Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированного аскомицета Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg.

Любимова, Елизавета Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированного аскомицета Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg.
ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированного аскомицета Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg."

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи Любимова Елизавета Григорьевна

«Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированного аскомицета Cladonia rangiferina (К) F. ^ Wigg.»

Специальность 03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Диссертационная работа выполнена на кафедре физиологии растений Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук,

профессор

И. П. Ермаков

кандидат химических наук старший научный сотрудник Н. Р. Мейчик

Официальные оппоненты

доктор биологических наук

профессор

Е. П. Феофилова

кандидат биологических наук старший научный сотрудник И. Д. Инсарова

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Защита состоится «11» марта 2005 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет. Факс-(095) 939-43-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан февраля 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Состав и свойства клеточных стенок организмов оказывают значительное влияние на протекание многих физиологических процессов и непосредственно воздействуют на поступление растворенных веществ в клетки. В таком организме, как лихенизированные аскомицеты клеточная стенка приобретает особое значение, поскольку лишайники не имеют специализированных структур для транспорта воды и ионов подобных сосудам ксилемы и флоэмы у высших растений. В слоевище транспорт воды и растворенных веществ, который обеспечивает поддержание равновесия между симбионтами, происходит преимущественно по апопласту, и определяется его свойствами. На примере растений и свободноживущих грибов установлено, что внеклеточный транспорт ионов зависит от ионообменных свойств клеточных стенок, а именно от количественного и качественного состава функциональных групп, способных принимать участие в ионном обмене.

В клеточных стенках мицелия как свободноживущих, так и образующих лишайниковый симбиоз грибов, могут накапливаться значительные количества тяжелых металлов. Связывание ионов при этом происходит по ионнобменному механизму, а также по механизму комплексообразования, в которых участвуют полимеры клеточных стенок (хитин и хитозан), обладающие высокой сорбционной способностью. Кроме того, лишайники образуют особую морфологическую структуру (слоевище), характеризующуюся низкой скоростью роста. Указанные выше особенности, а также имеющиеся у лишайников межвидовые различия в чувствительности к антропогенным загрязнениям, делают их удобными объектами для экологического мониторинга. Разная видовая чувствительность к загрязняющим веществам во многом определяется количеством токсичных ионов, проникающих в клетку, и, следовательно, также зависит от ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок.

Таким образом, ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированных грибов определяют накопление ионов в экстраклеточном пространстве и влияют на их поступление в клетки. Однако до настоящей работы данных, характеризующих функциональные группы, входящие в состав клеточных стенок микобионта лишайников, не получено. Недостаточно изучены процессы поглощения ионов клеточными стенками и их роль как во внеклеточном транспорте веществ, так и в поступлении в клетки.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в количественной оценке ионообменных свойств клеточных стенок лишайников и в определении вклада ионного

обмена в процессы поглощения веществ слоевищем на примере кустистого лишайника Cladoma rangiferina (Ь.) F. Н. Wigg.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить элементный состав слоевищ лишайника С. rangiferina и изолированных из них клеточных стенок.

2. Изучить качественный и количественный состав функциональных групп клеточных стенок лишайника.

3. Охарактеризовать физико-химические свойства полимерного матрикса клеточных стенок:

• определить константы диссоциации функциональных групп, расположенных в полимерной структуре клеточных стенок и способных вступать в ионообменные реакции с ионами внешней среды

• установить относительную сухую массу клеточных стенок и определить коэффициенты набухания их полимерного матрикса

• определить коэффициенты диффузии и оценить степень сшивки линейных цепей в полимерном матриксе клеточных стенок.

4. Изучить процесс поглощения органического катиона клеточными стенками лишайника как модель визуализации процессов ионного обмена и диффузии в природном полимере.

5. Оценить вклад ионообменного механизма связывания веществ клеточными стенками в процессы поглощения и транспорта растворенных веществ.

Научная новизна. Впервые установлено, что в составе клеточных стенок лишайника Cladonia rangiferina (Ь.) F. Н. Wigg. содержится три типа функциональных групп, из них две являются катионообменными (карбоксильные и фенольные группы), и одна -анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, характеризующие количественный и качественный состав ионогенных групп клеточных стенок лишайника, а также интервалы рН, в которых эти группы ионизированы и способны вступать в ионообменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Показано, что у лишайника С. rangiferina в составе полимерного матрикса клеточных стенок, представляющих собой преимущественно клеточные стенки микобионта, суммарное содержание хитина и хитозана составляет менее 6%.

Определены параметры, количественно характеризующие способность к набуханию и диффузионные свойства клеточных стенок С. rangiferina. На основании значений

коэффициентов набухания и коэффициентов диффузии органического катиона в матриксе клеточных стенок, можно заключить, что степень сшивки полимеров, составляющих каркас клеточных стенок лишайника, значительно превышает этот показатель у растений. Впервые показано, что объем клеточных стенок С. гangifeгina является относительно постоянной величиной и мало зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в апопласте, что также связано со структурой их полимерного матрикса.

Практическое значение. Разработан новый подход к количественной оценке ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок С. гangifeгina, который может быть применен к определению аналогичных свойств других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. В дальнейшем количественные показатели, характеризующие физико-химические свойства клеточных стенок различных видов лишайников, могут быть использованы при их выборе и характеристике в качестве объектов экологического мониторинга.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедр физиологии растений и микологии и альгологии биологического факультета МГУ, Международной научной конференции «Изучение и охрана биологического разнообразия природных ландшавтов Русской равнины» Пенза, 1999, V съезде общества физиологии растений России, Пенза, 2003, Ш-Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии», Караганда 2004.

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 5 работ, и одна статья принята к печати. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, списка цитированной литературы, включающего ■У/; наименования (из них иностранных языках), приложения. Работа содержит

Глава 1. Обзор литературы.

Обзор посвящен обсуждению роли клеточных стенок лихенизированных аскомицетов в обеспечении их жизнедеятельности. Представлены имеющиеся данные по химическому составу и строению клеточных стенок микобионта лишайников. Рассмотрен вклад клеточных стенок в поддержание водного режима этих организмов. Обсуждаются

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

вопросы участия клеточных стенок лишайников в накоплении различных веществ их слоевищами и возможности практического применения таких данных в связи с использованием этих организмов в экологическом мониторинге.

Глава 2. Материалы и методы.

Объект исследования. Изучение свойств клеточных стенок лишайников проводили на примере кустистого лишайника Cladonia гangifeгina F. ^ Wigg., относящегося к сем. Cladoniaceae порядка Lecanoгales аскомицетных лишайников. Фикобионтом этих лишайников являются зеленые водоросли рода Tгebouxia. Во взрослом состоянии слоевище этого вида лишайников представлено ветвящимися подециями с полостью внутри.

Методика сбора материала. Материал собирали в Тверской области в июле 2000-2002 гг. и помещали в бумажные конверты. В лаборатории слоевища промывали водой, высушивали на воздухе и использовали в экспериментах. Определение видовой принадлежности собранных образцов проводили по общепринятой методике с использованием определителя (Определитель лишайников СССР, 1978).

Для выделения клеточных стенок использовали живые части подециев, а также «молодые части», которые представляли собой четыре верхних междоузлия подециев, и «старые части» (с 4-го по 8-е междоузлия). Клеточные стенки изолировали путем последовательной обработки образцов растворами щелочи, кислоты и водой.

Определение элементного состава слоевищ лишайника и выделенных из них клеточных стенок. Содержание фосфора и восстановленного азота определяли в интактных слоевищах и в изолированных клеточных стенках методом Лоури и по методу Любошинского-Зальта соответственно. Процентное содержание углерода, водорода и азота в слоевищах лишайника и выделенных из них клеточных стенках определяли на химическом факультете МГУ на CHN-анализаторе фирмы Peгkin-Elmeг 2400.

Для определения качественного и количественного состава ионообменных групп клеточных стенок проводили потенциометрическое титрование, которое осуществляли методом отдельных навесок (Мейчик и др., 1999). Анализируя полученные кривые зависимости сорбционной способности от рН, определяли число типов ионообменных групп и их количество. Количество свободных аминогрупп определяли также методом неводного титрования.

Определение содержания воды в интактных слоевищах лишайника и весового коэффициента набухания клеточных стенок лишайника в воде. Набухшие в воде

фрагменты интактных слоевищ лишайников или стандартизованные клеточные стенки обсушивали фильтровальной бумагой и определяли их сырую массу (О;- и Се , соответственно). Затем образцы высушивали при 50°С до постоянного веса и определяли их сухую массу (вр и Ср , соответственно). Весовой коэффициент набухания стандартизованных клеточных стенок ) и содержание воды в интактных слоевищах (р) определяли по соответствующим формулам (Гельферих, 1962).

