Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка способов деконтаминации и диагностики специфических микробных контаминантов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка способов деконтаминации и диагностики специфических микробных контаминантов"

UÜ3452290

На правах рукописи

Попова Елена Юрьевна

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ДЕКОНТАМИНАЦИИ И ДИАГНОСТИКИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МИКРОБНЫХ КОНТАМИНАНТОВ

Специальность: 03.00.23 - "Биотехнология"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

и

Москва 2008

003452290

Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология».

Научный руководитель: - Минаева Людмила Павловна,

кандидат технических наук

Официальные оппоненты: - Туликова Татьяна Владимировна,

доктор технических наук - Юсупова Галина Георгиевна,

кандидат биологических наук

Ведущая организация: Московский государственный университет пищевых производств

Защита состоится 2 декабря 2008 г. в 10 на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9, ауд. 443

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан «31» октября 2008 г. Учёный секретарь

диссертационного совета ДМ 212.204.13,

кандидат технических наук

И.В.Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Споровые и неспоровые термоустойчивые контаминанты в сырье создают трудности в получении стабильных по микробиологическим показателям качества продуктов. Инактивация их происходит только при жестких режимах термообработки, однако, такая обработка негативно сказывается на технологических свойствах и биологической ценности получаемого в результате продукта. Пастеризация не обеспечивает необходимой защиты продукта из-за развития устойчивых микроорганизмов. Альтернативой может быть сочетание воздействия двух факторов: мягкая тепловая обработка и внесение бактериоцина низина для снижения термоустойчивых контаминантов, распространенных в пищевом сырье. При этом важно изучить чувствительность к низину споровых и неспоровых термоустойчивых контаминантов и особенности их развития в диапазоне температур пастеризации, а также найти способ сохранения свойств продукта в мягких условиях термообработки.

Другой проблемой является зараженность муки спорами бактерий рода Bacillus, вызывающих картофельную болезнь хлеба (КБХ). Известно, что бактерии рода Bacillus могут провоцировать у ослабленных людей заболевания желчного пузыря, менингиты, артриты, перитониты, эндокардиты. Оценка качества муки важна, с одной стороны, для производства безопасного для здоровья потребителя хлеба, с другой стороны Россия после вступления в ВТО становится потенциальным экспортером муки, что повлечет за собой обеспечение соответствия международным стандартам по показателям безопасности.

В настоящее время для оценки качества муки используется только метод пробной лабораторной выпечки, являющийся длительным, требующий специального оборудования и технологических навыков. Для создания объективных методов оценки качества муки и хлеба, и введения их в практику, сегодня недостаточно информации в изучении биологии возбудителей КБХ и проявления

их биохимических свойств с позиций постановки лабораторного метода. Вышесказанное и определяет актуальность данной работы.

Цель работы: изучение специфических микроорганизмов-возбудителей порчи молока и пшеничной муки, разработка способов их устранения и диагностики при изготовлении продуктов на их основе.

Основные задачи:

- провести экспериментальное изучение влияния бактериоцина низина на кинетику гибели споровых микроорганизмов в диапазоне температур пастеризации на примере контаминантов, выделенных из молока;

- разработать математическое описание кинетики гибели споровых контаминантов в присутствии низина;

- исследовать влияние низина на микрофлору молока и возможность его применения для увеличения сроков резервирования молока на предприятиях молочной промышленности при повышенных температурах;

- выявить газообразующие контаминанты кисломолочных продуктов и изучить влияние на них низина;

- исследовать развитие споровых контаминантов в опытных образцах хлеба в процессе хранения;

- исследовать динамику развития спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба в модельной среде;

- исследовать амилолитическую и протеолитическую активности бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба;

- исследовать термоустойчивость спор бактерий-возбудителей КБХ;

- разработать методы диагностики картофельной болезни в муке и хлебе.

Научная новизна:

- изучено влияние добавок низина на кинетику термической деконтами-нации споровых контаминантов и установлены значения стерического коэффициента А и энергии активации Е;

- разработаны инженерные методы расчета комбинированного способа деконтаминации, сочетающего тепловую обработку с добавлением биоконсерванта низина;

- установлено ингибирующее действие низина на неспоровые газообразующие контаминанты Lactobacillus fermentum, выделенные из молочнокислых десертов;

- изучена динамика развития споровых бактерий-возбудителей картофельной болезни в образцах хлеба и на модельной среде;

- предложено в качестве методов диагностики картофельной болезни хлеба использовать протеолитическую и амилолитическую активность бактерий и разработаны экспресс-методы для оперативной оценки этих параметров.

Практическая значимость:

- исследована чувствительность газообразующих кошаминантов к низину и молочной кислоте, определена рациональная доза низина - 40 мг/кг, обеспечивающая деконтаминацию творожных десертов;

- установлена рациональная доза внесения препарата низина в молоко - 10 мг/л для снижения уровня теплового воздействия на компоненты молока, обеспечивающая микробиологическую безопасность готовых продуктов в сезон повышенного микробного фона молока;

-изучено влияние остаточного низина на развитие заквасочной микрофлоры молочных продуктов и установлено, что низин не влияет на общее время сквашивания молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5 %;

- разработаны методики оценки качества муки и хлеба по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ;

- предложены показатели диагностики картофельной болезни хлеба по протеолитической и амилолитической активности бактерий-возбудителей КБХ.

Апробация работы Результаты диссертационной работы докладывались: на 2-й Международной конференции: Наука-Бизнес-Образование. Биотехнология-Бизнес-Окружающая среда в Пущино, ИБФМ, 2005 г; на 10-й и 11-й Меж-

дународной Пущинской школе-конференции молодых учёных в Пущино, ИБФМ, 2006, 2007 гг.; на Научной конференции студентов и молодых ученых МГУИЭ, 2008 г; на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2008 г.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объём работы Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы.

Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 31 таблицу и 28 рисунков, список литературы включает 110 наименований.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Обоснована актуальность темы, сформулированы положения, выносимые на защиту, научная новизна, сведения о личном вкладе соискателя.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Рассмотрены причины и источники микробиологической порчи пищевых продуктов, контаминанты молока и хлеба. Изложены методы предотвращения порчи пищевых продуктов, особенно термические, а также имеющиеся в настоящее время данные о кинетике термической деконтаминации продуктов. Представлена сравнительная характеристика методов борьбы и определения зараженности муки и хлеба возбудителями КБХ. Проанализированы работы: Афанасьевой О.В, Ереминой И.А., Мазохиной-Поршняковой Н.Н, Матвеева В.Е., Богатыревой Т.Г., Поляковой С.П., Delves-Broughton J., J.C., Hurst А., Mansour М., Peskera T.I. и др. На основе анализа литературы сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований - сырье для молочной и хлебопекарной промышленности: молоко, пшеничная мука.

Термостойкие споровые контаминанты выделяли путем прогрева сырого молока при 98°С в течение 15 минут, получения накопительной культуры и последующего высева на МПЛ. Неспоровые контаминанты выделяли из вздувшихся творожных десертов на селективной среде для лактобацилл. Споровые контаминанты идентифицировали с использованием определителя Берги, а неспоровые с использованием системы API® производства «BioMerieux». Термоустойчивость контаминантов определяли путем прогрева суспензии контами-нантов на водяной бане при разных температурах в фосфатном буфере. Влияния низина на лактобациллы оценивали по изменению значения оптической плотности при культивировании в жидкой среде MPC. Определение КМА-ФАнМ проводили по ГОСТ 9225-84. Определение низина в пробах молочных продуктов проводили методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus coaqulans ВСЕ 15-204. В опытах использовали российский препарат низина «БИЗИН 1000» фирмы ООО ПКФ "БИГОР".

Хлеб выпекали методом пробной лабораторной выпечки по ГОСТ 2766988. Общее количество бактерий КБХ в муке и хлебе определяли поверхностным высевом на идентификационную среду, обеспечивающая визуальное определение амилолитически активных колоний по реакции с йодом. Определение ами-лолитической активности непосредственно проводили по ГОСТ 20264.4-89, а также по косвенному показателю - изменению кинематической вязкости суспензии муки после профева и термостатирования. Измерения проводили вискозиметром ВПЖ-2. Определение протеолитической активности непосредственно проводили по ГОСТ 20264.2-89, а также по косвенному показателю - величине зон казеиновой преципитации модифицированным методом.

Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех по-вторностях. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненный по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ НИЗИНА НА ИНАКТИВАЦИЮ КОИТАМИНАНТОВ ПРИ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКЕ Кинетика инактивации споровых контаминаптов в присутствии низина

Изучали действие низина на споровые формы в условиях пастеризации. Споровый контаминант выделяли из сырого молока, полученного с приемного пункта Лианозовского молочного комбината. В результате идентификации установлено, что культура относится к роду Bacillus вид lentus. В экспериментах исходная концентрация спорового контаминанта была не менее 107спор/мл. Прогрев проводили в фосфатном буфере с рН=6,8 при температурах 75+0,5; 85+0,5; 97±0,5 °С в термостатированной водяной бане. Время выдержки проб составляло 5, 7, 10, 20, 30, 45 и 60 мин. В работе исследовали концентрации низина 25, 50, 75,100 и 125 МЕ/мл.

Кривые гибели спорового контаминанта с начальной концентрацией спор 4^107 КОЕ/мл при концентрациях низина 25, 50, 75, 100 и 125 МЕ/мл представлены на рисунках 1, 2, 3.

По экспериментальным данным рассчитаны значения удельной скорости гибели конгаминантов К. Для определения кинетических характеристик конта-минантов А и Е (табл. 1) использовали уравнение Аррениуса:

К—А* е~Е/(ЯТ) или 1пК=1пА-Е/(КТ). (2)

Таблица 1

Значения кинетических характеристик А, 1пА и Е при разных _концентрациях низина__

Концентрация низина, МЕ/мл А, мин"1 1п А Е, кДж/моль

0 4,2*1017 41 134

25 1,4*10" 35 116

50 2,6*10" 26 90

75 7,6*108 20 72

100 3,0*10' 17 62

125 3,4* 106 15 55

На рисунке 4 представлены зависимости кинетических параметров А и Е

от концентрации низина, которые можно описать уравнениями в экспоненциальной форме:

1пА=40.9е"°00850 (3)

Е=133.6е-°00750 (4)

Более простое описание получается при аппроксимации зависимости линейными уравнениями (рис.4):

1пА=39.2 - 0.22С (5)

Е=129.2 - 0.66С (6)

С - концентрация низина, МЕ/мл. При аппроксимации экспериментальных данных экспоненциальной зависимостью величина достоверности Л составляет

концентрация низвва, МЕ/мл

~ Экспо ненциальвый (1пА) I

; , -Линейный (1пА) |

--Экспоненциальный (Е) !

Линейный (Е)_ _|

Рис.4 Зависимость энергии активации Е и 1п А от концентрации низина

0,98, а линейной зависимостью - 0,95. Так как обе эти величины имеют высокие значения, то целесообразней принять для расчетов более простые - линейные уравнения (5) и (6). Преобразовав уравнение (2) с учетом уравнений (5) и (6), получили уравнение зависимости удельной скорости гибели от концентрации низина:

1пК = 39.2-0.22С - (129.2-0.66С) /(RT) (7)

|£_е(39.2-0.22С - (129.2-0.66C) /(RT)) ^

Задавая критерий стерилизации V для конкретного случая по уравнению (9) с учетом уравнения (8) можно подобрать разные режимы тепловой обработки пищевых продуктов в зависимости от концентрации низина:

V = In Nq/Nk = т х К, (9)

где N0 и NK - количество контаминантов до и после прогрева. Принятый ранее подход расчета тепловых режимов по наиболее термостойкому контаминанту В. stearothermophilus 1518 дает жесткую обработку, позволяющую получить стерильный продукт, но с ухудшением его качества. Введение низина позволяет снизить температуру и время обработки сырья (полупродукта), в отношении молока - приблизить его по качеству к натуральному.

Применение низина при тепловой обработке молока Сезонные повышения микробного фона молока в весенне-летний период приводят к ужесточению режимов пастеризации с 75-85°С до 95°С, что негативно сказывается на технологических свойствах молока. Увеличение объемов молока, поступающего на приемный пункт в летний период, приводит к вынужденному продолжительному хранению молока-сырья при неконтролируемых температурах прежде, чем оно поступит на следующую стадию переработки. Для обеспечения микробиологической стабильности на этой стадии необходимо исследовать действие низина на микрофлору молока.

Изучали влияние низина на сохранность молока при различной температурной обработке. В термизированное молоко (t=68±2°C, выдержка 15 мин)

вносили низин 10 МЕ/мл (мг/л), затем молоко пастеризовали: с низином при 84±2°С в течение 5 минут; без низина при 84±2°С - 5 минут и при 95±2°С - 5 минут (контроль). Полученные образцы хранили при температурах, представляющих интерес в производственных условиях, 10±2°С и 24±2°С в течение 24 ч. В процессе хранения определяли остаточное количество низина и общее количество микроорганизмов КОЕ/мл (КМАФАнМ) (табл.2).

Таблица 2

Общее количество микроорганизмов (КМАФАнМ) и концентрация низина в молоке после термической обработки и в процессе хранения

Время хранения молока при температуре 10°С, ч Время хранения молока при температуре 24°С, ч

0 18 | 24 0 | 18 | 24

После термизации при 68°С в течение 15 минут без низнна:

5,5х103 | 2,0x104 4,0x105 - - -

После термизации п ж 68°С в течение 15 минут с низином 10 МЕ/мл:

5.5х103 2,0х104 4,0x104 - - -

После пастеризации при 84°С в течение 5 минут без низина:

- - - 2,6x102 3,2x104 4,9x105

После пастеризации при 84°С в течение 5 минут с низином 10 МЕ/мл:

- ! - ! - 2,6x102 1 1,0x103 6,0x104

После пастеризации при 95°С в течение 5 минут без низина:

- - | 2,6х102 3,0x103 2,0x104

Содержание низина в процессе хранения снижалось на 30% после стерилизации. Общее количество микроорганизмов в образцах с низином после хранения при температурах 10±2°С и 24±2°С в течение 23-24 ч на порядок меньше, чем в аналогичных образцах без низина. Причем порядок КОЕ в образцах после пастеризации с низином при 84±2°С тот же, что и при 95±2°С без низина. Применение низина позволяет снизить температуру пастеризации с 95+2 °С до 84±2 °С без заметного ухудшения микробиологических показателей.

Влияние остаточного низина на развитие заквасок Изучали влияние остаточного низина на развитие мезофильной микрофлоры заквасок, используемых при производстве творога {Насйя, сгвтоп.ч)

(рис.5). Температура пастеризации молока для контрольных образцов 95±2°С.

В пастеризованное молоко с массовой долей жира 0,5 и 3,5% вносили закваску из мезофильных культур. В процессе сквашивания определяли активную кислотность. В молоке с 0,5% жира скорость нарастания кислотности происходит быстрее в низинсо-держащем образце в сравнении с контролем, а при 3,5% жирности скорости в образце с низином и в контрольном практически одинаковы.

Таким образом, предварительная пастеризация молока с низином не ухудшает качества кисломолочных продуктов.

Экономическая оценка: при применении низина стоимостью 7000 руб./кг в рекомендованных дозах 10 мг/л затраты для молока составят примерно 70 руб./т молока, что составляет 0,33±0,02% от стоимости молока.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ НИЗИНА, МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ И ЛАКТАТА КАЛЬЦИЯ НА РАЗВИТИЕ ГАЗООБРАЗУЮЩИХ КОНТАМИНАНТОВ

Очевидно, что при производстве молочных продуктов из пастеризованного молока, даже подвергшихся термизированию, существует опасность попадания в готовый продукт остаточной микрофлоры.

Были выделены контаминанты, вызывающие порчу - вздутие герметически упакованных молочных продуктов. Выделенные штаммы были идентифицированы как Lactobacillus fermentum. Источником контаминации сырого молока бактериями этого вида могут служить ферментированные корма для животных. Штаммы лактобацилл отличались по спектру сбраживания углеводов, по степени газообразования они распределились в следующем порядке:

Время, ч _

- О- ЗОС,ж =0,5% (контроль) —■—ЗОС, ж = 0,5% с низином —О—ЗОС ж =3,5% с низином -—¿г— ЗОС, ж = 3,5% (контроль)__

Рис.5.Влияние низина на скорость сквашивания молока с различной массовой долей жира творожной закваской-30±1 °С

L.fermentum 2 (Lb2) (наибольшая) -L.fermentum 1 (Lbl) - L.fermentum 8 (Lb8) (наименьшая). Для исследований выбраны штаммы Lbl и Lb2. Штамм Lb8 как наименее газообразующий не представляет опасности для вздутия герметически упакованных продуктов.

