Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ион-гидратное окружение и структурные особенности облученной ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ион-гидратное окружение и структурные особенности облученной ДНК"

ХАРК1ВСЬКИЙ НАЦЮНАЛЬНИЙ УН1ВЕРСИТЕТ IMEHI В.Н.КАРА31НА

ХОРУНЖА Ольга Володимнр1вна

УДК 577.32

ЮН-Г1ДРАТНЕ ОТОЧЕННЯ I СТРУКТУРН1 ОСОБЛИВОСТ1 ОПРОМ1НЕНСН ДНК

03.00.02 - бюф1знка

Автореферат дисертаци на здобуггя наукового ступеня кандидата ф i з и ко- м атем ати ч н их наук

Харюв - 2004

Дисерташею е рукопис.

Робота виконана в 1нституп радюф1зики та електрошки ¡м. О.Я.Усикова HAH УкраТни, м. Харкт.

Науковий кср1вник

доктор ф13ико-математичних наук, професор Малеев Володимир Якович, 1нституг радюф1зики та електрошки ¡м. О.Я.Усикова HAH УкраТни, завщувач в1дд1пу бюф1зики.

ОфщШш опоненти:

- доктор ф1зико-математичних наук, старший науковий сшвробгсник CopoKiH BiKTop Олександрович, Ф1зико-техн1чний ¡нститут низьких температур ¡м. Б.1. Верюна HAH УкраТни, провщний науковий ствробггник, (м. Хармв);

- кандидат ф13ико-математичних наук, доцент Пахомов Валерш 1нокентШович, Севастопольский нацюнальний техшчний ушверситет, доцент (м. Севастополь).

Провщна установа

1нститут фпики HAH УкраТни, в1ддш ф1зики бюлопчних систем, м. КиТв.

Захист вщбудеться "21 " травня 2004 року о /3 годиш на засщанш спешагпзованоТ вченоТ ради Д 64.051.13 у Харювському нацюнальному yHieepcHTeri ¡меш В.Н. Каразжа за адресою: 61077, м. XapKie, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

3 дисертащею можна ознайомитись у Центральны науковш б1блютещ Харювського нацюнального ушверситету ¡меш В.Н. Каразша за адресою: 61077, м. Харюв, пл. Свободи, 4.

Автореферат роз1Сланий " 20 " квггня 2004 року

Вчений секретар спещал1зованоТ вченоТ ради

Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуалынсть теми. Вивчення впливу ¡ошзуючоУ paaiauiV па ДНК г надзвичайно нажливою шофвичною задачею. оскиьки радшшйш ушколжснпя ДИК - основного генетичного компонента клггипи - обумовлюють мутагенш. канцерогешп ia iiinii пато.топчш ефекти. Для розу мши я природ» радшшйного ураженпя i нироблення мето;йв лжування i профилактики ушкоджень необхшно з'ясування виповииих j\iin у будов! ДНК. За осташп десятил1тгя численш достижения дозволили усчановити осповш типи радшишного ушкодження молекул ДНК, описати xiM¡4iii продукти модифжацп i структурш змжи нолЬгсру. Однак багато аспект ¡в ршпашйного ураження ДНК все ще мало чи iOBciM не внвчен1.

Вйомо. то багато найважливших властивостей пуклеУнових кислот (НК) (структуроутворення, стабпыпсть, динам|'ка. взаемод1я з лнандами й ¡нш.) ¡стотио визначаються взаемод1ею НК з водно-юнним оточеиням. Саме ступшь пдраташУ i характер розподиу молекул зв'язаноТ води по пдратно-активних центрах обумовлюють кнування тих чи ¡нших конформацш ДНК i саме УУ функшонування. Характер радюшйноТ поразки ДНК також залежить ви параметр!в пдраташУ. Тому актуалышм г детальне дослщжеиня впливу опромшення на характеристики »засмоли ДНК-розчинник. Роботи такого типу дотенер практично не ироводилися.

Зв'ягок роботи з науковнмн програмамн, планами, темами. Робота виконувхтася виповино до держбюджетних тем шддиу бюфпнки Ыституту рад1оф1зики та електрошки HAH УкраУни "Достижения ф1зичних особливостей пдратованих oioiio.niMepin з урахуванням впливу южзуючоТ piuiauiV" (шифр 'Трап". №01.96U006I10, постанова Бюро ВФА HAH УкраУни в'и 19.12.95, протокол №9, 1996-2000 рр.). "Дослщжеиня молекулярних мехашз\н'в дп гамма-опромпиовання на ДНК. фйриноген та мгжк.птижн взасмодн" (шифр "Гамма", виконувалась за проектом Державного фонду фундамент&чьних дослщжень УкраУни №2.4/764, 1997-2000 рр.), "Фшчж мехажзми взасмодн новосинтезованих бюлопчно активних речовин з гиратованою ДНК" (Шифр "Jliraivi", №0100U006336, постанова Вюро ВФА HAH УкраУни ви 24.10.2000. протокол № 9,2001-2003 рр.).

Мета i задач! достижения. Метою роботи було з'ясування впливу южзуючоУ рал1ацн на параметри. то характеризуют!, пзасмодио ДНК з водно-юнним оточеиням. Для досягнення поставлено'!' мети вирпиувались так1 задач¡:

1. Знаходження змiн стану водно-ionnoro оточення, обумовлених впливом у-ра;нанп, для модельного синтетичного полшуклеотиду poly(A) в одно- i ;iBocriipa.!biiii1 конформашях за допомогою методу д'|електрометрП' в ;папазож надвиеоких частот (НВЧ). Установления пипошдиих змш структури polv(A).

2. Одержання дамих про комплексну дклектричну проникжеть у .папазош НВЧ, с. icKipon poiii.T 11 icTi.. електрофоретичн) рухомкть. спектралып параметр! в ¡нфрачервоному (14) д1апазож для пативноУ i у-онромтеноУ в розчиш ДНК. Визначення впливу y-üiiиромii¡к^ванпя на ступшь пдраташУ, електропровишси.. ступшь iio.iiMepiiocii ДНК. Внявлення виповиних змш структурного стану сахарофосфатпого ланшога й азотиетих основ ДНК.

3. Вимф .мелекгричпих параме! pi» й е.тектропровипосп похиного актинонину

- ukihiio nn.i-6ie-(2-.4iMcrn,ia\iiiiot'iii.i) амшу (Actll). комплексу ДНК-Actll i у-опромшеного комплексу ЛНК-ActII. Визначення ïxirix ступени) пдратацп. Одержапня електрофореграм i визначення ci yiici i я ио.пмерноси у-опромшеного i неопромшеного комплекав ДНК-Actll. 4. Одержапня електрофореграм. 14 спектр!/! i дшлектричннх характеристик для ДНК, biuLichoï з печ'шки iitypin. опром'шсних у зош ЧАНС. Виявлення ш/шов1дмих змin по.нмерпост i. сшралыю!' структури i параметр!и ¡он-пдратного »точения ДНК.

