Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсивная технология получения низина с использованием мутантного штамма Lactococcus lactis

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсивная технология получения низина с использованием мутантного штамма Lactococcus lactis"

На правах рукописи

Гула Елена Александровна

ИНТЕНСИВНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МУТАНТНОГО ШТАММА ЬасЮсоссиэ /ас/к.

Специальность: 03.00.23 - «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003466226

Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология»

Научный руководитель:

Сергеева Алла Владимировна,

Официальные оппоненты: Авчиева Пенкер Бабаевна,

доктор технических наук, профессор Складнсв Дмитрий Анатольевич,

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ОАО «Государственный Научный Центр по Антибиотикам»

Защита состоится 14 апреля 2009 года в Ючас.ЗО мин. на заседании объединенного диссертационного совета ДМ212.204.13 в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд.443(Конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан <_- марта 2009г.

Ученый секретарь объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 кандидат технических наук

И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Бактериоцин низин, продуцируемый определенными штаммами молочнокислых бактерий Lactococciis lactis, широко используется как биологический консервант в пищевой промышленности во многих странах, включая страны ЕС, и обладает статусом GRAS - как безопасный консервант. В настоящее время существуют три крупных производителя низина: Aplin & Barrett Ltd. (Bearainster, Doset, Великобритания), производящий продукт Низаплин", Chr. Hansen A/S (Hoersholm, Дания), производящий Кризин* и Silver elephant (Китай).

Потребность в низине растет пропорционально мировому продовольственному рынку. В настоящее время в России потребление низина составляет 3-4 т/год. и потребности в нем постоянно растут. Все это свидетельствует о динамично развивающемся рынке сбыта природных консервантов и, в частности, низина.

Низин обладает достаточно высокой стоимостью, поэтому вопрос о снижении затрат па его производство имеет значительный коммерческий интерес. В связи с этим селекция высокопродуктивных штаммов-продуцентов низина, модернизация технологического процесса, удешевление сырья и улучшение технико-экономических показателей процесса получения биоконсерванта являются актуальными.

Цель работы

Целью работы является получение штамма Lactococcus lad is subsp . Icciis -продуцента низина, обладающего повышенной продуктивностью, а также усовершенствование технологии производства этого бактериоцина.

Основные задачи:

- ка основе штамма L. lactis subsp. lactis (№ патента: 2151796) получить мутантный штамм с повышенной способностью к низинобразованию;

- произвести сравнительную характеристику мутантного и исходного штаммов культуры L. lactis subsp. lactis по физиологическим и биохимическим признакам;

- оптимизировать состав ферментационной среды для выращивания МКБ путем замены сухого обезжиренного молока иа соевую муку, в качестве альтернативного более дешевого белкового субстрата;

- оптимизировать процесс приготовления ферментационной среды для выращивания МКБ с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения времени, затрачиваемого на ультрафильтрацию в условиях промышленного производства низина.

Научная новизна:

- определены условия поддержания штамма в продуктивном состоянии в течение длительного времени;

- впервые получен оригинальный штамм Lactococcus lactis subsp. /actis BcrR75, устойчивый к антибиотику бацитрацину (Нсгк-20мкг/мл), характеризующийся повышенной способностью к низинобразованию и сокращенным временем ферментации; -показано, что мутация устойчивости к бацитрацину L.lactis привела также к увеличению скоростей потребления лактозы и накопления молочной кислоты, ослаблению эффекта катаболитной репрессии, повышению устойчивости мутантного штамма к окислительному стрессу.

- разработай способ подготовки альтернативной среды для выращивания L.lactis, содержащей протеолизат соевой муки, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды необходимыми культуре питательными компонентами;

Практическая значимость:

- подобрана альтернативная среда для выращивания L. lactis, содержащая гидроли-зат соевой муки, что позволяет избежать использования дорогостоящего пищевого сырья - молока, и, следовательно, снизить стоимость питательной среды в 4 раза;

- предложены новые условия фильтрации питательной среды на стадии осветления, который приводит к сокращению времени фильтрации в 1,5 раза и увеличению выхода низина на 26%, за счет дополнительного обогащения питательной среды пептидами;

- полученный штамм L.lactis subsp. lactis BcrR75 в настоящее время используется в промышленном производстве низина на ООО «Фирма «МАКОФАРМ» в г.Лотошино. Себестоимость продукта от использования предложенного штамма в технологии получения низина снизилась на 27%.

Апробация работы:

Результаты диссертации докладывались: на 10 и 11-ой Путинской школе-конференции молодых ученых: Биотехнология-наука XXI века, г.Пущино, 2006, 2007гг.; на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2007г., на научной конференции студентов и молодых ученых МГИЭ, Москва, 2008г.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы:

Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, описание технологии производства низина, экономическую оценку технологии низина, выводы, список литературы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 24 таблицы и 28 рисунков. Список литературы включает 199 наименований.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы положения, выносимые на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В обзоре литературы рассмотрены биогенез и основные свойства бактериоцина низина А. Описан метаболизм и физиологические аспекты биосинтеза низина А. Отражены пути метаболизма углеводов и катаболитной репрессии в клетках Lactococcus lactis. Обобщены и проанализированы работы, в которых отмечалось, что культуры, устойчивые к полипептидному антибиотику бацитрацину, обладают повышенным уровнем биосинтеза. Обобщены патентные данные о производстве низина в России и за рубежом. Анализ литературных данных позволил сформулировать задачи данного исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись штаммы Lactococcus lactis svbsp.Iactis ВКПМ В-7699 (патент 2151796, РФ, 1999) и полученные на его основе мутанты. Глубинное культивирование проводили в качалочных колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на ротационных качалках (220-250 об/мин) и в лабораторном ферментере «Biotech» с системой термо- и рН-статирования, объемом 4 л (мешалка турбинного типа, 600

об/мин), при температуре 30±1°С. По окончании ферментации количество низина в культуральной жидкости определяли методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus coagulans ВСБ 15-204. В качестве стандарта использовали импортные препараты «Низагшин» и «Кризин». Определение редуцирующих веществ проводили методом Бертрана и методом ТСХ. Аминокислотный анализ проводили с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель 105» (фирма «Люмекс»). Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех повторностях. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненной по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Среда для поддержания МКБ

Проведена работа по подбору защитной среды для хранения молочнокислых бактерий-продуцеитов низина. В результате проведенных исследований из нескольких вариантов сред была выбрана среда для определения молочнокислых микроорганизмов MRS ^глицерин, при хранении на которой при -18°С культура сохраняла жизнеспособность и способность к образованию низина в течение года. Результаты по уровню низинобразования и жизнеспособности глубинных культур при хранении в замороженном состоянии представлены в табл.1.

Таблица 1.

Низинобразующая способность и уровень выживаемости клеток

при длительном хранении культуры_

Месяцев хранения

0 1 2 3 5 ^ 6 12

Низинобразующая способ- 100 104 108 97 97 98 96

ность, % от контроля

Жизнеспособность клеток, 100 99 98 98 97 97 97

% от контроля

Таким образом, среда МКЗ+глицерин позволяет поддерживать культуры НасШ - продуценты низина в замороженном виде длительное время, значительно снижая количество пересевов, риск инфицирования, трудоемкость при проведении селекционных работ в больших объемах.

3.2. Получение нового высокопродуктивного штамма.

Одним из приемов повышения эффективности экспорта целевого продукта из клетки является селекция продуцента на устойчивость к веществу, структурно-родственному целевому продукту и удаляемому из клетки схожей системой иммунитета. Наше внимание привлекла работа, в которой говорилось, что экспорт пептидного антибиотика бацитрацина, образуемого Bacillus licheniformis, осуществляется АВС-транспоргером, и амплификация генов, кодирующих этот транспортер, ведет к повышению биосинтеза бацитрацина.

Отбор устойчивых к бацитрацину вариантов L.laciis проводили на агаризованной среде М17 с добавлением нарастающих концентраций бацитрацина (AppliChem) 4, 8, 12, и 16 мкг/мл. Варианты, выросшие на среде с 16 мкг/мл бацитрацина, имели ослабленный рост и слабую способность к синтезу низина. Варианты, устойчивые к 4-14 мкг/мл бацитрацина были повторно пассированы через моноклоновый рассев с проверкой на устойчивость к бацитрацину. Устойчивые варианты (100 клонов) хранили при -18°С на среде MRS+глицерин.

В результате были отобраны 4 варианта, показавшие наибольшую активность, по сравнению с исходным штаммом и сохраняющие устойчивость к бацитрацину, по крайней мере, в 5 поколениях. Активность этих вариантов представлена на рис. 1.

Таблица 2.

Характеристика исходного штамма и полученных мутантов

Варианты культур Активность, % от контроля % клонов, сохраняющих активность 90-130% от контроля Концентрация бацитрацина, при которой отобран мутант,(мкг/мл)

Мутант №14 136 68 10

Мутант №75 144 100 8

Мутант №86 131 65 8

Мутант №97 134 79 14

К (исх.штамм) 100 76 4 (нет роста)

Также была изучена изменчивость этих вариантов по признаку низинсбразования (рис. 2 и табл. 2). Вариант №75 обладал большей активностью по сравнению с другими вариантами (табл.2), что объясняется преобладанием в популяции этого варианта

N»14 №75 №86 №S7 варианты культур

Рис.1 УровеБЬ. образования низина у исходного штамма L.laclis (К) и Всгк-мутантов при культи-

клонов с активностью 110-130% по отношению к контролю (рис.2). Для дальнейшей работы был отобран вариант №75, в дальнейшем мутант 75.

3.3 Характеристика мутантного штамма 3.3.1. Сравнение ферментационных характеристик мутанта 75 и исходного штамма.

вировании в колбах (среда ФС).

Сравнение ферментационных характеристик культур проводили по результатам ферментации в 4 литровом ферментере «Biotech». В процессе культивирования анализировали уровень низинообразования, титр жизнеспо собных клеток, потребление лактозы. Среда ФС содержала дополнительно 0,5% глюкозы.

