Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)

Рыжакова, Ольга Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)"

На правах рукописи

□ОЭ45427Э

Рыжакова Ольга Сергеевна

ИНТЕРСТИЦИАЛЬНАЯ КОЛЛАГЕНАЗА (ММП-1) И ЕЁ ЭНДОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ГЕНОМ Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ТИПА (НРУ16)

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

О 5 ДЕН 200В

Москва 2008

003454279

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Соловьева Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Яровая Галина Алексеевна

доктор биологических наук, профессор Соколов Николай Николаевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится «11» декабря 2008 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010 01 при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу 119121, г Москва. Погодинская ул., д 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН. Автореферат разослан «10»ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук

Карпова Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Матриксные металлопротеиназы или ММП относятся к семейству цинковых кальций-зависимых металлоцротеиназ, функция которых связана с обменом белков соеденительно-тканного матрикса (СТМ). Эти ферменты в совокупности способны гидролизовать все компоненты СТМ. ММП играют решающую роль в таких биологических процессах, как эмбриогенез, ремоделирование и репарация тканей, а также при развитии ряда патологических процессов, таких как ревматоидные артриты, остеоартриты, аневризмы аорты, периодонтиты, аутоимунные поражения кожи и т.д.

Особое место отводится ММП в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей. Тканевые коллагеназы, наряду с желатиназами (ММП-2, ММП-9), относятся к ММП и играют решающую роль в развитии этих процессов, поскольку они специфически гидролизуют белки группы коллагена - одного из основных компонентов СТМ. Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) специфически гидролизует фибрилярные коллагены I, II, III, V и ЕХ типов, которые составляют 25% от общего белка организма человека Нативные фибриллярные коллагены устойчивы к действию прогеолигаческих ферментов ММП-1 специфически запускает гидролиз фибриллярных коллагенов, при этом она гидролизует всего одну связь в молекуле этого белка, находящуюся на расстоянии 'А длины молекулы от С-конца. Образующиеся фрагменты способны денатурировать в физиологических условиях и далее подвергаться действию широкого спектра протеиназ, тем самым ММП-1 обеспечивает развитие деструктивного процесса. Желатиназы гидролизуют коллаген IV типа - основу базальных мембран. Этим двум группам ферментов принадлежит ключевая роль в разрушении соеденительно-тканного барьера при развитии инвазивного онкологического процесса.

В настоящее время интенсивно исследуются вопросы, связанные с экспрессией ММП при онкогенной трансформации. На клеточных системах показано влияние различных онкогенов на экспрессию ММП, однако вопросы связанные с эндогенной регуляцией активности этих ферментов исследованы недостаточно.

Нами было исследовано влияние гена Е7 вируса папиллом человека 16 типа (HPV16) на экспрессию ММП и их эндогенных регуляторов

Вирусы папиллом (HPV) высокого риска - HPV 16 и HPV18 являются этиологическими факторами возникновения рака шейки матки. За открытие ключевой роли вируса HPV в возникновении рака шейки матки доктору Харольду цур Хаузену в 2008 году была

присуждена Нобелевская премия. В настоящее время созданы вакцины против онкогенных вирусов папиллом человека, которые в ряде стран уже используются для предотвращения рака шейки матки. По статистическим данным в мире регистрируется до 500 тысяч новых случаев рака шейки матки, а женщины развивающихся стран подвержены этому заболеванию в 10 раз больше, чем остальные. Рак шейки магки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности от рака у женщин Установлено, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7. У 90% больных раком шейки матки обнаруживаются транскрипты ienoB Е6 и Е7 в биопсийном материале. Однако функциональный потенциал генов Е6 и Е7 остается недостаточно изученным Так недостаточно исследовано изменение протеолитического потенциала клеток и тканей, в частности интерстиднальной коллагепазы, при трансформации их этим вирусом, что может служить важным маркером инвазивного процесса

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является выяснение особенностей экспрессии интерстициальной коллагеназы(ММП-1), эндогенных регуляторов ее активности, как факторов инвазии при онкогенной трансформации фибробластов геном Е7 HPV1 б В соответствии с указанной целью поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнительные исследования экспрессии ММП-1 , и эндогенных регуляторов её активности, тканевого ингибитора ММП - ТИМП-1 и активатора плазминогена уракиназного типа - уАП на фибробластах крысы, иммортализованных LT геном вируса полиомы и трансформированных геном Е7 HPV16. Исследования провести на уровне мРНК и белка

2) На коммерческих клеточных линиях, полученных из опухолей шейки матки женщин: SiHa, Caski, Hela, С4-1, а также линии клеток СЗЗА, не содержащей копий HPV, провести сравнительные исследования экспрессии ММП-1, ММП-14 и ММП-2 ММП-9 (как двух групп ферментов, отвечающих за развитии инвазивного процесса), а также регуляторов их активности ТИМП-1, ТИМП-2 и у-АП на уровне м-РНК и этимологическом уровне.

3) Исследовать экспрессию ММП-1, 2, 9 и МТ1-ММП, а также ТИМП-1, ТИМП-2 и у-АП на операционных образцах плоскоклеточных карцином шейки матки, ассоциированных с геном Е7 HPV16 с использованием RT-PCR и методами иммуногистохимии и энзимологии.

Научная новизна и практическая значимость.

Разработан метод по определению коллагенолитической активности.

Получена четкая картина о ключевой роли ММП-1, ММП-2, ММП-9 и их ингибиторов в развитии инвазии на линиях клеток рака шейки матки, трансформированных геном Е7

HPV16 и клинических образцах плоскоклеточных карцином шейки матки, ассоциированных с HPV16. Эти данные могут иметь прогностическое значение и определять мишени для разработки фармакологических средств.

Данные об увеличении экспрессии ММП в окружающей опухоль строме могут быть использованы для оценки деструктивного (инвазивного) потенциала прилегающей к опухоли ткани и , по-видимому, для определения размера операционного поля при хирургическом вмешательстве.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сравнительное исследование экспрессии ММП-1, МТ1-ММП (как ММП-1 вязанной с мембраной) и эндогенных регуляторов их активности на уровне м-РНК и белка в фибробластах, иммортализованных LT-геном вируса полиомы и трансформированных геном Е7 HPV-16, которое позволяет оценить баланс системы фермент/активатор/ингибитор как в иммортализованных, так и трансформированных клетках.

2. Сравнительное исследование на уровне м-РНК и белка ММП-1, МТ1-ММП и ММП-2, 9 (как двух групп ферментов, отвечающих за инвазивные свойства клеток) и эндогенных ингибиторов их активности ТИМП-1 и ТИМП-2 на коммерческих клеточных линиях, полученных из опухолей шейки матки и ассоциированных с HPV16 и HPV18, а именно SiHa (HPV16), Caski (HPV16), Hela (HPV18) и С4-1 (HPV18), что позволяет оценить их деструктивный потенциал, спектр и уровень активностей ММП в зависимости от типа вируса и количества его копий.

3. Исследование ММП-1, МТ1-ММП и ММП-2, 9 и их ингибиторов на образцах плоскоклеточных карцином щешеи матки, ассоциированных с геном Е7 HPV16.

Публикация и апробация работы.

Результаты работы были представлены на VI симпозиуме "Химия протеолитических ферментов"( Москва, 2007), Международной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» ( Минск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Материалы диссертации отражены в 6 публикациях: 2 статьи и 4 публикации в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов и библиографии Материалы диссертации изложены на 98 страницах машинописного текста и включают 16 рисунков, 5 таблиц и список литературы из 126 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные модели

at Модель фибробластов крысы линии Фишер, разработанная в лаборатории молекулярной биологии вирусов Института канцерогенеза ОНЦ РАМН, включающая фибробласты иммортализованные LT геном вируса полиомы и трансформированные Е7 геном HPV16. 61 Коммерческие клеточные линии катонном шейки матки - СЗЗ-А, SiHa, Caski, HeLa, С4-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клеточные линии отличались по типу HPV и колличеству копий вируса: C33A(HPV отсутствует), SiHa(l-2 копии HPV16), Caski (500-600 копий HPVI6), Hela (10-50 копий HPV 18) и С4-1(1 копия HPV18 ). Клинический материей

Образцы опухолевой ткани плоскоклеточных карцином шейки матки, взятые во время операции, и морфологически нормальной ткани, прилегающей к опухоли, были предоставлены отделением гинекологии и радиохирургии ОНЦ РАМН г.Москвы и отделом потологической анатомии Московского научно-исследовательского онкологического института им П.А. Герцена

Клинический диагноз и степень дифференцировки были подтверждены отделениями патоморфологии ОНЦ РАМН и Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А Герцена.

Исследование экспрессии генов проводили методом полуколичественной RT-PCR с использованием специфических праймеров Условия реакции и последовательность праймеров описаны в таблице 1

Таблица 1. Праймеры, использованные в RT-PCR

ММП-1 (ч) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' gga саа аса cat ctg асс tac agg а 3' 5' ttg tcc ega tga tet ccc ctg аса 3' 185п.н. 62°C, 34 циклов, 30 сек

У-АП (ч) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' agg ega ccc tgg tgc tat 3' 5'acc cag caa gga ctg atg ag 3' 272 н.п. 54°C, 33 циклов, 30 сек

МТ1-ММП (ч. к) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' cct ttt асс agt gga tgg ас 3' 5' cca get cct taa tgt get tg 3' 444 н.п. 56°C, 29 циклов, 40 сек.

Т1МР-1 (ч) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' gac cac ctt ata cca get tt 3' 5' gca ggc agg caa ggt gac 3' 410 нп. 51°C, 28 циклов, 30 сек

ММР-2Ы) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' gag ttg gca gtg caa tac ct 3' 5' gee ate ctt ctc aaa gtt gt 3' 666 Н.П. 60°C, 34циклов, 30 сек

ММР-9М Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' tgg gca agg gcg teg tgg ttc3' 5' tgg tgc agg egg agt agg att3' 276 н.п 55°C, 35циклов, 30 сек.

