Использование биолюминесцентных систем для изучения закономерностей детоксикации растворов модельных поллютантов гуминовыми веществами

Тарасова, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование биолюминесцентных систем для изучения закономерностей детоксикации растворов модельных поллютантов гуминовыми веществами
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Использование биолюминесцентных систем для изучения закономерностей детоксикации растворов модельных поллютантов гуминовыми веществами"

На правах рукописи

АЦ1

Тарасова Анна Сергеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ СИСТЕМ Д ЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ДЕТОКСИКАЦИИ РАСТВОРОВ МОДЕЛЬНЫХ ПОЛЛЮТАНТОВ ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

03.01.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ДЕК 2012

Красноярск - 2012

005056579

Работа выполнена на кафедре биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», г. Красноярск.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Кудряшева Надежда Степановна

Официальные оппоненты: Новиков Кирилл Николаевич

доктор биологических наук. Московский государственный университет им. М.В Ломоносова, Биологический факультет, лаборатория физико-химии биомембран, ведущий научный сотрудник.

Тихомиров Александр Аполлинарьевич доктор биологических наук, профессор. ФГБУН Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория управления биосинтезом фоготрофов, заведующий лабораторией.

Ведущая организация: ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов, Россия.

Защита состоится «25» декабря 2012 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д. 003.007.01. при ФГБУН Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 660036, г.Красноярск, ул. Академгородок, 50, стр. 50, актовый зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, ул. Академгородок, 50, стр. 50.

Автореферат разослан «Х(У> ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Франк Л. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В связи с ростом антропогенной нагрузки на окружающую среду, в настоящее время актуальным является поиск эффективных методов ремедиации природных вод. При этом осознается необходимость изучения механизмов нейтрализации токсичных соединений в природных условиях и использования выявленных закономерностей в ремедиационных мероприятиях.

Способность гуминовых веществ снижать токсичность растворов является предметом интереса для многих исследователей [1, 2]. Известно, что карбоксильные, хиноидные, фенольные, ЯН- и другие электронно-донорные группы гуминовых веществ способны связывать, и, следовательно, уменьшать содержание ионов металлов в водных экосистемах. Фенольные, БН- и другие группы макромолекул гуминовых веществ, обладающие восстановительной активностью, снижают токсичность растворов окислителей. Гидрофобные фрагменты гуминовых веществ ответственны за связывание амфифильных молекул поллютантов. Таким образом, в настоящее время предполагается, что детоксицирующая способность гуминовых веществ является следствием гидрофобного связывания, комгшексообразовательных и окислительно-восстановительных процессов, которые приводят к уменьшению концентрации свободных токсичных соединений в водных растворах. Вместе с тем, термин «токсичность» является не только химическим, но и биологическим. Токсичность среды определяется реакцией организмов на неблагоприятное воздействие токсичных веществ. В настоящее время именно реакция организмов на воздействие токсичных соединений, а также изменение токсичности в присутствии гуминовых веществ представляют наибольший интерес.

Биолюминесцентные биотесты, основанные на светящихся бактериях, являются удобными системами для мониторинга состояния среды при оценке эффективности детоксикации сточных и природных вод. Эти биотесты характеризуются надежностью, высокой скоростью анализа,

чувствительностью, возможностью приборной регистрации и количественной оценки токсичности. Кроме того, возможность использования биолюминесцентных систем различной сложности (биолюминесцентные бактерии и выделенные ферменты), позволяет сравнивать эффекты на клеточном и биохимическом уровнях.

Самыми распространенными загрязнителями окружающей среды являются соли металлов и фенольные соединения, а также продукты окисления фенолов - хиноны. Являясь водорастворимыми отходами различных производств, эти соединения проникают как в природные водоемы, так и в гумусовые горизонты почв.

Цель работы - выявление с помогцыо биолюминесцентных тестовых систем закономерностей детоксикации гумиловыми веществами водных растворов модельных поллютангов.

В качестве модельных поллютавтов использованы неорганические и органические соединения - соли металлов, редокс-нара 1,4-бензохинон - 1,4-гидрохинон.

Постановка задач работы продиктована как прикладным, так и фундаментальным аспектами, а именно, необходимостью поиска условий наиболее эффективной детоксикации растворов гуминовыми веществами и выявлением механизмов этих процессов.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Оценка изменения общей и окислительной токсичности растворов модельных поллютангов (РЬ(Ы03)2, СоС12, Си304, Еи(ЫОз)з, СгС13,К3[Ре(СЫ)6] и пары 1,4-бензохинон - гидрохинон) при воздействии гумиповых веществ. Расчет коэффициентов детоксикации производили с помощью двух люминесцентных тестовых систем - системы сопряженных ферментативных реакций и лиофилизированных бактерий РИо(оЬас1ег1ит рЪозрИогеит.

2. Определение условий наиболее эффективной детоксикации растворов модельных поллютангов путем варьирования концентрации гуминовых веществ и времени предварительного инкубирования модельных поллютангов с гуматами.

3. Доказательство активности биотестовой системы в процессе детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами на основе:

а) изменения скоростей НАДН-зависимых реакций в присутствии гуминовых веществ в растворах модельных токсикантов на примере К3|Те(СЫ)б], СиБ04 и СоС12.

б) изменений ультраструктуры бактериальных клеток под действием гуминовых веществ в растворах модельных неорганических токсикантов на примере СгС13.

Положения, выносимые на защиту.

1. В процессах дегоксикации растворов гуминовыми веществами, наряду с химическими и физико-химическими процессами (комплексообразование, гидрофобное связывание, редокс-процессы), определяющимися полифункциональностью макромолекул гуматов и уменьшающими содержание токсикантов в растворе, важную роль играют процессы с участием биотестовой системы, такие как:

а) увеличение скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в биолюминесцентной тестовой системе;

б) стабилизация слизистого слоя капсулы на внешней поверхности клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на неблагоприятное воздействие токсикантов.

2. Гуминовые вещества способны как снижать токсичность растворов за счет перечисленных выше эффектов, так и увеличивать ее за счет увеличения скоростей автоокисления НАДН в растворе. Уменьшению токсичности способствует использование низких концентраций гуминовых веществ и предварительное инкубирование токсикантов о гуматами.

3. Биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций является удобным инструментом оценки изменений как общей, так и окислительной токсичности растворов при использовании гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов.

Научная новизна. На основе анализа скоростей НАДН-зависимых реакций в растворах модельных неорганических окислителей Си304 и К3[Ре(СМ)б], показано, что в процессе детоксикации гуминовые вещества ускоряют реакции с участием эндогенного окислителя (ФМН) и не влияют на скорости реакций с участием экзогенных неорганических окислителей, тем самым увеличивая конкурентоспособность эндогенных процессов. Продемонстрирована стабилизация гуминовыми веществами слизистого слоя на внешней поверхности клеток в растворе СгС13, используемого в качестве модельного поллютанта, что связано с активизацией гуминовыми веществами защитной реакции клеток на неблагоприятное воздействие. Таким образом, продемонстрировано, что детоксикация является сложным процессом, включающим не только «внешние» по отношению к тестовому организму физико-химические процессы (связывание и окисление поллютантов в водном растворе), но и «внутренние» процессы.

Показано, что гумиповые вещества способны не только снижать, но и увеличивать токсичность растворов, что вероятно связано со способностью гуминовых веществ увеличивать скорость автоокисления НАДН и диффузионными затруднениями в растворах полимерных молекул - Гумилевых веществ.

На примере гуминовых веществ экспериментально продемонстрированы способы оценки изменений общей и окислительной токсичности с помощью биолюминесцентных тестовых систем.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки биолюминесцентных методик оценки эффективности детоксикации неорганических и органических поллютантов гуминовыми веществами - детоксихантами природного происхождения. Результаты работы способствуют пониманию механизмов природных процессов, нейтрализующих антропогенное воздействие на водные экосистемы, и определяют возможность разработки новых ремедиационных технологий.

Подобраны условия для эффективной детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами в водных экосистемах. Использование бактериального биотеста показывает, что для наилучшего детоксицирующего действия растворов солей металлов необходимо применять гуминовые вещества следующих концентраций: 10"5 - 2-10"2 г/л. Продемонстрирована необходимость предварительного инкубирования растворов с гуминовыми веществами в течение 10 и более минут.

Показано, что биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций является удобным инструментом оценки изменений как общей, так и окислительной токсичности растворов при использовании гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на российских и международных конференциях: Всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010); 13-ой Международной конференции по химии и окружающей среде (Цюрих, Швейцария, 2011); VI-ом Съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); 17-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции» (Гуэлф, Канада, 2012); 16-ом Съезде международного гуминового общества (Ханджоу, Китай, 2012); 3-ем Международном симпозиуме по Химии окружающей среды (Скиатос, Греция, 2012).

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ № 2.2.2.2/5309, гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, контракт № 02.740.11.0766; гранта РФФИ 10-05-01059-а; программы РАН «Молекулярная и клеточная биология»; мега-проекта «Биотехнологии новых биоматериалов» по пост. Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 (договор № №11.G34.31.0013).

Работа удостоена государственной премии Красноярского края в 2010 году; стипендии Президента Российской Федерации на 2011/2012 учебный год

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах ВАК и 24 тезиса конференций.

Личный вклад автора состоял в проведении экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных результатов, анализе литературных данных. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Федоровой Е.С., Кисланом С.Л., Могальной OA., Стомом Д.И. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 3 таблицами, 24 рисунками и приложением. Библиография включает 172 источника.

Обозначения:

НАД" НАДН ФМН ФМН-Н2 RCHO RCHOOH 1 К

КохТ

Е?

- никотинамидденинуклеотид окисленный

- никотинамидденинуклеотид восстановленный

- флавинмононуклеотид

- флавинмононуклеотид восстановленный

- тетрадеканаль

- тетрадекакарбоновая кислота

- интенсивность биолюминесценции

- коэффициент детоксикации, рассчитанный по изменению общей токсичности раствора

- коэффициент детоксикации, рассчитанный по изменению окислительной токсичности раствора

- окислительно-восстановительный потенциал

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе диссертации рассмотрены свойства и основные источники экологически опасных и наиболее распространенных поллютантов - солей металлов, хинонов и фенолов. Описаны наиболее распространенные методы детоксикации растворов поллютантов. Показаны преимущества использования детоксикантов природного происхождения - гуминовых веществ. Приведены две основные концепции строения гуминовых веществ, описаны их свойства. Показано, что механизм детоксицирукяцего действия гуминовых веществ требует дальнейшего внимания и новых подходов.

Рассмотрены наиболее распространенные биотесты, строение и принципы функционирования бактериальных биолюминесцентных систем. Описаны возможные механизмы воздействия поллютантов на биолюминесценцию. Показаны преимущества использования биолюминесцентных биотестов, основанных на люминесцентных бактериях, для мониторинга состояния водной среды и оценки эффективности детоксикации сточных и природных вод.

Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. В работе использовали три биолюминесцентные системы: (1) Комплект Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ), который включает лиофилизированные препараты люциферазы Photobacíerium leiognathi (0,5 мг/мл) и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы из Vibrio fischeri (0,15 ед. активности), изготовленные в лаборатории нано биотехнологии и биолюминесценции Института Биофизики СО РАН (Красноярск); (2) биолюминесцентный «Микробиосенсор-677Ф», основанный на лиофильно высушенных люминесцентных бактериях Photobacíerium phosphoreum, производимый в Институте Биофизики СО РАН (Красноярск), (3) интактные бактерии - клеточная суспензия культуры бактерий Photobacterum phosphoreum 1883 ffiSO из коллекции Института биофизики СО РАН [3].

В качестве модельных поллютантов использовался ряд солей металлов CuS04, РЪ(Шз)2, K3[Fe(CN)6], СоС12, CrCl3, Еи(ЪГО3)3 марки «ч» (Химреактив, Россия), а также 1,4-гидрохинон и 1,4-бензохинон (Aldrich, США).

В качестве источника гуминовых веществ использовали препарат Гумат-80 (ООО «Гумат», Иркутск, Россия). Препарат получен механохимической реакцией бурого окисленного угля (Черемховское месторождение, Россия) со щелочью (КОН, NaOH) [4]. Характеристики препарата: гуминовые кислоты яг 85%, растворимый калий (КгО) - 9%, Fe - 1%, вода - 5%, рН 8-9 в 1% водном растворе.

Регистрировали максимальную интенсивность свечения ферментативной и бактериальной систем контрольных (без токсичных соединений - (/„)) и опытных (Г) растворов. Отношение Ге1 = 1/1а использовали для характеристики воздействия солей металлов, органических поллютантов и гуминовых веществ на биолюминесценцию. Снижение интенсивности биолюминесценции (1 / /0) определяет общую токсичность раствора. Определяли эффективные концентрации модельных поллютантов, ингибирующие биолюминесценцию до 50%-го остаточного свечения, ЕС ¡о-

Окислительную токсичность растворов характеризовали величиной задержки свечения, Т, которая соответствует перегибу 8-образной кинетической кривой. Эту величину определяли по методу второй производной.

Рис. 1 схематически демонстрирует особенности биолюминесцентной кинетики ферментативной системы в растворах окислителей [5].

, т ех

Г время, с

Рис. 1. Кинетика биолюминесценции ферментативной системы в отсутствии (1) и присутствии (2) окислителя [5].

Изменение общей токсичности растворов под действием гуминовых веществ оценивали с помощью коэффициентов детоксикации К:

К = Тв1([+гв) (1)

где Г" (т+гв) иГ у — относительная интенсивность биолюминесценции в растворе модельного поллютанта (соли металла, 1,4-бензохинона или 1,4-гидрохинона) в присутствии и отсутствии гуминовых веществ соответственно.

Изменение окислительной токсичности растворов под действием гуминовых веществ оценивали с помощью коэффициентов детоксикации Кохт-

Кохт = Тт/ Т(г+гв), (2)

где Тт - период задержки свечения в растворе модельного поллютанта без гуматов, Т(т+гв)~ в присутствии гуматов.

Величины коэффициентов К > 1 и К&х > 1 соответствуют детоксикации раствора, К = 1, Код = 1 - отсутствию эффекта, К < 1, Кал < 1 - увеличению токсичности. Погрешность измерения К и Ксьт не превышает 0,04.

Скорости окисления НАДН определяли по изменению оптической плотности раствора, Д на длине волны 340 нм в спектре поглощения НАДН на спектрофотометре UVIKON-943 (KONTRON Instruments, Italy). Погрешность измерения V равна 10 М/мин.

Электронно-микроскопические исследования проводились в Лимнологическом институте СО РАН г. Иркутска.

Третья глава диссертации посвящена оценке изменения общей токсичности растворов солей металлов РЬ(ЫС^)2, СоС12, CuS04, Еи(МОз)з, СгС13> K3[Fe(CN)6] при воздействии гуминовых веществ.

Как было показано в работе [6], тип неорганического аниона (СГ, SO42", и NCV) не влияет на интенсивность биолюминесценции. По этой причине мы учитывали только свойства катионов.

Предварительно с помощью биолюминесцентных тестовых систем (ферментативной, бактериальной) были определены эффективные концентрации растворов солей металлов, ЕС so, М, которые использовали далее в экспериментах с гумиповыми веществами.

Изучено действие растворов гуминовых веществ различных концентраций на биолюминесцентные системы. Для дальнейших исследований были выбраны концентрации гуминовых веществ, не приводящие к иншбированию свечения тестовых систем.

По изменению общей токсичности растворов солей металлов под действием гуминовых веществ определены коэффициенты детоксикации К. Измерения проводились при различных концентрациях гуминовых веществ и временах предварительного инкубирования гуматов с солями металлов.

На рис. 2, в качестве примера, представлена зависимость К от концентрации гуминовых веществ в растворах C0CI2, полученная с помощью ферментативной тестовой системы.

Подобные кривые были получены для всех исследуемых солей металлов.

Сщ, г/л

Рис. 2. Зависимость коэффициента детоксикации К от концентрации Тумановых веществ Сгв в растворе СоС12 (ЕС¡о = 5-10"5М). Ферментативная система. Время инкубирования: 1-0 минут, 2-50 минут.

Определены верхние границы детоксицирующих концентраций гуматов, С'рв, т.е. концентрации гуминовых веществ, при которых К = 1, и максимальные коэффициенты детоксикации гуминовыми веществами, К". Использовали ферментативную и бактериальную тестовые системы при различных временах инкубирования солей металлов с гуматами (табл. 1).

Таблица 1

Коэффициенты детоксикации, К", растворов солей металлов гуминовыми веществами, определенные с использованием ферментативной и бактериальной тестовых систем при различных временах предварительного инкубирования.

К"

Соль Ферментативная система Бактериальная система

металла 0 15 25 50 0 15 25 50

с 'гв, г/л мин мин мин мин С'гв, г/л мин мил мин мин

СоС12 2,0-10*3 1,07 1,12 1,15 1,27 з,о-ю"3 0,91 1,04 1,06 1,15

Еи(МОз)э 2,0-10"'' 1,28 1,80 2,16 2,26 2,0- 1С2 1,12 1,72 2,76 1,88

СгСЬ 2,0-10'3 1,26 1,32 1,66 1,71 3,0-Ю"3 0,89 1,13 1,24 1,43

РЬСШзЬ 1,3-Ю"3 1,22 1,69 1,76 1,88 1,5-10"3 0,91 1,42 1,72 1,18

Си804 6,2-10^ 0,81 1,40 1,62 1,02 2,0-10"3 0,96 1,02 1,04 1,26

КзРМСТОД 2,0-КГ1 1,00 1,14 1,14 1,14 3,0-10"3 0,93 1,06 1,21 1,29

Как следует из данных, представленных в табл. 1, предварительное инкубирование вызывает увеличение К™, то есть приводит к увеличению эффективности детоксикации. Исключением является 50-минутное

инкубирование растворов Си304 (ферментативная система) и РЬ(Ы03)2 (бактериальная система).

Образование комплексов металл - гуминовые вещества может быть одной из причин снижения общей токсичности растворов.

Рост коэффициентов детоксикации во времени объясняется, вероятно, длительностью образования комплексов при наличии диффузионных затруднений в растворах полимерных молекул - гуминовых веществ [4], а также в процессах взаимодействия гуматов с ферментативными и бактериальными системами.

В четвертой главе экспериментально исследовано влияние гуминовых веществ на окислительную токсичность растворов редокс-активных соединений. На начальном этапе были исследованы изменения кинетики биолюминесценции ферментативной системы сопряженных реакций в растворах органического (1,4-бензохинона) и неорганического (феррицианида калия - К3[Ре(С1^)б]) окислителей.

Показано, что кинетика биолюминесценции в растворах данных окислителей отличается от кинетики в растворах РЬ(ЬЮ3)2, СоС12, СиБОд, Еи(ЪГОз)з, и СгС13 и 1,4-шдрохинона, а именно: в присутствии окислителей, помимо снижения максимума люминесценции, появляется период задержки свечения. Подобные результаты ранее были получены другими исследователями [2]. Известно, что это явление связано со способностью окислителей конкурировать с ФМН в процессах восстановления (присоединения водорода). Показано, что эффективность этой конкуренции определялась стандартным окислительно-восстановительным потенциалом окислителя и его концентрацией. Подобные специфические изменения кинетики биолюминесценции ферментативной системы придают этой системе особые свойства - специфичность к группе окислителей и возможность оценивать окислительную токсичность.

По изменению окислительной токсичности под действием гуминовых веществ были рассчитаны коэффициенты детоксикации Кохг растворов 1,4-бензохинона и феррицианида калия; при этом варьировали концентрации гуминовых веществ и время инкубирования растворов окислителей с гуматами от 0 до 50 минут.

На рис. 3 в качестве примера представлены зависимости Ксхг от концентрации гуминовых веществ в растворах феррицианида калия при временах инкубирования 0 и 50 минут.

0,0005 Сп> г/л

0.001

Рис. 3. Зависимость коэффициента детоксикации Кол от концентрации гуминовых веществ Сгв в растворах феррицианида калия (ЕСза = 8-10"5 М). Время инкубирования 0 и 50 минут.

Данные, представленные на рис. 3, показывают, что воздействие гуминовых веществ в отсутствие предварительного инкубирования (0 минут) приводит к увеличению окислительной токсичности растворов (Кохг < 1) при Сгв > 2-10"4 г/л. В то же время, меньшие концентрации гуминовых веществ не оказывали заметного влияния на окислительную токсичность растворов (Кохт~ 1).

Инкубирование феррицианида калия с гуминовыми веществами (50 минут, рис. 3) приводит к снижению окислительной токсичности раствора феррицианида калия (Кохт > 1) при всех исследуемых концентрациях гуматов.

Подобные результаты были получены и для 1,4-бензохинона.

Сравнивали действие гуминовых веществ на органический и неорганический окислители (рис. 4).

1.4-бешохниоп : $

0.8 ■•;

0,5 ....................................!....................................-..................

0 20 40

время, мин

Рис. 4. Зависимость коэффициента детоксикации Ко*т от времени инкубирования 1,4-бензохинона и Кз[Ге(С1Ч)б] с гуминовыми веществами. Ферментативная система.

Данные рисунка 4 указывают на сходство результатов предварительного инкубирования органического и неорганического окислителей с гуминовыми веществами.

Т.о, коэффициенты детоксикации Кал, рассчитанные по изменению окислительной токсичности растворов, увеличиваются со временем инкубирования, аналогично коэффициентам для общей токсичности (см. табл.1).