Поглощение метиленового синего интактными слоевищами лишайника и выделенными из слоевищ клеточными стенками. Набухшие в воде клеточные стенки, выделенные из подециев С. гащИегта, или интактные слоевища обсушивали фильтровальной бумагой, определяли сырую массу и погружали в раствор с концентрацией метиленового синего 0,032 мг/мл (0,0001 М). Далее из раствора через определенные промежутки времени отбирали пробы, в которых определяли концентрацию метиленового синего спектрофотометрическим методом (анализатор Униплан, Россия). Количество метиленового синего, поглощенное образцами, рассчитывали по разности концентраций в исходном и конечном растворах при соответствующем времени 1. Для установления зависимости поглощения метиленового синего от рН набухшие в воде образцы, обсушивали фильтровальной бумагой и помещали в конические колбы со 150 мл раствора 0,0001 М метиленового синего. Через 3 часа материал удаляли из раствора, в котором определяли концентрацию метиленового синего и рН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. Элементный состав клеточных стенок лишайника в частях слоевища разного возраста.

Чтобы определить содержание основных биогенных элементов в слоевищах С. гащИегта, проведен анализ частей подециев разного возраста и выделенных из них клеточных стенок на содержание углерода, азота, водорода, кислорода и фосфора (табл. 1). Для сравнительной оценки результатов элементный анализ проведен также для чистого препарата хитина (фирма 1СК). Результаты анализа свидетельствуют, что N ацетилглюкозамин и глкжозамин не являются основными мономерами в полимерных цепях клеточных стенок данного объекта, так как и в слоевищах, и в изолированных из него клеточных стенках количество общего азота составляет менее 1%, что значительно меньше, чем в чистом препарате хитина (табл. 1). Молодые части подециев лишайника и изолированные из них клеточные стенки содержат в 2 раза больше азота, чем старые части

и выделенные из них стенки, а, следовательно, у первых способность к гидратации выше, чем у вторых. Расчеты показывают, что в клеточных стенках С. гащИегта содержится около 50% от всего имеющегося в клетках азота. Количество фосфора в слоевищах составляет 0,06% от сухой массы образцов, а в клеточных стенках этого биогенного элемента не обнаружено (табл. 1).

Таблица 1. Элементный состав С. гащИегта, изолированных из него клеточных стенок в зависимости от возраста и препарата хитина. С, Н, Р и N(1) выражены в % от сухой массы образца, N(11) - в мкмоль на г сухой массы образца. В скобках приведены расчетные количества элементов.

Образец Части подециев С Н Р N

I II

Лишайник живые 42,4210,10 6,8310,15 0,0610,01 0,4810,03 339115

молодые 43,6310,14 6,8510,02 не опред 0,8910,05 632125

старые 42,4810,13 6,9010,12 не опред 0,47+0,01 332125

Клеточные стенки живые 42,2310,10 6,9410,01 не обнар 0,4410,02 311125

молодые 42,2810,12 7,1110,02 не обнар 0,6110,04 432135

старые 41,5110,06 6,8810,01 не обнар 0,2810,03 31115

Хитин 46,2310,06 (47,29) 6,8710,02 (6,40) не опред 7,0810,01 (6,90) 5057150

Чтобы установить количественное соотношение ^ацилированных и свободных аминогрупп, разработана методика их раздельного определения в клеточных стенках С. гащИегта. В основе методики лежит неводное титрование хлорной кислотой растворимых низкоосновных соединений (Черонис и Ма, 1973). Показатели, полученные для клеточных стенок лишайника, мы сравнивали с количеством аминогрупп и содержанием азота в препаратах хитина и хитозана (фирма ГСМ), выделенных из панцирей ракообразных. Полученные результаты показывают, что выбранный метод анализа для раздельного определения ^ацилированных и свободных аминогрупп может быть применен к сшитым трехмерным структурам клеточных стенок, так как для препарата хитозана данные титрования (I) и результаты элементного анализа (II) полностью согласуются между собой (табл. 2). Этот вывод подтверждают также данные анализа препарата хитина. В этом полимере доля свободных аминогрупп составляет 27% (табл. 2), и это значение согласуется с данными литературы (Феофилова и др., 1995). Наименьшее

количество свободных аминогрупп (табл. 2), а также общего азота (табл. 1) содержится в старых частях подециев. В зависимости от возраста доля гидролизованных М-содержащих групп варьирует от 34% (молодые части подециев) до 40% (старые части подециев).

Таблица 2. Содержание свободных аминогрупп (I), общего азота (И), % свободных аминогрупп (III) в клеточных стенках, изолированных из разновозрастных частей подециев лишайника С. rangiferina, и в препаратах хитина и хитозана. Для клеточных стенок величины в (I) и (II) выражены в микрокмолях на грамм сухой массы клеточных стенок, а для препаратов - в микрокмолях на грамм сухой массы образца.

Образец части подециев I II III

Клеточные стенки лишайника живые 125+10 311+25 40

молодые 145+8 432+35 34

старые 73+5 196+10 37

хитин 1295+84 5057110 27

хитозан 680+33 650+25 104*

*- ошибка эксперимента составляет 5 %

Таким образом, в настоящей работе впервые количественно определен элементный состав клеточных стенок, выделенных из разновозрастных частей подециев лишайника С. rangiferina, который свидетельствует об относительно низком содержании хитина в их полимерном матриксе.

Глава 4. Исследование ионообменных свойств клеточных стенок, изолированных из слоевищ лишайника С. rangiferina, в зависимости от возраста.

4.1 Процессы кислотно-основного равновесия в клеточных стенках лишайника.

В качестве экспериментального подхода к изучению ионообменных свойств клеточных стенок лишайника выбран потенциометрический метод, который ранее был успешно применен к исследованию структуры ионогенных групп в клеточных стенках высших растений (Мейчик и др., 1999, Meychik and Yermakov, 1999, 2001). На рис. 1. представлена экспериментальная кривая для клеточных стенок, выделенных из

живых частей подециев лишайника С. rangiferina, где - ионообменная способность клеточных стенок при рН,. Область отрицательных значений S, соответствует поглощению протонов ионогенными группами клеточных стенок область

положительных значений - выделению протонов (R-OH + Na+—>R-ONa + Н4). При рН >

10,8 и рН< 2,8 значения сорбционной емкости по КОН и НС1 достигали максимального

neat пап neat пап

уровня ("/ И соответственно). "t и t характеризуют общее количество

кислотных и основных групп, которые имеются в полимерной структуре клеточных оболочек и потенциально способны принимать участие в реакциях обмена при соответствующих значениях рН окружающей среды. Также как у высших растений, у С. rangiferina общее количество катионообменных групп значительно превышает количество анионообменных. Эти результаты свидетельствуют о том, что клеточные стенки

исследуемого лишайника являются природным катионообменником.

Рисунок 1. Кривая потенциомет-рического титрования клеточных стенок, изолированных из живых частей С. rangiferina. S - ионообменная способность клеточных стенок, мкмоль/г сухой массы клеточных стенок. Сплошная линия - расчетная кривая (уравнение 3), точки -экспериментальные данные. Бары -среднее значение стандартное отклонение.

Кривые потенциометрического титрования имеют сложную полисигмоидную форму, что свидетельствует о наличии в структуре изолированных из лишайника клеточных стенок нескольких типов функциональных групп (Мейчик и др., 1999, Meychik and Yermakov, 1999). Разделение экспериментальных кривых на моносигмоидные участки проводили согласно дифференциальным кривым показывающим ряд

минимумов (рис. 2), которые соответствуют началу (0t = 0) и концу ((X = 1) ионизации функциональной группы j-того типа (Румшиский, 1971).

Рисунок 2. Типичная дифференциальная кривая, полученная по экспериментальным данным потенцио-метрического титрования клеточных стенок, изолированных из слоевищ лишайника. AS1, AS - коли-

чество ионогенных групп 1, 2 и 3 типа в клеточных стенках.

В соответствии с дифференциальными кривыми, полученными из экспериментальных потенциометрических кривых, определили общее количество содержащихся в клеточных стенках функциональных групп, а также значения емкости каждой ступени протонирования (Д^) (табл. 3). Степень диссоциации (СЦ) каждой ионогенной группы при соответствующих значениях рН| определили по формуле:

где - сорбционная емкость при соответствующем рН1г и - минимальное и максимальное значения сорбционной емкости, найденные в соответствии с экстремумами дифференциальных кривых для .¡-той ступени протонирования, = _ . 5,-, выражены в мкмолях на г сухой массы клеточных стенок (табл. 3, рис. 2).

Таблица 3. Количественный состав ионогенных групп клеточных стенок лишайника в зависимости от возраста, в, и $1 - общая катионообменная и анионообменная способности клеточных стенок соответственно. ] - тип группы; Д^ - количество ионогенных групп ] - типа. 1 - аминогруппы, 2 - карбоксильные группы; 3 - фенольные

j СЭ1 оп

группы. ДБ, Б, и выражены в мкмоль/г сухой массы клеточных стенок.

части подециев S?= Д5' &.S1 AS5 5,"'=Д5г +Д53

живые 125+10 400±30 250113 650153

молодые 145±15 500±25 200±18 700141

старые 70±11 350115 300122 650145

Для расчета величин констант ионизации ионогенных групп применено модифицированное Грегором уравнение Хендерсона-Хассельбаха (Gregor et al, 1954).

