Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (Linum usitatissimum L.)

Снегирёва, Анастасия Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (Linum usitatissimum L.)
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (Linum usitatissimum L.)"

На правах рукописи

СНЕГИРЕВА АНАСТАСИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИНТРУЗИВНЫЙ РОСТ ФЛОЭМНЫХ волокон ЛЬНА-ДОЛГУНЦА Щпит тИайзъипит Ь )

03 00 12 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3 172227

Казань - 2008

003172227

Работа выполнена в лаборатории механизмов роста растительных клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук

Горшкова Татьяна Анатольевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Иванов Виктор Борисович

доктор биологических наук, профессор Хохлова Людмила Петровна

Ведущая организация Всероссийский НИИ Растениеводства

им Н И Вавилова, г Санкт-Петербург

Защита состоится «27» июня 2008 г в II00 час на заседании диссертационного совета Д 002 005 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН (420111, г Казань, а/я 30, ул Лобачевского, 2/31, тел/факс (843)2927347)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН

Автореферат разослан « J£ » JctLL 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А Б Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Постановка проблемы и ее актуальность. Рост растительных клеток разделяют на координированный, протрузивный и интрузивный При интрузивном росте растущая клетка опережает рост клеток окружающих тканей и внедряется между ними по срединной пластинке (Эсау, 1980, Fahn, 1990, Лотова, 2001) Интрузивный рост характерен для клеток нескольких растительных тканей, при этом классическим примером служат волокна Волокно, в ботаническом понимании, - индивидуальная клетка, элемент склеренхимы - наиболее распространенного типа механической ткани вегетативных органов сосудистых растений Особое развитие волокна получают в лубоволокнистых и древесных культурах

Интрузивный рост растительных клеток отчасти напоминает рост аксонов и дендритов животных (Lev-Yadun, 2001), однако очевидно, что механизмы его осуществления существенно иные, хотя бы из-за наличия клеточной стенки Различаться могут и движущие силы, и способы регуляции, сведения о которых на сегодняшний день практически отсутствуют Этот пробел во многом объясняется тем, что непосредственное наблюдение интрузивного роста затруднено, а выделение растущих интрузивно клеток в количествах, достаточных для биохимических и молекулярно-биологических анализов, практически невозможно Причин для этого несколько Во-первых, интрузивный рост осуществляется клетками, находящимися в толще других тканей Во-вторых, клетки имеют на этой стадии биогенеза тонкую клеточную стенку при коэффициенте прозенхимности более 1000, что делает их чрезвычайно хрупкими В-третьих, in vitro интрузивный рост воспроизвести не удается, что делает особенно важным поиск подходов для его характеристики in situ Для исследования интрузивного роста логично выбрать объект, в котором этот процесс наиболее выражен К числу таких относятся флоэмные волокна льна (Lirmrn usitatissimum L). Временная и пространственная локализация стадий развития этих клеток легко определяется на стебле льна благодаря существованию «точки слома» -индикатора завершения интрузивного роста волокон и перехода к последующим стадиям дифференцировки (Горшкова с соавт, 2003, Gorshkova et al, 2003) Флоэмные волокна льна собраны в пучки и расположены вдоль всего длинного и тонкого стебля растения Лен является классическим объектом для изучения формирования волокон, на его примере, в основном, сформированы представления о развитии этих клеток (Эсау, 1980). Тем не менее, к началу наших работ, об интрузивном росте флоэмных волокон льна было лишь известно, что он существует, и что этот процесс завершается выше «точки слома»

Цель и задачи исследований. Целью представляемой работы являлась характеристика интрузивного роста флоэмных волокон льна-долгунца Были поставлены следующие задачи

1 Идентифицировать начало интрузивного роста флоэмных волокон

2 Выявить тип удлинения флоэмного волокна (апикальный или диффузный)

3 Проанализировать субклеточную организацию волокон на стадии интрузивного роста

4 Охарактеризовать формирование пучков в ходе интрузивного роста волокон

5 Подобрать метод оценки интрузивного роста волокон т situ

Научная новизна работы. В работе охарактеризован интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (L usitatissimum L) Впервые установлено, что интрузивный рост волокон начинается раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих тканей, и продолжается несколько дней За это время индивидуальная клетка достигает длины до 10 см Охарактеризована субклеточная организация клетки на стадии интрузивного роста Обнаружено, что число ядер в индивидуальном волокне составляет несколько десятков и положительно коррелирует (г=+0 6) с длиной клетки Впервые получены данные о симпластической изоляции волокон на этой стадии удлинения Впервые установлено, что волокна удлиняются всей поверхностью, а не кончиком, как предполагалось в ранних работах Показано, что именно в ходе интрузивного роста происходит формирование пучков волокон. Впервые установлено, что увеличение числа волокон в ходе интрузивного роста можно охарактеризовать in situ с помощью метода ЯМР по увеличению доли медленной компоненты диффузионного затухания сигналов спинового эха

Практическая ценность работы. Практическая значимость работы во многом определяется тем, что исследования проведены на хозяйственно ценной культуре -льне-долгунце Использование и дальнейшее усовершенствование разработанных представлений и методов позволят целенаправленно изменять свойства и качество технического волокна Полученные данные о положительной корреляции между длиной волокна и отрезком стебля от апекса до «точки слома» могут использоваться селекционерами для экспресс оценки длины формирующихся волокон Материалы по характеристике особого типа роста растительных клеток (интрузивный рост) могут быть использованы в лекционных курсах в университетах, академических институтах и других научных заведениях

Связь работы с научными программами. Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 01200 408625), частично поддержаны грантами РФФИ № 05-04-48906, 06-04-48853, 06-0481049, № 08-04-00845 а также грантом Фонда содействия отечественной науке «Лучшие аспиранты РАН» - 2008 Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), VIII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004), на Международной научно-практической конференции (Торжок, 2004), на Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), на I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-

Петербург, 2006), на II Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), на годичном собрании Общества физиологов растений Россия (Ростов-на-Дону, 2006), на VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), на конференциях молодых ученых КИББ КазНЦ РАН (2003, 2004, 2005), на итоговой конференции КИББ КазНЦ РАН (2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы В работе представлено 6 таблиц и 38 рисунков Список литературы включает 178 источников, в том числе 32 - отечественных

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Растительный материал. В качестве объекта исследований использовали растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L ) сорта Новоторжский, выращенные в условиях вегетационного опыта на открытом воздухе при естественном освещении Исследования проводили на растениях в период быстрого роста (25-45 дней после посадки) Для определения длины индивидуальных волокон использовали чесаное волокно, предоставленное Всероссийским научно-исследовательским институтом льна (г Торжок) и растения льна различных генотипов из коллекции Всероссийского института растениеводства им Н И Вавилова (г Пушкин)

1.2. Электронная микроскопия. Отрезки стебля длиной 1-2 см предварительно фиксировали 0 5% глутаровым альдегидом на 0 05М фосфатном буфере (рН 7 3) 3 часа при комнатной температуре Затем вырезали короткие участки из середины отрезка и фиксировали их в 2 5% глутаровом альдегиде на 0 1М фосфатном буфере в течение ночи Постфиксацию проводили в 1% тетраоксиде осмия при комнатной температуре в течение 2 часов После дегидратации ткань заливали в две различные смолы Ероп и LR White (Ted Pella Inc) Срезы делали на ультратоме LKB 8800 Контрастирование проводили в 2% водном растворе уранилацетата в течение 20 минут при температуре 60°С и цитратом свинца в течение 10 минут Образцы просматривали на электронном микроскопе Axiovert 200М (Zeiss)

1.3. Флюоресцентная микроскопия. Для окрашивания ядер использовали краситель DAPI (4'-6'-диамино-2-фенилиндол) (Serva) Индивидуальные волокна выделяли из стебля льна после частичной мацерации в 1% Macerozyme (Serva) в течение ночи и окрашивали DAPI в концентрации 0 5 мкг/мл в течение 5-20 мин

При анализе пучков волокон использовали краситель Cellufluor (Polyscience, Inc) Отрезки стебля ниже «точки слома» разделяли на ксилему и волокнистую часть Волокнистую часть стебля окрашивали Cellufluor в концентрации 0 01% на 1 25 мМ боратном буфере, рН 10 в течение 5 минут при комнатной температуре

Актиновые филаменты окрашивали красителем родамин-фалоидином на ASB (актин стабилизирующем) буфере. Из участка стебля выше «точки слома» (без фиксации) с помощью лезвия вырезали тонкую полоску ткани и окрашивали ее родамин-фалоидином в концентрации 0 33 мМ в течение 1-2 часов

Для регистрации окрашивания использовали эпнфлюорисцентный модуль микроскопа LSM-510 МЕТА (Carl Zeiss), фильтр для красителей DAPI и Cellufluor-FSET01 (365 им), фильтр для родамин-фалоидина - FSET15 (546 нм)

1.4. Определение длины флоэмного волокна.

Пучки волокон из верхней, средней и нижней частей чесаного волокна помещали на ночь в 1-2% Macerozyme Затем из пучка волокон выделяли 150 индивидуальных волокон Выделенные волокна раскладывали на предметном стекле, проверяли целостность клеток под световым микроскопом NU-2 (Zeiss) и измеряли их длину

При выделении индивидуальных волокон из растений льна различных генотипов, отрезок стебля помещали в 1-2% Macerozyme на ночь Сначала выделяли пучки волокон, а затем индивидуальные волокна и измеряли их длину по методике, описанной выше Проанализировали длину волокон в 25 образцах льна Общее число выделенных из одного образца волокон -150

1.5. Культивирование отрезков стебля льна in vitro. Отрезки стебля льна, вырезанные из участка стебля выше «точки слома», культивировали на среде Vi MC, которую готовили из стандартного порошка (Serva) Добавляли агар (0 8%) и сахарозу в различных концентрациях (5, 10, 20 мг/л), pH среды варьировал от 4 5 до 5 8 Среды автоклавировали, остужали и разливали в чашки Петри Длина культивируемых отрезков стебля составляла от 2 до 6 см

1.6. Подготовка растительного материала для метода ЯМР. В измерительную пробирку (0 1 см) наливали 2 мл воды и помещали срезанные стебли десяти растений Для более плотной упаковки стеблей с целью повышения интенсивности сигнала удаляли все листья, за исключением тех, которые примыкают к растущей верхушке (верхний 1 см стебля) Измерения проводили выше и ниже «точки слома» сразу после приготовления образцов и через сутки Перемещением пробирки с растениями в сквозном канале приемопередающего контура датчика ЯМР установки выбирали определенную зону измерения шириной 10 мм В ходе эксперимента растения не теряли тургор и за сутки вырастали на 1 см

1.7. ЯМР. Исследования проводили на установке спинового эха на частоте 16 МГц с использованием техники импульсного градиента магнитного поля Для измерений использовали импульсную последовательность стимулированного эха Регистрировали зависимости относительной амплитуды эха A(g )/А(0) (фактор R) при постоянном времени диффузии (td) в зависимости от амплитуды импульсов градиента магнитного поля (g) при варьировании их длительности (5) как параметра Схема эксперимента была построена на регистрации диффузионных спадов только при одном предварительно оцененном времени диффузии td - 100 мсек На

графиках представлены результаты одного из трех экспериментов с повторяющимися закономерностями

Полученные данные обработаны статистически, при изложении данных приведены средние значения и их стандартные отклонения Анализ корреляционных связей между различными параметрами выполнен при помощи пакетов программ «Анализ данных» Excel ХР

Выражаю искреннюю благодарность за методическую помощь сотрудникам лаборатории механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН д б н В В Сальникову и кбн MB Агеевой (электронно микроскопический анализ), сотрудникам лаборатории биофизики транспортных процессов д.ф -м н А В Анисимову и кбн Воробьеву В Н (ЯМР анализ) Приношу благодарность сотрудникам ВИР им Н И Вавилова (группе под руководством д б н Н Б Брач) за предоставление образцов коллекции генотипов льна

Огромное спасибо моему научному руководителю д б н Татьяне Анатольевне Горшковой за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Идентификация начала интрузивного роста флоэмных волокон.