Причиной снижения токсичности растворов окислителей, вероятно, является образование комплексов окислитель — гумат, с последующей нейтрализацией окислителя. Ранее была показана связь детоксицируюгцего эффекта гуминовых веществ с окислительной способностью молекул хинонов и их гидрофобностью [2, 7]. За восстановительную активность гуматов в процессах детоксикации окислителей отвечают гидрохиноновые, фенольные, спиртовые, а также некоторые азотсодержащие группы макромолекул гуминовых веществ.

Таким образом, согласно общепринятым представлениям, описанные эффекты детоксикации можно объяснить химическими процессами, уменьшающими содержание токсичных соединений в растворах вне тестового организма. Так как гуминовые вещества являются полифупкциональными, они могут образовывать координационные комплексы с металлами, участвовать в гидрофобном связывании амфифильных молекул, а так же в восстановлении окислителей.

Кроме того, гуминовые вещества могут участвовать и в биологических процессах, определяющих защитные реакции тестовых организмов.

Пятая глава посвящена изучению активной роли биолюминесцентных тестовых систем в процессах детоксикации солей металлов гуминовыми веществами.

Изменение скоростей окисления НАДН в растворах солей металлов в присутствии гуминовых веществ.

НАДН является органическим восстановителем и одним из компонентов биолюминесцентной ферментативной тестовой системы двух сопряженных реакций:

ФМН + НАДН НАД(Ф)П:ФМН^«ДорСдлггаМфМН.Н- + ЦД Ц+ > (1)

ФМН-Н" + ^СОН + о2™щ'*1и»%, ФМН + Ы,СОСГ + Н20 + ЬУ (490 шп). (2)

Величина скорости окисления НАДН служит индикатором ускорения (или замедления) окислительно-восстановительных процессов в ферментативной системе.

Скорости окисления НАДН в ферментативных и неферментативных процессах были определены в растворах трех солей металлов: СиБОд, Кз[Ре(СЫ)б] и СоСЬ. Использованы эффективные концентрации солей металлов ЕС ¡с, измерения проводили в присутствии и отсутствии гуминовых веществ (табл. 2).

Таблица 2

Скорости окисления НАДН в отсутствии (У) и присутствии (Угг) гуминовых веществ.

№ Компоненты растворов V-107, М/мин

V Угв АУ=Уп - У

Неферментативные процессы

1 НАДН (автоокисление) 0,4 1,0 0,6

2 НАДН + ФМН 3,9 5,1 1,2

3 НАДН + СиБСи 1,8 1,8 0,0

4 НАДН + Кз|Ре(СМ)«] 7,8 7,6 -0,2

5 НАДН + СоС12 0,6 0,5 -0,1

Ферментативные процессы

1Е НАДН+Е 0,4 0,9 0,5

2Е НАДН + ФМН +Е 7,0 8,0 1,0

ЗЕ НАДН + СивО*+Е 0,6 0,6 0,0

4Е НАДН + КзР^СЪад + Е 1,9 2,1 0,2

5Е НАДН + СоСЬ + Е -2,2 -2,6 -0,4

нг'м,

Ск3[р,(си)6]= 8-10 5 М. Е - препарат ферментов.

Данные табл. 2 демонстрируют, что скорости автоокисления НАДН в отсутствии (№1) и в присутствии (№1Е) ферментов близки. Добавление гуминовых веществ в растворы НАДН приводит к росту скорости его автоокисления соответственно на 0,6-10"7 и 0,5-10"7 М/мин (см. АУ в табл. 2). Таким образом, гумиловые вещества увеличивают скорость расходования эндогенного восстановителя НАДН, удаляя его из системы и снижая интенсивность биолюминесценции (в соответствии с уравнениями 1 и 2). Ускорение авто окислительных процессов можно рассматривать как причину увеличения токсичности растворов под действием гуминовых веществ.

Добавление гуминовых веществ к системе НАДН+ФМН в неферменгативном (№2) и ферментативном (№2Е) процессах дополнительно

увеличивает скорости окисления НАДН (AV = 1,2-10~7 и 1,0-10"7 М/мин соответственно).

Изучены скорости окисления НАДН в растворах неорганических экзогенных окислителей CuS04 и K3[Fe(CN)6]. Стандартные окислительно-восстановительные потенциалы полуреакций Cu2+ / Си+ равны 0,15 В, а [Fe(CN)6]3^ / [Fe(CN)6]*~ = 0,36 В, они превышают потенциал ФМН (-0,22 В, для полуреакции ФМН / ФМН-Иг [8], эндогенного окислителя ферментативной тестовой системы (реакция 1), что указывает на возможность конкуренции данных экзогенных окислителей с ФМН в реакции окисления НАДН (реакция 1) в стандартных условиях. Скорости окисления НАДН экзогенными окислителями CuS04 и K3[Fe(CN)6] приведены в табл. 2 (№ 3,4, ЗЕ, 4Е).

Добавление гуминовых веществ в растворы C11SO4 и K3[Fe(CN)ö] не изменяет или изменяет незначительно скорости окисления НАДН в неферментативных (№3 и №4, табл. 2) и ферментативных (№ЗЕ и №4Е, табл. 2) реакциях. Однако, как уже было сказано выше, гуминовые вещества увеличивают скорость расходования НАДН в присутствии эндогенного окислителя ФМН (№2 и №2Е, AV = 1,2-10"7 и 1,0-10"7 М/мин для пеферментативных и ферментативных процессов, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о том, что гуминовые вещества делают эндогенные процессы более конкурентоспособными в растворах CuS04 и K3[Fe(CN)6]. Вероятно, амфифильность молекул ФМН благоприятствует их взаимодействию с НАДН в присутствии гуминовых веществ, которые также являются амфифильными структурами.

Исследовали скорости окисления НАДН в растворах C0CI2. Было показано, что при добавлении СоС12 скорость окисления НАДН увеличилась незначительно (V = 0,4-10"7 против 0,5-10"7 М/мин в процессе №1 против №5) или уменьшилась (V = 0,4-10"7 против -2,2-10"7 М/мин в процессе №1Е против №5Е), табл. 2. Воздействие гуминовых веществ привело к еще более выраженному снижению скорости окисления НАДН: Угв = 1,0-10"7 против 0,6-Ю"7 М/мин (в процессе №1 против №5), или 0,9-10"7 против -2,6-10~7 М/мин (в процессе №1Е против №5Е), табл. 2.

Так как ион кобальта Со2+ взят нами не в максимальной степени окисления, то он может проявлять свойства слабого восстановителя, окисляясь до Со3+ (при этом окислительно-восстановительный потенциал для пары ионов кобальта, связанных гуматами, будет отличаться от потенциала несвязанных ионов). В этом случае возможно увеличение содержания НАДН за счет восстановления НАД+ с последующим увеличением скоростей реакций 1 и 2 в ферментативной тестовой системе. Отрицательные значения V и Угв в процессе

№5Е (табл.2) введены нами именно для того, чтобы указать на рост концентрации НАДН.

Сочетание вышеперечисленных процессов (т.е. увеличение и/или уменьшение скоростей окисления НАДН гуминовыми веществами) определяет общее изменение интенсивности биолюминесценции.

Таким образом, показано, что увеличение токсичности водных растворов солей металлов под действием гуминовых веществ может происходить за счет ускорения автоокисления НАДН. Снижение токсичности может быть связано с ускорением эндогенных НАДН-зависимых биохимических процессов гуминовыми веществами в растворах экзогенных окислителей (К3[Ре(СМ)6], СийОд), а также в растворе СоС12.

Ультраструктура бактериальных клеток в растворах СгС13 и гуминовых веществ.

Для выявления возможных изменений в ультраструктуре бактерий в процессе детоксикации, было проведено электронно-микроскопическое исследование ультратонких срезов Р.рИозрЬогеит, подвергшихся воздействию СгС1э (С = 10"4 М) в присутствии гуминовых веществ и без них. Ультраструктуры клеток в контрольном образце и в присутствии СгС1з представлены на рис. 5 А, Б соответственно.

Рис. 5. Ультраструктура клеток РрИоБрИогеит. Масштаб 1 ¡1М. А - контроль; Б - в присутствии СгС1з (С = 10"4 М).

Результаты исследования образцов, подвергшихся воздействию СгС1з (рис. 5 Б) показали, что клетки были неправильной (плеоморфной) формы. Клеточная стенка имела сглаженный профиль, внешние слизистые слои не выявлялись. В отличие от контрольного образца (рис. 5 А), в нуклеоплазме видны конденсированные нити ДНК. В клетках имеются электронно-плотные образования неправильной формы, расположенные в цитоплазме у полюсов клетки.

Следует отметить, что в отсутствии СгС13 гуминовые вещества не оказывают влияния на структуру клеток.

После обработки культуры СгС13 и гуминовыми веществами, клетки также имели шхеоморфную (неправильную) форму (рис. 6). При этом наблюдали изменения в строении клеточной оболочки: она становилась более плотной, внешняя мембрана клеточной стенки приобретала волнистый профиль. У большинства клеток на поверхности клеточных стенок наблюдалось аморфное вещество средней электронной плотности (показано стрелками на рис. 6). Возможно, это вещество - остатки слизистой оболочки, которая была стабилизирована макромолекулами гуминовых веществ.

Рис. 6. Ультраструктура клетки Р.рЬозрИогеит в присутствии СгС13 (С = 10"4 М) и гуминовых веществ (Сга = 0,9-10~2 г/л). Масштаб 1 цм.

Известно, что полисахаридная слизистая капсула защищает бактерию от антимикробных агентов [10], и она всегда присутствует на поверхности клеток, растущих в природных условиях (противоположно бактериям, выращенным в лаборатории). Как правило, при подготовке образцов для электронной микроскопии слизистый слой капсулы частично или полностью смывается.

Предполагается [7, 10], что бактерии усиливают синтез внеклеточного матрикса, в ответ на неблагоприятное влияние СгС1з. Вероятно, полимерные молекулы гуминовых веществ стабилизируют полисахаридный слой, и тем самым активизируют защитную функцию тестовой системы, т.е. бактериальных клеток. Подобные образования, то есть остатки слизистых капсул на внешней стороне клеточной стенки, были обнаружены в предыдущих исследованиях при добавлении гуминовых веществ в растворы органических окислителей -хинонов [2].

Таким образом, на основе анализа скоростей окисления НАДН в биолюминесцентной ферментативной системе и изучения изменений ультраструктуры бактерий в присутствии гуминовых веществ в растворе

модельного неорганического токсиканта, показано, что биолюминесцентные тестовые системы шрают активную роль в процессах детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами. Выявлены два типа отклика биолюминесцентных систем на воздействие гумиловых веществ в токсичных растворах: на уровне биохимических реакций и уровне клеток в целом. Эти процессы демонстрируют механизмы стимулирования защитной реакции бактерий гуминовыми веществами в растворах солей металлов, используемых нами в качестве модельных токсикантов.

ВЫВОДЫ

1. На примере растворов модельных токсикантов РЬ(К03)2, СоС12, СиБОд, Еи(Ж)3)3, ОСЬ. К3[Ре(С1Ч)6] и редокс-пары 1,4-бензохинон - гидрохинон продемонстрирована применимость биолюминесцентных тестовых систем (ферментативной системы реакций и лиофилизированных бактерий РИо1оЬас(егшт рЪохрНогеит) для оценки изменений общей и окислительной токсичности при воздействии гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов. Рассчитаны коэффициенты детоксикации гуминовыми веществами растворов модельных токсикантов.

2. Показано, что гуминовые вещества могут как увеличивать, так и снижать общую и окислительную токсичность растворов токсикантов. С использованием бактериального теста подобраны условия для более эффективной детоксикации гуминовыми веществами водных экосистем, а именно:

• для солей металлов — интервал концентраций гуминовых веществ 10"5 -2-10 г/л, время предварительного инкубирования с гуматами - не менее 10 минут;

• для 1.4-бензохинона - интервал концентраций гуминовых веществ 10~5 -

время предварительного инкубирования с гуматами - не менее

15 минут.

3. Показано, что присутствие гуминовых веществ в модельных растворах неорганических токсикантов стимулирует защитную функцию тестовой системы в результате:

а) увеличения скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в биолюминесцентной тестовой системе;

б) стабилизации слизистого слоя капсулы на внешней поверхности клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на воздействие токсикантов.

4. Увеличение токсичности растворов модельных токсикантов в

присутствии гуминовых веществ связано с увеличением скорости

автоокисления эндогенного восстановителя НАДН.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах ВАК

1. Tarasova, A.S. Bioluminescence as a tool for studying detoxification processes in metal salt solutions involving humic substances / A.S. Tarasova, S.L. Kislan, E.S. Fedorova, A.M. Kuznetsov, O.A. Mogilnaya, D J. Stom, N.S. Kudryasheva // Journal of photochemistry and photobiology. В - 2012.-V. 117.-N. 5.-P. 164-170.

2. Tarasova, Anna S. Bioluminescent toxicity monitoring of oxidizer solutions: effect of humic substances / Anna S. Tarasova, Devard L Stom, Nadezhda S. Kydryasheva // Environmental toxicology and chemistry. -2011. - V.30. -N.5. - P.1013-1017.

3. Tarasova, A.S. Bioluminescent monitoring: detoxification of phenol solutions by humic substances and UV-irradiation / A.S. Tarasova, N.S. Kudryasheva, E.S. Fedorova, D. I. Stom // Journal of Siberian federal university. Biology. - 2008. - V.l. -N2. -P.136-144.

Тезисы докладов наиболее значимых конференций

1. Tarasova, Anna S. Reaction rates in enzymatic assay system in solutions of metal salts and humic substances / Anna S. Tarasova, Nadezhda S. Kudryasheva // Abstract of the 16-th Meeting of humic substances society, September 9-14, 2012, Hangzhou, China. Functions of natural organic matter in changing environment, Springer, Ed. by J. Xu, J. Wu, Y. He. —P.315-317.

2. Kudryasheva, N.S. Mechanisms of detoxification by humic substances / N.S. Kudryasheva, A.S. Tarasova // Abstract of the 16-th Meeting of humic substances society, September 9-14,2012, Hangzhou, China. Functions of natural organic matter in changing environment, Springer, Ed. by J. Xu, J. Wu, Y. He. - P. 296-298.

3. Tarasova, A. S. Use of bioluminescence assay to verify mechanisms of detoxifying effects of humic substances in heavy metal solutions / AS. Tarasova, N.S. Kudryasheva // Abstract of the 17th International symposium on bioluminescence and chemi-luminescence, 2012. - Guelph, Canada. Luminescence. - V.27. - N2. - P.163-164.

4. Kislan, S.L. General toxicity of heavy metal solutions in the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring / S.L. Kislan, A.S. Tarasova, N.S. Kudryasheva // Abstract of the 17th International symposium on bioluminescence and chemiluminescence, 2012. - Guelph, Canada. Luminescence. - V.27. -N2. - P.127.

5. Kudryasheva, N.S. Detoxification of model toxic solutions by humic substances / N.S. Kudryasheva, A.S. Tarasova // Abstracts of 3-d International symposium on green chemistry for environment, Health and development, 3-5 October 2012, Skiathos, Greece.-P. 21.

6. Кислан, CJL Изменение токсичности тяжелых металлов в присутствии гуминовых веществ / C.JL Кислан, А.С. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Сборник

статей Двенадцатой международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологах в промышленности», 8-10 декабря 2011, г. Санкт-Петербург, Россия.-С. 247-249.

7. Тарасова, A.C. Применение биолюминесцентного метода для оценки детоксицирующей способности гуминовых веществ в растворах солей металлов / A.C. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы VI Съезда Российского фотобиологического общества, 15-22 сентября 2011, пос. Шепси, Россия. - С.139.

8. Tarase va, Л. S. Bioluminescent monitoring of general and oxidative toxicity under effect of humic substances / A.S. Tarasova, N.S. Kudiyasheva // Abstract of 13th International conference on chemistry and the environment, 11-15 September 2011, Zurich, Switzerland. - P.380.

9. Tarasova, A.S. General and oxidative toxicity of oxidizer in the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring / A.S. Tarasova, E.S. Fedorova, N.S. Kudryasheva И Abstract of the XVI International symposium on bioluminescence and chemiluminescence, 2010, Lyon, France. Luminescence. - V.25 -N.2. - P.136-137.

10. Тарасова, A.C. Детоксикация солей металлов гуминовыми веществами. Биолюминесцентный мониторинг / A.C. Тарасова, Е.С. Федорова, MA. Александрова // Тезисы всероссийской конференции с международным участием «Почвы Сибири: прошлое, настоящее, будущее», 30 ноября - 3 декабря 2010, г. Новосибирск, Россия. - С. 143-145.

11. Тарасова, A.C. Биолюминесцентный мониторинг детоксикации гуминовыми веществами растворов неорганического окислителя / A.C. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы международной научной конференции «Проблемы экологии», 20-25сентября 2010, г. Иркутск, Россия. - С. 472.

12. Тарасова, A.C. Изучение процессов детоксикации гуминовыми веществами растворов металлов переменной валентности на примере феррицианида калия / A.C. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере», 1-4марта 2010, г. Санкт-Петербург, Россия. - С. 350-355.

13. Тарасова, A.C. Детоксикация раствора неорганического окислителя гуминовыми веществами, биолюминесцентный мониторинг / A.C. Тарасова // Тезисы XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009», 13-18 апреля 2009, г.Москва, Россия. - С.142 - 143.

14. Тарасова, A.C. Детоксикация фенолов гуминовыми веществами. Биолюминесцентный мониторинг / A.C. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008», 8-11 апреля 2008, Москва, Россия. ISBN 978-5-91579- 003-1.

15. Тарасова, A.C. Мониторинг токсичности фенолов биолюминесцентными методами / A.C. Тарасова, Е.В. Ветрова, Н.С. Кудряшева, Е.С. Федорова // Тезисы XVHI менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 23-28 сентября 2007, г. Москва, Россия. - С.2192.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Perminova, I. Quantifcation and prediction of the detoxifying properties of humic substances related to their chemical binding to polycyclic aromatic hydrocarbons / I. Perminova, N. Grechishcheva, D. Kovalevskii, A. Kudryavtsev, V. Petrosyan, D. Matorin // Environmental science and technology. - 2001. - V.35 - N.19. - P. 38413848.

2. Fedorova, E. Bioluminescent monitoring of detoxification processes: Activity of humic substances in quinone solutions / E. Fedorova, N. Kudryasheva, A. Kuznetsov, O. Mogil'naya, D. Stom // Journal of photochemistry and photobiology B: Biology. -2007.-V. 88.-L 2-3.-P. 131-136.

3. Tyulkova, NA. Purification of bacterial luciferase from Photobacterium Leiognathi with the use of EPLC-system. In: B. Jezowska-Trzebiatowska, B. Kochel, J. Stawinski, W. Strek, editors. Bacterial Luminescence. Singapore: World Scient, 1990. - P.369-374.

4. Левинский, Б.В. Все о гуматах / Б .В. Левинский // Иркутск: Корф-Полиграф. — 2000.-75 с.

5. Kudryasheva, N. Bioluminescent assays: effects of quinones and phenols / N. Kudryasheva, E. Vetrova, A. Kuznetsov, V. Kratasyuk, D. Stom // Ecotoxicology and environmental safety. -2002.-N.53.-P. 221-225.

6. Кудряшева, H.C. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы различной сложности / Н.С. Кудряшева, Л.В. Зюзикова, ТВ. Гутаик, AB. Кузнецов // Биофизика. -1996. -Т.41. - №6. - С.1264-1269.

7. Федорова, Е.С. Биолюминесцентный мониторинг процессов детоксикации растворов органических соединений.: Автореф.... дис. канд. биологических наук. -Пущино, 2011.-21 с.

8. Champe, P.C. Lippincott's illustrated reviews: Biochemistry / P.C, Champe, RA. Harvey, D. R. Ferner // Lippincott Williams & Wilkins Publishers. - 2005.

9. Глинка, H. Л. Задачи и упражнения по общей химии: Учебное пособие для вузов / Глинка Н. Л. Под ред. ВА. Рабиновича и ХМ. Рубиной. - 24-е изд., испр. - Л.: Химия, 1986.-272 с.

10. Costerton, J. Structure and plasticity at various organization levels in the bacterial cell / J. Costerton // Canadian Journal of microbiology. -1988. - V.34. -P. 513-521.

Подписано в печать 16.11. 2012г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная 80 т/и2 Способ печати - оперативный. Заказ №384 Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «ДарМа-печать». Адрес: г. Красноярск, Академгородок, 50, стр. 28. оф. 156. Тел. 290-72-32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарасова, Анна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Гуминовые вещества - детоксицирующие агенты природного происхождения. Структура и свойства гуминовых веществ.

1.2. Способы оценки токсичности сред. Биотестирование.

1.3. Использование биолюминесцентных систем для биотестирования.

1.3.1. Светящиеся бактерии.

1.3.2. Биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций.

1.4. Биофизические основы биолюминесценции.

1.5. Механизмы воздействия поллютантов на люминесценцию.

1.6. Распространенные поллютанты и их токсичность.

1.6.1. Соли металлов.

1.6.2. Хиноны и фенолы.

1.6.3. Наиболее распространенные методы очистки сточных и природных вод.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование биолюминесцентных систем для изучения закономерностей детоксикации растворов модельных поллютантов гуминовыми веществами"

В связи с ростом антропогенной нагрузки на окружающую среду, в настоящее время актуальным является поиск эффективных методов ремедиации природных вод. При этом осознается необходимость изучения механизмов нейтрализации токсичных соединений в природных условиях и использования выявленных закономерностей в ремедиационных мероприятиях.