где рК, - кажущаяся константа ионизации ионогенной группы полимера, а - степень диссоциации, п - константа, зависящая от строения полимерной матрицы и природы противоиона (Gregor el al, 1954). Анализ экспериментальных данных показал, что во всех

случаях между соответствующими величинами рН, И 1оё

статистически значимая прямолинейная зависимость (рис. 3).

С помощью метода регрессионного анализа по найденным величинам О,' (уравнение 1) и уравнению (2) рассчитаны значения рК^ И п'для каждой ступени ионизации (табл. 4). С установленными значениями параметров (табл. 3 и 4) для всех точек экспериментально полученных значений рН, определены расчетные кривые (рис. 1) зависимости 5, = £ (рН,) по суммарному уравнению (Лейкин и др., 1978):

ССШ „си!

где и - максимальная катионообменная и рассчитанная ионообменная

способность клеточных стенок при соответствующих значениях (табл. 3); АБ1

СС01 д „ у „,¡¡1

количество ионогенных групп .¡-того типа (табл. 3); ,>3, выражены в мкмоль на

г сухой массы клеточных стенок; - кажущаяся константа ионизации ионогенных

групп ]-типа; П^ - константа уравнения (2) для ионогенных групп ^того типа (табл. 4); к -количество точек на экспериментальной потенциометрической кривой, т - количество типов ионогенных групп в клеточных стенках.

у= 1Л1Х+7.07 » рН ~

й2 = 0.86 ЛУ*

О-ЙТ « его , »

-1 л э »5

1од1еМ1-«))

Рисунок 3. Зависимость рН = / (а/(1-а)) для карбоксильных групп клеточных стенок лишайника. Точки - экспериментальные данные, сплошная линия - линия тренда. На диаграмме приведено уравнение линии тренда.

Адекватность примененного подхода к описанию кислотно-основного равновесия оценивали методом регрессионного анализа (Румшиский, 1972). Расчеты показали, что выбранная модель полностью соответствует полученным в настоящей работе экспериментальным данным.

Результаты расчета кривых потенциометрического титрования клеточных стенок лишайника (табл. 3 и 4) указывают на то, что в полимерной структуре оболочек

существует три типа ионогенных групп: две катионообменные и одна анионообменная. На основании литературных данных по химическому составу лишайников (Зенова, 1999), а также исходя из значений для ионогенных групп низкомолекулярных соединений (Альберт и Сержент, 1964) часть потенциометрической кривой в области рН = 9—11

Таблица 4. Параметры кислотно-основного равновесия в щгеточных стенках, выделенных из разных частей подециев лишайника. ] - тип группы; рК, - константа ионизации группы j - того типа; - константа уравнения (2) для группы ] - того типа; г - коэффициент корреляции для групп ] - того типа; количество групп ] - того типа, мкмоль/г сухой массы; к - количество точек на прямой. 1 - аминогруппы, 2 - карбоксильные группы; 3 -фенольные группы.

части подециев } рка' ] п J г согг к Д^

1 2,80 -0,6 0,915 14 125

живые 2 7,07 1,11 0,925 10 400

3 9, 86 1,15 0,903 16 250

1 2,96 -0,9 0,949 6 145

молодые 2 7,29 1,02 0,973 10 500

3 10,61 0,89 0,841 10 200

1 2,78 -0,6 0,908 8 70

старые 2 7,00 0,97 0,927 7 350

3 10,23 1,07 0,835 16 300

может быть отнесена к титрованию фенольных групп матрикса клеточных стенок, так как для фенола Группы с выявленные в структуре клеточных стенок,

являются, по-видимому, аминогруппами, а группы с могут быть карбоксильными

или фосфоновокислотными. Так как элементный анализ показал отсутствие фосфора в клеточной стенке С. гащИепла, можно полагать, что эти группы являются карбоксильными. Вероятнее всего, большинство групп с являются остатками

кислот фенольного ряда (лишайниковых кислот). Значения для высокомолекулярных кислот полифенольного ряда близки к полученному нами значению.

По сравнению со старыми частями подециев в клеточных стенках молодых частей количество аминогрупп и карбоксильных групп выше соответственно в 1,5 и 2 раза. Обращает на себя внимание тот факт, что в разных по возрасту частях подециев неодинаковое соотношение карбоксильных и фенольных групп, принадлежащих к вторичным метаболитам лишайников. Вероятно, изменение соотношения между количеством групп обусловлено зависимостью содержания лишайниковых веществ в

слоевище от возраста лишайника, и согласуется с имеющимися данными о влиянии различных факторов, в том числе и возраста, на содержание лишайниковых веществ в слоевище (Вайнштейн, 1982). Изменение с возрастом числа аминогрупп соответствует изменениям в общем содержании азота, и свидетельствует о снижении содержания хитина и хитозана в клеточных стенках старых частей подециев.

Рисунок 4. Зависимость степени ионизации (а) различных ионогенных групп, расположенных в клеточных стенках лишайника, от рН внешнего раствора. Линии соединяют расчетные значения, которые получены по уравнению 2 с параметрами таблицы 2. 1 -аминогруппы, 2 - карбоксильные группы; 3 -фенольные группы.

Полученные параметры, описывающие процесс кислотно-основного равновесия в клеточных стенках лишайника, позволяют определить количество функциональных групп в стенках, способных к ионному обмену в данных условиях (рис. 4). Результаты показывают, что в физиологической области рН ионизированы только карбоксильные группы с рК, ~ 7, принадлежащие лишайниковым веществам. Так как качественный и количественный состав лишайниковых веществ различен у разных видов лишайников, то различие в константах диссоциации карбоксильных групп лишайниковых кислот может быть одним из факторов, определяющих их способность к поглощению веществ, в том числе токсичных, а значит и видовую чувствительность к загрязнениям.

4.2 Набухание клеточных стенок.

Известно, что растительная клеточная стенка представляет собой природный слабосшитый ионообменник. Одним из важных физико-химических показателей, которые количественно характеризуют свойства полимеров клеточных стенок, как ионообменника, является набухание. Количественной характеристикой этого процесса служит весовой коэффициент набухания, равный количеству воды в полимере, отнесенной к грамму сухой массы вещества Причиной набухания ионообменных материалов в водном растворе является наличие гидрофильных групп, причиной нерастворимости - существование поперечных связей. Степень набухания ионообменного материала зависит от свойств ионита и состава внешнего раствора. Известно, что способность к набуханию возрастает с

уменьшением степени поперечной связанности, с увеличением общего количества ионогенных групп, с увеличением степени их диссоциации, с уменьшением концентрации раствора и зависит от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент (Гельферих, 1962).

Таблица 5. Оводненность слоевищ коэффициент набухания клеточных стенок в воде

(/Г^ ), средний коэффициент набухания клеточных стенок в 10 мМ №0 в

диапазоне рН 2-12 и относительная сухая масса клеточных стенок у С. rangifeгma. Q и

К« > К2а выражены в г НгО на г сухой массы слоевищ и клеточных стенок соответственно. G выражена в % от сухой массы слоевища.

части подециев (2 в воде Г/-С№ Л„ 0

живые 1,22 ±0,04 1,98±0,19 1,95±0,13 78±5

молодые _ 2,83±0,53 2,25±0,14 _

старые _ 1,69±0,19 1,66±0,06 _

Результаты настоящего исследования показывают, что клетки С. гangifeгina имеют достаточно развитую клеточную стенку, так как доля массы клеточных стенок от общей сухой массы слоевища составляет 78 %. Величина коэффициента набухания варьирует от 1,7 до 2,8 г Н2О/Г сухой массы клеточных стенок. Этот параметр значительно выше в молодых частях подециев по сравнению со старыми (табл. 5), что, вероятно, обусловлено большим содержанием у первых карбоксильных групп (табл. 3, 4). Основываясь на знаниях о физико-химических закономерностях набухания синтетических ионообменных материалов можно полагать, что главный фактор, который определяет способность к набуханию - это степень сшивки полимерных цепей, расположенных в структуре клеточных стенок. Нельзя оценить этот параметр экспериментальным путем, однако есть возможность оценить величину степени сшивки непрямым методом (Гельферих, 1962).

Рисунок 5. Зависимость коэффициента набухания слоевищ (С!) лишайника и клеточных стенок (К ) от рН внешнего раствора. С! и К'* выражены в г Н2О на г сухой массы слоевища и клеточных стенок соответственно. 1, 2, 3 -клеточные стенки, изолированные из молодых, живых и старых частей подециев соответственно. 4 - слоевища.

В соответствии с данными о набухании клеточных стенок высших растений (Meychik and Yermakov, 2001, 2003) и результатами настоящей работы можно полагать, что у С. rangiferina степень сшивки полимерных цепей в клеточных стенках значительно выше по сравнению с высшими растениями. Этот вывод следует из сравнительного анализа значений коэффициента набухания в воде, который свидетельствует, что у лишайника этот параметр в 2 - 10 раз меньше, чем у высших растений. У С. rangiferina коэффициент набухания клеточных стенок в воде приблизительно равен таковому в растворах (табл.5) и не зависит от рН (рис. 5), что также подтверждает вывод о высокой степени сшивки полимеров в структуре клеточных стенок лишайника. Полученные результаты показывают, что в отличие от стенок высших растений у С. rangiferina объем клеточных стенок варьирует в небольших пределах и мало зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в апопласте.