Известно, что интрузивный рост волокон заканчивается выше «точки слома» (Gorshkova et al, 2003) Чтобы идентифицировать начало интрузивного роста анализировали продольные срезы верхней части стебля Интрузивный рост волокон может инициироваться по следующим сценариям а - интрузивное удлинение волокон инициируется вследствие остановки роста клеток окружающих тканей при сохранении скорости роста волокон, б - волокна начинают интрузивно расти в зоне, где остальные клетки уже не растут, в - волокна начинают расти быстрее, чем окружающие клетки в зоне координированного растяжения стебля Выяснение этого вопроса важно, потому что различные сценарии предполагают различия в способах регуляции Для понимания того, как соотносится координированный рост соседних тканей и интрузивный рост волокон необходимо уметь идентифицировать конец координированного роста тканей и начало интрузивного роста волокон Область координированного роста тканей достаточно легко выявляется визуально по уменьшенному расстоянию между листьями Координированный рост происходит, в основном, в верхнем сантиметре стебля льна и отчасти захватывает второй (Ageeva et al, 2005)

Идентификация волокон на ранних стадиях развития на поперечных срезах стебля затруднена, однако на продольных срезах они выявляются как вытянутые прямоугольные клетки на расстоянии 0 3 мм - 0 4 мм от апекса, через 5-6 слоев паренхимных клеток от эпидермиса (рис 1 б) Ядра в волокнах имеют характерную вытянутую форму, тогда как клетки прилегающей паренхимы - овальную или круглую Это еще один показатель, по которому можно четко отличить волокна от

паренхимных клеток. В этой области волокна растут координирование с окружающими тканями и имеют тупые концы.

При идентификации начала интрузивного роста мы руководствовались тем, что при начале интрузивного удлинения тупые концы волокон должны трансформироваться в заостренные и сформировать характерное «колено» (рис. 2).

рост по срединной пластинке, начинающийся с образования «колена»

клетки окружающих тканей

Рисунок 2. Схема, иллюстрирующая появление «колена» при инициации интрузивного роста.

Действительно, мы обнаружили формирование таких «колен» (рис. 1 в). Они выявляются на расстоянии 1-2 мм от апекса стебля. Важно отметить, что «колено» образуется на обоих концах клетки, что свидетельствует о том, что волокно в стебле удлиняется и в верхнем и в нижнем направлении.

Таким образом, интрузивный рост волокон начинается в области 1-2 мм от апекса стебля, т. е. значительно раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих тканей. Маркером начала интрузивного роста служит образование характерного «колена».

2.2. Выявление типа удлинения флоэмных волокон льна в ходе интрузивного роста

Удлинение индивидуальной клетки может происходить двумя способами: апикально (растяжение только кончика клетки) и диффузно (растяжение всей поверхности клетки). Различия между концевым и диффузным типами роста выявляются при сопоставлении ультраструктуры кончика клетки и её срединной части. У клеток, растущих всей поверхностью, ультраструктура цитоплазмы не имеет серьёзных отличий по всей длине клетки, в то время как у клеток, растущих апикально, можно выделить несколько зон, различающихся по структуре цитоплазмы (Yang, 1998). В самом кончике клетки формируется так называемая «чистая» зона (3-5 мкм), в которой отсутствуют какие-либо крупные субклеточные структуры, за исключением пузырьков аппарата Гольджи. За чистой зоной располагается «актиновая шапочка», где сконцентрированы элементы цитоскелета. Субаликальная зона отличается плотной цитоплазмой, обогащенной различными органеллами. Микротрубочки организованы в тяжи, параллельные продольной оси клетки.

(а) 9 (б)

Рисунок 1. Продольные срезы стебля льна-долгунца, а - общий вид верхней части стебля; б - область координированного роста волокон, в — область интрузивного роста волокон. на фото (б) и (в) обозначены концы волокон, П

- паренхима «=>), Э - эпидермис ( —> ).

Провели сопоставление ультраструктуры кончика флоэмного волокна и его срединной части. В волокнах на стадии интрузивного роста не наблюдали зонального расположения оргамелл. В кончике клетки нет «чистой» зоны, так как в этой области присутствуют органеллы - например, митохондрии (рис. 3 в).

Диктиосомы и эндоплазматический ретикулум равномерно распределены в цитоплазме волокна (рис. 3 а, б). Микротрубочки в кончике волокна имеют поперечную ориентацию. Таким образом, анализ ультраструктуры интрузивно растущего волокна не выявил никаких признаков апикально растущей клетки.

Рисунок 3. Продольные срезы стебля льна-долгунца в области интрузивног роста волокон, а - общий вид волокна, б - субапикальная зона клетки; в - апикальна: зона клетки. В - волокно, П - паренхима, КС - клеточная стенка, MTX митохондрия, В К - вакуоль. Стрелкой на фото (в) отмечена митохондрия.

Еще одним показателем, различающимся у клеток при концевом и диффузном росте, может быть распределение плазмодесм в клеточной стенке При концевом интрузивном росте плазмодесмы в срединной части клетки должны сохраняться, а при диффузном интрузивном росте исчезать по всей поверхности клетки

Провели оценку частоты встречаемости плазмодесм (число плазмодесм на 1 мкм клеточной клетки) в волокнах на разных стадиях удлинения волокна (табл 1) На стадии координированного роста обнаружили плазмодесмы в клеточных стенках между волокнами и между волокнами и паренхимой. На стадии интрузивного роста плазмодесмы исчезают по всей поверхности клетки, что приводит к ее симпластической изоляции Это еще один аргумент в пользу того, что волокно растет всей поверхностью Существуют также данные о равномерном включении метки в клеточную стенку по всей длине интрузивно растущего волокна (А£ееуа е! а1, 2005), в отличие от клеток с концевым ростом, где включение вновь образующегося материала клеточной стенки осуществляется, в основном, в кончике клетки На основании совокупности представленных данных можно сделать вывод о том, что в ходе интрузивного удлинения волокно растет диффузно

Таблица 1 Частота встречаемости плазмодесм на стадиях координированного и интрузивного роста флоэмного волокна

Тип роста Клеточная стенка между клетками Длина клеточной стенки, мкм Число плазмодесм Частота встречаемости плазмодесм

Координированный Волокно-волокно 982 7 35 0 036

рост Волокно-пареихима 553 6 47 0 085

Интрузивный рост Волокно-волокно 703.6 0 0

Волокно-паренхима 502 2 0 0

2.3. Характеристика субклеточной организации волокон на стадии интрузивного роста

Субклеточная организация интрузивно растущего волокна, проанализированная нами, свидетельствует об активном метаболизме клетки (рис 4) В волокне активизируются хлоропласта на стадии интрузивного роста в них значительно сильнее развита система гран, чем при координированном росте, появляются крахмальные зерна Активизация фотосинтетического аппарата может быть связана с симпластической изоляцией и необходимостью в большей мере переходить на самообеспечение ассимилятами. В цитоплазме наблюдаются скопления митохондрий и активный шероховатый эндоплазматический ретикулум

Однако самой отличительной особенностью интрузивно растущих волокон является существенное возрастание числа ядер (рис 5), которое происходит за счет асинхронных делений Проанализировали число ядер в 36 волокнах различной длины (от 6 до 52 мм), предварительно убедившись в целостности клеток

Минимальное количество ядер в индивидуальной клетке было равно 29, максимальное - 175; средняя длина выделенных в этом эксперименте волокон составила 17±8 мм, число ядер в одной клетке - 77±29 штук. Такое количество ядер не имеет аналогов среди других типов клеток вегетативных органов растений. Его можно было бы объяснить необходимостью масштабной своевременной доставки

Рисунок 4. Продольный срез волокна льна-долгунца на стадии интрузивного роста. На фотографии представлены скопления митохондрий (MTX), хлоропласта (ХП), аппарат Гольджи (АГ), шероховатый эндоплазматический ретикулум (ШЭР). КС - клеточная стенка.

20 мкм

Рисунок 5. Группа ядер, окрашенных ОАР1, в интрузивно растущем волокне льна-долгунца.

транскритггов для обеспечения высокой скорости роста Однако известны другие типы клеток (трихомы, растущие протрузивно), достигающие сходной дины, но имеющие одно ядро (ЯуБег, 1999) В наших исследованиях между длиной волокон и числом ядер обнаружена положительная корреляция (г=+0 6), означающая, что связь между длиной волокон и количеством в них ядер все-таки существует Возможно, столь значительное количество ядер в индивидуальной клетке связано именно с интрузивным характером роста и необходимостью, например, интенсивного синтеза осмотически активных веществ для обеспечения повышенного тургорного давления в растущем волокне

2.4. Формирование пучков волокон

Ниже «точки слома», когда волокна перестают удлиняться и переходят к формированию вторичной клеточной стенки, на поперечном срезе стебля хорошо видны пучки волокон. Они разделены радиальными прослойками паренхимы, а с наружной стороны ограничены слоем клеток обкладки Число волокон в пучке на поперечном срезе может колебаться от 10 до 30, количество пучков на срезе - от 20 до 40 Таким образом, число волокон на поперечном срезе ниже «точки слома» обычно составляет - 600-700

В ходе исследований формирования пучков провели анализ последовательных поперечных срезов апикальной части стебля льна-долгунца Обнаружили, что на расстоянии 2 мм от апекса (рис 6 а), когда координированный рост завершен и начинается интрузивный, пучки волокон почти не визуализируются Видны лишь единичные интрузивно растущие волокна Слой клеток, который можно было бы идентифицировать как обкладку, отсутствует Но уже на расстоянии 15 мм от апекса волокна образуют пучки с хорошо заметными клетками обкладки (рис 6 б) В этой области число волокон на поперечном срезе уже составляет 80% от числа волокон на поперечном срезе ниже «точки слома» Это означает, что формирование пучков происходит именно в ходе интрузивного роста волокон, и что основная часть волокон удлиняется тогда, когда идет координированный рост окружающих тканей

Флоэмные волокна льна образуются из прокамбия (Эсау, 1943) Они возникают на границе листового примордия, затем прокамбий по мере дальнейшего роста распространяется к верхушке листового зачатка и вниз по стеблю При этом молодой прокамбиапьный пучок сливается с другими пучками, возникшими ранее, образуя непрерывную сеть Подобную анастомозную сеть формирует и первичная флоэма Так как волокна образуются из прокамбия, можно было предположить, что пучки флоэмных волокон также формируют похожую непрерывную сеть

Чтобы решить этот вопрос, использовали тангентальные срезы стебля выше «точки слома», а также отделенную от ксилемы волокнистую часть стебля ниже «точки слома» (рис 7) Проанализировали двадцать трёхсантиметровых отрезков волокнистой части стебля Обнаружили, что пучки волокон располагаются отдельно друг от друга, формируя «столбы», при этом клеточные анастомозы отсутствовали

Выросты индивидуальных волокон за пределы пучков не наблюдали; их наличие было бы неизбежно, если бы каждое волокно росло, самостоятельно прокладывая свой путь. Судя по полученным данным, волокна растут в тесной взаимосвязи друг с другом и используют при интрузивном проникновении пути, проложенные ранее удлинившимися волокнами.

(а) (б)

Рисунок 6. Поперечные срезы стебля льна-долгунца в области интрузивного роста волокон, а - 2 мм от апекса, б - 15 мм от апекса. Пунктиром на фото (б) обозначены волокна. + на фото (б) обозначены клетки обкладки.

•1 ' . I

. ■! Г .Зг; '

■Я

. £

яш

р I < I : 1 ?

