митохондриальных фрагментов ЦМС тинии (А-пинии \eda-A) и тинии закрепителя (Neda-B), амплифицированных парой SCAR-праимеров SCARmt03F-R в тою/се QPA01-OPB04

Сравнение секвенированных последовательностей локуса SCARint03 у LUV1C тинии Neda-A и ее линии закрепитетя \'eda-B показало, что у тинии закрепитетя в данной постедоватетьности произошли делеции (4 п н в разных местах) и замены основании (4 п н) в том числе 2 в сайте отжига RAPD-маркера ÜPB04 Поэтому из за отсувствия полной комплементарности локуса сайта RAPD-маркера ОРВ04 v тинии закрепитетеи, при ПЦР с комбинацей пары праймеров OPA01-OPBÜ4 данный фрагмент (-370 п н) не амплифипируется (рис 7, также см рис 4) Наличие таких м\татцей указывает на возможную роль гена nad4L в проявлении ЦМС WA- типа у риса

2. Тип наследования фертильностн

Гест на определение фертильности пыльцы показал, что отцовские тинии IR24 IR28 IR36, IR62030, IR60966, Amoll и Ато12 являются сильными тиниями восстанавителями, так как они потьностью восстанавливали фертитьность поточенных гибридов Fi (табл 1)

Анализ расщептения F; попутяций показал соответствие 3 (фертитьных) 1

(стерильное) растений, что указывет на моногенный контроль восстановления фертильности в соответствующих отцовских линиях. Однако, в Р2 популяции скрещивания Не<1а-А/1К24 выделено 15 (фертильных):! (стерильное) растений, что указывет на существование двух независимых доминантных генов восстановления фертильности в отцовской линии. В Р2 популяции скрещивания №с1а-АЛК36, выращенной в Иране выделено 3 (фертильных): 1 (стерильное), а в теплице РГАУ-МСХА - 9 (фертильных):7 (стерильных) растений, что указывет на возможное существование двух генов, взаимодействующих комплементарно в стрессовых условиях (табл. 1).

фертильность пыльцы (%)

скрещивание (Среднее значение ± БЕ)

и, т2 Расщепление

№<1а-А/Ш24 87.6 ±2.19 77.7±4.08ъ (Х2,5:1=0.2Г8)

№с!а-А/ПШ 85.5 ± 1.64 64.4 ± 5.09' (Х23:,=0.002°")

Ыес1а-А/Ж36 86.3 ± 2.25 61.8 ± 5.27а 49.3± 5.04ь (Х23:,=0.08П5) (Х2,:7=2.10П!)

Ке<1а-АЛК62030 84.7 ± 1.96 52.7± 5.46" (Х2З:,=2.51П5)

Ыес1а-А/ге.6096б 81.8 ± 1.74 59.4 ±5.42' (Х23:,=0.29П5)

Ке<1а-А/Ато11 83.9 ± 1.39 69.8 ± 4.92' (Х2з;1—0.98"'5)

Neda-A/Amol2 85.5 ±2.15 65.6 ±4.63' (Х23:1=0.29п5)

* и : выращенная в Иране и в Москве, соответственно.недостоверное на 5% уровне. 5Е= стандартная ошибка.

3. Картирование гена восстановления фертильности ЯП. действующего в нормальных условиях в популяции №<1а-А х ГО36

В Р2 популяции скрещивания №<За-А х Ш36, выращенной в полевых условиях на севере Ирана, выделено 143 фертильных и 50 стерильных растений, что соответствует соотношению 3:1 (х2фмгг= 0.08, х205= 3.84; табл. 1) и указывает на моногенный контроль восстановления фертильности.

Маркеры КМ171, 1Ш3773, 1Ш311, 1Ш6100, ИМ6128 и АВ443 (на 10-ой хромосоме), ЫМ1, 1Ш140 и ЯМ7180 (на 1-ой хромосоме) и ЯМ1335, ИМ1209 и ЯМ3555 (на 7-ой хромосоме) показали полиморфизм между №с1а-А и Ш36. Однако, ВЗА-анализ показал, что два ББЯ маркера - ИМ1 и 1Ш7180, и КРЬР-ПЦР маркер, 1Ш140, на 1-ой хромосоме обнаружили полиморфизм между стерильными и фертильными группами. Эти маркеры были картированы в Р2 популяции и было рассчитано их растояние до гена Я/З составляющие 2.7, 2.0 и 25.0 сМ, соответственно (рис. 8).