Глава 5. Диффузия ионов в клеточных стенках С. rangiferina.

Одной из важных характеристик клеточной стенки как катионообменника является коэффициент диффузии ионов в матриксе. В настоящей работе поставлена цель количественной оценки диффузии ионов в клеточных стенках лишайника и ее возможного вклада в адсорбционную способность слоевищ. В качестве химического реагента для слежения за процессом диффузии использовали краситель метиленовый синий, образующий в водном растворе окрашенный катион.

Рисунок 6. Зависимость величины поглощения катиона метиленово-го синего (МТ) от времени клеточными стенками, выделенными из слоевищ лишайника. Мсж выражена в мкмоль красителя на 1 г сухой массы слоевищ, из которых изолировали клеточные стенки. Соотношение объема раствора и массы образца составляет 2667 мл/г.

50 100 150 200 250 300 время, мин

Кинетические кривые поглощения метиленового синего клеточными стенками имеют вид экспоненциальной зависимости (рис. 6). Можно полагать, что поглощение метиленового синего происходит в результате реакции обмена между катионом

метиленового синего и протонами катионообменных групп клеточных стенок. В пользу этого положения свидетельствуют полученные результаты о зависимости величины адсорбции органического катиона от рН исходного раствора (рис. 7). С уменьшением или увеличением рН соответственно изменяется и количество метиленового синего в стенках. Такой характер изменений сорбционной способности от рН указывает на то, что связывание красителя со стенками носит ионообменный характер и, следовательно, величина ее поглощения связана с количеством ионогенных групп в матриксе клеточных стенок.

Рисунок 7. Влияние рН на величину поглощения катиона метиленового синего клеточными стенками лищайника за

3 ч контакта образцов с раствором красителя, выражена мкмоль на грамм сухой массы слоевищ, из которых изолировали клеточные стенки. Соотношение объема раствора и массы образца составляет 7500 мл/г.

Учитывая ионообменный характер связывания катиона, экспериментальные кривые

можно анализировать по уравнениям, описывающим кинетику ионного обмена, при этом

используя кинетический принцип лимитирующей стадии. Для оценки лимитирующей

стадии кинетические кривые необходимо представить в виде зависимостей Р=Г(1), где Б -

степень завершенности процесса или степень превращения, равная отношению количества

метиленового синего, поглощенного за время к максимальному количеству,

поглощаемому при заданных условиях. Рассмотрение кинетических кривых в

полулогарифмических координатах позволяет установить самую медленную

стадию процесса. Анализ экспериментальных кинетических кривых в указанных

координатах показал, что исследуемый процесс протекает в смешано диффузионной

области. В этом случае коэффициент диффузии может быть рассчитан по конечному

участку кинетической кривой в соответствии с уравнением для расчета диффузии в

круговой цилиндр бесконечной длины с радиусом Я, каким в первом приближении можно

считать гифу микобионта в слоевище лишайника. Расчеты показали, что коэффициент

-9 2

диффузии органического катиона в клеточных стенках слоевища составляет

У С. гап^еппа величина коэффициента диффузии метиленового синего в полимерном

матриксе стенок более чем на порядок ниже, чем у некоторых высших растений (табл. 6).

Так как коэффициент диффузии зависит от степени сшивки ионообменного материала

(чем больше сшивка структуры, тем меньше скорость движения органического катиона в

Таблица 6. Набухание и коэффициенты диффузии метиленового синего в клеточных стенках лишайника и корнях некоторых видов высших растений. Коэффициенты диффузии в клеточных стенках (Э) и набухания клеточных стенок (К ) выражены в см2/с и г Н20/г сухой массы клеточных стенок соответственно, *-данные Мейчик и др., 2003.

ШО8 К™

Лишайник 0,5 2,0±0,2

Огурец* 3,1 7,3±0,7

Пшеница* 1,3 6,4±0,2

Кукуруза* 8,4 14±1

полимере), полученные данные также свидетельствуют о более высокой степени сшивки полимеров в матриксе клеточных стенок лишайников по сравнению с высшими растениями. Такая сравнительно низкая скорость движения ионов в матриксе клеточных стенок, возможно, соответствует скорости поступления веществ в клетку и относительно низкому уровню метаболизма лишайников.

Коэффициент набухания клеточных стенок в воде и коэффициент диффузии характеризуют одно и то же свойство матрикса - степень сшивки его полимерной структуры. Сравнительный анализ данных о коэффициентах набухания и коэффициентах диффузии в клеточных стенках лишайника и некоторых высших растений (Мейчик и др., 2003) показал (табл. 6), что между этими параметрами существует статистически значимая взаимосвязь. Это еще раз подтверждает правильный выбор модели для определения коэффициентов диффузии, так как указанные характеристики полимерного матрикса получены в независимых экспериментах.

Таким образом, нами доказан ионообменный механизм взаимодействия метиленового синего с карбоксильными группами клеточных стенок лишайника и показано, что скорость процесса лимитируется диффузией органического катиона в полимерном матриксе экстраклеточного пространства. Доказательством последнего положения служат (1) анализ кинетических кривых в полулогарифмических координатах, (2) прямо

пропорциональная зависимость между коэффициентом диффузии катиона и коэффициентом набухания клеточных стенок в воде, (3) адекватность описания процесса поглощения метиленового синего клеточными стенками уравнением внутренней диффузии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свойства экстраклеточного матрикса лишайников имеют большое значение для жизнедеятельности этих организмов. Физико-химические свойства клеточных стенок влияют на процессы поступления воды и растворенных веществ в слоевище, а также на процессы транспорта веществ между симбионтами. Способность микобионта лишайников к накоплению токсичных веществ и чувствительность к загрязнениям также во многом определяются свойствами клеточных стенок.

Известно, что в лишайниковом симбиозе микобионт существенно преобладает по массе над фикобионтом. Основную роль в накоплении веществ, поступающих из внешней среды, и в регуляции их транспорта внутри слоевища играет грибной компонент лишайников. Микобионтами большинства лишайников, в том числе и С. гащрГеппа, являются аскомицеты. По качественному составу клеточные стенки грибов в лишайниковом симбиозе существенно не отличаются от клеточных стенок свободноживущих аскомицетов. Их полимерный матрикс также состоит из азотсодержащих полимеров и глюканов. Отличие состоит в количественном соотношении этих компонентов. Согласно данным элементного анализа в полимерной структуре клеточных стенок, изолированных из лишайника С. гап^Геппа, доля хитина составляет менее 6%, и, следовательно, азотсодержащие полимеры не являются основными структурными элементами внеклеточного матрикса С. гап^еппа. Известно, что хитин и хитозан обладают высокой способностью к комплексообразованию. Более низкое содержание этих полимеров в клеточных стенках микобионта лишайника свидетельствует, по-видимому, о меньшем вкладе механизма комплексообразования в процессы поглощения ионов у С. га^1Геппа по сравнению со свободноживущими аскомицетами.

Известно, что сорбционная способность хитина клеточных стенок грибов в отношении некоторых ионов возрастает при увеличении степени его деацетилирования (БеоШоуа, 2000). Степень деацетилирования хитина в составе клеточных стенок лишайников значительно превышает таковую для азотсодержащих полимеров клеточных стенок

свободноживущих грибов. Возможно, в определенных условиях, этот показатель может оказывать влияние на поглощение ионов матриксом клеточных стенок.

Нами установлено, что в трехмерной структуре клеточных стенок С. га^1Геппа содержится три типа ионогенных групп, которые определяют ионообменные свойства оболочек. Это аминогруппы с рКа—3, карбоксильные группы с рКа~7 и фенольные группы с рКа—10. Показано, что количество анионообменных групп в 5 и более раз меньше, чем катионообменных. Эти данные свидетельствуют о том, что, также как у высших растений, клеточные стенки С. гап?1Гегта обладают главным образом катионообменными свойствами и, следовательно, являются природным катионообменником. При физиологических значениях рН в ионном обмене участвуют только карбоксильные группы с принадлежащие, по-видимому, лишайниковым веществам. Другой тип

катионообменных групп (фенольные группы) также входит в состав вторичных метаболитов лишайников. Эти группы, также как и аминогруппы, не могут принимать участие в обмене ионов при физиологических значениях рН (5-8), так как их константа диссоциации лежит за пределами этой области. Возможные вариации в катионообменных свойствах разных видов лишайников в какой-то мере могут определять их видовую чувствительность к загрязнению среды. Учитывая, что для данного лишайника ионообменный механизм является преобладающим в поглощении катионов, состав катионообменных групп, по-видимому, существенно влияет на поступление веществ в клетки.