шк

Г I

Рисунок 7. Пучки волокон, отделенные от ксилемы после мацерации стебля льна-долгунца и окрашенные СеПоЯиог.

2.5 Определение длины индивидуальных флоэмных волокон и расчет скорости их интрузивного удлинения

Для определения скорости роста индивидуальных клеток обычно измеряют под микроскопом их длину и оценивают ее изменения за определенные промежутки времени (Иванов, 1974) В случае волокон задача усложняется, поскольку измерить их длину становиться невозможным уже вскоре после начала интрузивного роста В связи с этим размеры этих клеток оценивали в конце онтогенеза растения, когда все волокна уже имеют хорошо сформированную клеточную стенку, становясь достаточно прочными, что делает возможным выделение индивидуальных неповрежденных волокон для репрезентативной выборки Установив в наших исследованиях среднюю длину волокон (20 мм), отрезок стебля, где интрузивный рост идет с высокой эффективностью (верхние 20 мм стебля) и скорость роста стебля (10 мм/сутки), можно рассчитать среднюю (формула 1) и относительную (формула 2) скорость (Иванов, 1974) интрузивного роста волокон

К началу интрузивного удлинения волокна имеют длину около 0 1мм - (/), которую они достигают за счет координированного с окружающими тканями роста Конечная длина клетки (I) составляет, в среднем, 20 мм Среднее время интрузивного роста {At) 48 часов Соответственно средняя скорость (формула 1) интрузивного роста волокон составляет V(cp)= (20-0 1)/48 =04 мм/ч

Относительная скорость роста по формуле (2) к= 1/48 *ln(20/0 1) = 0 11 час" ', эта цифра означает, что за час интрузивно растущее волокно удлиняется на 11% своей длины

Определить скорость удлинения волокон во время координированного роста пока не представляется возможным, поскольку неизвестна ни исходная длина клеток, ни время осуществления процесса Известно лишь, что он продолжается не более нескольких часов, а конечная длина клеток 100 мкм Можно предположить, что скорость координированного роста волокон такая же, как и для окружающих тканей и лежит в пределах величин, характерных для растущих клеток апикальной части двудольных растений, т е порядка 0 006 - 0 009 час 1 (Иванов, 1997)

2 6. Длина участка стебля до «точки слома» как индикатор длины флоэмных волокон

Нами установлено, что длина отрезков стебля от апекса до «точки слома» у разных генотипов рода Linum варьирует от 50 до 190 мм Этот показатель может быть связан с длиной формируемых волокон, поскольку интрузивный рост волокон льна осуществляется только выше «точки слома» (Gorshkova, 2003)

О) У(ср)=(1-1)/А(,

где Д1 - время роста клетки, / - начальная длина клетки, £ - конечная длина клетки,

1(1 +Л)

(2) к=1/М*1п

КО

где I -начальная длина клетки, А1 - время роста клетки, 1(1 Л1)- конечная длина клетки, / (I)- начальная длина клетки

Для проверки этого предположения провели анализ длин волокон в 25 образцах льна из коллекции ВИР, включавших представителей долгунцов и масличных культур вида L usitatissimum, а также два диких вида - L flavum, и L perenne Выделение неповрежденных интрузивно растущих волокон практически невозможно из-за тонкой клеточной стенки Для анализа длин волокон использовали отрезки стеблей растений на стадии желтой спелости, когда волокна сформировали вторичную клеточную стенку Этот отрезок по месторасположению соответствовал участку стебля от апекса до «точки слома», отмеченному в период быстрого роста Средняя длина волокон у долгунцов составила 24±2 мм, при средней длине отрезка стебля от апекса до «точки слома» -130±30 мм, тогда как у масличных сортов -18±2 мм и - 77±12 мм, соответственно

На рисунке 8 приведены графики распределения длин волокон льна-долгунца (сорт ВИР-9), масличного (сорт К3002) и дикого вида льна L flavum У льна-долгунца длина отрезка стебля до «точки слома» составляла 190±8 мм, средняя длина волокон - 27±13 мм, самое длинное волокно - 90 мм Доля волокон длиннее 35 мм составила 25% У масличного сорта длина отрезка стебля от апекса до «точки слома» составляла 65±5 мм, средняя длина волокон - 15±8 мм, самое длинное волокно - 74 мм Доля волокон длиннее 35 мм составила 7%, что в несколько раз меньше, чем у льна-долгунца Длина отрезка стебля от апекса до «точки слома» у L flavum составляла 58±10 мм, средняя длина волокон - 4±3 мм, самое длинное волокно - 30 мм

Во всех исследованных 25 образцах средняя длина волокон, а особенно, доля длинных волокон, положительно коррелировала с размером отрезка стебля от апекса до «точки слома» (г=+0 6 и г=+0 7 соответственно) Таким образом, положение на стебле «точки слома» может служить индикатором длины формирующихся волокон

2.7. Поиск метода для оценки интрузивного роста волокон in vitro п in situ

Исследования механизмов и регуляции интрузивного роста флоэмных волокон могло бы значительно продвинуться при постановке методов культивирования волокон Индивидуальные волокна можно было бы использовать для биохимических и молекулярно-генетических анализов К сожалению, воспроизвести интрузивный рост волокон in vitro пока никому не удалось С целью не воспроизвести, а поддержать интрузивный рост волокон, мы культивировали отрезки стебля льна, надеясь, что концы не задетых при срезании растущих интрузивно клеток появятся на поверхности среза стебля Варьировали многочисленные параметры культивирования Отрезки стебля растения в большинстве случаев не теряли тургор и вырастали, в среднем, на 1 см в сутки, однако, выросших волокон ни в одном варианте не обнаружили Мы предположили, что интрузивный рост чувствителен к стрессу и быстро останавливается при повреждении стебля, что получило подтверждение в дальнейших исследованиях с

%70 60 50 40 30 20 10

оЬ %70

60 50 40 30 -1 20 -! 10 о I

Долгунец (ВИР-9)

а 198±1

б 27±13

в 25

г И

д 90

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71 ...

Длина клетки (мм)

Масличный (К3002)

а 65±5

б 15±8

в 7

г 2

д 74

% 70 60 50 40 30 20 10 о

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 3 6-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71...

Длина клетки (мм)

Дикий (Ь. Аауит)

а 58±10

б 4±3

в 0

г 0

д 30

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71..

Длина клетки (мм)

Рисунок 8. Распределение длин индивидуальных волокон у различных генотипов рода Ыпит. В таблицах обозначены следующие параметры: а - средняя длина отрезка стебля от апекса до «точки слома» (мм), б - средняя длина волокон (мм), в - доля волокон длиннее 35 мм в %, г - доля волокон длиннее 50 мм в %, д -самое длинное волокно.

использованием метода ЯМР При интрузивном росте волокна внедряются между окружающими клетками, это значит, что число клеток на поперечном срезе должно увеличиваться Следовательно, интрузивный рост волокон можно оценить с помощью метода световой микроскопии, определяя число волокон на поперечном срезе стебля в ходе онтогенеза растения Именно с помощью этого метода в нашей лаборатории были охарактеризованы стадии развития волокна и установлено, что волокно растет интрузивно только до «точки слома» (Gorshkova et al, 2003) Но у этого метода есть недостатки низкая пропускная способность, длительность анализа, сложность идентификации волокон в области, где интрузивный рост наиболее интенсивен

Увеличение числа барьерных структур (клеточных стенок, мембран и т д) на поперечном срезе растения может быть охарактеризовано методом спинового эха ЯМР, который активно применяется для исследования транспорта воды в растительных объектах Этот метод, в сочетании с импульсным градиентом магнитного поля, позволяет регистрировать трансляционное диффузионное перемещение молекул Наличие в образце барьерных структур создает ограничения для диффузионного перемещения молекул воды, что отражается в изменениях формы и скорости диффузионного затухания эха Причем при минимально достижимом времени диффузии при анализе диффузионного затухания в диапазоне 2-3 порядков величины проявляется медленно затухающая компонента, обязанная ограничениям пристеночных молекул диффузанта При постоянном времени диффузии и прочих равных условиях доля медленной пристеночной компоненты увеличивается с ростом числа ограничивающих структур Эти соображения свидетельствуют о возможности использования метода ЯМР для оценки интрузивного роста волокон in situ

Сравнили динамику диффузионного затухания в участках стебля выше и ниже «точки слома» При этом использовали растения, срезанные существенно ниже «точки слома» Анализ кривых, характеризующих диффузионное затухание, для участка стебля выше «точки слома» (рис 9 3 а) показал последовательное увеличение доли медленной компоненты Ниже «точки слома» (рис 9 3 6) увеличение доли медленной компоненты отсутствовало Число волокон на поперечных срезах стебля в зоне интрузивного роста составило 514±9 и за сутки возросло до 640±8 (рис 9 2 а) Число волокон на поперечных срезах стебля ниже «точки слома» было равно 740±14 и не изменялось со временем (рис 9 2 6) По-видимому, увеличение доли медленной компоненты диффузионного затухания

Рисунок 9 (справа) Применение метода ЯМР для оценки интрузивного роста волокон in situ Измерение диффузионного затухания сигналов спинового эха проводили а, в, г - выше «точки слома», б - ниже «точки слома», при условии, что растения срезаны а, б, в - ниже «точки слома», г - выше «точки слома», V///A область измерения диффузионного затухания сигналов спинового эха и подсчета числа волокон на поперечном срезе стебля Цифрами на графиках (3) обозначена населенность медленной компоненты диффузионного затухания

1) Схема эксперимента

(а)

(б)

(в)

§51 Ш

"Точка слома"

2)Число волокон на поперечном срезе

(а) (б)

Начало'эксперимента | 514 ±9 740 ±14

Через сутки : 640 ±8 738 ±17

(г)

ЫаС1

(в) (г)

514 ±9 514+9

550 +12 522 ± 11

3)Графики диффузионного затухания сигналов спинового эха

(а)

■ Начало эксперимента • Череч 8 часов 4 Через сутки

0.095

ТТР ТТЛ "ИТ1 То1 ГЗСР 2 -г,2,- 2 й .Г /т

(В)

Начало эксперимента Череч сутки

0.050

0.039

20 30 40

2 2 1 й'М пГ

(б)

■ Начало эксперимента • Через 8 часов А Через сутки

0-058

0.051

а.