Об'скт Оосл'Южсиня - пдрат на оболоика i структура молекул ДНК, poly(A) i комплексу ДНК-Actll.

Предмет дос.и'д.ження - результат впливу ¡огпзуючого випромшювання на юн-пдратну оболонку i структуру молекул ДНК. poly(A) i комплексу ДНК-Actll.

Методы Оосл/дження - методи диферешпальноТ НВЧ д'1електрометрп та п'сзограв1.метрп застосову валися для оцшки загатыюТ величини пдратно!' оболонки молекул, метод кондуктометрп вживався для оцшки елсктропро-вщносп дослЬжуваних молекул i для oiuhkh числа одно- i двониткових розривт у ДНК; метод 14 спектроскопы використовувався для визначення конформанм ДНК i стану ïï пдратно-активпих центрш. метод гель-електрофорезу застосовувався для визначення ступеня no.mtcpnocTi нагивних i опромшених зразюв ДНК.

Наукова новизна одержаних результатов полягас в наступному:

1. Розроблено ефективний та ¡нформативний комилексний шдхш з використанням метод ¡в диферешиальноТ НВЧ дюлектрометрп. кондуктометрп'. 14 спектроскопн i гель-електрофорезу для з'ясування впливу ioniiyioMoï paaianiï на стан водно-ionnoro оточенпя i структуру ДОК.

2. Впершс знайдеш змши ступеня пдратацп ДНК, одно- i двосшрального синтетичного полшуклеотиду poly(A). у-опромшених in vitro у високих дозах (>350 Гр). ¡¡»явлено значш змши в ста»! пдратно/ оболонки ДНК, bfulichoT з псч1ики mypiB. що тривалий час знаходилися у зош ЧАЕС.

3. На ochobî апалгзу 14 criCKipii! водогих пл'ток ДНК показано, що часткове руйнувапня пдратного оточення ДНК пов'язано 3i зменшенпям пдратацп дезоксирибоз, фосфатних груп i пору шенням стопочноТ структури азотистих основ, а у випадку ДНК опромшених mypiB - також 3Î змшою сшральноТ структури молекул.

4. Вперше nuм'фЯ1 ii дшлектричш вдастииосп похшного актиноцину Actll. комплексу ДНК-Actll, визначеш иараметри водно-ioHiioï оболонки комплексу i змши в них iii.i дкто y-pa;tianiï.

Практичне значения олержаннх результате. 1:ксперименталып результата, отримаш в дисертацм. модають noiii вшомосп про роль води в структур! рад1ашйио-пошкоджепих нуклешових кислот. Вони можуть бути використа1п в наукових установах. то займаюгься достижениям впливу юнгзуючих вииром'пновапь на ôiojoi i'ini об'скти i розробкою методик радшцшного захисту. Oipmiaiii ;tani про пдраташю комплексу ДНК гз похиним актииопину Actll. шо мае проткнухдинну актиншегь. важлиш для вироблення рекомеидлнй при розробш .пкарськич препарат!», шо взагмодноть з ДНК.

Особнстнй внесок здобувача. П он\б.йкованих cni.ii.no ji сп1»ави>рами на\ кових працях особисшй кнссок злобу вача полягаг: \ робел ах 11-11 ] у пошуку й аналЫ лггературних джерел. ипунанш дос.йджуваннх розчшйв. н \частi в нроведенш розра\\MKiii. у комп'ютернш o6po6ui отриманих результат ¡в. у епшучаеп в 061 оворешй. in lepiipeianii ланих i написашп наукових aaicii: \ роботах 11-3, 5-111 у нроведенш конд\ ктометр1чни\ i дклектричних вимipiн: у роботах [4.9] у проведешп liUMipiu методом 14 спсктроскопп. u cniin часп' н проведешп miMipin метолом п'сзогравЫетрм: у роботах [1-3] у проведешп BHMipm метолом УФ спектроскопа: у роботах [1,2,4.6] в спinx'iacii в обговорешп результат!» електрофорегичних пимфш, у розробш методики 3i частосуванням комп'ютерних програм для одержання лснситограм ¡з фотонегатив!в пофарбованих i е.нв.

Апробашя результате роботи. Результата роботи за темою дисертацм були представленi й обговореш па: 11 з'Гз.и УкраУнського бюфпичного топариства, (Харкш, УкраТпа. 1998); III International Symposium "Physics and Engineering of Millimeter and Submillimeter waves" (Kharkov, Ukraine, 1998); V Mi/КнаролпоТ конференцп "Фпичш явища в твердих Ti.iax" (Харклв. УкраУна, 2001): Копфереицп молодих учених !РН ПАН Укра'ши (XapKiB, УкраУна, 2001). \ сна доповщь "Вплив юшзуючого випромнпопання на ;нелектричш властивосп й структурний стан ДНК в розчиш" ш'дзпачена дипломом I ступеня як краща допошдь у секшУ "Бюфпика" (наказ №27 по IPE НАМ УкраУпи вщ 13.12.2001): II International Conference on "Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications" (Leipzig. Germany, 2002); III з'Уз;й УкраУнського бюфгзичпого товариства (Льв'т, УкраУна. 2002); II ХаркшеькоУ конференцп молодих учених "Радюфгзика и НВЧ электроника" (XapKiB, УкраУна, 2002); семшарах вииилу бюфгзики IPH НАМ УкраУни; coiinapi Харктського видпепня УкраУнського oioc[)i3H4Horo товариства (XapKiB, УкраУна, 2003). Тези перерахованих доповщей опуб:пковано.

Пуб.пклцп. Результати дисерташУ опублжоваш в 11 наукових працях, у тому чие:н в шести стаггях у штчизияиих фахових наукових журналах i в н'ятьох тезах доповщей нашональпих та мгжнародних конфереиц!й.

Структура та обеяг дисерташТ. Дисерташя складасться з вегуну, шести роздЫв i BuciiOBKin. Повний обсяг дисерташУ складас 122 ciopiiiKH. Mieinn> 21 рисунок. 9 таблииь. з них 3 рисунка й 1 таблиця розмнцеш па 3 окремих аркушах. Список використаних джерел метить 185 найменувапь на 19 сторшках.

OCHOBHIlfl 3MICT РОБОТИ

У встуш обгрунтовапо актуалыпеть теми дисерташУ. сформульонаио мету i ни чяачел! за.та'п дослижелпя. вшпачеш иаукова новизна i лрактичие значения робож. приведеш Bi.TOMOcri про апробацио результатов.

У першому роздЫ предегавлено оглял лператури за темою дисерташТ. Слкупшеть 1Йломи\ даиих указу с на те. то центральным об'скюм впливу ionny ючоУ pauauii с молеку ла Д1IK. У роздкн приводя!|,ся загалым зведення про структуру А-. 13- i /-форм ДНК. мк! iciiy101i. при ни¡пачених зовппшпх умовах. Показано, то стабттыйеть сшральноУ сгруктури ДНК у великж \iipi внзначагться характером взагмодн макромолеку ли ч полним оточеипям. то г

структурним слемеитом ргзпих конформашй ДНК. 1'олляи\то пдраташю (нзасмолмо з розчинпиком) ДНК. описано »¡лпопицнпдратно-активш цсптри.