Разработанный подход к количественной оценке ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок С. гап^еппа может быть применен к определению аналогичных свойств других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. Несмотря на то, что ранее проводили исследования сорбционной способности грибного мицелия, сравнение их результатов с полученными нами показателями не представляется возможным из-за несоответствия используемых методик. Количественные показатели, характеризующие сорбционные свойства клеточных стенок различных видов лишайников, могут быть использованы при их выборе и характеристике в качестве объектов экологического мониторинга.

клеточных стенок и являются количественной характеристикой проницаемости полимерного матрикса. Коэффициент набухания в воде клеточных стенок, изолированных из подециев лишайника, составил 1,98 г Н2О на г сухой массы стенок. Сравнительный анализ коэффициентов набухания у С. гап^Иеппа и некоторых высших растений показывает, что клеточные стенки лишайника характеризуются более высокой степенью сшивки полимеров в матриксе клеточных стенок. Этот вывод также подтверждается данными о малых различиях в коэффициентах набухания стенок С. гап^Иеппа в воде и растворах. На основании этих результатов можно заключить, что, в отличие от клеточных стенок высших растений, у лишайника объем экстраклеточного пространства является относительно постоянным и мало зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в апопласте.

В работе показано, что связывание органического катиона метиленового синего полимерами клеточных стенок С. гап^Иеппа происходит преимущественно по ионообменному механизму, что подтверждается наличием зависимости поглощения этого катиона от рН. Коэффициент диффузии органического катиона в матриксе клеточных стенок С. га^Иеппа, равный 7' 10 см2/сек, на порядок меньше по сравнению с аналогичным показателем для клеточных стенок, изолированных из корней высших растений. Эти результаты свидетельствуют, что стенка лишайника значительно менее проницаема для ионов, что также обусловлено большей степенью сшивки полимеров в клеточной оболочке С. га^Иеппа.

ВЫВОДЫ

1. Ионообменные свойства полимерного матрикса экстраклеточного пространства кустистого лишайника С. га^Иеппа определяются наличием в составе клеточных стенок трех типов функциональных групп, которые способны принимать участие в обменных реакциях с ионами окружающей среды при соответствующих условиях. Впервые показано, что катионообменные свойства клеточной стенки определяются присутствием в ней карбоксильных и фенольных групп а анионообменные -аминогруппами

2. У лишайника С. га^Иеппа ионообменная способность экстраклеточного матрикса зависит от возраста подециев, рН и ионного состава окружающей среды.

3. В полимерной структуре клеточных стенок кустистого лишайника С. гап^Иеппа присутствуют азотсодержащие полимеры хитина, однако их содержание менее 6%. В

молодых частях подециев хитина в два раза больше чем старых, а степень ацетилирования этого полимера составляет около 65%.

4. У лишайника С. rangiferina доля клеточных стенок от сухой массы (-75%) и степень сшивки их полимерных цепей выше, чем у цветковых растений, о чем свидетельствуют значения коэффициентов набухания клеточных оболочек и коэффициента диффузии органического катиона в их полимерном матриксе.

5. Объем полимерного матрикса клеточных стенок лишайника С. rangiferina является относительно постоянной величиной и мало зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в апопласте.

7. Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированных аскомицетов определяют сорбционную способность внеклеточного матрикса и оказывают существенное влияние на поступление веществ в клетки.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Толпышева Т. Ю., Любимова Е. Г. Эпиксильные лишайники Русской равнины // Изучение и охрана биологического разнообразия природных ландшавтов Русской равнины: Сборник материалов Международной научной конференции. 18-19 мая 1999. Пенза, 1999. С. 335.

2. Толпышева Т. Ю., Любимова Е. Г., Горшина Е. С, Сизова Т. П. Лихенофлора памятников деревянного зодчества. 3. Церковь Преображения в Кижах // Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология 2001. № 1. С. 24-33.

3. Любимова Е. Г., Толпышева Т. Ю., Александрова А. В. Влияние эпиксильного лишайника Vulpicida pinastri (Scop.) J.-E. Mattson et M. E. Lai на грибы рода Penicillium // Современная микология в России: Сборник материалов I съезда микологов. Изд. «Национальная академия микологии. М. 2002. С. 194.

4. Любимова Е.Г., Мейчик Н.Р. Ионообменные свойства клеточной стенки кустистого лишайника Cladina rangiferina (L.) Nyl. IN съезд общества физиологии растений России, 15-21 сентября 2003 г. Пенза, 2003. Тезисы докладов. С. 140.

5. Ермаков И. П., Любимова Е.Г., Мейчик Н.Р. Физико-химические свойства полимерного матрикса клеточных стенок кустистого лишайника С1аёша гап^Геппа и их роль в обеспечении поглощения им катионов//Актуальные проблемы экологии: Сборник материалов Ш-Международной научно-практической конференции. Караганда, 2-3 декабря 2004 г. Караганда 2004.

6. Мейчик Н. Р., Любимова Е. Г., Ермаков И. П. Диффузия органического катиона метиленового синего в полимерном матриксе клеточных стенок кустистого лишайника С1аёоша га^1Геппа (Ь.) Б. Н. // Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология. 2005. (в печати).

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 117234, Москва, Ленинские горы Заказ № 69 Тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Любимова, Елизавета Григорьевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Строение клеточной стенки микобионта

1.2 Роль клеточной стенки в поддержании водного режима лишайников

1.3 Использование лишайников в экологическом мониторинге

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Характеристика объекта исследований

2.2 Подготовка материала

2.3 Определение качественного и количественного состава ионообменных групп клеточных стенок

2.3.1. Метод потенциометрического титрования

2.3.2. Определение содержания аминогрупп в клеточных стенках лишайника методом неводного титрования хлорной кислотой

2.4 Определение содержания воды в интактных слоевищах лишайника и весового коэффициента набухания клеточных стенок лишайника в воде и растворах

2.5 Элементный анализ образцов

2.5.1. Определение восстановленного азота

2.5.2. Определение восстановленного азота по методу Любошинского-Зальта

2.6 Поглощение метиленового синего интактными слоевищами лишайника и выделенными из слоевищ клеточными стенками.

2.6.1. Определение зависимости поглощения от времени

2.6.2. Определение максимального поглощения метиленового синего клеточными стенками лишайников и интактными слоевищами

2.6.3. Определение зависимости поглощения метиленового синего интактными слоевищами С. rangiferina и изолированными из них клеточными стенками от рН

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Элементный состав клеточных стенок, изолированных из слоевищ лишайника С. rangiferina

Глава 4. Исследование ионообменных свойств клеточных стенок, изолированных из слоевищ лишайника С. rangiferina

4.1 Процессы кислотно-основного равновесия в клеточных стенках С rangiferina

4.2. Исследование набухания клеточных стенок, изолированных из лишайника С. rangiferina

Глава 5. Изучение диффузии органического катиона в полимерном матриксе клеточных стенок С. rangiferina

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированного аскомицета Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg."

Состав и свойства клеточных стенок различных организмов оказывают значительное влияние на протекание многих физиологических процессов и непосредственно воздействуют на поступление растворенных веществ в клетки. В таком организме, как лишайники клеточная стенка приобретает особое значение, так как они не имеют специализированных структур для транспорта воды и ионов, подобных сосудам ксилемы и флоэмы у высших растений. В слоевище транспорт воды и растворенных веществ, который обеспечивает поддержание равновесия между симбионтами, происходит преимущественно по апопласту, и определяется его свойствами. На примере растений и свободноживущих грибов установлено, что внеклеточный транспорт ионов зависит от ионообменных свойств клеточных стенок, а именно от количественного и качественного состава функциональных групп, способных принимать участие в ионном обмене.

Лишайники образуют особую жизненную форму (слоевища), представляющую собой переплетение грибных гиф, в котором располагаются группы водорослевых клеток, формирующие отдельный слой в структуре таллома. Такая жизненная форма характеризуется низкой скоростью роста по сравнению с свободноживущими грибами. Это обусловлено многими факторами, в том числе тем, что лихенизированные аскомицеты обитают на бедных питательными веществами субстратах, а фотосинтез в водорослевых клетках протекает в течение сравнительно небольших периодов активности.

Указанные выше особенности (способность к накоплению токсичных веществ в слоевищах, низкая скорость роста), а также имеющиеся у лишайников межвидовые различия в чувствительности к антропогенным загрязнениям, делают их удобными объектами для экологического мониторинга. Существует несколько факторов, определяющих чувствительность разных видов лишайников к загрязнениям. Поступающие в слоевища токсичные ионы могут инактивироваться или накапливаться в клеточных стенках и в клетках. Тем не менее, разная видовая чувствительность к токсичным веществам во многом определяется количеством токсичных ионов, проникающих в клетку, и, следовательно, также зависит от ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в количественной оценке ионообменных свойств клеточных стенок лишайников и в определении вклада ионного обмена в процессы поглощения веществ слоевищем на примере кустистого лишайника Cladonia rangiferina (L.) F. H. Wigg.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить элементный состав слоевищ лишайника С. rangiferina и изолированных из них клеточных стенок.