Наиболее газообразующий штамм Lb 2, был проверен на термоустойчивость. Культура выдерживала прогрев при 80 °С в течение 9 минут и только при 90 °С - 7 минут рост культуры не наблюдался. Эти результаты подтверждают возможность контамипирования кисломолочных продуктов лактобацил-лами, выжившими после пастеризации молока.

Влияние молочной кислоты и лактата кальция па развитие L. fermentum Было изучено влияние молочной кислоты на рост выделенных контами-нантов на модельных средах в опыте in vitro. Исследовали действие молочной кислоты в диапазоне 11-12,6 г/кг при рН 4,00±0,02 при разных стартовых нагрузках тестовых штаммов. Рост штамма Lb2 полностью подавлялся при стартовых нагрузках 102 и 105 КОЕ/мл, а штамм Lbl проявлял слабый рост при 10s КОЕ/мл.

Содержание молочной кислоты, образуемой естественным путем в твороге 9 г/кг, а концентрация 11 г/кг может придавать кислый вкус продукту, поэтому изучена возможность замены молочной кислоты частично или полностью лактатом кальция. Суммарная концентрация лактат-иона в опыте оставалась такой же 11-г-12,6 г/л, значение рН на уровне 4,84±0,02. Подавление роста не наблюдалось ни в одном из вариантов. Действие молочной кислоты в предыдущем опыте обусловлено в большей степени более низким уровнем рН, в отличие от последнего.

Влияние низина на развитие L.fermentum Следующим этапом было определение чувствительности лактобацилл к низину в опыте in vitro на модельной среде (табл. 3). Среду MRS-бульон иноку-лировали штаммами Lbl, Lb2 так, чтобы стартовая нагрузка составляла 104 и

Таблица 3

Влияние низина на рост газообразующих

Низин, МЕ/мл Lbl Lb2

104 ю6 104 ю6

0 +++ 1 +++ +++

20 + + - +

40 - - - -

60 - - - -

10 КОЕ/мл. Концентрация низина в опыте была 20, 40, 60 МЕ/мл, пробы термостатировали при 30+0,5 °С. Контролем служила среда без низина. Развитие Из 1 и ЬЬ2 полностью подавлялось при концентрации низина 40 МЕ/мл во всех вариантах.

Примечание: (ОП-оптическая плотность), «+++» максимум по ОП на 20 ч, «+» максимум по ОП на 40 ч, «-» роста нет

Влияние низина и молочной кислоты на развитие L.fermentum в творожных десертах

В промышленных условиях были приготовлены опытные образцы («Чудо-творог» с черносливом - 175 г, жирность 4 %), в которые вносили низин и искусственно контаминировали штаммом Lb2. Образцы инкубировали при температуре 25±1°С и определяли в них концентрацию тестовых штаммов через 5 суток хранения (табл. 4)

Таблица 4

Прирост численности1 (AlgKOE/r) лактобацилл в творожных десертах

Вариант Lb2

стартовая нагрузка, lgKOE/r

min max

Стартовая нагрузка, lg КОЕ/г 2А 5Л

Прирост AlgKOE/r:

Контроль 6,0 3,0

+ 2,0 г/кг лактата (из молочной кислоты) 1,4 1,5

+ 2,0 г/кг лактата (из лактата кальция) 5,4 2,8

+ 40 мг/кг низина нет 0,4

+ 60 мг/кг низина нет 0,1

Примечание. Стартовая нагрузка (подчеркнуто-) это lgKOE в начале инкубирования, а прирост - увеличение относительно стартовой нагрузки к концу инкубирования.

Закономерности поведения штамма Lb2, отмеченные в опытах in vitro, справедливы и для экспериментов с десертами. Низин в концентрациях 40 и 60 мг/кг задерживал развитие с эффективностью большей, чем молочная кисло-

та. Действие лактата из молочной кислоты, вводимого в продукт в количестве 2,0 г/кг, подавляло развитие штамма ЬЬ2. Однако, при введении такого количества молочной кислоты изменяется активная кислотность продукта до рН 3,99+0,01.

В образцах продукта измеряли концентрацию низина в начале эксперимента, а также на 1-е и 5-е сутки. На 5-е сутки в пробах творога с контаминан-том ЬЬ 2 количество низина в продукте не уменьшилось ни в одном варианте.

Была выработана опытная партия "Чудо-творога" в количестве 2500 кг с содержанием низина 40 мг/кг. Хранение десерта при температуре 6+0,5°С в течение 21 дня не выявило никаких отклонений в органолептических показателях.

Таким образом, применение низина позволит получать безопасные микробиологически стабильные молочные продукты.

При применении низина стоимостью 7000 руб/кг в рекомендованных дозах 40 мг/кг затраты для творожных десертов составят примерно 280 руб/т продукции, что составляет 0,24±0,02 % от стоимости продукции.

Глава 5 РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОНТАМИНАКТОВ - ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ХЛЕБА (КБХ)

Исследование корреляции органолептических характеристик с микробиологическими показателями хлеба в процессе хранения

Изменение экологической обстановки, нерациональное использование химических удобрений, снижение устойчивости сортов пшеницы и другие факторы приводят к увеличеншо объема муки, пораженной КБХ. Кроме того, расширяется ареал проявления болезни и увеличивается продолжительность этого сезонного заболевания. Своевременная диагностика контаминантов муки поможет контролировать и предотвратить заболеваемость хлеба.

Для изучения динамики развития микробного заражения из исследуемых образцов муки выпекали хлеб по методу пробной лабораторной выпечки (ГОСТ 27669-88). Образцы помещали в провоцирующие условия. В образцах в процессе хранения на 18, 24, 40 и 48 ч определяли наступление КБХ по органо-лептическим и микробиологическим показателям (рис. 6). Прорастая при благоприятных условиях, споровые бактерии синтезируют активный ферментативный комплекс, что приводит к изменению органолептических показателей

I

хлеба. Результатом деятельности протеолитических ферментов является гидролиз белков с выделением ароматообразующих веществ и появлением специфического запаха гнилой картошки. Деятельность амилолитических ферментов приводит к гидролизу углеводов муки и образованию липкого мякиша с темными пятнами. I

Рис.б Динамика развития КБХ по микробиологическому показателю Вид столбцов соответствует степени нарастания заболевания, сверху над ними указаны номера образцов муки.

Первые признаки заболевания появлялись при содержании бактерий 106 КОЕ/г - незначительный специфический запах, при увеличении их до

незначительный специфический

здоровый хлеб

11 12

резкий__|

специфический __!

запах. 9

слабый 3 специфический

14 !5

107 КОЕ/г - добавлялся слабый специфический запах, свыше 107 КОЕ/г - резкий специфический запах.

Показано, что по органолептичсским признакам болезнь может не проявляться, а содержание бактерий в нем превышает нормы, допустимые для пищевых продуктов, то есть больше 103 КОЕ/г по показателю КМАФАнМ согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 (п.1.4.7.1-1.4.7.4).

Обычно для определения общего количества спор в муке используется метод глубинного посева. Однако, бактерии-возбудители КБХ - аэробы. Поэтому был проведен сравнительный анализ по оценке количества бактерий выросших на агаризованной среде при глубинном и поверхностном способах посева. При глубинном способе количество выросших бактерий занижено более чем в 10 раз. В дальнейших исследованиях для количественной оценки бактерий КБХ в муке и хлебе использовали способ поверхностного посева.

Для определения в муке количества бактерий-возбудителей КБХ подобрана идентификационная агаризованная среда, позволяющая определять визуально амилолитически активные колонии по реакции с йодом.

В итоге разработана методика оценки качества хлеба по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ, предусматривающая переход с глубинного способа посева на поверхностный с использованием идентификационной среды. Показано, что воспроизводимость метода не превышает доверительный интервал ±5,6%.

Исследование термоустойчивости бактерий-возбудителей КБХ

Из заболевшего хлеба были выделены колонии контаминантов и исследована их термоустойчивость в опыте in vitro: суспензия спорового контаминанта в фосфатном буфере рН=6,8 с исходной концентраций 106-107 спор/мл, прогрев на водяной бане при температуре 97±0,5°С в течение 60 минут. Контаминанты, проявившие наибольшую термоустойчивость, встречались при анализе всех образцов хлеба и муки. Менее термоустойчивые контаминанты обнаруживались гораздо реже в заболевшем хлебе.