ТИМП-2(ч1 Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' ggt ctc get gga cgt tgg ag 3' 5' gga gee gtc act tet ctt g 3' 304 н.п. 58°C, 27циклов, 30 сек

у-АП Ск| Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' cat tea tga ggt ctg ctg tt 3' 5' gga ata ata cat tea agt gga 3' 272 и n. 58°C, 36 циклов, 30 сек

Т1МР-1 (к) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' gac сас ей Ла сса gcttt 3' 5' саа agt cgc Ш ggt ag 3' 401 н.п. 56°С, 26циклов, 30 сек

САРЙН (ч,к) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' асс аса §1с саг gcc а1с ас 3' 5' йс асс асс ОД ОД 1а 3' 450 н п. 60"С,28циююв, 30 сек

НРИТ (ч) Прямой праймер Обратный праймер Размер продукта Условия амплификации 5' ОД gat гас ааа gca ctg 3' 5' gga Иа гас tgc ctg асс aag 3' 230 н.п. 60°С, ЗОциклов, 30 сек

к - праймеры к генам крысы, ч - праймеры к генам человека

Культивирование клеток Для определения коллагенолитической активности клетки культивировали в течение 48 часов в бессывороточной среде РМЕМ, содержащей 0,5% гидролизат лактатьбумина (Н) с добавлением витаминного раствора (10мкл/мл) и гентамицина (100ед/мл). Клетки собирали с помощью 0,0002% раствора химопсина, затем промывали 4-5 раз раствором Хенкса и осаждали центрифугированием при 1000 об /мин Кондиционированную среду собирали, замораживали и хранили при -20°С [16] Дчя разрушения клеточной мембраны к клеткам добавляли раствор 0,45% №С1, содержащий 1мМ СаСЬ и 0,1% тритон Х-100 (из рассчета 1х10б клеток в 0,3мл раствора), затем клетки подвергали 6-кратному замораживанию-оттаиванию и разрушали в тефлоновом гомогенизаторе Осадок отделяли центрифугированием, в супернатанте определяли активность. Все процедуры проводили при 4°С

Определение коллагенолитической активности проводили по методу, разработанному нами Для определения активности ММП-1 использовали меченый флуоресцеинизотиоцианатом коллаген I типа, полученный из кожи крыс. На гидролиз брали по 20кл (72мкг) меченного коллагена, инкубировали в течение 2 часов при температуре 35°С до образования реконструированных фибрилл (пленок) Реакционная смесь содержала 0,0 Ш трис-НС1 буфера рН 7,6 с добавлением 1мМ СаС12 и 0,2 М №С1 и исследуемую пробу: супернатант лизатов фибробластов, соответствующий 30-500 тысяч клеток, супернатант лизатов тканей

(от 100 до 1000 мкг белка) или кондиционированной среды, (соответствующей 0,1-1,3 млн клеток) Общий объем пробы ЮООмкл. Инкубацию проводили в течение 18-20 часов при 35°С, флуоресценцию измеряли при длинах волн 490 и 520 нм возбуждения и поглощения соответственно. Активность коллагеназ анализировали в присутствии активатора (трипсина) и ингибитора (ЭДТА) ММП.

ЗимограАию с сопогимеризованныч желатином проводили по методу, описанному в статье [Murphy G.,1995, Leber at al. 1997]. При электрофорезе на каждый трек наносили пробы супернатантов лизатов тканей из расчета 50мкг белка на лунку. Активность ММП-2 и ММП-9 рассчитывали по площади гидролиза желатина в треках. Иммуногистохимическое исследование

Материал фиксировали 10% нейтральным формалином 24часа. Затем обезвоживали и пропитывали парафином в автоматизированном режиме в аппарате STP120. Использовали моноклональные антитела к ММР-1,2,9 и Т1МР-1,2 фирмы Lab Vision в готовом разведении Иммуногистохимические реакции проводили в автоматизированном режиме в иммуногисгостейнере Avtostemer (Dako). В качестве детекционной системы использовали систему Envision (Dako) , в качестве хромогена - диаминобензидин. Затем срезы докрашивали гематоксилином. Микроскопирование проводили на анализаторе изображения Leika Q 550.

Условия проведения реакции (метод восстановления антигенной активности и использованные разведения антител) представлены в таблице 2.

Таблица 2. Использованные антитела

Наименование Резведение Условия демаскировки

ММП-1 моноклональные 1-5 121 °С, pH 6,0 цитратныйбуфер

ММП-2 моноклональные 1:40 121 °С, pH 6,0 цитратныйбуфер

ММП-9 моноклональные 1:20 Без обработки

ТИМП-1 моноклональные 1-20 121 °С, pH 8,0 ЭДТА буфер

ТИМП-2 моноклональные 1:30 121 °С,рН 8,0 ЭДТА буфер

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с использование программы Excel с пакетом анализа данных по методам, описанным в книге «Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel» (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич ПН., 2000). Применяли также корреляционный анализ по Пирсону. При анализе корреляции метастазирования и степени дифференцировки клеток с интенсивностью ИГХ реакции

считали ее незначимой при значении модуля коэффициента корреляции от 0 до 0,3; значимой - от 0,3 до 0,75 и высокой - выше 0,75.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для решения поставленной задачи работа проводилась на трёх объектах: 1. модель экспериментального канцерогенеза, включающая иммортализованные и трансформированные фибробласты крысы, 2 коммерческие линии клеток, ассоциированные с HPV16 и HPV18; 3. образцы плоскоклеточных карцином шейки матки, экспрессирующие ген Е7 HPV16, взятые во время операции

На первом этапе исследования проводили на модели экспериментального канцерогенеза 1. Сравнительное исследование экспрессии матриксной металлопротеиназы-1 - ММП-1 и мембраносвязанной металлопротеиназы-1 - МТ1-ММП, а также тканевого ингибитора ММП - ТИМП-1 и активатора - уАП (активатора плазминогена уракиназного типа) на модели фибробластов крысы.

Исследования проводились на модели клеток - эмбриональных фибробластов крысы линии Фишер, включающей нормальные фибробласты (Reí), иммортализованные (клетки обладают способностью к неконтролируемому росту, но не вызывают развития опухоли - IE5) и трансформированные фибробласты (три клона трансформированных клеток - trB4,trF8 и trF8nmcc)., отличающиеся по степени туморогенности. Условно можно распределить клоны по степени выраженности туморогенных свойств в следующем порядке- trF8nmcc>trF8>trB4. Работу проводили на уровне мРНК и белка

Экспрессия генов ММП-1, МТ1-ММП, ТИМП-1 иуАП.

Работу по экспрессии мРНК ММП и их эндогенных регуляторов проводили совместно с лабораторией молекулярной биологии вирусов Института канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Были исследованы уровни экспрессии м-РНК МТ1-ММП, эндогенного ингибитора ММП-1 и МТ1-ММП - ТИМП-1 и активатора ММП-1 - уАП. Данные по экспрессии мРНК ММП-1 в фибробластах крысы отсутствуют, т.к. не удалось подобрать праймеры для этого фермента, поскольку ген ММП-1 крысы не расшифрован, а подбор праймеров на основе последовательности гена ММП-1 человека не дал результатов. Следует отметить, что уАП является активатором плазминогена, а плазмин рассматривается как основной физиологический активатор про-ММП-1 и других ММП. ТИМП-1 рассматривается как основной тканевый ингибитор ММП-1.

Данные но экспрессии мРНК МТ1-ММП, ТИМП-1 и уАП представлены на рис.1 А,Б, где приведены результаты типичных опытов по данным ЯТ-РСИ (рис.1,А) и денситометрии (рис.1,Б).

А Б GAPDH too —-------

Рис.1 Экспрессия м-РНК генов МТ1-ММП, ТИМП-1 и уАП по данным RT-PCR (А) и денситометрии (Б) Для реакции обратной транскрипции брали 1 )jg РНК каждого клона клеток: 1. Reí; 2. IE5; 3. trF8; 4.; trF8nmcc 5. trB4. Количество кДНК, вносимое в реакцию, соответствовало равному количеству продукта гена GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) для каждого клона клеток.

Данные свидетельствуют о том, что как иммортализация, так и трансформация фибробластов сопровождается изменением уровня экспрессии генов исследованных ферментов и ингибитора. Из представленных на рис.1 А данных следует, что экспрессия мРНК МТ1-ММП существенно увеличена во всех трёх клонах трансформированных фибробластов (ТФ) и значительно менее увеличена в иммортализованных фибробластах (ИФ). Экспрессия ТИМП-1 была снижена во всех линиях ТФ и находилась на уровне контроля в ИФ. Экспрессия уАП была увеличена только в ИФ, а ТФ находилась в пределах нормы.

Условно соотношение величин экспрессии мРНК в исследованных клонах , Ref, IE5, trF8, trB4, trF8nmcc, по данным электрофореза и денситометрии, представлены на рис.1Б. За 100% принята экспрессия в первичных фибробластах (Reí). Из представленных данных следует, что при трансформации (клоны trF8, trB4, trF8nmcc) происходит увеличение экспрессии МТ1-ММП в 2,5 - 3,5 раза (от 260 до 350 %, треки 3,4,5), уменьшение экспрессии ингибитора - до 30-60% от контроля (треки 3,4,5), в то время как экспрессия активатора остается в норме. При иммортализации (клон IE5) обнаружено увеличение экспрессии МТ1-ММП в 1,5 раза (трек 2), в то время как экспрессия ТИМП-1 (трек2) оставалась на уровне контроля, но была выше, чем в ТФ, а экспрессия активатора - уАП возрастала в 2 раза (200%). Следовательно, при трансформации происходит увеличение экспрессии фермента, уменьшение экспрессии

ингибитора, в то время как экспрессия активатора остается в норме. При имортализации обнаружено существенное увеличение экспрессии уАП и незначительное увеличение МТ] -ММП, в то время как экспрессия ТИМП-1 остается на уровне контроля. Полученные данные свидетельствуют о том, что как при трансформации, так и при иммортализации происходит нарушение соотношения фермент/активатор/ингибитор, причем в ТФ они выражены значительно ярче и в конечном итоге направлены на увеличение активности ММП.

Исследование коллагенолитической активности ММП-1 с использованием модифицированного нами метода определения активности, где в качестве субстрата использовали коллаген I типа, меченый флуоресцеинизотиоцианатом.

Активность определяли как в кондиционированной среде (секрстируемая активность), так и в лизатах клеток. Следует отметить, что ММП-1 относится к секретируемым ММП, в то время как МТ1-ММП связана с мембраной. Представленные на рис. 2 и 3 данные свидетельствуют о том, что в ТФ активность ММП-1, как секретируемая, так и в лизатах, увеличивается в 2-3 раза по сравнению с ИФ, причем уровень активности в лизатах был значительно ниже, чем в кондиционированной среде (рис.3).

□ исходная активность

® активность в присутствии трипсина _

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

№8 ^РВптсс

Р»с.2 Секретируемая коллагенолитическая активность.