2. Изучить качественный и количественный состав функциональных групп клеточных стенок лишайника.

3. Охарактеризовать физико-химические свойства полимерного матрикса клеточных стенок: определить константы диссоциации функциональных групп, расположенных в полимерной структуре клеточных стенок и способных вступать в ионообменные реакции с ионами внешней среды установить относительную сухую массу клеточных стенок и определить коэффициенты набухания их полимерного матрикса определить коэффициенты диффузии и оценить степень сшивки линейных цепей в полимерном матриксе клеточных стенок.

Научная новизна. Впервые установлено, что в составе клеточных стенок лишайника Cladonia rangiferina (L.) F. H. Wigg. содержится три типа функциональных групп, из них две являются катионообменными (карбоксильные и фенольные группы), и одна - анионообменной (аминогруппы). Впервые определены физико-химические параметры, характеризующие количественный и качественный состав ионогенных групп клеточных стенок лишайника, а также интервалы рН, в которых эти группы ионизированы и способны вступать в ионообменные реакции с катионами и анионами внешней среды. Показано, что у лишайника С. rangiferina в составе полимерного матрикса клеточных стенок, представляющих собой преимущественно клеточные стенки микобионта, суммарное содержание хитина и хитозана составляет менее 6%.

Определены параметры, количественно характеризующие способность к набуханию и диффузионные свойства клеточных стенок С. rangiferina. На основании значений коэффициентов набухания и коэффициентов диффузии органического катиона в матриксе клеточных стенок, можно заключить, что степень сшивки полимеров, составляющих каркас клеточных стенок лишайника, значительно превышает этот показатель у растений. Впервые показано, что объем клеточных стенок С. rangiferina является относительно постоянной величиной и мало зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в апопласте, что также связано со структурой их полимерного матрикса.

Практическое значение. Разработан новый подход к количественной оценке ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок С. rangiferina, который может быть применен к определению аналогичных свойств других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. В дальнейшем количественные показатели, характеризующие физико-химические свойства клеточных стенок различных видов лишайников, могут быть использованы при их выборе и характеристике в качестве объектов экологического мониторинга.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедр физиологии растений и микологии и альгологии биологического факультета МГУ, Международной научной конференции «Изучение и охрана биологического разнообразия природных ландшафтов Русской равнины» Пенза, 1999, V съезде общества физиологии растений России, Пенза, 2003, Ill-Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии», Караганда 2004.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 стр. машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, списка цитированной литературы, включающего 92 наименования (из них 55 на иностранных языках), приложения. Работа содержит 8 таблиц и иллюстрирована 17 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Любимова, Елизавета Григорьевна

выводы

1. Ионообменные свойства полимерного матрикса экстраклеточного пространства кустистого лишайника С. rangiferina определяются наличием в составе клеточных стенок трех типов функциональных групп, которые способны принимать участие в обменных реакциях с ионами окружающей среды при соответствующих условиях. Впервые показано, что катионообменные свойства клеточной стенки определяются присутствием в ней карбоксильных (рКа~7) и фенольных групп (рКа~10), а анионообменные - аминогруппами (рКа~3).

2. У лишайника С. rangiferina ионообменная способность экстраклеточного матрикса зависит от возраста подециев, рН и ионного состава окружающей среды.

3. В полимерной структуре клеточных стенок кустистого лишайника С. rangiferina присутствуют азотсодержащие полимеры хитина, однако их содержание менее 6%. В молодых частях подециев хитина в два раза больше чем старых, а степень ацетилирования этого полимера составляет около 65%.

4. У лишайника С. rangiferina доля клеточных стенок от сухой массы (~75%) и степень сшивки их полимерных цепей выше, чем у цветковых растений, о чем свидетельствуют значения коэффициентов набухания клеточных оболочек и коэффициента диффузии органического катиона в их полимерном матриксе.

6. Поглощение органического катиона метиленового синего клеточными стенками лишайника происходит главным образом за счет ионообменного механизма связывания, в котором принимают участие карбоксильные группы с рКа~7. Скорость процесса лимитируется диффузией органического катиона в полимерном матриксе клеточных стенок, а коэффициент диффузии может быть рассчитан с использованием внутридиффузионной модели. Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированных аскомицетов определяют сорбционную способность внеклеточного матрикса и оказывают существенное влияние на поступление веществ в клетки.

Я сердечно благодарю Игоря Павловича Ермакова и Наталью Робертовну Мейчик, под руководством которых выполнялась эта работа.

Также благодарю всех сотрудников кафедры физиологии растений, оказывавших помощь в моей работе.

Выражаю также глубокую признательность Татьяне Юрьевне Толпышевой и Ирине Ивановне Сидоровой, под руководством которых я работала на кафедре микологии, и которым обязана моими знаниями в области лихенологии.

Благодарю всех сотрудников кафедры микологии и альгологии, оказавших мне неоценимую помощь и поддержку во время выполнения работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свойства клеточных стенок лишайников имеют большое значение для жизнедеятельности этих организмов. Физико-химические свойства стенок влияют на процессы поступления воды и растворенных веществ в слоевище, а также на процессы транспорта веществ между симбионтами. Способность микобионта лишайников к накоплению значительных количеств загрязняющих веществ, а также чувствительность лишайников к загрязнениям также во многом определяются свойствами клеточных стенок. Указанные свойства лишайников имеют прикладное значение, так как позволяют использовать эти организмы в качестве индикаторов загрязнения окружающей среды.

Известно, что в лишайниковом симбиозе микобионт существенно преобладает по массе над фикобионтом. Основную роль в накоплении веществ, поступающих из внешней среды, и в регуляции их транспорта внутри слоевища играет грибной компонент лишайников. Микобионтами большинства лишайников, в том числе и С. rangiferina, являются аскомицеты. По качественному составу клеточные стенки грибов в лишайниковом симбиозе существенно не отличаются от клеточных стенок свободноживущих аскомицетов. Их полимерный матрикс также состоит из азотсодержащих полимеров и глюканов. Отличие состоит в количественном соотношении этих компонентов. Согласно данным элементного анализа в полимерной структуре клеточных стенок, изолированных из лишайника С. rangiferina, доля хитина составляет менее 6%, и, следовательно, азотсодержащие полимеры не являются основными структурными элементами внеклеточного матрикса С. rangiferina. Известно, что хитин и хитозан обладают высокой способностью к комплексообразованию. Более низкое содержание этих полимеров в клеточных стенках микобионта лишайника свидетельствует, по-видимому, о меньшем вкладе механизма комплексообразования в процессы поглощения ионов у С. rangiferina по сравнению со свободноживущими аскомицетами.

Известно, что сорбционная способность хитина клеточных стенок грибов в отношении некоторых ионов возрастает при увеличении степени его деацетилирования (Feofilova, 2000). Степень деацетилирования хитина в составе клеточных стенок лишайников значительно превышает таковую для азотсодержащих полимеров клеточных стенок свободноживущих грибов. Возможно, в определенных условиях, этот показатель может оказывать влияние на поглощение ионов матриксом клеточных стенок.

Нами установлено, что в трехмерной структуре клеточных стенок С. rangiferina содержится три типа ионогенных групп, которые определяют ионообменные свойства оболочек. Это аминогруппы с рКа~3, карбоксильные группы с рКа~7 и фенольные группы с рКа~10. Показано, что количество анионообменных групп в 5 и более раз меньше, чем катионообменных. Эти данные свидетельствуют о том, что, также как у высших растений, клеточные стенки С. rangiferina обладают главным образом катионообменными свойствами и, следовательно, являются природным катионообменником. При физиологических значениях рН в ионном обмене участвуют только карбоксильные группы с рКа ~7, принадлежащие, по-видимому, лишайниковым веществам. Другой тип катионообменных групп (фенольные группы) также входит в состав вторичных метаболитов лишайников. Эти группы, также как и аминогруппы, не могут принимать участие в обмене ионов при физиологических значениях рН (5-8), так как их константа диссоциации лежит за пределами этой области. Возможные вариации в катионообменных свойствах разных видов лишайников в какой-то мере могут определять их видовую чувствительность к загрязнению среды. Учитывая, что для данного лишайника ионообменный механизм является преобладающим в поглощении катионов, состав катионообменных групп, по-видимому, существенно влияет на поступление веществ в клетки.

Разработанный подход к количественной оценке ионообменных свойств полимерного матрикса клеточных стенок С. rangiferina может быть применен к определению аналогичных свойств других видов лихенизированных и свободноживущих грибов. Несмотря на то, что ранее проводили исследования сорбционной способности грибного мицелия, сравнение их результатов с полученными нами показателями не представляется возможным из-за несоответствия используемых методик. Количественные показатели, характеризующие сорбционные свойства клеточных стенок различных видов лишайников, могут быть использованы при их выборе и характеристике в качестве объектов экологического мониторинга.