Исследование развития бактерий-возбудителей КБХ в суспензии муки

Для выделения споровых бактерий образцы муки обычно суспендируют в воде, прогревают и затем делают высевы на питательные среды.

В литературе описаны различные режимы прогрева для получения спор возбудителей КБХ: 70-75°С - 5 мин, 80°С - 30 мин, 90-95°С - 10 мин. Споры Bacillus могут выживать в процессе выпечки хлеба в центре мякиша, где температура 96-100°С. Поэтому для уточнения метода обработки суспензии муки проведена оптимизация по четырем параметрам: концентрация муки в суспензии, температура, время, состав жидкой среды для прорастания спор.

Подбор конкентраиии суспензии по cvxmi веществам. В ранее опубликованных источниках используется 10%-ная суспензия муки, при прогреве которой получается сгусток. Определение количества спор при таком способе приводит к увеличению ошибки опыта. Были исследованы более низкие концентрации муки - 1% и 5%. При содержании спор в муке при концентрации около 100 КОЕ/г определение такого количества в 1%-ной суспензии невозможно. Поэтому для работы была выбрана 5%-ная концентрация муки.

Подбор режима прогрева суспензии муки. Исследовали три режима прогрева суспензии муки: 70-75°С - 5 мин, 80°С - 30 мин, 90-95°С - 10 мин. Сравнение бактерий, выделяемых из заболевших образцов хлеба и из тех же образцов муки после указанных способов прогрева, показало, что не все колонии из муки обладали амилолитической активностью. Однако, при анализе заболевшего хлеба, выпеченного из этих образцов муки, все колонии были амилолитиче-ски активны. В связи с этим было предложено повысить режим температурной обработки до 96°С с выдержкой 10 минут. Высевы показали, что при таком режиме все колонии были амилолитически активны и соответствовали высеваемым из хлеба.

Подбор жидкой питательной среды для прорастания спор бактерий КБХ, Для оценки ферментативной активности бактерий КБХ необходимо прорастить споры, получив накопительную культуру. В качестве модельной среды

была выбрана суспензия муки. Муку суспендировали в МГ1Б и 2,5%-ном водном растворе поваренной соли (в соответствии с соотношением соль : мука в тесте при приготовлении хлеба), прогревали, термостатировали и высевали на идентификационную среду. Развитие спор в мучной суспензии с МПБ происходило быстрее, чем в мучной суспензии с 2,5% соли. На 18 ч термостатироваиия уровень в ферментативной активности разных образцов муки в мучной суспензии с МПБ был высок и отличия для разных образцов менее заметны, поэтому для дальнейшей работы была выбрана суспензия муки в 2,5%-ном водном растворе соли.

В итоге для методики оценки качества муки по содержанию споровых бактерий-возбудителей КБХ и их ферментативной активности приняты следующие условия обработки муки: 5%-ная суспензия муки в водном 2,5%-ном растворе соли, объем суспензии 100 мл, прогрев при 96±1°С в течение 10 минут.

Исследование протеолитической активности бактерий КБХ в суспензии муки

Характерный признак бактерий КБХ - протеолитическая активность. Проведен сравнительный анализ методов определения протеолитической активности. по ГОСТ 20264.2-89, в тонком слое желатина и в пробирках с желатиновой средой. Однако, эти методы не позволили получить четких значений протеолитической активности по ряду причин: низкая чувствительность, отсутствие количественной оценки.

Учитывая невысокий уровень протеолитической активности бактерий КБХ в муке, нами был предложен метод, основанный на гидролизе казеината натрия.

Проведен подбор условий, при которых протеолитическая активность бактерий КБХ проявляется наиболее отчетливо. Активность определяли в суспензии муки после прогрева при 96±1°С в течение 10 минут и термостатнрования при 37±1 °С в течение 18 ч.

Подбор концентрации казеината натрия. Исследовали влияние концентрации казеината 0,5% и 1% на величину зон преципитации. Уменьшение концентрации казеината натрия до 0,5% приводит к увеличению зон и дает более четкую картину.

Подбор времени гидролиза. Показания фиксировали через 2, 3, 4 и 5 часов. Величина зон при гидролизе 5 ч наибольшая (рис. 7).

Подбор рН казеинатной среды. Исследовали рН 6,8±0,05; 6,5±0,05; и 5,85±0,05. Последнее значение соответствует кислотности теста после выбра-живания. Для всех образцов муки при рН = 5,85±0,05 зоны преципитации наибольшие (рис. 8).

Подбор температуры. Сравнение степени гидролиза при температурах 37±1, 40±1, 45±1 и 50±1°С показало, что во всех вариантах активность возрастает с увеличением температуры (рис. 8). Наибольший уровень протеолитической активности проявляется при рН=5,85±0,05, причем значительный рост в диапазоне температур 37 - 45°С сменяется умеренным, достигая наибольшего значения при 50 °С (рис.8).

от времени гидролиза на казеинатной среде тации от температуры и рН среды для различных образцов муки при гидролизе 5 ч

Подбор толщины агарового слоя. Толщина агарового слоя влияет на

размер зон и на погрешность. Воспроизводимость результатов увеличивается

при толщине слоя 4 мм. Возможно, это связано с повышенным количеством

пробы, вносимой в лунку по сравнению со слоем толщиной 2 мм.

В итоге для методики сравнительной оценки протеолитичсской активности бактерий КБХ в образцах суспензии муки приняты следующие условия: время гидролиза -5 ч; рН среды- 5,85; температура - 50°С; концентрация казеи-ната натрия - 0,5%; толщина агарового слоя - 4 мм; проба - 0,1 г.

Изучение амилолитической активности бактерий КБХ в муке При прогреве муки суспензия становится вязкой, но в дальнейшем при термостатировании по мерс развития бактерий КБХ и нарастания амилолитической активности происходит снижение вязкости. Количественное изменение вязкости можно оценить вискозиметром.

Подбор вискозиметра. Оценивали кинематическую вязкость до и после термостатирования вискозиметрами ВГ1Ж-2 с диаметром капилляра 0,56; 1,31 и 1,77. Для работы выбран вискозиметр ВПЖ-2 с диаметром капилляра 1,31 мм, который позволяет определить вязкость суспензии до и после прогрева.

Изучение доступности кислорода. Возбудители КБХ - аэробы и доступность кислорода влияет на их развитие.

Исследовали вязкость в зависимости от площади поверхности суспензии, контактирующей с воздухом. Суспензию по 50 мл вносили в колбы вместимостью 250, 100 и 50 мл. Поверхность контакта с воздухом составила при этом: 55,9; 28,3 и 12.9 см2, а соотношение поверхности к объему Б/У, соответственно, 1,12; 0,57 и 0,26.

Из рисунка 9 видно, что вязкость значительно зависит от площади контакта с воздухом, то есть доступность кислорода оказывает существенное влияние на уровень амилолитической активности.

0.26 0.57 1.12 Соотношение ЭЛ/

Рис. 9 Зависимость вязкости от условий роста споровых контаминантов в стационарных условиях на 18 часов

Изучение условий термостатирования. Учитывая влияние кислорода на развитие контаминантов, был поставлен опыт в стационарных условиях и при перемешивании. В колбы вместимостью 250 мл вносили по 100 мл и 50 мл

прогретой суспензии, термостатировали в стационарных условиях и на качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин. В эксперименте через 18 часов контролировали количество бактерий КБХ, протеолитическую активность и вязкость. Большая доступность

кислорода стимулировала больший прирост

100 мл 50 мл ! _

---------- --------- - бактерии, протеолитическая активность также

Рис. 10 Зависимость вязкости от условий роста споровых бактерий

достигала максимального значения при перемешивании. В наибольшей степени аэрация оказывала влияние на амилолитическую активность, что видно по низкому уровню вязкости в пробах при перемешивании (рис.10). При объеме суспензии 50 мл при перемешивании наблюдали самые низкие значения вязкости, которые для разных образцов муки были примерно одинаковы.

Таким образом, чтобы зафиксировать отличия в образцах с большей точностью были выбраны условия: экспозиция прогретой суспензии - перемешивание, температура - 37 °С, объем суспензии - 100 мл.

Сравнение различных образцов муки. Для практической проверки метода исследовали различные образцы муки. Начальное содержание спор в образцах было 102 - 103 спор/г муки. Количество бактерий КБХ в суспензиях муки после термостатирования находилось в пределах одного порядка 108 - 109 спор/г муки и не давало четкой картины о степени заражения муки. Разница уровней проте-олитической активности в этих образцах находилась в небольшом диапазоне зон преципитации в пределах 18-22 миллиметров. В наибольшей степени отличия были выявлены в уровнях амилолитической активности, которые и отражали заболеваемость хлебных образцов (рис. 11).