Коллагенолитическая активность, обнаруженная в лизатах клеток, а именно в этой фракции содержатся мсмбраносвязанные ММП, косвенно свидетельствует об активности МТ1-ММП, которую по субстратной специфичности считают ММП-1, связанной с мембраной. Активация про-ММП-1 трипсином приводила к значительному увеличению активности (в 1,5- 2 раза), исключение составлял клон йРВптсс, где активность в лизатах существенно не изменялась по сравнению с ИФ. Эти результаты свидетельствуют о наличии значительного количества ММП в форме предшественников. Данные по увеличению

коллагенолитической активности в ТФ согласуются с полученными данными по увеличению экспрессии мРНК в исследованных клонах.

IE5 trF8 trF8nmcc

Рис.3 Коллагенолитическая активность в лизатах клеток

Наличие свободных эндогенных ингибиторов ММП в кондиционированной среде определяли методом разведепий. Следует подчеркнуть, что это в значительной степени качественный, а не количественный подход к обнаружению свободных эндогенных ингибиторов ММП. Однако он позволяет оценить тенденцию и в какой-то мере степень изменений соотношения фермент/ингибитор. В качестве субстрата использовали коллаген I типа. Кондиционированную среду разводили в 2-10 раз.

В таблице 3 представлены данные только для трех разведений, где прослеживается общий характер изменений соотношения фермент/ингибитор.

Таблица 3. Активность коллагеназ I типа при различных разведениях кондиционированной среды.

Клон клеток Активность , мкг коллагена / 1млн. клеток* (при различных разведениях кондиционированной среды)

1:5 1:2 1:1

IE5 53,03±2,81 60,12±2,25 32,53±3,47

trF8 116,б7± 14,43 130,0+24,75 98,13+21,83

trF8nmcc 95,93±10,96 113,0±13,73 97,19±18,5

* Каждое значения является средним ± SD из пяти независимых опытов

Из полученных данных следует, что свободные ингибиторы коллагеназ выявляются во всех клеточных клонах. Однако в имморапизованных клетках (IE5) в большей степени, чем в обоих трансформированных клонах. Эти результаты согласуются с полученными данными по уменьшению экспрессии мРНК ТИМП-1 в трансформированных клонах и свидетельствуют о том, что во всех трансформированных клетках соотношение фермент/ингибитор существенно изменено по сравнению с исходными и

иммортализованными фибробластами. Снижение количества свободных эндогенных ингибиторов ММП может свидетельствовать о большей потенциальной возможности проявления ферментативной активности ММП

Итак, полученные данные свидетельствуют о том, что как трансформированные, так и иммортализованные клетки обладают деструктивным потенциалом, который в ТФ выражен значительно ярче. Основной вклад в увеличение уровня деструктивного потенциала в ТФ вносит увеличение экспрессии ММП и снижение экспрессии ингибитора, а в ИФ -увеличение экспрессии фермента (значительно менее выраженное , чем в ТФ) и увеличение экспрессии активатора. Данные по характеристике деструктивного потенциала иммортализованных клетках в литературе отсутствуют. Исключение составляют полученные ранее нами данные об экспрессии в ИФ желатиназ - ММП-2,9. Эти данные приобретают особое значение в связи с литературными данными, полученными на культурах клеток и животных, и свидетельствующими о том, что повышенная экспрессия ММП, которая достигалась путем трансфекции генов соответствующих ММП, вызывает в морфологически нормальных клетках спонтанную пролиферацию и/или увеличивает чувствительность их к канцерогенам, а иногда приводит к трансформации клеток.

На втором этапе работы исследование проводилось на коммерческих клеточных линиях карцином шейки матки, которые отличались по типу HPV и количеству копий вируса: СЗЗА(НРУ-отсутствует), SiHa(l-2 копии HPV-16), Caski (500-600 копий HPV-16), Hela (10-50 копий HPV-18) и С4-1(1 копия HPV-18). Работа проводилась с использованием методов RT-PCR и определения энзимологической активности клеток.

2. Сравнительное исследование экспрессии ММП-1,2, МТ1-ММП и регуляторов их активности уАП, ТИМП-1,2 в коммерческих клеточных линиях карцином шейки матки человека, ассоциированных с HPV-16 и HPV-18.

Для более полной характеристики деструктивного (инвазивного) потенциала клеток наряду с экспрессией мРНК ММП-1 и МТ1-ММП (ферментов, отвечающих за деструкцию фибриллярных коллагенов) исследовали экспрессию ММП-1 и ММП-9 (ферментов, отвечающих за деструкцию коллагена ГУтипа - основу базальных мембран), а также эндогенных регуляторов их активности. Следует отметить, что вирусы HPV16 и HPV18 , как этиологический фактор возникновения рака шейки матки, являются наиболее агрессивными и наиболее распространенными среди онкогепных вирусов HPV.

Экспрессия генов ММП-1,2, MTÍ-MMI1 и эндогенных регуляторов их активности.

Проведено сравнительное исследование экспрессии мРНК ММП-1, МТ1-ММП и ММП-2, ММП-9, а также эндогенных регуляторов их активности уАП - активатора ММП-1 и

тканевых ингибиторов этих ферментов ТИМП-1 и ТИМП-2 в линиях клеток Siha и Caski, трансформированных онкогенами HPV 16 и линиях клеток Hela и С4-1, трансформированными онкогенами HPV18. На рис.4 приведены результаты типичных опытов по данным RT-PCR (рис. 4,А) и денситометр™ (рис.4,Б). Результаты по экспрессии ММП-9 в клеточных линиях получить не удалось, поскольку праймеры, подобранные к гену ММП-9 человека и дающие положительный результат на клинических образцах, в случае клеточных линий продукта не дали. Проверка экспрессии ММП-9 во всех линиях клеток методом иммуногистохимии показма, что экспрессия ММП-9 обнаружена только в линии клеток Hela. Количественная оценка данных RT-PCR (рис.4 А) проведена методом денситометрии и представлена на рис.4Б. За 100% (контроль) условно принят уровень экспрессии мРНК в линии СЗЗ-А, не содержащей копий HPV. Денситометрические данные по всем линиям клеток соотнесены с данными в линии СЗЗА (рис.4 Б)

ЩШ-1

уАП

ТИМП-1

Рнс.4 Экспрессия м-РНК генов ММП-1, МТ1-ММП, ММП-2, уАП, ТИМП-1, ТИМП-2 по данным RT-PCR (А) и денситометрии (Б) в клеточных линиях: l.-Siha; 2. Caski; 3. СЗЗ-А; 4. Hela; 5. С4-1. Количество к-ДНК, вносимое в реакцию соответствовало равному количеству продукта гена GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидротеназы) и НРКТ(гипоксантин~гуанин фосфорибозилтрансфераза) для каждого клона клеток.

Полученные результаты (рис.4 А,Б) свидетельствуют о том, что в линиях клеток HPV-18 -Hela, С4-1 (рис.4А, треки 4 и 5) экспрессия ММП, как правило, была выше, чем в клетках HPV-16 - Siha, Caski (рис.4А, треки 1 и 2). В обоих типах клеток экспрессия ММП-1 и МТ1-ММП существенно увеличивалась (от 2 до 12 раз), исключение составляют клетки Siha для

ММП-1 и Hela для МТ1-ММП, где наблюдалось снижение экспрессии указанных ферментов (рис 4 А). Экспрессия ММП-2 изменялась незначительно (на 20-40%) в обоих типах клеток (рис 4 А). Высший уровень экспрессии ММП-1 и МТ1-ММП (в 8-12 раз) обнаружен в линии С4-1, ассоциированной с 1 копией HPV-18, в то время как в клетках Hela, ассоциированных с 10-50 копиями HPV-18, уровень экспрессии ММП-1 был в 4,5 раза выше контроля, а уровень экспрессии МТ1-ММП снижался до 30% от контроля (рис.4 А).

В линиях клеток, ассоциированных с HPV16, экспрессия ММП-1 и МТ1-ММП изменялась всего в 2-2,5 раза, а в Siha уровень экспрессии ММП-1 составлял всего 50% от контроля (рис.4 А,Б). Следует отметить, что количество копий HPV16 в Caski составляет 500-600, а в Siha - 1-2 копии. Следовательно, количество копий гена не оказывало влияния на степень экспрессии ММП. Экспрессия ингибиторов в основном была в пределах контроля (рис 4 А,Б). Исключение составила линия С4-1, где экспрессия ТИМП-1 и ТИМП-2 была увеличена в 1,7 и 2,6 раза соответственно. Экспрессия уАП увеличена во всех линиях клеток (от 2 до 4,5 раз), кроме Siha, где она была снижена до 20% (рис.4 А,Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что в трансформированных клетках существенно нарушено соотношение фермент/ингибитор/активатор, которое происходит в основном за счёт увеличения экспрессии ферментов и в меньшей степени - уменьшения экспрессии ингибитора, что приводит к увеличению деструктивного потенциала клеток.

Имеющиеся в литературе немногочисленные данные по экспрессии мРНК в исследованных линиях клеток достаточно противоречивы. Данные по экспрессии ММП-1 практически отсутствуют. Наши результаты согласуются с литературными данными по экспрессии мРНК в случае МТ1-ММП и ТИМП-1 во всех линиях клеток кроме линии С4-1, где нами была обнаружена максимальная экспрессия МТ1-ММП и ТИМП-1, в то время как по литературным данным экспрессия этих генов в линии С4-1 была мипимальна. По нашим данным уровни экспрессии ММП-2 во всех клеточных линиях были очень близки (рис.4), кроме С4-1, где экспрессия отсутствовала. Литературные данные в отношении экспрессии ММП-2 противоречивы и различаются по степени экспрессии. Существенные различия между нашими данными и литературными оказались в случае экспрессии ММП-9. Несмотря на то, что и условия проведения реакции и состав праймеров были идентичны, экспрессии ММП-9 была обнаружена нами только в клеточной линии Hela, в то время как по литературным данным она обнаружена в линиях Siha, Caski и С4-1. Такую разницу в результатах можно объяснить гетерогенностью клеточного материала, находящегося в разных банках.

Сравнительное исследование коллагенолнтической активности.

Исследование коллагенолитической активности ММП-1 (по гидролизу флюорогенного коллагена I типа) выявило активность ММП-1 во всех линиях клеток только в кондиционированной среде. В лизатах клеток, достоверной активности обнаружено не было, в отличие от клеточных линий фибробластов крысы, где активность ММП-1 в лизатах была существенной, хотя и значительно ниже, чем в кондиционированной среде (рис. 5).

□ исходная активность

¡ активность в присутствии трипсина

СЗЗА

Рис. 5 Сскрс тируемая коллагенолитическая активность.