На шдсгав1 вивчених лперат\рних ланих видиено три мехажзми впливу ¡онпуючого випромнновання на ДНК: пряма д'|я - за рахунок безпосерсдньоУ взасмодп у-квантт з атомами ДНК. непряма .'ия - обумовлена впливом продуют радюлгзу води (е"ач, ОН'. 1Т й ¡нш.). опоссредкована д1я у живому орган'п\п - в результат! взасмодп ДНК з ¡ншими рздацшно-уражепими бюмолекулами. Описано осповш типи рад1ацжпого ушкоджения ДНК: модиф1кашУ сахарного фрагмента й азотистих основ, структурш змши полимеру - утворення одно- й двониткових розрив'ш ДНК, формування мгж- 1 внутрпиньомолекулярних зшивок 1 т.д. У ряд'| роб1т виявлена залежшеть в'ш р1вня пдратацп типу пострадшцшних радикал ¡в ДНК \ рухомосп радЬцшно-утворених електрошв у пдратному шар'|.

Важлива роль пдратацп у функцюнувашп ДНК приводить до висновку про те, що для розумшня мехашзмт впливу випромнновання необхшш вщомосп про змши шд лкю рал'/ащУ у взасмодп 'ДНК - розчинник'. Однак у тсперкижй час там лан'| в публжащях висутш. що робить актуальним проведения такого роду дослижень.

У другому роздЫ коротко розглянуто ф1зичн| основи використовуваних мстод!в дослцження: диференшалыюУ НВЧ д1електрометрм (д1апазон мЫметрових довжин хвиль), 14 спектроскопп, п'езограв'метрп та гель-електрофорезу; приведен! характеристики вивчених прспаратт.

Можлив'|сть застосування методу диференщальноУ д1електрометрп (довжина хвил1 7,6 мм або частота 39 ГГц) для вивчення ступеня гшратацн розчинених у вод1 речовин визначасться тим, що молекули зв'язаноУ води \ розчиненоУ речовини менш рухливк шж молекули виьноТ води. Це приводить до зниження дшлектричноУ проникност1 розчину (ё*=еЧе") у поршнянш з д!електричною проникшетю чистоУ води. В основ! методу лежить вимф р'гзпиш, коефщютв поглинання Да 1 ргзниць фазових зеувш др ьпж значениями вщповщних параметр ¡в контрольних 1 дослшжуваних розчишв, з яких попм з високою точшетю (до 0,1% шд величин е' ! е") визначають р'пнищ Де' 1 Де". У величину Де" вводиться поправка на слектропровшшсть розчину а. ОскЬчьки в НВЧ дюпазош справедлива теор1я Дебая полярних риин, то виправданий перехщ до опису дюлектричних властивостей розчину параметрами е5 (низькочастотна межа величини е' розчину бшполмеру) 1 Розрахунок ступеня пдратацп со (г води / 1 г НК) проводився за формулою:

де Де5- ргзниця \пж статичними ;пе.1ектричними проникностями води 1 розчину НК. р - коефппент. що залежигь и ¡л форми молекули (1.58±0.08): V - питомий об'ем. см'/г: е"к и с"-"- д1електричш проникноат НК 1 води в 14 дтпазош (~4). Формула справедлива при низьких копцеитрашях с (г розчиненоУ речовини на 1 г розчину).

Викорисгання 14 спектроскопп в обласп 900-1800 см'1, що випош'лас коливалышм модам ДНК. дозволж знаходичи змши структури й стану пдрагних

ист рм» ЛПК ни шинном радшпп. Описано метлика иримпуиання плшкових зразкт. одержаппя та оброоки 14 спектрт. ПохиСжа шипачепня часто! CK.ia.ULia 1-2 см"'. У роздан коротко розглинуто метол н'гзофашмсфн. то використонунанея ;ия одержаппя ¡¡огерм г-¡лрагаим Д11К. Мсголн комдукюмстрп (частота 10 к1 и) \ гель-електрофорезу никорист овувались у роооп ;ия визначення, пиповино. юнноУрухомоем и ступсню по.имерност1 папшних 1 опромшених чразклв.

У роздЫ 3 павелено результат нпвчеппя методом ПИЧ .пелекфометрн шииву у-раиапн на стан пдрагпоУ оболочки но.пнуклеотиду ро1у(А). обраного » якосп почагкового. моделюючого ДИК об'гкта достижения. Вивчалиея одно-1 двонитков1 С1мра_11 ро1у(А). У табл.1 приведет шдом1 параметри ноли Н знайдеш р!зниш Да. Д(3. Де', Дб". Де5 мгж 'значениями виповиших параметрнз опромшенич 1 контрольных розчишв. 1ошш сила розчишв складала 0.1 М КС1. При розрахунку стунепя пдратапп зразкш використовувалися значения косфшкпта форм и р=1.5 для ро1у(А) 1 р=1.58 для ро1у(АН')ро1у(АН4) 1 обчпрювапа шкнометрически величина питомого об'сму \-0.544 см'/г.

Таблння 1

Характеристики розчшнв ро!у(Л) i poly(Ai 1' )ро1у(Л1Г)

Розним riapaMeTpii.l=20^ir ——___ Вода polv(A). с = 0.94% ро1у(А1Г)ро1у(А1Г). с = 0.75%

Дозау-опромшенвя. Гр - - 370 1650 - 670 1650

рН(±0.1) 6.3 6.3 6.3 6.2 4.0 4.5 4.5

и. Пп/мм 2.82 2.81 - - 2,88 - -

Ди(±0.0006). Нп/мм - 0 0.0008 0.0028 0 -0.0027 -0.0027

р. радиан/мм 4.93 4.91 - - 5.21 - -

Д|5(±0.0004). p;uiaii/.MM - 0 -0.0029 -0.0022 0 -0,0021 -0.0114

с' 16.5 16.4 - - 18,9 - -

Дг.'(±0.0!) - 0 -0.03 -0.04 0 -0.01 -0.10

г." 27.8 27.5 - - 30.0 - -

Ас"(±0.01) - 0 -0.01 0.02 0 -0.04 -0.10

е. 79.9 78.8 - - 77.8 - -

Дг,(±0.04) - 0 0.09 0.20 0 -0.18 -0.11

h(±I) мол. води/нукл. - 11 9 7 7 11 9-10

3 табл.! видно, то етупнп. пдратапп неоиромшепоУ однолапшоговоУ cuipxii poly (А) складаг II молекул води на иу кмеогил. При збиыиешп дозн у-он^лмшення чпко ирое.пджутться тепдешня зменшенпя ступепя пдратапп одноланшогоного poly (А). при дон 1650 Гр неличина h екладас 64% ви неличини пдратапп меоиромшеного no.iiny кмеош.чу. На ochoih .нтературпих данич припущено, шо ней ефект обумонлешш вшшкиенням внутршпп.о-лапшогових зшинок i \творениям nocrpxtiaiuilmix ироду кгiн модифкацп адешиу. шо може принести, наприклад. до пору шеиия сrept'iunx умов ¡спування иолиих мктки! \нж атомами asorv cyeuiiix оепон.