20 30 40

(Г)

■ Начало .-эксперимента • Череч сутки

:5! • . 0-025 ■ ' 11 | ,

0.025

20 30 40 50

2 -г2. 2 а Л -т

связано с возрастанием числа волокон на поперечном срезе стебля, поскольку оно отсутствовало в участке стебля, где волокна перестают интрузивно удлиняться Подобную закономерность мы наблюдали при любой длине исследуемого участка стебля (при условии, что он срезан ниже «точки слома»)

Для подтверждения связи между наличием интрузивного роста и ЯМР-характеристиками, использовали искусственное торможение удлинения волокон Для этого помещали отрезки стебля в раствор 1 М NaCl. Подобное воздействие резко снижало прирост числа волокон на поперечном срезе (рис 9 3 в), доля медленной компоненты практически не увеличивалась (рис 9 2 в) Совокупность полученных данных свидетельствует, что характер изменений медленной компоненты диффузионного затухания в ходе эксперимента совпадал с изменением числа волокон на поперечных срезах, а значит, метод ЯМР может быть использован для характеристики интрузивного роста волокон in situ

Отсутствие прироста со временем числа волокон на поперечном срезе стебля обнаружено и в том случае, когда стебель срезали в районе «точки слома» или выше (рис 9 2 г) При этом полностью исчезало и повышение доли медленной компоненты (рис 9 3 г) Важно отметить, что во всех представленных экспериментах отрезки стеблей, на которых проводили измерения, за сутки вырастали, в среднем, на 1 см Такая скорость роста характерна в наших условиях для интактных растений льна-долгунца Это означает, что в эксперименте, в котором стебель срезали в районе «точки слома» или выше, остановкой роста на механическое повреждение отвечают только волокна, тогда как остальные ткани отрезка стебля продолжают расти Интрузивный рост волокон реагировал не просто на поранение стебля (оно происходило и при срезании стебля ниже «точки слома», и при подготовки образца для анализа ЯМР, в ходе которой у отрезков стебля удаляли листья, задевая эпидермис стебля), а именно на повреждение интрузивно растущих волокон Таким образом, повреждение части интрузивно растущих волокон останавливает интрузивное удлинение волокон, расположенных на значительном расстоянии от места повреждения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе охарактеризован один из трех типов роста растительных клеток -интрузивный рост Для характеристики этого процесса были выбраны первичные флоэмные волокна льна-долгунца (Linum usitatissimum L) - клетки, достигающие за счет интрузивного роста длины в несколько сантиметров Сложности в изучении интрузивного роста волокон приводят к необходимости нетривиальных подходов даже для получения простейших характеристик, таких как скорость и продолжительность, локализация в стебле, соотношение с ростом сопредельных тканей, тип удлинения клетки и т д

Полученные данные свидетельствуют, что интрузивный ростфлоэмных волокон льна-долгунца инициируется раньше, чем заканчивается координированный рост

окружающих клеток, что предполагает персональную регуляцию скорости их роста Известно, что растяжение любой растительной клетки определяется дисбалансом между растяжимостью клеточной стенки и величиной тургорного давления (Cosgrove, 2005) Соответственно, увеличение размеров клетки может инициироваться как возрастанием тургорного давления, так и изменением свойств клеточной стенки Волокно расположено в толще других растущих тканей, в такой ситуации для клетки остается только одна возможность инициировать интрузивный рост - повысить тургорное давление Поэтому можно предположить, что ключевым процессом, инициирующим интрузивный рост волокон, служит накопление в них осмотика. Для установления его природы целесообразно попытаться точечно отбирать пробы из волокон и окружающих клеток для сопоставления их содержимого методами, позволяющими выявлять микроскопические количества таких потенциальных осмотиков как ионы и сахара Повышение тургора может быть связано и с увеличением проницаемости мембран для воды за счет, например, активной работой аквапоринов (Kjellbom, 2000, Tyerman, 2002) - еще одно из возможных направлений дальнейших исследований

Плодотворным подходом для изучения интрузивного роста может стать анализ профиля экспрессии генов с помощью микрочипов ДНК, хотя исследование интрузивного роста этим методом также сопряжено с рядом сложностей. Наиболее однозначно интерпретируются результаты в том случае, если выявляются изменение профиля экспрессии при запуске процесса Однако собрать в достаточном для выделения РНК количестве участки стебля, в которых волокна уже существуют, но еще не растут интрузивно, да еще отделить их от апикальной меристемы, практически невозможно, поскольку размер этого участка, согласно полученным в работе данным, менее 1 мм Можно попытаться выявить гены, содержание мРНК которых снижается при остановке интрузивного роста Подобный подход был предложен для изучения протрузивного удлинения волосков семян хлопчатника (Zhu et al, 2003, Wilkms et al, 2004) и недавно использован канадскими коллегами для выявления дифференциальной экспрессии генов на разных стадиях развития флоэмных волокон льна (Roach, Deyholos, 2007) Эти авторы использовали в своих исследованиях экспериментальную систему, разработанную в нашей лаборатории (Gorshkova et al, 2003), и провели сравнение профиля экспрессии генов в участках стебля льна, расположенных выше и ниже «точки слома» Полученные результаты представляют безусловный интерес, хотя анализ не затронул участка стебля, в котором, судя по нашим данным, интрузивный рост происходит наиболее интенсивно После установления полных нуклеотидных последовательностей генов, содержание мРНК которых в наибольшей степени снижается при остановке интрузивного удлинения волокон, можно будет связать эту информацию с рассуждениями о физиологических процессах, обеспечивающих интрузивный рост.

Исключительный интерес представляет изучения механизма и роли возрастания числа ядер в волокне Понимание механизма разобщения кариокинеза и цитокинеза

в растущих волокнах может существенно расширить представления об особенностях деления растительных клеток и его регуляции В интрузивно растущих волокнах льна при делении ядер выявлено образование на месте фрагмопласта неких вакуолеподобных структур, охарактеризованных пока только на уровне светового микроскопа (Ageeva et al, 2005)

Установленный диффузный характер удлинения волокна в ходе интрузивного роста позволяет сосредоточиться на анализе характерных для этого процесса механизмов Можно предполагать наличие в волокнах специфичных изоформ ферментов и белков, обеспечивающих растяжение клеточной стенки, например экспансинов и ксилоглюкантрансгликозилаз

Выявлена возникающая на стадии интрузивного роста симластическая изоляция волокон, которая должна приводить к особенностям их метаболизма и субклеточной организации Вместе с тем, при отсутствии плазмодесм, волокна хорошо "взаимодействуют" между собой в сериях экспериментов с использованием методов культивирования т vitro и ЯМР было обнаружено, что механическое повреждение части интрузивно растущих волокон останавливает интрузивное удлинение волокон, удаленных от места повреждения Вероятно, именно поэтому нам не удалось поддержать интрузивный рост волокон при культивировании отрезков стебля Такое поведение волокон свидетельствует, что должна существовать система передачи сигнала между этими клетками Природу сигнала можно пока лишь предполагать, но ясно, что он передается не по симпласту, так как, судя по нашим результатам, в ходе интрузивного роста волокна становятся симпластически изолированными

По полученным результатам составлена таблица, суммирующая характеристики волокон на стадии координированного и интрузивного роста (табл 2)

Таблица 2 Сопоставление характеристик волокон на стадии координированного и интрузивного роста

---_____Стадия Параметр Координированный рост Интрузивный рост

Положение на стебле 0 3-1 мм от апекса 1 мм от апекса -до «точки слома»

Продолжительность Менее суток 2-3 суток

Форма клетки Вытянутая с тупыми концами Вытянутая с заостренными концами

Длина клетки 0 1-0 2 мм 0 2-е 100 мм

Ширина клетки 4-7 мкм 7-20 мкм

Деление ядер Синхронное Асинхронное

Расположение микротрубочек Поперечное Поперечное Спиральное

Ориентация актиновых филаментов Продольная Продольная

Активность хлоропластов Неактивные Активные

Присутствие плазмодесм есть нет

ВЫВОДЫ

1) Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца инициируется раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих клеток, и продолжается у большинства волокон до конца области координированного растяжения тканей стебля, ниже этой области лишь доля волокон продолжает удлиняться до «точки слома»

2) Интрузивный рост флоэмных волокон льна осуществляется всей поверхностью клетки, о чем свидетельствуют, в частности, отсутствие зональности в расположении органелл и поперечная ориентация микротрубочек в кончике клетки

3) Плазмодесмы, присутствующие в клеточной стенке волокон льна на стадии координированного роста, в ходе интрузивного удлинения исчезают по всей поверхности клетки, что приводит к симпластической изоляции волокон.

4) На стадии интрузивного роста в волокнах резко возрастает количество ядер, число которых в индивидуальной клетке может достигать 175 Установлена положительная корреляция между длиной волокна и количеством ядер в клетке

5) Длина волокон у различных генотипов льна колеблется в диапазоне от 3 до 100 мм; существует положительная корреляция между средней длиной волокон, а особенно долей длинных волокон, и размером отрезка стебля от апекса до «точки слома»

6) Формирование пучков волокон происходит именно в ходе интрузивного роста Отсутствие выростов индивидуальных волокон за пределы пучков свидетельствует о том, что в ходе интрузивного роста волокна растут в тесной взаимосвязи друг с другом и используют при интрузивном проникновении пути, проложенные ранее удлинившимися волокнами

7) Метод ЯМР может быть использован для характеристики интрузивного роста волокон in situ Увеличение доли медленной компоненты диффузионного спада в ходе эксперимента связано с увеличением числа волокон на поперечных срезах

8) Механическое повреждение части интрузивно растущих волокон останавливает интрузивное удлинение других волокон, расположенных на значительном расстоянии от места повреждения, что позволяет предполагать наличие системы передачи сигнала между волокнами

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Стадии формирования лубяных волокон Linum usitatissimum L /ТА Горшкова, М В Агеева, В В Сальников, Н В Павленчева, A.B. Снегирева, Т Е Чернова, С Б Чемикосова//Бот журн -2003 - Т 88 -N 12 - С 1-11

2 Intrusive growth of flax phloem fibers is of intercalary type / Ageeva M V., Petrovská В , Kieft, H, Salnikov V V , Snegireva A.V., van Dam J E G, Emons, AMC, GorshkovaTA , van Lammeren A AM //Planta -2005 -V 222 -P 565-574

3 Использование метода ЯМР для характеристики интрузивного роста растительных волокон / A.B. Снегирёва, М В Агеева, В Н Воробьев, А В Анисимов, ТА Горшкова//Физиология растений -2006 -Т53 №2 - С 1-7

4 Ультраструктурная характеристика роста и развития лубяных волокон льна / М В Агеева, А В Снегирева, Т.Е. Чернова, Т А Горшкова // V Всероссийского съезда физиологов растений Сб тезисов - Пенза, 2003 - С. 369

5 Волокна склеренхимы стадии развития /ТЕ Чернова, А. В. Снегирева, М В Агеева, Т А Горшкова, А П Ситников // Материалы VIII Молодежной конференции ботаников - Санкт-Петербург, 2004 - С 114

6 Исследование волокон склеренхимы как предпосылка улучшения качества волокон льна /СБ Чемикосова, М В Агеева, В В Сальников, Н В Павленчева, Т.Е Чернова, A.B. Снегирева, ТА Горшкова // Материалы международной научно-практической конференции Вопросы улучшения качества льна-долгунца — Торжок,

2005 - С 20-32

7 Характеристика интрузивного роста флоэмных волокон льна-долгунца Liniim usitatissimum L / A.B. Снегирева, М В Агеева, В В Сальников, А В Анисимов, В Н Воробьев, Т А Горшкова // Материалы международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы Вопросы общей ботаники традиции и перспективы Сб тезисов 4 1 -Казань, 2006 - С 159

8 Диффузный характер удлинения флоэмных волокон льна-долгунца Linum usitatissimum L / A.B. Снегнре'ва, M В Агеева, В В Сальников, Т А Горшкова // Материалы 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников - Санкт-Петербург, 2006 -С 199

9 Использование метода ЯМР для характеристики интрузивного роста растительных волокон / A.B. Снегирёва, М В Агеева, А В Анисимов, В Н Воробьев, ТА Горшкова // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН Сб тезисов-г Пущино,

2006 -С 119

10 Биоэлектрическая составляющая сигнальных систем в координации развития растительных волокон / A.B. Снегирева, Т Е Чернова, А В Анисимов, В Н Воробьев, ТА Горшкова // Второй международный симпозиум Сигнальные системы клеток растений Роль в адаптации и иммунитете Сб тезисов - Казань, 2006 - С 207

11 Биогенез волокон склеренхимы /ТЕ Чернова, A.B. Снегирева, Н Е Мокшина, Т А Горшкова // Материалы годичного собрания физиологов растений -Ростов на Дону, 2006 - С 159-160

12 Интрузивный рост растительных волокон / A.B. Снегирева, MB Агеева, В В Сальников, Т А Горшкова, А В Анисимов, В Н Воробьев // Материалы VI съезда Общества физиологов растений России - Сыктывкар, 2007 -С 366

13 Биогенез растительных волокон /ТЕ Чернова, М В. Агеева, В В Сальников, A.B. Снегирева, С Б Чемикосова, О П Гурьянов, Т А Горшкова // Материалы VI съезда Общества физиологов растений России - Сыктывкар, 2007 - С 168

Отпечатано в ООО «Печатный двор» г Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф 207

Тел 272-74-S9, 541-76-41, S4I-76-S1 Лицензия ПДШ-0215 от 01 И 2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 23 OS 2008г Усл. пл 1,5 Заказ №К-6545 Тираж 150 экз Формат 60x841/16 Бумага офсетная. Печать -ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Снегирёва, Анастасия Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Типы роста растительных клеток.

1.2. Типы растительных клеток, растущих интрузивно.

1.2.1. Млечники.

1.2.2. Пыльцевая трубка.

1.2.3. Веретеновидные инициали камбия.

1.2.4. Элементы склеренхимы.

1.2.4.1. Склереиды.

1.2.4.2. Волокна.

1.3. Флоэмные волокна льна-долгунца как объект изучения 31 интрузивного роста.

1.4. Характеристика растяжения растительных клеток с помощью 36 методов молекулярной биологии.

1.4.1. Гены белков, которые могут принимать участие в 38 поддержании или повышении тургорного давления.

1.4.2. Гены белков, которые могут принимать участие в растяжении клеточной стенки.

1.4.3. Другие гены.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.1. Электронная микроскопия.

2.3. Флюоресцентная микроскопия.

2.4 Определение длины флоэмного волокна.

2.5. Культивирование отрезков стебля льна in vitro.

2.6. Подготовка растительного материала для метода ЯМР.

2.7. ЯМР.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Идентификация начала интрузивного роста флоэмных волокон.

3.2 Выявление типа удлинения клетки в ходе интрузивного роста флоэмных волокон льна.

3.2.1. Сопоставление ультраструктуры цитоплазмы кончика и срединной части флоэмного волокна.

3.2.2 Оценка встречаемости плазмодесм в волокнах на разных стадиях роста.

3.3. Характеристика субклеточной организации волокон на стадии 65 интрузивного роста.

3.4 Формирование пучков волокон.

3.5 Определение длины индивидуальных флоэмных волокон и расчет 78 скорости интрузивного удлинения.

3.6 Длина участка стебля до «точки слома» как индикатор длины 81 флоэмных волокон.

3.7 Поиск метода для оценки интрузивного роста волокон in vitro и in vivo.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (Linum usitatissimum L.)"

Постановка проблемы и ее актуальность

Рост растительных клеток разделяют на координированный, протрузивный и интрузивный. При интрузивном росте растущая клетка опережает рост клеток окружающих тканей и внедряется между ними по срединной пластинке (Эсау, 1980; Fahn, 1990; Лотова, 2001), Интрузивный рост характерен для клеток нескольких растительных тканей; при этом классическим примером служат волокна. Волокно, в ботаническом понимании, - индивидуальная клетка, элемент склеренхимы - наиболее распространенного типа механической ткани вегетативных органов сосудистых растений. Особое развитие волокна получают в лубоволокнистых и древесных культурах.

Для исследования интрузивного роста логично выбрать объект, в котором этот процесс наиболее выражен. К числу таких относятся флоэмные волокна льна (Linum usitatissimum L.). Временная и пространственная локализация стадий развития этих клеток легко определяется на стебле льна благодаря существованию «точки слома» - индикатора завершения интрузивного роста волокон и перехода к последующим стадиям дифференцировки (Горшкова с соавт., 2003; Gorshkova et al., 2003). Флоэмные волокна льна собраны в пучки и расположены вдоль всего длинного и тонкого стебля растения. Лен является классическим объектом для изучения формирования волокон, на его примере, в основном, сформированы представления о развитии этих клеток (Эсау, 1980). Тем не менее, к началу наших работ, об интрузивном росте флоэмных волокон льна было лишь известно, что он существует, и что этот процесс завершается выше «точки слома».

Цель и задачи исследований. Целью представляемой работы являлась характеристика интрузивного роста флоэмных волокон льна-долгунца. Были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать начало интрузивного роста флоэмных волокон.

2. Выявить тип удлинения флоэмного волокна (апикальный или диффузный).

3. Проанализировать субклеточную организацию волокон на стадии интрузивного роста.

4. Охарактеризовать формирование пучков в ходе интрузивного роста волокон.

5. Подобрать метод оценки интрузивного роста волокон in situ.

Научная новизна работы

В работе охарактеризован интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (L. usitatissimum L.). Впервые установлено, что интрузивный рост волокон начинается раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих тканей, и продолжается несколько дней. За это время б индивидуальная клетка достигает длины до 10 см. Охарактеризована субклеточная организация клетки на стадии интрузивного роста. Обнаружено, что число ядер в индивидуальном волокне составляет несколько десятков и положительно коррелирует (г=+0.6) с длиной клетки. Впервые получены данные о симпластической изоляции волокон на этой стадии удлинения. Впервые установлено, что волокна удлиняются всей поверхностью, а не кончиком, как предполагалось в ранних работах. Показано, что именно в ходе интрузивного роста происходит формирование пучков волокон. Впервые установлено, что увеличение числа волокон в ходе интрузивного роста можно охарактеризовать in situ с помощью метода ЯМР по увеличению доли медленной компоненты диффузионного затухания сигналов спинового эха.

Практическая ценность работы

Практическая значимость работы во многом определяется тем, что исследования проведены на хозяйственно ценной культуре — льне-долгунце. Использование и дальнейшее усовершенствование разработанных представлений и методов позволят целенаправленно изменять свойства и качество технического волокна. Полученные данные о положительной корреляции между длиной волокна и отрезком стебля от апекса до «точки слома» могут использоваться селекционерами для экспресс оценки длины формирующихся волокон. Материалы по характеристике особого типа роста растительных клеток (интрузивный рост) могут быть использованы в лекционных курсах в университетах, академических институтах и других научных заведениях.

Связь работы с научными программами

Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 0120.0 408625); частично поддержаны грантами РФФИ № 05-04-48906; 06-04-48853; 06-04-81049; № 08-04-00845 а также грантом Фонда содействия отечественной науке «Лучшие аспиранты РАН» -2008. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на V съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); VIII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004); на Международной научно-практической конференции (Торжок, 2004); на Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006); на I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); на II Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006); на годичном собрании Общества физиологов растений России и конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006); на VI съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007); на конференциях молодых ученых КИББ КазНЦ РАН (2003, 2004, 2005); на итоговой конференции КИББ КазНЦ РАН (2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Благодарности

Огромное спасибо моему научному руководителю д.б.н. Татьяне Анатольевне Горшковой за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку. Выражаю благодарность за методическую помощь сотрудникам лаборатории механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН д.б.н. Вадиму Владимировичу Сальникову и к.б.н. Марине Вячеславовне Агеевой (электронно-микроскопический анализ), сотрудникам лаборатории биофизики транспортных процессов д.ф.-м.н. Александру Васильевичу Анисимову и к.б.н. Владимиру Николаевичу Воробьёву (ЯМР анализ). Благодарность приношу сотрудникам ВИР им Н.И. Вавилова (группе под руководством д.б.н. Н.Б. Брач) за предоставление образцов коллекции генотипов льна.

Приношу благодарность всем сотрудникам и аспирантам лаборатории механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН за теплую рабочую атмосферу.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 6 таблиц и 38 рисунков. Список литературы включает 178 источников, в том числе 32 - отечественных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Снегирёва, Анастасия Вячеславовна

ВЫВОДЫ

1) Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца инициируется раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих клеток, и продолжается у большинства волокон до конца области координированного растяжения тканей стебля; ниже этой области лишь доля волокон продолжает удлиняться до «точки слома».

4) На стадии интрузивного роста в волокнах резко возрастает количество ядер, число которых в индивидуальной клетке может достигать 175. Установлена положительная корреляция между длиной волокна и количеством ядер в клетке.

6) Формирование пучков волокон происходит именно в ходе интрузивного роста. Отсутствие выростов индивидуальных волокон за пределы пучков свидетельствует о том, что в ходе интрузивного роста волокна растут в тесной взаимосвязи друг с другом и используют при интрузивном проникновении пути, проложенные ранее удлинившимися волокнами.

7) Метод ЯМР может быть использован для характеристики интрузивного роста волокон in situ. Увеличение доли медленной компоненты диффузионного спада в ходе эксперимента связано с увеличением числа волокон на поперечных срезах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе охарактеризован один из трёх типов роста растительных клеток — интрузивный рост. Для характеристики этого процесса были выбраны первичные флоэмные волокна льна-долгунца (Ыпит шНаШятит Ь.) - клетки, достигающие за счет интрузивного роста длины в несколько сантиметров. Сложности в изучении интрузивного роста волокон приводят к необходимости нетривиальных подходов даже для получения простейших характеристик, таких как скорость и продолжительность, локализация в стебле, соотношение с ростом сопредельных тканей, тип удлинения клетки и т.д.

Полученные данные свидетельствуют, что интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца инициируется раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих клеток, что предполагает персональную регуляцию скорости их роста. Известно, что растяжение любой растительной клетки определяется дисбалансом между растяжимостью клеточной стенки и величиной тургорного давления (Соз§гоуе, 2005). Соответственно, увеличение размеров клетки может инициироваться как возрастанием тургорного давления, так и изменением свойств клеточной стенки. Волокно расположено в толще других растущих тканей; в такой ситуации для клетки остается только одна возможность инициировать интрузивный рост - повысить тургорное давление. Поэтому можно предположить, что ключевым процессом, инициирующим интрузивный рост волокон, служит накопление в них осмотика. Для установления его природы целесообразно попытаться точечно отбирать пробы из волокон и окружающих клеток для сопоставления их содержимого методами, позволяющими выявлять микроскопические количества таких потенциальных осмотиков как ионы и сахара. Повышение тургора может быть связано и с увеличением проницаемости мембран для воды за счет, например, активной работой аквапоринов (К]е11Ьот, 2000; Туегтап, 2002) — еще одно из возможных направлений дальнейших исследований.

Wilkins et al., 2004) и недавно использован канадскими коллегами для выявления дифференциальной экспрессии генов на разных стадиях развития флоэмных волокон льна (Roach, Deyholos, 2007). Эти авторы использовали в своих исследованиях экспериментальную систему, разработанную в нашей лаборатории (Gorshkova et al., 2003), и провели сравнение профиля экспрессии генов в участках стебля льна, расположенных выше и ниже «точки слома». Полученные результаты представляют безусловный интерес; хотя анализ не затронул участка стебля, в котором, судя по нашим данным, интрузивный рост происходит наиболее интенсивно. После установления полных нуклеотидных последовательностей генов, содержание мРНК которых в наибольшей степени снижается при остановке интрузивного удлинения волокон, можно будет связать эту информацию с рассуждениями о физиологических процессах, обеспечивающих интрузивный рост.

Исключительный интерес представляет изучения механизма и роли возрастания числа ядер в волокне. Понимание механизма разобщения кариокинеза и цитокинеза в растущих волокнах может существенно расширить представления об особенностях деления растительных клеток и его регуляции. В интрузивно растущих волокнах льна при делении ядер выявлено образование на месте фрагмопласта неких вакуолеподобных структур, охарактеризованных пока только на уровне светового микроскопа (Ageeva et al., 2005).

Установленный диффузный характер удлинения волокна в ходе интрузивного роста позволяет сосредоточиться на анализе характерных для этого процесса механизмов. Можно предполагать наличие в волокнах специфичных изоформ ферментов и белков, обеспечивающих растяжение f клеточной стенки, например экспансинов и ксилоглюкантрансгликозилаз.

Выявлена возникающая на стадии интрузивного роста симластическая изоляция волокон, которая должна приводить к особенностям их метаболизма и субклеточной организации. Вместе с тем, при отсутствии плазмодесм, волокна хорошо "взаимодействуют" между собой: в сериях экспериментов с использованием методов культивирования in vitro и ЯМР было обнаружено, что механическое повреждение части интрузивно растущих волокон останавливает интрузивное удлинение волокон, удаленных от места повреждения. Вероятно, именно поэтому нам не удалось поддержать интрузивный рост волокон при культивировании отрезков стебля. Такое поведение волокон свидетельствует, что должна существовать система передачи сигнала между этими клетками. Природу сигнала можно пока лишь предполагать, но ясно, что он передаётся не по симпласту, так как, судя по нашим результатам, в ходе интрузивного роста волокна становятся симпластически изолированными.