Уровень коллагенолитической активности в клеточных линиях соотносили с уровнем активности в линии СЗЗА, где отсутствуют копии HPV-16 и 18. В клеточной линии SiHa активность была сопоставима с активностью в линии СЗЗА, в линии Caski активность была выше, чем в СЗЗА в 2,3 раза, а в линии Hela в 3,Зраза.

Активация про-ММП-1 трипсином приводила к значительному увеличению активности (в 1,5- 2 раза) во всех клеточных линиях, что свидетельствуют о наличии значительного количества ММП в форме предшественников. Полученные данные указывают на то, что клеточная линия Hela, ассоциированная с HPV-18, обладала более высокой коллагенолитической активностью, чем линии Caski и Siha, ассоциированные с HPV-16. Ферментативная активность клеточных линий, отличающихся по количеству копий HPV-16 - Siha(l-2 копии), Caski (500-600 копий) различалась всего в 1,5 - 2 раза в пользу линии Caski, т.е. существенных различий в экспрссии ММП в зависимости от количества копий HPV-16 не было обнаружено. Была предпринята попытка оценить наличие свободных эндогенных ингибиторов в кондиционировнной среде клеточных линий карцином шейки матки методом разведений. Однако, в отличие от модели фибробластов крысы в клеточных линиях карцином шейки матки свободных эндогенных ингибиторов в кондиционированной среде не было обнаружено.

Данные по исследованию коллагенолитической активности согласуются с данными по экспрессии мРНК и свидетельствуют о том, что; 1. в клетках, трансформированных HPV-18 деструктивный потенциал значительно выше, чем в клетках, трансформированных HPV-16.

2. Основной вклад в деструктивный (инвазивный) потенциал обеих линий клеток вносят ММП-1 и МТ1-ММП, в то время как экспрессия ММП-2 существенно не изменяется, а ММП-9 (по данным иммуногистохимии) экспрессируется только в линии клеток Hela.

3. Исследование экспрессии ММП-1, МТ1-ММП, ММП-2, ММП-9 и регуляторов их активности у АЛ, ТИМП-1,2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки.

Для оценки деструктивного (инвазивного) потенциала опухолевой ткани работу проводили на образцах плоскоклсточных карцином шейки матки, взятых во время операций. Во всех образцах экспрессировался ген Е7 НРУ1б. Исследовали экспрессию двух групп ММП, как и при исследовании на клеточных линиях человека, а именно ММП-1, МТ1-ММП и ММП-2, ММП-9, а также регуляторов активности ММП. Работа проводилась с использованием четырёх методов: ЯТ-РСЯ, иммуногистохимии, зимографии и определения коллагеиолитической активности.

Эспрессия генов ММП-1, МТ1-ММП, ММП-2, ММП-9 и регуляторов их активности уАП, ТИМП-1 и ТИМП-2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки.

Исследование проводилось на 36 образцах карцином шейки матки и 11 образцах морфологически нормальной ткани, прилегающей к опухоли. Экспрессию ММП и их эндогенных тканевых ингибиторов оценивали в сравнении с экспрессией в образцах прилегающей ткани. В качестве иллюстрации приведены 5 пар образцов (рис. 6).

12 3 4 5

N т N т N т N т N т

ММП-1 - ~ * ** ** * *~185п.н. МТ1-ММП"**" ** —' ~ *** М 444 п.н.

ММП-2 ^ "" "" «* V Ж1 ^ 666 п.н.

ММП-9 ^ Щ * ¿? Ш ^ 276 п.н.

ТИМП-1 ~ — * « — 410п н

ТИМП-2 — Л — ' .. 304 п.н.

*«т *** Щ; эд» <— 272 п н

НРЯ'Г .....*• "" "" ^ 230 п.н.

вАРОН - - ~ Г - — — ~ — 450 п.н.

Рис 6.Экспрессия мРНК генов ММР-1, МТ1-ММР , ММР-2, ММР9, и-РА, Т1МР-1,Т1МР-2 в образцах плоскоклеточных карцином шейки матки . Количество к-ДНК, вносимое в реакцию, соответствовало равному количеству продукта гена вАРОН (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) и гена НРЯТ (гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза) для каждого клона клеток.

Из представленных на рис.6 данных следует, что выраженное увеличение экспрессии мРНК ММП-1 наблюдалось в большинстве образцов, увеличение экспрессии ММП-2 и

ММП-9 было менее выражено, а в случае ингибиторов в большинстве образцов наблюдалось снижение экспрессии мРНК.

Количественная оценка экспрессии ММП и их ингибиторов с помощью денситометрии показала, что увеличение экспрессии происходило не более, чем в два раза, а в ряде случаев было равно экспрессии в норме или было ниже нормы, т.ч. разброс данных был достаточно велик. Статистическая обработка данных денситометрии по экспрессии генов ММП и их регуляторов не позволила выявить достоверных существенных различий в экспрессии как ММП, так и их ингибиторов в исследуемых образцах опухоли по сравнению с морфологически нормальной тканью. В связи с этим мы попытались рассмотреть положительную и отрицательную направленность экспрессии ММП и их ингибиторов в исследуемых образцах, для этого выделили две группы данных с увеличением и уменьшением экспрессии в опухолях по сравнению с контролем. Оказалось (рис.7), что во всей группе исследованных образцов, которую принимаем за 100%, увеличение экспрессии ММП-1 обнаружено в 86% образцов, ММП-2 в 66% , ММП-9 в 58%, уАП в 53%, при этом наблюдалось снижение экспрессии ТИМП-1 и ТИМП-2 (61% образцов и 89% соответственно), и снижение экспрессии МТ1-ММР в 75% образцов.

100 -

Рис. 7.Наиравленность экспрессии ММП и их регуляторов в образцах карцином шейки матки.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в большей части опухолевых образцов экспрессия ММП была повышена, а экспрессия их ингибиторов снижена по сравнению с прилегающей к опухоли нормальной тканью, т.е. экспрессия как ММП, так и их ингибиторов была направлена на увеличение деструктивного потенциала клеток,

Исследование коллагенолитичеекой активности (по флюорогенному коллагену I типа).

Коллагенолитическую активность определяли в лизатах образцов опухоли и прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани (строме). Коллагенолитическая активность представяет собой сумму активности ММП-1 и МТ1 -ММП. Следует учитывать, что ММП-1 является секретируемой, а МТ1-ММП - мембраносвязанной металлопротеиназой. На рис. 8 .представлены результаты, полученные на пяти парах образцов, включающих ткань опухоли и прилегающую к опухоли морфологически нормальную ткань. Полученные данные свидетельствуют о том, что коллагенолитическая активность была обнаружена как в опухоли, так и в строме (рис. 8). В первых трёх парах образцов активность в опухоли превышает активность в нормальной ткани (от1,3 до 2,7 раза). В образцах 4 и 5 наблюдается обратная картина, активность в нормальной ткани превышала активность в опухоли (в 3 и 1,4 раза). При этом активность в опухоли была достаточно высокой во всех образцах, т.е. экспрессия ММП-1 и МТ1-ММП была достаточно выраженной.

□ строма,

□ строма, активация трипсином

■ опухоль

ЕЗ опухоль, активация трипсином

1 2 3 4 5

Рис.8 Коллагенолитическая активность в образцах карцином шейки матки.

Активация трипсином приводила к увеличению активности в опухолевых тканях и в строме (рис.8.). Полученные данные свидетельствуют о наличии значительного протеолитического потенциала, как в опухолевых клетках, так и в строме. Результаты согласуются с литературными данными о том, что в ряде видов опухолей активность ММП в окружающей опухоль ткани была сравнима или существенно выше, чем в самой опухоли за счёт активации ММП стромы с помощью различных факторов, вырабатываемых опухолью. Данные о присутствии активности ММП в прилегающей к опухоли шейки матки ткани отсутствуют в литературе. Результаты могут быть использованы для оценки деструктивного

потенциала прилегающей к опухоли ткани и, по-видимому, для определения размеров операционного поля при хирургическом вмешательстве.

Исследование ММП-2, ММП-9 методом зимографии.

Спектр и активности ММП-2 и ММП-9 в образцах морфологически нормальных и опухолевых тканей исследовали методом зимографии.

Работа проводилась на 19 образцах карцином шейки матки и 15 образцах прилегающих к опухоли тканей. На рис.9 представленны данные зимографии типичных опытов. Из полученных данных следует, что во всех образцах опухоли и контроля присутствовала ММП-2. Необходимо отметить, что ММП-2 относится к конститутивным ферментам, уровень которых в тканях мало зависит от факторов, индуцирующих синтез. Ярко выраженная экспрессия ММП-9 (индуцируемый фермент) наблюдалась в 94% образцов опухолей. Активность ММП-9 резко увеличиваюсь во всех образцах опухоли по сравнению со стромой, где она присутствовала в очень незначительных количествах (рис.9). Активность ММП-2 обнаружена как в опухоли, так и в строме, причем в образцах 1-3 в прилегающей ткани она была значительно ниже, чем в опухоли, а в 4 и 5 образцах активность в строме была на уровне опухоли или несколько выше неё.

92 кДа *- 86 кДа ММП-9

— 72 кДя •*- 68 кДа ММП-2

Рис.9 Идентификация коллагеназ IV типа - ММП-2 и ММП-9 с помощью метода зимографии. N - морфологически нормальная ткань, Т - ткань опухоли. Супернатанты лизатов тканей нанесены из рассчета 50мкг белка в трек. БОв-электрофорез проводили - в 7,5% ПААГ с 0,1 % желатином.

Результаты, полученные по исследованию активности ММП-2 и ММП-9 свидетельствуют о том, что экспрессия этих ферментов происходит не только в опухолевых клетках, но и в прилегающей к ним морфологически нормальной ткани (рис.9). Иммуно гистохимическое исследование.

Работа проводилась совместно с отделением патологической анатомии Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена.

4 5

N Т N Т

Иммуношстохимические исследования были предприняты с целью выяснения возможных различий по экспрессии ММП и их регуляторов в зависимости от клинических показателей, таких как, наличие метастазов и степень дифференцировки опухолевых клеток. Исследование экспрессии МПП-1, ММП-2, ММП-9 , ТИМП-1 и ТИМП-2 методом иммуногистохимии было проведено на 24 образцах карцином шейки матки. Количественная оценка результатов проводилась по интенсивности реакции полуколичественным методом по бальной шкале от 0 до 3 баллов. Материал был разделен на две группы с учетом наличия {№) или отсутствия (Н-) метастазов в региональные лимфатические узлы. Для сравнительного иммуногистохимического анализа было взято 13 образцов опухолей без метастазов (Г*}-) и 11 образцов опухолей, в которых были обнаружены неотдаленные метастазы

□ ИГХ реакция

отсутствует ■ интенсивность ИГХ

реакции 1 + О интенсивность ИГХ реакции 2+3+

Рис.10 Зависимости уровней экспрессии ММП и их ингибиторов от наличия метастазов в образцах карцином шейки матки.