Опромшепия дволаншо! оного пол ¡меру на вимшу пи одноланшогоного привело до збиыпення ступени пдратапп (на 55',*¿> ;ыя дози 670 Гр). Очевидно, нняв.'.еиий сфек! иои'я'занни з переходом полипу к.теотиду ч днолаш uoronoro п

одполаншоговий стаи. В резулыап шлпомлш I ираню-активш иснгри mo.ickv.ih стають дос1> гшнми для изас модп з розчинником.

У четвертому роздЫ подано рез>льтати винчения впливу у-ра'шип па ДНК. Для з'ясування ступени по.пмерпосп зразкчв ДНК було проведено гель-електрофорез. На рис.1 наведено деиситограми дослижуваних зразкли ДНК (як приклад обрана доза 370 Г~р>. Положения смуги нативноТ ДНК (п-ДНК) июдо смуг маркерш свичить про високу молшершеть нативних макромолекул: Тхня ловжина в основному ск.чадас (20+50)-10' нар пуклеоти;ив (п.н.). то вЦшовиас молекуляршй маа ~2107Да. 3 рис.1 випливаг. то опромшення приводить до розмивання криво'Г розпод1пу I зосереджешпо основноТ частини фрагментов в облает! (0,6+6)-10; п.н. або ~10'1 Да. У той же час у розчин! практично висупи фрагмента з розм!рами в десятки п.н. чи мснш, ию приводить до висновку про дуже иезначний внесок у гираташю, д!електричн! й спектральн! параметри кшцевих груп таких фрагмент.

Результата д'юлектричпих 1 коидуктометричних вимф'т контрольного й опромшеного розчишв ДНК з ¡онною силою 0.01 М №С1 представлен! в табл.2. Приведен! в ¡дом! параметри води ! знайдеш р!зииш Де', Де", Де5 м!ж значениями в!дпов!дних парамстр!в опромшеного ! контрольного розчишв. Дтя розрахунку ступеня пдратацп ДНК викорнстовували значения коеф!ц!снта форми р=1.58 ! иитомого об'сму %=0.581 ем'/г.

3 табл.2 видно, що радшцшний вилив у доз! 19 Гр практично не впливас на дос.йджуваш характеристики, а в доз! 370 Гр викликае достов!р1п зм'ши Д1елсктрични.\ властивостей. КЬьк!сть молекул зв'язаиоТ води на нуклеотид змепшусться на 4 (~20%) у портпянш з1 ступенсм пдратацп н-ДНК. Цей сфект обумовлеиий. мабуть. иорушеппями сгруктури водного оточепня. ню вибуваються внасл!док рад!ац!йноУ модифжацп пативноТ конформацн ДНК. про перекрч чуванпя якоТ евпчнть поява великого числа розрив'ш водпевих зв'язкш -до 10% при 370 Гр (розраховамо з даних С'оПугк В. с/ а!.. 1965). Виявлено. що зб!лыпеппя ра,па1и й I юУ дози л о 1650 Гр не приводи 11. до посилення депдратацп.

О

Рис. 1. Деиситограми дослижуваних зразкт:

1 -розчин нативноТДНК.

2 - ДНК фага X, З-рсстриктДНК фагаЫ1!пс1 III. 4 - розчин ДНК. опромшений

у доз! 370 Гр.

Таблица 2

Д!електричш параметр« розчишв ДНК

' ■—_______ Розчин Параметрил=21 °С —___ Вода ДНК. с = 0.75%

Доза учшромшепня. Гр - - 19 370

Е' 17.0 16.9 - -

ДЕ'(±0,01) - 0 0,01 0,03

z" 28.2 27.8 - -

ДЕ"(±0.01) - 0 0 0,07

о(±0,02)х103. Ом"1 0 2.22 2.22 2,20

Е. 79.6 78.3 - -

Де5(±0.04) - 0 -0,04 0,20

Ъ(± 1) молек. води/пукл. - 19 19 15

В!домо. що в результат! у-опромшення в сахарному фрагмент! вибуваютъся так! пронеси, як розшеплення зв'язюв Н-С'п. виникнення радикал'т С„-, поява этмерт лезоксирибозила, у тому числ! в конформацн под!бноТ З'3-енло в гуан! новом нуклеотид! в 7-ДНК. У випалку таких перетворснь кут мЬк >1-ГЛ1КОЗИЛНИМ зв'язком \ напрямком ТГ перв!сноТ ор!снтацн досягае 80-100°, то !стотно позначастьея на розташуванн! основи в просторь Структура плратноТ оболонкн ДНК, мабуть. також повинна помтю змшитися. Тому виявлене змсншення сп'пеня пдратацп може вказувати на наступи! поетрадтшГпи порушення:

1) змши в головному жолобку умов формування волних м!стк!в м1ж метилыюю групою тим¡ну 1 5'-фосфатами тих же нуклеотидт, а також м!сткт м!ж атомами к пеню фосфатт ланцюга (на атом кисню приходиться до 5 молекул води), а також на порушення умови утворення бщентатних мюпав м!ж атомами азоту й кненю двох сусших пар основ.

2) з м!на в м¡норному жолобку ор!снтшш оспоа що руйнус водш метки «¡ж атомами 02 тим]ну й атомами N3 адешну.

3) Змша стану тих молекул пдратного хребта, шо примикшоть до дефектних д!лянок кютяка або пдратного хребта.

Слц зазначитн. то у випадку сопол!мер\ ро1у((Ю-с!С)-ро!у((1С]-<1С). в якому с под'топа шдмшшеп, ор!гмтаин сахару ви його ор!снтацн в В-ДНК. кктыасть мод -кул -эд'язаноТ води на нуклеотид складас тпьки 9, а не 19 [игпеЬага Т. е1 а1.. 19901."

Для з'ясування конформацшного стану опромшеноТ ДНК 1 стану н гиратно-актнвних центрт були отримаш 14 спектрн недейтерованих 1 леитерогипнч пл!вок ДНК в облает! ноглинапня сахарофосфатного ланшога й азогистих основ при 0%, 76% I 92% «¡лноспоГ пологост! (ВВ). 3 рис.2.а видно, ию 1ф!1 76 1 92% В В смуги иоглинаиия антисимефичного коливанпя фосфатних груп этом!» (\,л.=1221 см"1) ! внутрннпыжиьцевих колнвань азотистих основ (у=!713 см"') мають частотн характерн! для а пролито!' В-форми Д11К.