В связи с этим, актуальными являются исследования токсичности водных растворов поллютантов в присутствии гуминовых веществ -продуктов естественной трансформации органической массы в почве и донных отложениях. В процесс образования гуминовых веществ (гумификацию) вовлекается около 20 Гт углерода в год (Hedges et al., 2000; Перминова и Жилин, 2004); это второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в окружающей среде. Известно, что гуминовые вещества выполняют в природных условиях роль детоксицирующих агентов (Орлов и др., 1995; Орлов, 1997; Perminova et al., 2001; Gu and Chen, 2003; Zhilin et al., 2004; Sachs and Bernhard, 2011). В последнее десятилетие препараты на основе гуминовых веществ все чаще используются для детоксикации загрязненных водоемов, сточных вод промышленных предприятий. Разработаны и используются твердые сорбенты на основе гуминовых веществ (Pena-Mendez et al., 2005; Перминова, 2008). Способность гуминовых веществ снижать токсичность водных растворов является предметом интереса для многих исследователей (Grainer et al., 1999; Perminova et al., 2001; Стом и Дагуров, 2004; Provenzano et al., 2004; Tchaikovskaya et al., 2007). Известно, что карбоксильные, хиноидные, фенольные, SH- и другие электронно-донорные группы гуминовых веществ способны связывать, и, следовательно, уменьшать содержание ионов металлов в водных экосистемах (Lorenzo et al., 2002; 5

Havelcova et al., 2009; Yamamoto et al., 2010; Al-Abri et al., 2010; Sachs and Bernhard, 2011). Фенольные, SH- и другие группы макромолекул гуминовых веществ, обладающие восстановительной активностью, снижают токсичность растворов окислителей (Kulikova et al., 2005; Fedorova et al., 2007).

Таким образом, в настоящее время предполагается, что детоксицирующая способность гуминовых веществ является следствием комплексообразовательных и окислительно-восстановительных процессов, которые приводят к уменьшению концентрации свободных токсичных соединений в водных растворах. Вместе с тем, термин «токсичность» является не только химическим, но и биологическим. Токсичность среды определяется реакцией организмов на неблагоприятное воздействие токсичных веществ. В настоящее время именно реакция организмов на воздействие токсичных соединений, а также изменение токсичности в присутствии гуминовых веществ представляет наибольший интерес.

Биолюминесцентные биотесты, основанные на светящихся бактериях, являются удобными системами для оценки эффективности детоксикации сточных и природных вод. Эти биотесты характеризуются надежностью, высокой скоростью анализа, чувствительностью, возможностью приборной регистрации и количественной оценки токсичности. Кроме того, возможность использования биолюминесцентных систем различной сложности (биолюминесцентные бактерии и выделенные ферменты), позволяет сравнивать эффекты на клеточном и биохимическом уровнях.

Самыми распространенными загрязнителями окружающей среды являются соли металлов и фенольные соединения, а также продукты окисления фенолов - хиноны (Холодкевич и др., 1996; Hooda, 2007). Являясь водорастворимыми отходами различных производств, эти соединения проникают как в природные водоемы, так и в гумусовые горизонты почв.

Цель работы - выявление с помощью биолюминесцентных тестовых систем закономерностей детоксикации гуминовыми веществами водных растворов модельных поллютантов.

В качестве модельных поллютантов использованы неорганические и органические соединения - соли металлов и редокс-пара 1,4-бензохинон -1,4-гидрохинон.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Оценка изменения общей и окислительной токсичности растворов модельных поллютантов (Pb(N03)2, C0CI2, CuS04, Eu(N03)3, CrCl3i K3[Fe(CN)6] и пары 1,4-бензохинон - гидрохинон) при воздействии гуминовых веществ. Расчет коэффициентов детоксикации производили с помощью двух люминесцентных тестовых систем - системы сопряженных ферментативных реакций и лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphor еит.

2. Определение условий наиболее эффективной детоксикации растворов модельных поллютантов путем варьирования концентрации гуминовых веществ и времени предварительного инкубирования модельных поллютантов с гуматами.

3. Доказательство активности биотестовой системы в процессе детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами на основе: а) изменения скоростей НАДН-зависимых реакций в присутствии гуминовых веществ в растворах модельных токсикантов на примере K3[Fe(CN)6], C11SO4 и СоС12. б) изменений ультраструктуры бактериальных клеток под действием гуминовых веществ в растворах модельных неорганических токсикантов на примере СгСЬ.

Положения, выносимые на защиту.

1. В процессах детоксикации растворов гуминовыми веществами, наряду с химическими и физико-химическими процессами (комплексообразование, гидрофобное связывание, редокс-процессы), определяющимися полифункциональностью макромолекул гуматов и уменьшающими содержание токсикантов в растворе, важную роль играют процессы с участием биотестовой системы, такие как: а) увеличение скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в биолюминесцентной тестовой системе; б) стабилизация слизистого слоя капсулы на внешней поверхности клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на неблагоприятное воздействие токсикантов.

Научная новизна. На основе анализа скоростей НАДН-зависимых реакций в растворах модельных неорганических окислителей Си804 и

К3[Те(СЫ)6], показано, что в процессе детоксикации гуминовые вещества ускоряют реакции с участием эндогенного окислителя (ФМН) и не влияют на скорости реакций с участием экзогенных неорганических окислителей, тем 8 самым увеличивая конкурентоспособность эндогенных процессов. Продемонстрирована стабилизация гуминовыми веществами слизистого слоя на внешней поверхности клеток в растворе СгС1з, используемого в качестве модельного поллютанта, что связано с активизацией гуминовыми веществами защитной реакции клеток на неблагоприятное воздействие. Таким образом, продемонстрировано, что детоксикация является сложным процессом, включающим не только «внешние» по отношению к тестовому организму физико-химические процессы (связывание и окисление поллютантов в водном растворе), но и «внутренние» процессы.

Показано, что гуминовые вещества способны не только снижать, но и увеличивать токсичность растворов, что вероятно связано со способностью гуминовых веществ увеличивать скорость автоокисления НАДН и диффузионными затруднениями в растворах полимерных молекул -гуминовых веществ.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки биолюминесцентных методик оценки эффективности детоксикации неорганических и органических поллютантов гуминовыми веществами - детоксикантами природного происхождения. Результаты работы способствуют пониманию механизмов природных процессов, нейтрализующих антропогенное воздействие на водные экосистемы, и определяют возможность разработки новых ремедиационных технологий.

5 2 вещества следующих концентраций: 10" — 2-10" г/л. Продемонстрирована необходимость предварительного инкубирования растворов с гуминовыми веществами в течение 10 и более минут.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на российских и международных конференциях: Всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010); 13-ой Международной конференции по химии и окружающей среде (Цюрих, Швейцария, 2011); У1-ом Съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); 17-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции» (Гуэлф, Канада, 2012); 16-ом Съезде международного гуминового общества (Ханджоу, Китай, 2012); 3-ем Международном симпозиуме по Химии окружающей среды (Скиатос, Греция, 2012).

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ № 2.2.2.2/5309, гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, контракт № 02.740.11.0766; гранта РФФИ 10-05-01059-а; программы РАН «Молекулярная и клеточная биология»; проекта «Биотехнологии новых биоматериалов» по пост. Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 (договор №11.034.31.0013).

Работа удостоена государственной премии Красноярского края в 2010 году; стипендии Президента Российской Федерации на 2011/2012 учебный год.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах ВАК и 24 тезиса конференций.

Автор выражает самую глубокую и искреннюю признательность: Федоровой Е.С., Кислану СЛ., Кузнецову A.M., Селивановой (Александровой) М.А., Медведевой С.Е., Родичевой Э.К., Чугаевой Ю.В., Озимок H.H. за сотрудничество и помощь в работе, Стому Д.И. за продуктивную и интересную совместную работу, Могильной O.A. за оказанную помощь в проведении анализов методом электронной микроскопии. Глубокая признательность Свидерской И.В. и Кратасюк В.А за всестороннюю помощь и поддержку.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тарасова, Анна Сергеевна

выводы

1. На примере растворов модельных токсикантов РЬ(Ж)з)2, С0О2, Си804, Еи(ЫОз)з, СгС1з. К3[Те(С1Ч)6] и редокс-пары 1,4-бензохинон -гидрохинон продемонстрирована применимость биолюминесцентных тестовых систем (ферментативной системы реакций и лиофилизированных бактерий РкоюЬаМегшт ркоБркогеит) для оценки изменений общей и окислительной токсичности при воздействии гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов. Рассчитаны коэффициенты детоксикации гуминовыми веществами растворов модельных токсикантов.

• для солей металлов - интервал концентраций гуминовых веществ 10"5 л

- 210 " г/л, время предварительного инкубирования с гуматами - не менее 10 минут;

• для 1,4-бензохинона - интервал концентраций гуминовых веществ 10"5- 2 • 10"4 г/л, время предварительного инкубирования с гуматами -не менее 15 минут.

3. Показано, что присутствие гуминовых веществ в модельных растворах неорганических токсикантов стимулирует защитную функцию тестовой системы в результате: а) увеличения скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в биолюминесцентной тестовой системе; б) стабилизации слизистого слоя капсулы на внешней поверхности клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на воздействие токсикантов.

4. Увеличение токсичности растворов модельных токсикантов в присутствии гуминовых веществ связано с увеличением скорости автоокисления эндогенного восстановителя НАДН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарасова, Анна Сергеевна, Красноярск

1. Александрова, М. А. Влияние трития на люминесцентные бактерии. Радиационная биология./ М. А. Александрова, Т. В. Рожко, Г. А. Бадун, Л. Г. Бондарева, Г. А. Выдрякова, Н. С. Кудряшева // Радиоэкология. — 2010. — Т.50. № 6. - С.60-65.

2. Бирман, Ю.А. Инженерная защита окружающей среды / Ю.А. Бирман, Н.Г. Вурдова М. : изд-во АСВ, 2002 - 296 с.

3. Богдановский, Г.А. Химическая экология / Г.А. Богдановский. М. : МГУ, 1994.-237 с.

4. Васильев, Р.Ф. Механизмы возбуждения хемилюминесценции / Р.Ф. Васильев // Известия АН СССР, Сер.физ. 1982. - Т. 46. - № 2. - С. 323329.

5. Ветрова, Е.В. Механизмы действия редокс активных соединений на биолюминесцентную систему НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза -люцифераза. Автореф. . дис. канд. биологических наук. - Красноярск, 2002. - 20с.

6. Вигдорович, В.И. Экологическая характеристика фенола, его миграция и очистка сточных вод, содержащих оксибензол / В.И. Вигдорович, А.Ю. Пудовкина // Вопросы современной науки и практики. Университет им. В.И. Вернадского. -2011. Т. 33. -№2. - С. 45-51.

7. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследованиях биологических мембран / Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов // М. : Наука, 1980.-320 с.