Важными показателями, характеризующими физико-химические свойства клеточных стенок как катионообменника, являются коэффициент набухания и коэффициент диффузии. Эти параметры характеризуют степень сшивки между цепями полимеров клеточных стенок и являются количественной характеристикой проницаемости полимерного матрикса. Коэффициент набухания в воде клеточных стенок, изолированных из подециев лишайника, составил 1,98 г H20 на г сухой массы стенок. Сравнительный анализ коэффициентов набухания у С. rangiferina и некоторых высших растений показывает, что клеточные стенки лишайника характеризуются более высокой степенью сшивки полимеров в матриксе клеточных стенок. Этот вывод также подтверждается данными о малых различиях в коэффициентах набухания стенок С. rangiferina в воде и растворах. На основании этих результатов можно заключить, что, в отличие от клеточных стенок высших растений, у лишайника объем экстраклеточного пространства является относительно постоянным и мало зависит от ионных условий и рН в окружающей среде и в апопласте.

В работе показано, что связывание органического катиона метиленового синего полимерами клеточных стенок С. rangiferina происходит преимущественно по ионообменному механизму, что подтверждается наличием зависимости поглощения этого катиона от рН. Коэффициент диффузии органического катиона в матриксе клеточных стенок

-у 2

С. rangiferina, равный 7-10 см/сек, на порядок меньше по сравнению с аналогичным показателем для клеточных стенок, изолированных из корней высших растений. Эти результаты свидетельствуют, что стенка лишайника значительно менее проницаема для ионов, что также обусловлено большей степенью сшивки полимеров в клеточной оболочке С. rangiferina.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Любимова, Елизавета Григорьевна, Москва

1. Ahti Т. Cladoniaceae. // In Flora Neotropica Monograph 78. NY bot. garden. 2000. 362 p.

2. Aloni R., Enstone D. E., Peterson C. A. Indirect evidence for bulk water flow in root cortical cell walls of three dicotyledonous species // Planta. 1998. V. 207. P. 1-7.

3. Bargagli R., Sanchez-Hernandes J. C., Monaci F. Baseline concentrations of elements in the arctic macrolichens// Chemoshere. 1999. V. 38. N 3. P. 475-487.

4. Beckett R. P. Some aspects of water relations of lichens from habitats of contrasting water status studied using thermocouple psychrometry// Annals of Botany. 1995. V. 76. P. 211-217.

5. Beckett R. P. Pressure-volume analysis of a range of poikilohydric plants implies the existence of negative turgor in vegetative cells// Annals of Botany. 1997. V. 79. P. 145-152.

6. Brown D. H., Slingsby D. R. The cellular location of lead and potassium in the lichen Cladonia rangiformis (L.) Hoffm//New Phytologist. 1972. V. 71. P. 297-305.

7. Brown D. H., Beckett R. P. The role of the cell wall in the intracellular uptake of cations by lichens// In Lichen Physiology and cell biology. Ed. D. H. Brown. New York Plenum Press. 1985. P. 247-258.

8. Buck G. W., Brown D. H. The effect of dessication on cation location in lichens// Annals of Botany. 1979. V. 44. P. 265-277.

9. Carbonero E. R., Sassaki G. L., Gorin P. A. J., Iacomini M. A (l-6)-linked (3-mannopyrananan, pseudonigeran and a (l-4)-linked P-xylan, isolated from the lichenised basidiomycete Dictyonema glabratum// FEMS Microbiology Letters 2002. V. 206 P. 175-178.

10. Chang K. L. В., Tsai G., Lee J., Fu W.-R. Heterogeneous N-deacetylation of chitin in alkaline solution// Carbohydrate Research. 1997. V. 303. P. 327-332.

11. Chettri M. К., Sawidis Т., Zachariadis G. A., Stratis J. A. Uptake of heavy metals by living and dead Cladonia thalli// Environmental and Experimental Botany. 1997. V. 37. P. 39-52.

12. Fahselt D. Carbon metabolism in lichens// Symbiosis. 1994. V. 17 P. 127-182.

13. Farrar J. F. The uptake mechanism of phosphate by the lichen Hypogymnia physodes// New Phytologist. 1976. V. 77 P. 127-134.

14. Feofilova, E. P., Mar'in A. P., Tereshina V. M., Nemsev D. M., Kozlov V. P. Role of components of cell walls in metal uptake by Aspergillus niger// Resource and Environmental Biotechnology. 2000. V. 3. P. 61-69.

15. Freundling C., Starrach N., Flach D., Gradmann D., Mayer W.E. Cell walls as reservoirs of potassium ions for reversible volume changes of pulvinar motor cells during rhythmic leaf movements // Planta. 1988. V. 175. P. 193-203.

16. Fukamizo Т., Ohkawa Т., Sonoda K., Toyoda H., Nishiguchi Т., Ouchi S., Goto S. Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum// Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1992. V. 56. N 10. P. 1632-1636.

17. Galun M., Keller P., Malki D. Removal of Uranium (VI) by Fungal Biomass and Fungal Wall-Related Biopolymers// Science. 1982. V. 219. P. 285-286.

18. Gregor H. P., Luttinger L. D., Loeble E. M. Titration Polyacrylic Acid with Quaternary Ammonium Basses// Journal of Americain Chemical Society. 1954. V.76. P. 5879-5880.

19. Grignon C., Sentenac H. pH and ionic conditions in the apoplast//Annual Revew of Plant Physiology 1991. V.42.P. 103-128.

20. Haynes R.J. Ion exchange properties of roots and ionic interactions within the root apoplasm. Their role in ion accumulation by plants// Botanical Review. 1980. V46. P.75-99.

21. Honegger R., Peter M., Scherrer S. 1996. Drought-induced structural alterations at the mycobiont-photobiont interface in a range of foliose macrolichens// Protoplasma. V. 190. P. 221-232.

22. Honneger R. 1993. Tansley Review № 60. Developmental biology of lichens// New Phytologist. V. 125. P. 659-677.

23. Lange O. L., T. G. A. Green, U. Heber. Hydratation-dependent photosynthetic production of lichens, what do laboratory studies tell us about field performance. // Journal of Experimental Botany. 2001. V. 52. N 36. P. 2033-2042.

24. Larson D. W. Lichen water relations under drying conditions// New Phytologist. 1979. V. 82. P. 713-731.

25. Mar'in A. P., Conti C., Gobbi G. Sorprtion of lead and caesium by mushrooms grown in natural conditions// Resource and Environmental Biotechnology. 1998. N. 2. P. 35-50.

26. Marshner Y. Mineral nutrition of higher plants. 2nd Ed. London etc. Academic Press. 1995. 889 p.

27. Meychik N. P., Yermakov I. P. A new approach to the investigation on the tonogenic groups of root cell walls// Plant and Soil. 1999. V. 217. P. 257-264.

28. Meychik N. R., Yermakov I. P. Ion exchange properties of plant root cell walls // Plant and Soil. 2001. T. 234. C. 181-193.

29. Molano J., Polachek I., Duran A., Cabib E. An endochitinase from wheat germ // Journal of Biological Chemistry. 1979. V. 254. P. 4901-4907.

30. Morvan C., Demarty M., Thellier M. Titration of Isolated Cell Walls of Lemna minor // Plant Phisiology. 1979. V.63. P.l 117-22.

31. Muzzarelli R. A. A., Tanfani F., Scarpini G. Chelating, film-forming and Coagulating abiliti of the the chitosan-glucan complex from Aspergillus niger industrial wastes//Biotechnology and Bioengeneering. 1980. V.22. P. 885-896.

32. Nieboer E., Puckett K. J., Grace B. The uptake of nickel by Umbilicaria muhlenbergii a physicochemical process// Canadian Journal of Botany. 1976. V. 54. P. 724-733.

33. Nieboer, E., Richardson D. H. S., Lavoie P., Padovan D. The role of metal-ion binding in modifying the toxic effects of sulphur dioxide on the lichen Umbilicaria muhlenbergii// New Phytologist. 1978. V. 82. P. 621-632.

34. Palmquist K. 2000. Carbon economy in lichens//New Phytologist. V. 148. P. 1136.

35. Puckett K. J., Nieboer E., Gorzynski M. J., Richardson D. H. S. The uptake of metal ions by lichens a modified ion-exchange process// New Phytologist. 1973. V. 72. P. 329-342.

36. Richardson D. H. S., Nieboer E., Lavoie P., Padovan D. Anion accumulation by lichens I. The characteristics and kinetics of arsenate uptake by Umbilicaria muhlenbergii//New Phytologist. 1984. V. 96. P. 71-82.

37. Richter C., Dainty J. Ion Behaviour in Plant Cell Walls. I. Characterization of the Sphagnum Rissowii Cell Wall Ion Exchanger// Canadian Journal of Botany. 1989. V.67. P.451-459.

38. Rios A., Ascaso C., Wierzchos J. Study of lichens with different state of hydratation by combination of low temperature scanning electron microscopies// International Microbiology. 1999. N 2. P. 251-257.