На рис. 3, 4, 5 и 6 даны усредненные значения исследуемых показателей (по две ферментации для исходного штамма и мутанта 75).

Из рис.3 видно, что синтез низина у мутанта 75 достигал своего максимума к 16 часам роста и затем не менялся в течение 4-х часов, в то время как у исходного штамма максимум биосинтеза наступил только к 20 часу. В период между 8 и 16 часами ферментации скорость потребления лактозы и скорость титрования (отражающего степень образования лактата) в культуре мутанта 75 выше, чем в культуре исходного штамма.

70-90 90-110 11Q-130 130-150 Активность, %

Рис. 2. Изменчивость мутантов (клонов) по уровню низинобразования, (в % к уровню низина в контроле).

Рис.3 Накопление низина культурами исходного штамма (—) и мутанта 75 (—)

100 80 60 40 20 О

часы роста

Рис.4 Рост (титр) культур исходной штамма (■—) и мутанта 75 (—)

I »1 ! i-5.

/ ч ! ¡84. 1 1 Е 1 I 3- !§*■ i ?

Jt- V:

о 1 1 ; *

0 4 8 12 16 20 | о

-Sj

8 10 12 часы роста

14 18 20 22

Рис.5 Скорость титрования исходного штамма (—) и мутанта 75 (—)

Рис.6 Потребление лактозы исходным штаммом (—) и мутантом 75 (—)

3.3.2. Устойчивость к бацнтрацину.

Проведена повторная проверка чувствительности мутанта 75 к бацнтрацину. Мутант 75 хранился при -18°С на среде с глицерином в течение 8 месяцев. В качестве контроля использовался исходный штамм. Проверка осуществлялась путем высева культур на чашки Петри на твердую агаризованную среду MRS без и с содержанием бацитрацина 10 и 20мкг/мл. Чашки Петри инкубировали при 30°С в течение 48 часов. По количеству выросших колоний судили о чувствительности культуры к данному антибиотику. Результаты представлены в таблице 3.

Из полученных результатов видно, что мутант 75 сохранил свою устойчивость к бацнтрацину, что является важным признаком для подтверждения его в качестве самостоятельного штамма.

Таблица 3

Устойчивость мутанта 75 к бацитрацину

Культуры Среды — Lactococcus 1actis

Мутант 75 Исходный штамм

Без бацитрацина 6x10У КОЕ/мл 4x10" КОЕ/мл

10 мкг/мл бацитрацина 3x109 КОЕ/мл отсутствие роста

20 мкг/мл бациграцина 2x10* КОЕ/мл отсутствие роста

3.3.3. Устойчивость к окислительному стрессу

С целью выявления новых физиологических различий между исходным штаммом и му тантом 75 было изучено влияние Н2О2 на их жизнеспособность. Впервые обнаружено, что в результате мутации резистентности к бацитрацииу повышалась устойчивость штамма Всг*75 к окислительному стрессу - явление ранее не описанное для микроорганизмов, устойчивых к бацитрацину. Если на среде с Н202 титр мутанта 75 составлял около 5х108 КОЕ/мл, то титр исходного штамма - около 2х103 КОЕ/мл.

3.3.4. Биосинтез низина при утилизации различных углеводов

При культивировании в среде ФС лактококки в качестве основного источника углерода и энергии используют лактозу. Чтобы выяснить зависимость продуктивности мутанта 75 от различных углеводных субстратов, было проведено культивирование продуцентов в колбах на модифицированной среде МК5, содержащей разные углеводы в концентрации 2%. Результаты этих опытов представлены в таблице 4.

Повышенная продуктивность мутанта 75 проявилась при утилизации всех испытанных углеводов. Однако, если при потреблении мальтозы, декстрина, сахарозы, лактозы и галактозы активность низина в культуре мутанта превышала таковую в культуре исходного штамма ка -50%, то при утилизации глюкозы она была выше на 74 %, чем в культуре исходного штамма.

Таблица 4

Влияние различных углеводов на биосинтез низина А__

Вариант среды Вариант культуры Активность низина

МЕ/мл % к исх.шт

MRS исх.шт 2306 100

мутант 75 3294 143

+ мальтоза исх.шт 4254 100

мутант 75 Г 6487 153

+ декстрин исх.шт 4427 100

мутант 75 6766 153

+ сахароза исх.шт 5485 100

мутант 75 7860 143

+ лактоза исх.шт 4660 100

мутант 75 7220 155

+ глюкоза исх.шт 3920 100

мутант 75 6810 174

+ галактоза исх.шт 4690 100

мутант 75 7080 151

Известно, что глюкоза оказывает репрессирующее действие ке только на утилизацию друпгх углеводов, но и на биосинтез вторичных метаболитов, в том числе и антибиотиков. В связи с этим возникло предположение, что эффект катзболишой (глю-козной) репрессии (КР) ослаблен у мутанта 75 в большей степени, чем у исходного штамма, с чем и связана, по крайней мере, частично, его повышенная продуктивность. Чтобы убедиться в этом, были проведены эксперименты с целью определения чувствительности роста продуцентов к 2-деоксиглюкозе (2-DOG), аналогу глюкозы, и влияния глюкозы на потребление другого углевода, подверженного катаболитной репрессии. Изучение влияния 2-DOG на рост исходного штамма в среде MRS с глюкозой выявило еще одно различие между этими культурами. В лог-фазе роста мутант проявил большую резистентность к 2-DOG (2 мкг/мл), чем исходный штамм. Чувствительность к 2-DOG оценивали по значениям оптической плотности суспензии клеток, растущих в среде без и с 2-DOG (таблица 5).

Таблица 5.

Оптическая плотность суспензий клеток исходного штамма и мутанта 75

ОП через 5 ч.роста ОП через 7 ч.роста

без DG + DG без DG + DG

Исходный штамм 0,32 0,04 0,47 0,08

Мутант 75 0,30 0,12 0,46 0,18

Косвенно это указывает на нарушение фосфоенолпируват-транспортной системы переноса глюкозы. В случае этого нарушения у мутанта 75 должен измениться и эффект КР. Чтобы проверить это был получен мутант (из исходного штамма), устойчивый к 2-DOG (мутант DOGR). В качестве углевода, утилизация которого подвержена эффекту КР, была выбрана рибоза, четко разделяемая от глюкозы, что облегчает количественное определение этих Сахаров методом ТСХ. При росте исходного штамма, мутанта 75 и мутанта DOGR в среде MRS с глюкозой (0,5%) и рибозой (0,5%) потребление рибозы в лог-фазе активнее в культуре мутанта 75, чем в культуре исходного штамма, а в культуре мутанта DOGR активнее, чем культуре мутанта 75 (табл. 6). Интенсивность потребления глюкозы, напротив, слабее в культуре мутантов, чем у исходного штамма.

Таблица 6

Потребление Сахаров (рибоза и глюкоза) исходным штаммом и мутантами

7 часов ферментации 9 часов ферментации

Штамм, мутант глюкоза глюкоза + рибоза рибоза глюкоза глюкоза + рибоза

глюкоза рибоза глюкоза рибоза

г/л % г/л г/л % г/л % г/л г/'л г/л %

от исх. от исх. от исх. от исх.

Исх 3.23 100 3.69 1.17 100 1.45 100 4.15 4.45 1.36 100

Всгк75 1.76 54 2.10 1.36 116 1.74 120 2.33 2.72 1.62 119

dogr 1.53 47 1.60 1.78 152 2.12 146 2.14 2.38 2.04 150

доверительный интервал среднего значения ± 5%

Эти данные свидетельствуют об ослаблении КР потребления рибозы, наиболее выраженной в культуре мутанта DOGR.

Исследование динамики процессов роста, потребления глюкозы и накопления низина в культурах исходного штамма и мутанта DOGR в период лог-фазы при ферментации в среде MRS (с 1 % глюкозы) показало снижение скорости потребления сахара и скорости роста клеток и повышение продукции низина в культуре мутанта DOGR, по сравнению с культурой исходного штамма (рис. 7, 8 и 9). Удельная продуктивность (МБ / Ю10 КОН) в течение 4-часового периода в культуре мутанта выше приблизительно на 80%, чем в культуре исходного штамма (рис.9). Следовательно, ослабление КР сказалось не только на процессах потребления глюкозы и роста, но и специфически на интенсивности биосинтеза низина.

2

4 6 8

часы роста

4 6 3

часы роста

1 Рис. 7. Рост (титр) клеток в культурах Рис. 8. Потребление глюкозы в культурах исх.штамма (—■) и мутанта DOGK (—) исх.штамма (—) и мутанта DOGR (—)

Рис. 9. Биосинтез низина в культурах исх.штамма (—) и мутанта ОООк (---) (вставка - удельная продуктивность, МЕ/Ю10КОЕ)

Все эти отличительные (от исходного штамма) признаки дают основание считать мутант самостоятельным штаммом ЬАасШ Всгк 75.

3.4. Модификация технологии получения низина с использованием штамма Всгк 75.

3.4.1. Влияние режимов фильтрации ферментационной среды на биосинтез низина.

По ранее разработанной технологии продуцент низина выращивали на молоч

| ной гидролизованной ферментационной среде, отфильтрованной на ультрафильтрах I

диаметром пор 15кДа.

На данном этапе было исследовано влияние условий фильтрации ферментаци

онной среды (различный диаметр пор ультра- и микрофильтра) на биосинтез низина.

Испытывали четыре варианта ферментационных сред:

1. Нативная без фильтрации

2. Отфильтрованная на ультрафильтрах с диаметром пор 15 кДа

3. Отфильтрованная на ультрафильтрах с диаметром пор 50 кДа

4. Отфильтрованная на микрофильтрах с диаметром пор 0Д4мкм Ферментации проводили в 4-х литровом ферментере «Biotech» с системой термо- и рН статирования при 30°С и рН=6,8. Объем посевного материала составлял 10% от объема ферментационной среды. После проведения ферментации культуральную жидкость (КЖ) фильтровали на микрофильтрах с размером пор 0,14мкм и определяли активность низина. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Технологические параметры 3-х режимов осветления среды

Режимы фильтрации Неосветленная среда 15 кДа 50 кДа 0,14 мкм

Скорость фильтрации среды до культивирования, % от контроля - 100 (контроль) 126 153

Активность низина, МЕ/мл 12021 9550 11353 11982

% от контроля 126 100 119 125

Скорость фильтрации среды после культивирования,% от контроля 71 100 100 95

доверительный интервал среднего значения ± 8%

При ферментации на среде без фильтрации и на среде, осветленной на фильтрах с диаметром пор 0,14мкм, биосинтез низина выше на 26 и 25%, соответственно, чем на среде, осветленной на фильтрах с диаметром пор 15 кДа (контрольная среда). Но скорость микрофильтрации неосветленной КЖ на 29% ниже, чем контрольной. В то же время, скорости микрофильтраций контрольной КЖ и КЖ после очистки на фильтрах 50кДа и 0Д4мкм сопоставимы между собой. Следовательно, использование среды, отфильтрованной на микрофильтрах с диаметром пор 0,14мкм в качестве ферментационной более эффективно для биосинтеза низина, чем на среде, осветленной на фильтрах 15кДа, без существенного ухудшения скорости микрофильтрации КЖ.

В дальнейших исследованиях для фильтрации ферментационной среды использовали фильтры с диаметром пор 50кДа и 0,14мкм.

3.4.2. Оптимизация ферментационной среды но составу белковых субстратов

В последние годы в связи с резким сокращением поголовья коров, в стране на продовольственном рынке наблюдается дефицит молока. В связи с этим цены на молоко возросли в несколько раз, что привело к существенному повышению себестоимости биоконсерванта. Для того чтобы исключить использование пищевого сырья (молоко) при культивировании ЬАас/и мы попытались заменить гидролизат молока на гидролизат соевой муки. Предварительные исследования показали, что по составу незаменимых аминокислот, необходимых для роста лактобактерий и биосинтеза низина, соевая мука близка к молоку, при этом ее стоимость в 4 раза ниже.

На нервом этапе испытывали гидролизат соевой муки и режимы гидролиза: продолжительность гидролиза различными протеолитпчсскими ферментами.

В состав опытной среды входили соевая мука (4%) и сыворотка (4%). Контрольная среда содержала молоко - 3% и сыворотку - 4%.

Гидролиз среды с соевой мукой осуществляли при 55°С протеолитическими ферментами алкалазой, нейтразой и протосубтилином в рекомендуемых дозах в течение 1, 2.5 и 4 часов. Результаты биосинтеза низина при использовании гидролизован-ных сред приведены в таблице 8.

Таблица 8

Биосинтез низина на гидролизованных средах с соевой мукой.

Гидролиз протеазамн

Продолжительность гидролиза Алкалаза | Нейтраза (0,1%) | (0,1%) Протосубтилин (0,28%)

Активность низина (% от контроля)

1ч 10 60 72

2,5ч 15 75 74

4ч 18 75 74

Гидролиз соевой муки алкалазой оказался наименее эффективным для биосинтеза низина. Приближенные к контролю результаты были получены при использовании протеолитических ферментов нейтразы и протосубтилина. С учетом стоимости ферментов наилучшим вариантом можно считать гидролиз протосубтилином. Продолжительность гидролиза протосубтилином достаточна в течение 1 часа.

Дальнейшая работа по оптимизации условий гидролиза включала изучение влияния количества протосубтилина, температуры и продолжительности гидролиза для среды, состава: соевая мука - 4%, сыворотка - 4%, фермент протосубтилин. Результаты опыта представлены в таблице 9. Наибольшая активность низина наблюдается при культивировании в среде, протеолиз которой осуществляли протосубтилином в концентрации 0,84%, в течение 1часа и температуре 40°С.

Таблица 9.

Оптимизация стадии протеолиза питательной среды по признаку низинобразования

Кол-во фермента, Температура Время гидролиза, Активность низина,

% гидролиза, °С ч % от контроля

0,28 30 1 88

2,5 84

4 92

0,28 40 1 94

2,5 98

4 64

0,56 30 1 96

2,5 80

4 82

0,56 40 1 94

2,5 92

4 62

0,84 30 1 98

2,5 94

4 72

0,84 40 1 116

2,5 80

4 60

1,12 30 1 96

2,5 92

4 92

1,12 40 1 115

2,5 100

4 95

На следующем этапе была проведена работа по подбору оптимальной концентрации сыворотки в ферментационной среде. Испытывали следующие варианты сред (таблица 10):

Таблица 10.

Варианты ферментационных сред при варьировании компонента «сыворотка»

Компоненты среды, %__Контроль Вар, 1 Вар. 2 Вар. 3

Молоко___3

Сыворотка____________4______3^ 4 5

Протосубтиллин, гидролиз 1 час, 40°С - 0,84 0,84 0.84

Ферментацию проводили в качалочных колбах. Результаты опыта представлены на рис.10. Наибольшая активность низина наблюдалась при ферментации на среде, со! держащей 4% соевой муки и 4% сыворотки.

Далее была проведена работа по оптимизации концентрации соевой муки в ферментационной среде. Варианты сред даны в таблице 1!. Ферментацию проводили в качалочных колбах. Результаты опыта представлены на рис.11. Наиболее высокая активность низина наблюдалась при ферментации в среде, содержащей 4% соевой муки и 4% сыворотки, в которой синтез низина на 20% выше, чем в молочной (контрольной) среде.

Таблица 11.

Варианты ферментационных сред при варьировании компонента «соевая мука»

Компоненты среды, % Контроль 1 2 3 4

Молоко 3 - - - -

Сыворотка 4 4 4 4 4

Соевая мука - 1 2 3 4

Алкалаза, гидролиз 4 часа. 55оС 0,1 - - -

Протосубтиллин, гидролиз 1 час, 40оС - 0,84 0,84 0,84 0,84

Был проанализирован аминокислотный состав опытной среды, содержащей 4% соевой муки и 4% сыворотки и контрольной среды, содержащей 3% сухого обезжиренного молока.

Таблица

Варианты ферментационных сред при варьировании компонента «сыворотка»

Компоненты среды, % Контроль Вар. 1 Вар. 2 Вар. 3

Молоко 3 - - -

Сыворотка 4 3 4 5

Соевая мука - 4 4 4

Алкалаза, гидролиз 4 часа, 55°С 0,1 - - -

Протосубтиллин, гидролиз 1 час, 40°С - 0,84 0,84 0.84

3 4 5

кол-ао сыворотки, %

Рис.10. Биосинтез низина в средах с различной концентрацией сыворотки

Анализ аминокислот проводили методом электрофореза на анализаторе «Капель 105» (Фирма «Люмекс»), Результаты анализа аминокислот представлены в таблице 12.

Анализ аминокислот показал, что среда, содержащая 4% соевой муки по аминокислотному составу сопоставима со средой, содержащей 3% молока.

Рис. 11. Биосинтез низина в средах с различной концентрацией соевой муки

Таблица 12.

Аминокислоты Содержание аминокислот, г/л

в молочной среде в среде с соевой мукой

Lys 0,98 1,01

Туг 0,60 0,55

Phe 0,88 0,75

His 0,45 0.27

Leu/ile 1.19 1.71

Met 0,09 0

Val 0,57 0,35

Pro 0,95 0,89

Thr 0,45 0,52

Ser 0,84 1,32

Ala 0,52 1,40

Glv 0,55 0,79

Общее кол-во а/к 8,12 9,56

Далее было испытано влияние условий фильтрации питательной среды, содержащей соевую муку (с использованием фильтров с диаметром пор 50кДа и 0,14мкм) на биосинтез низина. Ферментация проводилась в качалочных колбах. Результаты опыта представлены на рис. 12 и в таблице 13.

Таблица 13

Биосинтез низина в контрольной и альтернативной ФС

Ферментационная среда Вид фильтрации Активность низина, МЕ/мл

Молочная среда 50кДа 9224

0,14мкм 9792

Среда с соевой мукой 50кДа 6584

0,14мкм 9542

50кДа 0,14 мкм

диаметр пор фильтра

Рис.12 Биосинтез низина в контрольной (молочной) (■) и альтернативной (□) ферментационных средах

Таблица 14.

Состав ферментационной среды на основе соевой муки и условия ее приготовления

№ Компоненты Концен-

п/п трация, Л %

1 соевая мука 4

2 сыворотка 4

3 Протосубтилин (гидролиз 1 часпри40°С) 0,84

4 ФИЛЬТРАЦИЯ 0,14 мкм

Значительное снижение активности наблюдается при ферментации в гидролизате соевой муки, осветленного на фильтрах с диаметром пор 50кДа.

Это может объясняться менее интенсивным гидролизом соевого белка протосубта-лином, нежели молочного белка алкалазой.

В таблицей показан состав альтернативной питательной среды для культивирования 1ас1ососс11аст и продукции низина.

В настоящее время на заводе в г.Лотошино проводятся ферментации с использованием мутанта 75 и предложенной технологии приготовления ферментационной среды для культивирования продуцента низина. Данные нововведения позволяют улучшить технологические показатели процесса и повысить выход конечного продукта по сравнению с используемой ранее технологией.

3.5 Экономическая оценка применения мутанта 75 и предложенной технологии биосинтеза низина.

Экономическая оценка себестоимости низина при использовании в производстве

мутанта 75 и предложенной альтернативной среды представлены в таблицах 15 и 16

Таблица 15

Экономический эффект при использовании мутантного штамма L,¡actis BcrR75

Исходный штамм Мутант 75

Активность КЖ, МЕ/мл 6386 9054

Себестоимость продукции, руб/кг 7538 5533

При использовании мутанта Всгк75 себестоимость препарата «БИЗИН 1000» снижается на 27%.

Таблица 16

Экономический эффект при использовании предложенной альтернативной среды для культивирования мутантного штамма Ь.1асШ Всга75

Компонент ферментационной среды

Соевая мука Сухое обезжиренное молоко

Активног.ть КЖ. МЕ/мл 9054 9054

Себестоимость продукции, руб/кг 4903 5533

При замене сухого молока (3%) на соевую муку (4%) и фермента алкалазы (0,1%) на протосубтилин (0,84%) себестоимость препарата «БИЗИН 1000» снижается на 13%.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Предложены защитная среда и условия для длительного хранения молочнокислых бактерий-продуцентов низина, при которых культура сохраняет свои биосинтетические способности в течение 12 месяцев.

2. Впервые получен мутантный штамм ЬасШсоссш 1асШ Всгк, резистентный к 20мкг бацитрацина, с уровнем низинообр.тювапия на 40% выше по сравнению с исходным штаммом и меньшей продолжительностью ферментации.

3. Установлено, что мутация устойчивости к бацитрацину НасИй привела к повышению продукции низина А, увеличению скорости роста, увеличению скоростей потребления лактозы и накопления молочной кислоты, ослаблению эффекта катаболитной репрессии, повышению устойчивости к окислительному стрессу.

4. Предложены новые условия подготовки ферментационной среды для выращивания ЫасШ. При использовании на стадии фильтрации среды микрофильтров 0,14мкм вместо ультрафильтров 15кДа скорость фильтрации увеличивается в 1,5 раза, а выход низина увеличивается на 27%.

5. Предложен альтернативный вариант питательной среды для выращивания ЫасНБ, при использовании которой себестоимость единицы продукции снижается на 13%.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гула, Е.А. Среда для поддержания и длительного хранения молочнокислых бактерий Lactococcus lactis - продуцентов низина / Е.А. Гула, A.B. Сергеева, Н.И. Кудрина, Е.Ю. Попова // Биология - наука XXI века: сб. тезисов 10-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых. - 2006. -С.336.

2. Гула, Е.А. Подбор среды для поддержания и длительного хранения молочнокислых бактерий Lactococcus lactis - продуцентов низина / Е.А. Гула, Е.И. Мельникова, Н.И. Кудрина, Л.П. Минаева, A.B. Сергеева // Сборник научных трудов МГУИЭ: Вып.З. -2006. - С. 131-136.

3. Гула, Е.А. Увеличение продукции низина путем активации транспорта полипептидного лантибиотика из микробной клетки у мутантов Lactococcus lactis / Е.А. Гула, A.B. Сергеева, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Биология - наука XXI века: сб. тезисов 11-й Международной Путинской школы-конфереиции молодых ученых. - 2007.

4. Гула, Е.А. Генетическая модификация штамма Lactococcus lactis с целью получения суперпродуцента биоконсерванта низина / Е.А. Гула, A.B. Сергеева /7 Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ: сборник научных докладов. - 2007. -С.255-257.

5. Гула, Е.А. Генетическая модификация штамма Lactococcus lactis для промышленного получения бакгериоцина пизина / Е.А. Гула, A.B. Сергеева // Научная конференция студентов и молодых ученых МГУИЭ 2008. - 2008. - С. 35.

6. Гула, Е.А. Мембранные технологии получения биоконсерванта низина / Е.А. Гула, A.B. Сергеева // Доклады молодых ученых и студентов МГУИЭ. - 2008. - С. 35.

7. Гула, Е.А. Низин - природный консервант / Е.А. Гула, A.B. Сергеева, В.В.Бирюков // Масложировая промышленность. - 2009. - № 1. - С. 24-25.

-С. 194.

Гула Елена Александровна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 04.03.2009 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1.25 п.л. Тираж 120 экз. Заказ №585

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл.13. т. (499) 264-30-73 www.firmablok.ru

Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гула, Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1 Биогенез и свойства низина.

1.1.1 Структура низина.

1.1.2 Свойства и механизм действия низина.

1.1.3 Организация кластера генов низина.

1.1.4 Регуляция биосинтеза низина.

1.1.5. Возможные механизмы защиты клеток продуцента от низина.

1.2 Мультилекарственная резистентность у молочнокислых бактерий.

1.3 Метаболизм молочнокислых бактерий.

1.3.1 Питательные потребности и протеолиз белков.

1.3.1.1. Питательные потребности молочнокислых бактерий.

1.3.1.2. Протеиназы молочнокислых бактерий.

1.3.1.3. Продукты расщепления казеина.

1.3.1.4. Аминокислотные и пептидные транспортные системы.

1.4 Углеводный метаболизм.

1.4.1 Регуляция гликолиза.

1.4.2 Влияние углеводов на биосинтез низина.

1.4.3 Регуляция утилизации углеводов.

1.5. Применение низина.

ГЛАВА 2 Материалы и методы.

2.1 Штаммы, использованные в работе.

2.2 Питательные среды.

2.2.1 Агаризованные среды для проведения селекционной работы, поддержания и хранения культуры Lactococcus lactis subsp. lactis.

2.2.2 Среды для глубинного культивирования L.lactis subsp. lactis в колбах.

2.2.3 Среды для глубинного культивирования L.lactis subsp. lactis в аппарате.

2.3 Хранение, поддержание и глубинное культивирование продуцента низина.

2.4. Морфологическая характеристика культуры.

2.5 Методика определения активности низина.

2.6. Получение мутантов, устойчивых к антибиотикам.

2.7. Определение редуцирующих веществ методом Бертрана.

2.8 Определение редуцирующих веществ методом ТСХ.

2.9. Тесты на чувствительность к антимикробным агентам.

2.10. Чувствительность к деоксиглюкозе.

2.11. Чувствительность к окислительному стрессу.

2.12. Определение титра клеток.

2.13. Определение содержания молочной кислоты.

2.14. Определение протеолитической активности.

2.15 Определение рН среды.

2.16 Метод определения а/к «Капель 105».

2.17 Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3 Результаты и обсуждения.

3.1. Схема экспериментальных исследований.

3.2 Условия поддержания культуры.

3.3 Получение нового высокопродуктивного штамма.

3.4 Характеристика нового бацитрацинустойчивого штамма.

3.4.1. Сравнение ферментационных характеристик мутанта 75 и исходного штамма.

3.4.2 Устойчивость к бацитрацину.

3.4.3. Чувствительность исходного штамма и мутанта 75 к различным антимикробным агентам.

3.4.4 Чувствительность исходного штамма и мутанта 75 к низинуА.

3.4.5. Устойчивость к окислительному стрессу.

3.4.6. Биосинтез низина при утилизации различных углеводов.

3.5. Модификация технологии получения низина с ипользованием штамма Lactococcus lactis вар.№75.

3.5.1. Влияние режимов фильтрации ферментационной среды на биосинтез низина.

3.5.2. Оптимизация ферментационной среды по составу белковых субстратов.

3.6. Обсуждение результатов.

ГЛАВА 4 Биосинтез низина в промышленных условиях.

4.1. Технология производства низина.

4.2. Утилизация отходов производства низина.

4.3. Экономическая оценка себестоимости продукта с использованием предлагаемых изменений.

4.3.1. Расчет экономического эффекта при использовании мутанта 75.

4.3.2. Расчет экономического эффекта при замене молочной среды на среду, содержащую соевую муку.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интенсивная технология получения низина с использованием мутантного штамма Lactococcus lactis"

Актуальность темы.

За последнее время возрос интерес к использованию молочнокислых бактерий (МКБ) в качестве защиты от порчи пищевых продуктов. Одной из главных причин этого является заинтересованность потребителей в том, чтобы в пищевой промышленности уменьшалось использование химических средств защиты и жесткой термообработки «натуральных» продуктов с целью сохранения их качества.

Биозащита - метод, с помощью которого микроорганизмы и/или их антимикробные вещества, прежде всего бактериоцины, используются для увеличения срока хранения продуктов. МКБ играют определенную роль и при ферментации пищевых продуктов, продлевая срок хранения их по сравнению с нефер-ментированными продуктами.

В настоящее время известно большое количество бактериоцинов. Наиболее известный и изученный бактериоцин - низин А. Результаты новых исследований, опубликованных в 1928, продемонстрировали антимикробную активность Streptococcus lactis против других МКБ. Позднее было установлено, что эта активность обусловлена бактериоцином, низином А. В 1969 году экспертная комиссия по вопросам продовольствия и сельского хозяйства при ООН и Всемирной организации здравоохранения (ФАО/ВОЗ) одобрила использование низина в качестве защитной добавки к пищевым продуктам. В 1988 низину был присвоен статус GRAS (Обще Признанный Как Безопасный) в США. В 1990 Научный комитет по вопросам питания (SCF) при ЕС произвел оценку низина и постановил, что ДСП (допустимое суточное потребление) низина должно равняться 0.13 мг/кг веса в пересчете на препарат с активностью 40000 ME (Scientific Committee for Food, 1990). Сегодня использование низина в пищевых продуктах разрешено в более чем 50 странах, включая Европейский Союз, где низин (Е234) применяется в ограниченных количествах в качестве защитного компонента в ряде продуктов ежедневного потребления таких, как некоторые виды сыров, сливок, пудингов. На сегодняшний день низин является единственным бактериоцином, одобренным и разрешенным для защиты продуктов.

Важным свойством, позволяющим использовать низин в пищевой промышленности, является то, что он быстро распадается в человеческом организме до аминокислот. В силу этого, низин является безвредным консервантом для пищевых продуктов.

Потребность в низине растет пропорционально мировому рынку продовольствия. Только в производстве сыра и йогуртов, традиционной области использования низина, в обороте находятся миллионы долларов. В настоящее время в России потребление низина составляет 3-4 т/год, и потребности постоянно растут. Проявляется интерес к использованию низина и в медицине для подавления патогенных бактерий, устойчивых к «классическим» антибиотикам. Однако низин является относительно дорогим продуктом. В настоящее время розничные цены низинсодержащих препаратов в России составляют около 400 $/кг. Поэтому актуальным является снижение цены низина как за счет повышения продуктивности штаммов-продуцентов низина, так и за счет модернизации технологии процессов ферментации, выделения и очистки бактериоцина.

Цели и задачи исследования.

Целью работы является усовершенствование процесса получения низина А.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

- на основе штамма Lactococcus lactis subsp. lactis получить новый штамм с повышенной способностью к низинообразованию;

- провести сравнительную характеристику нового и исходного штаммов L. lactis subsp. lactis по физиологическим и биохимическим признакам;

- оптимизировать состав ферментационной среды для выращивания L.lactis путем замены сухого обезжиренного молока на соевую муку, альтернативно более дешевый азотный субстрат;

- оптимизировать процесс приготовления ферментационной среды для выращивания МКБ с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения времени, затрачиваемого на ультрафильтрацию в условиях промышленного производства низина.

Научная новизна.

1. Определены условия поддержания, штамма в продуктивном состоянии1 в течение длительного времени.

R,

2'. Получен оригинальный штамм Lactococcus lactis subsp. lactis Bcr 75, устойчивый к антибиотику бацитрацину (BcrR-20 мкг/мл), характеризующийся повышенной способностью к низинообразованию при сокращенной продолжительности ферментации.

3. Впервые обнаружено, что мутация• устойчивости к бацитрацину L.lactis привела к:

- повышению продукции низина в процессе ферментации;

- увеличению скоростей потребления лактозы

- устойчивости к 2-деоксиглюкозе и катаболитной репрессии;

- устойчивости к окислительному стрессу.

4. Установлено, что механизм катаболитной репрессии причастен1К регуляции, биосинтеза, низина (на примере мутанта, устойчивого к 2-деоксиглкжозе), и ослабление катаболитной репрессии - одна из причин повышения продукции низина штаммом L. lactis BcrR75.

5. Разработан способ подготовки альтернативной среды для выращивания L.lactis, содержащей протеолизат соевой муки, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды необходимыми культуре питательными компонентами.

Практическая значимость.

1. Модифицирован способ поддержания L. Lactis в стабильном продуктивном состоянии длительное время.

2. Подобрана альтернативная ферментационная среда для L.lactis, содержащая гидролизат соевой муки, что позволяет избежать использования дорогостоящего сырья - молока, и снизить стоимость питательной среды в 4 раза. Себестоимость продукта от использования новой ферментационной среды в технологии получения низина снизилась на 13%.

3. Подобран эффективный способ подготовки питательной среды для культивирования продуцента низина, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды питательными компонентами.

4. Замена на стадии осветления ферментационной среды ультрафильтрации 15кДа на микрофильтрацию 0,14 мкм привела к увеличению выхода низина на 25% за счет дополнительного обогащения питательной среды пе-тидами и сокращения времени фильтрации в 1,5 раза.

5. Новый штамм L.lactis subsp. lactis BcrR75, способный за 15-16 часов ферментации синтезировать до 10-12 тыс. МЕ/мл низина А, апробирован при промышленном производстве низина на предприятии ООО «Фир-ма»Макофарм» (г. Лотошино). Себестоимость продукта от использования нового штамма в технологии получения низина снизилась на 27%.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы докладывались: на 10 и 11-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых: Биотехнология-наука XXI века, Пущино, 2006, 2007 гг.; на Всеросийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2007 г., на научной конференции студентов и молодых ученых МГУИЭ, Москва, 2008.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано: 7 печатных работ, из них 1 - статья в сборнике научных трудов МГУИЭ, 1 статья в журнале «Масложировая промышленность», тезисов докладов (5) на научных конференциях.

Данные исследования выполнены в соавторстве с к.б.н. Сергеевой А.В., к.б.н. Мироновым В.А., д.т.н., проф. Бирюковым В.В. и др.

Соискателем были выполнены: постановка задач исследований, основные экспериментальные исследования, обработка данных и обобщение результатов. В селекционных работах и определении биохимических характеристик принимали участие Кудрина Н.И., Петрищева О.А. Обсуждение результатов проводилось совместно с Сергеевой А.В., Мироновым В.А., Бирюковым В.В. Вклад соискателя в работу является определяющим.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гула, Елена Александровна

107 ВЫВОДЫ

1. Предложены защитная среда и условия для длительного хранения молочнокислых бактерий-продуцентов низина, при которых культура сохраняет свои биосинтетические способности в течение 12 месяцев.

2. Впервые получен мутантный штамм Lactococcus lactis BcrR, резистентный к 20мкг бацитрацина, с уровнем низинообразования на 40% выше по сравнению с исходным штаммом и меньшей продолжительностью ферментации.

3. Установлено, что мутация устойчивости к бацитрацину L.lactis привела к повышению продукции низина А, увеличению скорости роста, увеличению скоростей потребления лактозы и накопления молочной кислоты, ослаблению эффекта катаболитной репрессии, повышению устойчивости к окислительному стрессу.

4. Предложены новые условия подготовки ферментационной среды для выращивания L.lactis. При использовании на стадии фильтрации среды микрофильтров 0,14мкм вместо ультрафильтров 15кДа N скорость фильтрации увеличивается в 1,5 раза, а выход низина увеличивается на 25%.

5. Предложен альтернативный вариант питательной среды для выращивания L.lactis, при использовании которой себестоимость единицы продукции снижается на 13%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гула, Елена Александровна, Москва

1. Белозерский А.Н. Практическое руководство по биохимии растений / А.Н. Белозерский, Н.И. Проскуряков. Под ред. А.И. Опарина // М: Советская наука. -1951. с. 658-665.

2. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. / В.В. Бирюков.-М.: КолосС, 2004. — 296 е.: ил. — (Учебники и учеб. Пособия для студентов высш. учеб. заведений).

3. Егоров, Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н.С. Егоров, И.П. Баранова и др. // Антибиотики и химиотерапия. —1999. -№ 6. -с. 33-40.

4. Красникова, JI.B. Биохимическая активность сухих концентратов МКБ, полученных методом непрерывного культивирования / JT.B. Красникова, JI.A. Силантьева, К.К. Горбатова, Н.Ф.Васильев // Прикладная биохимия и микробиология. -1978. №.3. -С. 405-409.

5. Попов, А.Ю. Биосинтез низина при периодическом культивировании Streptococcus lactis / А.Ю. Попов, Д.М. Исакова // Биотехнология. -1989. -№ 5. -с. 583-587.

6. Северин С.Е. Практикум по биохимии / С.Е. Северин, Г.А.Соловьева // М: Изд.Московского университета. -1989.

7. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель М: Мир. -1972. — С.471.

8. Abee, Т. Pore-forming bacteriocins of Gram-positive bacteria and self-protection mechanisms of producer organisms. / T. Abee // FEMS Microbiology letters. 1995. -№ 1. -p. 1-10.

9. Allgaier, H. Epidermin: sequencing a heterodet tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. / H. Allgaier, G. Jung, R.G. Werner, U. Schneider, H. Zahner // European journal of biochemistry. -1986. -№ 1, -p. 9-22.

10. Altena, K. Biosynthesis of the lantibiotic mersacidin: organization of a type-B lantibiotic gene cluster. / K. Altena, A. Guder, C. Cramer, G. Bierbaum // Applied and environmental microbiology. -2000. -№ 6. -p. 2565-2571.

11. Andrade, A.B. Reproductive Biology of the dusky grouper Epinephelus mar-ginatus / A.B. Andrade, L.F. Machado, M.H. Silva, J.P. Barreiros // Brazilian archives of biology and technology. -2003. -№ 3. -p. 373-381.

12. Andersson, U. Trehalose-6-phosphate phosphorylase is part of a novel metabolic pathway for trehalose utilization in Lactococcus lactis. / U. Andersson, F. Levander, P. Radstrom // The journal of biological chemistry. -2001. —№. 2. -p.42707-42713.

13. Bavin, E.M. Nisin in experimental tuberculosis / E.M. Bavin, A.S. Beach, R. Falconer, R. Friedmann II Lanchet. -1952. -№ 1. -p. 127-129.

14. Bechinger, B. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin / B. Bechinger // Journal of membrane biology. -1997. № 3. -p. 197-211.

15. Benedict R.G. Cinnamycin, an antibiotic from Streptomyces cinnamoneus / R.G. Benedict, W. Dvonch, O.L. Shotwell, T.G. Pridham, L.A. Lindenfelser // nov. Sp. Antib. Chemother. -1952. -№ 2. -p. 591-594.

16. Bissett, D.L. Lactose and D-galactose metabolism in group N streptococci: presence of enzymes for both the D-galactose 1-phosphate and D-tagatose 6-phosphate pathways / D.L. Bissett, R.L. Anderson // Journal of bacteriology. -1974. -No l.-p. 318-320.

17. Breukink, E. The C-terminal region of nisin is responsible for the initial interaction of nisin with the target membrane / E. Breukink, C. van Kraaij, A. De-mel, R.J. Siezen, O.P. Kuipers, B. de Kruijff // Biochemistry. -1997. -№ 36. -p. 6968-6976.

18. Breukink, E. Use of the Cell Wall Precursor Lipid II by a Pore-Forming Peptide Antibiotic / E. Breukink, I. Wiedemann, C. van Kraaij, A., B. de Kruijff, O.P. Kuipers, H.-G. Sahl // Science. -1999. -v. 287. -p. 2361-2364.

19. Brotz, H. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II / H. Brotz, G. Bierbaum, K. Leopold, P.E. Reynolds, H.-G. Sahl // Antimicrobial agents and chemotherapy. -1998. -№ 1. -p. 154—160.

20. Buchman, G.W. Structure, expression, and evolution of a gene encoding the precursor of nisin, a small protein antibiotic. / G.W. Buchman, S. Banerjee, J.N. Hansen // The journal of biological chemistry. -1988. -№ 263. -p. 1626016266.

21. Cain, B.D. Amplification of the bacA gene confers bacitracin resistance to Escherichia coli / B.D. Cain, P.J. Norton, W. Eubanks, H.S. Nick, C.M. Allen // Journal of Bacteriology. -1993. -№ 12. -p. 3784-3789.

22. Chandrapati, S. Characterization of the promoter regions involved in galactose- and nisin-mediated induction of the nisA gene in Lactococcus lactis ATCC 11454 / S. Chandrapati, D.J. O'Sullivan // Molecular microbiology. -2002. -№ 2. -p. 467-477.

23. Chandrapati, S. Procedure for quantifiable assessment of nutritional parameters influencing Nisin production by Lactococcus lactis subsp. lactis / S. Chandrapati, D.J. O'Sullivan // Journal of Biotechnology. -1998. -№ 3. -p. 229-33.

24. Cheigh, C.I. Enhanced nisin production by increasing genes involved in nisin Z biosynthesis in Lactococcus lactis subsp. lactis A164 / C.-I. Cheigh, H. Park, H.-J. Choi, Y-R. Pyun // Biotechnology letters. -2005. -№ 3. -p. 155-160.

25. Cheigh, C.-I. Nisin biosynthesis and its properties / C.-I. Cheigh, Pyun Y.R. // Biotechnology letters. -2005. № 21. p. 1641-1648.

26. Chen, H. Bacteriocins and their food applications / H. Chen, D.G. Hoover // Comprehensive reviews in food science and food safety. -2003. -V.2. -p. 82100.

27. Cocaign-Bousquet, M. Physiology of pyruvate metabolism in Lactococcus lactis / M. Cocaign-Bousquet, C. Garrigues, P. Loubiere, N.D. Lindley // An-tonie Van Leeuwenhoek. -1996. -№ 2-4. -p. 253-267.

28. Cogan, J.F. Impact of aeration on the metabolic end products formed from glucose and galactose by Streptococcus lactis / J.F. Cogan, D. Walsh, S. Condon // The journal of applied bacteriology. -1989. -№ 66. -p. 77-84.

29. Cohn, M. Physiology of the inhibition by glucose of the induced synthesis of /?-galactosidase-enzyme system of Escherichia coli / M. Cohn, K. Horibata // Journal of bacteriology. -1959. -№ 5. -p. 624-635.

30. Collins, L.B. Pyruvate kinase of Streptococcus lactis / L.B. Collins, T.D. Thomas // Journal of bacteriology. -1974. -№ 1. -p. 52-58.

31. Condon, S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen / S. Condon // FEMS microbiology review. -1987. -№ 3. -p. 269-280.

32. Crow, V.L. Fructose 1,6-diphosphate-activated Llactate dehydrogenase from Streptococcus lactis: kinetic properties and factors affecting activation / V.L. Crow, G.G. Prichard // Journal of bacteriology. —1977. -№ 1. -p. 82-91.

33. Cottesman, M.M. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters / M.M. Cottesman, T. Fojo, S.E. Bates // Nature reviews. Cancer. -2002.-№ l.-c. 48-58.

34. Delves-Broughton, J. Applications of the bacteriocin, nisin / J. Delves-Broughton, P. Blackburn, R.J. Evance, J. Hugenholtz // Antonie van Leeu-wenhoek. -1996. -№ 2. -p. 193-202.

35. Delves-Broughton, J. Nisin as a food preservative / J. Delves-Broughton // Food Australia. -2005. -№ 12. -p. 525-527.

36. Delves-Broughton, J. Nisin preparations Production, Specifications and assay procedure in the use of nisin in cheese making / J. Delves-Broughton, M. Friis // the International Dairy Federation (IFD) document no. 329. -1998.-p. 18-19.

37. Delves-Broughton, J. Nisin and its uses as a food preservative / J. Delves-Broughton // Food technology. -1990. № 44. -p. 100-117.

38. Dills, S.S. Carbohydrate transport in bacteria / S.S. Dills, A. Apperson, M.R. Schmidt, M.H: Saier// Microbiological review. -1980. -№ 3. -p. 385^118.

39. Delves-Broughton, J. The use of the bacteriocin, nisin, as a preservative in pasteurized liquid whole egg / J. Delves-Broughton, G.C. Williams, S. Wilkinson // Letters in applied microbiology. -1992. -№ 4. -p. 133-136.

40. Drider, D. The Continuing Story of Class Ha Bacteriocins / D. Drider, G. Fim-land, Y. Hechard, L.M. McMullen, H. Prevost // Microbiology and molecular biology reviews. -2006. p. 564-582.

41. Engelke, G. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein / G. Engelke, Z. Gutowski-Eckel, M. Hammelmann, K.D. Entian // Applied and environmental microbiology. — 1992. -№11. -p. 3730-3743.

42. Engelke, G. Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3 / G. Engelke, Z. Gutowski-Eckel, P. Kiesau, K. Siegers, M. Hammelmann, K.D. Entian // Applied and environmental microbiology. -19941 -№ 3. -p. 814-825.

43. Even, S. Molecular physiology of sugar catabolism in Lactococcus lactis IL1403 / S. Even, N.D. Lindley, M. Cocaign-Bousquet // Journal of bacteriology. -2001. -№13. -p. 3817-3824.

44. Fukase, T. Total synthesis of peptide antibiotic nisin / T. Fukase, M. Kitaza-wa, A. Sano, K. Shimbo, H. Fujita, S. Horimoto, T. Wakamiya, T. Shiba // Tetrahedron letters. -1988. -№ 29. -p. 795-798.

45. Gaji, O. Relationships between MDR proteins, bacteriocin production and proteolysis in Lactococcus lactis / O. Gaji, G. Buist, M. Kojic, L. Topisirovic, O. P. Kuipers, J. Kok // Journal of biological chemistry. -2003. -№ 36. -p. 34291-34298.

46. Giffard, С. J; Interaction of nisin with planar lipid bilayers monitored by fluorescence recovery after photobleaching / G. J. Giffard, L. Ladha, A.R. Mackic,

47. D.C. Clark, D. Sanders // Journal of membrane biology. -1996. -№ 3. -p. 293300.

48. Gosalbes, M.J. Elements Involved in Catabolite Repression and Substrate Induction of the Lactose Operon in Lactobacillus casei / M.J. Gosalbes, V. Mo-nedero, G. Perez-Martinez // Journal of Bacteriology. -1999. -№13: -p. 39283934.

49. Gross, E. Dchydroalanyllysine: identical COOH-terminal structures in the peptide antibiotics nizin and subtilin / E. Gross, J.C. Morell, L. Craig»// Biochemistry. -1969. -№ 3. -p. 952-956.

50. Gross, E. The number and nature of a, p-unsaturated amino acids in subtilin /

51. E.Gross, H. Kiltz // Biochemical; and biophysical research communications. -1973.-№ 2.-p. 559-565.

52. Gross, E. The structure of nisin / E. Gross, J.L. Morell // Journal of the American Chemical Society. -1971. -№ 18. -p. 4634-4635.

53. Guder, A. Posttranslationally modified bacteriocins the lantibiotics / A. Glider, I. Wiedemann, H.-G. Sahl // Biopolymers. -2000. -№ 1. -p. 62-13.

54. Hall R.H. Nisin and Food Preservation / R.H. Hall // Process Biochemistry. -1966. -№ l.-p. 461-464.

55. Hansen, J.N. Antibiotics synthesized by posttranslational modification / J.N. Hansen // Annual review of microbiology. -1993. -№ 47. -p. 535-564.

56. Hirsch, A. Growth and nisin production of a strain of Streptococcus lactis / A. Hirsch // Journal of general microbiology. -1951. -№ 5. -p. 208-221.

57. Hurst, A. Nisin / A. Hurst // Advances in Applied Microbiology. -1981. -№ 27.-p. 85-123.

58. Hurst, A. Function of nisin and nisin-like basic proteins in the growth cycle of streptococcus lactis / A. Hurst // Nature. -1967. -№ 5094. -p. 1232-1234.

59. Jarvis, B. Partial purification, specificity and mechanism of action of the ni-sin-inactivating enzyme from Bacillus cereus / B. Jarvis, J. Farr // Biochimica et biophysica aota. -1971. -№ 2. -p. 232-240.

60. Juillard, V. Specificity of Milk Peptide Utilization by Lactococcus lactis / V. Juillard, A. Guillot, D. Le Bars, J-C. Gripon // Applied and environmental microbiology. -1998. -№ 4. -p. 1230-1236.

61. Juille, О. The specificity of oligopeptide transport by Streptococcus thermo-philus resembles that of Lactococcus lactis and not that of pathogenic streptococci / O. Juille, D. Le Bars, V. Juillard // Microbiology. -2005. -№ 6. -p. 1987-1994.

62. Jung, G. Lantibiotics: a survey. / G. Jung; editors G. Jung, H-G. Sahl // Nisin and novel lantibiotics: Science Publishers. Leiden: ESCOM, 1991. -p. 1-34.

63. Jung, G. Lantibiotics ribosomally synthesized biologically active polypeptides containing sulfide bridges and a and P-didehydroamino acids / G. Jung // Angewandte Chemie. -1991. -№ 9. -p. 1051-1068.

64. Jung G. Nisin and Novel Lantibiotics: Proceedings of the First International Workshop on Lantibiotics / G. Jung, H.-G. Sahl. Leiden: ESCOM, 1991, -512 p.

65. Kaan, T. Genome-wide transcriptional profiling of the Bacillus subtilis cold-shock response / T. Kaan, G. Homuth, U. Mader, J. Bandow, T. Schweder // Microbiology. -2002. -№ 11. -p. 3441-3455.

66. Kaletta, C. Nisin, a peptide antibiotic: cloning and sequencing of the nisA gene and posttranslational processing of its peptide product / C. Kaletta, K.-D. Entian // Journal of bacteriology. -1989. -№ 3. -p. 1597-1601.

67. Kellner, R. Galligermin: a new lanthionine-containing-polypeptide antibiotic / R. Kellner, G. Jung, T. Horner, H. Zahner, N. Schnell, K-D. Entian, F. Gotz // European journal of biochemistry -1988. -V. 177. -p. 53-59.

68. Kettenring, J.K. Sequence determinations of actagardine, a novel lantibiotic, by 2D NMR spectroscopy / J.K. Kettenring, A. Malabarba, K. Vekey, B.Cavalleri // Journal of antibiotics. -1990. -№ 9. -p. 1082-1088.

69. Kim, W.S. Improving nisin production by increasing nisin immunity/resistance genes in the producer organism Lactococcus lactis /W.S. Kim, R.J. Hall, N.W. Dunn // Applied microbiology and biotechnology. -1998. -№ 4. -p. 429-433.

70. Kim, W.S. Nisin production1 by Lactococcus lactis using two-phase batch culture / W.S. Kim // Letters applied microbiology. -1997. -№ 3. -p. 169-71.

71. Kim, W.S. The effect of nisin concentration and nutrient depletion on nisin production of Lactococcus lactis / W.S. Kim, R.J. Hall, N.W. Dunn // Applied microbiology and biotechnology. -1997. -№ 4. -p. 449-453.

72. Kleerebezem, M. Peptide pheromone-dependent regulation of antimicrobial peptide production in Gram-positive bacteria: a case of multicellular behavior / M. Kleerebezem, L.E. Quadri // Peptides. -2001. -№ 22. -p. 1579-1596.

73. Kleerebezem, M. Quorum-sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction system in Gram-positive bacteria / M. Kleerebezem, L.E.N. Quadri, O.P. Kuipers, W.M. de Vos // Molecular microbiology. -1997. -№ 5. -p. 895-904.

74. Klein C. Biosynthesis of the lantibiotic subtilin is regulated by a histidine ki-nase/response regulator system / C. Klein, C. Kaletta, K.D. Entian // Applied and environmental microbiology. -1993. -№ 1. -p. 296-303.

75. Koebmann, B.J. Experimental determination of control of glycolysis in Lactococcus lactis / B.J. Koebmann, H.W. Andersen, C. Solem, P.R. Jensen // Anto-nie van Leeuwenhoek. -2002. -№ 1-4. -p. 237-248.

76. Konings, R.N.H. Lantibiotics: A Unique Group of Antibiotic Peptides / R.N.H. Konings, C.W. Hilbers // Antonie van Leeuwenhoek and Molecular microbiology -1996. -№ 2. p. 87-202.

77. Kordel, M. Susceptibility of bacterial, eukaryotic and artificial membranes to the disruptive action of the cationic peptides Pep5 and nisin / M. Kordel, H.-G. Sahl // FEMS microbiology letters. -1986. -№ 34. -p. 139-144.

78. Kramer, N.E. Transcriptome Analysis Reveals Mechanisms by Which Lactococcus lactis Acquires Nisin Resistance / N.E. Kramer, S.A.F.T. van Hi-jum, J. Knol, J. Kok, O.P. Kuipers // Antimicrobial agents and chemotherapy. — 2006. -№ 5. -p. 1753-1761.

79. Kuipers, О. P. Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction / O. P. Kuipers, M. M. Beerthuyzen, P.C.M. De Ruyter, E. J. Luesink, W.M. De Vos // The journal of biological chemistry. -1995. -№ 45. -p. 27299-27304.

80. Kunji, E.R.S. The proteolytic systems of lactic acid bacteria / E.R.S. Kunji, I. Mierau, A. Hagfing, B. Poolman, W.N. Konings // Antonie van Leeuwenhoek. -1996. -№ 2-4. -p. 187-221.

81. Leistner, L. Food preservation by hurdle technology / L. Leist-ner, G.M. Gorris // Trends in food science & technology. -1995. -№2. -p. 41-46.

82. Li, Y. Glutatione protects Lactococcus lactis against oxidative stress / Y. Li, D. Molenaar, J. Hugenholtz, T. Abee // Applied and environmental microbiology. 2003. - №10. - p. 5739-5745.

83. Litman, T. From MDR to MXR: new understanding of multidrug resistance systems, their properties and clinical significance / T. Litman, Т. E. Dru-ley, W. D. Stein, S. E. Bates // Cellular and molecular life sciences. -2001. -№ 7.-p. 931-959.

84. Liu, W. Some chemical and physical properties of nisin, a small-protein antibiotic produced by Lactococcus lactis / W. Liu, J.N. Hansen // Applied and environmental microbiology. -1990. -№ 8. -p. 2551-2558.

85. Lohmeier-Vogel, E.M. Phosphorus-31 NMR studies of maltose and glucose metabolism in Streptococcus lactis / E.M. Lohmeier-Vogel, B. Hahn

86. Hagerdahl, SJ. Vogel // Applied and environmental microbiology. —1986. -№ l.-p. 43-51.

87. Lopez de Felipe, F. The role of NADH-oxidation in acetoin and diacetyl production from glucose in Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363 / F.M. Lopez de Felipe, J.C. Starrenburg, J. Hugenholtz // FEMS microbiology letters. -1997. -№ l.-p. 15-19.

88. Lu, W. Nisin Production by Lactococcus Lactis Subsp. lactis under Nutritional Limitation in Fed-Batch Culture / W. Lu, W. Cong, Z. Cai // Biotechnology Letters. -2004. -№ 3. -p. 235-238

89. Mason, P.W. The importance of inorganic phosphate in regulation of energy metabolism of Streptococcus lactis / P.W. Mason, D.P. Carbone, R.A. Cushman, A.S. Waggoner // The journal of biological chemistry. -1981. -№ 4. -p. 1861-1866.

90. McAuliffe, O. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action / O. McAuliffe, R.P. Ross, C. Hill // FEMS microbiology reviews. -2001. -№ 3. -p. 285-308.

91. McGinnis, J.F. Catabolite inhibition: a general phenomenon in the control of carbohydrate utilization / J.F. McGinnis, K. Paigen // Journal of bacteriology. -1969. -№ 2. -p. 902-913.

92. Melchiorsen, C.R. Dynamics of pyruvate metabolism in Lactococcus lactis / C.R. Melchiorsen, N.B. Jensen, B. Christensen, K.V. Jokumsen, J. Vil-ladsen // Biotechnology and bioengineering. -2001. -№ 4. -p: 271-279.

93. Melchiorsen, C.R. Synthesis and posttranslational regulation of pyruvate formate-lyase in Lactococcus lactis / C.R. Melchiorsen, K.V. Jokumsen, J: Vil-ladsen, M.G. Johnsen, H. Israelsen, J. Arnau // Journal of bacteriology. -2000. -№ 17.-p. 4783-4788.

94. Moll, G.N. Bacteriocins: mechanism of membrane insertion and pore formation / G.N. Moll, W.N. Konings, A.J.M. Driessen // Antonie van Leeu-wenhoek. -1999. -№ 1-4. -p.l85-198.

95. Mulders, J.W.M. Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin variant / J.W.M. Mulders, I J. Boerrigter, H.S. Rollema, R.J. Siezen, W.M. De Vos // European journal of biochemistry. -1991. -№ 1-2. -p. 581-584.

96. Navarre, W.W. Surface Proteins of Gram-Positive Bacteria and Mechanisms of Their Targeting to the Cell Wall Envelope / W.W. Navarre, O. Schneewind // Microbiology and molecular biology reviews. —1999. -№1. —p. 174-229.

97. Neves, A.R. In vivo NMR studies of glycolytic kinetics in Lactococcus lactis / A.R. Neves, A. Ramos, M.C. Nunes, M. Kleerebezem, J. Hugenholtz, W.M. de Vos, J. Almeida & H. Santos // Biotechnol. Bioeng. 1999. -№ 64. -p. 200-212.

98. Neves, A.R. Overview on sugar metabolism and its control in Lactococcus lactis The input from in vivo NMR / A.R. Neves, W.A. Pool, J. Kok, O.P. Kuipers, H. Santos // FEMS microbiology review. -2005. -№ 3. -p. 531554.

99. Novak, L. Metabolism and Energetics of Lactococcus lactis during growth in complex or synthetic media / L. Novak, M. Oocaighn-Bousquet, N.D. Lindley, P. Loubiere //Applied and environmental microbiology. -1997. -№7.-p. 2665-2670.

100. Palmfeldt, J. The Pool of ADP and ATP Regulates Anaerobic Product Formation in Resting Cells of Lactococcus lactis / J.Palmfeldt, M. Paese, B. Hahn-Hagerdal, W. J. van Niel // Applied and environmental microbiology. -2004. -№ 9. -p. 5477-5484.

101. Papagianni, M. Glycolysis and the regulation of glucose transport in Lactococcus lactis spp. lactis in batch and fed-batch culture / M. Papagianni, N. Avramidis, G. Filiousis // Microbial cell factories. -2007. -№ 16. -p. 1-13.

102. Parente, E. Influence of pH on growth and bacteriocin production by Lactococcus lactis subsp. lactis 140 MWC during batch fermentation / E. Pa-rente, A. Ricciardi, G. Addario // Applied microbiology and biotechnology. -1994. -№ 4. -p. 388-394.

103. Parente, E. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria / E. Parente, A. Ricciardi // Applied microbiology and biotechnology. -1999. -№ 5. -p. 628-638.

104. Parkinson, J.S. Communication modules in bacterial signaling proteins / J.S. Parkinson; E.C. Kofoid // Annual review of genetics. -1992. -№ 26. -p. 71-112.

105. Parkinson, J.S. Signal transduction schemes of bacteria / J.S. Parkinson // Cell. -1993. -№ 5. -p. 857-871.

106. Payne, J. Heat-resistant bacteria in pasteurized whole egg / J. Payne, J.E.T. Gooch, E.M. Barnes // The Journal of applied bacteriology. -1979: -№ 3. -p. 601-613.

107. Podlesek, Z. Amplification of bacitracin transporter genes in the bacitracin producing Bacillus licheniformis / Z. Podlesek, B. Herzog, A. Comino // FEMS microbiology letters. 1997. -№ 1. -p. 201-205.

108. Pongtharangkul, T. Effects of pH profiles on nisin production in biofilm reactor / T. Pongtharangkul, A. Demirci // Applied microbiology and biotechnology. -2006. —№ 6: -p. 804-811.

109. Podlesek, Z. The role of the bacitracin ABC transporter in bacitracin resistance and collateral detergent sensitivity / Z. Podlesek, A. Comino, B. Herzog, M. Grabnar // FEMS microbiology letters. 2000. -№ 1. -p. 103-106.

110. Poolman, B. Secondary solute transport in bacteria / B. Poolman, W.N. Konings // Biochimica et biophysica acta. -1993. -№ 1. -p. 5-39.

111. Poolman, B. Transporters and their roles in LAB cell physiology / B. Poolman // Antonie van Leeuwenhoek. -2002. -№ 1-4. -p. 147-164.

112. Putman M. Molecular characterization and antibiotic specificities of multidrug transporters in Lactococcus lactis / M. Putman. Groningen (Netherlands): University of Groningen. -2000. -p. 127.

113. Qian, N. Product formation and phosphoglucomutase activities in Lactococcus lactis: cloning and characterization of a novel phosphoglucomutasegene / N. Qian, G.A. Stanley, A. Bunte, P. Radstrom // Microbiology. -1997. -№. l.-p. 855-865.

114. Qiao, M. Evidence for a role of NisT in transport of the lantibiotic nisin produced by Lactococcus lactis N8 / M. Qiao, P.E.J. Saris // FEMS microbiology letters -1996. -№ 1. -p. 89-93. ^

115. Ra, R. Genes responsible for nisin synthesis, regulation and immunity form a regulon of two operons and are induced by nisin in Lactococcus lactis N8 / R. Ra, M. Qiao, T. Immonen, I. Pujana, P.E.J. Saris // Microbiology. -1996. -№ 142. -p. 1282-1288.

116. Redon, E. Transcriptome Analysis of the Progressive Adaptation of Lactococcus lactis to Carbon Starvation / E. Redon, P. Loubiere, M. Cocaign-Bousquet// Journal of Bacteriology. -2005. -№ 10. -p. 3589-3592.

117. Reizer, J. Regulation of beta-galactoside phosphate accumulation in Streptococcus pyogenes by an expulsion mechanism / J. Reizer, C. Panos // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. -1980. -№ 9. -p. 5497-5501.

118. Roberts, R.F. Shelf-life of Pasteurized Process Cheese Spreads Made from Cheddar Cheese Manufactured with a Nisin-Producing Starter Culture / R.F. Roberts, E.A. Zottola // Journal of dairy science. -1993. -№ 7. -p. 18291836.

119. Rogers, L.A. The inhibiting effect of Streptococcus lactis on Lactobacillus bulgaricus / L.A. Rogers // Journal of bacteriology. -1928. -№16. -p. 321325.

120. Rollema, S. Structure and biological activity of chemically modified nisin A species / S. Rollema, W. Metzger, P. Both, P. Kuipers, J. Siezen // European journal of biochemistry. -1996. -№ 3. -p. 716-722.

121. Roller S. Natural Antimicrobial for the Minimal Processing of Foods / S. Roller. -Cambridge: Woodhead publishing limited; 2003. 320 p.

122. Romano, A.H. Regulation of beta-galactoside transport and accumulation in heterofermentative lactic acid bacteria / A.H. Romano, G. Brino, A. Pe-terkofsky, J. Reizer // Journal of bacteriology. -1987. -№12. -p. 5589-5596.

123. Ross, K.F. Isolation and characterization of the lantibiotic salivaricin A and its, structural gene sal A from! Streptococcus salivarius / K.F. Ross, C.W. Ronson, J.R: Tagg // Applied and environmental microbiology. -1993. -№ 7. -p. 2014-2021.

124. Ruhr, E. Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence on the membrane potential of whole cells and on cytoplasmic and artificial membrane vesicles / E. Ruhr, H.-G. Sahl// Antimicrobial; agents and' chemotherapy.-1985:-№ 5.-^833-836.

125. Samarzija, D. Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis / D. Samarzija, N. Antunac, J. Luka-Havranek // Mljekarstvo. -2001. -№. 1. -p. 35-48.

126. Savijoki, K. Proteolytic systems of lactic acid bacteria / K. Savijoki, H. Ingmer, P. Varmanen // Applied microbiology and biotechnology. -2005. -№ 4.-p. 394-406.

127. Schnell, N. Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four sulphide-rings / N. Schnell, K-D. Entian, F. Gotz, T. Horner, R. Kellner, G. Jung // Nature. -1988. -№ 6170. -p. 276-278.

128. Sen, A.K. Post-translational modification of nisin. / A.K. Sen, A. Nar-bad, N. Horn, H.M. Dodd, A.J. Parr, I. Colquhoun, M.J. Gasson // FEBS Journal. -1999. -№ 2. -p. 524-532.

129. Shinkel, A.H. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family: an overview / A. H. Shinkel, J. W. Jonker // Advanced drug delivery reviews. -2003. -№ 1. -p. 3-29.

130. Siegers, K. Genes involved in immunity to the lantibiotic nisin produced by Lactococcus lactis 6F3 / K. Siegers, K.D. Entian // Applied and environmental microbiology. -1995. -№ 3. -p. 1082-1089.

131. Siezen, R.J. Comparison of lantibiotic gene clusters and encoded proteins / RJ. Siezen, O.P. Kuipers, W.M. de Vos // Antonie van Leeuwenhoek. -1996. -№2.-p. 171-184.

132. Smart, J. Effect of oxygen on lactose metabolism in lactic streptococci / J. Smart, T.D. Thomas // Applied and environmental microbiology. -1987. -№ 3.-p. 533-541.

133. Solem, C. The las Enzymes Control Pyruvate Metabolism in Lactococcus lactis during Growth on Maltose / C. Solem, B. Koebmann, F. Yang, P.R. Jensen // Journal of bacteriology. -2007. -№ 18. -p. 6727-6730.

134. Stiles, M.E. Biopreservation by lactic acid bacteria / M.E. Stiles // Antonie van Leeuwenhoek. -1996. -№ 2-4. -p. 331-345.

135. Stein, T. Function of Lactococcus lactis Nisin Immunity Genes nisi and nisFEG after Coordinated Expression in the Surrogate Host Bacillus subtilis /

136. Т. Stein, S. Heinzmann, I. Solovieva, K.D. // Journal of Bacteriology. -2003. -№ 1. -p. 89-94.

137. Stock, J.B. Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria / J.B. Stock, A.J. Ninfa, A.M. Stock // Microbiology reviews. -1989. -№ 4. -p. 450-490.

138. Takahashi, S. Purification of pyruvate formate-lyase from Streptococcus mutans and its regulatory properties / S. Takahashi, K. Abbe, T. Yamada // Journal of bacteriology. -1982. -№ 3. p. 1034-1040.

139. Thomas, T.D. Change from homo- to heterolactic fermentation by Streptococcus lactis resulting from glucose limitation in anaerobic chemostat cultures / T.D. Thomas, D.C. Ellwood, M.C. Longyear // Journal of bacteriology. -1979. -№ i.p. Ю9-117.

140. Thomas, T.D. Galactose fermentation by Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris: pathways, products, and regulation / T.D. Thomas, K.W. Turner, V.L. Crow // Journal of bacteriology. -1980. -№ 2. -p. 672-682.

141. Thompson, J. In vivo regulation of glycolysis and characterization of sugar: phosphotransferase systems in Streptococcus lactis / J. Thompson- // Journal of bacteriology. -1978. -№ 2. -p. 465-476.

142. Thompson, J. Novel phosphoenolpyruvate-dependent futile cycle in Streptococcus lactis: 2-deoxy-D-glucose uncouples, energy production from growth / J. Thompson, B.M. Chassy // Journal of Bacteriology. -1982. -№ 3. -p. 1454-1465.

143. Thompson, J. Sugar transport in lactic acid bacteria / J. Thompson, J. Reizer, A. Peterkofsky // Sugar transport and Metabolism in Gram-Positive bacteria. -Chichester: Ellis Horwood Limited. -1987. -p. 13-38.

144. Todorov, S.D. Screening of lactic-acid bacteria from South African barley beer for the production of bacteriocin-like compounds / S.D. Todorov, L.M.T. Dicks // Folia microbiologica. -2004. -№ 4. -p. 406-10.

145. Vaughan, E.E. Transcriptional Regulation and Evolution of Lactose Genes in the Galactose-Lactose Operon of Lactococcus lactis NCD02054 / E.E. Vaughan, R.D. Pridmore, B. Mollet // Journal of Bacteriology. -1998. -№ 18.-p. 4893^1902.

146. Verheul, A. Modifications of membrane phospholipids composition in nisin-resistant Listeria monocytogenes / A. Verheul, N.J. Russell, R. Van'T Hof, F.M. Rombouts, T. Abee // Applied and environmental microbiology. -1997. -№ 9. -p. 3451-3457.

147. Wakamiya, T. The structure of ancovenin, a new peptide inhi- bitor of angiotensin I converting enzyme / T. Wakamiya, T. Ueki, T. Shiba, Y. Kido, Y. Motoki // Tetrahedron letters. -1985. -№ 26. -p. 665-668.

148. Wessels, S. Bacteriocins of the Lactic Acid Bacteria: An Overlooked Benefit for Food / S. Wessels, B. Jelle, I. Nes // Danish Toxicology Centre, Hoersholm, Denmark. -1998.

149. Wolin, M.J. Fructose-1,6-diphosphate requirement of streptococcal lactic dehydrogenases / M.J. Wolin // Science. -1964. -№ 3645. -p. 775-777.

150. Wood, S.L. Factors affecting the occurrence of Bacillus cereus in liquid whole egg / S.L. Wood, W.M. Waites // Food microbiology. -1988. -№ 5. -p. 103-107.

151. Zamfir, M. Production kinetics of acidiphilin 801, a bacteriocin produced by Lactococcus acidophilus IBB 801 / M. Zamfir, R. Callewaert, P.C. Cornea, L. De Vuyst // FEMS microbiology letters. -2000. -№ 2. -p. 305-308.

152. Zendo, T. Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural variant produced by Lactococcus lactis 61-14 isolated from a river in Japan / T. Zendo,

153. M. Fukao, К. Ueda, Т. Higuchi, J. Nakayama, K.Sonomoto // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. -2003. -№ 7. -p. 1616-1619.

154. Zhang, J. Glutathione protects Lactococcus lactis against acid stress / J. Zhang, R.Y. Fu, J. Hugenholtz et.al. // Applied and environmental microbiology. 2007. - №16. - p. 5268-5275.

155. Zimmermann, N. The tetracyclic lantibiotic actagardine 1H-NMR and 13CNMR-assigments and revised primary structure / N. Zimmermann, J.W. Metzger, G. Jung // European journal of biochemistry. -1995. -№ 2. —p. 786797.