На рис.2.6 при тих же В11 нрикслено спек три илшок опромшсноУ /II1К (у-ДПК) и облас'11 гюглинаппя сахарофосфамюю ламшога и азотистич основ. При 92% НИ смути сн.чстричного (у,= )()86см"') 1 аптисиметричного (уа<=1223 см'1) колинаш. фосфатных труп \ смут поглииаппя ииутрпииьокип.цевих колинаш, лезоксирибози при \'|=1053 см'1 1 у:=971 см"1 мають час юти характерш для cuipa.ii,но! комформашУ В-тип\. Олнак штснспвиосп них смуг вирЬняються вЬ ипеисивностей аиалопчннх смугн-ДИК.

Рис. 2. 14 спсктри недсйтсровапих п.пвок нативноТ (а) 1 опромшсноУ в доз1 1650 Г'р (б) ДНК тимуса теляти в обласп иоглинаппя сахарофосфатного ланщога й азотистих основ при ВВ: 1 - 0%: 2 - 76%: 3 - 92%.

У табл.3 представлено результат» розрахункш шлпоспоУ штенсивносп за формулою

Д..... = •

ОГ

•100%,

де О™^' /5™ ах - онтичш щиыюсп и максимум! поглинапня сму ги при 0 *| 92% ВВ.

Таблнця 3

ВЬшосна ¡итснсившсть смуг поглинапня I рун атомш фоефатт 1 лезоксирибози нативноУ й у-опромшеноУ ДНК

013. % Натиппа ДНК у-опромшена ДНК I

V. см-' Вимссення 1ЭВ1ЛИ • v. см"1 Винсссння | [)ва„.% ;

0 92 1242 1222 ро; 38.2(±5) 70.0(±5) 1243 1223 1094 1086 28.2(±5) 54.8(±5)

0 92 1097 1087 ро;

0 92 1068 1053 VI 20.5(±5) 1067 1054 v, ; 3.3(±5) ;

0 | 963 92 | 971 91.1(±5) 965 971 V, 1 37.5(±5)

0п»дх гчл13\

<}•• и и

Видно, ню у випадку як н-Д11К. 1ак \ у-Д1 П\. при змий ВВ ни 0% до 92% смут поглинання коли ваш. фосфат их груп \\ 1 зазнаю и> пизькочастгний зеув з одночасним ростм ¡птенеивноси. Зменшенпя на 10-15% ниносноТ ¡птснсивпоетч них см\гу внпадку у-ДНК > нпр1впя1пн з н-ДПК (при практично однак-оних частотпих зсунах при змий полотен) сшдчитъ про мешпу плрапшно фосфатпих труп у-ДНК. Ней ефект тдтверджуг висунуте положения про депдрагашю у-ДНК за рахунок пор\ шеппя \мов формування водних \йеткт ¡а участю атомш фосфатпих |руи.

3 табл.3 також видно, то при збпмнешй вологоеп плшок н-ДНК 1 у-ДНК гид 0% до 92% емуга поглинання дезоксирибози V, зазнас низькочастотний зеув вЬповино на 15 1 13 см'1, а смуга - високочастотний зеув вЬшовцшо на 8 1 6 см"'. Одночасно зростають Тхш штснсивносп. При иьому в пор1внянш з н-ДНК ¡нтенсивносп смут \'| 1 у: ;ия у-ДНК на 20-50% нижче. то говорить про меншу пдраташю и дезоксирибози.

3 рис.2,а.б також видно, то при 92% ВВ частота конформацшно-чутливоТ смуги поглинання азотистих основ \'= 1710 см"1 для у-ДНК виргзняеться шд частоти т1сТ ж смуги V = 1713 см"1 /и я н-ДНК. Не сличить про змшу сгруктури азотистих основ.

На рис.З.а.б приведено спектри поглинання н-ДНК 1 у-ДНК у 1)2() при 0% I 76% ВВ. Виомо. пю перехи ДНК ¡з неунорядкованого стану (при 0% ВВ) у сшральну конформацио (при 76% або 92% ВВ) супроводжуеться високочастотним зеувом \ гшохромгзмом смуг поглинання поза- й внутрпнньокиьцевих коливанпь кратиих зв'язкш основ, то пов'язано з виникпенням резонансних взагмодж коливадышх моментш переходт при утворешй "стопок" основ (Семенов I ¡п.. 1984.1988). Такий же ефект видно на рис.3,а для смуги гуаншу V = 1574 см"1 1 смут V = 1621 см'1, то виноситься до аденшу 1 частково цитозину.

3 рис.З.б також випливаг, що 14 ппохромгзм у-ДНК ¡стотно ослаблено: на аленшовоп гуапнювоУ смутах для н-ДНК шн дор1вшос 46 1 35%, а для у-ДНК вш над ас до 12 й 15% виповино. УФ ппохромгзм при X = 260 мм для у-ДНК виявився менше (в -1.5 рази), шж для н-ДНК.

Рис. 3. 14 спектри деГперонанич плшок нативноТ (а)! опромшеноТ в доз1 1650 Гр (б) тимуспоТ Д11К в облаем иоглипапия азотистих основ при ВВ: 1 - 0%: 2 - 76%.

Чшдси випливас. що упорядкована "стопочна" стру ктура основ у-ДНК у ¡машин Mipi розупорядкована. БЬьш радючутливими г АТ-парк: для смуги иоглинания адешну гшохромгзм лоршнюг 349о. а гуажну - 18%. Цсй ефект корелюг з вищезгатаним передбачуваним руйнуванням ваших мкткш на ато.хй N3 адешну. 11с виключено. що бьтмн близьке розташування водного хребта в мпюрному жолобку до АТ-посл1довносп створюс умови для кращого руйнування стопочно) АТ-структури за рахунок утворення у зв'язашй вод1 продукт! в радюлпу.

У п'ятому роздии приведен! результата винчения шиш ну у-випромнновання на комплекс ДНК ¡з похитим актиноцину, Actll, що г аналогом протипухлшшого препарату актиномщину D.

У табл.4 представлен! результата .пелектричних BUMipin розчишв чисто! ДНК. Actll, комплексу Днк-АсШ з виношенням P/D=5 i у-опромшеного в доз! 800 Гр комплексу. Концентрашя cani NaCI у розчинах склалала 0.08 М. При розрахунку стул спя пдратацн використовували значения коеф!шслта форми р=1,58 i значения шпомого об'сму v=0,581 см3/г для ДНК, \ -0,732 см3/г для Actll i \'=0,619см3/г для комплексу ДНК-Actll. Видно, що стушнь пдратацн ДНК склал 15 молекул води на нуклеотид (що виповиас ¡снуючим оцшкам), а .пганд маг биьш високу лдратну актившеть у поршняшп з нуклеотидом ДНК: з од1нпо молекулою Actll пов'язано близько 22 молекул води. Значения h комплексу склало в перерахувашн па 1 нуклеотид 34 молскули води. Зросганпя ступепя гйратацп комплексу в пор'шнянш з сумарним значениям величин h для ДНК i Actll з урахуванням P/D=5 означас, що зв'язування ДНК з Actll приводить до появи в пдратнш обачоши комплексу додаткових зв'язаних молекул води. Гамма-опромшення в доз! 800 Гр приводить до зменшення величини h до 28 (-20%), що св'шчить, як i у випааку опромшення чисто! ДНК, про часткове руйнування пдратноТ оболонки. Опромшення викликас також зр1ст електропровиносп о на 10%. указуючи на викил додаткових ¡ошв narpiio в розчин унаслшок радцщшноТ дсструкшТ ком плсксу.

Таблиця 4

Д1слсктричш характеристики розчишв ДНК, Actll, комплексу ДНК-ActII i у-опро.чшеного комплексу ДНК-ActII

' Розчин ПараметриД=21 Вода ДНК. с=0.47% Act II. с=0.38% комплекс ДНК-ActII комплекс ДНК-ActII. 800 Гр

Е' 18.45 - - - -

Аг'(±0.01) 0 0.05 0,09 0.04 -0,10

с" 29.16 - - - -

ДЕ"(±0.()1) 0 0.21 0,38 0.52 0.40

о(±0.01 )х 10'. О.м"1 О 2^0 0,73 2.97 330

78.53 - - - -

ДЕ5(±0.04) 0 0.81 0.73 1.71 140

h(±l). молск. Н:0/нукл. - 15 22 34 28

Даш электрофорезу вказують па те, то чиста ДНК характеризуется смуюю. яка блнзька ло смут маркера 23130 и.п.. а смута комплексу ДПК-ActII шлстаг пи смуш контрольно? ДНК. Тобто молекулярна маса комплексу бимне шж у чисто! ДНК. Денситометрична крина onpoMiiieiioro комплексу вказус на фрагмептацио зразка: при nopiniiMiiii з кривою маркера вилно. uio осповна час!ка фрагментов мае розмф (1-40)10' п.н. Таким чином, можна лумати, то дегираташя опромшепого комплексу пов'язана з"| змшами його структури. як i у випалку опромшення чистоТ ДНК.

У шестому роздЬи лано результат вивчення змш дтлектричних властивостей i пдратацн ДНК, обумовлепих впливом на живий оргашзм радюнуклиш зони ЧорпобильськоТ ЛЕС. Дослщжувалася ДНК з печшки mypia 6-го поколпшя. що постжно знаходнлися протягом 12 \нсяшв у 30 км зош ЧАЕС.

Гель-электрофорез показав, що ДНК опромшених тварин (ч-ДНК) складасться з високомолекулярноУ (-23-105 п.н.) i низькомолекулярноТ (-600 п.н.) фракцш, то вказус на те, що ТГ полЫершсть значно нижче, шж у н-ДНК (>48-103 п.н.). Однак у зразку практично немас фрагмештв з довжиною менш conii пар ну клеотидш. що виключас вплив кшцевих ефектт на стугпнь взаемодн ДНК-розчинник.

3 табл.5 видно, що значения Де', Дб" i Де5, що описують вщмпшосп параметр!в води вш параметрт розчишв, помггно менше для ч-ДНК, тж для н-ДНК. Розрахунок пдратанн показуе, що для ДНК, видгленоТ з печшки onpo\iinennx тварин, вона склалас лише 14 молекул води на нуклеотид (на 25% нижче, шж для н-ДНК). Оскьтьки paiiiuie (роздш 4) аналопчна дегщраташя спостер1'галася для ДНК, опромшеноУ in vitro, можна думати, що й у цьому випадку вьабувасться деструкшя ДНК: змша структурного стану ланцюга й азотистих основ. Дтя з'ясування цього питания були нроаналповани 14 спектри в областях поглинання сахарофосфатного ланцюга й азотистих основ, як! були одержани Семеновим М.О. (Семенов М.О. el а!, 1994).

Таблиця 5

Д1електрич1н параметри води i розчишв ДНК

—-—~__Розч И11 Парамефи. t=23°r Вода и-ДНК, с = 0,65% ч-ДНК, . с = 0.65%

е' 18.0 - -

Дг'(±0,005) 0 0,12 0,09.

е" 28.8 - -

Д£"(±0,01) 0 0,38 0,31

fo 78.8 - -

ДеЛ+0,03) 0 1,19 1.02

//. молеку л воли/ нуклеотид 19 14

3 рис.4,а,б ииплипас. шо з ростом ПН сиектралып параметри смут ноглинанпя коливапь сахарофосфатного ланцюга ДНК значно змпиоються, мричому не однаково для ч-ДПК i н-ДПК. Гак, у випалку н-ДНК штенсившеть смуги поглинання дезокеирибози \s=972 см"' значно зроетаг, а дтя

чорноби.н.ськот зразка таким сфект с шдсупнм. Смущ поишпапня колииаппя фосфашоУ 1'рупи v,«-|224 см'1 и-ДПК шкож шпаг ¡pici нпенеивносп при , збиынешп ИВ. u y нипадку ч-ДНК ппенсиншсм» iucï c\iyi и збиынупьея позначно, aie при 56% OD вибуиапься розшеплення смуги на лш - з частотами 1228 см'1 i 1240 см"1. IU сфсьпи нказуюгь на деепфапзацпо опромшсноУ Д1IK. то шдшерджусгься и висутшспо в спектр! смут v^l()55 см'1, характерно! для cnipaibiiHX молекул.

Ц155; ' 1 : • Х72 ■ V

!\ /,

,„/ \

о

а 0.5-

1224 0.4

! J245 0.3

Ï * 1 0.2

5 0.1-

0.0'

Чо4 974

КЖ8 \

|0ЫЬ; ;

. ш

2 4:" v 1 \ 34/ 1085',

..У

122» i .1240

''О' t i*

,•' 1245'.

UOOv.c«

Рис. 4. 14 спектри пслсйтсронапих плшок ДНК нечшки неопромшених (а) 1 онромшепих (б) шурт в облает! поглинапня сахарофосфатного ланшога при ВВ: 1 -0%: 2-56%; 3-90%.

Вп.иш рапанп па структу ру ДНК шдтиерджусться й ¡стотпим зменшенням (в -3 рази) всличинп 1Ч-ппочромгз.му смуг поглинапня коливапь азотистих основ (алешну I гуапшу) в опро.мшепш ДНК у порншяшн з нативною. Це вказуг на розрии частипи структуроутворюючич зв'язкш. Значп'| зм'ши спостер'паюп.ся в обласн поглинапня коливапь карбопЬьних груп основ, шо також вказуг па деетру кти ю м акромол скул и.

висновки

1. Застосунання ефективного та информативного шдходу з використапням методш диферепшальпоТ НВЧ ;пслектромстри. кондуктомстрн. 14 спектроскопiï i гель-слектрофорезу дозволило комплексно вивчити пилив ¡ошзуючоУ patiaiin на стан водно-юнного оточенпя i ару ктуру Д1IK.