100 90 80 70 ■ 60 ■ 50 40 30 20 -10 0

стац

пере м

Ш"

стац _I

р——ререм'

Таким образом, было показано, что заболеваемость хлеба в большей степени

определяется амилолитической активностью споровых контаминантов муки. Образцы № 1, 3, 4, 7 относятся к слабозараженной муке по результатам выпечки (рис.6) и вязкость у этих образцов имеет наибольшие значения 18-97 мм2/с. Хлеб из образцов му-

1 3 4 7 8 10 14 Образцы муки

| ки № 8, 10, 14 сильно зараженный на 24 часа хранения, и в этих суспензиях муки вязкость

Рис.11 Вязкость для разных

образцов муки при перемешивании наименьшая 2-7 мм2/с.

В результате проведенных исследований была разработана методика сравнительной оценки амилолитической активности бактерий КБХ в образцах суспензии муки, в которой определяемым параметром является вязкость.

Предложенные методы могут быть использованы для оценки качества муки в лабораториях на мукомольных и хлебопекарных предприятиях.

1. Изучено влияние низина на кинетические характеристики гибели клеток контаминанта. Показано, что в присутствии низика увеличивается удельная скорость инактивации К, но снижается стерический коэффициент А и энергия активации Е. С помощью математического анализа получено описание кинетики гибели клеток контаминанта с учетом концентрации низина в среде.

2. Изучено действие низина на штаммы газообразующих лактобацилл. Показано, что добавление низина в творожные изделия в концентрации 40 мг/кг практически полностью подавляет активность наиболее газообразующего штамма Lactobacillus fermentum 2, что позволяет использовать низин для предотвращения вздутия творожных изделий.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

3. Установлено, что рациональной дозой низина для сырого молока при сезонном повышенном микробном фоне является 10 мг/л, при этом режим пастеризации 95+1 °С может быть заменен более мягким режимом - 83+2°С без увеличения микробного заражения.

4. Показано, что использование предварительной пастеризации молока с низином не оказывает существенного влияния на скорость сквашивания обезжиренного молока и молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5%, что позволяет использовать низин в молоке при производстве кисломолочных продуктов.

5. Проведено изучение влияния протеолитической и амилолитической активностей бактерий-возбудителей на развитие картофельной болезни хлеба. Установлено преимущественное влияние на этот процесс амилолитической активности.

6. Разработана методика диагностики качества муки по содержанию спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба и предложены экспресс-методы сравнительной оценки протеолитической и амилолитической активности споровых контаминантов муки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нгуен, Вьет Ань. Влияние низина на кинетику гибели споровых контаминантов/ Вьет Ань Нгуен, Л.П. Минаева, Е.Ю. Попова, Н.И. Дунченко, В.В. Бирюков // Наука-Бизнес-Образование. Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда: тез. докл. 2-й Международ, конф. - 2005. - С.35.

2. Попова, Е.Ю. Исследование термоустойчивости газообразующих контаминантов Lactobacillus fermentum! Е.Ю. Попова, Е.А. Гула, Л.П. Минаева, Н.И. Дунченко, И.Н. Мозговая, Т.Ф. Вустина, В.В. Бирюков // Биология - наука XXI века: сб. тезисов 10-й Международ. Путинской школы-конф. молодых ученых. - 2006. - С. 390.

3. Попова, Е.Ю. Изучение кинетики гибели споровых контаминангов, выделенных из молока/ ЕЛО. Попова, ЛИ. Минаева, В.В. Бирюков // Сб. научн. тр. МГУИЭ: Вып.З. - 2006. - С.23 7-243.

4. Попова, Е.Ю. Повышение срока хранения мясных и молочных продуктов с применением низина/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Биология — наука XXI века: сб. тезисов 11-й Международ. Путинской школы-конф. молодых ученых. - 2007. - С. 214-215.

5. Попова, Е.Ю. Влияние низина на кинетику термической инактивации споровых микроорганизмов/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева, В.В. Бирюков // Биотехнология. -2008.-№2.-С. 69-73.

6. Попова, Е.Ю. Разработка методики определения протсолитической активности споровых бактерий в муке/ Е.Ю. Попова, Л.П. Минаева // Доклады молодых ученых и студентов МГУИЭ. - 2008. - С 28-29.

7. Попова, Е.Ю. Интенсификация технологии производства отечественного препарата "БИЗИН 1000" - консерванта из молочнокислых бактерий/ Е.Ю. Попова, В.В. Бирюков // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ: сборник научных докладов. — 2008. - С. 260-261.

Попова Елена Юрьевна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Подписано в печать 30.10.2008 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 3953

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл.13. т. (499) 264-30-73 www.firmablok.ru

Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Попова, Елена Юрьевна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1 Контаминанты сырья для пищевых продуктов.

1.1.1 Причины микробиологической порчи продуктов.

1.1.2 Источники микробиологического загрязнения молока и хлеба.

1.1.3 Микроорганизмы - контаминанты молока.

1.1.4 Микроорганизмы - контаминанты муки.

1.2 Методы предотвращения порчи пищевых продуктов.

1.3 Влияние тепловой обработки на компоненты сырья для пищевых продуктов.

1.4 Термическая деконтаминация - теория тепловой гибели микроорганизмов.

1.5 Методы борьбы с картофельной болезнью хлеба.

1.6 Методы определения зараженности муки и хлеба возбудителями картофельной болезни хлеба.

1.6.1 Бактериологические методы.

1.6.2 Технологический метод.

1.6.3 Биохимические методы.

1.6.4 Физические методы.

1.7 Низин как средство деконтаминации.

1.7.1 Структура и свойства низина.

1.7.2 Механизмы действия низина и антимикробный спектр бактериоцина.

1.7.3 Области применения низина.

1.8 Выводы и постановка задачи.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1 Условия выполнения и принципиальная схема исследования.

2.2 Характеристика объектов исследования.

2.3 Методы исследования.

Глава 3. Влияние низина на инактивацию контаминантов при тепловой обработке.

3.1 Кинетика инактивации споровых контаминантов в присутствии низина.

3.2 Математическое описание кинетики инактивации с применением низина.

3.3 Применение низина при тепловой обработке молока.

Глава 4. Влияние низина, молочной кислоты и лактата кальция на развитие газообразующих контаминантов.

4.1 Выделение и изучение контаминантов - возбудителей порчи молочнокислых продуктов.

4.2 Проверка термоустойчивости газообразующих контаминантов -L.fermentum.

4.3 Влияние молочной кислоты и лактата кальция на развитие L.fermentum

4.4 Влияние низина на развитие L.fermentum.

4.5 Влияние низина и молочной кислоты на развитие L.fermentum в творожных десертах.

Глава 5. Разработка методов диагностики специфических контаминантоввозбудителей картофельной болезни хлеба.

5.1 Исследование образцов заболевшего хлеба.

5.1.1 Исследование корреляции органолептических характеристик с микробиологическими показателями хлеба в процессе хранения.

5.1.2 Исследование термоустойчивости бактерий-возбудителей.

5.2 Исследование образцов муки как источника бактерий КБХ.

5.2.1 Исследование развития бактерий-возбудителей КБХ в суспензии муки.

5.2.2 Изучение протеолитической активности бактерий КБХ в суспензии муки.

5.2.3 Изучение амилолитической активности бактерий КБХ в муке.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка способов деконтаминации и диагностики специфических микробных контаминантов"

Большая часть производимого в мире продовольствия подвержена повреждающему действию микроорганизмов и выделяемых ими ферментов или токсинов. Поэтому важнейшей задачей является недопущение или предотвращение развития микроорганизмов-контаминантов в пищевых продуктах.

В настоящее время остаются актуальными проблемы безопасности сырья для пищевых продуктов: молока и пшеничной муки. Процессы их порчи во многом обусловлены наличием общего типа контаминантов — присутствием спор бактерий.

Молоко, поступающее на завод, изначально заражено вегетативными клетками и спорами. Первичная термическая обработка молока - термизация и пастеризация недостаточна для уничтожения термоустойчивых микроорганизмов и тем более спор. Инактивация спор происходит при температуре свыше 120 °С, то есть в режиме стерилизации, что негативно сказывается на технологических свойствах молока и качестве получаемых из него продуктов.

Изменение экологических условий окружающей среды, широкое применение искусственных пищевых добавок, химических консервантов приводит к появлению новых более устойчивых штаммов - контаминантов. Разработанные ранее режимы тепловой обработки при производстве продуктов питания часто бывают неэффективными.

Для расчета эффективных режимов стерилизации и пастеризации необходимо изучение кинетики гибели новых штаммов - контаминантов, выделенных из исходного сырья при различных условиях.

В настоящее время производство продуктов питания свободных от микроорганизмов уже не является достаточным условием. Продукты должны быть не только безопасны, но и сохранять как можно больше ценных питательных компонентов, иметь внешний вид и вкус, приближенные к натуральным продуктам. Альтернативой жестким режимам стерилизации может быть термическая обработка в более мягких условиях, которую позволяет провести внесение в продукт консерванта низина.

Использование в качестве консерванта бактериоцина низина, продуцируемого молочнокислыми бактериями, в последнее время всё более расширяется. Низин зарекомендовал себя как эффективный и безопасный консервант и был удостоен статуса наивысшей безопасности - статуса GRAS, низин разрешён к применению более чем в 50 странах, включая страны Европы и США. Поэтому использование низина для деконтаминации и последующего хранения пищевых продуктов остаётся актуальной задачей.

Следующая проблема - проблема безопасности хлебобулочных изделий, связанная с повышенной зараженностью муки спорами бактерий рода Bacillus, вызывающих картофельную болезнь хлеба.

Известно, что «картофельная палочка» и сопутствующие ей бактерии рода Bacillus могут вызывать у ослабленных людей такие тяжелые заболевания как эндокардиты, эндофтальмиты, менингиты, септицемии, артриты, остеомиелиты, пищевые токсикоинфекции, бактериемии, перитониты, заболевания желчного пузыря.

Проблема качества муки является актуальной, с одной стороны, для производства здорового хлеба потребителю, с другой стороны Россия после вступления в ВТО становится потенциальным экспортером муки. Товары, представляемые страной-экспортером на международный рынок, должны соответствовать международным стандартам по показателям безопасности.

В России стандартизированный микробиологический контроль муки существует лишь для продуктов детского питания ГОСТ 26972-86. Однако, даже там отсутствует контроль количества споровых бактерий - возбудителей картофельной болезни хлеба (КБХ). Несмотря на множество разработанных методик оценки зараженности муки бактериями-возбудителями КБХ, до сих пор единственным способом проверки муки является метод пробной лабораторной выпечки.

Несомненно, актуальна разработка единой методики по оценке качества муки в отношении возбудителей КБХ, которая отличалась бы хорошей чувствительностью и простой воспроизводимостью в условиях любой исследовательской лаборатории.

Положения, выносимые на защиту:

Установлено, что добавление низина увеличивает удельную скорость гибели клеток контаминанта, но снижает стерический коэффициент и энергию активации. Получено математическое описание кинетики гибели клеток контаминанта с учетом концентрации низина в стерилизуемой среде.

Показано, что низин подавляет развитие газообразующих лактобацилл и введение низина в творожные изделия в концентрации 40 МЕ/мл практически полностью подавляет активность наиболее активного газообразующего штамма Lactobacillus fermentum 2, что позволяет его использовать для предотвращения вздутия творожных изделий.

Установлено, что рациональной концентрацией низина для сырого молока является 10 мг/л, при этом режим пастеризации 95±1 °С может быть заменен более мягким режимом - 83±2 °С без увеличения микробного заражения.

Изучение влияния остаточного количества низина в молоке на развитие микрофлоры закваски показало, что низин не оказывает существенного влияния на скорость сквашивания обезжиренного молока и молока с массовой долей жира до 3,5%.

Показано, что хлеб, приготовленный из зараженной муки и не проявляющий признаков КБХ по органолептическим показателям, не может быть признан удовлетворительным по микробиологическим показателям.

Подобраны условия и режим термической обработки анализируемой суспензии муки, после которого остаются только споровые бактерии, вызывающие картофельную болезнь хлеба.

Установлено, что заболеваемость хлеба в большей степени определяется амилолитической активностью популяции бактерий-контаминантов в муке.

Разработаны экспресс-методики сравнительной оценки качества муки по показателям протеолитической и амилолитической активности бактерий КБХ в муке.

Научная новизна

Изучено влияние добавок низина на кинетику термической деконтами-нации споровых контаминантов и установлены значения стерического коэффициента А и энергии активации Е.

Разработаны инженерные методы расчета комбинированного способа деконтаминации, сочетающего тепловую обработку с добавлением биоконсерванта низина.

Установлено ингибирующее действие низина на неспоровые газообра-. зующие контаминанты Lactobacillus fermentum, выделенные из молочнокислых десертов.

Изучена динамика развития споровых бактерий-возбудителей картофельной болезни в образцах хлеба и на модельной среде.

Предложено в качестве методов диагностики картофельной болезни хлеба использовать протеолитическую и амилолитическую активность бактерий и разработаны экспресс-методы для оперативной оценки этих параметров.

Основные публикации по работе выполнены в соавторстве с В.В. Бирюковым и Л.П. Минаевой, которые также принимали участие в постановке саэкспериментов, обсуждении результатов, редактировании публи мого текста работы.

Соискателем были выполнены все экспериментальные раб дена статистическая оценка экспериментальных данных; полученные таты оформлены в виде статьи и тезисов, которые были апробированы на шести конференциях.

Таким образом, вклад соискателя в работу является определяющим.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Попова, Елена Юрьевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние низина на кинетические характеристики гибели клеток контаминанта. Показано, что в присутствии низина увеличивается удельная скорость инактивации К, но снижается стерический коэффициент А и энергия активации Е. С помощью математического анализа получено описание кинетики гибели клеток контаминанта с учетом концентрации низина в среде.

2. Изучено действие низина на штаммы газообразующих лактобацилл. Показано, что добавление низина в творожные изделия в концентрации 40 мг/кг практически полностью подавляет активность наиболее газообразующего штамма Lactobacillus fermentum 2, что позволяет использовать низин для предотвращения вздутия творожных изделий.

3. Установлено, что рациональной дозой низина для сырого молока при сезонном повышенном микробном фоне является 10 мг/л, при этом режим пастеризации 95±1°С может быть заменен более мягким режимом - 83±2°С без увеличения микробного заражения.

4. Показано, что использование предварительной пастеризации молока с низином не оказывает существенного влияния на скорость сквашивания обезжиренного молока и молока с массовой долей жира 0,5 % и 3,5%, что позволяет использовать низин в молоке при производстве кисломолочных продуктов.

5. Проведено изучение влияния протеолитической и амилолитической активностей бактерий-возбудителей на развитие картофельной болезни хлеба. Установлено преимущественное влияние на этот процесс амилолитической активности.

6. Разработана методика диагностики качества муки по содержанию спор бактерий-возбудителей картофельной болезни хлеба и предложены экспресс-методы сравнительной оценки протеолитической и амилолитической активности споровых контаминантов муки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время остаются актуальной проблема безопасности продуктов повседневного потребления: молока и хлебобулочных изделий. Процессы порчи этих продуктов во многом обусловлены наличием общего типа контами-нантов — присутствием спор бактерий.

Направленное воздействие на кинетические характеристики споровых контаминантов представляет большой интерес, так как именно споры создают наибольшие трудности при производстве безопасных продуктов. Природный консервант низин эффективно действует на споры при термической обработке. Очевидно, что добавление низина в продукт, подлежащий деконтаминации, должно влиять на кинетические характеристики споровых контаминантов.

Изучали действие низина на споровые формы в условиях пастеризации -при температурах 75, 85, 97 °С и при концентрации низина 25, 50, 75, 100 125 МЕ/мл. Споровую культуру контаминанта выделяли из цельного молока.

По результатам были определены кинетические характеристики спорового контаминанта А и Е, исследовано влияние низина на эти характеристики. Показано, что показатели А и Е падают при увеличении концентрации низина. Было получено итоговое уравнение зависимости удельной скорости гибели К от концентрации низина. Проведен статистический анализ полученного уравнения, показано, что уравнение позволяет оценивать удельную скорость гибели клеток контаминанта в присутствии низина с погрешностью ± 6%.