RM! R3140 ДО RM7 ÎO chrj s i i_l__

Рис 3 Генетическая карта Rfl - региона на 1-ой хромосоме риса 4 Обнаружение QTL-tokvcob восстановления «Ьертнльностн в стрессовых условиях внешней среды

Аномальное расщепление наблюдалось в F; популяции скрещивания Neda Л х IR36 выращенной в теплице селекционной станции РГАУ-МСХА. в г Москве (табл 1) Расщепление в F; соответствовало соотношению 9 7 (/фак1^ 2 10, <

3 84, табл 1), что указывает на участие двух генов, взаимодействующих комплементарно в стрессовых условиях

4 1 Множественно-интервальное картирование QTL-iokvcob восстановления фергнльности

Два главных QTL-локуса (M-QTLs) было обнаружено для восстановления фертильности в изучаемой популяции с достаточно высокими LOD порогами Первый QTL (qFerl-1) с LOD> 18 находится близко от RG140, и второй (qFerl-2) с относительно низким LOD порогом (LOD=2 96) близко от RM7180 на 1-ои хромосоме (табл 2, рис 9) Эти два M-QTL, соответственно, ограничиваются интервалами между маркерами RG140-RM7180/pA и RM71S0/pA -RM6100d

Таблица 2. Параметры, полученные методом MIM, для каждого QTL-юкуса.

QTL Ьтижаишии маркер LOD QTL Pos Len Ve 1%) ^ффelcт da 1 1

a d a(°«> d(%)

qFerl 1 RG140 1S 85 10 3 90 61 9 40 47 4 S7 62 1 56 U 12 1

qFerl-2 RM71S0 2 96 36 4 54 43 S -19 20 57 44 11 9 38 2 2 99 i

С\чма 21 81 93 97 1

Pos почиция QTL Len— длина QTL, Ve — обуславливающий процент от оощеи изменчивости а аддитивный d= доминантным d а—степень доминирования

Множественно-интервальное картирование (MIM) показало, что qFerl-1 об\сювливает -62 %, и qFerl-2, ~44 % от общей изменчивости признака qFerl-1 имеет более высокий аддитивный эффект, чем его доминирующий эффект Это свидетельствует о том, что действия этого QTL аддитивное (da — 0 12), и напротив, qFerl-2 имеет относительно средний отрицательный аддитивныи зффект и высокий доминирующий эффект на признак, что указывает действия этого QTL как сверхдоминирование в противоположном направлении от первого QTL (d'à -2 99) В целом, эти два QTL обусловливают ~940/о от общей изменчивости признака восстановления фертильности (табл 2)

Рис. 9. Графический результат обнаружения самых вероятных QTL-локусов, вызывающих восстановление фертильности методом MIM. 4.2. Анализ взаимодействия между обнаруженными QTL-локусами fl-OTLs) Результаты MIM показали, что два обнаруженных QTL, имеют достоверное аддитивное взаимодействие друг с другом. Но, это взаимодействие имеет отрицательный эффект (-59.3%) на экспрессию признака в стрессовых условиях, так, что число стерильных растений в F2 популяции увеличивается. Только этой причиной возможно объяснить отклонение наследования признака от соотношения 3:1.

5. Идентификация и локализация гена Rf5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров в популяции Neda-A х IR62030

На этой популяции маркеры локусов RJ3- и Щ4- генов не выявили полиморфизм между двумя стерильными и фертильными группами растений F2.

Только, SSR- маркер RM311 сцепленный с локусом Rß- гена показал полиморфизм между Neda-A и IR62030. Этот маркер не только выявил полиморфизм между стерильной и фертильной группами растений, но и также продемонстрировал высокую корреляцию с геном восстановления фертильности в

и

F. популяции Анализ сцептения показал, расстояние SSR маркера RM311 до RJ5 составило 2 9 сVI (рис 10)

Результаты картирования с использованием SSR- маркера RM171 показали, что он находится на расстоянии 40 5 сМ от RM311 Расстояние RM171 до Rß- гена составило 37 6 сМ (рис 10)

RM3H SP RM 171 ChrlOS -j-j-1-

ч— 29 —- 376 -

Рис 10 Генетическая карта Rf5 региона на кротком тече 10-ой хромосоме риса в пои\ ляиии F-. скрещивания Neda-A/[R62030

6. Идентификация и локализация гена Rf4 и сцепленных с ним ДНК-маркеров в популяции \eda-A \ Amoll

6 1. Идентификация гена Rf4 v линии Amoll и картирование региона Rf4- генл

Для обнаружения гена восстановления фертичьности v Amoll, на первом этапе отобрали 21 микросателитный праймер и RFLP- ПЦР маркер RG140 Среди них семь маркеров выявили полиморфизм между Neda-А и Amoll Микросстелитные маркеры RM228, RM171, RM5841 и RM304 на длинном птече 10-ой хромосомы не голько показали полиморфизм между Neda-A и Amoll но и также показали сцептение с геном восстановления фертильности RJ4 Расстояния дв\ч самых близких SSR маркеров, RM171 и RM304, от R/4 были 3 2 сМ и 2 1 сМ соответственно (рис 11 и 12)

Так как RJ4 ген был картирован между этими маркерами, нами были выбраны дополнительные SSR- маркеры на генетической карте риса [McCouch et al , 2002] и разработаны новые праймеры на основе последовательностей ДНК в этом регионе

Праймеры, созданные на основе #/7,!-последовалельносли (SPRFA01 03) не выявляли полиморфизм между родительскими линиями даже после рестрикции с 14 рестриктазами (CAPS- маркеры) Однако BS А- анализ с другими маркерами показал, что один SSR маркер, RM6737, находится в этом регионе и был тесно сцеплен с Rf4 геном на расстоянии 1 6 сМ (табл 3, рис 12)

Кроме вышеупомянутых маркеров, два разработанных нами праимера на основе последовательности ABl 10443, называнные АВ443 F и R, обнаружили полиморфизм между двумя родителями и амплифицировали два полиморфных фрагментов ДНК, специфичных для стерильной тинии, размерами -400 и ~^00 п н соответственно Они были тесно сцеплены с рецессивным г/4- аллелем (рис 11 ) на расстоянии -0 5 и 1 03 сМ, соответственно (табл 3, рис 11 и 12)

Таблица 3. Частоты рекомбинации и генетические расстояния между

Лок\с Частота рекомбинации (%) в стери чьной группе Частота рекомбинации(%) среды всех гомозиготных растений Генетическое расстояние (сМ) ШП 1 порог | 1

ЯМ228 13 28 12 25 12 77 13 86 (

КМ5841 7 03 6 63 6 67 19 41

ЯМ171 3 13 3 06 3 16 23 76 |

1Ш304 2 34 2 04 2 05 25 28 ;

11М6737 1 56 1 53 1 55 26 14

•ЧВ443-500 , 0 51 1 03 1 03 27 07

■\B443-400 0 0 051 ' 051 28 13

П Р' ВР ь * 4 ^ р р р р М

Р1 Р2 ВЬ ВР Ч Ч s Р Ь Р м

Рис 11 ПНР- амплификация ЯЙИ маркера ИМ 171 (стева) и АВ443 (справа) у дв\\ родитетьскич тинии, двух стерильных и фертитьных гр>пп и 8 гомозиготных стершьных и фертильных растений Я; популяции Р1, ЦМС- тиния ^¿а-А Р2 фертичьныи родитель Ашо11

2

Рис 12 Высоко- разрешающее картирование Я/4 гена на длинном плече 10-ой хромосомы риса

6 2. Физическая локализация Дгена

Для определения физической токализации ¡1/4- гена и сцепленных с ним маркеров

использовали пакет BLASTN в базе данных геномной последовательности ДНК сорта 93-11. Этот поиск дал возможность идентификации контигов, несущих сцепленные с ним маркеры от маркера RM6737 на одной стороне (центромерной) до маркера АВ443 на другой (теломерной). Сравнение последовательностей праймеров SSR- маркера RM6737 и праймеров АВ443 с последовательностью сорта 93-11 показало, что последовательности прамеров SSR- маркера RM6737 находятся в Ctg030205, а последовательности прамеров АВ443 в Ctg030228 (рис. 13). Физическая карта, построенная h¿ основе этих данных состояла из 15 контигов, охватывая ~206 т.п.н подвида indica риса.

Так как общей характерной особенностью Rf- генов растений является кодирование пентатрикопептидного (PPR) белка, имеющего в своём N-конце последовательность, необходимую для транспорта в митохондрию (Bentolila, 2003; Akagi et al., 2004), этот регион был проанализирован на наличие таких генов компьютерными пакетами MitoProt II и Pfam 11.0.

Результаты этого анализа показали, что среди 45 генов в этом регионе, только пять генов, включая OsIFCC036677, (MFCC036680, OsIFCC036693, OsIFCC036694 и OsIFCC036695, соответственно, на контигах Ctg30207, Ctg30216, Ctg30225, Ctg30225 и Ctg30227 удовлетворяли критериям характерным для Rf-генов (рис.13).

" RM67374-■--206 kbp-►АВ443

30207 .... 30216

30225

30227

30228

OsIFCD036693 OsIFCD036694 OsIFCD036W5

OSIFCD036677 OsIFa)036680

m *

Num.ofPPRs: И PPR 5 PPR 16 PPR 14 PPR 16 PPR

Рис.13. Структура фрагмента ДНК, несущего маркеры, сцепленные с Rf4- геном на

10-ой хромосоме риса подвида indica. 7. Классификация генов, находящихся в ДНК фрагменте, несущем молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления фертнльности ЦМС WA- типа

Как доказано исследователями [Bentolila, 2003; Akagi et al., 2004] все гены восстановления фертильности (кроме RJ2 гена у кукурузы) кодируют PPR-содержащий белок с высокой вероятностью экспорта в митохондрию и имеют в N-конце полипептида последовательность, необходимую для транспорта в митохондрию. У риса имеются ~600 генов, кодирующих PPR- содержащие белки (Wang et al., 2006), функции которых неизвестна. Все эти гены не могут быть генами восстановления фертильности. Классификация генов, на основе их

^ ^ ^ ^ 5 ^ г ¡^ ? « - й ж ¡га к: а? а ь; • Й §2 й й

ср о о о < о о; о «=> са £3 о с2 сЗ о сЗ о <3 о сЗ сЗ 3 о гЗ ЬЙ

Рис. 14. Графический результат обнаружения мотивов комбинацей программ

МЕМЕ-МАБТ.

структуры и организации при помощи компьютерных программ и баз данных-полезный метод для классификации генов.

В нашей работе, в базе данных ~90 генов были идентифицированы в регионе между SSR- маркерами RM304 и RM1108. Из них, 32 гена имели в N-конце белка последовательность, необходимую для транспора в митохондрию и только 25 имели >50% вероятности экспорта в митохондрию. В дальнейшем использовали эти 25 генов и два гена линии IR24, RflB и RflA {RflA - ген восстанавления фертильности ЦМС ВТ-типа, который был недавно клонирован [Komori et al., 2003; Akagi et al., 2004]), в качестве контроля. Эти гены были проанализированы програмным обеспечением MEME, и его результаты суммированы с использованием программного обеспечения MAST (рис.14). При комбинировании программных обеспечений MEME и MAST, был идентифицирован 71 мотив. Затем, изучаемые гены классифицировали UPGMA - методом на основе наличия или отсутствия и частоты полученных мотивов.

I S 10 15 20 25

ей

Си

о.

H

В-2^

Gene

Osircc...

036693 036(93 ИЩГО11

036694 RtlBtIR2«ï 0.1667?

. OJ6710 03«720 036711 036660 f036719 036724 036665

036735 036692 036669 03 67 IS 036726 03 6731 03 6722 036691 0366B6 036675 036739

036736 03 6729

Ч036669

Рис. 15. Распределения изученных генов (UPGMA - методом), находящихся между SSR-маркерами RM304 и RM1108 на дленом плече 10-ой хромосоме риса.

Результаты классификации представлены на рис 15 Гены кластеризовались в две группы, А и В 6 генов кластеризовались с /?/7А, группа А которую можно разделить на 3 подгруппы

Для дальнейшего изучения мы провели поиск известных белковых мотивов лежащих в основе функции всех 92 генов Для этого, использовали базу данных Р1ат, которая идентифицирует структуру белков Из 92 изучаемых генов распологаемых в этом регионе, только 10 имели РРЯ-содержащий белок Частота встречаемости РР11- мотивов в зависимости от гена варировала (табл б)

Таб шца 6. Частота встречаемости РРЯ- мотивов в белковои последовательности.

| Частота 1 встречаемости Ген | РРЯ мотивов Класс Ген Частота встречаемости РРК- мотивов К лас, |

16 а 1 ОЗ№ССО*66Ч4 14 а: 1

яп в 14 а 2 Оз1РСС0366У5 16 а 1

СЫРССО чбб80 | 5 в 1 ОзГРССО^б^Ю 10 1

ОьШССО^бб-'' 1 11 а 3 о5шссозб7;о 3 в 1

ОБШССО^бб"?* 16 а 1 ОзШСС036721 3 в1 1

Сравнение дендрограмы рис 15 с данными табл 6 показывает, что Ь РРК-содержащих генов сорта 93-11 плюс два РРЯ-со держащих гена линии 1И24 (табл 6) группировались в два различных класса (группа А и группа В-1, рис 1^) из них 6 генов кластеризовались с ранее клонированным геном восстановления фертильности ЦМС ВТ- типа, Я/1 А, и 3 кластеризовались в группе В-1

Сравнение дендрограмы рис 15 с данными в табл 6 указывает, что частоIа встречаемости РРК- мотивов увеличена у 7 генов (5 от линии 93-11, 2 от шнии 1И24) которые кластеризовались в группе А (А-1 А-2 и А-3) по сравнению с 3 ми генами кластеризованными в группе В-1 Как минимум 10 РРЯ- мотивов имеются в генах группы Лав генах группы В-1, максимум 5 Это позволяет выдви^ть гипотезу что наличие достаточно многих (не менее 10) РРЯ- мотивов необходимо для функционального проявления генов восстановления фертильности

8. Идентификация наиболее вероятного гена - кандидата восстановления фертильности ЦМС УУА-тнпа

Д тя идентификации самых вероятных генов - кандидатов восстановления фертильности ЦМС \УА- типа мы сравнивали результаты предложенного мелола классификации, с результатами картирования генов восстановления фертильности различных систем ЦМС

1) Ген восстановления фертильности Rfl для ЦМС ВТ был картирован между двумя RFLP- маркерами С1361 и S12564 (Komori et al., 2003)] и клонирован несколькими группами (Kazama et al., 2003; Komori et al., 2004; Akagi et al., 2004)]. Akagi и др. описали этот ген как Rfl А (рис. 16В).

2) Два гена восстановления фертильности ЦМС HL были картированы на длинном плече 10-ой хромосомы риса (Liu et al., 2004). Rf5 был картирован между двумя SSR маркерами RM1108 и RM3150, a Rf6(t) между SSR маркером RM6737 и RAPD маркером SBD07 (рис. 16 В).

3) Ген восстановления фертильности Rf4 для ЦМС WA- типа был картирован между двумя маркерами Y3-8 (0.9 сМ) и Y1-10 (3.2 сМ) (Zhang et al., 2002). Y3-8 совпадает с местоположением SSR маркера RM171, и Y1-10 совпадает с местоположением SSR маркера RM304 (Wang et al., 2006).

А.

a g; a f= S

s s 40 § r £3

S s s

Rf4 (VVA)

Rf5 (HL)

Рис.16. Сравнение результатов классификации, проведенной нами (А), с результатами картирования некоторых Rf- генов различных систем ЦМС на длином плече 10-ой хромосомы риса (В).

4) В нашей работе результаты картирования в F2 популяции Neda-А X Amoll, показали, что ген восстановления фертильности ЦМС WA также расположен в

данном регионе, что соответствует данным Zhang и др (2002) Мы картировали Щ4 ген между RM304 и RM17I, и при более точном картировании между RM6737 и АВ443-400 (рис 16В)

Как показано на рис 16В, в данном регионе (от RM304 до RM1108) среди 90 генов только восемь генов кодируют белок с несколькими тандемными PPR-мотивами Однако результаты классификации белков изучаемых генов как показано на рис 16А, показали, что только пять генов принадлежат классу Rf генов (класс А в рис 16А)

Класс Л-1 состоит из двух генов OsIFCC036693 и OsIFCC03b6Q5 классифицируемых с Rf] 4 (9311- аналог OsIFCC036695) Поэтому, этот класс можно определить как ЦМС ВТ- класс Класс А-3 состоит из двух генов OsIFCC036677 и OstFCC036710, где картированы R/5- и Rf6(t)- гены для ЦМС HL соответственно [Liu et al, 2004] Поэтому, этот класс можно определить как ЦМС HL- класс Оставшийся ген, OsIFCC036694, кластеризован с его IR24- аналогом RUB в классе А-2 Поэтому, этот класс можно определить как ЦМС WA класс

На основе сравнений между результатами экспериментов картирования и результатами разработанного нового метода классификации, можно делать вывод что RflB (или его аналог у линии 93-11, OsIFCC036694) - самый вероятный ген -кандидат восстановления фертильности ЦМС WA- типа В дополнение к itomv выводу, в этом подходе также было возможно идентифицировать самые вероятные гены - кандидаты восстановления фертильности ЦМС HL типа Поэтому OsIFFC036677 и OsIFCC036710 - самые вероятные гены - кандидаты для генов Rf5 и Rfóft), соответственно

9 Изучение роли гена- кандидата RflB в проявлении восстановления фертильности

Для изучения возможной роли RflB- гена в проявлении признака восстанов 1ения фертильности былы созданы специфичные праймеры (табл 7) на основе его последовательности у линии IR24 (ABl 10443 в ГенБанк)

| RflB- гена.

Название 5 -3 последовательность

A (F) atgtggtgtcgtacagcaccg

A (R) gcacaatactattatatgtcatgca

В (F) tgagcagatgatcgatgaagga

В (R) gttctgaaacatccgaagtgcat

В ПЦР анализе с парой А- праймеров, ДНК фрагмент, амплифицированный на фертильных линиях Ш24 и Ашо11, был длинее на -10 п н, чем у ЦМС линии \eda-A (рис 17) Однако, в случае пары В-праймеров, полиморфизм не

наблюдался. В случае комбинации А-В праймеров, амплифицировались полиморфные фрагменты между А- линией и линиями восстановителями (рис. 17).

Рис. 17. ПЦР- амплификация специфичными праймерами RflB- гена.

днк фрагменты, амплифицированные на ДНК трёх линий парой А-праймеров былы успешно секвенированы (рис. 18).

СТА—CCeGCTTGTTCJLJLGTGGGOG-TTCGC-iCJUUG-CTTACAG-T-JLCi.TJlCACATO III ШПШШШШШ Hill IIIIII lllllll I llllll III) CTACGCCGGCTTGTTCAAGTCGCOOCTTCGGCACAAAGGCTTACAGCTCACATAC-CATG

-AAATG-CTTG-AGCAGAGGGAT-TTCTACCAGAJLTGT--GTGACCTTACAACTCTATTA

II I II II I I II III II III II III I I I I I I I I I II I I III I I II I I I I I I TAAATGTCTGGTAGCAGAGGCATCTT-TACCAGAATGTCTGTGAC-TTACAACACTATTG

TTCGCTGCCCTTGTGCAAGGCTCAAGCTATGGACAAGGCCATGGAGGTACTTAACACCAT

I lllllll 1ПШ1ШШШ11ШП lllllllllll lllinini II

T-CGCTGCC-TTGTGCAAGGCTCAAGCTATGGATAAGGCCATGGATGTACTTAATAGGAT

GGTTAAGAATGGTGTCATGCCTGATTGCATGACATATAAT-GTATTTGTGC 217 111II II 11111 llllllll II1111111 11111 1111 llllllllll GGTTAAGAATGGAGTCATGCCCGATTGCATGACATATAATAGTATTTGTGC 22 6

Рис. 18. Сравнение секвенированных последовательностей локуса А- праймеров, специфичных гену RflB, линий Neda-A (ЦМС) и Amoll.

Сравнение секвенированной последовательности этого локуса с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что ДНК фрагмент ЦМС линии гомологичен участку (197/226 п.н; 87%) гена RflB риса линии IR24, MTC-10R, Minghui63. Сравнение секвенированных последовательностей локуса А- праймеров у линии Neda-A и линий восстановителей Amoll и IR24 показало, что у ЦМС линии в данной последовательности произошло несколько делеций (в разных местах), вставки и замены оснований, но количество делеций больше чем вставки и поэтому ДНК фрагмент ЦМС линии короче на 9 п.н по сравнению с фрагментом линии Amoll (рис. 18).

Наличие таких мутаций в изучаемом локусе А- праймеров, а также наличие

NedaA 1

Amoll 1

NedaA 54

Апю11 60

NedaA 106

Amoll IIB

NedaA 168

Amoll 176

других возможных мутаций в последоватетьности данного гена (как показано в рис 17 при комбинации двух праймеров), в конечном счете вызывает сдвиг открытой рамки считывания, и синтезу дефектного белка у ЦМС чинии

Полученные выше нами результаты указывают на возможную рочь гена ЯП В в контроле экспрессии признака восстановления фертильности ЦМС V типа Данный ген скорее всего можно считать геном - кандидатом контролирущим восстановление фертильности ЦМС в \УА-системе

Структура данного гена показана на рис 19 Сигнальная гюс чело вате тышсть необходимая для транспорта белка в митохондрию ноходигся в М-конце В состав гена - кандидата ЯП В входят 3 мотива мотив 3 в \-kohul мотив 1, 17 копии, 16 из которых тандемно расположены в постедовате 1ьности гена и мотив 4 в С- конце А

ИАДЕА АЗШиСА1Д5Е&310СК&ОКШС5РОСАЫ)А1ЩУГ Мо^З

Дррси>ВР

Hoti.fl

НЕЗ ЬЕАЗТАЗЬГЮ ЬI, Э ЭОК УОЕТОР ГЬРЕКУКЗГ МоО.£4

.Н... С.. РВ. .ТУН. 1.1. ИСК. Я*. .ЕА.. ЬЕ. .Н\ГК. вУ. РОТУТЭТДЫ. И,СК. ОИ-ЕСАНЕи. ЕНУЮЮСКРОТХТТНШНШГСКЕОЯТОЕАИЕЬКН

В

ялв нг

Н0Т1Г1

Рис 19 (А) Структура гена - кандидата (Я/1В) восстановления фертильности ЦМС \VA-rnna Оснавания, одинаковые с консенсусным мотивом 1, показаны темно-серым цветом (В) консенсусный мотив данного гена, консенсусный мотив ктасса генов восстановления фертильности (ЯР) и мотив 1 показаны в нижной части

выводы

1. В митохондриальной последовательности ДНК риса выявлен полиморфизм, на основе которого при помощи молекулярных маркеров можно различать генотипы ЦМС линий и линий закрепителей. Для выявления генотипов ЦМС линий и линий закрепителей созданы специфичные SCAR- маркеры.

2. Секвенирован участок митохондриального гена nad4L ЦМС линии и линии закрепителя. Анализ секвенированных последовательностей, позволяет сделать вывод о возможной роли митохондриального гена nad4L в проявлении ЦМС.

3. Наследование признака восстановления фертильности системы ЦМС WA-типа контролируется более чем двумя генами, расположенными в разных хромосомах риса.

4. Ген восстановления фертильности RJ3 картирован на коротком плече 1-ой-хромосомы риса линии IR36, между разработанным нами RFLP- ПЦР маркером RG140 и SSR- маркером RM7180.

5. Ген восстановления фертильности Rf5 картирован на коротком плече 10-ой хромосомы риса линии IR62030, между SSR- маркерами RM311 и RM171.

6. Ген восстановления фертильности Rf4 картирован на длином плече 10-ой хромосоме риса линии Amoll, между SSR- маркером RM6737 на расстоянии 1.6 сМ и разработанным нами STS- маркером АВ443 на расстоянии 0.5 сМ.

7. Наследование признака восстановления фертильности системы ЦМС WA-типа при скрещивании ЦМС линии (Neda-A) с линией восстановителем (IR36) в стрессовых условиях внешней среды отклоняется от соотношения 3:1 и составляет 9:7; определены два QTL- локуса на 1-ой хромосоме риса, отвечающие за проявление этого признака и взаимодействующие друг с другом.

8. Разработан метод классификации генов на основе первичной структуры белков. Этим методом можно различать гены восстановления фертильности, действующие в разных ЦМС системах.

9. Выдвинута гипотеза «необходимости наличия критического числа (не менее 10) PPR- мотивов в генах восстановления фертильности для функционального проявления данного признака».

Ю.Идентифицирован ген - кандидат RflB - в R/4- локусе восстановления фертильности ЦМС WA- типа. Получены экспериментальные данные, указывающие на возможную роль этого гена в контроле экспрессии признака восстановления фертильности ЦМС WA- типа.

РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется использовать

- разработанные митохондриальные SCAR- маркеры для выявления генотипов ЦМС тений и линий закрепителей при создании гетерозисных гибридов риса и для идентификации новых линий закрепителей

- идентифицированные линии восстановители фертильности в селекционных программах создания гибридного риса

- идентифицированные маркеры генов восстановления фертильности для идентификации потенциальных линий восстановителей, а также при переносе генов восстановления фертильности в интересующие линии, имеющие высокую комбинационную способность

- разработанный нами метод классификации генов на основе первичной структуры белков для выявления генов - кандидатов восстановления фертильности риса и других растений

- оценить комбинационную способность линий восстановителей IR24, IR28 IR3ö IR62030 IR60966 Amol 1 и Amol2 на гетерозис

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ахмадихах А., Шевелуха В С, Карлов Г И Изучение наследования восстановления фертильности риса ЦМС WA - типа // Материалы 4 ои межународной конференции "Иран-Россия по Аграрным Наукам и Природным Ресурсам", 2004 Шахр-Корд, Иран, С 5-11 (перевод с английского)

2 Ахмадихах А., Шевелуха В С, Карлов Г И Использование SSR маркеров генов восстановления фертпльности (Rf) для генотипирования линий риса Материалы 3-го Московского международного конгресса Биотехнология состояние и перспективы развития", 2005 Москва, Россия, С 244 (перевод i. английского)

3 Ахмадихах А., Шевелуха В С , Карлов Г И Картирование гена восстановления фертильности (Rf3) для ЦМС WA - типа // Материалы научной конференции

m vitro Биология2005 Мариланд, США, С 41 (перевод с английского)

4 Ахмадихах А , Шевелуха В С , Карлов Г И Тип наследование и картирование гена восстановления фертильности ЦМС WA— типа риса линии IR28 Материалы 8-ой научной конференции "Генетическая изменчивость и геномная динамика растений", 2005 Гатерзлебен, Германия, С 67 (перевод l. английского)

5 Ахмадихах А Изучение структуры и организации генов восстановления фертильности растений И Материалы 4-ого регионального конгресса

Биотехнология \ 2005 Керман, Иран, С 128 (перевод с английского)

6 Ахмадихах А., Шевелуха В С, Карлов Г И Ассоциация молекулярных

маркеров с 2 генами восстановления фертильности в расщепляющихся популяциях риса. // Материалы 1-го международного конгресса "Биотехнология", 2005. Тегеран, Иран, С.158 (перевод с английского).

7. Ахмадихах А., Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Создание и идентификация новых молекулярных маркеров, расщепляющихся с RJ3 геном риса. // Материалы 13-ой Иранской научой конференции в Европе (IRCE), 2005. Лидз, Великобритания, С. 72-73 (перевод с английского).

8. Ахмадихах А. Новая и быстрая методика выделения ДНК. // Материалы 2-ой международной конференции "qPCR", 2005. Германия, С.23 (перевод с английского).

9. Ахмадихах А. Идентификация и динамика генов восстановления фертильности растений. // Материалы 2-ой симпозиумы "Биотехнология и Биоинформатика", 2005. Колорадо, США, С.55 (перевод с английского).

10. Ахмадихах А. Изучение структуры и динамики генов восстановления фертильности (Rf), взаимодействующих с различными ЦМС системами. // Материалы международной конференции "Биосаенс: от генов к системам",

2005. Глазго, Шотланд, С.91 (перевод с английского).

11. Ахмадихах А., Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Картирование локусов количественных признаков (QTL), контролирующих восстановление фертильности у риса в стрессовых условиях внешней среды. // Материалы межународной научной конференции, посвященной Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева,

2006. Москва (в печати).

12. Ахмадихах А., Карлов Г. И., Шевелуха В. С. Идентификация и клонирование маркеров, сцепленных с ЦМС WA— типа риса. // Материалы научной конференции "in vitro Биология", 2006. Миннесота, США, С.47 (перевод с английского).

13. Ахмадихах А., Шевелуха В. С., Карлов Г. И. Идентификация гена восстановления фертильности с частичным эффектом для ЦМС WA- типа риса с использованием SSR- маркеров. // Материалы 9-ой Иранской конференции "Генетика", 2006. Тегеран, Иран, С.7 (перевод с английского).

14. Ахмадихах А., Карлов Г. И., Шевелуха В. С. Идентификация новых молекулярных маркеров, сцепленных с ЦМС WA- типа риса. // Материалы 9-ой Иранской конференции "Генетика", 2006. Тегеран, Иран, С.10 (перевод с английского).

15. Ahmadikhah A., Karlov G.I. (2006) Molecular Mapping of the Fertility -Restoration Gene Rf4 for WA-Cytoplasmic Male Sterility in Rice (Молекулярное картирование гена восстановления фертильности Rf4 для ЦМС WA— типа риса) // Plant Breeding, Vol.125, Iss.3 (в печати).

1,5 печ л

Зак 357.

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ — МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44