2. Знандено. то при збЬыиешн дози у-онромшення до 1650 Гр сноаериасться зменшення ступени пдратаин одноннтковоТ poly(A). Достошрно зафжсована 35%-ва ;iei ¡драгашя зразка. опромшеного в доз1 1650 Гр. Вияилсно. шо для двонитковоУ poly(A) спостериасгься збЬынения значения ступепя пдратанп на 55% у поршияши з контролем при опромшенш в .tojî 670 Гр i на 30% при onpoMiiienni в .wii 1650 Гр. Показано, шо змиш величиии пдратного оточенпя poly(A) обумовлсш ноя ною моднфжованих основ, у творениям 31Ш1ВОК лаптоп». а \ нипатку ро1у(Л1Г) ро1>(Л1Г) - додагково переходом но.пну клеотиду з двопптконоУ конформашУ в одпопиткону.

3. Вияилсно зменшення сгупепя i Lipaianii' ДНК. опромшсноУ in \itro \ виеокич

дозах y-paiiuuiV (до 1650 I р). Установлено, mo вплив у-нипромшювання приводить до деполгчернзаци ДНК. а депдраташя макромолекул пов'язана з частковою депдратажао дезоксирибоз. фосфатних ipyn i порушенням стекжгу азо1иетих основ.

4. Buepiue ви\пряж ;пелектричш властшкхпт похиного актиноиину ActII i його комплексу з ДНК. Установлено, то стушнь пдратацп ActII складас 22 молекули зв'язаноУ води, утпорення комплексу ДНК i ActII еупроводжуеться збпьшенням пдраташ'У, a у-опромшепня приводить до фрагментацн i частковоУ (до 20%) депдратацн комплексу.

5. Вперше виявлено зменшення ступеня luparauiï на 25% для ДНК, видшеноУ з печшки 6Lihx щурш 6-го поколншя, шо протягом 12 мкяцш постшно знаходилися в 30-км 30Hi ЧАЕС. Показано, то депдраташя ДНК обумовлена зменшенням пдратаци сахарофосфатного данцюга, а також порушенням стопочноУ структури азотистих основ i сшральноУ структури молекули. Виявлено наявжсть високо- i низькомолекулярноУ фракшй у ДНК печ1нки оиром1нених mypÎB.

СПИСОК ОПУБЛ1КОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦП

1. Кашпур В.А., Дубовицкая О.В., Красницкая A.A., Малеев В.Я. КВЧ диэлектрометрический метод исследования у-облученной ДНК // Радиофизика и электроника. - 1997. - Т.2. -№2. - С.153-155.

2. Кашпур В.А., Дубовицкая О.В., Красницкая A.A., Малеев В.Я. Влияние у-облучения на состояние ион-гидратной оболочки ДНК // Bien. Харк. ун-ту. -№410. - БюфЬичний bîchhk. -1998. - Вип.1. - С. UI-115.

3. Дубовицкая О.В., Кашпур В.А., Малеев В.Я. Влияние у-облучения на гидратацию полирибоадениловой кислоты // Bien. Харк. ун-ту. - №450. -Бюфгзичний BicHHK. - 1999. - Вип.2. - С.88-91.

4. Хорунжая О.В.. Семенов М.А., Кашпур В.А., Больбух Т.В., Красницкая A.A., Малеев В.Я. Гидратация и структурное состояние у-облученной ДНК по данным инфракрасной спектроскопии и пьезогравимстрии // Bien. Харк. унту. -№525. - Бюф1зичний bîchhk. - 2001. - Вып. 1(8). - С.37-41.

5. Кашпур В.А., Хорунжая О.В., Красницкая A.A.. Матеев В.Я, Семенов М.А. КВЧ диэлектрическая проницаемость и структурные изменения ДНК из печени крыс, облученных в Чернобыльской зоне // Радиофизика и электроника. - 2001.*- Т.6. - №2-3. - С.345-349.

6. Хорунжая О.В., Кашпур В.А.. Красницкая A.A., Малеев В.Я. Гидратация производного актиноцина и его интактного и у-облученного комплексов с ДНК по данным КВЧ диэлектромегрии // Bien. Харк. ун-ту. - №593. -Бюфгзичний bîchhk. - 2003. - Вып.1(12). - С.20-23.

7. Дубовииька О.В.. Кашпур В.А., Краеницька A.A. Д1електричш влааивосп у-опромшених розчишв ДНК // "Гези доповшей II з'Узду УкраУнеького бюфничного товариства. - Харклв (УкраУна). - 1998. - С.347.

8. Dubovitskaya O.V. Kashpur V.A., Krasnitskaya A.A.. Maleev V.Ya. Using of the ГНГ method for investigation of radiation-induced changes in DNA hydration shell // Proc. Third International Kharkov Symposium "Physics and Engineering of

Millimeter and Submillimeter Waves" (MSMW'98). - Kharkov (Ukraine). - 1998. -P.748-750.

9. Хорунжая О.В.. Семеном М.Л.. Кашнур В.А.. Ьольбух Т.Н.. Красницкая Л.А., Малеев В.Я. Влияние у-облучения на структуру ДНК и ее гидратное окружение // Материалы V Международной конференции "Физические явления в твердых телах". - Харьков (Украина). - 2001. - С.76.

10.Gatash S.. Gorobchenko ().. Khorunzhaya О.. Kushpur V.. Maleev V. Dielectric permittivity of heterogeneous disperse systems with particles of various shapes and structure under influence of physical factors// Book of abstracts. 2nd International Conference on Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications. - Leipzig (Germany). - 2002. - P.T55.

П.Кашпур В.Л.. Красницька A.A., Семенов M.O.. Хорупжа О.В. Вплив опромшепня в зож ЧАЕС на структуру i пдратне оточення ДНК з печшки mypie // Тези допов'шей III з'Тзду Укра'шського б'юфгзичного товариства. -Львш (Укра'ша). - 2002. - С.22.

АНОТАЦ1Я

Хорунжа О.В. 1он-пдратнс оточення i стру ктуры! особливоот опромшспоТ ДНК. - Рукопис.

Дисерташя на здобуття паукового ступеня кандидата фгзико-математичпих наук за спешалынспо 03.00.02 - бюф1зика. - Харклвський нацюнальний ушверситет ¡м. В.Н. Каразша, м. Харклв, 2004.

Дисерташя присвячена експеримепталыюму вивченпю впливу юшзуючоТ pa/jiauii на ion-rupamy оболонку i структуру ДНК. Робота виконапа за допомогою комплексу сучасних ф1зичних метол!в (диференшальна НВЧ Д1електрометр!я. 14 спектроскогпя. гель-електрофорез i ¡и.). Установлено, що у-опро.мшенпя in vitro у дозах 370-1650 Гр приводить до значних змi11 структури i сгупсня пдратацн poly(A) i ДНК. Виявлсно значш змши стану пдратиоТ оболонки i структури ДНК. видиеноУ з печшки шурш. пцианих хрошчному опром'шепшо в умовах зони ЧАЕС. Знайдено, що кЬьюсть зв'язаних з опромшеною ДНК молекул води зменшусться на величину до 25%. Визначено параметри Bo;mo-ionnoT оболонки похщного актиноцину - актииоцил-бш-(2-дшетиламшоетил) амшу (ActH), комплексу ДНК-ActII i змши в них шд дкто у-радтци.

Ключов1 слова: ДНК, пдраташя. юшзуюча ра.цашя. структура uiono.iiMepy, НВЧ дюдектрометрЫ, 14 спектроскогпя, гель-електрофорез.

АННОТАЦИЯ

Хорунжая О.В. Иои-гидраиюе окружение и структурные особенности облученной ДНК. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук но специальности 03.00.02 - биофизика. Харьковский национальный у ниверситет им. В.Н. Каризина. г. Харьков. 2004.

Для выяснения причин и конкретных механизмов нарушения биохимических и физиоло! ических процессов в облученном организме

необходимо изучение пострадиационных изменений и структуре и функционировании био.Ю! ичееки значимых макромолекул. Особенно важным является выявление структурных изменений в молекуле ДНК. поскольку ее повреждение ноет генетический характер и может вызвать онкологические заболевания. К настоящему времени характер радиационных изменений молекулы ДНК выяснен достаточно детально - по появление одно- и двунитевых разрывов, модификация азотистых оснований и сахарного фрагмента, образование сшивок. Однако многие аспекты радиационного поражения ДНК все еще мало или совсем не изучены. Как известно, в стабилизации спиральной структу ры нуклеиновых кислот большую роль играет гидратно-ионное окружение. 13 некоторых экспериментальных работах была обнаружена зависимость радиационного эффекта от соотношения 'вода - ДНК' в образце, но не изучалась связь между структурой облученной ДНК и ее гидратной оболочкой. Практически ничего не известно о вызванных излучением изменениях во взаимодействии ДНК с водным окружением.

Поэтому целью диссертационной работы являлось выяснение роли гидратации в пострадиационных изменениях структуры молекул ДНК, ро!у(А) и комплекса ДНК-АсШ. Изучали водные растворы промышленно-выделенных биополимеров и комплекса ДНК-АсШ. облученные у-квантами 60Со; растворы ДНК. выделенной из печени крыс, подвергнутых комбинированному облучению в реальных условиях зоны ЧАЭС. а также приготовленные из этих растворов пленки биополимеров. Применение комплексного полхода с использованием различных экспериментальных методов позволило впервые с разных сторон описать взаимодействие биополимер - вода и соответствующие структурные изменения, вызванные облучением. Для оценки общей величины гидратной оболочки макромолекул применялись методы дифференциальной КВЧ диэлектрометрии и пьезогравиметрии, для определения конформации биополимера и состояния его гидратно-акгивных центров использовался метол ИК спектроскопии, для определения степени полимерности нативных и облученных образцов ДНК применялся метод гель-электрофореза, для изучения изменения ионного окружения макромолекул использовался метод кондуктометрии.

Изучено воздействие у-радиации на диэлектрические свойства и степень гидратации полирибоадениловон кислоты. Методом дифференциальной диэлектрометрии в миллиметровом диапазоне длин волн получены данные о комплексной диэлектрической проницаемости водных растворов ро1у(А) в одно-и дву хцепочечной конформации при различных дозах у-облучения. Обнаружено, что облучение в дозе 1650 Гр вызывает снижение степени гидратации односпирального полипу клеотида на 35%. Облучение двухсиирального полинуклеотида п дозе 670 Гр приводит к увеличению значения степени гидратации на 55%. а в дозе 1650 Гр - на 30% по сравнению с контролем. Показано, что наблюдаемые эффекты можно объяснить образованием модифицированных оснований, возникновением сшивок цепей, а в случае двунитевого ро!у(А). кроме того, переходом полимера в одиоспиральную конформацию.

Метолом КВЧ диэлектрометрии обнаружено уменьшение степени гидратации ДНК. облученной ¡п \itro в высоких дозах у-радиации (>350 Гр).

Метлами ИК спектроскопии и пьезогравиметрии проведено сравнительное исследование структурного состояния и гидратации у-облученной и натииной ДНК в кленках при различной относительной влажности. Полимерное!ь образцов определена методом гель-электрофореза. Установлено, что воздействие у-излучения на ДНК привело к значительному уменьшению степени ее полимерности, а обнаруженный эффект дегидратации ДНК связан с частичной дегидратацией дезоксирибоз. фосфатных групп и нарушением стэкинга азотистых оснований.

Впервые измерены диэлектрические свойства производного актиноцина с двумя мстилсновыми группами в аминоалкильных цепочках, Actll, и его комплекса с ДНК. Установлено, что степень гидратации Actll составляет 22 молекулы связанной воды, образование комплекса ДНК с Actll (P/D=5) сопровождается увеличением гидратации, стабилизирующей комплекс, а у-облученис в дозе 800 Гр приводит к частичной (до 20%) дегидратации комплекса. Методом гель-электрофореза обнаружено, что облученный комплекс ДНК-ActII значительно фрагментирован.

Изучено гидратное окружение и изменения структу рного состояния ДНК, выделенной из печени крыс, которые длительное время пребывали в зоне ЧАЭС. Обнаружено уменьшение степени гидратации ДНК на 25%. Методом гель-электрофореза установлено. что ДНК имеет хорошо выраженну ю фрагментацию. На основе анализа ИК спектров показано, что дегидратация ДНК обусло&тсна уменьшением гидратации сахарофосфатного остова, а также нарушенем стопочной структуры азотистых оснований и спиральной структуры молекулы.

Ключевые слова: ДНК, гидратация, ионизирующая радиация, структура биополимера, КВЧ диэлектрометрия. ИК спектроскопия, гель-электрофорез.

SUMMARY

Khorunzhaya O.V. Ion-hydration surroundings and structural features of irradiated DNA. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by specialty 03.00.02 - biophysics. -V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2004.

The thesis is dedicated to experimental research of ionizing radiation influence on ion-hydration shell and structure of DNA. The work was carried out by means of a complex of modem physical methods (EHF differential diclcctrometry. IR spectroscopy, piezogravimctrv. gel electrophoresis and others).

It was found that y-irradiation in vitro at doses 370-1650 Gy resulted in substantial changcs of structure and extent of hydration of poly (A) and DNA. The considerable changcs of the state of hy dration shell and the structure of DNA from liver of irradiated in Chernobyl NPS zone rats were revealed. It was found that the amount of bound water moleculcs was decreased by a value up to 25 / о for irradiated DNA. Parameters of ion-hydration shell of actinocin derivative Actll. complex DNA-Actll and changes of these parameters under the y-irradiation were determined.

Key words: DNA, hydration, ionizing radiation, structure of biopolymer. EHF diclcctrometry. IR spectroscopy, gel electrophoresis.