Сезонные изменения микробного фона молока, особенно в весенне-летний период, приводят к необходимости ужесточения режимов его тепловой обработки. Изучение действия низина на микрофлору молока и молочных продуктов проводили в весенний период — наиболее неблагоприятный в микробиологическом отношении. Также повышенные температуры хранения молока и, соответственно, повышенный фон микробиологической зараженности существует в летний период. В связи с этим температурные режимы обработки молока - термизация, пастеризация — как правило, выше установленных режимов.

Введение низина в концентрации 10 мг/л в молоко перед пастеризацией позволяет снизить температуру пастеризации с 95±2 °С до 84±2 °С с последующим хранением молока при 24±2 °С без заметного ухудшения микробиологических показателей (104 КОЕ/мл) в течение У ч.

Использование низина при пастеризации молока не оказывало тормозящего действия на развитие мезофильных заквасок при последующем приготовлении творога.

При производстве термизированных молочных продуктов из пастеризованного молока существует опасность попадания в готовый продукт остаточной микрофлоры молока.

В процессе исследований из вздутых образцов творожков были выделены контаминанты, вызывающие порчу герметически упакованных кисломолочных продуктов. Выделенные штаммы были идентифицированы как Lactobacillus fermentum - непатогенные грамположительные гетерофермен-тативные палочки. Была проверена термоустойчивость и подтверждена возможность контаминирования кисломолочных продуктов лактобациллами, выжившими после пастеризации молока.

Исследования показали, что эти контаминанты проявляют различную газообразующую способность. При проверке чувствительности к низину наиболее чувствительным оказался штамм с наибольшей газообразующей способностью. Это было подтверждено в опытах in vitro и в образцах творога.

Показано, что добавление низина в творожные изделия в концентрации 40 МЕ/мл практически полностью подавляет активность наиболее газообразующего штамма Lactobacillus fermentum 2, что позволяет использовать низин для предотвращения вздутия творожных изделий в условиях жаркого климата и при повышенной микробиологической зараженности. Хранение творожного десерта, приготовленного с добавкой низина в количестве 40 мг/кг, при температуре 6±0,5 °С в течение 21 дня не выявило никаких отклонений в органолепти-ческих показателях.

Проблема безопасности хлебобулочных изделий, связанная с повышенной зараженностью муки спорами бактерий рода Bacillus, вызывающих картофельную болезнь хлеба. Проблема качества муки является актуальной, как для производства здорового хлеба потребителю, так и с точки зрения конкурентоспособности на мировом рынке. Проанализированы методы оценки зараженности муки споровыми контаминантами. Несмотря на множество разработанных методик оценки зараженности муки, до сих пор единственным способом проверки муки является метод пробной лабораторной выпечки.

Изучена динамика развития бактерий-контаминантов в заболевшем хлебе. Установлено, что хлеб по органолептическим признакам может не вызывать опасности, а содержание бактерий в нем превышает нормы, допустимые для пищевых продуктов, предназначенных для непосредственного употребления в пищу, т.е больше чем

1(Г КОЕ/г. Хлеб, приготовленный из зараженной муки и не проявляющий признаков КБХ по органолептическим показателям, не может быть признан удовлетворительным по микробиологическим показателям.

Проведены исследования по разработке экспресс-методики определения зараженности муки бактериями-возбудителями КБХ. В результате подобраны условия и режим термической обработки анализируемой суспензии муки, после которого остаются только споровые бактерии. Последующий высев на подобранную идентификационную среду показывает наличие именно бактерий, вызывающих картофельную болезнь хлеба. Исследованы протеолитическая и ами-лолитическая активности этих бактерий. Выявлено, что бактерии чувствительны к присутствию кислорода и наиболее чувствительным показателем является амилолитическая активность.

На основании проведенных исследований разработаны экспресс-методы определения протеолитической и амилолитической активности бактерий КБХ в муке.

Показано, что заболеваемость хлеба, приготовленного из муки с примерно одинаковой степенью зараженностью споровыми бактериями — 10 спор/г муки, в большей степени определяется амилолитической активностью популяции бактерий-контаминантов в отдельном образце муки.

Разработана методика оценки количества бактерий, вызывающих картофельную болезнь хлеба, в образцах хлеба и муки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Попова, Елена Юрьевна, Москва

1. Аиба Ш. Биохимическая технология и аппаратура / Ш. Аиба, А. Хемфи, Н. Миллис. М.: Пищевая промышленность, 1975- 286 с.

2. Аношкина, Г. Болезни хлебных изделий / Г. Аношкина // Хлебопродукты. —2001. №7. - С.24-26.

3. Ауэрман Л.Я. Технология хлебопекарного производства / Л.Я. Ауэрман. -М.: Пищевая промышленность, 1972. 512 с.

4. Афанасьева О.В. Микробиология хлебопекарного производства / О.В. Афанасьева. СПб: Береста, 2003. - 220 с.

5. Барбашина, М.А. Разработка технологии молока питьевого пастеризованного длительного срока хранения с функциональными свойствами.: дис.канд. техн. наук: 05.18.07 и 05.18.04: защищена 25.11.205/ М.А. Барбашина -Воронеж., 2005. — 166 с.

6. Бирюков, В.В. Условия эквивалентности термической обработки ферментационных сред/ В.В. Бирюков, Л.П. Минаева, Вьет-Ань Нгуен // Биотехнология. 2004. - №4. - С. 90-95.

7. Богатырева Т.Г. Современные методы диагностики картофельной болезни хлеба / Т. Богатырева, Р.Д. Поландова. — М.: ЦНИИТЭИхлебпродуктов —1990.- 18 с.

8. Богатырева, Т.Г. Применение пшеничных заквасок целевого назначения в производстве хлебобулочных изделий / Т.Г. Богатырева, Р.Д. Поландова // Хлебопечение России. 2000. - №3. - С.17-19.

9. Богатырева, Т. Современные методы диагностики болезней хлеба / Т. Богатырева // Хлебопродукты. 2008. - №2. - С.50-51.

10. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии: в 3 т. Т.1/ Ф. Герхард. М.: Мир, 1983.-536 с.

11. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы (СаНПиН 2.3.2. 1078-01). М., 2001.-п. 1.4.

12. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов/ К.К. Горбатова. -3-е изд. СПб.: ГИОРД, 2003. - 320 с.

13. ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. Введ. 01.01.91. — М.: Изд-во стандартов, 1989.-с. 108- 119.

14. ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности. Введ. 01.07.91. — М.: Изд-во стандартов, 1989.-с. 43 - 49.

15. ГОСТ Р 52054 Молоко натуральное коровье сырье. Технические условия.

16. М.: Изд-во стандартов, 2003. с. 1 - 9.

17. Гудков А.В. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты / А.В. Гудков. М.: ДеЛи принт, 2003. - 800 с. Дедюхина В.П. Основы микробиологии / В.П. Дедюхина. — Владивосток.: ДВГАЭУ, 2004.-234 с.

18. Дремучева, Г. Улучшение качества хлеба из муки с пониженными хлебопекарными свойствами / Г. Дремучева, О. Карчевская, Р. Поландова // Хлебопродукты. 2000. - №4. - С.26-27.

19. Егоров Н.С. Влияние возраста и количества инокулята на рост Streptococcus lactis и образование им низина / Н.С. Егоров, Ю.И. Козлова и др. // Микробиология. 1975. - т.44, № 4. - С. 637-640.

20. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии / Н.С. Егоров. М.: Изд-во Московского университета, 1976. - 307 с.

21. Еремина И.А. Микробиология молока и молочных продуктов: учебное пособие / И.А. Еремина. — Кемерево: Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 2004. — 80 с.

22. Золотин Ю.П. Стерилизованное молоко / Ю.П. Золотин. М.: Пищевая промышленность, 1979. — 158 с.

23. Зюзько, А.С. Влияние комплексных улучшителей на качество и сохранение свежести хлеба / А.С. Зюзько, М.Ф. Комличенко // Сб. науч. тр. / Краснод. регион. Ин-т агробизнеса. 1999. -Вып.8. - С. 187-189.

24. Карнаушенко, JL Повышение качества пшеничного хлеба из слабой муки / JI. Карнаушенко, Г. Пшенишнюк, Т. Лебеденко // Хлебопродукты. — 2001. -№6.- С.26-27.

25. Козубаева, JI.A. Использование заквасок при приготовлении хлеба /Л.А. Козубаева, С.И. Конева // Соврем, пробл. техники хранения и переработки зерна. Барнаул., 2000. - С. 140 - 143.

26. Крамм Э.А. Деконтаминация питательных сред в процессе биосинтеза: Текст лекций/ Э.А. Крамм. М.: МИХМ, 1991. - 40 с.

27. Кузнецова, Л.И. О возможности использования низинобразующих штаммов лактококков для подавления картофельной болезни хлеба / Л.И. Кузнецова, Е.Н. Павловская, О.В. Афанасьева, Л.В. Красникова // Хлебопечение России.- 2004.-С.31-33.

28. Люк Э. Консерванты в пищевой промышленности / Э. Люк, М. Ягер. — 3-е изд. СПб.: ГИОРД, 1998. - 256 с.

29. Лейстнер Л. Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья. Доклады 6-й Международной конференции памяти В.М. Горбатова./ Л. Лейстнер. М.:ВНИИМП, 2002. - 305 с.

30. Липатов, Н.Н. Функциональные кисломолочные продукты для грудных детей / Н.Н. Липатов, Г.Ю. Сашинов, О.И. Башкиров // Пищевая промышленность. 2001. - №7. - С. 30 - 31.

31. Лихачева, Е.И. Повышение качества хлебобулочных изделий с использованием молочной сыворотки / Е.И. Лихачева, И.А. Еремкина // Материалы всерос. науч.-техн. конф. "Пищ. пром-ти XXI в." -Тольятти, 2008. - С.53-55.

32. Е.Мелешкина // Хлебопродукты. 2002. - №11. - С. 24-25. Мартынова, А.И. Пробная лабораторная выпечка хлеба - прямой и надежный способ оценки качества зерна пшеницы / А.И. Мартынова, Е.П. Пищугина // Зерн. культуры - 2001. - №2. - С.28-30.

33. Мартынов П.Н. Фильтр для очистки молока/ П.Н. Мартынов // Молочная промышленность. 2001. - № 9. — С. 29 - 30.

34. Матвеев В.Е. Основы асептики в технологии чистых микробиологических препаратов / В.Е. Матвеев М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.312 с.

35. Минаева, Л.П. Интенсификация технологии пищевого полипептидного консерванта низина.: дис.канд. техн. наук: 03.00.23: защищена 19.12.200/ Л.П. Минаева -М.,2000. 173 с.

36. Мудрецова-Висс К.А. Микробиология, санитария и гигиена / К.А.Мудрецова-Висс, А.А. Кудряшова, В.П. Дедюхина. М.: Деловая линия, 2001.-388 с.

37. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др. М.: Академия, 2005. - 608с.

38. Пащенко, Л.П. Жидкие дрожжи в технологии хлеба / Л.П. Пащенко, И.М. Жаркова, Ю.Ф. Росляков, Л.Ю. Пащенко // Изв. вузов Пищ. технологии. -2003.-№ 4.-С. 31-34.

39. Поландова Р.Д. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба / Р.Д. Поландова, Т.Г. Богатырева, О.А. Сидорова и др. М.: ГосНИИХП, 1998.-32 с.

40. Поландова, Р.Д. Жидкие дрожжи с улучшенными биотехнологическими свойствами для регионов с жарким климатом / Р.Д. Поландова, Т.Т. Богатырева, А.А Атаев // Хлебопечение России. 1999. —№ 5. - С. 21-22.

41. Поландова, Р.Д. Применение пропионовокислых заквасок в хлебопечении / Р.Д. Поландова, Т.В. Быковченко, Е.П. Рыжкова // Хлебопечение России. -2005.-№ 6.-С. 12-13.

42. Полыгалина Г.В. Определение активности ферментов. Справочник / Г.В. По-лыгалина, B.C. Чередниченко, JI.B. Римарева. М.: ДеЛи принт, 2003. — 375 с.

43. Полякова, С.П. Дезинфицирующие средства для хлебопекарных предприятий/ С.П. Полякова // Хлебопечение России. 2001. - №5. - С. 1213.

44. Полякова, С.П. Использование ультрафиолетового излучения для борьбы с картофельной болезнью хлеба/ С.П. Полякова, Т.Г. Богатырева // Хлебопечение России. 2003. - №5. - С. 28-29.

45. Полякова, С.П. Методы и средства повышения микробиологической безопасности хлебобулочных изделий/ С.П. Полякова // Хлебопечение России. 2003. - №6. - С. 3-5.

46. Степанова, Л.И. Справочник технолога молочного производства. Цельномолочные продукты: в 1 т. / Л.И. Степанова. СПб.: ГИОРД, 2004. -384 с.

47. Тифанюк, О.Ю. Борьба с картофельной болезнью хлеба / О.Ю. Тифанюк //

48. Аграр. наука. 2001. - №8. - С.28-29.

49. Цыганова, Т.Б. Влияние йодированной соли на микрофлору хлеба из пшеничной муки / Т.Б. Цыганова, JI.H. Шатнюк, М.Н. Костюченко // Хлебопечение России. 2001. - №4. - С.24-25.

50. Abee Т, Krockel L, Hill С. Bacteriocins: modes of action and potential in food preservation and control of food poisoning. Int. Food Microbiol 28. 1995. -p. 169.

51. Aplin and Barrett Ltd: Use of Nisaplin in procesed cheese and processed cheese preparations. Technical Information Sheet No. 10/91. Aplin and Barrett Ltd,

52. Beamivster, Dorset, England.- 1991.

53. Bratovanova P., Rothe M. Einsatz von gefriergetrockneten Garstoffen aus Laktokokken bei der Zubereitung von Weizenbrot // Getreide Mehl Brot. 2000. -Jg.54, H.l.-S. 18-22.

54. FAIR Report (1999): Harmonization of Safety Criteria for Minimally Processed Foods (79 pages). FAIR Concerted Action CT96-1020, European Commision, Brussels, Belgium.

55. Ferreira MASS, Lund BM. The effect of nisin on Listeria monocytogenes in culture medium and long-life cottage cheese. Lett Appl Microbiol 22, 1996433-8.

56. Gould G.W.(2000b): New and emerging physical of preservation. In: B.M.Lund,

57. T.C. Baird-Parker & G.W. Gould (Eds.), The Microbigical Safety and Quality of

58. Food (pp. 277-293). Aspen Publishers, Gaithersburg, USA.

59. Hansen J.N. // Crit. Rev. Food Sci. Nutri. 1994. - v.34. - p. 69-93.

60. Hurst A. Nisin.// Advances in Applied Microbiology- 1991.- v.21- p.85-123.

61. Hurst A., Hoover D. Nisin. In: Davidson M., Branen A.: Antimicrobials in Food.

62. Maisnier-Patin S., Deschamps S.R., J. Richard. 1992: Ingibition of Listeria monocytogenes in Camembert chees made with a nisin-producingstarter. Le Lait 72, p.249-263.

63. Mansour M, Milliere JB. An inhibitiry synergistic effect of nisin-monolaurin combination on Bacillus spp. Vegetative cells in milk. Food Microbiol 18., 2001. -p. 87-94.

64. Marin S.,Guynot M.E., Arbones J., Ramos A.J. Aspergillus flavus, Aspergillus niger and Penicillium Corylophilum spoilage prevention of bakery products by means of weak-acid preservatives // J.Food Sc. 2002. - Vol.67, № 6. - P. 2271 -2277.

65. Matsusaki H., Endo N., Sonomoto K., Ishizaki A. Lantibiotic nisin Z fermentative production by Lactococcus lactis Ю-1: relatioship between production of the lanti-biotics and lactat and cell growth // Food Sci. Technol., Int.,- 1996.- v.2.-p.l57-162.

66. McAuliffe O, Ross RP, Hill C. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action. FEMS Microbial Rev 25., 2001. p. 285 - 308.

67. Roberts R. F., Zottola E.A. Self-life of Pasteurized Process Cheese Spreads Made from Cheddar Cheese Manufactutured with a Nisin-Producing Starter Culture // J. Dairy Sci.- 1993.-76.-p. 1829-1836.

68. Schlimme E. Chemical process parameters for thermal inactivation of alkaline phosphatese in milk // Kiel. Milchwirt. Forshungsber. 1997. - V.49, № 3. - p. 207-219.

69. Stephen Wessels, Birthe Jelle, Ingolf F.Nes. Bacteriocins of the Lactic Acid Bacteria: An Overlooked Benefit for Food. Danish Toxicology Centre, 1999. — p 86.

70. Szabo EA, Cahill ME. The combined effects of modified atmosphere, temperature, nisin and ALTA 2341 on the growth of Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiol 43., 1998. p. 21 - 31.