8. Гиль, Т.А. Гашение люминесценции светящихся бактерий как тест для оценки токсичности фенольных компонентов стоков / Т.А. Гиль, А.Э. Балаян, Д.И. Стом//Микробиология. 1983. - Т.52. - №6. - С. 1014-1016.

9. Гительзон, И.И. Светящиеся бактерии / И.И. Гительзон, Э.К. Родичева, С.Е. Медведева, Г.А. Примакова, С.И. Барцев, Г.А. Кратасюк, В.Н. Петушков, В.В. Межевикин, Е.С. Высоцкий, В.В. Заворуев, В.А. Кратасюк. Новосибирск: Наука, 1984. 280 с.

10. Глинка, Н. JL Задачи и упражнения по общей химии / Н. JI. Глинка. Л. : Химия, 1986.-272 с.

11. Гудков, А.Г. Механическая очистка сточных вод / А.Г. Гудков // Вологда: ВоГТУ, 2003. 152с.

12. Гусева, Т.В. Гидрохимические показатели состояния окружающей среды / Т.В. Гусева, Я.П. Молчанова, Е.А. Заика, В.Н. Виниченко, Е.М. Аверочкин. Справочные материалы. СПб. : Эколайн, 2000. 61 с.

13. Евгеньев, М.И. Тест-методы и экология / М.И. Евгеньев // Соровский образовательный журнал. 1999. - № 11. - С. 29-34.

14. Елин, Е.С. Фенольные соединения в биосфере / Е.С. Елин. Новосибирск: СО РАН, 2001. 392 с.

15. Есимбекова, E.H. Сравнение иммобилизованной и растворимой биферментной системы НАДН: ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза / E.H. Есимбекова, И.Г. Торгашина, В.А. Кратасюк // Биохимия. 2009. - Т. 74. -№6.-С. 853-859.

16. Ефремов, A.A. Эколого-химическая безопасность питьевой воды промышленных городов России: состояние и перспективы / А. А. Ефремов // Химия растительного сырья. 1998. - № 3. - С.75-81.

17. Жилин, Д.М. Исследование реакционной способности и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к соединениям ртути: Автореф. дис. . канд. химических наук. М., 2006. -23 с.

18. Журавлев, А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей // Биохемилюминесценция. М. : Наука, 1983. - С. 3-29.101

19. Иванов, В.Г. Органическая химия / В.Г. Иванов, В. А. Горленко, О.Н. Гева. М. : Мастерство, 2003. - 624с.

20. Ильин, В.Б. Тяжелые металлы в системе почва-растение / В.Б. Ильин. Новосибирск: Наука, 1991. - С. 151.

21. Краснов, К.С. Физическая химия / К.С.Краснов, Н.К.Воробьев, И.Н. Годнев. М. : Высшая школа, 1995. - 420 с.

22. Краснова, О.И. Бактериальная биолюминесценция с флавинмононуклеотидом, активированным N-метилимидазолом / О.И. Краснова, H.A. Тюлькова, И.О. Дорошенко, J1.A. Франк // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2003. - Т. 44. - № 1- С. 5-8.

23. Кратасюк, В.А. Биолюминесцентный мониторинг стрессового состояния растений в замкнутых системах жизнеобеспечения / В.А. Кратасюк, E.H. Есимбекова, H.H. Реммель // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2008. - Т. 42. - № 6/1. - С. 32-35.

24. Кратасюк, В.А. Влияние фузариотоксинов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro / В.А. Кратасюк, О.И. Егорова, Н.С. Кудряшева, JI.C. Львова, Н.Ю. Орлова, В.О. Бытев // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т.34. - №2. - С.207-209.

25. Кратасюк, В.А. Гелевая модель функцонирования люциферазы в клетке / В.А. Кратасюк, В.В. Абакумова, Н.И. Ким // Биохимия. 1994. -Т.59. - №7. - С.761-765.

26. Кратасюк, В.А. Использование бактериальной биолюминесцеюнции и биолюминесцентного анализа / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Успехи микробиологии. 1987. - Т.21. - С.3-30.

27. Кудряшева, Н.С. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные системы различной сложности / Н.С. Кудряшева, J1.B. Зюзикова, Т.В. Гутник, A.B. Кузнецов // Биофизика. 1996. -Т. 41. -№.6.-С. 1264-1269.

28. Кудряшева, Н.С. Механизм действия солей металлов на бактериальную биолюминесцентную систему in vitro / Н.С. Кудряшева, Е.В. Зюзикова, Т.В. Гутник // Биофизика. 1999. - Т.44. - №2. - С. 244250.

29. Кудряшева, Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, E.H. Есембекова. Красноярск: КГУ, 2000.- 154с.

30. Кудряшева, Н.С. Электронновозбужденные состояния при биолюминесценции / Н.С. Кудряшева, П.И. Белобров, В.А. Кратасюк, Д.Н. Шигорин//Доклады АН СССР. 1991.-Т. 321.-№4.-С. 837-841.

31. Куликова, H.A. Сравнительная характеристика элементного состава водорастворимых гуминовых веществ, гуминовых и фульвокислот дерново-подзолистых почв / H.A. Куликова, И.В. Перминова // Вестник МГУ. Сер. 17, Почвоведение.-2010.-№ 4.-С. 16-19.

32. Курц, A. JL Фенолы и хиноны / A. J1. Курц, М.В. Ливанцов, Л.И. Ливанцова // Методическая разработка для студентов III курса. М., 1996.

33. Куценко, С.А. Основы токсикологии / С. А. Куценко. СПб. : Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, 2002 - 395 с.

34. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович. М. :Мир, 1986. - 496 с.

35. Левинский, Б.В. Все о гуматах / Б.В. Левинский. Иркутск: Корф-Полиграф, 2000. - 75 с.

36. Манжуль, М.М. Исследование свойств НАД(Р)Н:ФМН-оксидоредуктазы из морских люминесцентных бактерий Vibrio fischeri / М.М. Манжуль, В.С.Данилов // Журнал биохимии. 1994. - Т. 59. - № 10. -С. 1608-1614.

37. Немцева, Е.В. Механизм формирования электронного возбуждения в биолюминесцентной реакции бактерий / Е.В. Немцева, Н.С. Кудряшева // Успехи химии. 2007. - Т. 76 - № 1.- С. 101 -112.

38. Никольский, Б.П. Физическая химия / Б.П. Никольский, H.A. Смирнова, М.Ю. Панов, Н.В. Лутугина, В.В. Пальчевский, A.A. Пендин, Ф.А. Белинская, O.K. Первухин, А.К. Чарыков // Л. : Химия. 1987. - 880 с.

39. Орлов, Д.С. Гуминовые вещества в биосфере // Соровский образовательный журнал. 1997. - №2. - С. 56-63.

40. Орлов, Д.С. Сравнительное изучение сорбционного поглощения тяжелых металлов гуминовыми кислотами различного происхождения / Д.С. Орлов, Л.К. Садовникова, А.Л. Саврова // Доклады РАН, сер. Геохимия,- 1995.-Т. 345.-№4.-С. 1-3.

41. Орлов, Д.С. Химия почв / Д.С. Орлов. М. : МГУ, 1992. - 259 е.

42. Перминова И.В. Гуминовые вещества в контексте зеленой химии / И.В. Перминова, Д.М. Жилин // Зеленая химия в России. М. : Изд-во МГУ, 2004.-С. 146-162.

43. Перминова, И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот: Дис. .д-ра химических наук. М., 2000. - С. 15.

44. Перминова, И.В. Гуминовые вещества вызов химикам XXI века / И.В. Перминова // Химия и жизнь. - 2008. - № 1. - С. 50-56.

45. Петушков В.Н. Способ определения активности протеаз / В.Н. Петушков, В.А. Кратасюк, A.M. Фиш, И.И. Гительзон // Авт.свид. № 1027615, опубл.07.07.83, Бюлл. -№ 25. С. 159.

46. Петушков, В.Я. Биферментная система NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза из светящихся бактерий / В.Я. Петушков, В.А. Кратасюк, Н.С. Родионова, A.M. Фиш, П.И. Белобров // Биохимия. -1984. Т. 49. - № 4. - С. 692-702.

47. Потапов, В.М. Органическая химия / В.М. Потапов, С.Н. Татаринчик. М. : Наука, 1989. - С. 370.

48. Родичева, Э.К. Каталог культур светящихся бактерий / Э.К.Родичева, Г.А. Выдрякова, С.Е. Медведева. Новосибирск: Наука, 1997,- 125с.

49. Серегин, И.В. Распределение тяжелых металлов в растениях и их действие на рост.: Автореф. . д-ра биологических наук. Москва, 2009. -53 с.

50. Смит, К. Молекулярная фотобиология / К. Смит, Ф. Хенеуолит. -М. : Мир. 1972.-272 с.

51. Стом, Д.И. Комбинированное действие нефтепродуктов и "Гумата" на дафний / Д.И. Стом, A.B. Дагуров // Сибирский экологический журнал.- 2004. № 1.-С. 35-40.

52. Тихонов М.Н., Цыган В.Н. Общие механизмы токсичности металлов. Электронный ресурс. // Antiatom. Безопасность и экология: [сайт]. [2010]. URL: http://www.antiatom.ru/2010 6-22.php. (дата обращения: 06.05.2012).

53. Трубецкая, О. Гуминовые вещества как природные фотоиндукторы, осуществляющие деградацию пестицидов в окружающей среде / О. Трубецкая, О. Резникова, О. Трубецкой // Доклады Академии наук. 2006.- Т. 406. № 4. - С. 567-569.

54. Федорова, Е.С. Биолюминесцентный мониторинг процессов детоксикации растворов органических соединений.: Автореф. . дис. канд. биологических наук. Пущино, 2011. - 21 с.

55. Федорова, Е.С. Детоксикация растворов органических окислителей гуминовыми веществами. Биолюминесцентный мониторинг / Е.С. Федорова, Н.С. Кудряшева, A.M. Кузнецов, Д.И. Стом, A.B. Белов, А.Г. Сизых // Доклады академии наук. 2005. - № 4. - С. 1-3.

56. Филов, В.А. Тиунов J1.A. Вредные химические вещества. Галоген- и кислородсодержащие органические соединения: Справочник / В.А. Филов, Л.А. Тиунов. СПб. : Химия, 1994.

57. Холодкевич, C.B. Перспективные методы обезвреживания органических загрязнений воды / C.B. Холодкевич, Г.Г. Юшина, Е.С. Апостолова // Экологическая химия. 1996. - Т. 5. - № 2. - С. 75-106.

58. Хотунцев, Ю.Л. Экология и экологическая безопасность: Учебное пособие / Ю.Л. Хотунцев. М.: Издательский центр «Академия», 2004. -480с.

59. Цыбульский, И.Е. Новые биосенсоры для мониторинга токсичности среды на основе морских люминесцентных бактерий / И.Е. Цыбульский, М. А. Сазыкина // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. - Т. 46. -№ 5. - С. 552-557.