39. Ritchie and Larkum. Cation exchange properties of the cell walls of Enteromorpha intestinalis (L.) Link (Ulvales, Chlorophyta) // Journal of Experimental Botany. 1982. 33.P125- 139.;

40. Santesson, R., Moberg, R., Tonsberg, Т., Vitikainen, O. 2004. Lichen-forming and lichenicolous fungi of Fennoscandia. Museum of Evolution, Uppsala University. 625 p.

41. Sattelmacher B. The apoplast and its significance for plant mineral nutrition // New Phytologist. 2001. V. 149. P. 167-192.

42. Scheidegger C., Schroeter В., Frey B. Structural and functional processes during water vapour uptake and dessication in selected lichens with green algal photobionts// Planta. 1995. V. 197. P. 399-409.

43. Scherrer S., de Vries О. M. H., Dudler R., Wessels J. G. H., Honneger R. Interfacial self-assembly of fungal hydrofobins of lichen-forming ascomycetes

44. Xanthoria parietina and X. ectaneoides// Fungal Genetics and Biology. 2000. V. 30. P. 81-93.

45. Schlarmann G., Peveling E., Tenberge K. The occurrence of chitin in cell walls of ascomycete mycobionts// Bibliotheca Lichenologica. 1990. V. 38. P. 395-409.

46. Starrach N, Flach D., Mayer W-E. Activity of fixed negative charges of isolated extensor cell walls of the laminar pulvinus of primary leaves of phaseolus. // Journal of Plant Physiology. 1985. V. 120. P. 441-455.

47. Steudle E., Peterson C. A. How does water get through roots? // Journal of Experimental Botany. 1998. V.49. P. 775-788

48. Teixeira A. Z. A., Iacomini M., Gorin P. A. J. Chemotypes of mannose-contaning polysaccharides of lichen mycobionts a possible aid in classification and identification// Carbohydrate Research. 1995. V. 266. P. 309-314.

49. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin// Polymer. 2000. V. 41 P. 2463-2469.

50. Tyler G. Uptake, retention and toxicity of heavy metals in lichens// Water, Air and Soil Pollution. 1989. V. 47. P. 321-333.

51. Valladares F., Sancho L. G., Ascaso C. Water storage in the lichen family Umbilicariaceae// Botanica Acta 1998. V. 111. P. 99-107.

52. Valladares F., Ascaso C. Intratalline variability of some structural and physical parameters in the lichen genus Lasallia// Canadian Journal of Botany. 1994. V. 72. P. 415-428.

53. Wales D. S., Sagar B. F. Recovery of metal ions by microfungal filters// Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 1990. V. 49. P. 345-355.

54. Woranovicz-Barreira S. M., Gorin P. A. J., Sassaki P. L., Marcelli M. P., Iacomini M. Galactomannoglucans of lichenized fungi Cladonia spp. significance as chemotypes// FEMS Microbiology Letters. 1999. V. 181. P. 313-317.

55. Альберт А., Сержент E. Константы ионизации кислот и оснований. JL Химия. 1964.140с.

56. Беккер 3. И. Физиология и биохимия грибов. 1988. М. Изд-во Моск. ун-та. 230 с.

57. Бязров Л. Г. Лишайники в экологическом мониторинге. 2002. Отв. ред. Криволуцкий Д. А. М. Научный мир. 336 с.

58. Вайнштейн Е. А. Лишайниковые вещества вторичного происхождения. 1982. 4.1-3. 717 с.

59. Веселовский В. А., Веселова Г. В. 1990. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. М. Наука. 152 с.

60. Гальбрайх Л. С. 2001. Хитин и хитозан строение, свойства, применение// Соросовский образовательный журнал. Т 7. № 1. С. 51-56.

61. Гельферих Ф. Иониты. 1962. Иностранная литература. Москва.

62. Головина И. Т. 1972. Цит по Костина А. М., Бабицкая В. Г., Лобанок А. Г. Хитин мицелиальных грибов рода Penicillium// Прикладная биохимия и микробиология. 1978. Т. 14. № 4. С. 586-593.

63. Захаров В. М., Кларк Д. М. Биотест. Интегральная аценка здоровья экосистем и отдельных видов. М. 1993. 68 с.

64. Зенова Г. М. Лишайники// Соросовский образовательный журнал. 1999. №8. С.30-34.

65. Инсаров Г. Э. Об учете лишайников эпифитов на стволах деревьев// Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л. Гидрометеоиздат. 1982. Вып. 5. С. 25-33.

66. Инсарова И. Д. Влияние сернистого газа на лишайники// Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л. 1982. Вып. 5. С. 33-48

67. Инсарова И. Д. Влияние тяжелых металлов на лишайники// Прблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л. 1983. Вып. 6. С. 101-113.

68. Кокотов Ю. А., В. А. Пасечник. Равновесие и кинетика ионного обмена. Химия. Ленинград. 1970.336 с.

69. Костина А. М., Бабицкая В. Г., Лобанок А. Г. Хитин мицелиальных грибов рода Penicillium// Прикладная биохимия и микробиология. 1978. Т. 14. № 4. С. 586-593.

70. Красногорская Н. Н. Методы контроля загрязнения окружающей среды на модели растительных объектов// Вестник УГАТУ. 2000. №2 С.85-90.

71. Кузнецова Н.Н. Катионообменная емкость корней и ее роль в питании растений// Вестник ЛГУ. 1972. №3. С.119-127.

72. Лейкин Ю.А., Мейчик Н.Р., Соловьев В.К. Кислотно-основное равновесие полиамфолитов с пиридиновыми и фосфновокислотными группами// Журнал физической химии. 1978. Т. 52. № 7. С. 1420-1424.

73. Либинсон Г. С., Савицкая Е. М. Журнал физической химии. 1963. Т. 37. С. 2706-2712.

74. Либинсон Г.С. Физико-химические свойства карбоксильных катионитов. М. Наука. 1969. 110 с.

75. Люттге У., Хигинботам Н. Передвижение веществ в растении. М. Колос. 1984. 408 с. (Luttge U. and Higinbotham N. 1984. Transport in Plants. Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin. 408 p.)

76. Мейчик H .P., Ермаков И. П. Набухание клеточной стенки корня, как отражение ее функциональных особенностей // Биохимия. 2001 а. Т. 66. Вып. 2. С. 223-233.

77. Мейчик Н. Р., Ермаков И. П. Ионообменные свойства выделенных клеточных оболочек из корней люпина // Биохимия. 2001 b. Т 66. Вып. 5. С. 688697.

78. Мейчик Н. Р., Ермаков И. П., Прокопцева О. С. Диффузия органического катиона в клеточных стенках корня// Биохимия. 2003. Т. 68. № 7. Р. 926-940.

79. Мейчик Н. Р., Ермаков И. П., Савватеева М. В. Ионогенные группы клеточной стенки корней пшеницы// Физиология растений. 1999. Т. 46 № 4. С. 1-6.

80. Мейчик Н. Р., Лейкин Ю. А., Косаева А. Е., Галицкая Н. Б. Исследование кислотно-основного равновесия и сорбционных свойств азот-гидроксилсодержащих ионитов//Журнал физической химии. 1989. Т.63. №2. С. 540-542.

81. Окснер А. Н. Определитель лишайников СССР. Вып. 2. Морфология систематика и географическое распространение. Изд. «Наука». 1974. Л. 284 с.

82. Определитель лишайников СССР. Вып. 5. Изд. "Наука" Л. 1978. 304 с.

83. Плакунова О. В., Плакунова В. Г. Влияние возрастных изменений компонентов лишайников рода Cladina на их взаимодействие и морфофункциональную дифференцировку ткани подециев// Известия Академии наук СССР. Серия биологическая. 1984. №. 3. С. 353-361.

84. Румшиский Л.З. Математическая обработка результатов эксперимента. М. Наука. 1971., 192 с.

85. Сабинин Д.А. Избранные труды по минеральному питанию растений. М. Наука. 1970.512 с.

86. Феофилова Е. П., Марьин А. П., Терешина В. М. Сорбция ионов свинца Aspergillus niger. Влияние предварительной обработки мицелия// Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. № 1. С. 149-155.

87. Феофилова Е. П., В. М. Терешина, А. С. Меморская. Хитин мицелиальных грибов, методы выделения, идентификации и физико-химические свойства// Микробиология. 1995. Т. 64. № 1. С. 27-31.

88. Шапиро И. А. Устойчивость нитратредуктазы у лишайника Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm. к действию двух поллютантов// Актуальные проблемы экспериментальной лихенологии в СССР. Под ред. Н. С. Голубковой. 1991. Вып. 1.С. 89-93.

89. Шапиро И. А. Физиолого-биохимические изменения у лишайников под влиянием атмосферного загрязнения// Успехи современной биологии. 1996. Т. 116. №2. С. 158-171.

90. Шатаева Л. А., Кузнецова Н. Н., Елькин Г. Е. Карбоксильные иониты в биологии. Л. Наука. 1979. 286 с.

Информация о работе

Любимова, Елизавета Григорьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.24

Диссертация

Ионообменные свойства клеточных стенок лихенизированного аскомицета Cladonia rangiferina (L.) F.H. Wigg. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы