Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсификация технологии пищевого полипептидного консерванта низина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсификация технологии пищевого полипептидного консерванта низина"

На правах рукописи

РГб од

2 2 ДЕК 20СЗ

Минаева Людмила Павловна

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВОГО ПОЛИПЕПТИДНОГО КОНСЕРВАНТА НИЗИНА

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Государственном научнолсследоватсльском институте биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок) Министерства промышленности, науки и технологии РФ и Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) Министерства образования РФ

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор Бирюков Валентин Васильевич кандидат технических наук Щеблыкин Игорь Николаевич Официальные оппоненты:

доктор технических наук Красникова Людмила Васильевна кандидат биологических наук Литвинова Мирра Николаевна Ведущая организация:

Государственны 11 научный центр антибиотиков

Защита состоится « 2000 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 033.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д. 9)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д.И, Менделеева.

Автореферат разослан «У/» //С -С__2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.И. Гусева

/\2Нв. 6 -32пО

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы проявляется все возрастающий иитерес к использованию молочнокислых бактерий для защиты пищевых продуктов. Требования потребителей, предъявляемые к производству продуктов питания - сократить использование химических консервантов. Использование бактериоцинов, производимых молочнокислыми культурами, а также самих культур позволяет получать пищевые продукты высокого качества, обработка которых сведена к минимуму и, в то же время, не подверженных быстрой порче и не представляющих опасности для здоровья человека. Одним из таких бактериоцинов является низин - лантибиотик полипептндной природы, который относится к биологическим ингибиторам и продуцируется молочнокислыми бактериями ЬасЮсоссиз 1ас(Ь.

Низин подавляет развитие ряда грамположительных бактерий: бацилл, стрептококков, сарцин, снижает термоустойчивость многих споровых форм, вызывающих порчу пищевых продуктов, что позволяет производить консервированные продукты с длительным сроком хранения, но более высокого качества. Безвредность низина для живого организма, непригодность его для медицинских целей, быстрое разрушение ферментами желудочно-кишечного тракта обусловили широкое применение его препаратов в качестве консервантов.

Применение низина в пищевой промышленности разрешено Министерством здравоохранения СССР при изготовлении мягких и плавленых сыров, сгущенного молока, молочных продуктов, овощных продуктов (зеленого горошка, картофеля, томатопродуктов, фасоли) и соков, грибов, икры осетровых, пива, консервированных супов и в хлебопечении.

В связи с недостаточно развитой инфраструктурой подготовки, транспортировки и хранения сырья и готового продукта в России ни-зинсодержащие консерванты имеют высокую потребительскую ценность. Минсельхозпрод России подтверждал потребность в препарате низине для Москвы и Московской области в объеме 3-5 т/год, в целом

по России - 10-15 т/год. В то же время промышленное производство низина в России в настоящее время отсутствует.

В этой связи актуальной проблемой является интенсификация технологии природного пищевого полипептидного консерванта низина, делающая его конкурентноспособным с импортными аналогами. Такая технология позволила бы создать производство сухого высокоактивного препарата низина - 1000 МЕ/мг, более дешевого по стоимости, но не уступающего по качеству английскому аналогу. Это, в свою очередь, позволит удовлетворить потребность в данном препарате и сделать его доступным для российских производителей пищевых продуктов. Необходимо также расширение спектра его применения. Таким образом, интенсификация технологии низина является несомненно актуальной научно-технической проблемой. Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских программ Минобразования РФ: «Биотехнологическая безопасность и лечебно-профилактическое питание», проводимой в 1998-1999 годах и «Научные исследования высшей школы по технологии живых систем», проводимой в 2000 году.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка интенсивной технологии безопасного полипептидного консерванта - низина, продуцируемого молочнокислыми бактериями Lacto-coccus lactis. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- селекция высокоактивных штаммов Lactococcus lactis - продуцентов низина;

- исследование влияния условий приготовления питательной среды на биосинтез низина и подбор оптимальных условий, обеспечивающих высокий уровень синтеза низина;

- исследование влияния условий перемешивания на биосинтез низина;

- отработка процессов ферментации в периодическом, много циклическом и отьемно-доливном режимах в аппаратах с рабочим объемом до 200 л;

- формирование параметров управления процессом ферментации;

- повышение эффективности методов выделения и концентрирования целевого продукта и их экспериментальная апробация;

- наработка опытных образцов препарата и проведение всесторонней оценки их качества;

- изучение действия низина на спорообразующие бактерии с целью расширения спектра применения ни?ина

Научная новизна работы.

Изучено влияние буферных свойств среды на интенсивность биосинтеза низина.

Предложен способ ускоренной селекции штаммов-продуцентов низина с использованием элективной среды повышенной буферности. За счет применения этого способа из 40 проверенных культур Lacto-coccus lactis были выделены два высокоактивных штамма Laclococcus 1actis, обеспечивающих биосинтез низина в 2-2,5 раза выше по сравнению с.контролем. Селекционированные штаммы защищены патентами РФ: №2115724 1998 г., и №2151796 2000 г.

Изучено влияние условий ферментативного гидролиза белковых компонентов среды, с использованием различных ферментов, на биосинтетические свойства культуры-продуцента.

Разработаны условия температурной обработки питательной среды, препятствующие образованию лактулозаминов и обеспечивающие деконтаминацию среды и максимальный синтез низина в последующей ферментации.

Установлена зависимость выхода низина на стадии ферментации от гидродинамических условий и от условии взаимодействия низина с кислородом воздуха в пене.

Исследована динамика процесса высаливания и установлено оптимальное время его завершения, что позволило обеспечить суммарный выход на уровне 55-60% от его содержания в культуралыюи жидкости.

Установлено бактерицидное действие низина на возбудителей «картофельной болезни» хлеба Bacillus subtilis. Разработана и согласована с санитарными органами методика оценки зараженности муки и хлеба спорами этого микроорганизма.

Практическая ценность работы. Разработана технология биосинтеза и выделения низина, позволяющая получать препарат, не уступающий по качеству импортным аналогам и обеспечивающая возможность выпуска продукта по цене в 2-3 раза ниже аналогов.

На технологию разработан лабораторный регламент, утверждены технические условия (ТУ) и получен гигиенический сертификат.

Разработан бизнес-план промышленного производства низина мощностью 20 т/год.

Наработаны опытные партии жидкого препарата низина для фирмы «КОНСЭКО», прошедшие успешные испытания для промышленных задач консервирования картофеля.

Разработан метод контроля микробиологической зараженности муки и хлеба. Рекомендованы показатели по микробиологической зараженности муки и хлеба, включенные в Дополнение к СанПиН 2.3.4.545-96, которые позволят повысить эффективность борьбы с «картофельной болезнью» хлеба.

Апробация работы. Результаты работы докладывались:

- на международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» в Москве, МГУПБ, 1995г.;

- на конференции «Холод и пищевые производства» в Санкт-Петербурге, ГАХПТ, 1996г.;

- на II международном симпозиуме молодых ученых, аспирантов и студентов «Техника и технология экологически чистых производств» в Москве, Кафедра ЮНЕСКО МГУИЭ, 1998г.;

- на III международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» в Москве, МГУПБ, 1999г.;

- на семинаре «Интенсификация и автоматизация технологических процессов обработки пищевых продуктов» в Москве, МГУПБ, 1999 г.

- на Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов», посвященной памяти М.Н. Манакова, в Москве, ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН, МХТИ им. Д.И. Менделеева, 2000 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав, заключения, выводов, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 140 страницах, содержит^ таблиц,23 рисунков.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Представлены актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая ценность, а также сведения о публикациях и апробаций работ.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В обзоре представлены: история низина; ею характеристика, свойства; единицы измерения и существующие методы определения низина; механизмы действия, атнимикробнын спектр и области применения низина; метаболизм культуры-продуцента; культивирование на различных питательных средах; условия ферментации продуцента; выделение низина и способы его концентрирования. Проанализированы работы: Н.С. Егорова, И.П. Барановой, Ю.И. Козловой, Л.Г. Стояновой, Л.В. Красниковой, М.Н. Литвиновой, М.П. Силёвой, Ю.В. Шкундовой, В.Л. Кудряшова,Г.ЕЛндисовон, Д.М. Исаковой, В.Л. Гру-

шиной. А.Ю. Попова и др. Обзор завершается выводами и постановкой задачи.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использовали продуценты низина - молочнокислые бактерии Lactococcus lactis, селекционированные в ГосНИИсинтезбелок.

Инокулят выращивали на обезжиренном молоке (обрате) с концентрацией сухих веществ (СВ) 12% при 30°С в течение 24 часов, для засева вносилось 10%. Среда для биосинтеза низина содержала молочные и сывороточные белки (50 г/л СВ), подвергнутые протеолити-ческому ферментативному гидролизу.

Для гидролиза молочных и сывороточных белков использовали ферменты: папаин - активность по казеину 6000 USP/mg (107147, Merck); панкреатин - протеазная активность 100 USP-U/mg (107133, Merck); протосубтилин производства Вышневолоцкого завода ферментных препаратов - удельная протеазная активность 630 Е/г (по Ансену); мегатерии производства Вышневолоцкого завода ферментных препаратов - удельная протеазная активность 1000 Е/г (по Ансену).

Глубину гидролиза оценивали по количеству аминного азота, определяемому методом формольного титрования. Белок определяли по реакции с красителем амидо-черным 10Б. Продукты ферментативного гидролиза белковых компонентов питательной среды разделяли осаждением: белок - 10% раствором трихлоруксусной кислоты, пептиды -20% раствором таннина. Последующая количественная оценка осуществлялась по методому Кьельдаля.

Ферментацию проводили в качалочных колбах вместимостью 750 мл с объемом среды 100 мл в стационарных условиях и при перемешивании на качалке -120 и 220 об/мин при 30°С, а также в ферментерах с перемешиванием и автоматическим поддержанием величины рН:

«Биостат» с рабочим объемом I л, «Марубиши» с рабочим объемом 1,5 и 20 л и «Ферматрои » с рабочим объемом 200 л.

Интенсивность перемешивания оценивали по величине сульфитного числа.

Концентрацию низина определяли методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus coa^ulans.

Отделение биомассы проводили на сепараторе с коэффициентом разделения 10230 g или на микрофильтрационном модуле с полыми волокнами 100 кДа.

Концентрирование низина проводили добавлением поваренной соли с последующим отделением осадка па сепараторе пли микрофильтрационном модуле.

Сушку готового продукта осуществляли на распылительном сушилке.

Исследования микробиологической зараженности муки и хлеба проводили высевом проб на твердые питательные среды с последующим микроскопированием.

Для статистической обработки результатов вычисляли усредненную оценку дисперсии воспроизводимости и доверительный интервал.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Отбор высокоактивных штаммов-продуцентов низина на селективной среде

Исследовано влияние буферных свойств среды на ннзинобра-зующую способность молочнокислых стрептоккоков L. taclis. В ходе экспериментов было замечено, что активность нпзппа, получаемая при культивировании L. Iactis на обрате в стационарных условиях, значительно превышает уровень, достигнутый на гидролнзованнои среде при тех же условиях, несмотря на то, что данная среда в ходе ферментативного г идролиза белков обогащается более доступными дня клеток продуцента источниками азота - пептидами п аминокислотами - и содержит достаточное количество лактозы. Повышение буферной емко-

сти среды с помощью пяти типов традиционных буферных растворов не дало существенного увеличения выхода низина. Возможной причиной низкого уровня активности на средах с достаточной буферной емкостью является негативное влияние самих буферообразующих солей на рост культуры и синтез низина.

Следующим шагом было введение в среду карбоната кальция, который, в данном случае, рассматривался как буферный агент. Результаты работ предыдущих исследователей, описанные в литературных источниках, говорят либо о негативном влиянии ионов кальция на стабильность низина, либо об отсутствии положительного влияния на синтез низина. Вопреки этому мел был введен в питательную среду. При этом негативного влияния ионов кальция на низин не наблюдалось, а переход от стационарных условий культивирования к интенсивному перемешиванию позволил значительно увеличить выход низина в колбах (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние добавки мела в разные среды при различных условиях переметите!т.ч ¡¡^ биосинтез низина и рЫ в конце пппп^ггя (после 14 ч культивирования).

Условия Тип среды Буферная Актив- рН в

культивиро- емкость, ность колбах

вания г-экв/л низина через

через 14 14 ч

ч, МЕ/мл

Стационар- 1. Молоко 0.278 900 4.96

ные 2. Гидролизат 0.19 360 4.63

молока

3. Молоко+4% мела 4.25 1015 5.07

4. Гидролизат 4.16 1380 5.05

молока + 4% мела

Перемеши- Гидролизат молока + 4.16 11010 5.9

вание 4% мела

220 об/мин

Для выяснения необходимого количества мела рассматривали диапазон концентрации от 0.5 до 10 % в среде (рис.1). Оптимальная

концентрация мела находится в пределах 4*6 % при наличии перемешивания среды. Достигнутый в ходе эксперимента уровень синтеза низина соответствует значениям, получаемым для данного штамма в ферментере с подтптровкон щелочью (табл.2).

я о т X о.

1 1 I I 1 1 I I 1 1 I I I I I I I I 1

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

0 12 3

4 5 6 Мел, %

7 8 9 10

к 2

Рис. I. Зависимость синтеза низина и рН в конце ферментации от содержания мела в среде.

Таблица 2.

Сравнение результатов культивирования двух штаммов-продуцентов при различных условиях и на различных средах

Культура СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Молоко Гндро- лнзат молока Гидрол изат + 4% мела Гидролизат молока с подтитровкон щелочью

Пробирка, Колба Колба Ферментер Ураб=1 л Ферментер Ураб=2 0л Ферментер Ураб= 200 л

Штамм №8 1645 375 7545 8400 8550 8200

Штамм №31 1080 360 9600 9750 10100 9950

На основании этих результатов предложен способ отбора наиболее активных штаммов-продуцентов низина и оптимизации состава питательной среды, позволяющий в колбочных опытах моделировать условия, аналогичные условиям культивирования в ферментерах с автоматическим титрованием. Отобранные штаммы №8 и 31 были испытаны при культивировании в ферментационных аппаратах с рабочим объемом 1, 20 и 200 л (табл.2). При этом было показано, что штаммы, проявившие наибольшую активность при обычном способе селекции (на обрате), не проявляют высокой активности при отборе по предложенному модифицированному способу, и наоборот. Но важно, что отобранные по модифицированному способу штаммы оказываются наилучшими и в реальных условиях культивирования в ферментерах.

3.2. Исследование условий ферментативного гидролиза белковых компонентов среды

Ь. 1ас(15 относится к молочнокислым бактериям, естественной средой обитания которых является молоко. Физиологическими особенностями культуры являются: утилизация в кгчестпе ос::сп::ь:х источников углерода Сахаров - лактозы и глюкозы, с образованием молочной кислоты, а также потребность в доступных источниках азота, вследствие малой протеолитической активности молочнокислых стрептококков.

Для развития культуры-продуцента и биосинтеза низина необходимое обогащение питательной среды возможно как внесением отдельных аминокислот, витаминов, субстратов, содержащих комплекс источников органического азота, так и ферментативным гидролизом белковых компонентов среды.

Учитывая описанные выше физиологические свойства молочнокислых стрептококков, было предложено исследование влияния качества гидролизата молочных белков на биосинтез низина штаммом-продуцентом.

Гидролиз белковых компонентов среды проводился протеолити-ческими ферментами: мегатерином, протосубтилином, панкреатином

и папаином с подбором условий гидролиза. Проведенные для разных ферментов эксперименты по гидролизу в обобщенном виде представлены на рис. 2, где в качестве параметра-аргумента использована концентрация аминного азота. Из графика видно, что зависимости получаются различными для разных ферментов. Одинаковая концентрация аминного азота в среде, полученная на разных ферментах, приводит к различным концентрациям низина в конце ферментации.

о

120 100 80 60 40 20

0 -0.20

1 Аегатери 1

Д "Р лос}0 ИЛИИ

/ Панкрс атии г--А аип

г 1 ДО-- 1 # -^Пап

/ ш — г»

0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 Концентрация аминного азота, мг/мл

1.40

Рис.2 Зависимость биосинтеза низина от концентрации аминного азота в среде полученного гидролизом белков различными ферментами

Полученные данные можно интерпретировать таким образом -синтез бактериоцнна низина на сложных питательных средах обусловлен наличием не только доступных форм органического азота, но и качественным составом продуктов, образуемых в ходе гидролиза. Соотношение качественных и количественных показателей органического азота в гидролизате подбирается эмпирически для штамма-продуцента, зависит от применяемого фермента и условий гидролиза.

3.3. Подбор условий стерилизации питательной среды.

Среда, используемая в данной технологии для культивирования штамма-продуцента, содержит такие термолабильные компоненты как лактозу, белки, пептиды и аминокислоты. При термической обработке

изменяются первоначальные свойства этих компонентов: аминогруппы белковых компонентов среды вступают в реакцию меланоидирования с сахарами среды. Образующиеся комплексы трудно расщепляются. Таким образом, необходимые питательные компоненты становятся недоступными для потребления клетками микроорганизмов. Количественно это может быть выявлено по снижению концентрации низина в конце процесса ферментации. С другой стороны, процесс биосинтеза должен проходить в строго асептических условиях, которые необходимо обеспечить термообработкой среды.

Стерильность жидких сред может быть достигнута сочетанием различных факторов, например: температуры, времени и активной кислотности среды (рН). Задача состоит в том, чтобы, варьируя эти факторы, обеспечить надежную стерильность и питательную ценность среды. Изучение влияния этих факторов проведено на примере стерилизации среды в ферментере вместимостью 20 л и в колбах (автокла-вированием) с последующим культивированием. Найдено оптимальное соотношение условий: температура 113-И 14°С, время 17-20 минут, величина рН 6,8. При этом критерий стерилизации по В. 51еаго1Ьегто-рНИт составляет 17,8, а выход низина является максимальным для всех исследованных сред.

3.4. Изучение влияния условий перемешивания на биосинтетические свойства культуры-продуцента

Культура-продуцент Ь. ¡асНя является факультативным анаэробом. Энергетические ресурсы культура восполняет синтезом АТФ путем субстратного фосфорилирования. Как указывалось в опубликованных исследованиях, культура образует низин в анаэробных и в аэробных условиях, а ее рост и биосинтез низина ингибируется конечным продуктом гомоферментативного брожения - молочной кислотой.

В процессе подбора селективной среды при культивировании Ь. ¡асШ в колбах с карбонатом кальция в стационарных условиях и с различной интенсивностью перемешивания (табл. 1) наибольшее образование низина наблюдалось при перемешивании 220 об/мин. При варьировании объема среды 100, 200 и 300 мл в колбах и культивировании

на качалке с 220 об/мин, наибольшая активность низина 10150 МЕ/мл была в колбе с 100 мл среды.

В гетерогенной системе, которую представляют собой твердые частицы мела в жидкой среде, максимальная эффективность его «работы» по нейтрализации выделяющейся молочной кислоты обеспечивается при наиболее равномерном распределении мела в объеме среды, что достигается интенсивным перемешиванием. Таким образом, перемешивание является необходимым условием культивирования, в присутствии карбоната кальция, для интенсивной нейтрализации образующейся молочной кислоты, ингибирующей биосинтез низина.

При переходе к культивированию в ферментерах с автоматической подачей нейтрализующего агента необходимо было выбрать критерий масштабирования. Для культуры, не требующей аэрации, но чувствительной к величине рН, таким критерием может быть время перемешивания. На примере культивирования в 1-литровом ферментере была получена зависимость выхода низина от интенсивности перемешивания. Сульфитное число в данном случае рассматривалось как показатель интенсивности перемешивания (рис. 3)

Рис. 3. Уровень синтеза низина в зависимости от интенсивности перемешивания в ферментере «Биостат» с рабочим объемом 1л.

Из этой зависимости видно, что для получения высокой активности низина необходим оптимальный режим перемешивания, который характеризуется значениями сульфитного числа в пределах 3-5-4 кЮ2/м3ч, для данного аппарата с рабочим объемом 1 л - это соответствует 200^-300 об/мин (рис.3).

Менее интенсивное перемешивание приводит к снижению концентрации низина, что связано, по-видимому, с недостижением быстрой нейтрализации выделяемой молочной кислоты и с локальным за-щелачиванием культуральной жидкости. Более интенсивное перемешивание - свыше 300 об/мин - также приводит к снижению активности низина, хотя в меньшей степени. При этом увеличивается захват воздуха из воздушной подушки аппарата и, соответственно, возрастает концентрация растворенного кислорода в КЖ, что также оказывает негативное влияние на культуру-продуцента - факультативного анаэроба.

Исследование стабильности низина при различных рН от 7 до 11 при температуре 30°С, соответствующей условиям культивирования, показало инактивацию низина в условиях рН выше 7, которые создаются в культуральной жидкости при локальном зашелачивании.

100

^ 80 О4

■¿Г

й 60 о я

х 40 |

^ 20 0

мь Г-*- г?

•< м- * - < >--- - -¿>

••-С *— —о

1 „ 2

Время, ч

—♦—рН7

— О — рН 8 Д рН9

— О— рН 10 -••©---рН 11

0

Рис. 4. Активность низина при различных величинах рН и термостати-ровании при 30°С.

При исследовании влияния кислорода воздуха непосредственно на сам низин было отмечено снижение содержания низина на 23 % через 1 час в условиях интенсивной аэрации и перемешивания. Низин наиболее стабилен в кислой среде, поэтому жидкость, содержащая низин, предварительно была закислена до рН 2. Однако, несмотря на это, наблюдалась частичная инактивация низина (рис. 6 приведен в разделе 3.6).

Обобщая полученные результаты, можно сделать следующий вывод - для увеличения биосинтеза низина культивнрованне штамма-продуцента необходимо проводить в условиях перемешивания. Уровень низина в культуральной жидкости определяется несколькими параметрами - временем распределения титранта и присутствием растворенного кислорода в среде. Эти параметры оказывают влияние, как на культуру-продуцента, так и на стабильность самого низина.

3.5. Отработка процессов ферментации в периодическом режиме, мпогоциклическом и режиме отлива-долиса в аппаратах с рабочим объемом 1.20 и 200 л

Питательная среда, получаемая после ферментативного гидролиза, содержит большое количество взвешенных частиц, затрудняющих выделение и концентрирование низина на последующих стадиях. Поэтому было исследовано культивирование штамма-продуцента на осветленной среде. Для этого ферментативный гидролизат пропускался через микрофильтрационный модуль 100 кДа. Затем среда стерилизовалась термически. Активность низина на осветленной среде ниже, чем на исходной.

Молочная кислота - единственный продукт сбраживания Сахаров Ь. 1асив. Наиболее активному росту культуры, в условиях рН-статирования, соответствует наибольшая скорость потребления щелочи, а максимальное накопление низина происходит в фазе замедленного роста культуры. Динамика представлена на рис. 5, из которого видно, что наибольшее содержание низина в культуральной жидкости 9570 и 9510 приходится на 19 и 20 часов ферментации;скорость тит-

роваиия при этом составляет 134 и 108 мл/ч, что в 2,8 и 3,5, раза соответственно, меньше максимального потребления щелочи.

Далее наблюдается снижение активности низина, чтобы этого избежать, необходимо останавливать процесс. Наиболее удобным для контроля в данном случае является соотношение между максимальным расходом щелочи и расходом при максимальном накоплении низина. Для данного штамма-продуцента, в периодическом режиме культивирования, это соответствует снижению скорости титрования в 3 раза от максимального.

и

с; з* ^

(L 2

5 =г

е у

►о о

р п

о у

о 3

о. -J о

Ьй

и

400 350 300 250 200 150 100 50 0

b

4е»

\ fc Л ^ь чь Время, ч

П Скорость 1ютребления щелочи, мл/ч — Активность низина, МЕ/мл

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

е

§

t; Ж

Рис. 5. Динамика синтеза низина и потребления щелочи в Марубишп Ураб=20 л (обобщенные данные).

Для повышения продуктивности процесса ферментации были поставлены опыты культивирования в режиме отлива-долива.(о-д) Исследовались режимы: отлив-долив 20%, 60%, 87% (многоциклический). Оперативным параметром, по которому определяли момент перезасева, была скорость потребления щелочи. Ферментацию в каждом цикле останавливали в первом варианте - после окончания потребления щелочи, во втором - после снижения расхода титранта до одной трети от максимального расхода. Предварительные опыты показали,

что в основном к этому моменту заканчивается накопление низина, а продление культивирования может привести к частичной инактивации низина.

Культивирование в режиме о-д 20% при перезасеве по варианту 1 продолжалось 12 циклов, в режиме о-д 60% - 5 циклов. В обоих случаях активность была достаточно стабильна и к концу последнего снизилась примерно на 900 МЕ/мл. При перезасеве по варианту 2 замечено резкое падение концентрации низина, как в режиме о-д 20 % на 4140 МЕ/мл к концу 5 цикла, так и в режиме о-д 87 % - на 4410 МЕ/мл концу 4 цикла. Такое поведение, видимо, связано с метаболизмом культуры-продуцента.

Наибольшая средняя производительность 1430 МЕ/мл*ч была в режиме отлив-долив 20% - вариант 1. В режиме отлив-долив 60 % ниже - 920 МЕ/мл*ч, что связано с увеличением продолжительности цикла. В периодическом режиме производительность составляла 550-HS50 МЕ/мл*ч.

Из полученных данных видно, что наибольшее количество низина образуется при культивировании на неюсветленной среде, выбранный параметр управления - расход титранта - позволяет достаточно четко регулировать процесс, для получения стабильного выхода низина в каждом цикле при проведении многоциклического или отьемно-доливного культивирования процесс необходимо останавливать лишь после окончания титрования, то есть после перехода культуры в фазу стационарного роста, максимальная средняя производительность получена в режиме отлив-долив 20%.

3.6. Выделение и концентрирование низина из кулыпуральиой жидкости

Первой стадией отделения низина от клеток является его экстракция. Учитывая свойство молекул низина адсорбироваться на поверхности клеток по мере повышения рН раствора и десорбироваться при снижении рН, в данной работе в качестве способа отделения низина от биомассы рассматривалась кислотная экстракция. При выборе оптимальных условий экстракции подбирались Такие условия, которые

обеспечивали бы высокий выход нпзипа в возможно наиболее «мягких», с т.з. коррозии, условиях экстракции. Эффективность экстракции оценивалась по степени перехода низина в раствор, т.е. по его концентрации в фугате.

В качестве экстрагентов использовались кислоты: фосфорная и лимонная. Эти кислоты обладают значительно меньшей по сравнению с соляной (используемой традиционно) коррозионной активностью, находящейся в допустимых для стандартного оборудования пределах -0+0,1 мм/год,. Выделение низина рассматривалось в двух температурных режимах 70° и 100°С и диапазоне рН 2+4.

Подобранные условия перевода низина в раствор позволяют получать высокий выход целевого продукта в процессе экстракции - не менее 94% при кипячении с фосфорной кислотой 10 минут при рН = 3,0 и 98% - при кипячении с лимонной кислотой - 10 минут при рН = 3,5 (рис. 5). Применение фосфорной и лимонной кислот позволит снизить коррозионную нагрузку на оборудование по сравнению с соляной кислотой.

1-фосфорная кислота

2-лимонная кислота

3-соляная кислота

1 *■ -■

Й

зЙ

Рис. 5. Экстракция низина различными кислотами.

Следующим этапом выделения было отделение биомассы. Наиболее простым и технологичным способом является сепарация КЖ, которая осуществлялась она сепараторе с фактором разделения 10230 g. На этой стадии выход низина составлял в фугате - 80%, в осадке 1,7 % от содержания в культуральной жидкости, тогда как при центрифугиро-

вании активность в фугате составляла 97%, в осадке - 3 %. Чтобы выяснить причину такой потери активности,закисленную до рН 2 и прогретую культуральную жидкость интенсивно аэрировали в течение 2 часов (рис. 6). Режим аэрации и перемешивания был подобран таким образом, чтобы всю культуральную жидкость перевести в пену и лод-держивать в таком состоянии.___

0.5 1

Время, ч

О

Рис. 6. Влияние аэрации и интенсивного перемешивании на активность низина

За первый час интенсивной аэрации активность низина снизилась до 76,7 % и до 73,2% за следующий час. Эти данные показывают, что под действием кислорода воздуха происходит частичная инактивация низина. Сепарация сопровождается активным захватом воздуха, который, возможно, является причиной частичного снижения активности низина.

Концентрирование низина из раствора проводилось высаливанием хлористым натрием. Низин, как соединение пептидной природы, переходит в осадок при увеличении концентрации соли в экстракте, однако вместе с ним в осадок переходят и другие белковые компоненты жидкой фазы. Для получения высококонцентрированного конечного продукта была исследована зависимость концентрации низина в осадке от времени высаливания (рис. 7).

Рис. 7. Концентрация низина в осадке при различном времени высаливания.

Максимальная активность низина 2770 МЕ/мг в осадке была получена при минимальном времени высаливания. Отделение осадка сепарацией проводилось сразу после растворения соли.

Полученный высококонцентрнрованпый продукт стандартизировался добавлением соли №С1 до содержания низина 1000 МЕ/мг по сухому весу. После этого суспензия подавалась на распылительную сушилку. Активность низина в сухом препарате составляла 1000 МЕ/мг.

Суммарный выход низина по данной технологии составил 55-60% от его содержания в культуральной жидкости.

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ПРОВЕРКА И ВНЕДРЕНИЕ

4.1. Испытание и внедрение

Полученные в работе результаты были использованы в опытно-промышленной технологии. На базе научно-экспериментального комплекса ГУП «ГосНИИсинтезбелок» было организовано опытное производство, где осуществлялась наработка опытных партий жидкого препарата низина для фирмы «КОНСЭКО». Препарат прошел успешные испытания для промышленных задач консервирования картофеля.

Проверка стабильности жидкого препарата показала сохранение активности на исходном уровне в течение полугода и более с даты изготовления, что наемного превышает гарантированный срок хранения. Оформлены технологический регламент, технические условия и гигиенический сертификат на продукт.

4.2. Изучение действия низина с целью расширения спектра его применения

Изучалось действие низина на спорообразующие бактерии Bacillus subtilis, вызывающие так называемую «картофельную» болезнь хлеба. Низин не оказывает влияния на вегетативные клетки, но полностью подавляет прорастание спор. В образцах без низина рост В. subtilis наблюдался через сутки выдерживания в термостате при 37°С, в образцах с низином роста не наблюдалось и через 17 суток при тех же условиях.

Это наблюдение может явиться основой разработки препарата для борьбы с «картофельной болезнью» хлеба, особенно при условии производства дешевого низина.

В процессе исследований была разработана методика определения микробиологической зараженности образцов муки и хлеба возбудителями «картофельной» болезни, которая может быть рекомендована для контроля хлебопекарных и мукомольных предприятий.

Консервирующее действие низина исследовалось таюже в мясных изделиях на примере колбас. Использование низина приводит к улучшению санитарно-микробиологических показателей готовой продукции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Изучение влияния буферных свойств среды на биосинтез низина позволило разработать способ ускоренной селекции штаммов-продуцентов низина с использованием элективной среды повышенной буферности. За счет применения этого способа из 40 проверенных культур Lactococcus lactis были выделены два высокоактивных штамма Lactococcus lactis, обеспечивающих биосинтез низина в 2-2,5 раза вы-

ше по сравнению с контролем. Селекционированные штаммы защищены патентами РФ: №2115724 1998 г., и №2151796 2000 г.

2. Установлено, что синтез бактериоцина низина па сложных питательных средах обусловлен не только наличием доступных форм органического азота, но и качественным составом продуктов, образуемых в ходе ферментативного гидролиза.'Соотношение качественных и количественных показателей гидролизата подбирается эмпирически для штамма-продуцента и зависит от применяемого фермента и условий гидролиза.

3. Показано, что уровень биосинтеза низина зависит от условий термической обработки среды во время стерилизации. На основе проведенных исследований предложена совокупность факторов (рН, температура и время обработки) обеспечивающих асептичные условия п высокий уровень биосинтеза низина.

4. Установлено, что уровень биосинтеза низина определяется временем распределения титранта в среде, наличием контакта низина с кислородом воздуха, вызывающим его инактивацию.

5. Предложен способ определения времени завершения культивирования в периодическом режиме н времени перезасева в отьемпо-доливном режиме по скорости титрования при рН-статировании.

6. Опробованы варианты ферментации в многоциклическом и в отьемно-доливном режиме. Показана возможность повышения производительности процесса в 2 раза и более при отливе-доливе 20 % объема и времени перезасева следующего цикла, определяемому по моменту прекращения титрования.

7. Для совершенствования стадий выделения продукта предложены новые экстрагенты и режимы осаждения, обеспечивающие повышение качества продукта и улучшение коррозионной стойкости оборудования.

8. Полученные в работе результаты использованы в опытно-промышленной технологии. Оформлены технологический регламент, технические условия и гигиенический сертификат на продукт, организовано опытное производство в ГУП «ГосНИИсинтезбелок».

9. С целью расширения спектра использования низина проведены эксперименты по изучению его влияния на споры «картофельной палочки» В. subtilis, вызывающие заболевание хлеба. Установлено, что низин оказывает ннгибирующее воздействие на споры при температурах, соответствующих условиям в мякише при выпечки хлеба. Разработан метод контроля зараженности муки и хлеба и проект Дополнения к СанПиН 2.3.4.545-96, обеспечивающий возможность регулярного микробиологического наблюдения за работой хлебопекарных и мукомольных предприятий.

Список публикаций по теме диссертации

1. Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Минаева Л.П., Биттеева М.Б. Совершенствование технологии получения пищевого консерванта низина: Тез. докл. Междунар. науч-но-техн.конф. «Пища. Экология. ЧеловеюьМ.; МГУПБ, 1995.-С. 105.

2. Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Минаева Л.П., Биттеева М.Б. и др. Получение пищевого консерванта низина в опытно-камеральных условиях: Тез. докл. Науч. конф. «Холод и пищевые производства» - С-Пб.: ГАХПТ, 1996.

3. Минаева Л.П., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Биттеева М.Б., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Смирнова С.Н. Разработка технологии пищевых полипептидных консервантов//Труды МГАХМ, -1997.-Вып.1, С.24-25.

4. Минаева Л.П., Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Архипов М.Ю. Пищевой полипептидный консервант низин: Тез. докл. II международного симпозиума молодых ученых, аспирантов и студентов «Техника и технология экологически чистых производствам.: ЮНЕСКО, -1998. -С. 63.

5. Минаева Л.П., Бирюков В.В., Щеблыкин H.H., Биттеева М.Б., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д. Штамм бактерий Streptococcus lactis - продуцент низинаУПатент России №2115724, БИ № 20, 1998.

6. Минаева Л.П., Смирнова С.Н., Тахохова И.Б., Чередникова Е.В. Влияние степени гидролиза молочных белков на биосинтез низина:

Тез. докл. III международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек»-М.: МГУПБ, 1999.-С. 91.

7. Щеблыкин И.Н., Бирюков В.В., Минаева Л.П., Смирнова С.Н. Особенности аппаратурного оформления и масштабирования процесса биосинтеза низина: Тез. докл. III международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек» // Там же. - С. 126.

8. Минаева Л.П., Архипов М.Ю., Чередникова Е.В., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н. Экстракция низина из культуральной жидкости различными кислотами// Труды МГУИЭ, -1999.-Т.4.- С. 236-240.

9. Минаева Л.П., Биттеева М.Б., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Осипова В.Г., Смирнова С.Н. Разработка условий биосинтеза низина в колбах, обеспечивающих селекцию штаммов для крупномасштабного производства// Биотехноло-гия.-2000.- № 2. -С.29-36.

10. Биггеева М.Б., Бирюков В.В., Щеблыкин Й.Н., Шушеначева Е.В., Осипова В.Г., Минаева Л.П., Стехновская Л.Д. и др. Штамм Lac-tococcus lactis - продуцент бактериоцина низина./Патент России №2151796, БИ№ 18, 2000.

11. Разживин A.B., Мергуцкая O.A., Минаева Л.П., и др. Особенности использования низина в качестве консерванта для вареных колбас: Тез. докл. Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов», посвященной памяти М.Н. Манакова.- М.: ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН, МХТИ им. Д.И. Менделеева, 2000.- С. 60-61.

12. Минаева Л.П., Щеблыкин И.Н., Биттеева М.Б., и др. Изучение микробиологических показателей пшеничного хлеба и разработка биопрепарата в связи с «картофельнойболезнью»хлеба: Тез. докл. Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов», посвященной памяти М.Н. Манакова.// Там же.- С. 74.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Минаева, Людмила Павловна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. История низина.

1.2. Характеристика и свойства низина.

1.3. Единицы измерения и методы их определения.

1.4. Механизмы действия низина и антимикробный спектр бактериоцина.

1.5. Области применения консерванта.

1.6. Биосинтез низина культурой продуцента.

1.7. Метаболизм культуры-продуцента низина.

1.8. Питательные среды

1.9. Подготовка питательной среды.

1.10. Условия ферментации продуцента низина.

1.11. Выделение низина и способы его концентрирования.

Выводы и постановка задач.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Отбор высокоактивных штаммов-продуцентов низина на селективной среде.

3.2. Ферментативный гидролиз белковых компонентов среды.

3.3. Подбор условий температурной обработки среды

3.4. Изучение влияния условий перемешивания на биосинтез низина.

3.5. Отработка процессов ферментации в периодическом, многоциклическом режиме и режиме отлива-долива в аппаратах с рабочим объемом 1, 20 и 200л.

3.6. Выделение и концентрирование низина

3.7. Технологическая схема.

Глава 4. Практическая проверка и внедрение.

4.1. Практическая проверка.

4.2. Внедрение.

4.3. Изучение действия низина на спорообразующие бактерии Bacillus subtilis -возбудителей «картофельной» болезни хлеба.

4.4. Разработка методики определения микробиологической зараженности муки и хлеба возбудителями «картофельной» болезни хлеба.

4.5. Изучение действия низина на микрофлору, вызывающую порчу вареных колбасных изделий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Интенсификация технологии пищевого полипептидного консерванта низина"

В последние годы проявляется все возрастающий интерес к использованию молочнокислых бактерий (МКБ) для защиты пищевых продуктов. Одна из главных причин интереса к биологической защите - это требование потребителя о сокращении использования химических консервантов при производстве продуктов питания. Потребители хотят "естественных" пищевых продуктов высокого качества, которые при этом являлись бы безопасными и при минимальной обработке. Эта задача может быть решена методом биоконсервации, при котором используются микроорганизмы и/или их антимикробные продукты. Молочнокислые бактерии являются наиболее подходящими для реализации этого метода. Они имеют естественный потенциал для использования в биоконсервации, потому что, как правило, безопасны, играют существенную роль в большинстве ферментативных процессов при обработке продуктов и, в итоге, являются преобладающей микрофлорой во многих пищевых продуктах, сохраняемых естественным образом. Это обусловлено их ингибирующим эффектом в отношении нежелательных бактерий, который, главным образом, проявляется в образовании органических кислот, в конкуренции за субстрат, в образовании перекиси водорода и, для некоторых штаммов, в синтезе бактериоцинов. Комбинации различных физических, химических и микробных способов консервирования - важные факторы в "барьерной концепции" для защиты пищевых продуктов. Бактериоцины и/или бактериоцин-синтезирующие культуры могут выступать как два защитных барьера. .

Бактериоцины были известны в течение многих десятилетий. Лучше всех известен и наиболее исследован бактериоцин - низин. Низин эффективен против широкого диапазона грамположительных 5 бактерий: бацилл, стрептококков, сарцин; снижает термоустойчивость многих споровых форм, например, клостридий и бацилл, вызывающих порчу пищевых продуктов. Безвредность низина для живого организма, непригодность его для медицинских целей, быстрое разрушение ферментами желудочно-кишечного тракта обусловили широкое применение его препаратов в качестве консервантов.

В настоящее время, низин - единственный бактериоцин, одобренный как пищевой консервант.

В 1969 году Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ (JECFA) и Научная комиссия по пищевым добавкам Европейского Сообщества (SCF) признали использование низина как пищевого консерванта. В 1988 году низину был выдан статус GRAS (Generaraly Recognised As Safe - широко признанный как безопасный) (JECFA 1969, FDA 1988). Сегодня использование низина в продуктах питания разрешено более чем в 50 странах, включая ЕС, где низин (Е234) используется регулярно как консервант с узким спектром действия в таких молочных продуктах, как твердый сыр, плавленый сыр и топленые сливки, вместе с тапиокой (крупа) и манными пудингами (Европейский Парламент и Руководящий Совет, 1995).

Применение низина в пищевой промышленности разрешено Министерством здравоохранения СССР при изготовлении мягких и плавленых сыров, сгущенного молока, молочных продуктов, овощных продуктов (зеленого горошка, картофеля, томатопродуктов, фасоли, грибов), соков, икры осетровых, пива, консервированных супов, в хлебопечении.

В связи с недостаточно развитой инфраструктурой подготовки, транспортировки и хранения сырья и готового продукта в России низинсодержащие консерванты имеют высокую потребительскую ценность. По данным Минсельхозпрода России на 1995 год потребность в препарате низина для Москвы и Московской области составляла 3-5 т/год, а в целом по России - 10-15 т/год (письмо

Департамента пищевой и перерабатывающей промышленности №11-9/5 от 16.02.95 г.). В то же время промышленное производство низина в России в настоящее время отсутствует. Поэтому фирмы -производители продуктов с длительным сроком хранения вынуждены закупать импортный препарат, рыночная цена которого составляет 450 долларов США за килограмм.

В этой связи актуальной проблемой является интенсификация технологии природного пищевого полипептидного консерванта низина, делающая его конкурентноспособным с импортными аналогами. Такая технология позволила бы создать производство сухого высокоактивного препарата низина - 1000 МЕ/мг, более дешевого по стоимости, но не уступающего по качеству английскому аналогу. Это, в свою очередь, позволит удовлетворить потребность в данном препарате и сделать его доступным для российских производителей пищевых продуктов. Необходимо также расширение спектра его применения. Таким образом, интенсификация технологии низина является, несомненно, актуальной научно-технической проблемой. Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских программ Минобразования РФ: «Биотехнологическая безопасность и лечебно-профилактическое питание», проводимой в 1998-1999 годах и «Научные исследования высшей школы по технологии живых систем», проводимой в 2000 году.

Научная новизна работы.

Изучено влияние буферных свойств среды на интенсивность биосинтеза низина.

Предложен способ ускоренной селекции штаммов-продуцентов низина с использованием элективной среды повышенной буферности. За счет применения этого способа из 40 проверенных культур Ьас1ососси8 ЫсНб были выделены два высокоактивных 7 штамма Lactococcus lactis, обеспечивающих биосинтез низина в 22,5 раза выше по сравнению с контролем. Селекционированные штаммы защищены патентами РФ: №2115724 1998 г., и №2151796 2000 г.

Изучено влияние условий ферментативного гидролиза белковых компонентов среды с использованием различных ферментов на биосинтетические свойства культуры-продуцента.

Разработаны условия температурной обработки питательной среды, препятствующие образованию лактулозаминов и обеспечивающие деконтаминацию среды и максимальный синтез низина в последующей ферментации.

Установлена зависимость выхода низина на стадии ферментации от гидродинамических условий и от условий взаимодействия низина с кислородом воздуха в пене.

Исследована динамика процесса высаливания и установлено оптимальное время его завершения, что позволило обеспечить суммарный выход низина на уровне 55-60% от его содержания в культуральной жидкости.

Установлено бактерицидное действие низина на возбудителей «картофельной болезни» хлеба Bacillus subtilis. Разработана и согласована с санитарными органами методика оценки зараженности муки и хлеба спорами этого микроорганизма. 8

Положения, выносимые на защиту

1. Биосинтез низина молочнокислыми стрептококками при культивировании в колбах зависит от буферных свойств среды и от природы буферообразующего агента. Карбонат кальция не оказывает негативного влияния на биосинтез низина, а наоборот, стимулирует его в условиях интенсивного перемешивания.

2. Предложен способ отбора штаммов-продуцентов низина в колбах на забуференных средах, позволивший выделить два высокоактивных штамма.

3. Биосинтез низина на сложных питательных средах зависит не только от наличия доступных форм органического азота, но и от их качественного состава.

4. Количество низина, синтезируемого культурой-продуцентом на комплексных питательных средах, включающих сахара и источники органического азота, зависит от условий термической обработки среды.

5. Накопление низина в культуральной жидкости при выращивании штамма-продуцента в аппарате с автоматическим поддержанием рН, определяется временем распределения титранта в среде и контактом низина с кислородом воздуха в пенной фракции.

6. Стабильность процесса культивирования в режиме отлив-долив определяется возрастом инокулята, связанным с продолжительностью цикла.

7. Применение фосфорной и лимонной кислот на стадии V экстраирования позволит заменить традиционно используемую соляную кислоту, получая при этом высокий выход низина в жидкую фазу, и при этом снизить коррозионную нагрузку на оборудование. 9

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Минаева, Людмила Павловна

Основные результаты и выводы

1. Изучение влияния буферных свойств среды на биосинтез низина позволило разработать способ ускоренной селекции штаммов-продуцентов низина с использованием элективной среды повышенной буферности. За счет применения этого способа из 40 проверенных культур Ьас(ососси8 1асИз были выделены два высокоактивных штамма Ьасгососсиз 1асНз, обеспечивающих биосинтез низина в 2-2,5 раза выше по сравнению с контролем. Селекционированные штаммы защищены патентами РФ: №2115724 1998 г., и №2151796 2000 г.

2. Установлено, что биосинтез низина на сложных питательных средах обусловлен не только наличием доступных форм органического азота, а также качественным составом продуктов, образуемых в ходе ферментативного гидролиза. Соотношение качественных и количественных показателей гидролизата подбирается эмпирически для штамма-продуцента и зависит от применяемого фермента и условий гидролиза.

3. Показано, что уровень биосинтеза низина зависит от условий термической обработки среды во время стерилизации. На основе проведенных исследований предложена совокупность факторов (рН, температура и время обработки), обеспечивающих асептичные условия и высокий уровень биосинтеза низина.

4. Установлено, что накопление низина в культуральной жидкости зависит от времени распределения титранта в среде и от контакта низина с кислородом воздуха в пенной фракции, где происходит его частичная инактивация.

5. Предложен способ определения времени окончания цикла в периодическом и в отъемно-доливном режимах по относительной скорости титрования при рН-статировании.

143

6. Опробованы варианты ферментации в многоциклическом и в отъемно-доливном режимах. Показана возможность повышения производительности процесса в 2 раза и более в режиме отлив-долив 20 % объема культуральной жидкости с завершением цикла, в момент прекращения титрования.

7. Для совершенствования стадий выделения продукта предложены новые экстрагенты и режимы осаждения, обеспечивающие повышение качества продукта и улучшение коррозионной стойкости оборудования.

8. Полученные в работе результаты использованы в опытно-промышленной технологии. Оформлены технологический регламент, технические условия и гигиенический сертификат на продукт, организовано опытное производство в ГУП «ГосНИИсинтезбелок».

9. С целью расширения спектра использования низина проведены эксперименты по изучению его влияния на споры «картофельной палочки» В. йиЬИНз, вызывающие заболевание хлеба. Установлено, что низин оказывает ингибирующее воздействие на споры при температурах, соответствующих условиям в мякише при выпечки хлеба. Разработан метод контроля зараженности муки и хлеба и проект Дополнения с СанПиН 2. 3.4.545-96, обеспечивающий возможность регулярного микробиологического наблюдения за работой хлебопекарных и мукомольных предприятий.

144

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Минаева, Людмила Павловна, Москва

1. Whitehead H.R.// Biochem. J.- 1933.- 27.- p. 1793-1800.

2. Mattick A.T.R., Hirsch A. // Lancet (u).- 1947.- p. 5-7.

3. Berridge N.J. // Lancet (u). 1947.- p. 7-8.

4. Hirsch A., Grinsted E., Chapman H. R. and Mattick A.T.R. A note on the inhibiton of an anaerobic sporeformer in Swiss-type cheese by a nisin-production Streptococcus //Nature.- 1951.- 167.-p. 1031-1035.

5. Delves-Broughton, J. and M. Fiis. Nisin preparation Production, Specification and assay procedure. In: The use of nisin in cheesemaking. Bulletin of the International Dari Federation (IDE) -1998.-No. 329.- p. 18-19.

6. Баранова И.П., Егоров Н.С., Стоянова Л.Г. Низин, условия образования и получения препарата // Антибиотики и химиотерапия, -1997. т. 42, № 3. -с. 37-44.

7. Hurst A. Nisin.// Adv. Appl. Microbiol.- 1981.- v.27- p.85-125.

8. Delves-Broughton, J. Nisin and its application as a food preservative // J. Soc. Dairy Technol.- 1990.-v.43, № 3.- p. 73-77.

9. Wessels, S., Jelle, В., Nes, Ingolf F. Bacteriocins of the Lactic Acid Bacteria: An Overlooked Benefit for Food. Denmark: Danish Toxicology Centre, -1999.- 85 p.

10. Klaenhammer T.,R. Genetics of bacteriocins prodused by lactis acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev.- 1993.- 12- p. 39-85.

11. Nes, I.F., Dzung Bao Diep, Havarstein L.S., et al. Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria // J. Gen. & Molec. Mikrobiol.-1996.- 70- p. 17-32.

12. Gross E., Morell J.C., Craig L. Dehydroalanyllysin: Identical COOH-terminal structures in the peptide antibiotics nisin and subtilin // Biochmistry, 1969.- 62.- p. 952-956.145

13. Gross E., Morell J.L. The presence of dehidroalanine in the antibiotic nisin and its relatioship to activity // J.Amer. Chem. Soc.-1971.-v. 93.-p. 4634-4635.

14. Hansen J.N.// Crit. Rev. Food Sci. Nutri.- 1994.- v.34.-p. 69-93.

15. Hirsch A. // G. Jen. Microbiol.,- 1951.- 5.- p. 208-221.

16. Bavin E.M. Beach A.S., Falconer R., Friedmann R.// Lancet (i),-1952.- p. 127-129.

17. Jarvis В., Farr J.// Biochim. Biophys. Acta.-1971.- p. 227, 232-240.

18. Matsusaki H., Endo N., Sonomoto K., Ishizaki A. Lantibiotic nisin Z fermentative production by Lactococcus lactis IO-l: relatioship between production of the lantibiotics and lactat and cell growth // Food Sci. Technol., Int.,- 1996.- v.2.-p.157-162.

19. Mulders J.W.M., Boerrigter I.J., Rollema H.S., at al. Identification and characterization of the lantibiotic nisin Z, a natural nisin variant //Europ.J. Biochem.-1991.- 201 (3).-p. 581-584.

20. Cheesnian G. C., Berridge N. J. Observations on the molecular weight and chemical composition of nisin A // Biocnem. J. 1959.- 71 (1).- p. 185-195.

21. Gross E., Morell J.C.// J. Amer. Chem. Soc.- 1959.- 89.-p. 27912796.

22. Егоров H.C. Баранова И.П., и др. Аминограмма Streptococcus lactis продуцента низина // Микробиология. - 1972.- т.41, №5.- с. 805-808.

23. Егоров Н.С., Баранова И.П., и др. Влияние органических кислот на рост Streptococcus lactis и образование низина // Микробиология. 1968. - т. 57, №2 .- с. 286-292.

24. Van de Ven. // Eur.J. Biochem. 1951. - 202. - p. 1181-1188.

25. Engelke. G.// Appl. Environ. Microbiol. -1992. 11.- p. 3730-3743.

26. Баранова И.П. , Егоров Н.С., Грушина В.А. К вопросу об инактивации антибиотика низина // Прикладная биохимия и микробиология,- 1976, т. 12, №4. - с. 627-629.

27. Hall R.H.// Process Biochem.,- 1966. -l.-p. 461-464.146

28. Егоров Н.С., Баранова И.П., и др. Оптимизация состава питательной среды для Streptococcus lactis, образующего антибиотик низин // Микробиология, -1971,- т. 40, №6.- с. 993-998.

29. Tramer J. Fowler G. G.II J. Sei. Food. Agric. -1964. 15. -p. - 522528.

30. Люк Э., Ягер M. Консерванты в пищевой промышленности.-СПб.: ГИОРД, 1998.-256 с.

31. Егоров Н.С., Козлова Ю.И., и др. Влияние возраста и количества инокулята на рост Streptococcus lactis и образование им низина // Микробиология, -1975, т.44, № 4.-е. 637-640.

32. Anon. Specification for the identity and purity of Food additives and their toxicological evalution, Some antibiotics. Twelfth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. WHO Technical Report Series No 430.

33. Cox G.A.//N.Z.J. Agric. 1934. - 48.- p. 321-234.

34. ChevalierR., Fournaud J. , Lepebre E., Moequot. G. // Ann. Technol. Agric. 1957. - 2. - p. 117-137.

35. Баранова И.П., Егоров Н.С., и др. Использование отечественных кремнеземных адсорбентов для выделения низина из нативного раствора // Биотехнология, -1989. № 5. -с. 588-593.

36. Mbequot В., Lepebre Е. // J.Appl. Bacteriol.,- 1955. 19.- p. 322323.

37. Tramer J. In "Microbial. Inhibitors in Food" (N. Molin, ed.)/Almgvist and Wiksell, Stockholm. 1964. - p. 25-33.

38. Berridge N.J., Barrett J.// J.Ien. Microbiol.,- 1952.- 6.- p. 14-20.

39. Hurst A. Biosynthesis of the antibiotic nisin by whole Streptococcus lactis organism // J. Ien. Microbiol., -1966. 44. - p. 209-220.147

40. Stumbo C.R., Voris L., Skaggs B.G., Heinenann B.// J.Food.Sei.-1964. 2., - p. 859-861.

41. Ingram L. C. Synthesis of the antibiotic nisin: Formation of lantionine and a-methyllantionine // Biochem. Biophys. Ads, 1969. -164.-p. 216-219.

42. Falahee M.B., Adams M.R., Dali J.W., Gover C. G. Development of an immunoassay for nisin // J.Appl. Bacteriol. 1989. -67, (26). xxvi. Abstract.

43. Matsusaki H., Endo N., Sonomoto K., Ishizaki Lantibiotic nisin Z fermentative production by Lactococcus lactis 10-1: relatioship between production of the lantibiotics and lactat and cell growth // Food Sei. Technol., Int.,- 1996.- v.2.-p. 157-162.

44. Henning S., Metz R., Hammens W.P. Studies on the mode of action of nisin //Int.J.Food Microbiol.,- 1986.- 3 (3).-p.121-134.

45. Wincovski K., Ludescher R., Montville T. // IFT Ann Meeting '95: Book of Abstracts.- 1995.- 81, D-4.

46. Russell A.D. The destruction of bacterial spores. In: Hugo WB: Inhibition and destruction of the microbial cell. Academic Press, London New York.- 1971.- S 555-556.

47. Tramer J. The inhibitory action of nisin on Bacillus stearothermophilus. Proc. 4th Int. Symp. Food Microbiol., Goteborg,-1964.- S 25-33.

48. Stevens K.A., Sheldon B.W., Klapes N.A., Klaenhammer T.R.// J.Food Protect.,- 1992.- 55.- p. 763-766.50. ten Steeg P. Interactions of nisin, lysozym and citrate in biopreservation. De Ware(n)-Chemicus.- 1993.- 23.- p. 183-190.

49. Vas K. Anvendung von Nisin in der Lebensmittelindustrie // Dtsch. Lebensm. Rdsch.,- 1964.- 60.- p. 63-67.

50. Hurst A., Hoover D. Nisin. In: Davidson M., Branen A.: Antimicrobials in Food. Dekker: New York.- 1993.- S. 369-394.

51. Hawley H.B. Nisin in food technology // Food Manuf.- 1957.- 32.-p. 270-376 and 430-434.

52. Ramsfeier H. Die Wirkung von Nisin auf Clostridium butyricum //148

53. Arch. Microbiol.- 1960.-37.- p. 57-94.

54. Wodsak W. Nisin und seine Verwendungmoglichkeiten // Dtsch. Lebensm. Rdsch.- 1962.- 58.- p. 135-137.

55. Delves-Broughton, J., Blackburn P., Evans R. J., Hugenholtz J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie vsn Leeuwenhoek.-1996.- 69.- p. 193-202.

56. R. F., Zottola E.A. Self-life of Pasteurized Process Cheese Spreads Made from Cheddar Cheese Manufactutured with a Nisin-Producing Starter Culture // J. Dairy Sci.- 1993.-76.- p. 1829-1836.

57. Tanaka N., Traisman E., Plantinga P., et al. Evaluation of factors Involved in Antibotulinal Propertis of Pasteurised Process Cheese Spreads //J. Food Prot.- 1986.- v. 49, No 7.- p. 526-531.

58. Somers E. B., Taylor S.L. Antibotulinal Effectiveness of Nisin in Pasteurized Process Cheese Spereads // J. Food Prot.- 1987.- v. 50, No 10.-p. 842-848.

59. Anonymous. Use of Nisaplin in procesed cheese and processed cheese preparations. Technical Information Sheet No. 10/91. Aplin and Barrett Ltd, Beamivster, Dorset, England.- 1991.

60. Maisnier-Patin S., Deschamps N., Tatini S.R., Richard J.//Le Lait.-1992.- 72.-p. 249-263.

61. Benkerroum N., Sandiene W.E.// J. Dairy Res.- 1988.- 71.- p. 32373245.

62. Ferreira M.A.S.S., Lund B.M.// Letters in Appl. Microbiol. 1996.22.- p. 433-438.

63. Davies E.A., Beivis H.E., Delves-Broghton J. The use of the bacteriocin, nisin, as a preservative in ricotta-type cheeses to control the food-borne pathogen Listeria monocytogenes II Letters in Appl. Microbiol. 1997.- 24.- p. 343-346.

64. Anon. Nisin preservation of chilled deserts // Dairy Ind. Int.- 1985.-p.41-43.

65. Dean J.P., Zottola E.A.//J. Food Prot.-1996.- v.59, No.5.- p. 476480.

66. Anon. Preservation of milk and milk products with nisin. Aplin &149

67. Barrett Technical Information Sheet No. 11/88.- 1988.

68. Vanini G.C., Moro C. Estratto dal Jional di Bacteriologia, Virologia ed Jmunologia ed Annali dell Ospldall Maria Vittoria si Torino, 1967, - 60, p. 5-8.

69. Peskera T.I. //Revista Espanoles da Lecheria, 1966, - 59,- p. 2541.

70. Poreta A., Jianone L, Kasolari A.// Industria Conserve, 1966, -2,- p. 89.

71. Масленникова H.X., Нехотенова Т.И., Шкундова Ю.В.// Консервная и овощесушильная промышленность.- 1968.- 23 (4).- с. 7.

72. Bardsley A. Antibiotics in food canning // Food Technology in Australia. 1962.- 14.- p. 532.

73. Taylor S.L., Somers E.B. Evaluation of the antibotulinal effectiveness of nisin in bacon //J. Food Prot.- 1985.- 48.- p. 949-952.

74. Chung K.-T., Dickson J. S., Crouse J. D. Effects of Nisin on Growth of Bacteria Attached to Meat //Appl. Environ. Microbiol.-1989.- v.55, No.6.-p. 1329-1333.

75. Cutter C.N., Siragusa G.R. Decontamination of beef carcass tissue with nisin using a pilot scale model carcass washer //Food Microbiol.-1994.- 4.-p. 481-489.

76. Taylor S.L., Somers E.B., Krueger L.A. Antibotulinal Effectiveness or Nisin-Nitrite Combinations in Culture Medium and Chicken Frankfuter Emulsions //J. Food Prot.- 1985.- 48.- p. 234-239.

77. Rayman M.K., Aris В., Hurst A. Nisin; a Possible Alternative or Adjunct to Nitrite in the Preservation of Meats //Appl. Environ. Mikribiol.-1981.-v. 41, No.2.- p. 375-380.

78. Rayman M.K., Malik N., Hurst A. Failure of Nisin to Inhibit Outgrowth of Clostrudium botulinum in a Model Cured Meat System //Appl. Environ. Mikribiol.-l983,-v. 46, No.6.-p. 1450-1452.

79. Anonymous. Listeria control in the sausage production. Bioprotection of sausages with FloraCarn LC. FloraCarn Bulletin No.3. EN-B3-FC-1195. Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmark.-1995.150

80. Wang S.Y., Dockerty T.R., Ledford R.A., Stouffer J.R. Self-Life Extension of Vacuum Packaged Frankfurters Made from Beef Inoculated with Streptococcus lactis //J. Food Prot.- 1986.-v.49, No.2.-p. 130-134.

81. Hurst A. // Nature (London), -1967.- 214, p. 1232-1234.

82. Hurst A. Biosynthesis of the antibiotic nisin and other basic peptides by Streptococcus lactis grown in batch culture // J. Ien.Microbiol. -1966.- 45, -p. 503-513.

83. Ingram L.C. // Biochem. Blophys. Acta. 1970.- 224, -p. 263-265.

84. Ingram L.C. Synthesis of the antibiotic nisin: Formation of lantionine and a-methyllantionine // Biochem. Biophys. Acta.- 1969. -184, p. 216-219.

85. White R.J., Hurst A. The location of nisin in the produser organism, Streptococcus lactis II J.Ien.Microbiol, -1968. 53, p. 171-179.

86. Hurst A., Lasarus V. Apparent destruction of nisin by the produser organism before initiation of growth in Streptococcus lactis Streptococcus lactis II Nature. -1968. 219, p. 403-407.

87. Гриневич А.Г. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов.- Мн.: Выш. Школа, 1981.-164 с.

88. Старикова С.И. Исследование специфичности протеолиза молочнокислых бактерий при культивировании на концентрате сывороточных белков. Сб. тр./Проблемы сельского хоз. Сибири.-Омск, 1996.- в. 1- с. 109-114.

89. Kikuchi Т., Bergere J., Desmazeaud M.//Ann. Biol. Anim. Biochem., Biophys.,-1974.- V.14, 2.- P.313.

90. Егоров H.C., Баранова И.П., и др. Амминограмма Str. lactis -продуцента низина // Микробиология, 1972, т. 11, №5, с. 805-808.

91. Егоров Н.С., Баранова И.П., и др. Изучение влияния аминокислот на биосинтез низина и рост Streptococcus lactis с применением метода математического планирования эксперимента // Известия АН СССР, сер, биол. -1973. 1 - с. 99-102.

92. Баранова И.П., Егоров Н.С. Влияние состава среды и условий культивирования на рост Streptococcus lactis и биосинтез низина //151

93. Прикл. биохимия и микробиология, -1969.- № 2,- с. 175.

94. Calderón С., Collins-Tompson D.L,. Usborne W.K. // J. Food Protection. -1985. -48, p. 330-333.

95. Kozak W., Dobrganski W.T.// Acta microbiol. polonica. 1977. -26,- p. 361-368.

96. Баранова И.П., Егоров Н.С. Влияние различных соединений азота на рост Streptococcus lactis и образование низина // Микробиология.- 1967.- т.36, в.6.- с.958-963.

97. Баранова И.П., Егоров Н.С. Влияние состава среды и условий культивирования на рост Streptococcus lactis и биосинтез низина // Прикладная биохимия и микробиология.- 1969.-т.5, №2.- с.175-182.

98. Егоров Н.С., Баранова И.П. Связь условий культивирования Streptococcus lactis с биосинтезом низина //Вестник Московского Ун-та.- 1971.- в.1.- с.35-42.

99. Баранова И.П., Егоров Н.С., и др. Применение ферментных гидролизатов биомассы микроорганизмов в средах для культивирования Streptococcus lactis, продуцента низина // Антибиотики, -1980.- №10, с. 735-738.

100. Шкундова Ю.В. Влияние состава среды на рост и образование низина культурой Streptococcus lactis II Прикладная биохимия и микробиология, -1968, №5, -с. 599.

101. Липинска Е., Ростен Е., и др. Международный конгресс по молочному делу. М.: Пищепромиздат, 1971.- 272 с.

102. Липинска Е., Гудков А., и др. Применение низина в сыроделии. М.: Пищевая пром-ть, 1972, с. 96.

103. Силёва М.Н., Благушина Р.Ф., и др.// Труды ВНИИ микробиол. ср-тв защ. раст. и бак, препаратов, 1976. 4, - с. 90-93.

104. Красникова Л.В., Воронина Л.Н., Силева М.Н. Влияние растительных экстрактов на биосинтез низина культурой Str. lactis II Известия вузов. Пищевая технология, -1982, -2, с. 24-27.

105. Кудряшов В.Л., Сергеева И.Д., Стоянова Л.Г. и др. Синтез биоконсерванта низина на отходах и вторичном сырье ряда биотехнологических производств //Биотехнология,-1995.- №12.- с.15225.28.

106. Thibault P.A. Partial hydrolisat of whey proteins, enzymic method for preparation of the partial hidrolysate, and low-allergenicty dietic products containing the partial hydrolysate.// French patent Application, 1990, FR 2 634 104 Al (FR2634104A1).

107. Nalamura T., Sado H., Syukunobe Y./l P. Milk and dairy products Milchwissenschaft. 1992.-V.20, N 3.- P. 141-145.

108. Калунянц К.А., Смирнова Т.А., Карликова H.P. Использование микробных ферментных препаратов для получения гидролизатов из обезжиренного молока и сыворотки // Обзорная информация.-М.: АгроНИИТЭИММП, 1987.-С. 28-30.

109. Максимюк H.H., Телишевская Л.Я., Комаров A.A. Использование протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов //Ветеринария.- 1993.-№7.-С.28-30.

110. Морозова И.П., Честухина Г.Г., Борматова М.Е. и др. Выделение и характеристика металлопротеиназы Bacillus megaterium II Биохимия,-1993.- т. 58, в. 6. С. 896-907.

111. Пригода A.C., Коренева А.И. и др.// Биотехнология.- 1991.-№5.- С. 55-58.

112. Молосов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Мысль, 1971. 404 с.

113. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов.- М.: Колос, 1997.- 288 с.

114. Ересько Г.А., Кийс A.A., и др. Оборудование для высокотемпературной пастеризации, стерилизации и охлаждения пищевых жидкостей.-М.¡Машиностроение, 1967.- с.

115. Матвеев В.Е., Скворцов Г.Е. Методы ускоренного расчета эффективности режимов тепловой обработки питательных сред в153микробиологической промышленности // Микробиологическая промышленность.- 1970.-е. 17-20.

116. Храмцов А.Г. Молочный сахар.- М.:Агропромиздат, 1987.- 224 с.

117. Шкундова Ю.В., Егоров Н.С., Овчарова Т.П. Изучение влияния некоторых условий культивирования Sir. lactis на образование низина // Антибиотики,-1965.-№9.- с. 784-787.

118. Chinachoti N., Zaima Т., Matsisaki Н., Sonomoto К., Ishizaki А. Nisin Z Production by Lactoococcus lactis IO-l Using Xilose as a Carbon Sourse.// Biosci., Biotechnol. and Biochem.- 1998.-62, №5-p.1022-1024.

119. Chinachoti, N., Endo, N., Sonomoto, K., and Ishizaki A. Bioreactor Systems for Efficient Production and Separation of Nisin Z Using Lactococcus lactis IO-l// J. Fac.Agr., Kyushi. Univ.,- 1997.-V.43 N 3-4.- P. 421-436.

120. Chinachoti N., Zaima Т., Matsisaki H., Sonomoto K., Ishizaki A. Relationship between Nisin Z Fermentative Production and Aeration Condition Using Lactococcus lactis IO-l // J. Fac.Agr., Kyushi. Univ.,-1997.-V.43 N 3-4.- P. 437-448.

121. Красникова JI.В. Получение и применение регуляторов роста., Медвуз, сб. науч. трудов ЛТИ, Л.: 1986, с. 90-94.

122. Егоров Н.С., Баранова И.П., и др. // Антибиотики, -1976.-№21, с. 499.

123. Chinachoti, N., Endo, N., Sonomoto, К., and Ishizaki A. Bioreactor Systems for Efficient Production and Separation of Nisin Z Using Lactococcus lactis IO-l// J. Fac.Agr., Kyushi. Univ.,- 1997.-V.43 N 3-4.- P. 421-436.

124. Archibald F., Fridovich I.//J. Bacteriol.,- 1981.-145.- p. 442-451.

125. Smart J.В., Thomas T.D. Effect of oxygen on lactose metabolism in lactis streptococci //Appl. Environ. Microbiol.,- 1987.- 53,- p. 533541.

126. Козлова Ю.И., Егоров H.C., Баранова И.П., Максимова В.Н.154

127. Кинетика обмена веществ Streptococcus lactis на исходной и оптимизированной средах // Микробиология.-1972.- т.16, №6.- с. 1007

128. Cogan J.F., Walsh D., Condon S. Impact of aeration on the metabolic end product formed from glucose and galactose by Streptococcus lactis // J.Appl.Bacteriol.- 1989.- 142.-p. 77-84.

129. De Vuyst L., Vandamme E.J.// In: Bacteriocins of Lactis Acid Bacteria, ed. by L.de Vuyst, and E.J. Vandamme, Blackie Academic and Professional, Glasgow,- 1994.-p. 151-221.

130. Попов А.Ю., Исакова Д.М. Бисинтез низина при периодическом культивировании Streptococcus lactis II Биотехнология, 1989.- №5, с. 585-587.

131. Chinachoti N., Sonomoto К., Ishizaki A.// J.Fac.Agr., Kyushu Univ.,- 1997.-v.42, No. 1-2.-p. 151-169.

132. Oberman J., Jakubowska L.// Acta milcrobiol. polonica. -1976. -25, p. 78-82.

133. Красникова JI.В., Васильев Н.Ф., и др. Условия биосинтеза низина молочнокислыми стрептококками при непрерывном культивировании // Известия вузов. Пищевая технология, 1979, -№5, с.35-37.

134. Литвинова М.Н. Подбор и сравнительное изучение штаммов Streptococcus lactis продуцентов отечественного антибиотика низина.: Автореф. дис. канд. биол. наук.- М., 1978.- 28 с.

135. Oberman J., Jakubowska L., Kipinska E.// Acta microbiol. Polonica,-1974. 23,-p. 3-9.

136. Патент США №2785108, н.кл.195-96, 1957.

137. Патент Англии № 844782, 1958.

138. Патент СССР, № 427516, м. кл. С 12 д 9/12, БИ №17, 1974.

139. Хохлов А.С., Решетов П.Д., Стерликова Н.Н. и др. А.С. СССР № 088288 -1983.

140. Wlimowska-Pele A., Olichurier Z., Malicka-Blaskiewic МЛ Acts Microbiol. Pol. -1976. 25, p. 71-77.155

141. Патент США, № 2785108, н. кл. 195-96, 1957.

142. Bailey F.J, Hurst А. // Can. J.Microbiol. 1971.- 17, - p. 61-67.

143. Баранова И.П., Егоров Н.С., и др.// Антибиотики, -1985.- №4, -с. 258.

144. Баранова И.П., Егоров Н.С. и др. Изучение сорбции и десорбции низина на силикагеле С-3 // Антибиотики, 1985. - №9, -с. 649-653.

145. Баранова И.П., Егоров Н.С., и др. Изучение сорбции и десорбции низина на различных кремнеземных адсорбентах // Антибиотики и мед. биотехнология,- 1987. №6,- с. 437-439.

146. Баранова И.П., Клюева Л.М., Егоров Н.С. и др. Выделение низина из нативного раствора и его очистка на катионитах // Антибиотики и химиотер.- 1992.-№3.- с. 5-6.

147. Егоров Н.С., Баранова И.П., Клюева Л.М. и др. А.с.4937788, 1991.

148. Bower С.К., Mcquire J., Daeschel М.А. Suppression of Listeria monocytogenes colonization following adsorption of nisin onto silica surfaces // Appl. Envioron. Mikrobiol.,- 1995.- 61.- p. 992-997.

149. Исакова Д.М., Литвинова M.H., Буленков Г.И. Отчет о НИР: Разработать и внедрить усовершенствованную опытно-промышленную технологию производства нироса. /ВНИИбиотехнология.-М.-1989.- 29 с.

150. Петров К.П. Практикум по биохимии пищевого и растительного сырья. М.: Пищевая промышленность, 1965.- с.330.

151. Инихов Г. С., Брио Н.Н. Методы анализа молока и молочных продуктов,- М.:Пищ.промыш., 1971.- 420 с.

152. Баранова И.П., Егоров Н.С. К методике определения концентрации антибиотика низина // Антибиотики. 1967 .- №1 .-с.66-69.

153. Бончев П.Р. Введение в аналитическую химию.- Л.: Химия, 1978.-486с.156

154. Алексеевский Е.В., Гольц Р.К., Мусакин А.П. Количественный анализ.-Л.: Гос.научно-техн. Изд-во химической литературы, 1955.-72с.

155. Мосичев М.С., Складнев A.A., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. М., Легкая и пищевая пром-сть, 1982.-264.

156. Slijper-M., Hilbers-CW., Konings-RNH., Ven-FJM-van-de. NMR studies of lantibiotics. Assignment of the -1H-NMR spectrum of nisin and identification of interresidual contacts // FEBS-Letters.,-1989.-V.252 (1/2).- P.22-28.

157. Квасников Е.И., Нестеренко O.A. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975. - 256 с.

158. Баранова И.П., Егоров Н.С., Сильвестрова О.И. Ауксограмма молочнокислой бактерии Streptococcus lactis штамм МГУ // Прикладная биохимия и микробиология./ 1973. №1.- с.55-59.

159. Егоров Н.С., Баранова И.П., Козлова Ю.И. Влияние пуриновых и пиримидиновых оснований на на рост Streptococcus lactis и биосинтез низина // 1976.- t.XLV, вып.1.- с.100-103.

160. Шагинян К.А., Изотова Л.С., Иомантас Ю.В. и др. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеточный и внутриклеточный ферменты // Биохимия,- 1980.- т.45, в.11. - С. 2083-2095.

161. Ваганова Т.И., Ластовецкая Л.В., Стронгин А.Я. и др. Биоспецифическая хроматография металлоэндопротеиназы Bacillus subtilis и обнаружение множественных форм фермента // Биохимия,-1976.- т. 41, в. 12. С. 2229-2236.

162. Егоров Н.С., Баранова И.П. Влияние условий аэрации на рост Streptococcus lactis и образование низина //Микробиология,- 1967.-т.36, в.3.-431-434.

163. Дятлова В.Н. Коррозионная стойкость металлов и сплавов. Справочник. М., Машиностроение, 1964.-352 с.

164. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-331 с.157

165. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба. М.: ГосНИИХП, 1998.- 32 с.

166. Афанасьева О.В. Микробиологический контроль хлебопекарного производства.-М.: Пищев. пр-ть, 1976.- 143 с.

167. ГОСТ 27669-88 «Мука пшеничная. Методы пробной лабораторной выпечки».

168. Витавская A.B., Матвеев А.И., и др. Биологический способ предотвращения картофельной болезни хлеба. Обзор. М.: ЦНИИТЭИпищепром, - 1976.- 51 с.

169. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. М.:

170. ГОСТ 26972-86. Зерно, крупа, мука толокно для продуктов детского питания. Методы микробиологического анализа.

171. Лаврова Л.П., Крылова В.В. Технология колбасных изделий. -М.: Пищевая промышленность, 1975. 350 с.

172. Егоров Н.С., Стоянова Л.Г. Штамм Streptococcus lactis F 116 - продуцент антибиотика низина. А.с.№ 1687616, 1991, БИ № 40

173. Стоянова Л.Г., Егоров Н.С., Пятницина И.Н., Задояна С.Б. Штамм Streptococcus lactis продуцент низина (F 119 X). A.c. № 1551744, 1990.- БИ №11.

174. Силева М.Н., Литвинова М.Н., Буленков Г.И. и др. Штамм Streptococcus lactis 24-24 продуцент низина. A.c. № 507055.1979.- БИ № 8.

175. Литвинова М.Н., Силева М.Н., Федоров Н.К., и др. Штамм Streptococcus lactis 4968 продуцент низина. A.c. № 410081,- 1974,-БИ № 1.

176. Стоянова М.Н., Егоров Н.С. // Микробиология.- 1967.-t.36, в.1.-с. 431-434.

177. Литвинова М.Н., Красникова М.Н., Бирюков В.В., и др. Патент РФ № 2059716. Штамм Streptococcus lactis продуцент бактериоцина низина.- 1996.- БИ № 13.

178. Литвинова М.Н., Красникова М.Н., Бирюков В.В., и др.158

179. Литвинова М.Н., Красникова М.Н., Бирюков В.В., и др. Патент РФ №2061042. Штамм Streptococcus lactis продуцент бактериоцина низина.- 1996.- БИ № 15.

180. Минаева Л.П., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., и др. Патент РФ № 2115724, Штамм бактерий Streptococcus lactis продуцент низина (ВКПМ 7430),- 1998.- БИ №20.

181. Биттеева М.Б., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н., и др. Патент РФ № 2151796, Штамм Lactococcus lactis продуцент бактериоцина низина (ВКПМ 7699).- 2000.- БИ № 18.

182. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (МИНСЕЛЬХОЗПРОД РОССИИ)

183. ДЕПАРТАМЕНТ ПИЩЕВОЙ И ПЕРЕРАБАТЫВАЮЩЕЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ107139, Д\оскиа, Орлнкои пер., 3 Телетайп:1. Тел. 207-49-58, 204-44-021. ЖЖ.Ж. .\<ь••tfUA //-¿/к.1. На №.Г1. О потребности в низине