По полученным результатам составлена таблица, суммирующая характеристики волокон на стадии координированного и интрузивного роста (табл. 2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Снегирёва, Анастасия Вячеславовна, Казань

1. Атлас ультраструктуры растительных тканей /Васильев А.Е.; Под редакцией Даниловой М.Ф., Кобузова Г.М. -Петрозаводск. 1980. -456 с.

2. Ботаника. Анатомия и морфология растений /А.Е. Васильев, Н.С. Воронин, А.Г. Еленевский, Т.И. Серебрякова. М.: Просвещение, 1978. -478 с.

3. Стадии формирования лубяных волокон Linum usitatissimum L. / Т.А. Горшкова, M.B. Агеева, B.B. Сальников и др. // Бот. журн. 2003. - Т. 88, № 12.-С.1-11.

4. Лен / Горшкова, Т.А. // Частная физиология полевых культур; Под ред. Е.И. Кошкина / Т.А. Горшкова, A.A. Жученко, С.Б. Чемикосова и др. — М.: Колосс, 2005. 344 с.

5. Горшкова, Т.А. Растительная клеточная стенка как динамичная система /Т.А. Горшкова. —М.: Наука, 2007. 426 с.

6. Дьяконов, А.П. К материалам по изучению конопляного стебля / А.П. Дьяконов //Научно-агрономический журнал. 1927.- № 1. - С.34-37.

7. Жуковский, П.М. Ботаника / П.М. Жуковский. — М.: Колос, 1982. -623 с.

8. Иванов, В.Б. Клеточные основы роста растений /В.Б. Иванов. М.: Наука, 1974.-222с.

9. Иванов В.Б. Является ли барьерная функция эндодермы единственной причиной устойчивости ветвления корней к солям тяжелых металлов /В.Б. Иванов, ИВ. Серёгин // Физиология растений. -1997. ~Т. 44. -С. 916-922.

10. Конопля; Под ред. П.Ф. Панченко, A.C. Хренникова, H.H. Гришко. — М.: Сельхозгиз, 1938. С.5-3 7.

11. Jlomoea, Л.И. Морфология и анатомия высших растений / Л.И. Лотова. -М. : Эдиториал УРСС, 2001. 526 с.

12. Магитт, М.С. Основы технической анатомии лубяных культур / М.СМагитт. -М.: Сельхозгиз, 1948. 96 с.

13. Обручева H.B. Физиология растущих клеток корня /Н. В. Обручева. М.: Наука. -1965. -111с.

14. Ордина, H.A. Структура лубоволокнистых растений и ее изменение в процессе переработки / H.A. Ордина. М.: Легкая индустрия, 1978.-127 с.

15. Полевой, В.В. Физиология роста и развития растений / В.В. Полевой, Т.С. Саламатова. -JI.: Изд-во Ленинграгр. Ун-та, 1991. —238 с.

16. Полевой В.В. Физиология растений/ В.В. Полевой М.: Высшая школа. -1989. - 464.

17. Раздорский В.Ф. Анатомия растепий/В.Ф. Раздорский. М.: Советская наука, 1949. -524 с.

18. Рейв П. Современная ботаника: В 2 т.: Пер. с англУ77. Рейвн, Р. Эверт, С. Айкхорн.-М.: Мир, 1990. Т.1. 458 с.

19. Сабинин Д.А. Физиология развития растений/Д.А. Сабинин. М.: Академия наук СССР. -1963. -196 с.

20. Ультраструктурный анализ лубяных волокон / В.В. Сальников, М.В. Агеева, В.Н. Юмашев, В.В. Лозовая // Физиология растений. 1993. - Т. 40, № 3. . С.458-464.

21. Ботаник с основами фитоценологии:. Анатомия и морфология растений / Т.П. Серебрякова, Н.С. Воронин, А.Г. Еленевский и др. — М.: Академкнига, 2007. 543 с.

22. Сизов И.А. Лен /И.А. Сизов. Л.: Сельхозгиз, 1955. - 255 с.

23. Словарь ботанических терминов; Под общ. ред. Дудки И. А. — Киев: Наукова думка, 1984. 308 с.

24. Труша М.М. Лен-долгунец/М.М. Труша. М.: Колос,1976. - 352 с.

25. Тутаюк, В.Х. Анатомия и морфология растений / В.Х. Тутаюк. — М.: Высшая школа, 1980. 317 с.

26. Хржановский, В.Г. Курс общей ботаники / В.Г. Хржановский. — М.: Высшая школа, 1982. с. 384.

27. Чернова Т.Е. Биогенез растительных волокон/Т.Е. Чернова, Т.А. Горшкова// Онтогенез. -2007. Т. 38. - С. 1-14.

28. Рост и развитие растений. /Чуб В.В./ Физиология растений Под ред. И.П. Ермакова. /В.В. Чуб/М.: Академия, 2005. - 640 с.

29. Шапигузое А.Ю. Аквопорины: строение, систематика и особенности регуляции. /А.Ю. Шапигузое// Физиология растений. -2004. —Т. 51(1). -С. 142-152.

30. Эсау, К. Анатомия растений: Пер. с анг. /К. Эсау. М.: Мир, 1969. -564 с.

31. Эсау, К. Анатомия семенных растений: В 2 т: Пер. с анг. / К Эзау. -М.: Мир, 1980. -2 т. с. 558.

32. Принципы строения стебля лубоволокнистых текстильных растений и методы его изучения / Яковлев М. С. Александров В.Г., Абесадзе К. Ю., Насонов В. А. // Тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1932. -Т. 3. С. 49-74.

33. Intrusive growth of flax phloem fibers is of intercalary type / M. V. Ageeva, B. Petrovska, H. Kiefietal. //Planta. 2005. - Vol. 222. - P.565-574.

34. Aldaba, V.C. The structure and development of the cell wall in plants I. Bast fibers of Boehmeria and Linum / V.C. Aldaba // Amer. J. Bot. 1927. - Vol. 14. -P. 16-22.

35. Aloni, R. Role of auxin and gibberellin in differentiation of primary phloem fibers / R. Aloni // Plant Physiol. 1979. - Vol. 63. - P.609-614.

36. Anderson, D.B. A microchemical study of the structure and development of flax fibers/D.B. Anderson //Amer. J. Bot. 1927. - Vol. 14, № 1. - P. 187-211.

37. Allen R.D. Cytochemical localisation of pectinase activity in laticifers of Nerium oleander L. /R.D.Allen, C.L.Nessler //Protoplasma.- 1984. -Vol. 119. -P. 74-78.

38. Arzee T. Morphology and ontogeny of foliar sclereids in Olea europaea II. Ontogeny./ T. Arzee //American Journal of Botany. -1953. -Vol. 40. -P. 745-152.

39. Bailey I.W. The cambium and its derivative tissues: II, Size variation of cambial initials in gymnosperms and angiosperms/1. W. Bailey // Am. J. Bot. -1920 a, -Vol. 7. -P. 355-367.

40. Bailey I.W. The cambium and its derivative tissues: III, A reconnaissance of cytologicalphenomena in the cambium/I.W. Bailey //Am. J. Bot. -1920 6. -Vol. 7. -P. 417-434.

41. Bailey I. W. The formation of cell plate in the cambium of the higher plants/ I.W. Bailey//Proc. Natn. Acad. Sci. -1920 e. -Vol. 6. -P. 197-200.

42. Bailey I.W. The cambium and its derivative tissues: IV, The increase in girth of the cambium/I.W. Bailey//Am. J. Bot. -1923. -Vol. 10. -P. 499-509.

43. Bailey I.W. The cambium and its derivative tissues: V, A reconnaissance of the vacuole in living cells. /I.W. Bailey // Z. Zellforsch. mikrosk. Anat. -1930. -Vol. 10. -P. 651-682

44. AA.Baskin T. I. Anisotropic Expansion of the Plant Cell Wall / T. I. Baskin// Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -2005. -Vol. 21. -P. 203-222.

45. Bannan M. W. The elongation of fusiform cambial cells in Chamaecyparis L. / M.W. Bannan, B.E. Whalley// Canad. Jour. Res. Sect. C., Bot. Sci. 1950. -Vol. 28. -P. 341-355.

46. Bannan M. W. The elongation of fusiform cambial cells in Thuja occidentalis LJ M.W. Bannan// Canad. Jour. Bot. . 1956. —Vol. 34. —P. 175-196.

47. De Bary A. Vergleichende Anatomie der Vegetationsorgane der Phanerogamen und Farne. /De Bary A.//Engelmann, Leipzig. -1877.

48. Baluska F. Actin-based motility of endosomes is linked to the polar tip growth of root hairs/ F. Baluska, B. Voigta, A. C.J. Timmersa // European Journal of Cell Biology. 2005. -Vol. 84. -P. 609-621

49. Becker J.D. Transcriptional profiling of Arabidopsis tissues reveals the unique characteristics of the pollen transcriptome / J.D. Becker, L.C. Boavida, J. Carneiro et al. //Plant Physiol. 2003. Vol. 133. № 2. - P. 713-725.

50. Bibikova T.N. Microtubules regulate tip growth and orientation in root hairs of Arabidopsis thaliana/ T.N. Bibikova //Plant J. -1999. -Vol. 17. -P. 657665.

51. Blyth, A. Origin of primary extraxylary stem fibers in dicotyledons / A. Blyth // Univer. California Publ. Bot. 1958. - Vol. 30. - P. 145-232.

52. Block R. Differentiation and pattern in Monstera deliciosa. The idioblastic development of the trichosclereids in the air root. /Bloch R.// American Journal of Botany. 1946. -Vol. 33. -P. 544-551.

53. Bosch M. Pectin methylesterase, a regulator of pollen tube growth / M.Bosch, A.Y. Cheung, P.K. Hepler // Plant Physiol. -2005. -Vol. 138. -P. 13341346.

54. Boyd D. W. Sclereid development in Camellia petioles /Boyd DW, Harris WM, Murry LE.// American Journal of Botany -1982. -Vol. 69. -P. 339-347.

55. Clark G.B. Annexins of plant cells. /G.B. Clark, S.J. Roux//Plant Physiol. -1995. -Vol. 109. -P. 1133-1139.

56. Chaffey, N. A cytoskeletal basis for wood formation in angiosperm trees: the involvement of cortical microtubules / N. Chaffey, J. Barnett, P. Barlow // Planta. 1999. - Vol. 208. - P. 19-30.

57. Cheung A. Y. Polarized cell growth in higher plants / A. Y. Cheung, P.K. Hepler, L. Vidali//Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2001. -Vol. 17. -P. 159-187.

58. Chen C.Y. The regulation of actin organization by actin-depolymerizing factor in elongating pollen tubes/ C.Y. Chen, E.I. Wong // Plant cell. 2002. -Vol. 14. -P. 2175-2190.

59. Cheung A.Y. Characterization of cDNAs for stylar transmitting tissue-specific proline-rich proteins in tobacco / A. Y. Cheung, B. May, E. Kawata, Q. Gu, H. Wu//Plant J 1993. -Vol. 3. -P. 151-160.

60. Cosgrove D.J. Water uptake by growing cells: an assessment of the controlling roles of wall relaxation, solute uptake and hydraulic conductance / D.J. Cosgrove//Int. J. PlantSci. -1993. -Vol. 154. -P. 10-21.

61. Cosgrove D.J. Wall structure and wall loosening. A look backwards and forwards / D.J. Cosgrove//Plant Physiol. -2001. Vol. 125. -P. 131-134.

62. Cosgrove D. J. Enzymes and other agents that enchance cell wall extensibility /D.J. Cosgrove // Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1999. -Vol. 50. -P. 391-417.

63. Cosgrove D. J. New genes and biological roles for expansins /D.J. Cosgrove //Plant Biol. -2000. Vol. 3. - P. 73-78.

64. Cosgrove D.J. Growth of the plant cell wall. /D.J. Cosgrove // Nature Rev Mol Cell Biol. -2005. -Vol. 6. -P. 850-861.

65. Davies J.M. Annexins: multifunctional components of growth and adaptation. /J.M. Davis, J.C. Mortimer, A. Laohavisit et al.// J. Exp. Bot. 2008. ~ Vol. 10.

66. Demura T. Molecular cloning and characterization of cDNAs associated with tracheary element diVerentiation in cultured Zinnia cells. / T. Demura, H. Fukuda//Plant Physiol. 1993. -Vol. 103. -P. 815-821.

67. Doblin M.S. Cellulose biosynthesis in plants: from genes to rosettes./ M.S. Doblin, I. Kurek, D. Jacob-Wilk, D.P. Delmer//Plant Cell Physiol. . 2000. -Vol.43. -P. 1407-1420.

68. Emons A.M. The cytoskeleton in plant and fungal cell tip growth/ A.M. Emons//J.Microsc. -2000. -Vol 198. -P. 218-245.

69. Esau, K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. I. The procambium /K. Esau//Amer. J. Bot. 1942. - Vol. 29. - P. 738-747.

70. Esau, K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. II. The first phloem andxylem / K. Esau // Amer. J. Bot. 1943 a. - Vol. 30. - P.248-255.

71. Esau, K. Vascular differentiation in the vegetative shoot of Linum. III. The origin of bast fibers / K. Esau //Amer. J. Bot. 1943 b. - Vol. 30. - P.579-586.

72. Esau, K. Plant anatomy /K. Esau. — New York: John Wiley & Sons Inc.; London: Chapman & Hall, Ltd, 1953. 733 p.

73. Fahn, A. Plant Anatomy / A. Fahn. — Oxford: Pergamon Press., 1990. -587p.

74. Feijo J.A. Growing pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a growth-dependent acidic tip / J.A. Feijo, J. Sainhas, G.R. Hackett //J. Cell Biol. 1999. -Vol. 144. -P. 483-496.

75. Feijo J.A. Cellular oscillations and the regulation of growth: The pollen tube paradigm / J.A. Feijo, J. Sainhas, T. Holdaway-Clarke, M.S. Cordiero// BioEssays. -2001. -Vol. 23. -P. 86-94.

76. Feijo J.A. Transcriptional profiling of Arabidopsis tissues reveals the unique characteristics of the pollen transcriptome / Feijo J.A., Becker J.D., Boavida L.C., Carneiro J., Haury M. //Plant Physiology. 2003. -Vol. 133. -P. 713-725.

77. Foster A.S. Origin and development of sclereids in the foliage leaf of Trochodendron aralioides Sieb. & Zucc ,/A.S. Foster // American Journal of Botany 1945. -Vol. 32. -P. 456-468.

78. Frankling-Tong V.E. Signaling and modulation of pollen tube growth/ V.E. Frankling-Tong//The Plant Cell. -1999. -Vol. 11. -P. 727-738.

79. Gaudet J. Ontogeny of the foliar sclereids in Nymphaea odorata/ J Gaudet. // American Journal of Botany. 1960. -Vol. 47. —P. 525-532.

80. The rheological properties of the pollen tube cell wall. / A. Geitmann / Sexual plant reproduction and biotechnological applications / A. Geitmann, M. Cresti, G. Cai // Springer Verlag. -1999. -P. 283-302.

81. Gepstein S. Differential expression of growth-related genes in the elongation zone of maize primary roots/ S. Gepstein, M. Bassani, P.M.Neumann // Plant Molecular Biology. 2004. -Vol. 56. -P. 367-380.

82. Goosen-de Roo L. Microfilament bundles assotiated with tubular endoplasmic reticulum in fusiform cells in the active cambial zone of Fraxinus excelsior L. / L. Goosen-de Roo, P.D. Burggraaf, ICR. Libbenga // Protoplasma, -1983, -Vol. 116. -P. 204-208.

83. Cell-wall polysaccharides of developing flax plants / T.A. Gorshkova, S.E. Wyatt, V. V. Salnikov et al. //Plant. Physiol. -1996. Vol 110, №2.- P. 721-729.

84. Snap point: a transient point in Linum usitatissimum bast fiber development / T.A. Gorshkova, V. V. Salnikov, S.B. Chemikosova et al. // Ind. Crops and Products. 2003. - Vol. 18. - P. 213-221.

85. Tissue-specific processes during cell wall formation in flax fiber / T.A. Gorshkova, M. Ageeva, S. Chemikosova, V. Salnikov // Plant Biosystems. 2005. -Vol. 139, № 1. - P. 88-92.

86. Gritsch, C.S. Ultrastructure of fibre and parenchyma cell walls during early stages of culm development in Dendrocalamus asper / C.S. Gritsch, R.J. Murphy //Ann. Bot. 2005. - Vol. 95. - P.619-629.

87. Heide-Jorgensen H.S. Xeromorphic leaves of Hakea suaveolens R. Br. IV. Ontogeny, structure and function of the sclereids / H.S. Heide-Jorgensen // Australian Journal of Botany. 1990. -Vol. 38. -P. 35-43.

88. Hirschi K.D. Genetic manipulation of vacuolar proton pumps and transporters. / K.D. Hirschi, R.A. Gaxiola, G.R. Fink// Plant Physiology. 2002. -Vol. 129. -P. 967-973.

89. Honys D. Comparative analysis of the Arabidopsis pollen transcriptome / D. Honys, D. Twell//Plant Physiol. -2003. -Vol 132. -P. 640-652.

90. Holdaway-Clarke T.L. Pollen tube growth and the intracellular cytosolic calcium gradient oscillate in phase while extracellular calcium influx is delayed / T.L. Holdaway-Clarke, J.A. Feijo, P.IC. Hepler // Plant Cell 1997. -Vol. 9. -P. 1999-2010.

91. Inouhe M. Inhibition of auxin-induced cell elongation of Maize coleoptiles by antibodies specific for cell wall glucanases / M. Inouhe, D.J. Nevins / /Plant Physiol. -1991. -Vol. 96. -P. 426-431.

92. Ketelaar T. Unstable F-actin specifies the area and microtubule direction of cell expansion in Arabidopsis root hairs/ T. Ketelaar, A.M. Emons //Plant Cell. -2003. -Vol 15. -P. 285-292.

93. Keller E. Expansins in growing tomato leaves /E. Keller, D.J. Cosgrove // Plant J. -1995. -Vol 8. -P. 795-802.

94. Kjellbom P. An abundant TIP expressed in mature highly vacuolated cells. / P. Kjellbom, M. Karlsson, I. Johansson et al.// The Plant J. -2000. -Vol. 21(1). -P. 83-90.

95. Ko J.-H. Plant body weight-induced secondary growth in Arabidopsis and Its transcription phenotype revealed by whole-transcriptome profiling / J.-H. Ko, K.-H. Han, S. Park, J. Yang//Plant Physiol. 2004. - Vol. 135. - P. 1069-1083.

96. Kohorn B.D. An Arabidopsis cell wall-associated kinase required for invertase activity and cell growth. / B.D. Kohorn, Masaru Kobayashi, S. Johansen etaU/The plant journal. -2006. -Vol. 46. -P. 307-316.

97. Kundu, B.C. Origin and development of fibres in Ramie (Boehmeria nivea Gaud.) / B.C. Kundu, S. Sen // Proc. Nat Inst. Sci. (India). 1960. - Vol. 26. -P. 190-198.

98. Lam, T. B. T. Structural characteristics of cell walls of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) and fixation of carbon dioxide / T. B. T. Lam, H. Keko, K. Iiyama // J. Wood Sci. 2003. - Vol. 49. -P.255-261

99. Lee, K. B. Ultrastructure and development of nonarticulated laticifers in seedlings of Euphorbia maculate L. / K. B. Lee, P. G. Mahlberg // J. Plant Biol. -1999. Vol 42, № 1. - P.57-62.

100. Lev-Yadun, S. Fibres andfibre-sclereids in wild-type Arabidopsis thaliana /S. Lev-Yadun //Ann. Bot. -1997. Vol. 80. - P. 125-129.

101. Lev-Yadun, S. Intrusive growth — the plant analog of dendrite and axon growth in animals /S. Lev-Yadun //New Phytologist. 2001. - Vol. 150. - P.508-512.

102. Lind J.L. A style-specific 120 kDa glycoprotein enters pollen tubes of Nicotiana alata in vivo / J.L. Lind, I. Bonig, A.E. Clarke. // Sexual Plant Reprod. -1996. -Vol. 9. -P. 75-86.

103. Li Z.C. An oat coleoptile wall protein that induces wall extension in vitro and that is antigenically related to a similar protein from cucumber hypocotyls / Z.C. Li, D.M. Durachko, D.J. Cosgrove //Planta. -1993. -Vol. 191. -P. 349-356.

104. Lockhart J.A. An analysis of irreversible plant cell elongation. /Lockhart J.A .//J. Theoret. Biol. -1965. -Vol. 8. -P. 264-275.

105. Mahlberg P.G. Development of non-articulated laticifers in proliferated embryos of Euphorbia marginata Pursh. / P.G. Mahlberg // Phytomorphology. -1959. -Vol. 9. -P. 156-162.

106. Mahlberg P.G. Embryogeny and histogenesis in Nerium oleander: Origin and development of the non-articulated laticifers. / P.G. Mahlberg / /Am. J. Bot. -1961. -Vol. 48. -P. 90-99.

107. Mahlberg P.G. Development of non-articulated laticifers in seedling axis of Nerium oleander/ P.G. Mahlberg // Botanical Gazette. 1963. -Vol. 124. -P. 224231.

108. Malho R. Expanding tip growth theory/ Malho R. // Trend Plant Sci. -2000a. -Vol. 3. -P. 40-42.

109. Malho R. Signaling pathways in pollen tube growth and reorientation. / R. Malho, A. Moutinho, L. Camach //Annals of Botany. 20006. -Vol. 85. -P. 59-68.

110. Malho R. Expanding tip-growth theory. / R. Malho // Trends in plant science. 1998 -Vol. 3. -P. 40-42

111. Mascarenhas J.P. Molecular mechanisms of pollen tube growth and differentiation / J.P. Mascarenhas // Plant Cell. -1993. Vol. 5. -P. 1303-1314.

112. Plant fibres: botany, chemistry and processing for industrial use / G. J. McDougall, I. M. Morrison, D. Stewart et al. // J. Sci. Food Agric. 1993. - Vol. 62. -P. 1-20.

113. Mayer M.P. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. /M.P. Mayer, B. Bukau//Cell Mol Life Sci. 2005. - Vol. 62. (6). -P. 670-84.

114. McQueen-Manson S. J. The molecular basis of plant cell wall extension / S. J. McQueen-Manson, C.P. Darley, A.M. Forrester // Plant Molecidar Biology. -2001. -Vol. 47. -P. 179-195.

115. McQueen-Mason S. Expansin mode of action on cell walls: analysis of wall hydrolysis, stress relaxation, and binding/ S. McQueen-Mason, D.J. Cosgrove //Plant Physiol. -1995. -Vol. 107. -P. 87-100.

116. McQueen-Mason S. The relationship between xyloglucan endotransglycosylase and in vitro cell wall extension in cucumber hypocotyls / S.

117. McQueen-Mason, S.C. Fry, D.M. Durachko, D.J. Cosgrove //Planta. -1993. -Vol. 190. -P. 327-331.

118. Metcalfe C.R. Distribution of latex in plant kingdom. /C.R. Metcalfe // Economic Bot. 1967. -Vol. 21. -P. 115-125.

119. Mellerowicz E.J. Unravelling cell wall formation in the woody dicot stem / E.J. Mellerowicz, M. Baucher, B. Sundberg, W. Boerjan // Plant Molecular Biology. -2001. Vol. 47. - P.329-274.

120. Mellerowicz E.J. Expansins abundant in secondary xylem belong to subgroup A of the a-expansin gene family. /E.J. Mellerowicz, M. Gray-Mitsumune, HisashiAbe et al. //Plant Physiol. 2004. -Vol. 135. -P. 1552-1564.

121. Motose H. A proteoglycan mediates inductive interaction during plant vascular development./H. Motose, M. Sugiyama, H.A. Fukuda // Nature. . 2004. -Vol. 429. -P. 873-878.

122. Murmanis L Structural changes in the vascular cambium of Pinus strobes L. during an annual cycle /Murmanis L // Annals of Botany. — 1971. — Vol. -35. —P. 133-141.

123. Niminen, K.M. A weed for wood? Arabidopsis as a genetic model for xylem development / K.M. Nieminen, L. Kauppinen, Y. Helariutta // Plant Physiol. 2004. - Vol. 135. - P. 653-659.

124. Nieuwland J Lipid transfer proteins enhance cell wall extension in tobacco. /J. Nieuwland//Plant Cell. 2005. -Vol. 17. -P. 2009-2019.

125. Napier R.M. Auxin action and auxin-binding proteins./ R.M. Napier, M. Venis//New Phytol. -1995. -Vol 129. -P. 167-201.

126. Orford S.J. Expression of a lipid transfer protein gene family during cotton fibre development. / S.J. Orford, J.N. Timmis // Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids -2000. -Vol. 1483. -P. 275-284.

127. Palanivelu R., Pollen tube targeting and axon guidance: paralleles in tip growth mechanisms/R. Palanivelu, D. Preuss // Trends in cell biology. 2000. - Vol. 10.-P. 517-524.

128. Parre E. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth ofSolanum chacoense / E. Parre, A. Geitmann // Planta. 2005. -Vol. 220. -P. 582-592.

129. Pierson E.S., Tip-localized entry fluctuates during pollen tube growth./ E.S. Pierson, P.K. Hepler//Dev. Biol. -1996. -Vol. 174. -P. 160-173.

130. Ramsey, J.C. Ultrastructural aspects of early stages in cotton fiber elongation / J.C. Ramsey, J.D. Berlin // Amer. J. Bot. 1976. - Vol. 63, № 6. -P.868-876.

131. Rayle D.L. The acid growth theory of auxin-induced cell elongation istalive and well / D.L. Rayle, R. Cleland//Plant Physiol. -1992. -Vol. 99. № 4. -P. 1271-1274.

132. Rayle D.L. Enhancement of wall loosening and elongation by acid solutions /D.L. Rayle, R. Cleland//Plant Physiol. -1970. -Vol. 46. -P. 250-253.

133. Rea P.A. Plant ATP-binding cassette transporters. /P.A. Rea // Annu. Rev. Plant Biol. -2007. -Vol 58. -P. 347-375.

134. Roach, M.J. Microarray analysis of flax (Linum usitatissimum L.) stems identifies transcripts enriched in fibre-bearing phloem tissues / M.J. Roach, M.K. Deyholos//Mol. Genet Genomics. 2007. - Vol. 278, № 2. -P. 149-165.

135. Rosowski J.R. Laticifer morphology in the mature stem and leaf of Euphorbia supine. /J.R. Rosowski//Bot. Gaz. -1968. -Vol. 129. -P. 113-120.

136. Roland J.C. Early differences between radial walls and tangential walls of actively growing cambial zone./ J.C. Roland // IAWBull. 1978. -Vol. 1. —P. 7-10.

137. Roberts K. Rectricted cell elongation in Arabidopsis hypocotyls is assotiated with a reduced average pectin esterification level. /K. Roberts, P. Derbyshire, M.C. McCann//BMC Plant Biology. -2007. -Vol. 7(31).

138. Robards A. W. A comparative study of the ultrastructureof resting and active cambium of Saltc fragilis L. /A. W. Robards and P. Kidwai// Planta. 1969. -Vol. 84. -P. 239-249.

139. Ryser Dr. U. Cell wall growth in elongating cotton fibers: an autoradiographic study /Dr. U. Ryser// Cytobiologie. -1977. Vol. 15. —P. 78-84.

140. Cotton fiber initiation and histodijferentiation // Ryser, U. Cotton fibers. Developmental biology quality improvement, textile processing / U. Ryser. New York: Haworth Press, 1999. - P. 1-45.

141. Scharffstein G. Untersuchungen an ungegliederten Milchrohren./ G. Scharffstein//Beih. Bot. Zbl. -1932. -Vol. 49. -P. 197-220.

142. Schoch-Bodmer H. Das spitzenwachs tum der fasern bei Linum perenne L. /H. Schoch-Bodmer, P. Huber//Experientia. 1945. - Vol. 1/9. - P.327-328.

143. Schoch-Bodmer H. Stitzenwachstum und tupfelverteilung bei secundaren Fasern von Sparmannia/H. Schoch-Bodmer //Ztschr. Der Schweiz. Forstver. Beih.- 1960. Vol. 30. - P. 107-113.

144. Seagul R. W. Changers in microtubule organisation and wall microfibril orientation during in vitro cotton development: an immunofluorescent study/ R. W. Seagul //Can. J. Bot. 1986. -Vol. 64. -P. 1373-1381.

145. Shin H. GTPase activity and biochemical characterization of a recombinant cotton fiber annexin. /H. Shin, M. Brown // Plant Physiol. . -1999. — Vol. 119. -P. 925-934.

146. Sinnot E. W. changes in intercellular relatiomships during the growth and differention of living plant tissues. / E.W. Sinnot, R. Bloch// Amer. J. Bot. -1939. -Vol. 26. -P. 625.

147. Tammes, T. Der Flachsstengel. Eine statistisch-anatomische / T. Tammes. Haarlem: Erven Loosjes, 1907. - 285p.

148. Taliercio E.W. Analysis of gene expression in cotton fiber initials /Taliercio E. W. and D. Boykin //BMC Plant Biology. 2007. -Vol. 7. -P. 22.

149. Tiwari, S.C. Cotton (Gossypium hirsutum) seed trichomes expand via diffuse growing mechanism / S.C. Tiwari, T.A. Wilkins // Can. J. Bot. 1995. Vol. 73. -P.746-757.

150. Tomlinson, P.B. Development of gelatinous (reaction) fibers in stems of Gnetum gnemon (Gnetales) /P.B. Tomlinson // American Journal of Botany. 2003. - Vol. 90 (7). - P.965-972.

151. Tomlinson, P.B. Development of nonlignified fibers in leaves of Gnetum gnemon (Gnetales) / P.B. Tomlinson, J.B. Fisher // American Journal of Botany. -2005. Vol. 92.-P.383-389.

152. Tscirch A. Angewandte Pflanzenanatomie. Urban and Schwarzenberg, Wien, 1889.

153. Tyerman S. D. Plant aquaporins: multifunctional water . and solute channels with expanding roles /S. D. Tyerman, C. M. Niermaitz, H. Bramley // Plant, Cell and Environment-2002. -Vol. 25. -P. 173-194.

154. Uggla, C. Indole-3-acetic acid controls cambial growth in scots pine by positional signaling / C. Uggla, E.J. Mellerowicz, B. Sundberg // Plant Pysiol. -1998. Vol. 117. -P.l 13-121.

155. Plant growth and development: Plant fiber formation, Chapter MS 46 // van Dam, J.E.G. Encyclopedia of Applied plant sciences / J.E.G. van Dam, T.A. Gorshkova. Academic Press, Elsevier Ltd., - 2003. P. 87-96.

156. Vestal P.A. The formation of septa in the fiber tracheids of Hypericum Androsemum L. / P.A. Vestal, M.R. Vestal // Harvard Univ. Bot. Mus. Leaflet. -1940. -Vol. 8. -P. 169-188.

157. Verbelen J.-P. Root hair initiation is coupled to a highly localized increase of xyloglucan endotransglycosylase action in Arabidopsis roots / J.-P. Verbelen, K. Vissenberg, S.C. Fry // Plant Physiol. 2001. - Vol. 127. - P. 11251135.

158. Wloch, W. Intensive change of inclination of cambial initials in Picea abies (L.) Karst. tumours. / W. Wloch, E. Mazur, P. Kojs // Trees — Structure and Function. 2001. - Vol. 15, № 8. - P. 498-502.

159. Waxman S.G. The Axon / S.G. Waxman, J.D. Kocsis, P.K. Stug//. New York.: Oxford university Press, - 1995. 1200p.

160. Wang H. Development and pollination regulated accumulation and glycosylation of a stylar transmitting tissue-specific proline-rich protein / H. Wang, H.M. Wu, A.Y. Cheung//Plant Cell. 1993.-Vol. 5. -P. 1639-1650.

161. Wasteneys G. O., Remodeling the cytoskeleton for growth and form An Overview with Some New Views / G. O. Wasteneys, M. E. Galway // Annu. Rev. Plant Biol. -2003. -Vol. 54. -P. 691-722.

162. Wheeler M.J. The molecular and genetic basis ofpollen-pistil interactions /M.J. Wheeler, V.E. Franklin-Tong, F.C.H. Franklin//New Phytol. 2001. -Vol. 151. -P. 565-584.

163. Wilkins T. A. Functional genomics of cell elongation in developing cotton fibers / T. A. Wilkins, A.B. Arpa., M. Waugh // Plant Molecular Biology 2004.1. Vol. 54.-P. 911-929,

164. Wilkins T. A. Genes involved in osmoregulation during turgor-driven cell expansion of developing cotton fibers are differentially regulated / T. Wilkins A. L.B. Smar, F. Vojdani, //Plant Physiology. 1998. -Vol. 116. -P. 1539-1549.

165. Wloch, W. Formation of spiral grain in the wood of Pinus sylvestris L. / W. Wloch, E. Mazur, M. Beltowski // Trees Structure and Function. - 2002. - Vol. 16, №4-5. - P. 306-312.

166. Woodward A.W. Auxin:regulation, action, and interaction / A.W. Woodward, B. Bartel//Annals of Botany. -2005. -Vol. 95. -P. 707-735.

167. Wu H.M. A pollen tube growth stimulatory glycoprotein is deglycosylated by pollen tubes and displays a gradient in the flower / H.M. Wu, H. Wang, A. Y. Cheung //Cell. -1995. -Vol. 82. -P. 393-403.

168. Wu H.M A pollen tube growth-promoting arabinogalactan protein from Nicotiana alata is similar to the tobacco TTS-protein / H.M. Wu, E. Wong, J. Ogdahl, A. Y. Cheung//Plant J. -2000. -Vol. 22. -P. 165-176.

169. Xu F. Comparative study of anatomy and lignin distribution in normal and tention wood of Salix gordejecii / F. Xu, R.-C. Sun, Q. Lu, G.L. Jones. // Wood Sci. Technol. 2006. - Vol. 40, № 5. - P.358-370.

170. Yang Z. Signaling tip growth in plants / Z. Yang // Current opinion in Plant biology. 1998. -Vol. 1. -P. 525-530.

171. Zhu Yu-Xian Isolation and analyses of genes preferentially expressed during early cotton fiber development by subtractive PCR and cDNA array / Zhu Yu-Xian//Nucleic Acids Research. -2003. -Vol. 31. -P. 2534-2543.

Информация о работе

Снегирёва, Анастасия Вячеславовна
кандидата биологических наук
Казань, 2008
ВАК 03.00.12

Диссертация

Интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы