Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование иммуноанализа цитокининов для изучения активности цитокининоксидазы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Использование иммуноанализа цитокининов для изучения активности цитокининоксидазы"

РГБ ОД

На правах рукописи

Симонян Марианна Вячеславовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОАНАЛИЗА

ЦИТОКИНИНОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНИНОКСИДАЗЫ

(Специальность 03.00.12 - Физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЮОП J ~ I ^ ^ У

Работа выполнена на кафедре физиологии растений биологического факультета Башкирского государственного университета имени 40-летия Октября.

Научный руководитель: доктор биологических наук

С.Ю.Веселов

Научный консультант: доктор биологических наук

И.Ю. Усманов Официальные оппоненты: доктор биологических наук

КофЭ.М. кандидат биологических наук

H.A. Мартьянов Отдел биохимии и цитохимиии УНЦРАН

2000 г. в /<fcc часов на заседании диссертационного совета К 064.13.09 в Башкирском государственном университете имени 40-летия Октября.

Адрес: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет Башкирского государственного университета, ауд. 332.

Ведущая организация:

Защита состоится "/j " ¿(.«Icyjt

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан " /с " ß&ta. £/)Л 1999 г.

Ученый секретарь

П

диссертационного совета i\[f к.б.н. Г.Г. Кузяхметов

- I i'i',^ »ч -Jl" ; /

EfHJbV- Jobcß, О

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Цитокининм - полифункциональные гормоны, оказывающие влияние на самые разнообразные физиологические процессы, протекающие в растениях (Кулаева, 1982; Binns, 1994). Предполагается, что воздействие на рост, развитие и другие функции в ходе жизнедеятельности растения реализуются через изменение концентрации цитокининов. Содержание гормона в той или иной части растения определяется его продукцией, транспортом, взаимопревращением активных и неактивных форм, а также его распадом. Изучению накопления, транспорта и метаболизма цитокининов посвящено большое количество работ. Однако, что касается распада гормона, то в этом вопросе имеется значительный пробел. В настоящее время признано, что основным ферментом, который катаболизирует цитокинины, является цито-кининоксидаза (ЦКО). Многие исследователи считают, что циго-кининоксидаза может играть существенную роль в процессе жизнедеятельности растений, pei-улируя концентрацию цитокининов посредством их окисления (Hare, Van Staden, 1994). Поэтому, изучение этого фермента может существенно дополнить наши представления о физиологических реакциях растения, протекающих с участием цитокининов. Последнее обстоятельство, в свою очередь, будет способствовать более осознанному и правильному применению регуляторов роста растении в практике растениеводства.

Существенным тормозом в развитии представлений об участии цитокининоксидазы в регуляции концентрации цитокининов является ограниченная методическая база. На сегодняшний день предложено два подхода для оценки активности фермента. Один из них, основанный на колориметрическом определении продукта окислительной реакции - З-метил-2-бутеналя (Libreros-Minotta, Tipton, 1995), обладает низкой чувствительностью и, по .этой причине, может использоваться только в редких случаях. Методы, в которых регистрируют образование радиоактивного аденина из гормона, содержащего изотоп углерода С11 или водорода Н3 в сочетании с ВЭЖХ или ТСХ (Burch, Morgan, 1989; Redig et al., 1997), малодоступны для большинства лабораторий.

В этой связи мы поставили перед собой цель разработать высокочувствительный и достаточно простой метод определения активности ЦКО, не требующий использования радиоактивных изотопов и продемонстрировать его возможности в физиологических экспериментах на растениях.

При этом необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать иммуноферментную тест-систему для определения изопентениладенозина;

- показать специфичность метода на основе изменения параметров. активности цитокининоксидазы при использовании активато-роЕ и ингибиторов фермента, а также на основе определения его субстратной избирательности;

- подобрать оптимальные условия определения цитокининоксидазы (температура, время, рН, состав инкубационной среды) у проростков кукурузы и пшеницы;

- с помощью ИФА выявить изменение соотношения концентрации цитокининов и активности цитокининоксидазы при воздействии на растения различных факторов внешней среды.

Научная новизна. Предложена иммуноферментная тест-система для определения изопентениладенозина и на ее основе разработан новый метод определения цитокининоксидазы без использования радиоактивных изотопов. В экспериментах по определению субстратной специфичности, а также по влиянию известных активаторов и ингибиторов на активность фермента продемонстрирована специфичность метода. Впервые определены температурный и рН оптимум для цитокининоксидазы из проростков кукурузы и пшеницы. Обнаружено, что цитокининоксидаза, выделенная из проростков пшеницы, проявляет максимальную активность при более низкой температуре, чем фермент, выделенный из проростков кукурузы, что соответствует более высокой жароустойчивости кукурузы по сравнению с пшеницей. Показано, что при резком охлаждении корней растений пшеницы в их побегах возрастает активность цитокининоксидазы, а при обрезании части корневой системы активность фермента в побеге снижается, что сопровождается соответственно уменьшением и возрастанием концентрации цитокининов в побегах растений. Выявлено, что добавление в безклеточную систему ионов кадмия в низкой концентрации активирует распад изопентениладенозина, а в более высокой - подавляет. Эти результаты могут объяснить снижение концентрации цитокининов на начальных стадиях поглощения ионов металла и их возрастание по мере накопления токсичного металла растением. Показано, что индуцированное дегидратацией быстрое уменьшение количества работающих рибосом у проростков кукурузы сопровождается повышением активности цитокининоксидазы и снижением количества цитокининов.

Практическая ценность. Разработанная в данной работе тест-система для определения активности цитокининоксидазы, отличающаяся чувствительностью и относительной простотой, будет полезна для исследователей, которые занимаются фитогор-монами. Полученные с ее помощью результаты способствуют более глубокому пониманию механизма регуляции концентрации гормонов, что может быть использовано для разработки более эффективных агротехнических приемов регуляции роста растений.

Апробации работы. Основные положения работы были представлены на 5-ом международном симпозиуме по исследованию корней (Южная Каролина, 1996), XI Конгрессе ФЕОФР (Варна, 1998), 5-м международном симпозиуме "Структура и функция корней" (Словакия, 1998), IV съезде общества физиологов растений России (1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9

работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 13! странице, включает 17 рисунков и 10 таблиц. Список литературы состоит из 263 наименований.

Автор благодарит своего научного руководителя, научного консультанта, а также сотрудников лаборатории физиологии растений Института биологии УНЦ РАН.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили четырехсуточнь е проростки кукурузы (Zea mays /,.) гибрида Краснодарский 395 и гибрида Краснодарский 1642, а также восьмисуточные проростки пшеницы (ГпИсит durum L) сорта Безенчукская 139.

Выращивание растений. Семена кукурузы проращивали на водопроводной воде в темноте при 22°С в течение четырех суток. Семена пшеницы проращивали на водопроводной воде в темноте при температуре 24°С в течение трех суток и затем в течение пяти суток выращивали на 10% питательной среде Хогланда-Арнона 1 при температуре 21-23°С на светоплощадке (освещенность 18 кЛк, продолжительность светового периода 14 ч).

Определение активности ферментов, ыетаполпзируюи/их топентеиилаОеиолш (ИПА). Растительный материал гомогенизировали в холодном (6°С) 0,1М трис-HCl буфере (рН -= 7,1) или в

0,1 M имидазол-HCI буфере (pH = 7,1). Гомогенат центрифугировали при 12000g в течение 25 мин. Белки из супернатанта осаждали добавлением равного объема насыщенного раствора (NH-i^SO*! и центрифугировали при 5000g в течение 15 мин. Осадок ресус-пензировалн в соответствующем буфере. 50 мкл препарата добавляли к 50 мкл% смеси, содержащей стандарт ИПА и трис-HCl или имидазол-HCI буфер (рН=7,1) в конечной концентрации 0,04-0J)6M, а также в ряде опытов 0,16-1мМ C11SO4 и/или 1,3-дифенилмочевину (ДФМ) в концентрации 20мкМ. Для контроля в смесь вместо белкового препарата добавляли'50 мкл соответствующего буфера. Реакционные смеси инкубировали в термостате при 37°С в течение 0,5-16ч. Реакцию останавливали добавлением 0,2 мл холодного этанола и проводили центрифугирование при 5000g в течение 10 мин. Содержание ИПА в супернатанте оценивали с помощью иммуноферментного анализа в тест-системе для определения нзопеитениладенозина/ изопентениладенина. Активность ферментов, катаболизирующих ИПА, оценивали по разнице между уровнем добавляемого к растительному образцу ИПА и количеством гормона, которое определялось в смеси после инкубации его с белковым препаратом. Все опыты проводили в двух биологических и четырех химических повторностях.

Приготовление коньюгата гормона с белком и получение антител. Коныогацию ИПА с овальбумином осуществляли с помощью периодата натрия по методу Эрланжера и Бейзера (Erlanger, Beiser, 1964). Сыворотку к гормону получали как описано у Г.Р. Кудояровой (Кудоярова и др., 1990).

Твердофазный иммунофрментный анализ. Для иммуноа-нализа ИПА использовали вариант, при котором коныогат белка с гормоном сорбировали на твердой фазе (Veselov et al., 1992) и после стадии взаимодействия твердофазного и свободного антигена с антителами кролика против ИПА реакцию проявляли с помощью антикроличьего пероксидазного коньюгата (Кудоярова и др., 1990). Кросс-реактивность данной гест-системы составила 100% для ИПА, не более 1,6% для производных зеатнна (3) и не выше 2% для производных дигидрозеатина (ДГЗ). Аденин был не реактивен. Чувствительность анализа составила 20 икг/0,1 мл.

ИФА. других фитогормонов проводили по той же схеме, но использовали соответствующие коньюгаты гормона с белком и сыворотоки.

Определение белка и препарате проводили по методу Ло-ури (Lowory et al., 1951).

Для определения изменения концентрации цитокинннов (ЦК) и активности цптокининоксидазы под влиянием различных факторов проводили следующие эксперименты:

Охлаждение корней восьмисуточных проростков пшеницы проводили путем добавления к питательному раствору льда. Контролем служили побеги растений, которые не подвергались охлаждению.

Обрезание корней. У растений пшеницы убирали зерновку, у опытных растений удаляли часть корневой системы, оставляя на побеге один корень, у контрольных растений корни не удалялись. Далее контрольные и опытные растения помещали в стаканчики с 10% средой Хогланда-Арнона 1.

При исследовании действия ионов кадмия на содержание ЦК в растениях пшеницы ацетат кадмия (10мг/л) вводили в питательный раствор. Влияние ионов кадмия на активность ПКО исследовали при добавлении ацетата кадмия (0,04; 0,4; 4,0 м'Ч) в реакционную смесь с ферментом.

Дегидратация. Перед гомогенизацией отделенные от эндосперма проростки кукурузы подсушивались на фильтровальной бумаге в течение 30 мин при комнатной температуре (24°С). Контрольные проростки гомогенизировали сразу после удаления эндосперма.

Экстракцию, очистку и разделение гормоноа проводили как описано у С.10. Веселова (Веселов и др., 1992, 1997).

Препараты рибосом получали по (Еркеев и Кудоярова,

19X1).

Статистическую обработку проводили по стандартным программам. На рисунках и в таблицах приведены средние значения параметров и их статистическая ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка метода определения тпокишшокшдагм

Активность ЦКО мы оценивали по разнице между уровнем добавляемого к препарату фермента субстрата (ИПА) и его количеством п реакционной смеси после инкубации, которое определяли с помощью ИФА. Последовательность этапов, предлагаемой методики с использованием в финальной части иммуноанализа ИПА, представлена на рис. 1.

гомогенизация растительной ткани центрифугирование (12000g, 25 мин) фильтрование через бумажный фильтр осаждение белков (NH.t^SO.i центрифугирование(5000g, 15 мин)

ресуспензирование осадка в буфере

добавление в реакционную смесь,

содержащую стандарт ИПА „ *

инкуоирование остановка реакции 96% этанолом

упаривание до водного остатка I

--> ИфД

Рис.1. Схема проведения анализа активности цитокининоксидазы.

Поскольку присутствующие в растительном гомогенате ЦК могли составить конкуренцию стандарту ИПА, добавляемому в инкубационную среду, а также повлиять на результаты имму-ноферментного анализа, мы проводили контроль на эндогенные цитокинины. Оказалось, что осаждение белков с помощью сульфата аммония приводило к практически полной очистке препарата от собственных цитокининов.

Как видно из таблицы I, после добавления стандарта пзо-пентениладенозина к образцам, содержащим грис-буфер и белковый препарат из проростков кукурузы, наблюдалось уменьшение количества ИПА, зарегистрированное с помощью ИФА. Это могло происходить в результате либо окисления ИПА при участии цитокининоксидазы, либо вследствие трансформации его в другие формы цитокининов, которые проявляют низкую иммунореак-тивность в данной тест-системе. Для проверки первого предположения е инкубационную смесь вводили известные активаторы (имндазол. ионы меди) и ингибитор (дифенилмочевнна) цитокининоксидазы (Chatfield, Armstrong, 1987; Laloue, Fox, 1989).

Таблица 1

Влияние различных ингредиентов инкубационной среды на деградацию ИГ1Л под воздействием белкового преш.рага _из проростков кукурузы_____

Состав инкубационной среды Количество деградированного ИПА (пкмоль/мг белка за час)

0,06М трис-НС1 буфер (рН=7,1) 234 ± 16

0,06М трис-НС1 буфер (рН-7,1) + СиБОл (0,16 мМ) 451 ±32

0,06М имидазол-НС1 буфер (рН=7,1) 432 ± 30

0,06М имидазол-НС1 буфер (рН=7,1) + СиБСЬ (0,16 мМ) 661 ± 46

0,06М имидазол-НС1 буфер (рН=7,1) ± СиБС^ (0,16мМ) + 1,3-дифенилмочевнна (20мкМ) 441 ±31

Из таблицы 1 видно, что добавление в инкубационную среду ионов меди и|или] имидазольного буфера приводило к повышению инактивации ИПА под действием белкового препарата, а введение ДФМ, к ее снижению. Это указывало на возможность того, что процесс убыли цитокининов в инкубационной смеси связан с активностью цитокининоксидазы.

Для проверки возможной, наряду с окислением, трансформации ИПА в другие формы цитокининов, в частности в зеатин (зеатинрибозид) или дигидрозеатин (дигидрбзеатинрпбозид), мы проводили тестирование образцов в тест-системах для определения этих фитогормонов. При этом присутствие цитокининов ряда зеатина и дигидрозеатина в исследуемых образцах не было обнаружено. Это свидетельствовало о том, что во всех указанных выше экспериментах убывание ИПА в ходе реакции не сопровождалось трансформацией его в другие формы цитокининов.

Таким образом, используя активаторы и ингибиторы ЦКО, а также контролируя возможную трансформацию ИПА в другие формы цитокининов, мы обеспечиваем специфичность предлагаемой методики.

На следующем этапе работы мы подбирали оптимальные условия для проведения реакции и получения достоверных результатов.

При выборе оптимальной концентрации изопентениладе-нозина (ИПА), добавляемого в реакционную смесь, мы руководствовались двумя критериями. Во-первых, в ходе инкубации с

ферментом должно было деградировать около 50 или более процентов внесенного количества ИГТА. Это условие было связано с тем, что небольшие различия между уровнями И ПА, определяемыми с помощью ИФА, в контроле и в образцах после инкубации могут привести к снижению точности и достоверности анализа. Для достижения возможно более высокой точности метода важно такхе, чтобы измерение количества добавленною гормона осуществлялось на прямолинейном участке концентрационной кривой ИФА.

Нами было показано, что оптимальное количество стандарта ИПА, добавляемого в реакционную среду, - 30 нг. При подборе оптимальной концентрации имидазольного буфера было показано, что уровень имидазола в реакционной смеси не оказывает значительного влияния на степень повышения активность цитокининоксидазы. Поэтому, в дальнейших своих опытах мы использовали имидазольный буфер в конечной концентрации 0,04 М. В процессе изучения влияния различных концентраций ионов меди на активность цитокининоксидазы из проростков кукурузы было установлено, что при добавление СиБО^ до конечной концентрации I мМ активность фермента возрастала примерно в 2 раза. Увеличение концентрации сульфата меди до 20-100мМ приводило к нарушению взаимодействия антиген-антитело в ИФА и делало вообще невозможным определение гормона. Для стандартизации методики определения цитокининоксидазы необходимо было также установить границы, в которых наблюдается пропорциональная зависимость ферментативной активности от концентрации фермента и времени инкубации его с субстратом. Исследование уровня деградации ИПА в зависимости от продолжительности инкубации реакционной смеси показало, что пропорциональность между временем воздействия фермента и степенью деградации ИПА наблюдается в течение первых двух часов инкубации.

Н;1 рис.2 представлена динамика деградации стандарта ИПА в зависимости от степени разведения препарата фермента. Из рисунка видно, что при инкубации образцов, содержащих имидазольный буфер и ионы меди, в течение 1 часа наблюдалась прямая зависимость между разведением добавляемого в смесь препарата и инактивацией ИПА, кроме случая, когда препарат разводили в 8 раз.

1 I

з- 20

<

0

1/2

1/4 1/8

разведение препарата

Рис. 2. Влияние степени разведения белкового препарата из проростков кукурузы на активность фермента.

Таким образом, добавляя в реакционную смесь 30 нг изопентснн-ладенозина, мы могли достоверно зарегистрировать деградацию 7 нг (209 нМ) ИГ1А при разведении исходного препарата фермента в 4 раза. Метод оценки активности цитокин иноке ид азы, основанный на колориметрическом определении образующегося в процессе окисления З-метил-2-бутеналя, позволяет определять до 1мкМ указанного продукта (Libreros-Minotta, Tipton, 1995). То есть, предложенная нами методика оказалась в 5 раз более чувствительной. Однако, принимая во внимание способность ИФА выявлять крайне низкие концентрации гаптена (в нашем случае до 20 пкг ИПА в образце), теоретически, за счет снижения количества добавляемого в реакционную среду изопентениладенозина возможно зарегистрировать деградацию всего 600 пкМ гормона. Такая высокая чувствительность сразнима с чувствительностью методов оценки активности цитокининоксидазы, основанныч на использовании радиоизотопов. Однако, по сравнению с радиоизотопным определением наш вариант определения активности ЦКО являегся более простым. Коэффициент вариации метода составил около 15%.

Таким образом, в процессе наших изысканий был разработан высокочувствительный и достаточно специфичный метод оп-

ределения активности цитокининоксидазы.

2. Определение оптимальных параметров работы цитокининоксидазы из проростков кукурузы и побегов

пшеницы

Максимальная активность фермента из проростков кукурузы наблюдалась при рН 7,0. ЦКО из побег ов проростков пшеницы проявляла активность в широком диапазоне (рН 7,0-8,5) с достоверным возрастанием активности при рН 7,5 и рН 8,5.

На рис. 3 представлены результаты исследования влияния температуры на активность цитокининоксидаз.

200

10 20 30 40 тсмпсратура.°С

пшеница кукуруза

Рис. 3. Влияние температуры на активность цитокининоксидаз из проростков кукурузы и из побегов пшеницы. По оси ординат ооозиачено количество дег радированного ИПА/ мг белка за 1ч (кукуруза) или за 16ч (пшеница).

Как видно из рисунка, максимальная активность фермента из проростков кукурузы наблюдалась при температуре 45°С, а ЦКО из побегов пшеницы при 37°С. Это говорит о том, что при температуре 37"С в тканях растений пшеницы резко возрастает активность фермента, разрушающего цитокинины. У кукурузы оптимум работы данного фермента смещен в область более высоких температур. В результате при той температуре, при которой у пшеницы цитокинины окисляются с максимально высокой скоростью, у кукурузы этот фермент работает с интенсивностью, еще

далекой от максимальной. Учитывая стимулирующее действие ЦК на рост, можно отметить, что приведенные данные хорошо согласуются с тем, что у пшеницы ингибирование роста и снижение урожайности происходит при температуре превышающей 24°С, в то время как для кукурузы 35°С - это еще температура, при которой возможен ее активный рост. Таким образом., сравнительное изучение температурного оптимума у растении пшеницы и кукурузы подтверждает функциональную роль ципнсилннокси-дазы в регуляции роста растений через изменение концентрации в них цитокининов.

Результаты исследования субстратной специфичности ЦКО из проростков кукурузы представлены в таблице 2.

Таблица 2

Субстратная специфичность цитокининоксидазы из проростков

кукурузы

Стандарт гормона (100 иг) Количество деградировя вше] о гормона(нг/0,л мл)

инкубация 1ч инкубация 2ч

изопентениладенозин 36,9 ± 1,1 61,0 ± 3,3

зеатин 20,6 ± 1,85 49.9 ± 4,5

Ж-глюкозид зеатина (N91^3) 13,2 ±0,6 3 1.9 ± 1,44

дигидрозеатинрибозид (ДГЗР) 0 С

Как видно из таблицы, цитокининоксидаза из проростков кукурузы наиболее легко окисляет изопентениладенозин и имеет высокое сродство к зеатину. 1М9-глюкозид зеатина также является субстратом этого фермента, но окисляется в меньшей степени, чем ИГ1А и 3. Дигидрозеатинрибозид оказался устойчивым по отношению к цитокининоксидазе. Эти результаты совпадают с литературными данными о субстратной специфичности цитокининоксидазы и также свидетельствуют о том, что в растительных тканях этот фермент может участвовать в регуляции уровня физиологически активных форм эндогенных цитокининов.

3. Исследование роли цитокининоксидазы в физиологических процессах

В предварительных исследованиях были получены результаты, указывающие на возможное участие цитокининоксидазы в регуляции содержания цитокининов при ответе растении на внешние воздействия. Для проверки этого предположения активность цитокининоксидазы определяли в тканях растений, испытывающих различные воздействия.

3.L Динамика содержания гормонов и активность цнтокмниноксидазы в проростках пшеницы при охлаждении

корней

Было изучено влияние на растения резкого охлаждения питательного раствора при добавлении к нему льда. Такое локальное понижение температуры корневой зоны испытывают активно транопирирующие тепличные растения при поливе холодной водой (Fennell, Markhart, 1998).

Как видно из рис. 4, содержание цитокининов в побеге снижалось в пять раз уже через 15 мин после начала охлаждения питательного раствора. Одновременно замедлялся рост побега. Это позволило нам предположить, что уменьшение содержания цитокининов в побеге могло способствовать торможению его роста. Так как уровень гормона в корнях через 15 мин после начала охлаждения повышался (рис. 4), снижение концентрации цитокининов в побеге могло быть следствием ингибирования их транспорта из корня. Однако, было показано, что растениям нужно не меньше 1ч, чтобы получить из корней столько цитокининов, сколько содержится в их побегах (Веселов, 1999). Следовательно, даже полное прекращение поступления цитокининов из корней при неизменной скорости распада гормона не могло привести к снижению его содержания в побеге в 5 раз, которое мы наблюдали через 15 мин после начала охлаждения корней.

' о 200 т

. о F

"; 11 150 «j

ё д •

а о ЮО

<и tr

::: -а

в о

«J и

к ^ 50

П. X

«

1-Т

о

О о

-30 0 30 60 90 120 Время от начала охлаждения, мин

Рис. 4. Влияние охлаждения корней растений пшеницы на содержание цитокининов.

1Ь

Вероятно, при охлаждении корней происходила активация процесса распада гормона в побеге. Для проверки этого, мы определили активность цитокининокендазы в побегах проростков пшеницы до и через 15 мин после начала охлаждения корней (таблица 3). Как видно из таблицы, скорость распада ИПА в без-клеточной системе с ферментом, выделенным и5 побегав растений с охлажденными корнями, была выше по сравнению с контролем. В обоих случаях добавление ионов меди в инкубационную смесь увеличивало деградацию ИПА, а введение ДФМ инги-бировало ее. Полученные результаты свидетельствовали о том, что резкое снижение концентрации цитокининов в побеге, наблюдаемое при охлаждении корней, происходит в результате повышения активности цитокининокендазы в побеге.

Таблица 3

Влияние охлаждения корней пшеницы на активность цитокининокендазы в побегах

Состав инкубационной смеси Количество деградированного (пкмоль/мг белка за 16ч)

контроль опыт

0,04М имидазол-HCl буфер 476,0 ± 7,1 576,7 ± 11,3

0,04М имидазол-HCl буфер 4 CuS04(1mM) 573,3 ± 10,7 763,9 ± 8,8

0,04М имидазол-HCl буфер ь ДФМ (20мкМ) 367,2 ± 6,4 442,8 ± 9,6

В наших опытах охлаждение корней приводило к возрастанию содержания ИУК в побегах (данные приведены в диссертации), что, возможно, являегся результатом освобождения гормона из связанных форм под влиянием электрического сигнала, быстро распространяющегося из корней (Кудоярова и др., 1990; Fromm et al., 1995). Эти данные представляют интерес в связи с тем, что ИУК способна активировать цитокининоксидазу (Hare, Van Staden, 1994).

В результат е охлаждения корней вслед за потерей тургора наблюдалось его восстановление, что говорит о закрытии устьиц. Этому могло способствовать уменьшение содержания цитокининов, которые способствуют поддержанию устьиц в открытом состоянии (Mansfield, McAinsh, 1995).

Таким образом, показано увеличение активности цитокининокендазы в побеге под влиянием охлаждения корней, которое

приводит к быстрому снижению концентрации цитокининов, что может играть важную роль в торможении роста и снижении транспирации и тем самым обеспечивать приспособление водного обмена и других физиологических функций к данному неблагоприятному фактору.

3.2. Активность цигокининоксидазы и побегах растений с частично удаленной корневой системой

Известно, что основная масса цитокининов образуется в . корнях. Поэтому предполагалось, что удаление большей части гормон-иродуцирующего органа (удаляли 4 корня из пяти) приведет к снижению содержания этих фитогормонов в побеге. Определение концентрации цитокннинов в пасоке показало, что после обрезания части корней в побег 1 растения за 1ч поступало 30 вместо 100 нг ЦК. Однако, как видно из рисунка 5, содержание цитокининов в побегах растений с удаленными корнями было не ниже, а выше, чем у контрольных растений.

контроль

—с1- опыт

время после удаления корнем, ч

Рис. 5. Динамика концентрации цитокининов в побегах контрольных растений (контроль) и растений с частично удаленными корнями (опыт).

растет (опыт).

Эксперименты, которые проводились в лаборатории ИБ УНЦ РАН (УуяоТзкауа е( а!., 1999), исключали возможность освобождения цитокининов из запасных форм, содержащихся в побеге. Оставалось предположить, что высокий уровень гормона в побеге растений с частично удаленными корнями поддерживался за счет снижения активности распада цитокининов.

Из таблицы 4 видно, что удаление части корней приводило к снижению активности цитокинииоксидазы. Введение в инкубационную среду и.мидазола и ионов меди повышало активность фермента, выделенного как из контрольных, так и из опытных растений. Эти результаты подтверждают предположение о том, что высокий уровень цитокининов. в побеге растений с частично удаленными корнями поддерживается за счет снижения активности распада гормона в этом органе.

Таблица 4

Активность цитокинииоксидазы из побегов проростков пшеницы

поеле удаления части корневой системы

Время после удаления корней (мин) Количество деградированного ИПА (пкмоль/мг белка за 16ч)

0,0 4 М трис-НС1 буфер 0,04М имидазол- НС1 буфер + Си80.| (1 мМ)

контроль опыт контроль опыт

30 428 ± 19 319 ± 15 852 ±41 607 ± 29

60 293 ± 10 2*70 ± 8 600 ± 23 524 ±25

Таким образам, наши результаты свидетельствуют о том, что транспорт гормонов из корней не является единственным фактором, определяющим содержание цитокининов в побегах. Изменение активности цитокинииоксидазы позволяет побегу активно регулировать концентрацию своих цитокининов, что в свою очередь обеспечивает возможност ь, контролирования процессов в соответствие с физиологическим состоянием побега (например, складывающимся водным статусом).

3.3. Влияние ионов кадмия на активность ЦИТОКШШ11 оксидязы

Еще одним воздействием, при котором быстрое изменение концентрации цитокининов указывало на возможную регулятор-ную роль цитокинииоксидазы, был кадмий. Имеется ряд работ, в которых показано влияние кадмия на содержание цитокининов в растениях (7.¡гагоуа, 11о1иЬ, 1993). Однако, механизм действия кадмия при этом оставался неясным. В тоже время установлено,

что предварительная обработка растений цитокининами приводит к повышению их устойчивости к кадмию (Бессонова и др., 1985).

и о х

х о н

3

Е

из *

о. <ч п о О

к Ч о

а. н

к о т

н о

О

I

3

12

Время действия кадмия, ч

Рис. 6. Влияние кадмия (0,04 мМ) на суммарное содержание цитокининов в побегах и корнях 13-дневных проростков пшеницы.

Таблица 5

Влияние различных концентраций ионов кадмия на активность цитокининоксидазы из побегов пшеницы

Конц-я ' ацетата кадмия в реакционной смеси (мМ) Кол-во деградированного ИПА (пкмоль/мг белка за 16ч) Активирование режции в присутствии Си 1 и имндазола Ингибирование реакции ДФМ

пкмоль/мг белка за 16ч % * пкмоль/м г белка за 16ч %

0 315,2± 11,0 882,3^39,7 2.79,9 78,8±3,5 24,7

0,04 450,0±18,3 1020,0*63,1 226,7 128,0^=4,0 28,4

0,4 372,&± 13,1 900,>±30,9 241,9 74,6*2,6 19,8

4 2б8,5±10,7 728,2*24,2 271,6 47,1*1,8 17,5

Как видно из рис. 6, в результате воздействия кадмия концентрация цитокининов в побегах и корнях сначала быстро снижалась, а через 2 ч резко возрастала. Сравнительный анализ изменения концентрации цитокининов и скорости роста свидетельствовал о возможном участии цитокининов в регуляции ростового ответа растений на добавление кадмия в питательную среду. Тем более важно было понять механизм действия токсичного иона на концентрацию гормона. Для того чтобы проверить, влияет ли

кадмий на активность цитокининоксидазы, раствор ацетата кадмия в различных концентрациях добавляли в инкубационную среду, содержащую ИIIА и препарат фермента, выделенный из проростков пшеницы. При такой постановке опыта мы могли оценить прямое влияние токсичного металла на активность фермента. Как видно из таблицы 5, в низких концентрациях кадмии увеличивал активность цитокининоксидазы, а и высокой - ингибировал ее.

Таким образом, снижение концентрации цитокининов сразу же после введения кадмия в питательную среду, может быть следствием активации цитокининоксидазы. В результате дальнейшего поглощения кадмия, его концентрация в тканях может локально достигать чех значений, при которых кадмий подавляет активность фермента, что может быть причиной наблюдаемого в конце эксперимента увеличения концентрации цитокининов.

3.4. Активность цигокишшоксндазы в проростках кукурузы при дегидратации

Другой пример быстрых изменений концентрации цитокининов, в которых, как нам казалось, цитокининоксидаза может принимать участие, - дегидратация проростков кукурузы.

Известно, что дефицит воды снижает активность физиологических процессов у растений (Мелехов, 1985). В частности подавляется активность синтеза белка, что проявляется в уменьшении количества полисом в препарате рибосом. Такая реакция имеет приспособительное значение, т.к. прекращение тотального синтеза белка обеспечивает возможность мобилизации ресурсов на синтез защитных белков (Шакирова и др., 1982).

Мы выделили препарат рибосом из четырехсуточных проростков кукурузы, которые сразу же после отделения от эндосперма фиксировали жидким азотом (контроль) или подсушивали в течение 30 минут (дегидратация). Как видно из рис. 7, в препарате рибосом, выделенных из подсушенных проростков кукурузы, присутствовали практически одни неработающие рибосомы (моносомы), которые обнаруживались во фракциях 23-24.

Было важно попытаться понять, каким образом регулируется такая быстрая разборка полисом при дегидратации. Известно, что цитокинины оказывают влияние на активность синтеза белка (Кулаева, 1982) и сборку полисом (Шакирова и др., 1982). Поэтому в проростках кукурузы при дегидратации было исследовано содержание цитокининов.

л н о о к н о

к

СЗ

иг о <и Г

н с О

о ю гч

5.

с

1,2 т 1 -0,8 -0,6 -0,4« 0,2«

0

о

■ контроль ■дегидратация

10 15 20 Номер фракции

25 30

Рис. 7. Влияние дегидратации на содержание полисом в препаратах рибосом, выделенных из проростков кукурузы.

со о

е

е О

3 8

о з

н ~

3 о о В-

е л

е и

§ ^

К и

О- д

4 <и о О

700 у 600 -500 -400 -300 200 --

100 «

X

контроль

□ :зп ВЗР шз

!=ЗШШИ.

дегидратация

Рис. 8. Влияние дегидратации на содержание цитокининов в проростках кукурузы.

Оказалось, что через 30 мин после начала дегидратации уровень зеатина и его рибозида в проростках кукурузы снижался в 20-25 раз по сравнению с контролем, в то время как концентрация нук-

леотида зеатина не изменялась (рис. 8). Снижение содержания ци-токининоп в проростках кукурузы при дегидратации могло быть тем самым регулирующим фактором, который вызывает быстрое прекращение синтеза белка. Поэтому, было очень важно попытаться выяснить, каким образом может так быстро снижаться концентрация цитокннинов. С этой целью из тканей контрольных и подвергнутых дегидратации проростков кукурузы был выделен препарат ферментов, в котором in vitro определяли активность цитокининоксидазы. Результаты определений представлены в таблице 6. Из таблицы видно, что дегидратация действительно повышает активность цитокининоксидазы. Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение содержания цитокннинов в процессе дегидратации могло быть следствием повышения активности цитокининоксидазы.

Таблица 6

Влияние дегидратации на активность цитокининоксидазы

из проростков кукурузы

Состав инкубационной среды Количество деградированного (пкмоль/мг белка за 2 ч)

ненодсушен-н ые подсушенные

0,04М трис- НС1 буфер 52,6 ± 1,75 74,9 ± 4,0

0,04М имидазол-HCl оуфер 161,3 ±3,1 273,1 ±9,2

0,04М имидазол-HCl буфер + CuS04(1mM) 466,9 ± 7,3 505,8 ± 5,5

Представляет также интерес обсуждение изменений спектра цитокннинов при дефиците йоды. Содержание нуклеотида зеатина в отличие от зеатина и его рибозида не изменялось. Судя по данным литературы, нуклеогид зеатина устойчив к действию цитокининоксидазы (Laloue, Fox, 1989). Таким образом, быстрое снижение содержания зеатина и его рибозида, являющихся подходящими субстратами для цитокининоксидазы, и сохранение уровня устойчивого . к цитокининоксидазе нуклеотида зеатина, еще раз подтверждает, что изменения концентрации цитокннинов являются следствием процессов распада, катализируемых данным ферментом.

Таким образом, с помощью разработанного нами метода было обнаружено, что цитокиншюксидаза участвует в регуляции концентрации цитокннинов при ряде воздействий. Это может быть важным фактором, регулирующим адаптацию к изменениям

условий окружающей среды.

ВЫВОДЫ:

!. На основе иммуноферментного анализа изопентениладе-нозина разработан высокочувствительный метод определения ци-токининоксидазы, не предполагающий использование радиоактивных изотопов.

2. Для обеспечения специфичности определения ЦКО рекомендуется использовать известные активаторы (имидазол, ионы меди) и ингибитор (дифеннлмочевина) фермента.

3. С помощью разработанного метода показано, что субстратная избирательность цитокининоксидазы из проростков кукурузы падает в ряду - изопентениладснозин (100%), зеатин (60%), 9-Ы-глюкозид зеатинг, (35%), дигидрозеатин (0%). Таким образом, фермент может контролировать концентрацию цитоки-нпнов не только за счет инакт ивации предшественника активной формы гормона (ИПА), синтезирующегося в корнях, но и за счет катаболизирования физиологически активной формы - зеатина.

3. Впервые показаны различия в температурном оптимуме цитокининоксидазы из проростков пшеницы и кукурузы. Обнаружено, что цитокининоксидиа, выделенная из проростков пшеницы, проявляет максимальную активность при более низкой температуре, чем фермент, выделенный из проростков кукурузы, что соответствует более высокой жароустойчивости кукурузы по сравнению с пшеницей.

4. Обнаружено повышение активности фермента в побегах в результате охлаждения корней, и снижение его активности в побегах растений пшенмцы с частично удаленной корневой системой, что являегся одной из причин быстрот уменьшения содержания цитокининов в нервом случае и их накопления во втором.

5. В опытах in vitro выявлена активация цитокининоксидазы низкими концентрациями кадмия и ингибирование ее активности - более высокими концентрациями, что может быть одним из механизмов, обуславливающих первоначальное снижение и последующее увеличение концентрации цитокининов при действии данного токсичного металла на растения пшеницы.

6. Обнаружена активация цитокининоксидазы при дегидратации проростков кукурузы, что совопровождаегся и может быть причиной снижения концентрации цитокининов и активности трансляционного аппарата растений.

7. Сравнительный анализ действия ряда факторов на активность цитокининоксидазы, содержание цитокининов в растении и активность процессов, контролируемых цитокининами, демонстрирует функциональную роль цитокининоксидазы в обеспечении гормопзависимых реакций растения.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1) Veselov S., Ivanova Т., Simonyan М., Melentyev А., Kudoyarova G. Immunoassay of eytokinins produced by ryzosphere microorganisms // Abst. 5th symposium international society of root recerches. Madren Conference Center-Clemson, South Carolina, July I4-18,1996.-P.127.

2) Веселок С.Ю., Симонян MB., Усманов И.lO. Определение активности питокинниоксидазы в проростках кукурузы с помощью иммуноферментного анализа // В сб. тезисов докладов: «Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1996 год»,- Уфа: Изд-во БашГУ, 1997,- С.50-51.

3) Симонян М.В. Использование иммуноферментного анализа для оценки активности цитокининоксидазы // В сб. тезисов докладов науч. конф. студентов и молодых ученых биологического факультета.- Уфа: Изд-во БашГУ, 1997,- С. 39.

4) Veselov S., Ivanova Т., Simonyan М., Melentyev А., Kudoyarova G. Immunoassay of eytokinins produced by ryzosphere microorganisms// Proceedings of 511 symposium international society of root recerches. (J.E.Box ed.) - Amsterdam: Kluwer Acad. Publ., 1998. -P.641-649.

5) Веселой С. 10., Иванова ГГ. H., Симонян М. В., Меленть-ев А. И. Исследование цитокининов, продуцируемых ризосфер-ными микроорганизмами // Прикладная биохимия и микробиология,- 1998,- Т.34, № 2,-С. 175-179.

6) Симонян MB., Усманов И.Ю., Веселое С.Ю. Определение цитокининоксидазы в проростках кукурузы с помощью иммуноферментного анализа и исследование ее регуляции in vitro // В сб. научных трудов «Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1997 год»,- Уфа: Изд-во БашГУ, 1998,- С.6-12.

7) Фархутдинов Р.Г., Митриченко А.Н, Теплова И.Р., Симонян М.В., Веселов С.Ю., Кудоярова Г. Р. Ростовой и гормональный ответ растений пшеницы на охлаждение корней // В сб. научных трудов: «Итоги научных исследований биологического факультета БашГУ за 1997 год».- Уфа: Изд-во БашГУ, 1998 - С. 12-

8) Высоцкая Jl.Б., Тимергалина JI.H., Симонян М.В., Веселое С.Ю. Регуляция содержания цитокининов у проростков пшеницы с частично удаленной корневой системой // В сб. тезисов докладов IV съезда общества физиологов растений: «Физиология растений - наука III тысячелетия».-Москва, 4-9 октября, 1999,-С.549.

9) Symonyan М., Usmanov I., Veselov S. Immunoassay of the conversion of isopentenyl riboside by cell free system from maize and wheat seedlings // Abstracts of the 11"1 Congress of Federation of European Society of Plant Physiology, Varna, Bulgaria, September 711, 1998.-P.134.

10) Vysotskaya L.B., Timergalina L.N.,. Simonyan M.V, Veselov S.Yu., Kudoyarova G.R. Growth rate, IAA and cytokinin content of wheat seedling after root pruning // Plant Growth Regul. -1999.-(in press). .

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Симонян, Марианна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

1 /М1 л/л I"» : 11 ITi; I1! 4 'Г* / !> * Т

1. UDJUr JlULlErAl УГВ1.

1.1. Цитокинины.

1.1.1. Химическая структура и распространение в растительных организмах.

1.1.2. Физиологическое действие.

1.1.3. Место образования цитокининов и их транспорт.

1.1.4. Биосинтез, метаболизм и катаболизм.

1.2. Цитокининокеидаза.

1.2.1. Распространение.

1.2.2. Окислительный механизм реакции.

1.2.3. Классификация.

1.2.4. Молекулярная масса, рН и температурный оптимумы.

1.2.5. Субстратная специфичность.

1.2.6. Механизмы регуляции активности цитокининоксидазы.

I Т 1 \ /" I т пt i I /л г» лйптл! » »i^yroi^Amroira 1111'l'HI-IJ IIII11 /Ml

1.Z. / . j lavinv и uv-W-Uvivi ivxv^хаиилиотч^ цтилипИпив.

1.2.8. Методы определения цитокининоксидазы.

2. МАТЕРИАЛЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и реактивы.

0 О ^ Т Т ТТ I /лтл гтт т Т1ЛЛТТЛ ттлп гч гит гт z-.z,. wudi^KI 1»! и мсхиДт и^лсдОвапил.

2.2.1. Использованные в работе растения и их выращивание.

2.2.2. Определение активности ферментов, катаболизирующих

1 !'1/ЛГ1 1-ГОТ t I 1 - 111 ттаттАгутттт wooiiwni wnwjid/i.urn-ioi'iri.

2.2.3. Определение эндогенных гормонов в растениях.

2.2.4. Физиологические эксперименты с растениями.

2 О ^ U лггл>» яf\г^пт^л гтт ттт та к гтт т jjviiuiviOi aic-jii>ni>iw

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка метода определения цитокининоксидазы.

3.2. Исследование оптимальных параметров работы цитокининоксидазы из проростков кукурузы и пшеницы.

3.3. Исследование роли цитокининоксидазы в физиологических процессах.

3.3.1. Динамика содержания гормонов и активность цитокининоксидазы в проростках пшеницы при охлаждении корней.

3.3.2. Активность цитокининоксидазы в побегах растений с частично удаленной корневой системой.

3.3.3. Влияние ионов кадмия на активность цитокининоксидазы.

3.3.4. Активность цитокининоксидазы в проростках кукурузы при дегидратации.

4. ВЫВОДЫ.