Как видно из диаграммы (рис.10), во всех без исключений образцах опухолей, где были обнаружены метастазы экспрессировалась ММП-1, причем в большинстве случаев экспрессия оценивалась в 2-3 балла, в образцах без метастазов высокая экспрессия ММП-1 была обнаружена только в 29% случаев, в остальном же она была низкой или отсутствовала. ММП-9 экспрессировалась в 90% образцов, из них в 80% экспрессия была наивысшей и оценивалась в 2-3 балла. Выраженных различий в экспрессии ММП-2 в образцах с метастазами и без метастазов обнаружено не было, причем в образцах без метастазов высокая активность ММП-2 была обнаружена даже в большем количестве образцов, чем в

случае образцов с метастазами. Слабая экспрессия ТИМП-1 и ТИМП-2 была обнаружена в образцах метастазирующих опухолей, так же как и в опухолях без метастазов

Корреляционный анализ результатов показал, что данные по степени дифференцировки клеток опухоли имеют обратную корреляцию с высоким уровнем экспрессии ММП-1, ММП-2 и ММП-9 (коэффициенты корреляции 0,5, 0,43 и 0,36 соответственно), а данные по экспрессии ММП-1 и ММП-9 имеют прямую корреляцию с данными о наличии метастазов (коэффициенты корреляции 0,4 и 0,37 соответственно).

Полученные данные, как на исследованных клеточных линиях, так и на образцах опухолей, свидетельствуют о том, что основной вклад в деструктивный (инвазивный) потенциал трансформированных клеток вносит увеличение экспрессии ММП-1 и ММП-9, и в меньшей степени - увеличение экспрессии ММП-2 и снижение экспрессии ингибиторов -ТИМП-1 и ТИМП-2.

выводы

1. Трансформация фибробластов крысы геном Е7 HPV16 сопровождается увеличением деструктивного (инвазивного) потенциала клеток, которое связано с увеличением экспрессии мРНК фермента - мембраносвязанной матриксной металлопротеиназы (МТ1-ММП) и снижением экспрессии тканевого ингибитора ММП (ТИМП-1), в то время как экспрессия активатора - уАП (активатора плазминогена уракиназного типа) остается на уровне контроля. Эти данные согласуются с увеличением коллагенолитической активности (ММП-1, МТ1-ММП) в трансформированных фибробластах и снижением уровня эндогенных ингибиторов (ТИМП-1, ТИМП-2) в этих клетках.

2. Иммортализация фибробластов крысы LT-геном вируса полиомы сопровождается увеличением деструктивного потенциала клеток, хотя на значительно более низком уровне, чем в трансфомированных фибробластах, и связано с увеличением экспрессии мРНК фермента (МТ1-ММП) и активатора (уАП), которое приводит к увеличению коллагенолитической активности ферментов (ММП-1, МТ1-ММП).

3. В коммерческих линиях клеток человека, трансформированных онкогенами HPV18 (Hela, С4-1), деструктивный потенциал значительно выше, чем в клетках, трансформированных HPV16 (Siha, Caski). Увеличение деструктивного потенциала всех линий клеток связано с увеличения экспрессии ММП-1 и МТ1-ММП, в то время как экспрессия ММП-2 существенно не изменяется, а ММП-9 была обнаружена только в линии клеток Hela. Экспрессия ТИМП-1 и ТИМП-2 находится на уровне контроля.

4. В большинстве взятых во время операции образцов плоскоклеточных карцином шейки матки экспрессия ММП носит более выраженный характер, чем в исследованных клеточных линиях. Деструктивный потенциал образцов опухолей ассоциирован с экспрессией ММП-1 и ММП-9 (и в меньшей степени ММП-2), а также с низким уровнем экспрессии ТИМП-1, ТИМП-2 и МТ1-ММП. Иммуногистохимические данные по экспрессии ММП-1, ММП-2, МПП-9 в опухолевой ткани имеют обратную корреляцию с данными по степени дифференцировки клеток (коэффициенты корреляции - 0,5, 0,43 и 0,36 соответственно), а данные по экспрессии ММП-1 и ММП-9 имеют прямую корреляцию с данными о наличии метастазов (коэффициенты корреляции - 0,4 и 0,37 соответственно).

5. В прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани обнаружена существенная экспрессия ММП-1, ММП-2, ММП-9, которая, по-видимому, вносит свой дополнительный вклад в увеличение деструктивного потенциала опухоли.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Рыжакова О С., Соловьева Н.И. Метод определения активности тканевых кодлагеназ с помощью коллагена меченного флуоресцеин изотиоцианатом. //Биомедицинская химия. -2005,- Т 51.-С 432-438.

2 Рыжакова О.С, Гуреева Т.А, Журбицкая В.А., Соловьева Н.И. Экспрессия интерстициальной коллагеназы и эндогенных регуляторов ее активности в фибробластах , трансформированных геном Е7 HPV-16. //Биомедицинская химия - 2007. - Т. 53 - С 322331.

2а. Ryzhakova O.S , Gureeva Т.А., Zhurbilskaya V А , Solovyeva NI Expression of interstitial collagenase and its endogenous regulators in immortalized and transformed by HPV16 E7 gene fibroblasts // Biochemistry (Moscow) Supplement Scries B- Biomedical Chemistry - 2007 - Vol 1 -№4.-pp. 342-347

3 Рыжакова О С , Киселева Н П , Завалишина Л Э , Андреева Ю.Ю . Петров А Н, Франк Г.А, Соловьева Н И Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их эндогенных ингибиторов в плоскоклеточных карциномах шейки матки. //Материалы международной конференции « Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» - Минск - 2007. - С.68-69

4 Рыжакова О.С ,Гуреева ТА, Соловьева НИ Экспрессия интерстициальной коллагеназы и эндогенных регуляторов ее активности в иммортализованных и трансформированных геном Е7 HPV-16 фибробластах. //Материалы VI симпозиума "Химия протеолшических ферментов". - Москва, - 2007.-С.137.

5. Соловьева Н И, Гуреева Т. А., Рыжакова О.С. Матриксные металлопротеиназы и их эндогенные регуляторы в клетках трансформированных онкогенами HPV16 и HPV18. //Материал! IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. -Новосибирск - 2008. - С.222

6. Рыжакова О.С., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю, Франк Г.А, Соловьева Н.И Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы в плоскоклеточных карциномах шейки матки. //Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов - Новосибирск. - 2008. - С 444

Для заметок

Подписано в печать 07.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ №1125 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рыжакова, Ольга Сергеевна

Оглавление.2

Список сокращений.

Введение.6

Глава I Обзор литературы.9

1.1. Общая характеристика ММП.9

1.2. Структура ММП.12

1.3. Характеристика основных подсемейств ММП.17

1.3.1. Коллагеназы.17

1.3.2. Желатиназы.22

1.3.3. Стромелизины.

1.3.4. Матрилизины.24

1.3.5. Мембраносвязанные ММП.25

1.3.6. Неклассифицированные ММП.26

1.4. Регуляция активности ММП.28

1.4.1. Регуляция транскрипции.28

1.4.2. Активация про-ММП.30

1.4.3. Эндогенные тканевые ингибиторы ММП (ТИМП).32

1.5. Роль ММП в опухолевой прогрессии.33

1.5.1. ММР-1 или коллагеназа-1(интерстициальная коллагеназа) в прогрессии опухоли.35

1.5.2. МТ1-ММР- мембраносвязанная ММП- в клеточной инвазии.37

1.5.3. Роль коллагеназы —3 - ММР-13 в прогрессии опухоли.40

1.5.4. ММР-8 - коллагеназа —2 (коллагеназа нейтрофилов) в прогрессии опухоли .41

1.6. Некоторые регуляторные функции ММП.42

Глава П Материалы и методы исследования.45

ПЛ. Использованные материалы.45

11.1.1. Список использованных реактивов.45

11.1.2. Клеточные линии.

Н.1.3. Клинический материал.

II.2. Методы исследования.48

11.2.1. Одновременное выделение ДНК и РНК гуанидинизотиоцианатным методом.48

11.2.2. Реакция обратной транскрипции РНК.49

11.2.3. Исследование экспрессии генов.50

II.2.3.1 Полимеразная цепная реакция (RT-PCR).52

II.2.3.2. Электрофорез в агарозном геле.

11.2.4. Определение коллагенолитической активности.52

11.2.4.1. Выделение коллагена из кожи крыс.

11.2.4.2. Определение концентрации коллагена по содержанию оксипролина.

И.2.4.3. Получение меченного флуоресцеинизотиоцианатом коллагена.53

II.2.4.4.Определение коллагенолитической активности.55

11.2.5. Идентификация коллагеназ IV типа, с помощью метода зимографии.

11.2.6. Иммуногистохимическое исследование.

Глава III Результаты исследования и их обсуждение.58

Ш.1. Сравнительное исследование экспрессии ММП-1. МТ1-ММП.59

ТИМП-1 и уАП на модели фибробластов крысы

111.1.1. Экспрессия генов ММП-1, МТ1-ММП, ТИМП-1 и уАП.69

Ш.1.2. Исследование коллагенолитической активности ММП.62

Ш.2. Сравнительное исследование экспрессии ММП-1. ММП-2 МТ1-ММП. уАП. ТИМП-1.2 в коммерческих клеточных линиях карцином шейки матки человека, ассоциированных с HPV-16 и HPV-18. .68

Ш.2.1. Экспрессия генов ММП-1, ММП-2, МТ1-ММП и эндогенных регуляторов их активности.68

111.2.2. Сравнительное исследование коллагенолитической активности.72

Ш.З. Исследование экспрессии ММП-1. МТ1-ММП. ММП-2. ММПуАП. ТИМП-1. ТИМП-2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки,.74

Ш.3.1. Эспрессия генов ММП-1, МТ1-ММП, ММП-2, ММП-9, уАП, ТИМП-1 и ТИМП-2 в плоскоклеточных карциномах шейки матки.75

Ш.3.2. Исследование коллагенолитической активности.77

111.3.3. Исследование ММП-2, ММП-9 методом зимографии.79

III.3.4. Иммуногистохимическое исследование.80

Выводы.85

Список опубликованных работ по теме диссертации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16)"

Матриксные металлопротеиназы или ММП относятся к семейству цинковых кальций-зависимых металлопротеиназ, функция которых связана с обменом белков соединительно-тканного матрикса (СТМ). Эти ферменты в совокупности способны гидролизовать все компоненты СТМ. ММП играют решающую роль в таких биологических процессах, как эмбриогенез, ремоделирование и репарация тканей, а также при развитии ряда патологических процессов, таких как ревматоидные артриты, остеоартриты, аневризмы аорты, периодонтиты, аутоимунные поражения кожи (1, 2) и т.д.

Особое место отводится ММП в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей. Тканевые коллагеназы (ММП-1, ММП-8, ММП-13), наряду с желатиназами (ММП-2, ММП-9), относятся к ММП и играют решающую роль в развитии этих процессов, поскольку они специфически гидролизуют белки группы коллагена — одного из основных компонентов СТМ. Коллагеназы, и в частности интерстициальная коллагеназа (ММП-1), специфически гидролизуют фибрилярные коллагены I, II, III, V и IX типов (2), которые составляют 25% от общего белка организма человека. Нативные фибриллярные коллагены устойчивы к действию протеолитических ферментов. ММП-1 специфически запускает гидролиз фибриллярных коллагенов, при этом она гидролизует всего одну связь в молекуле этого белка, находящуюся на расстоянии Ул длины молекулы от С-конца. Образующиеся фрагменты способны денатурировать в физиологических условиях и далее подвергаться действию широкого спектра протеиназ, тем самым ММП-1 обеспечивает развитие деструктивного процесса (2). Желатиназы гидролизуют коллаген IV типа -основу базальных мембран (3). Этим двум группам ферментов принадлежит ключевая роль в разрушении соединительно-тканного барьера при развитии инвазивного онкологического процесса.

Нами было исследовано влияние гена Е7 вируса папиллом человека 16 типа (HPV16) на экспрессию ММП и их эндогенных регуляторов.

Вирусы папиллом (HPV) высокого риска - HPV16 и HPV18 являются этиологическими факторами возникновения рака шейки матки (4, 5, 6). Эти типы HPV являются наиболее агрессивными и широко распространенными. За открытие ключевой роли вируса HPV в возникновении рака шейки матки доктору Харольду цур Хаузену в 2008 году была присуждена Нобелевская премия. В настоящее время созданы вакцины против онкогенных вирусов папиллом человека, которые в ряде стран уже используются для предотвращения рака шейки матки. По статистическим данным в мире регистрируется до 500 тысяч новых случаев рака шейки матки, а женщины развивающихся стран подвержены этому заболеванию в 10 раз больше, чем остальные. Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности от рака у женщин. Установлено, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7 (4, 5, 6). У 90% больных раком шейки матки обнаруживаются транскрипты генов Е6 и Е7 в биопсийном материале. Однако функциональный потенциал генов Е6 и Е7 остается недостаточно изученным. Так недостаточно исследовано изменение протеолитического потенциала клеток и тканей, в частности интерстициальной коллагеназы, при трансформации их этим вирусом, что может служить важным маркером инвазивного процесса.

Настоящая работа является продолжением и частью исследований, проводимых в лаборатории биохимии и химической патологии белков ГУ НИИ БМХ РАМН и направленных на выяснение роли ММП в многоступенчатом процессе канцерогенеза. Целью настоящего исследования является выяснение особенностей экспрессии интерстициальной коллагеназы (ММП-1), эндогенных регуляторов ее активности, как факторов инвазии, при онкогенной трансформации фибробластов геном Е7 HPV16.

В соответствии с указанной целью поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнительные исследования экспрессии ММП-1 , и эндогенных регуляторов её активности: тканевого ингибитора ММП - ТИМП-1 и активатора плазминогена уракиназного типа - уАП на фибробластах крысы, иммортализованных LT геном вируса полиомы и трансформированных геном Е7 HPV16. Исследования провести на уровне мРНК и белка.

2) На коммерческих клеточных линиях, полученных из опухолей шейки матки женщин: SiHa, Caski, Hela, С4-1, а также линии клеток СЗЗА, не содержащей копий HPV, провести сравнительные исследования экспрессии ММП-1, ММП-14 и ММП-2 ММП-9 (как двух групп ферментов, отвечающих за развитии инвазивного процесса), а также регуляторов их активности ТИМП-1, ТИМП-2 и у-АП на уровне мРНК и энзимологическом уровне.

3) Исследовать экспрессию ММП-1, ММП-2, ММП-9 и МТ1-ММП, а также ТИМП-1, ТИМП-2 и у-АП на операционных образцах плоскоклеточных карцином шейки матки, ассоциированных с геном Е7 HPV16 с использованием RT-PCR и методами иммуногистохимии и энзимологии.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рыжакова, Ольга Сергеевна

Выводы.

1. Трансформация фибробластов крысы геном Е7 HPV16 сопровождается увеличением деструктивного (инвазивного) потенциала клеток, которое связано с увеличением экспрессии мРНК фермента — мембраносвязанной матриксной металлопротеиназы (МТ1-ММП) и снижением экспрессии тканевого ингибитора ММП (ТИМП-1), в то время как экспрессия активатора - уАП (активатора плазминогена уракиназного типа) остается на уровне контроля. Эти данные согласуются с увеличением коллагенолитической активности (ММП-1, МТ1-ММП) в трансформированных фибробластах и снижением уровня эндогенных ингибиторов (ТИМП-1, ТИМП-2) в этих клетках.

3. В коммерческих линиях клеток человека, трансформированных онкогенами HPV18 (Hela, С4-1), деструктивный потенциал значительно выше, чем в клетках, трансформированных онкогенами HP VI6 (Siha, Caski). Увеличение деструктивного потенциала всех линий клеток связано с увеличения экспрессии ММП-1 и МТ1-ММП, в то время как экспрессия ММП-2 существенно не изменяется, а ММП-9 была обнаружена только в линии клеток Hela. Экспрессия ТИМП-1 и ТИМП-2 находится на уровне контроля.

4. В большинстве взятых во время операции образцов плоско клеточных карцином шейки матки экспрессия ММП носит более выраженный характер, чем в исследованных клеточных линиях. Деструктивный потенциал образцов опухолей ассоциирован с экспрессией ММП-1 и ММП-9 (и в меньшей степени ММП-2), а также с низким уровнем экспрессии ТИМП-1, ТИМП-2 и МТ1-ММП. Иммуногистохимические данные по экспрессии ММП-1, ММП-2, Ml 111-9 в опухолевой ткани имеют обратную корреляцию с данными по степени дифференцировки клеток (коэффициенты корреляции — 0,5, 0,43 и 0,36 соответственно), а данные по экспрессии ММП-1 и ММП-9 имеют прямую корреляцию с данными о наличии метастазов (коэффициенты корреляции - 0,4 и 0,37 соответственно).

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Рыжакова О.С., Соловьева Н.И. Метод определения активности тканевых коллагеназ с помощью коллагена меченного флуоресцеин изотиоцианатом. //Биомедицинская химия. - 2005. - Т. 51. - С. 432-438.

2. Рыжакова О.С., Гуреева Т.А, Журбицкая В.А., Соловьева Н.И. Экспрессия интерстициальной коллагеназы и эндогенных регуляторов ее активности в фибробластах , трансформированных геном Е7 HPV-16. //Биомедицинская химия.-2007. - Т. 53. - С. 322-331.

2а. Ryzhakova O.S., Gureeva Т.А., Zhurbitskaya V.A., Solovyeva N.I. Expression of interstitial collagenase and its endogenous regulators in immortalized and transformed by HPV16 E7 gene fibroblasts. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry.- 2007.- Vol.1.- №4.-pp. 342-347

3. Рыжакова O.C., Киселева Н.П., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Петров А.Н., Франк Г.А., Соловьева Н.И. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их эндогенных ингибиторов в плоскоклеточных карциномах шейки матки. //Материалы международной конференции « Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» - Минск. — 2007. - С.68-69

4. Рыжакова О.С., Гуреева Т.А., Соловьева Н.И. Экспрессия интерстициальной коллагеназы и эндогенных регуляторов ее активности в иммортализованных и трансформированных геном Е7 HPV-16 фибробластах. //Материалы VI симпозиума "Химия протеолитических ферментов". - Москва. -2007. - С.137.

5. Соловьева Н. И., Гуреева Т. А., Рыжакова О.С. Матриксные металлопротеиназы и их эндогенные регуляторы в клетках трансформированных онкогенами HPV16 и HPV18. //Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск - 2008. - С.222

6. Рыжакова О.С., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы в плоскоклеточных карциномах шейки матки. //Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. — Новосибирск. - 2008. -С.444.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыжакова, Ольга Сергеевна, Москва

1. Kerkela Е., Saarialho-Kere U. Matrix metalloproteinases in tumor progression: focus on basal and squamous cell skin cancer // Exp. Dermatol.-2003- Vol. 12.-P.109-125.

2. Ala-Aho R., Kahari V.-M. Collagenases in cancer // Biochemie -2005- Vol.87-P.273-286

3. Nabeshima K., Inoue Т., Shimao Y. and Sameshima T. Matrix metalloproteinases in tumor invasion: Role for cell migration// Pathology International-2002- Vol. 52-P.255-264

4. Longwarth M. S., Laimins L. A. Pathogenesis of Human Papillomaviruses in Differentiating Epithelia// Microbiology and Molecular Biology Reviews-2004,-P.362-372

5. Munger K., Baldwine A., Edwards К., M. et al., Mechanism of Human Papillomavirus- Indused Oncogenesis // Journal of Virology -2004 P. 11451-11460

6. Um S.-J., Lee S.-Y., Kim E.-J., Myoung J., Down-regulation of pappilomavirus E6/E7 oncogene by arsenic trioxide in cervical carcinoma cells // Cancer Letters- 2002-181 P. 11 -22

7. Lynch C., Matrisian L. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication// Differentiation-2002-Vol. 70-P. 561-573

8. Folgueras A.R, Pendas A. M., Sanchez L. M., Loprz-Otin C. Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies//1.t. J. Dev. Biol.-2004-Vol. 48-P. 411-424

9. Overall С. M., Molecular determinants of metalloproteinase substrate specificity: matrix metalloproteinase substrate binding domains, modules, and exosites // Mol. Biotechnol.- 2002-Vol. 22-P. 51-86.

10. Bjorlund M., Koivunen E., Gelatinase-mediated migration and invasion of cancer cell // Biochemica et biophysica Acta-2005-Vol. 1755-P. 37-69.

11. Maskos K., Crystal structure of MMPs in complex with physiological and pharmacological inhibitors // Biochemie-2005-Vol. 87-P. 249-263

12. Zucker S., Pei D., Cao J,. Loprz-Otin C. Membrane type-matrix metalloproteinases (MT-MMP) //-Curr. Top Dev. Biol.-2003-Vol. 54-P. 1-74.

13. Pardo A., Selman M., MMP-1: the elder of the family // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology-2005-Vol. 37-P. 283-288

14. Nagase H., Visse R., Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. // Cardiovascular Research-2006-Vol. 69-P. 562-573

15. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции // Биоорганическая химия 1998- Т. 24, №4 - с.245-255.

16. Holmback К., Bianco P., Yamada S., Birkedal-Hansen Н., МТ1-ММР: А Tethered Collagenase//-Journal of Cellular Physiology-2004-Vol. 200-P. 11-19

17. John A., Tuszynski G., The role of matrix metalloproteinases in tumor angiogenesis and tumor metastasis // Pathology Oncology Research-2001-Vol. 7-№l.

18. Van Wart H, Birkedal-Hansen H. The cysteine switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloprotein-ase gene family // Proc Natl Acad Sci U S А-1990-Vol. 87-P. 55785582.

19. Nagase H, Woessner J F. Matrix metalloproteinases//-J. Biol. Chem.-1999-Vol. 274-P. 21491-21494.

20. Gross J., Lapiere C.M., Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissueculture assay // Proc. Natl.Acad. Sci. USA-1962-Vol. 48-P. 1014-1022.

21. Goldberg G.I., Wilhelm S.M., Kronberger A., Bauer E.A.,. Grant G.A, Eisen A.Z., Human fibroblast collagenase. Complete primary structure and homology to an oncogene transformation-induced rat protein // J. Biol. Chem.-1986-Vol. 261-P. 66006605.

22. Overall C.M., Lopez-Otm C., Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for the post-trial era//Nat. Rev. Cancer-2002-Vol. 2-P. 657-672.

23. Egeblad M., Werb Z., New functions for the matrix metalloprotein-ases in cancer progression//-Nat. Rev. Cancer-2002-Vol. 2-P. 161-174.

24. Giambernardi T.A., Grant G.M., Taylor G.P., Hay R.J., Maher V.M., McCormick J.J., Klebe R.J., Overview of matrix metalloproteinase expression in cultured human cells // Matrix Biol.- 1998-Vol. 16-P. 483-496.

25. Lindsey M.L. MMP Induction and Inhibition in Myocardial Infarction: Special Issue: The Matrix Metalloproteinases: New Insights into Myocardial Remodeling // Heart Failure Reviews-2004-Vol. 9-P. 7-19.

26. Prikk K., Maisi P., Pirila E., Sepper R., Salo Т., Wahlgren J., Sorsa Т., In vivo collagenase-2 (MMP-8) expression by human bronchial epithelial cells and monocytes/macrophages in bronchiectasis//-.!. Pathol.- 2001-Vol. 194-P. 232-238.

27. Lindy O., Konttinen Y.T., Sorsa Т., Ding Y., Santavirta S., Ceponis A., Lopez-Otin C., Matrix metalloproteinase 13 (collagenase 3) in human rheumatoid synovium // Arthritis Rheum.- 1997-Vol. 40-P. 1391-1399.

28. Mao D., Lee J.K., VanVickle S.J., Thompson R.W., Expression of collagenase-3 (MMP-13) in human abdominal aortic aneurysms and vascular smooth muscle cells in culture // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1999-Vol. 261-P. 904910.

29. Knauper V., Lopez-Otin C., Smith В., Knight G., Murphy G., Biochemical characterization of human collagenase-3 //J. Biol. Chem.-1996-Vol. 271-P. 1544-1550.

30. Ashworth J.L., Murphy G., Rock M.J., Sherratt M.J., Shapiro S.D., Shuttleworth C.A., Kielty C.M., Fibrillin degradation by matrix metalloproteinases: implications for connective tissue remodeling // Biochem. J.- 1999-Vol. 340-P. 171— 181.

31. Fosang A.J., Last К., Knauper V., МифЬу G., Neame P.J., Degradation of cartilage aggrecan by collagenase-3 (MMP-13) // FEBS Lett.- 1996-Vol. 380-P. 1720.

32. Nagase H., Hooper. L., Zink metalloproteinases in health and disease, Ed.N.M // Taylor & Francis Ltd.-1996- P. 286-292

33. Sato H. A matrix metalloproteinase expressed on the sureface of invasive tumor cells // Nature-370-Р. 61-65

34. Kinoshita T, Sato H, Okada A. et al. TIMP-2 promotes activation of progelatinase A by membrane-type 1 matrix metalloprotein-ase immobilized on agarose beads // J. Biol. Chem.-1998-Vol. 273-P. 16 098-16 103.

35. Atkinson J. J. & Senior R. M., Matrix Metalloproteinase-9 in Lung Remodeling // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.- 2003-Vol. 28-P. 12-24.

36. Visse R., Nagase H. Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitorsof Metalloproteinases Structure, Function, and Biochemistry // Circ Res.-2003-Vol. 92-P. 827-839.

38. Muller D., Breathnach R., Engelmann A., et al. Expression of collagenase-related metalloproteinase genes in human lung or head and neck tumours // Int J Cancer-1991-Vol. 48-P. 550-556.

39. Polette M., Claver C., Muller D., Abecassis J., Binninger I., Birembaut P. Detection of mRNAs encoding collagen-ase-l and stromelysin-2 in carcinomas of the head and neck by in situ hybridization // Invasion Metast-1991-Vol. 11-P. 76-83.

40. Rechardt O., Elomaa O., Vaalamo M., et al. Stromelysin-2 is upregulated during normal wound repair and is induced by cytokines // J. Invest. Dermatol.-2000-Vol. 115-P. 778-787.

41. Sternlicht M., Lochter A., Sympson С J., et al. The stromal proteinase MMP3/stromelysin-l promotes mammary car-cinogenesis // Cell.-1999-Vol. 98-P. 137-146.

42. McCawley L., Matrisian L. M. Matrix metalloproteinases: multifunctional contributors to tumor progression // Mol. Med. Today-2000-Vol. 6-P. 149-156.

43. Suzuki M., Raab G., Moses M.A., Fernandez C.A. & Klags-brun M. Matrix metalloproteinase-3 releases active hep-arin-binding EGF-like growth factor by cleavage at a specific juxtamembrane site // J. Biol. Chem.-1997-Vol. 272-P. 3173031737

44. Dunsmore S., Saarialho-Kere U. K., Roby J. D., et al. Matri-lysin expression and function in airway epithelium // J. Clin. Invest.-1998-VoI. 102-P. 1321-1331.

45. Saarialho-Kere U., Vaalamo M., Puolakkainen P., Airola K., Parks W. C., Karjalainen-Lindsberg M. L. Enhanced expression of matrilysin, collagenase, and stromelysin-1 in gastrointestinal ulcers // Am. J. Pathol.-1996-VoI. 148-P. 519-526.

46. Basset P., Bellocq J. P., Wolf C., et al. A novel metalloprotein-ase gene specifically expressed in stromal cells of breast carcinomas //Nature- 1990-Vol. 348-P. 699-704.

47. Muller D., Breathnach R., Engelmann A., et al. Expression of collagenase-related metalloproteinase genes in human lung or head and neck tumours // Int. J. Cancer-1991-Vol. 48-P. 550-556

48. Karelina Т., Goldberg G. I., Eisen A. Z. Matrilysin (PUMP) correlates with dermal invasion during appendageal development and cutaneous neoplasia // J. Invest. Dermatol.-1994-Vol. 103-P. 482-487

49. Park H., Ni J., Gerkema F. E., Liu D., Belozerov V. E., Sang Q. X. Identification and characterization of human endo-metase (Matrix metalloproteinase-26) from endometrial tumor // J. Biol. Chem.-2000-Vol. 275-P. 20540-20544.

50. Sato H., Takino Т., Okada Y., et al. A matrix metalloprotein-ase expressed on the surface of invasive tumour cells //Nature-1994-Vol. 370-P. 61-65

51. Will H., Hinzmann В. cDNA sequence and mRNA tissue distribution of a novel human matrix metalloproteinase with a potential transmembrane segment // Eur. J. Biochem.-1995-Vol. 231-P. 602-608.

52. Puente X., Pendas A. M., Llano E., Velasco G., Lopez-Otin C. Molecular cloning of a novel membrane-type matrix metalloproteinase from a human breast carcinoma// Cancer. Res.-1996-Vol. 56-P. 944-949.

53. Llano E., Pendas A. M., Freije J. P., et al. Identification and characterization of human MT5-MMP, a new membrane-bound activator of progelatinase a overexpressed in brain tumors // Cancer. Res.-1999-Vol. 59-P. 2570-2576.

54. Pei D. Leukolysin/MMP25/MT6-MMP. a novel matrix metalloproteinase specifically expressed in the leukocyte lineage // Cell. Res.-1999a-Vol. 9-P. 291-303.

55. Velasco G., Cal S., Merlos-Suarez A., et al. Human MT6-matrix metalloproteinase: identification, progelatinase A activation, and expression in brain tumors // Cancer. Res.-2000-Vol. 60-P. 877-882.

56. Knauper V., Will H., Lopez-Otin C., et al. Cellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation. Evidence that MT1-MMP (MMP-14) and gelatinase a(MMP-2) are able to generate active enzyme // J. Biol. Chem.-1996-Vol. 271-P. 17124-17131.

57. Nelson A., Fingleton В., Rothenberg M. L., Matrisian L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications // J. Clin. 0ncol.-2000-Vol. 18-P. 1135-1149.

58. Zhou Z., Apte S. S., Soininen R., et al. Impaired endochon-dral ossification and angiogenesis in mice deficient in membrane-type matrix metalloproteinase I // Proc. Natl. Acad. Sci.-2000-Vol. 97-P. 4052-4057.

59. Holmbeck K., Bianco P., Caterina J., et al. MTl-MMP-de-ficient mice develop dwarfism, osteopenia, arthritis, and connective tissue disease due to inadequate collagen turnover// Cell-1999-Vol. 99-P. 81-92

60. Basset P., Bellocq J. P., Wolf C., et al. A novel metalloprotein-ase gene specifically expressed in stromal cells of breast carcinomas //Nature-1990-Vol. 348-P. 699-704

61. Rouyer N., Wolf C., Chenard M. P., et al. Stromelysin-3 gene expression in human cancer: an overview // Invasion Metastasis-1994-Vol. 14-P. 269-275.

62. Shapiro S., Kobayashi D., Ley T. J. Cloning and characterization of a unique elastolytic metalloproteinase produced by human alveolar macrophages // J. Biol. Chem.-1993-Vol. 268-P. 23824-23829

63. Vaalamo M., Karjalainen-Lindsberg M. L., Puolakkainen P., Kere J., Saarialho-Kere U. Distinct expression profiles of stromelysin-2 (MMP-10), collagenase-3

64. MMP-13), macrophage metalloelastase (MMP-12), and tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (T1MP-3) in intestinal ulcer-ations // Am. J. Pathol.-1998-Vol. 152-P. 1005-1114

65. Shipley J., Wesselschmidt R. L., Kobayashi D. K., Ley T. J., Shapiro S. D. Metalloelastase is required for macrophage-mediated proteolysis and matrix invasion in mice //Proc. Natl. Acad. Sci. U S A-1996-Vol. 93-P. 3942-3946

66. Stracke J. O., Hutton M., Stewart M., et al. Biochemical characterization of the catalytic domain of human matrix metalloproteinase 19. Evidence for a role as a potent basement membrane degrading enzyme // J. Biol. Chem.-2000-Vol. 275-P. 1480914816

67. Llano E., Pendas A. M., Knauper V., et al. Identification and structural and functional characterization of human en-amelysin (MMP-20) // Biochemistry-1997-Vol. 36-P. 15101-15108

68. Pei D., Kang Т., Qi H. Cysteine array matrix metalloprotein-ase (CA-MMP) /ММР-23 is a type II transmembrane matrix metalloproteinase regulated by a single cleavage for both secretion and activation // J. Biol. Chem. 2000-Vol. 275-P. 3398833997

69. Lohi J., Wilson C. L., Roby J. D., Parks W. C. Epilysin, a novel human matrix metalloproteinase (MMP-28) expressed in testis and keratinocytes and in response to injury //-J. Biol. Chem.-2001-Vol. 276-P. 10134-10144.

70. Marchenko G., Strongin A. Y. MMP-28, a new human matrix metalloproteinase with an unusual cysteine-switch sequence is widely expressed in tumors // Gene.-200lb-Vol. 265-P. 87-89.

71. Uria J. A., Jimenez M. G., Balbin M., Freije J. M. & Lopez-Otin C. Differentialeffects of transforming growth factor-beta on the expression of collagenase-1 and collagenase-3 in human fibroblasts // J. Biol. Chem-1998-Vol. 273-P. 9769-9777.

72. Pendas A. M., Balbin M., Llano E., Jimenez M. G. & Lopez-Otin C. Structural analysis and promoter characterization of the human collage-nase-3 gene (MMP 13) // Genomics.-1997-Vol. 40-P. 222-33

73. Karin M., Liu Z G., Zandi E. AP-1 function and regulation // Curr. Opin. Cell. Biol.-1997-Vol. 9-P. 240-246.

74. Wasylyk C., Gutman A., Nicholson R., Wasylyk B. The c-Ets oncoprotein activates the stromelysin promoter through the same elements as several non-nuclear oncopro-teins // EMBO J.-1991-Vol. 10-P. 1127-1134

75. Denhardt D. Oncogene-initiated aberrant signaling engenders the metastatic phenotype: synergistic transcription factor interactions are targets for cancer therapy // Crit. Rev. Oncog.-1996-Vol. 7-P. 261-291

76. Tower G. В., Coon С. I., Belguise K., Chalbos D. & Brinckerhoff С. E. Fra-1 targets the AP-1 site/2G single nucleotide polymorphism (ETS site) in the MMP-1 promoter // Eur. J. Biochem.-2003-Vol. 270-P. 4216-25

77. Westermarck J., Kahari V.M., Regulation of matrix metalloproteinase expression in tumor invasion//FASEB J.-1999-Vol. 13-P. 781-792.

78. Bjo'rklund M., Koivunen E., Gelatinase-mediated migration and invasion of cancer cells // Biochimica et Biophysica Acta-2005-Vol. 1755-P. 37 69

79. Suzuki K., Enghild J. J., Morodomi Т., Salvesen G. & Nagase H. Mechanisms of activation of tissue procollagenase by matrix metalloproteinase 3 (stromelysin) // Biochemistry-1990-Vol. 29-P. 10261-10270

80. Zhai Y., Hotaiy К. В., Nan В., Bosch F. X., Munoz N., Weiss S. J., & Cho K.R. Expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase is associated with cervical carcinoma progression and invasion // Cancer Research-2005-Vol. 65-P. 6543-6550.

81. Fingleton В., Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis. I I Front Biosci.-2006-Vol.ll-P. 479-491.

82. Nagase H., Woessner J. F Jr. Matrix metalloproteinases // J. Biol. Chem.-1999-Vol. 274(31 )-P.21491-21494.

83. Baker A.H., Edwards D.R., Murphy G., Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities // J. Cell Sci.-2002-Vol. 115-P. 3719-3727

84. Nasr M., Ayyad S. В., El-Lamie I. K., Mikhail M. Y. Expression of matrix metalloproteinase-2 in preinvasive and invasive carcinoma of the uterine cervix // Eur. J. Gynaecol. C>ncol.-2005-Vol. 26(2)-P. 199-202.

85. Brummer O., Bohmer G., Hollwitz В., Flemming P., Petry K. U. Kuhnle H.Source, MMP-1 and MMP-2 in the Cervix Uteri in Different Steps of Malignant

86. Transformation-An Immunohistochemical // Gynecologic C)ncology-2002-Vol. 84-P. 222-227.

87. Kang Y., Siegel P.M., Shu W., Drobnjak M., Kakonen S.M., Cor-don-Cardo C., Guise T.A., Massague J. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone// Cancer Cell -2003- 3-P. 537-549.

88. Etoh Т., Inoue H., Yoshikawa Y., Barnard G.F., Kitano S., Mori M., Increased expression of collagenase-3 (MMP-13) and MT1-MMP in oesophageal cancer is related to cancer aggressiveness// Gut-2000-47 -P.50—56.

89. Nikkola J., Vihinen P., Vlaykova Т., Hahka-KemppinenM. V. , Kahari M., Pyrhonen S., High collagenase-1 expression correlates with a favourable chemoimmunotherapy response in human meta-static melanoma// Melanoma Res.-2001 -11 -P. 157-166.

90. Moilanen M., Pirila E., Grenman R., Sorsa Т., Salo Т., Expression and regulation of collagenase-2 (MMP-8) in head and neck squamous cell carcinoma//J. Pathol. -2002197 -p.72-81.

91. Balbin M., Fueyo A.,. Tester A.M, Pendas A.M., Pitiot A.S., Astu-dillo A., C.M. Overall, Shapiro S.D., Lopez-Otin C., Loss of collage-nase-2 confers increased skin tumor susceptibility to male mice//Nat. Genet. -2003- 35 -P.252-257.

92. Coussens L. M., Fingleton В., Matrisian L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations // Science-2002 -295(5564) -P. 23872392.

93. Komissarova E. V., Soyfer M. V., Pavlova L. S., Kisseljov F.L. Oncol. Rep.-1995-Vol. 2-P. 1169-1174

94. Zhurbitskaya V. A., Fedorova L. I., Yartseva N. M., Savel'eva L. V., Zelenin A. V., Kisseljov F. L., Mol. Biol.-1999-Vol. 33-P.243-247

95. Yartseva N., Komissarova E., Zhurbitskaya V., Kisseljova N., Pavlova L., FedortsevaR., Kisseljov F., Oncol. Rep.-1997-Vol. 4-P. 629-635

96. Schwarz E., Freese U. K., Gissmann L., Mayer W., Roggenbuck В., Stremlau A., zur Hausen H. Structure and transcription of human papillomavirus sequences incervical carcinoma cells //Nature.- 1985-Vol. 314-P. 111-114.

97. Callahan D. E, Karim A, Zheng G, Tso P. O, Lesko S. A., Quantitation and mapping of integrated human papillomavirus on human metaphase chromosomes using a fluorescence microscope imaging system //Cytometry.-1992; 13(5):453-461.

98. Mincheva A., Gissmann L., zur Hausen H. Chromosomal integration sites of human papillomavirus DNA in three cervical cancer cell lines mapped by in situ hybridization//Med. Microbiol. Immunol.-1987-Vol. 176-P. 245-256.

99. Chirgwin J. M., Przybyla A. E., MacDonald R. J., Rutter W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease // Biochemistry-1979-Vol. 18-P.5294-5299.

100. Samoylova E.V., Shaikhaiev G.O., Petrov S.V., Kisseljova N.P., Kisseljov F.L., //Int. J. Cancer,-1995-Vol. 610P. 337-341.

101. Ivanova Т., Vinikurova S., Petrenko A., Eshilev E. Solovyova N., Kisseljov F., Kisseljova N., // Int. J. Cancer-2004-Vol. 108-P. 882-886.

102. Рыжакова О.С., Соловьева Н.И. Метод определения активности тканевых коллагеназ с помощью коллагена меченного флуоресцеин изотиоцианатом. // Биомедицинская химия-2005.-Т. 51-С. 432-438.

103. Kato Y., Yamashita Т., Ishikawa M., Relationship between expression of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 and invasion ability of cervical cancer cells. // Oncology Reports.-2002-Vol.9(3)-P.565-569.

104. John A., Tuszyski G. The Role of Matrix Metalloproteinases in Tumor

105. Angiogenesisand Tumor Metastasis // Pathology oncology research-2001-№ 1-Vol 7,

106. Sheu В., Ysu S., Ho H., A novel role of metalloproteinase in cancer-mediated immunosupression // Cancer Res. 2001 -61(1)- P. 237-242.

107. Rauvala M., Aglund K., Puistola U., Turpeenniemi-Hujanen Т., Horvath G., Willen R., Stendahl U. Matrix metalloproteinases-2 and -9 in cervical cancer: different roles in tumor progression // Int. J. Gynecol. Cancer.-2006-Vol. 16(3)-P. 1297-302.

108. Arguello-Ramirez J., Perez-Cardenas E., Delgado-Chavez R., Solorza-Luna G., Villa-Trevino S., Arenas-Huertero F. Matrix metalloproteinases-2, -3, and -9 secreted by explants of benign and malignant lesions of the uterine cervix // Int. J. Gynecol.

109. Cancer.-2004-Vol. 14(2)-P. 333-40.

Информация о работе

Рыжакова, Ольга Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Интерстициальная коллагеназа (ММП-1) и её эндогенные регуляторы при трансформации фибробластов геном Е7 вируса папилломы человека 16 типа (HPV16) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы