Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма генома перца и оптимизации селекционного процесса

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма генома перца и оптимизации селекционного процесса"

На правах рукописи

СНИГИРЬ ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма генома перца и оптимизации селекционного процесса

Специальности: 03.02.07 - генетика 06.01.05 -селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 СЕН 2013

005532988

Москва-2013

005532988

Работа выполнена в лаборатории селекции и семеноводства пасленовых культур Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур Российской академии сельскохозяйственных наук и в лаборатории системной биологии растений Учреждения Российской академии наукЦентр «Биоинженерия» РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Кочиева Елена Зауровна доктор сельскохозяйственных наук Пышная Ольга Николаевна

Официальные оппоненты:

Кудрявцев Александр Михайлович, г эктор биологических наук, Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова Российской академии наук, заместитель директора по научной работе

Игнатова Светлана Ильинична, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией селекции пасленовых культур

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится 25сентября 2013г. в 14-30 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу 127550, г.Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан 23 августа 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Перец (род Capsicum) в настоящее время является одной из основных овощных культур. В настоящее время перец (как острый, так и сладкий) возделывается во всех странах земного шара, где климатические условия позволяют вести промышленную культуру. Площадь под перцем в мире в 2010 году составила 1,86 миллионов гектар, а мировое товарное производство перца составляет около 27,55 миллионов тонн (FAO, 2010). Перец является «рекордсменом» среди овощей по содержанию витамина С и Р-активных веществ, в 5-10 раз превосходя такие традиционные овощные культуры, как томат и баклажан. Хорошие вкусовые и диетические качества плодов обеспечивают устойчивый постоянный спрос на них в течение всего года, - и это приводит к востребованности новых сортов с различными характеристиками. Ежегодно создаются десятки новых сортов и гибридов перца классическими методами с комплексом хозяйственно ценных признаков.

В настоящее время для ускорения отдельных этапов селекционного процесса и повышения эффективности отбора наиболее рациональным считается применение высокоточных, быстрых и надежных молекулярно-генетических методов. В семеноводстве для определения степени гибридности при получении коммерческих гибридов, а также для контроля сортовой чистоты при размножении сортов, отдельное значение приобретают молекулярные маркеры и разработанные на их основе молекулярно-генетические паспорта. В связи с введением в действие законов РФ «О селекционных достижениях» создание молекулярно-генетических паспортов сортов сельскохозяйственных культур имеет особое значение, в том числе и для защиты авторских прав селекционеров.

На сегодняшний момент оценка полиморфизма как всего генома, так и его отдельных функциональных участков осуществляется с помощью современных методов молекулярного маркирования (AFLP, SSR, RAPD, SSAP, ISSR, SNP и др.). Полученные данные применяются для подбора родительских форм, генотипирования сортов и линий, идентификации ценных генотипов, а также для маркирования отдельных генов и локусов растений. В последние годы в связи с тенденцией увеличения потребления перца и количества новых сортов проблема геномной идентификации сортов становится особенно актуальной, но, несмотря на это, в

России не проводилось целенаправленной научно-исследовательской работы по созданию систем молекулярного маркирования генотипов сортов перца отечественной селекции. Молекулярная идентификация сортов с помощью созданных маркерных систем могла бы стать основой Государственного реестра отечественных сортовых стандартов.

Все вышесказанное определяет актуальность разработки систем молекулярной идентификации геномов отечественных сортов перца и оценку их геномной вариабельности.

Цель и задачи работы. Цель работы - разработка систем маркирования генома культурных видов Capsicum для оценки генетического полиморфизма и получения молекулярных маркеров для идентификации сортов перца отечественной селекции, а ткже для ускорения отдельных этапов селекционного процесса.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

• Используя молекулярные системы маркирования (мультилокусное AFLP маркирование, система микросателлитных SSR маркеров) определить уровни вариабельности генома образцов рода Capsicum, включающих сорта С.аппиит отечественной и зарубежной селекции, а также гибриды Fi;

• Для каждого микросателлитного локуса определить аллельный состав и частоту встречаемости каждого аллеля у сортов перца отечественной и зарубежной селекции;

• На основе определенных аллельных вариантов микросателлтиных локусов составить молекулярно-генетические паспорта анализируемых сортов;

• По результатам молекулярно-генетического анализа подобрать родительские пары и провести скрещивания; определить ОКС и СКС родительских форм и эффект гетерозиса у гибридных комбинаций;

• Определить и проанализировать последовательности генов глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у перца, выявить уровень полиморфизма и аллельные варианты.

Научная новизна. Впервые с помощью молекулярных методов маркирования (SSR, AFLP) генома охарактеризовано генетическое разнообразие сортов Capsicum аппиит отечественной селекции, а также образцов родственных видов. С

использованием отобранных SSR маркеров разработана система (минимальный набор локусов) для идентификации сортов перца и анализа гибридных комбинаций. Для каждого сортообразца получены индивидуальные SSR спектры, которые могут стать основой паспортизации сортов.

На основе систем AFLP и SSR маркирования впервые проведено молекулярное генотипирование сортов перца отечественной селекции.

Впервые были определены и проанализированы последовательности генов глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у перцев, определен уровень полиморфизма и аллельные варианты.

Практическая значимость. Результаты AFLP анализа позволяют обоснованно подходить к подбору родительских форм для скрещиваний, прогнозировать эффект гетерозиса и оптимизировать селекционный процесс за счет сокращения вовлекаемого в него селекционного материала.

Молекулярные микросателлитные маркеры и разработанные на их основе молекулярно-генетические паспорта сортов могут применяться для контроля сортовой чистоты и определения степени гибридности при получении коммерческих гибридов, а также обеспечивают защиту авторских прав селекционера.

Исследование вариабельности генов может быть использовано для выявления и маркирования аллельных вариантов ассоциированных с содержанием Сахаров в плодах и холодоустойчивостью.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II Международной конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур» (Москва, 2010), III Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics III» (Moscow, 2012), 16th Evolutionary Biology meeting (France, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 - в рецензируемых научных журналах и 3 - в сборниках статей материалов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ¿¿У печатных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего <ЗУ наименований. Работа содержит 33 таблиц и 2Л рисунков.

Объекты и методы исследования.

Объекты исследования. В работе были использованы образцы перца сладкого С.аппиит (26 сортов отечественной селекции и 19 сортов зарубежной) и видов C.frutescens, C.chinense, C.baccatum, C.pubescens, C.galapagoense, C.eximium, C.cardenasii, C.chacoense, C.praetermissum, C. tovarii, а также 21 комбинация межсортовых гидридов F,

Обработку экспериментальных данных проводили методами дисперсионного анализа по Б.А. Доспехову (1985) с помощью программы Microsoft Excel. Анализ комбинационной способности родительских линий определяли по методу Б. Гриф-финга (Griffing, 1956). Эффект гетерозиса определялся как достоверное превышение гибридом лучшего родителя (истинный гетерозис). Степень доминантности количественных признаков определялась по формуле Д. Брюбейкера (1966).

SSR анализ проводили по стандартной методике (Minamiyama et al., 2006). Анализ микросателлитов проводили в денатурирующем 6%-ном ПААГ с последующей визуализацией ДНК фрагментов путем окрашивания геля нитратом серебра. Результаты анализа фрагментов в ПААГ были подтверждены анализом первичных последовательностей выявленных аллельных вариантов, - методом прямого сиквенирования.

AFLP анализ проводили по стандартной схеме (Vos et al., 1995) Разделение и анализ AFLP фрагментов в 6%-ном ПААГ проводили с использованием системы LICOR DNA Analyzer 4300 (Biosciences, USA). В качестве метки для AFLP праймеров использовали флуорофоры IRD700 и IRD800.

Статистическая обработка спектров. Определение генетических различий исследованных генотипов перца проводили с использованием программ MEGA 5.0, TREECON, STATISTICA, PAUP.

Результаты исследований и их обсуждение

Анализ генома сортов перца Capsicum аппиит и его близкородственных видов

методом AFLP

Для оценки вариабельности всего генома в целом был использован метод AFLP анализа. Из 20, взятых в анализ вариантов праймер/фермент, было отобрано восемь EcoRI/TruI праймерных комбинаций, которые характеризовались достаточным уровнем информативности, то есть позволяли детектировать оптимальное число фрагмен-

тов на полиакриламидном геле и выявлять межсортовой полиморфизм. Использование отобранных праймерных комбинаций позволило получить для каждого образца перца воспроизводимые специфичные полиморфные спектры AFLP фрагментов (рис.1).

Общее число выявленных AFLP фрагментов составило 1009, длины которых варьировали от 80 до 550 н.п. Для всего набора генотипов было обнаружено 956 полиморфных фрагментов и, таким образом, полиморфизм составил 94,8 %.

iSSJ

s

— ..... -

-450 ii.H.

s — —--- _.

■-шшшшяшя'щшшжшт-атт» •

тлтш — ш ш ~ m — m m^

¿йе»5аГ iiiiiHgi.Ki-iiiAgif

"... Н--~ГГ~--Г-~ГГГ.^. - 200 H.H.

сорта С.апиитт виды перца

Рис. 1. AFLP-снектры видов и сортов Capsicum, полученные при использовании праймерной комбинации E-AGG/T-CTG (представлен фрагмент геля)

Таблица 1

Характеристика AFLP-комбинаций праймер/фермент

Комбинация праймер/фермент (EcoRI/TruI) Число амплифицированных фрагментов Число сор- тоепе-цифичных фрагментов

Сорта С.аппиит+виды Сорта С.аппиит

Полиморфные (%) Всего Полиморфные(%) Всего

Е-АСА/Т-АСТ 129 (97,7%) 132 35 (53%) 66 6

E-AGG/T-ACT 133 (95,7%) 139 36 (56,3%) 64 14

E-ACA/T-CGA 97 (97%) 100 13 (35,1%) 37 2

E-AGG/T-CGA 97 (95,1%) 102 15 (38,5%) 39 6

Е-АСА/Т-СТА 99 (86,8%) 114 9(19,2%) 47 1

E-AGG/T-CTA 151 (97,4%) 155 27 (49,1%) 55 6

E-ACA/T-CTG 106 (96,4%) 110 7(31,8%) 22 1

E-AGGAT-CTG 144(91,7%) 157 40 (57,1%) 70 6

Всего: 956 (94,8%) 1009 182 (45,5%) 400 42

Для сортов С.аппиит было получено 182 полиморфных фрагмента (табл.1).

При этом каждый из исследованных генотипов был дифференцирован. Наибольшую эффективность в выявлении сортового полиморфизма показали праймерные комбинации Е-АОв/Т-СТС и Е-АСА/Т-АСТ. Процент полиморфных фрагментов, детектированных с их помощью, составил 57,1 и 53,0 соответственно. Для всего набора генотипов, включающих как сорта, так и образцы видов, наиболее информативными ока-

зались праймерные пары Е-АСА/Т-АСТ и Е-АСА/Т-СТА, и выявленный с их помощью полиморфизм составил 97,7% и 86,8%, соответственно.

При использовании восьми праймерных комбинаций для 24 сортов С.аппиит было выявлено 42 сортоспецифичных фрагмента, - и для каждого сорта были получены уникальные AFLP спектры. Наибольшее число специфических фрагментов характеризовало геномы сортов Пирати, Каскад, Хризолит и Златозар. Идентифицированные сортоспецифичные AFLP фрагменты в дальнейшем могут быть модифицированы в SCAR маркеры этих сортов.

На основе комплекса полученных данных при использовании восьми AFLP праймерных комбинаций были рассчитаны коэффициенты межсортовых генетических различий. Согласно рассчитанным коэффициентам уровень межсортовых генетических различий был невысок и не превышал 0,07, - уровень межсортовых генетических различий варьировал в пределах от 0,005 (сорта Мазурка и Пурпурная красавица) до 0,066 (сорта Каскад и Медаль), - что говорит о значительной консервативности генома С.аппиит и, в частности, о генетической однородности используемых в мировой селекции сортов сладкого перца. Такой низкий уровень сортового генетического полиморфизма, с одной стороны, может отражать консервативность генома культивируемого вида С.аппиит, связанную с самоопылением, а с другой - может быть обусловлен ограниченностью генетического пула, используемого в селекции крупноплодных сортов перца сладкого. Полученные результаты подтверждают данные ряда авторов, использовавших для анализа техники мультилокусного маркирования RAPD и AFLP. В работе Paran et al, (1998) также отмечался крайне низкий уровень генетического разнообразия, практически нулевого, между крупноплодными сортами перца. В работе Aktas et al. (2009) отмечено отсутствие значительных различий между европейскими крупноплодными сортами, при этом несколько больший полиморфизм был выявлен для местных сортов и образцов из Турции (GD=0,079), а также для некоторых мелкоплодных острых сортов перца различного происхождения (GD=0,07).

Как и ожидалось, выявленные генетические расстояния, характеризовавшие различия между сортами С.аппиит и видами C.frutescens, C.chinense, C.baccatum, были существенно выше и составили 0,43, 0,46 и 0,43, соответственно. При достаточно вы-

соком родстве С.аппиит- C.frutescens - C.chinense, относящихся к одному эволюцион-но-филогенетическому комплексу аппиит, детектированные различия между видами

этого комплекса могут указывать на существование генетического потенциала разнообразия, который может быть использован в селекции современных сортов перца С.аппиит за счет межвидовой гибридизации.

»PurpleKrai.NI. 1 OMnsurknNX

32SibirJakRUS IKalUChndoUSA 7СЫт esNL 40Ag»po\skliRL'S UMemphls.Nb ltfBuleiu 14RS87001NL 24Zhel«B«kelRUS 12Pír»«l>TL 1 lOrnneeChiudoM. 35ArIaRLS 29HrIzolltRUS 45Slren 1 u ni nil К L í>

1 *Hyb rldNL 361znb«llaRV6 4JRod BlkRVS 2ЛЛ1яг1яК1ГК 38Llne71RVS SSnlndFesliialENG 37ZlalozarRLS 18Sr«geda 44NezbaoslRUS

2 SZolotDocbd 3»Sir*nRVS 41 ZdoroveRT'Ü SRaisnNL ZOMedal

6MarconiPepperITL lTSharm

26MajakRLS 31KarlilcRUS

2MadoamFR 22Belosn«zbkaRUS 2 lEkaterinaRVS 2 TKnskarlRUS 42MavrKUS 4RoblnCn SOOcharovaalc 34RuzaRrS 33MahshRUS 46C(k-ntesccos

47Cchinense 48Cbaccatum

Рис. 2. Дендрограмма генетических различий исследованных 48 генотипов перца, построенная на основе использования 8 AFLP праймерных пар (в узлах обозначены ИБ>50%)

На основе данных о генетическом полиморфизме сортов и образцов видов перца была построена дендрограмма, отражающая сходство изучаемых генотипов (рис. 2). Как видно из дендрограммы, базальное положение занял представитель вида C.baccatum (генетический комплекс baccatum). Представители культурных видов {С.аппиит, C.frutescens, C.chinense), относимых к генетическому комплексу аппиит, формировали один общий кластер, в котором C.frutescens и C.chinense объединяются вместе (ИБ 75%), в то время как сорта С.аппиит образовывали отдельную малополиморфную группу (ИБ 100%). В целом топология кластера С.аппиит в полной мере отражает низкий уровень детектированной сортовой вариабельности и консервативность генома С.аппиит.

Таким образом, в результате AFLP маркирования 48 образцов рода Capsicum были подобраны комбинации AFLP праймеров и ферментов, позволяющих получить

полиморфные ДНК спектры для сортов С.аппиит наиболее широко используемых в отечественной селекции перца сладкого. Показано, что с помощью двух праймерных комбинаций можно дифференцировать генотипы всех 45 сортов. Для каждого сорта получены специфичные спектры фрагментов. Для 24 сортов получены сортоспеци-фичные AFLP фрагменты, которые могут быть преобразованы сортоспецифичные монолокусные ДНК маркеры. При этом показан крайне низкий уровень генетического полиморфизма и высокая консервативность генома С.аппиит. Очевидно, что существует необходимость в расширении генетической основы для отечественных и зарубежных сортов перца с привлечением более полиморфных источников, близкородственных дикорастущих (C.baccatum) и культурных видов (С.аппиит, C.frutescens, C.chinense), образцов С.аппиит из центров происхождения и других дивергентных локальных популяций.

Микросателлитиый SSR анализ генома сортов перца С.аппиит и близкородственных видов Capsicum.

Для проведения SSR маркирования генома 48 образцов рода Capsicum из 21 SSR

локуса генома перца было отобрано четыре (С 1а, СЗ, С5, С9а), наиболее информативных и локализованных на разных хромасомах. Для выявления аллельных вариантов анализируемых микросателлитных локусов перца и верификации результатов анализа полученные ПЦР продукты амплификации разделялись на агарозном (рис. 3) и 6%-ном денатурирующем полиакриламидном геле (рис. 4).

3 а , ,

•."■в»-"« •

Рис. 3. SSR аллели локуса СЗ у 45 сортов С.аппиит и образцов видов перца C.frutescens, C.chinense, C.baccatum (1.7% агарозный гель, маркер- lOObpLadder, Frementas)

*4 — , — , ""'—-, —и -i- . - ^ ~ _ __ -150

. £ -I

Рис. 4. SSR аллели локуса СЗ у 45 сортов С.аппиит и образцов видов перца C.frutescens, C.chinense, C.baccatum (6% денатурирующий ПААГ)

Для определения точных размеров аллельных вариантов SSR локусов проводили

прямое секвенирование ПЦР продуктов амплификации. Были определены ДНК последовательности отобранных локусов, каждая из полученных нуклеотидных после-

довательностей содержала ожидаемый микросателлит, длина которого у исследованных образцов варьировала и определялась числом повторяющихся единиц микросателлита. Кроме того были выявлены точковые замены, также определяющие аллель-ный полиморфизм исследованных БвЯ локусов.

Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса СЗ. Для микросателлитного локуса СЗ, локализованного в III хромосоме (Мшагшуата й а1., 2006), разброс длин варьировал в пределах 141-171 п.н. Всего было выявлено 6 аллельных вариантов локуса (табл. 2,рис. 5). Размер наиболее часто встречающегося аллеля А составил 157 п.н., и он был идентифицирован у 18 сортов перца сладкого, а также у образца вида С./гШезсет. Аллель С (159 п.н.) был характерен для 11 сортов С.аптшт. Размер аллеля В составил 171 п.н. и он был идентифицирован у 14 сортов. Среди сортов редкий аллель Э размером 169 п.н. был детектирован у сорта Ежик. Кроме того, у аллелей В и О была идентифицирована точковая замена Т/А, которая привела к возникновению нового типа микросателлита вместо основного (ТС)„—»(ТС)„АС(ТС)П. Аллели Е (147 н.п.) и Р (141 п.н.) характеризовали генотипы

образцов видов С.chínense и C.baccatum.

С.ёппишЕ Agspovskii СЗ тьь i шп в

C.smmua Zzñik СЗ lllllll Г lllli iC:cic:cieic:cicic:cic:c--J.c:cici5uníJcr^i6Jiirccci:si: D

C.snnuus üodnik СЗ шш Г тсгст iliMilililiMilil.........--ílíliiiMillMIiil! с

С.ышшк Zdorovie СЗ Г illli МИННШ--..........llllllIBBillTlIrxxliirrB^ A

С.chúcense СЗ ¡lililí I т№ ilrlrSíl.......................IIHIIlIftliTlIillllllllH E

C.baccaúua СЗ lllllll I tllli ti-----------------------------lliliil№lgtl|g|||llilll F

Рис. 5. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита СЗ

Таблица 2

_Аллельный состав микросателлитного локуса СЗ у 48 генотипов перца _

Тин локуса Размер локуса Состав локуса

А 157 пн (tc)„

в 171 пн (tc)20ac(tc)2

С 159 пн (te),7

D 169 пн (tc)i,ac(tc)2

Е 147 нн (tc)„

F 141 пн (te).

Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С1а. Для локуса С1а, локализованного в I хромосоме (Minamiyama et al., 2006), разброс длин анализируемых образцов варьировал в пределах 243-259 п.н. Было выявлено 5 аллельных вариантов (рис. 6, табл. 3). Наиболее распространённый аллель А (245 п.н.) был идентифицирован у 20 сортов. Размер аллеля В составил 243 п.н. и он был выявлен у 19 сортов. Редкий аллель D длиной 247 п.н. был детектирован только у

сортов Медаль и Раиса. У сортов Здоровье, Мадона, Маркони пепер и Шарм был выявлен аллель С (259 п.н.). Уникальные аллель Е локуса С1а размером 600 п.н. характеризовал генотип вида С.chínense.

С.chinease Cía lÉ^il

С.мшгаш Zdorovie Cía llí

С.ашшиш Hedal Cía

C,aimiM_Spady_Cla m

С.ашш Chines Cía №

ш lias

crs:sr|rjiji¡r|i|iji|i|

Рис. 6. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С1а

Таблица 3

Тип локуса Размер локуса Состав локуса

А 245 пн (ta)7tgtc(tg),,aa (tg)3

В 243 пн (ta)6tgtc(tg),,aa(tg)3

С 259пн (ta)io (tg)naa (tg)3

D 247 пн (ta)stgtc(tg),iaa(tg)3

Е 600 пн (ta),4 (tg)i6aa (tg)3

Интересно, что помимо специфического микростеллита этот локус у С.chínense содержал 335-нуклеотидную инсерцию. У видов C.frutescens и C.baccatum последовательность данного локуса не амплифицировалась, что, скорее всего, связано с точковыми мутациями во фланкирующих микросателлит последовательностях.

Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С5. Для локализованного в V хромосоме локуса С5 (Minamiyama et al., 2006) разброс длин варьировал в пределах 143-161 п.н. Локус был представлен четырьмя аллельными вариантами (рис. 7, табл. 4), наиболее часто встречающийся из которых был аллель А (161 п.н.), выявленный у 27 сортов сладкого перца (табл. 7). Размер аллеля В составил 155 п.н., и он был детектирован у 13 сортов, а также у образцов С.chínense и C.baccatum. Аллель С также размером 155 п.н. был идентифицирован у 5 сортов.

л

C.fcuteaeens С5

Ъшбтбшшшш----

II1IIIIIIIIIIIIIIII IIIIIIIIIIIIIIIII lUHIlHBfll Jillililllllllil--------

lilililililililili1ji--lûlllilillïsiisillSllkiillllllli

IIIIHIHimilllilllllllllllllilliSiiiiianiiliÜlUglIi Мт|т1гШ

Рис. 7. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С5

В С

Таблица 4

Тип локуса Размер локуса Состав локуса

A 161 пн (gt)3a(ta)7(tg),2

В 155 пн (gt)3a(ta)5(tg)„

С 155 пн (gt)3a(ta)4(tg),.

D 143 пн (ta)3(tg).

Данные аллели, несмотря на то, что имели одинаковую длину, представляли собой два разных по первичной последовательности микросателлита, различить которые на ПААГ было бы невозможно. Кроме того в последовательности фланкирующей микросателлитный локус в положении 94 была выявлена точковая замена A/G. Специфический аллель D размером 143 п.н. был обнаружен у вида C.frutescens. У этого аллеля, вследствие точковых замен, отсутствует первая часть микросателлита (GThA.

Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса С9а. Для локуса С9а, локализованного в IX хромосоме (Minamiyama et al., 2006), разброс длин микросателлита варьировал в пределах 326-335 п.н. Было выявлено 4 аллельных варианта (рис. 8, табл. 5). У большинства сортов (31) был детектирован аллель А (332 п.н.). Размер аллеля В составил 335 п.н. и он был идентифицирован у 9 сортов. Аллель С локуса С9а размером 329 п.н. был выявлен у сортов Раиса, Мазурка, Медаль и Пирата. Также был выявлен сортоспецифичный аллель D (326 п.н.) у сорта Каскад. У видов C.frutescens, C.chinense и C.baccatum локус С9а не амплифицировался.

illlllllllllllllHIIlllllllllllllllllIllllIlllllllllIllllllHIIIIIIIlllllllllll в gllllllllllllllllHIIIIIIIIIHIIIIIIIHIIIIIIIIllllllllllllllIIIIIIHIlilllllll

gllllllllllllll lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll А

gllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllilllllllllllllllll <

iilll- - -—illilUIf Ililllillllff lillillil- - - HIIIIIUHIIlSilBUIIIIII D

Рис. 8. Первичные последовательности аллельных вариантов микросателлита С9а

Таблица 5

Тип локуса Размер локуса Состав локуса

А 332 пн (aag), i aac(aag), 0aac(aag)2

В 335 пн (aag)22aac(aag), 0аас( aag)2

С 329 пн (aag)2,aac(aag)9aac(aag)2

D 326 пн <aag)20aac(aag),aac(aaj>)2

В результате SSR маркирования 48 образцов рода Capsicum были амплифицированы и, путем прямого секвенирования ПЦР фрагментов, определены ДНК последовательности 4 SSR локусов С 1а, СЗ, С5 и С9а. Каждая из полученных нуклеотидных последовательностей содержала ожидаемый микросателлит, длина которого у исследованных образцов варьировала и определялась числом повторяющихся единиц микросателлитной последовательности. Кроме того, были выявлены точковые замены, также определяющие аллельный полиморфизм исследованных микростеллитных локусов. При этом были определены преобладающие и уникальные аллели исследованных локусов и установлены их

точные размеры. Всего по четырем микросателлитным локусам у исследованного

набора образцов перца было выявлено 19 аллелей (в среднем 4,7 аллелей на локус).

Наибольшее число аллелей (6) для данного набора генотипов было детектировано для

локуса СЗ, наименьшее (4) для локусов С5 и С9а.

Сравнение частот встречаемости аллелей SSR локусов сортов перца С.аппиит отечественной и зарубежной селекции

Частоты встречаемости выявленных аллелей несколько различались у

отечественных и зарубежных сортов. По локусам С1а и СЗ у российских сортов преобладал аллель А, а у европейских сортов наиболее часто встречался аллель В. По локусу С5 у отечественных сортов преобладал аллель В, в то время как у всех исследованных европейских сортов присутствовал только аллель А этого локуса. По локусу С9а и у всех сортов наиболее часто встречающимся был аллель А (рис. 9).

SSR локусов у сортов перца селекции

Частоты аллелей SSR локусов у европейских сортов перца C.annuum

а)

Рис. 9. Частоты встречаемости SSR локусов у сортов перца С.аппиит а)отечественной селекции; б) европейских сортов

Были определены коэффициенты информативности исследованных микросателлитных локусов, которые также различались для групп российских и европейских сортов. Наиболее информативным в выявлении сортового полиморфизма российских сортов оказались локусы СЗ и С5, а для европейских сортов наиболее эффективными оказались локусы С1а и СЗ (табл. 6).

Таблица 6

Коэффициенты информативности микросателлитных локусов С1а, СЗ, С5 и С9а

Локус Число аллелей Величина PÍC Число аллелей Величина Величина PIC Величина PIC

(весь набор) (весь набор) (сорта PIC (сорта (отечественные (европейские

С.аппиит) С.аппиит) сорта) сорта)

С1а 5 0.63 4 0.61 0.54 0.63

СЗ 6 0.69 4 0.67 0.62 0.57

С5 4 0.58 3 0.55 0.65 0.00

С9а 4 0.47 4 0.47 0.43 0.55

Таблица 7. Аллельные варианты микросателлитных локусов сортов С.аппиит

Сорта и виды рода Capsicum С 1а сз С5 С9а

А В С D А В с D А В С А В С D

Размеры SSR фрагмента, п.н. 245 243 259 247 157 171 159 169 161 155 155 332 335 329 326

Калифорнийское Чудо • • • •

Мадонна • • • «

Спади • • • •

Рубин • • • •

Салат Фестиваль • • • •

Маркони пеппер • • • •

Чаймс • • • •

Рапса • • • •

Пурпурная красавица • • • •

Мазурка • • • •

Оранжевое Чудо • • • •

Пират» • • • •

Мемфис • • • •

RS 87001 • • • •

Гибрид 167 • к • • •

Болеро • • • •

Шарм • • • •

Шрегеда • • • •

Бенда • • • •

Медаль • • • •

Екатерина • • • •

Белоснежка • • • •

Мария • • • •

Желтый букет • • • •

Ежик • • • •

Маяк • • • •

Каскад • • • •

Золотой Дождь • • • •

Хризолит • • • •

Очарование • • • •

Карлик • • • •

Сибиряк • • • •

Малыш • • • •

Руза • • • •

Ария • • • •

Изабелла • • • •

Златозар • • • •

Линия 71 • • • •

Сирень • • • •

Агаповский • • • •

Здоровье • • • •

Мавр • • • •

Родник • • • •

Нежность • • • •

Сиреневый туман • • • •

Применение исследованных микросателлитных локусов для паспортизации сортов перца С.аппиит и видов С./гШеэсет, С.сЫпете, С.ЬассаШт

По данным проведенного ЭЗЯ анализа все отобранные локусы показали высокую эффективность в выявлении внутривидового полиморфизма и идентификации сортов перца отечественной и зарубежной селекции. Определен диагностический набор наиболее информативных локусов, позволяющих дискриминировать все генотипы взятых для анализа сортов перца. Для каждого исследованного сорта установлена аллельная БЭЛ формула (табл. 7), которая может быть использована в качестве основы его молекулярного паспорта.

Подбор компонентов скрещиваний на основе данных БвИ и АГЬР маркирования и прогнозирование эффекта гетерозиса

Проведенный молекулярно-генетический анализ позволил отобрать для

дальнейшей работы 7 сортов перца сладкого (Мадона, Чаймс, Пирати, Екатерина, Желтый букет, Оранжевое чудо, Мемфис), которые располагались в различных кластерах дендрограммы, построенной на основе АР1_Р маркирования, и обладали различным набором аллелей четырех ББЛ локусов. Была проведена 21 комбинация диаллельных скрещиваний, в которых данные сорта использовались в качестве родительских компонентов, и были получены гибридные растения Р^

На основе предварительного сортоиспытания определена общая (средняя величина гетерозиса данного сорта в гибридных комбинациях) и специфическая комбинационная способность (величина гетерозиса в конкретной гибридной комбинации) и показано, что по ряду хозяйственно ценных признаков выделились Желтый букет, Мемфис, Пирати, Мадона и Оранжевое чудо.

По результатам анализа было установлено, что гибриды, полученные при использовании в качестве родительских форм сортов со сходными геномами (расположенными близко на дендрограмме), например, таких как Пирати и Желтый букет, не дают эффекта гетерозиса. Эффект гетерозиса определялся по четырем признакам (табл. 8). У данной комбинации эффект гетерозиса отсутствовал по признакам: «продолжительности периода всхожесть - биологическая спелость» -97,6%; «ранняя урожайность» - 95,73%; «общая урожайность» - 87,89%; «содержание аскорбиновой кислоты» - 91,7%.

В случае использования в качестве родительских компонентов сортов, геномы которых менее схожи (на дендрограмме расположены в отдаленных кластерах), например, таких как Екатерина и Мемфис (рис. 2), то гибриды р! показывают достаточно высокий эффект гетерозиса. По следующим признакам у данной комбинации эффект гетерозиса составил: «продолжительность периода всхожесть -биологическая спелость» - 109,6 %; «ранняя урожайность» - 106,52 %; «общая урожайность» - 115,48 %; «содержание аскорбиновой кислоты» -137 %.

Гибридные комбинации, полученные на основе генетически более отдаленных родительских форм, различающихся по ряду хозяйственно ценных признаков, выявили наибольший эффект гетерозиса по скороспелости, урожайности и содержанию витамина С. Так, по комплексу этих признаков с высоким эффектом гетерозиса были отобраны четыре гибридные комбинации: И, Екатерина х Мемфис, Р, Пирати х Мемфис, Р, Мадона х Мемфис, р! Мадона х Желтый букет.

Таблица 8

Эффект гетерозиса по количественным признакам гибридных комбинаций К] перца сладкого в условиях __малообъемной гидропоники _

Гибридные комбинации Эс )фект гетерозиса, %

Продолжительность периода «всхожесть -биологическая спелость» Ранняя урожайность Общая урожайность Витамин С

И] Мадона х Чаймс 100 135,44 85,62 89,8

Р] Мадона х Пирати 97,5 95,24 92,27 90,4

К] Мадона х Екатерина 105,5 154,18 94,92 76,5

Р) Мадона х Желтый букет 99.3 96,21 91,37 102,4

Р| Мадона х Оранжевое чудо 102 105,61 91,77 83,1

Р| Мадона х Мемфис 104,! 143,69 106,36 71,7

Р, Чаймс х Пирати 102,5 83,65 82,38 103,2

И, Чаймс х Екатерина 104,1 181,21 124,40 106,5

Р] Чаймс х Желтый букет 102,8 85,84 100,41 100,7

И, Чаймс х Оранжевое чудо 102,1 114,51 87,95 89,1

р! Чаймс х Мемфис 99,4 70,34 118,95 105,6

Р| Пирати х Екатерина 103,5 120,24 105,41 105,0

р! Пирати х Желтый букет 97,6 95,73 87,89 91,7

Р] Пирати х Оранжевое чудо 101,9 113,07 88,38 104,4

р1 Пирати х Мемфис 101,6 157,14 129,69 128,7

Р| Екатерина х Желтый букет 99,1 86,20 85,02 75,0

р! Екатерина х Оранжевое чудо 103,3 125,90 92,29 82,0

р! Екатерина х Мемфис 109,6 106,52 115,48 137,0

Р| Желтый букет х Оранжевое чудо 104,6 58,91 88,54 97,3

Р; Желтый букет х Мемфис 100,4 94,57 93,32 125,7

Р, Оранжевое чудо х Мемфис 101,2 55,09 62,50 80,9

По скороспелости, урожайности, качеству плодов, высокой товарности, физио-

логической засухоустойчивости была выделена гибридная комбинация Р, Мадона х

Желтый букет. Данная гибридная комбинация передана на Государственное сортоиспытание под названием Р,Мила.

Анализ полиморфизма генов углеводного обмена альфа-глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы

Одним из перспективных направлений селекции новых сортов перца является

повышенное содержание Сахаров в плодах, а также холодоустойчивость сортов, что способствует продвижению данной культуры в северные широты. Поиск потенциальных источников новых генов, вовлеченных в метаболизм Сахаров и крахмала, и их аллельных вариантов, которые можно ввести в селекционный процесс, является наиболее актуальным направлением в современных исследованиях. Так, например, для ряда пасленовых было показано, что гены углеводного обмена альфа-глюканфосфорилаза, сахарозосинтаза и инвертаза могут определять такие важные хозяйственные признаки как содержание Сахаров и крахмала, а также вовлечены в формирование устойчивости растений к холоду (Chen et al. 2001; Menendez et al. 2002; Gebhardt et al. 2005; Li et al., 2008). Последовательности этих генов у Capsicum не были известны, поэтому представляет особый интерес анализ полиморфизма последовательностей данных генов с целью выявления уровня вариабельности и определения их аллельных вариантов, в том числе и ассоциированных с содержанием Сахаров и крахмала, для их дальнейшего использования в селекционной практике.

Для работы были выбраны участки данных генов, кодирующие их основные функциональные домены: для гена Stp23 - глюканфосфорилазный домен (последовательность экзонов II-IV), для гена Pain-1 - ключевая часть инвертазного домена (последовательность экзонов III—V), для гена Sus4 - ключевая часть сахарозосинтазного домена (последовательность экзонов II—VI), а также гликозилрансферазный домен (экзои XII).

На основе сравнительного анализа последовательностей генов-гомологов у картофеля и томата были разработаны 8 специфичных праймеров для амплификации и секвенирования выбранных последовательностей функциональных доменов данных генов у представителей рода Capsicum. У полученных последовательностей генов были определены экзон-интронные границы и охарактеризованы первичная нуклеотидная и аминокислотная последовательности.

Анализ полиморфизма гена альфа-глюканфосфорнлазы Stp23у представителей рода Capsicum

Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемого участка гена Sip23 видов Capsicum составила 696-705 п.н. В последовательностях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектировано 18 сайтов единичных нуклеотидных замен (SNP) и 4 индели различной длины и локализации (табл. 9).

Таблица 9

Длина и уровень полиморфизма исследуемых последовательностей экзонов и нитронов гена Stp23

Участок гена

Длина выровненной последовательности, п.н.

Число вариабельных сайтов

Число инделей

Полиморфизм(%)

Фрагмент экзона II

45

I

5,6

Интрон II

189-190

50

Экзон III

101

11,1

Интрон III

203-211

22,2

Экзон IV

158

И,1

Все экзоны

304

27,8

Все интроны

392-401

13

72,2

Весь фрагмент гена

696-705

18

100

Как и ожидалось, у анализируемых последовательностей гена Stp23 наиболее консервативными были экзоны. В последовательностях экзонов II, III и IV было детектировано 5 SNP, в интронах - 13 SNP. Последовательности экзонов были инвариабельны по длине, в то время как в интронных последовательностях были выявлены индели (рис. 10).

Рис. 10. Нуклеотидная последовательность интрона III гена Stp23 у представителей рода Capsicum

Наиболее полиморфным из интронов оказался интрон II, который помимо точковых нуклеотидных замен содержал также индели. В последовательности интрона III у видов C.eximium, C.tovarii, C.pubescens также была выявлена инсерция, длина которой составляет семь нуклеотидов (ТАТСТТС).

Анализ аминокислотной последовательности фрагмента белка Stp23. Экзонные нуклеотидные последовательности гена Stp23 изучаемых образцов перца были транслированы. Анализ транслированных экзонных последовательностей показал, что 5 полиморфных нуклеотидных позиций в экзонах не привели к аминокислотным

заменам у видов и сортов Capsicum, однако дополнительный анализ, включающий представителей других родов Solanaceae, позволил выявить целую группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен (рис. 11).

Iii®

Рис. 11. Аминокислотные замены у представителей рода Capsicum в белке Stp23 Анализ полиморфизма гена инвертазы Pain-1 у представителей рода Capsicum

Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемого участка гена Pain-1, включающего последовательность экзон III—V, кодирующую ключевую часть инвертазного домена, составила 1741-1778 п.н. В последовательностях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектировано 60 сайтов единичных нуклеотидных замен (SNP) и 16 инделей различной длины и локализации (табл. 10).

Таблица 10

Длина и уровень полиморфизма исследуемых последовательностей экзонов и интронов гена Pain-1

Участок гена

Экзон П1

Интрон HI

Экзон IV

Интрон IV

Длина выровненной последовательности, п.н.

778-784

482-512

168

77-78

Число вариабельных сайтов

21

30

Число инделей

Полиморфизма{%)

35,0

50,0

5,0

3,3

Экзон V

236

6,7

Все экзоны

1182-1188

28

46,7

Все интроны

559-590

32

12

53,3

Весь фрагмент гена

1741-1778

60

16

100

В последовательностях экзонов III, IV и V гена было детектировано 28 SNP, а в интронах - 32 SNP. Наибольшее число замен локализовалось в области интрона III (табл. 10). В последовательности экзона III выявлен 21 вариабельный сайт и 4 индели, а также инсерция GGACCG у вида C.tovarii (рис. 12).

Ш ест ■И«

; «iia -iziias.—J Sri-'

Анализ вариабельности интронных последовательностей показал, что наиболее полиморфным был интрон III, в составе которого обнаружено 30 единичных нук-

леотидных замен и 11 инделей, а также протяженная 33-нуклеотидная делеция у вида С, pubescens.

Анализ аминокислотной последовательности белка Pain-1. Анализ транслированных экзонных последовательностей гена Pain-1 изучаемых образцов показал, что из 28 полиморфных нуклеотидных позиций 12 приводили к аминокислотным заменам, 11 из которых были несинонимичными. Также дополнительный сравнительный анализ позволил выявить целую группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен (рис. 13).

т^-штт

Hi^il iiisi ашщ

II

Рис. 13. Аминокислотная последовательность инвертазного домена гена Pain-1

Анализ полиморфизма гена сахорозосинтазы Sus4у представителей

рода Capsicum

Общая длина полученных нуклеотидных последовательностей исследуемых участков гена Sus4, включающих последовательность экзон II-VI, кодирующую ключевую часть сахарозосинтазного домена и последовательность экзона XII, кодирующую гликозилтрансферазный домен, составила 1526-1552 п.н. В последовательностях экзонов и интронов изучаемых образцов в общей сложности было детектировано 93 SNP и четыре индели различной длины и локализации (табл. 11).

Таблица 11

Длина и уровень полиморфизма исследуемых последовательностей экзонов и интронов гена Sus 4

Участок гена

Фрагмент экзона II

Интрон II

Экзон III

Интрон Щ

Экзон IV

Длина выровненной последовательности, п.н.

31

135-137

127

91-92

152

202

Число вариабельных сайтов

1

16

13

Число инделей

Полиморфизма(%)

1,1

11,8

4,3

17,2

7,5

14,0

Интрон V

217-240

12

Фрагмент экзона VI

12,9

48

Экзон XII

435

Все экзоны

21

995

46

Все интроны

531-557

О 22.6 49,5

47

Весь фрагмент гена

50,5

1526-1552

93

У анализируемых последовательностей гена 5"«.*/ и в экзонах, и в интронах уровень полиморфизма был примерно одинаков - 49,5 % и 50,5 %, соответственно. Интересно, что экзонные последовательности характеризовались высоким уровнем полиморфизма: в последовательностях экзонов II, III, IV, V, VI и XII было детектировано 46 81МР. Наибольшее число замен локализовалось в области XII экзона (рис. 14).

С. репе с. _12R+F

Рис. 14, Нуклеотидная последовательность гликозилтрансферазнога домена гена Sus4

Из интронных последовательностей наиболее полиморфным оказался интрон III, уровень его полиморфизма составляет 17,2 % и в его составе обнаружено 16 единичных нуклеотидных замен. Наиболее вариабельным по длине оказался интрон V, последовательность которого варьировала у разных образцов от 217 до 240 п.н. и содержала протяженную 23-нуклеотидную делецию GTTTTTTCACGCCACTATACGTA у видов C.cardenasii и C.pubescens (рис. 15).

Анализ аминокислотной последовательности белка Sus4. Анализ транслированных экзонных последовательностей гена Sus4 изучаемых образцов показал, что из 46 полиморфных нуклеотидных позиций в экзонах 11 приводили к аминокислотным заменам, 10 из которых были несинонимичными. Также дополнительный сравнительный анализ, включающий представителей других родов Solanaceae позволил выявить группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен (рис. 14).

Рис. 15. Аминокислотная последовательность гликозилтрансферазного домена гена Sus4

В результате проделанной работы впервые для видов Capsicum были получены фрагменты генов Stp23, Sus4 и Pain-1 кодирующие их основные функциональные домены, охарактеризованы их первичные нуклеотидные и аминокислотные последовательности, выявлен уровень их вариабельности и аллельные варианты. Полиморфизм у анализируемых последовательностей генов определялся не только

484848535353238923484823485323232323234853532323484823

точковыми нуклеотидными заменами, а также инделями, в том числе и в экзонных последовательностях. Анализ транслированных последовательностей исследуемых генов позволил детектировать группу родоспецифичных для Capsicum аминокислотных замен. Для последовательностей белков Sus4 и Pain-1 у видов и сортов перца были обнаружены как синонимичные, так и несинонимичные аминокислотные замены, которые, возможно, могут изменять функции данных белков и будут использованы в дальнейшей работе для выявления аллельных вариантов, ассоциированных с содержанием Сахаров и холодоустойчивостью, и которые могут быть введены в селекционный процесс.

выводы

1. Разработана система AFLP маркирования, позволившая оценить генетическое разнообразие представителей рода Capsicum:

- идентифицировано 956 полиморфных AFLP фрагмента, определены уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности ДНК последовательностей перца.

- показано, что с помощью двух праймерных комбинаций можно дифференцировать генотипы всех 45 сортов и для каждого из них получены специфичные спектры фрагментов;

-для 24 сортов получены сортоспецифичные фрагменты, которые могут быть преобразованы в монолокусные SCAR маркеры;

- выявлены наиболее генетически родственные и отдаленные группы сортов для оптимизации селекционного процесса.

2. Методом SSR анализа четырех микросателлитных локусов у 45 сортов и видов рода Capsicum выявлено 19 аллельных вариантов, определены их точные размеры и нуклеотидные последовательности, частоты встречаемости и коэффициенты информативности.

3. Показана возможность использования разработанных систем микросателлитного и AFLP маркирования при подборе родительских пар для получения гибридов с высоким эффектом гетерозиса.

4. Для защиты авторских прав селекционера составлены молекулярно-генетические паспорта сортов перца сладкого, представленные сортоспецифичными формулами аллельных вариантов четырех микросателлитных локусов.

5. Определены и проанализированы последовательности функциональных участков генов альфа-глюканфосфорилазы, инвертазы и сахарозосинтазы у видов и сортов Capsicum, выявлен уровень полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Список опубликованных работ

1. Снигирь Е.А. Характеристика полиморфизма микросателлитного локуса CAMS-336 у сортов перца. /Е.А. Снигирь, О.Н. Пышная, Е.З. Кочиева, Н.Н. Рыжова // Сельскохозяйственная биология,- 2011. - № 6,- С.45-50.

2. Снигирь Е.А. AFLP-анализ сортового полиморфизма Capsicum аппиит L. /Е.А. Снигирь, О.Н. Пышная, Е.З. Кочиева, Н.Н. Рыжова// Сельскохозяйственная биология,- 2013. - № 1.-С.53-60.

3. Снигирь Е.А. Изучение эффекта гетерозиса перца сладкого при подборе родительских пар с использованием данных молекулярного анализа. /Е.А. Снигирь, Е.З. Кочиева, М.И. Мамедов, Т.П. Супрунова, Н.А. Шмыкова, О.Н. Пышная //Овощи России. - 2012.-№ 4,- С.25-28.

4. Снигирь Е.А. Структура и полиморфизм фрагмента локуса Pain-1, кодирующего вакуолярную инвертазу видов Solamtm. / М.А. Слугина, Е.А. Снигирь, Н.Н. Рыжова, Е.З. Кочиева//Молекулярная биология. - 2013.-№ 2.- С.1-8.

5. Снигирь Е.А. Микросателитный анализ сортов перца овощного./Е.А. Снигирь, Н.Н. Рыжова/Материалы II Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы» М.: Издательство ВНИИССОК, 20Ю.-Том II. - С.507- 509.

6. Snigir Е.А. Polymorphisms and phytogeny of a-glucanphosphorilase gene (Sip 23) in Solanaceae. /М.А. Slugina, E.A. Snigir, E.Z. Kochieva/ЛИ Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics MolPhy - 3». Moscow. 2012. P. 108.

7. Snigir E.A. The glucosyl-transferase domain of sucrose synthase: variability in Capsicum species. /N.N. Ryzhova, E.A. Snigir, K.V. Boris//16th Evolutionary Biology meeting, Marseilles, France. 2012. P. 156.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 18.06.2013 г. Формат 60х84'/16. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 401.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12,977-26-90, 977-40-64