60. Чебакова, И. Б. Очистка сточных вод / И. Б. Чебакова. Омск: Изд-во ОмГТУ, 2001.-84 с.

61. Яворский, В.А. Планирование научного эксперимента и обработка экспериментальных данных / В.А. Яворский // Методические указания к лабораторным работам. М., 2006. - 24 с.

62. Якименко, О.С. Гуминовые препараты и оценка их биологической активности для целей сертификации / О.С. Якименко, В.А. Терехова // Почвоведение. Биология почв. 2011. - №11. - С. 1334-1343.

63. Agbenin, J.O. Competitive adsorption of copper and zinic by a Bt horizon of a savanna Alfisol as affected by pH and selective removal of hydrous oxides and organic matter / J.O. Agbenin, L.A. Olojo // Geoderma. 2004. - V. 119. -N.l-2 - P. 85-95.

64. Al-Abri, M. Combined humic substance and heavy metals coagulation, and membrane filtration under saline conditions / M. Al-Abri, A. Dakheel, C. Tizaoui, N. Hilal//Desalination.-2010.-V. 253. N.l-3. - P. 46-50.

65. Alexandrova, M. Effect of americium-241 on luminous bacteria. Role of peroxides / M. Alexandrova, T. Rozhko, G. Vydryakova, N. Kudryasheva // Journal of Environmental Radioactivity. 2011. - V. 102. - N. 4. - C. 407-411.

66. Bironaite, D. Interaction of quinines with Arabidopsis thaliana thioredoxin reductase / D. Bironaite, Z. Anusevic, J.P. Jacquot, N. Cenas // Biochemica et biophysica acta. 1998. - V. 1383.- P. 82-92.

67. Brunmark, A. Redox and addition chemistry of quinoid compounds and its biological implications / A. Brunmark, E. Cadenas // Free radical biology and medicine. 1989. - V. 7. -1. 4. - P. 435-477.

68. Bulish, A.A. Use of the luminescent bacterial system for rapid assessment of aquatic toxicity / A.A. Bulish, D.L. Isenberg // ISA trans actions. 1981. - V. 20.-P. 29-33.

69. Champe, P.C. Lippincott's Illustrated Reviews: Biochemistry / P.C. Champe, R.A. Harvey, D. R. Ferrier // Lippincott Williams and Wilkins Publishers. 2005. - 608 p.

70. Chen, Y. Mechanisms of plant growth stimulation by humic substances: the role of organo-iron complexes / Y. Chen, C.E. Clapp, H. Magen // Journal of plant nutrition and soil science. 2004. - V. 50. - P. 1089-1095.

71. Cheng, Y. Combining biofunctional magnetic nanoparticles and ATP bioluminescence for rapid detection of Escherichia coli / Y. Cheng, Y. Liu, J. Huang, K. Li, W. Zhang, Y. Xian, L. Jin // Talanta. 2009. - V.77. - N. 4. - P. 1332-1336.

72. Costerton, J. Structure and plasticity at various organization levels in the bacterial cell / J. Costerton // Canadian Journal of microbiology. 1988. - V.34. -P. 513-521.

73. Donnelly, K. Utility of four strains of white-rot fungi for the detoxification of 2,4,6-trinitrotoluene in liquid culture / K. Donnelly, J. Chen, H. Huebner, K. Brown // Environmental toxicology and chemistry. 1997. - V. 16. -N. 6.-P. 1105-1110.

74. Esimbekova, E. N. Bioluminescent enzymatic tests for ecological monitoring / E. N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk // Ecology and Safety, International scientific publications. 2008. - V. 2. - P. 578-586.

75. Francisco, W.A. Deuterium kinetic isotope effects and the mechanism of the bacterial luciferase reaction / W.A. Francisco, H.M. Abu-Soud, A.J. DelMonte, D.A. Singleton, T.O. Baldwin, F.M. Raushel // Biochemistry. -1998.-V. 37.-P. 2596.

76. Frank, C. Lu. Basic toxicology / C. Lu Frank//CRC. 1996.-. 376 p.

77. Gachter, R. Regulation of copper availability to phytoplankton by macromolecules in lake water / R. Gachter, J.S. Davis, A. Mares // Environmental science and technology. 1978.-V. 12.-N. 13-P. 1416-1421.

78. Garcia-Mina, J.M. Metal-humic complexes and plant micronutrient uptake: a study based on different plant species cultivated in diverse soil types / J.M. Garcia-Mina, M.C. Antolin, M. Sanchez-Diaz // Plant and soil. 2004. -V. 258.-N. 1-2.-P. 57-68.

79. Girotti, S. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria / S. Girotti, E.N. Ferri, M.G. Fumo, E. Maiolini // Analytica chimica acta. 2008. - V. 608. - N. 1. - P. 2-29.

80. Grabert, E. About the effect of nutrients on the luminescent bacteria test / E. Grabert, F. Kossler // Bioluminescence and chemiluminescence, Wiley, Chichester. 1997. - P. 291-294.

81. Gray, N. F. Biology of wastewater treatment. Series on environmental science and management / N. F. Gray // World scientific publishing company. -2004.-V. 4.-P. 1444.

82. Gu, B. Enhanced microbial reduction of Cr (VI) and U (VI) by different natural organic matter fractions / B. Gu, J.Chen // Geochim cosmochim acta. -2003.-V. 67-P. 3575-3582.

83. Hastings, J. W. Bioluminescence / J.W. Hastings // Cell Physiology, Academic Press, NY, 2001. P. 1115-1131.

84. Hastings, J.W. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduced flavin mononucleotide / J.W. Hastings, Q.H. Gibson // The journal of biological chemistry. 1963. - V. 238. - P. 2537.

85. Havelcova, M. Sorption of metal ions on lignite and the derived humic substances / M. Havelcova, J. Mizera, I. Sykorov, M. Pekar // Journal of hazardous materials. 2009. - V. 161. -1. 1. - P. 559-564.

86. Heelis, P.F. The photophysical and photochemical properties of flavins (isoalloxazines)//Chemical society reviews. 1982. - V.l 1- N. 1-P. 15-39.

87. Hooda, V. Phytoremediation of toxic metals from soil and waste water / V. Hooda // Journal of environmental biology 2007. - V.28. - N. 2. - P. 367376.

88. Hsieha, C.Y. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fischeri in the Microtox® chronic toxicity test / C.Y. Hsieha, M.H. Tsaib, D. K. Ryanc, O.C. Pancorbo // The science of the total environment. 2004. - V. 320. -I.-P. 37-50.

89. Hu, X. Combined effects of titanium dioxide and humic acid on the bioaccumulation of cadmium in Zebrafish / X. Hu, Q. Chen, L. Jiang, Z. Yu, D. Jiang, D. Yin // Environmental pollution. 2011. - V. 159. - N. 5. - P. 11511158.

90. Hunter, D.M. Rapid detection and identification of bacterial pathogens by using an ATP bioluminescence immunoassay / D.M. Hunter, D.V. Lim // Journal of food protection. 2010. - V. 73.-N. 4.-P. 739-746.

91. Imbufe, A.U. Effects of potassium humate on aggregate stability of two soils from Victoria, Australia / A.U. Imbufe, A.F. Patti, D. Burrow, A. Surapaneni, W.R. Jackson, A.D. Milner // Geoderma. 2005. - V. 125. -1. 3-4. -P. 321-330.

92. John, B. Storage of organic carbon in aggregate and density fractions of silty soil under different types of land use / B. John, T. Yamashita, B. Ludwig, H. Flessa // Geoderma. 2005. - V. 128. -1. 1-2. - P. 63-79.

93. Kamnev, A.A. Effects of tritium and humic substances on cells of Photobacterium phosphoreum: bioluminescence and FTIR spectroscopic studies / A.A. Kamnev, A.V. Tugarova, M.A. Alexandrova, P.A. Tarantilis, M.G.1.l

94. Polissiou, N.S. Kudryasheva // Spectroscopy in the biological sciences of the XXI Century. Intracellular fluorescence spectroscopy, P6cs, Hungary, 2011. P. 35.

95. Katafias, A. Hydrogen peroxide as a reductant of hexacyanoferrate (III) in alkaline solutions: kinetic studies / A. Katafias, O. Impert, P. Kita // Transition metal chemistry. 2008. - V.33. - N. 8. - P. 1041-1046.

96. Kerner, M. Self-organization of dissolved organic matter to micelle-like micropadicles in river water / M. Kerner, H. Hohenberg, S. Ertl, M. Reckermann, A. Spitzy // Nature. 2003. - V. 422. - P. 150-154.

97. Khwaja, A.R. Binding constants of divalent mercury (Hg2+) in soil humic acids and soil organic matter / A.R. Khwaja, P.R. Bloom, P.L. Brezonik // Environmental science and technology. 2006. - V. 40. - N. 3. - P. 844-849.

98. Kirillova, T.N. Effect of halogenated fluorescent compounds on bioluminescent reactions / T.N. Kirillova, M.A. Gerasimova, E.V. Nemtseva, N.S. Kudryasheva // Analytical and bioanalytical chemistry. 2011. - V. 400. - N.2. -P. 343-351.

99. Kleinhempel, D. Ein beitrag zur theories des huminstoffzustandes // Albrecht thaer archiv. 1970. -V. 14. - N. 1. - P. 3-14.

100. Klocking, R. Medical aspects and applications of humic substances // Biopolymers for medical and pharmaceutical applications / R. Klocking, B. Helbig // Wiley-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim. 2005. - P. 316.

101. Kochany, J. Application of humic substances in environmental remediation / J. Kochany, W. Smith // WM'01 Conference, February 25-March 1, 2001, Tucson, AZ.-P. 1-12.

102. Kratasyuk, V. Bioluminescent enzyme assay for the indication of plant stress in enclosed life support systems / V. Kratasyuk, E. Esimbekova, M. Correll, R. Bucklin // Luminescence. 2011. - V. 26. -1. 6. - P. 543-546.

103. Kratasyuk, V.A. Principle of luciferase biotesting / V.A. Kratasyuk // Proceeding of the First International School "Biological Luminescence". -Singapore, 1990. World Scientific Publishing Co., 1990. P. 550-558.

104. Kratasyuk, V.A. The use of bioluminescent biotests for study of natural and laboratory aquatic ecosystems / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova, M.I. Gladyshev, E.B. Khromichek, A.M. Kuznetsov, E.A. Ivanova // Chemosphere. -2001.-V. 42.-N. 8.-P. 909-915.

105. Kudryasheva, N. Bioluminescent assays: effects of quinones and phenols / N. Kudryasheva, E. Vetrova, A. Kuznetsov, V. Kratasyuk, D. Stom // Ecotoxicology and environmental safety. 2002. - V. 53 - N. 4. - P. 221-225.

106. Kudryasheva, N. Nonspecific effects of exogenous compounds on bacterial bioluminescent enzymes: Fluorescence study / N. Kudryasheva // Current enzyme inhibition. 2006. - V. 2. - N. 4. - P. 363-372.

107. Kudryasheva, N.S. Bioluminescence and exogenous compounds. Physico-chemical basis for bioluminescent assay / N.S. Kudryasheva // Journal of photochemistry and photobiology B: Biology. 2006. - V. 86. - N.l. - P. 7786.

108. Kudryasheva, N.S. Effect of quinones and phenols on the triple enzymic bioluminescent system with protease / N.S. Kudryasheva, E.N. Esimbekova, N.N. Remmel, V.A. Kratasyuk, A.J.W.G Visser, A.van Hoek // Luminescence. 2003. - V. 18. - N.4. - P.224-228.

109. Kudryasheva, N.S. Effects of quinones and phenols on the NAD(H)-dependent triple systems / N.S. Kudryasheva, I.Y. Kudinova, E.N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk, D.I. Stom // Chemosphere. 1998. - V. 38. - N. 4. - P. 751758.

110. Kudryasheva, N.S. Interaction of aromatic compounds with Photobacterium leiognathi luciferase: fluorescence anisotropy study / N.S. Kudryasheva, E.V. Nemtseva, A.J.W.G. Visser, A.van Hoek // Luminescence. -2003. V.18. -N.3. - P. 156-161.

111. Kulikova, N.A. Estimation of uptake of humic substances from different sources by Escherichia coli cells under optimum and salt stress conditions by use of tritium-labeled humic materials / N.A. Kulikova, I.V.114

112. Perminova, G.A. Badun, M.G. Chernysheva, O.V. Koroleva, E.A. Tsvetkova // Applied and environmental microbiology. 2010. - V. 76. - N. 18. - P. 62236230.

113. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy / J. R. Lakowicz // Springer. 2006. - 954 p.

114. Lee, J. Chemistry and biochemistry of flavins and flavoenzymes. orlando / J. Lee, I.B.C. Matheson, F. Muller, D.J. O'Kane, J. Vervoot, A.J.W.G. Visser // CRC Press, 1991. V. 11. - P. 109-151.

115. Lorenzo, J.I. Effect of humic acids on speciation and toxicity of copper to paracentrotus lipids larvae in seawater / J.I. Lorenzo, O. Nieto, R. Beiras // Aquatic toxicology. -2002. V. 58.-N. 1-2.-P. 27-41.

116. Lovley, D. R. Bioremediation of metal contamination / D. R. Lovley, J. D. Coates // Current opinion in biotechnology. 1997. - V. 8. - I. 3. - P. 285289.

117. Low, J.C. Energy transfer evidence for in vitro and in vivo complexes of Vibrio harveyi flavin reductase P and luciferase / J.C. Low, S.C. Tu // Photochemistry and photobiology. 2003. - V. 77. - P. 446.

118. McCapra, F. Chemical generation of excited states: the basis of chemiluminescence and bioluminescence / F. McCapra // Methods in enzymology. 2000. - V. 305. - P. 3-47.

119. Medvedeva, S.E. Bioluminescent Bioassays Based on Luminous Bacteria / S.E. Medvedeva, N.A. Tyulkova, A.M. Kuznetsov, E.K. Rodicheva // Journal of Siberian federal university. 2009. - V.4. - N. 2 - P. 418-452.

120. Meighen, E.A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes / E.A. Meighen // The FASEB Journal. 1993. - V. 7. - N. 11 -P. 1016-1022.

121. Natecz-Jawecki, G. Evaluation of toxicity of medical devices using Spirotox and Microtox tests: I. Toxicity of selected toxicants in various diluents / G. Natecz-Jawecki, B. Rudz, J. Sawicki // Biomedical materials research. -1997. V. 35 - P. 101-105.

122. Nealson, K.H. Isolation, indentification and manipulation of luminous bacteria / K.H. Nealson // Methods in enzymology. 1978. - V. 57. - P. 153166.

123. Paisio, C. E. Toxicity of phenol solutions treated with rapeseed and tomato hairy roots / C. E. Paisio, P. S. González, A. Gerbaudo, M. L. Bertuzzi,

124. E. Agostini // Desalination. 2010. - V. 263. -1. 1-3. - P. 23-28.

125. Park, Ji-Sook. Phenol toxicity to the aquatic macrophyte Lemna paucicostata / Ji-Sook Park, M. T. Brown, T. Han // Aquatic toxicology. 2012. -V. 106-107.-P. 182-188.

126. Pegoraro, R.F. Diffusive flux of cationic micronutrients in two Oxisols as affected by low-molecular-weight organic acids and cover-crop residue / R.F. Pegoraro, I.R. Silva, R.F. Nováis, E.S. Mendonca, V.H. Alvarez, F.N. Nunes,

127. F.M. Fonseca, T.J. Smyth // Journal of plant nutrition and soil science- 2005. -V. 168.-N. 3.-P. 334-341.

128. Pena-Mendez, E. M. Humic substances compounds of still unknown structure: applications in agriculture, industry, environment, and biomedicine /

129. E. M. Pena-Mendez, J. Havel, J. Patocka // Journal of applied biomedicine. -2005.-V. 3.-N. l.-P. 13-24.

130. Petukhov, V.N. Plant Biotests for Soil and Water Contaminated with Oil and Oil Products / V.N. Petukhov, V.M. Fomchenkov, V.A. Chugunov and V.P. Kholodenko // Applied biochemistry and microbiology. 2000. - V. 36. -N. 6.-P. 564-567.

131. Piccolo, A. Chromatographic and spectrophotometric properties of dissolved humic substances compared with macromolecular polymers / A. Piccolo, P. Conte, A. Cozzolino // Soil science. 2001. - V. 166. - N. 3 - P. 174-185.

132. Provenzano, M. Fluorescence behaviour of Zn and Ni complexes of humic acids from different source / M. Provenzano, V. D'Orazio, M. Jerzykiewiez, N. Senesi // Chemosphere. 2004. - V. 55. - N. 6. - P.885-892.

133. Raushel, F.M. Proposed mechanism for the bacterial luciferase reaction involving a dioxirane intermediate / F.M. Raushel, T. O. Baldwin // Biochemical and biophysical research communications. 1989. - V. 164. - P. 1137-1142.

134. Remmel, N.N. Bioluminescent biosensors for space biotechnology / N.N. Remmel, E.N. Esimbekova, S.M. Gusev, V.A. Kratasyuk // Luminescence. -2006,-V.21.-N. 5. P.288.

135. Ren, S. Phenol mechanism of toxic action classification and prediction: a decision tree approach / S. Ren // Toxicology letters. 2003. - V. 144. -1. 3. -P. 313-323.

136. Rodriguez, C. E. An examination of quinone toxicity using the yeast Saccharomyces cerevisiae model system / C. E. Rodriguez, M. Shinyashiki, J. Froines, R. C. Yu, J. M. Fukuto, A. K. Cho // Toxicology. 2004 - V. 201. - I. 1-3.-P. 185-196.

137. Schmidt, T.M. Bioluminescence of the insect pathogen Xenorhabdus luminescens / T.M. Schmidt, K. Kopecky, K.H. Nealson // Applied and environmental microbiology. 1989. - V. 55. - N. 10 - P. 2607-2612.

138. Schultz, T.W. Quinone-induced toxicity to Tetrahymena: structure-activity relationships / T.W. Schultz, G.D. Sinks, M.T.D. Cronin // Aquatic toxicology. 1997. - V. 39. -1. 3-4. -P.267-278.

139. Stom, D.I. Bioluminescent method in studying the complex effect of sewage components / D.I. Stom, T.A. Geel, A.E. Balayan, A.M. Kuznetsov, S.E. Medvedeva // Archives of environmental contamination and toxicology. 1992. -V .22.-1. 2-P. 203-208.

140. Tao, S. Uptake of copper by neon tetras (Paracheirodon innesi) in the presence and absence of particulate and humic matter / S. Tao, T. Liang, C. Liu, S. Xu // Ecotoxicology. 1999. - V. 8. - N. 4. - P. 269-275.

141. Trubetskoj, O.A. Photochemical activity and fluorescence of electrophoretic fractions of aquatic humic matter / O.A. Trubetskoj, O.E. Trubetskaya, C. Richard // Water resources. 2009. - V.36. -1. 5 - P. 518-524.

142. Tyulkova, N.A. Bacterial bioluminescence and its application / N.A. Tyulkova, S.E. Medvedeva, E.K. Rodicheva, A.M. Kuznetsov // Bioluminescence in focus A Collection of illuminating essays, Research Signpost.Trivandrum, India, - 2009. - P. 27-49.

143. Tyulkova, N.A. Purification of bacterial luciferase from Photobacterium Leiognathi with the use of FPLC-system / N.A. Tyulkova // Bacterial Luminescence. Singapore: World Scient, 1990-P.369-74.

144. Valimaa, A.L. A novel biosensor for the detection of zearalenone family mycotoxins in milk / A.L. Valimaa, A.T. Kivisto, P.I. Leskinen, M.T. Karp // Journal of microbiological methods. 2010. -V.80. - N. 1. - P. 44-48.

145. Vanysek, P. Electrochemical series / P. Vanysek // Handbook of chemistry and physics. Chemical Rubber Company Press LLC, 2007.

146. Vervoort, J. Bacterial luciferase: a carbon-13, nitrogen-15, and phosphorus-31 nuclear magnetic resonance investigation / J. Vervoort, F. Muller, D.J. O'Kane, J. Lee, A. Bacher // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 8067-8075.

147. Vetrova, E. V. Effect of quinone on the fluorescence decay dynamics of endogenous flavin bound to bacterial luciferase / E. V. Vetrova, N. S Kudryasheva, K. H Cheng // Biophysical chemistry. 2009. - V. 141. - N 1. -C. 59-65.

148. Watanabe, T. Studies on luciferase from Photobacterium phosphoreum. XI. Interaction of 8-substituted FMNH2 with luciferase / T. Watanabe, K. Matsui, S. Kasai, T. Nakamura // Biochemistry. 1978. V. 84. - N. 6. - P. 1441-1446.

149. Wershaw, R.L. Molecular aggregation of humic substances / R.L. Wershaw // Soil science- 1999.-V. 164.-N. 11.-P. 803-813.

150. Williams P. L. The Principles of toxicology: Environmental and industrial applications / P. L. Williams, R. C. James, S. M. Roberts // Wiley-Interscience, 2000. 603 p.

151. Zhilin, D. Reduction of Cr(VI) by peat and coal humic substances / D. Zhilin, P. Schmitt-Kopplin, I. Perminova // Environmental chemistry letters. -2004.-V. 2.-P. 141-145.

Информация о работе

Тарасова, Анна Сергеевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Использование биолюминесцентных систем для изучения закономерностей детоксикации растворов модельных поллютантов гуминовыми веществами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы