Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств

Ночевная, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств"

На правахрукописи

НОЧЕВНАЯ Татьяна Владимировна

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ ВИРУСА ЭНТЕРИТА НОРОК И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.00.06. «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 2005

Работа выполнена в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

ГРУЗДЕВ Константин Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ГЛОБЕНКО Людмила Алексеевна (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных);

доктор биологических наук, профессор ЮРКОВ Сергей Григорьевич (ГНУ ВНИИВВИМ, г. Покров);

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП, г. Щелково)

Защита диссертации состоится «19» апреля 2005 года в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600 901, г. Владимир, пос. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан «16» марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с

Г.М. Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирусный энтерит норок (ВЭН) - одно из наиболее распространенных заболеваний пушных зверей. Экономический ущерб, наносимый звероводству ВЭН, складывается из гибели молодняка норок (до 90%), нарушения функции воспроизводства, а также значительных затрат на ветеринар-но-санитарные мероприятия. Существенное место в борьбе с ВЭН занимает специфическая профилактика (АА Сулимов, А.К. Кириллов, 1973,1974; Г.А. Комарова, 1985; А.М. Литвинов, НА Яременко, 1998; J. Gorski, 1987).

За последние десятилетия ХХ-го века накоплен обширный материал по созданию противовирусных преператов нового поколения: векторных, маркированных и синтетических. Однако, реальным на сегодняшний день остается профилактика ВЭН вакцинами, изготовленными по традиционной технологии, с использованием первичных культур клеток (ПКК) почек котят - ПК. Применение данной культуральной модели не экономично и не перспективно из-за сезонности получения доноров ткани, трудоемкости и длительности процесса трипсинизации ткани почек, опасности эндогенной контаминации суспензии клеток различными микроорганизмами и низкой производительности метода стационарных моно-слойных культур, а также невозможности длительного пассирования вируса in vitro (Е.Ю. Зеленое, 1983; А.В. Борисов и др., 1995; Zhang Deli, 1991).

За последние 10-15 лет в мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток (ПЛК) в качестве субстрата для производства иммунобиологических препаратов (ИБП). Необходимо отметить, что используемые в практике линии клеток собак, кошек и норок характеризуются различной чувтвительностью и, в основном, не пригодны для длительного пассироваания ВЭН (Л.Л. Миронова, 1988; В.Н. Тарасов, 1991; В.А. Сергеев, 1993; А.В. Борисов и др., 1995; Н.И. Герасимова и др., 1996).

Тем не менее, при общей тенденции более широкого применения ПЛК в биотехнологии, существует целый ряд нерешенных и малоизученных проблем, тормозящих процессы разработки и совершенствования ИБП и, в частности, вакцин

против ВЭН. Важное место в решении этих задач занимают вопросы: выбора, контроля и стандартизации свойств высокочувствительных к ВЭН культуральных моделей, совершенствования технологии и длительности культивирования ПЛК и штаммов ВЭН в больших объемах, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, стабилизации свойств и условий хранения штаммов вируса, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур клеток и ИБП от бактерий и микоплазм (А.С. Новохатский, Л.П. Дьяконов и др., 1981; В.Н. Тарасов, 1990).

Поэтому исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенных для получения ВЭН с выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, представляют для науки и практики бесспорную актуальность.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлась оптимизация условий культивирования вируса энтерита норок в культурах клеток и изучение его биологических свойств.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительное изучение чувствительности первичных и перевиваемых линий клеток к штаммам ВЭН и отобрать наиболее перспективные из них для серийного пассирования вируса;

- деконтаминировать отобранные линии клеток от микоплазм и оптимизировать культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и роллерного культивирования;

- изучить физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства культу-рального ВЭН различного уровня пассажей;

- определить условия стабилизации и хранения культурального ВЭН;

Научная новизна. Определена и охарактеризована наиболее чувствительная к ВЭН линия клеток селезенки кошки (FS) и доказана ее пригодность для получения активного гемагглютинирующего антигена в течение 25 пассажей.

Разработана рациональная схема деконтаминации ПЛК кошек от микоплаз-менной инфекции при помощи фторхинолонов.

Оптимизировано культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и роллерного культивирования.

Впервые показана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для экспресс-оценки ростовых свойств и изучения популяции линий клеток кошачьего происхождения, используемых в качестве субстрата для размножения вируса.

Определены физико-химические показатели белков и ДНК вирионов, антигенные и иммуногенные свойства культурального ВЭН различного уровня пассажей.

Практическая значимость. Предложена культуральная модель FS и оптимальные условия серийного пассирования ВЭН стационарным и роллерным методами.

Создан криобанк из линии клеток FS, очищенной от микоплазм.

Разработаны «Методические указания по поддержанию, хранению и контролю линии клеток FS», утвержденные директором ФГУ «ВГНКИ» от 02.03.2004 г.

Предложены защитная среда оптимального состава, режимы лиофилизации и хранения сухих форм культурального вируса энтерита норок.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2004 гг.; международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - г.Щелково, 2001 г.; методической научно-практической конференции «Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства», посвященной 70-летию ГНУ НИИПЗК им. ВА Афанасьева, п. Родники Московской обл., 2002 г.; международной научно-практической конференции «Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства», посвященной 80-летию ВНИИОЗ. - г.Киров, 2002г.; международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ. -г.Владимир, 2003 г.; международной научной конференции «Современные дос-

тижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». - г.Москва, 2003 г.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- теоретическое и практическое обоснование выбора ПЛК FS и CRFK для серийного пассирования ВЭН;

- практические предложения по очистке ПЛК кошек от микоплазменной контаминации при помоши фторхинолонов;

- способ и условия культивирования ВЭН в лабораторных условиях;

- физико-химические свойства культурального ВЭН различного уровня пассажа:

- перспективность применения ВЭН различного уровня пассажей для производства иммунобиологических и диагностических препаратов;

- условия стабилизации культурального ВЭН методом лиофильного высушивания.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 15 рисунков. Список литературы включает 199 источников, из них 93 иностранных авторов.

Особую благодарность выражаю научному руководителю профессору Груздеву Константину Николаевичу, профессору Уласову Валентину Ильичу и всем сотрудникам отдела вирусных препаратов ФГУ «ВГНКИ» за помощь в работе, а так же Б.В. Виолину, Ю.Г. Опарину, Т.А. Скотниковой, Н.Ю. Смысловой, А.П. Пономареву.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В работе использовали:

- первичную культуру клеток почки кошки (ПК) готовили в соответствии с методическими указаниями (Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф. и др., 1980);

- перевиваемые линии клеток (ПЖ) почки (CRFK), фибробластов эмбриона (СС-81) и селезенки (FS) кошки, почки американской норки (mVILu), а также почки собаки (MDCK); клеточные линии поддерживали в стационарных условиях в соответствии с требованиями паспортов; посевная концетрация клеток составляла 100 тыс/мл; эффективность пассирования перевиваемых линий оценивали по урожаю клеток (УК), индексу пролиферации (ИП) и морфологии тест-культур.

- питательные среды: 199, Игла MEM, ГЛА/Х и раствор Хенкса (рН 7,2-7,4);

- сыворотки крови (СК) крупного рогатого скота (КРС), телят и фетальную в концентрации 5 -10%;

- тканевае штаммы «Родники» и «Береговой» вируса энтерита норок (ВЭН) с активностью 15,0-16,0 log2 в РГА получены из «Отдела вирусных препаратов» ВГНКИ; культуральный вирус готовили в культуре ПК с активностью не менее 10,0 log2 в РГА; доза и способ заражения, условия и сроки культивирования ВЭН были оптимальными; активность вируса оценивали микрометодом в РГА (Тро-ценко Н. И. и др., 2000);

- фторхинолоны (ФХЛ); в качестве антимикоплазменных средств испытывали энрофлон-К (ТУ 934343-016-47611900-00), изготовленный на основе энрофлок-сацина с активностью 10 мг/мл и 2 комплексных препарата на основе норфлокса-цина (50 мкг/мл) и энрофлона-К (35 мкг/мл) с поверхностно-активными веществами (ПАВ) - этонием и Tween-80 (SERVA 37475) в дозе 7 мкг/мл.

2.1.1. Методы индикации микоплазм в клеточных культурах.

- Микробиологический метод контроля основан на росте микоплазм-кон-таминантов (МК) ПЛК на элективных жидкой (ТПБС-триптическом переваре мышц сердца КРС-бульоне), полужидкой (ПЖА с 0,3% агара) и плотной (с 1,3% агара) питательных средах. Условия культивирования и оценку результатов кон-

троля ПЛК на микоплазменную контаминацию осуществляли в соответствии с требованиями «Методических рекомендаций по выделению, культивированию и идентификации микоплазм, ахолеплазм и уреаплазм» (М, 1982).

- Цитохимический метод (ЦХМ) контроля основан на окраске ДНК клеток МК флюорохромами: оливомицином или Hoechst-33258. Контроль культур на микоплазменную контаминацию ЦХМ проводили в соответствии с требованиями "Методических рекомендаций по способу выявления микоплазм в культурах перевиваемых клеток (М., 1983).

- Индикация МК культур клеток в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Подготовку исходных компонентов и диагностику МК линий клеток проводили совместно с д.б.н. И.Л. Обуховым в соответствии с требованиями «Методических указаний по диагностике возбудителей микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции (утверждены МСХ РФ 7 октября 1997г.).

2.1.2. Очистка ПЛК от микоплазменной инфекции. Деконтаминации были подвергнуты линии клеток СС-81, FS и CRFK при помощи энрофлона-К и нор-флоксацина в дозе 10 мг/мл и комплексных препаратов на основе ФХЛ и ПАВ в нетоксичных и субтоксических дозах. Схема обработки культур предусматривала внесение антимикоплазменных препаратов на монослой или в суспензию изолированных клеток в течение 10 пассажей. Результативность деконтаминации ПЛК от микоплазм оценивали по ростовым свойствам, морфологии клеток в культуре, ИП и результатам ЦХМ и в ПЦР.

2.1.3. Оценка чувствительности деконтаминированных линий клеток к ВЭН. Деконтаминированные и исходные (контроль) линии клеток СС-81, FS и CRFK заражали в суспензию клеток и на монослой штаммом "Береговой" ВЭН и оценивали чувствительность культур в течение 3 пассажей. Доза и способ заражения, условия и длительность культивирования вируса были оптимальными. Уровень накопления вируса оценивали микрометодом в РГА.

2.1.4. Цитометрическое исследование линий клеток. Культуры клеток FS и CRFK, выращивали в стационарных условиях и отделяли от субстрата общепринятыми методами. Изолированные клетки трижды отмывали и центрифугировали в

3 мл фосфатно-буферного раствора (ФБР) с рН 7,2, содержащим 0,15М NaCL и фиксировали 70% этанолом в течение 3 часов при 4°С. Зафиксированные клетки трижды отмывали от фиксатива, центрифугировали в 3 мл охлажденного ФБР. Осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл ФБР, содержащего 40 мг/мл йодита пропидия (Calbiochem) и 0,5 мг/мл рибонуклеазы (Sigma) и инкубировали в течение 60 мин. Анализ клеток проводили на лазерном проточном цитофлуориметре-сортере EP1CSr «Elite» (Coulter, USA), оборудованном аргоновым лазером CYON-ICS (Uniphage, USA) с длиной волны возбуждения 488нм и мощностью луча 15 тВт. Оценивали среднестатистические размеры и гранулярность клеток, распределение ДНК по фазам клеточного цикла и величину апоптоза. Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ EXPO 32 (Beckman-Coulter, USA) и Multi Cyce (Phoenix Flow Systems USA).

2.1.5. Условия культивирования вируса. Изучали размножение штаммов "Родники" и "Береговой" ВЭН в зависимости от вида и концентрации клеток, дозы и способа заражения культур, времени адсорбции вируса клетками перевиваемых линий, состава ПС и СК животных, способа культивирования и вида антибактериальных средств. Уровень накопления ВЭН оценивали в РГА

2.1.6. Изучение физико-химических свойств ВЭН. Очистку и концентрирование штамма «Береговой» ВЭН 5 и 25 пассажей в культуре клеток FS с титром 12,0 Iog2 в РГА проводили при помощи ПЭГ-6000 и дифференциального градиентного центрифугирования. Качество полученых антигенов оценивали по ГА активности и удельному содержанию общего белка по методу Бредфорда (Дарбре А., 1982).

Электронно-микроскопический анализ образцов культурального ВЭН проводили совместно с д.б.н., ст.н.с. А.П. Пономаревым (2002) с помощью электронного микроскопа YEM-100B (Jeol, Япония) при увеличении 300 000.

Исследование структурных белков концентрированного культурального вируса 5 и 25 пассажей проводили методом электрофореза в ДСН-ПААГе при постоянном напряжении 80В в течение 20 мин и в дальнейшем при напряжении 200 В в течение 3-х часов. Результаты разделения протеинов на электрофореграмме

обрабатывались с помощью программ Gel-Imager, пакета программ Gel explorer версия 1,0 (ДНК-технология, Москва).

Выделение ДНК из сконцентрированных образцов ВЭН 5 и 25 пассажей осуществляли с использованием протеиназы-К методом электрофореза по Blin N., Stafford D.W. (1976). Полученный препарат вирусной ДНК затем анализировали методом электрофореза в течение 2 часов при напряженности электрического поля 8 В/см в 1,5% агарозном геле, содержащем 20% формамида. Полученные результаты обрабатывались с помощью программы Gel-Imager, пакета программ Gel explorer версия 1,0 (ДНК-технология, Москва).

2.1.7. Изучение антигенности и иммуногенности культурального вируса. Для иммунизации кроликов массой 3,0-3,5 кг и норок 3-х месячного возраста использовали тканевой и культуральный антигены штамма «Береговой» ВЭН 5 и 25 пассажей на линии клеток FS с активностью 10,0 log2 в РГА, вакцина «Минвак» против чумы энтерита, ботулизма и псевдомоноза. Активность сывороток крови оценивали на 7, 14 и 21 сутки после иммунизации животных микрометодом в РТГА (Троценко Н. И. и др., 2000), а иммуногенные свойства вируса оценивали по степени устойчивости норок к вирулентному штамму «Береговой» с активностью 15,0 log2 в РГА.

2.1.8. Лиофилизация вируса. Высушивание культурального штамма «Родники" ВЭН 5 пассажа с активностью 12,5 log2 в РГА проводили в ампулах ШПВ-6 в «Лаборатории инструментальных методов исследований» ФГУ «ВГНКИ» на установке LIOVAK GT-2 совместно с к.б.н. Ю.Г. Опариным. В качестве защитных сред (ЗС) использовали обезжиренное молоко (ОМ), среду ВГНКИ-3, среду №2 и среду №4. Гемагглютинирующую активность сухих образцов ВЭН оценивали при регламентированных условиях хранения и методом ускоренного старения.

2.1.9. Статистическая обработка результатов исследований проведена методами (Веденягин Г.В., 1973; Лакин Г.Ф., 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Сравнительная оценка культуральных моделей к ВЭН. Была изучена чувствительность линий клеток почки (CRFK), фибробластов эмбрионов (СС-81), селезенки (FS) кошки, почки американской норки (MVlLu), почки собаки (MDCK), а также первичной культуры почек котят (ПК), широко используемой в практике, к штаммам «Родники» и «Береговой» ВЭН. Доза заражения монослой-ных культур и сроки стационарного культивирования составляли соответственно 6,0 log: в РГА на мл среды и 6 суток при 37°С. Полученные антигены однократно замораживали (-40°С) и оттаивали (37°С).

Установлено, что наиболее чувствительными культурами к ВЭН являются линии клеток кошек CRFK и FS, а максимальной репродутивной активностью характеризовался штамм «Береговой». В тоже время следует подчеркнуть, что наиболее перспективной системой следует считать культуру FS в которой вирус накапливался до 12,0-15,0 Iog2 в РГА. Культуры клеток MVlLu и СС-81 оказались слабо чувствительными, вирус репродуцировался только в 1-ом пассаже и накопление ГА антигена не превышало соответственно 5,0-6,0 и 11,0-12,0 log2 в РГА. Культура MDCK оказалась не чувствительной к ВЭН, так как накопление вируса не наблюдалось даже в 1 пассаже.

Анализ микропрепаратов культур CRFK и FS, инфицированных штаммом «Береговой» ВЭН показал следующие результаты. На 6 сутки наблюдения в микрокультурах были отмечены частичное округление, сморщивание и отслоение отдельных клеток от субстрата с образованием «окон», ряд клеточных элементов сливаются в многоядерные симпласты, однако монослой с отдельными очагами дегенерации при этом сохраняется. Аналогичная картина наблюдается при визуальном контроле и в нативных монослойных культурах клеток, при этом монослой становится более темным, а клетки ориентированы в виде тяжей. Наиболее выраженные изменения отмечены со стороны ядра. В покоящихся клетках наблюдается пикнотизация ядер, а в делящихся - развитие патологических митозов (от-

ставание хромосом в метафазе, трехполюсные митозы), что характерно для представителей парвовирусов.

3.2. Стандартизация культур клеток-субстратов для производства ВЭН

Контроль ПЛК на микоплазменную контаминацию. Для индикации мико-плазм в культурах клеток СКРК, Б8, СС-81 и ПК параллельно испытывали микробиологический (ММ), цитохимический (ЦХМ) методы и ПЦР. Установлено, что все тестируемые линии клеток контаминированы микоплазмами. Из первичной культуры ПК контаминант выделить не удалось.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что микоплазменная инфекция ПЖ кошек установлена во всех 3-х клеточных культурах только при помощи ПЦР. Достаточно чувствительным оказался также ЦХМ индикации (в 2-х случаях из 3) контаминанта, который пригоден также для предварительного контроля и оценки уровня инфицированности клеточных культур микоплазмами. Микробиологический метод контроля оказался неэффективным.

Деконтаминация линий клеток кошек при помощи моно- и комплексных препаратов на основе ФХЛ и ПАВ. Испытания показали, что энрофлон-К в оптимальной дозе 10 мкг/мл является умеренно токсичным для линий клеток ГО и СС-81 и достаточно эффективным в отношении микоплазм-контаминантов.

Применение препарата по методу Мс^ев (1988) в течение 10 пассажей позволило очистить культуры клеток от микоплазменной инфекции. Эффект элиминации МК из линии клеток был достигнут даже после 5-ти кратной обработки культуры ФХЛ благодаря оптимальному соотношению дозы препарата, концентрации клеток и уровня инфицированности культур. В контрольных образцах ПЖ наблюдали дегенеративные изменения и нечеткость границ клеток в культуре. Специфичность этих процессов подтверждена в ПЦР и ЦХМ.

Было также установлено, что комплексные препараты на основе энрофлона -К (35 мкг/мл) и твина-80 (7 мкг/мл), норфлоксацина (50 мкг/мл) и этония (7 мкг/мл) в субтоксических дозах характеризовались выраженными антимикоплаз-менными свойствами и обеспечивали деконтаминацию линии клеток СКРК от МК даже в течение 5 пассажей. Дальнейшая обработка культуры комбинирован-

ными препаратами и последующее 10-кратное пассирование с обычными антибиотиками не изменило достигнутого эффекта, что и было подтверждено в ПЦР.

Свободные от МК линии клеток СС-81, FS и CRFK обладали выраженными ростовыми свойствами, сохраняли исходную морфологическую структуру монослоя без признаков дегенерации клеток в культурах и были предложены в качестве субстрата для размножения ВЭН. Деконтаминированные линии клеток были размножены и криоконсервированы в жидком азоте по 15-20 ампул эталонного и по 70 ампул рабочего банков. Исходная концентрация и выживаемость клеток после размораживания составляли соответственно 4,0-7,0 млн/мл и 82-93%. Ростовые свойства и характерная морфология ПЛК восстанавливались через 2-4 пассажа после размораживания. Культуры клеток CRFK и FS сохранили чрезвычайно высокую, но равноценную чувствительность к штамму «Береговой» ВЭН и обеспечивали накопление вируса в течение 3 пассажей на уровне 12,0-15,0 log2 в РГА.

Линия клеток СС-81 напротив обеспечивала максимальное накопление вируса (13,0 log2 в РГА) только в 1 пассаже. Во 2-ом и 3-ем пассажах титры ВЭН не превышали соответственно 8,0 и 1,0-3,0 Iog2 в РГА.

3.3. Цитометрический анализ клеточного цикла линий клеток FS и CRFK. Оценивали пригодность и перспективность метода проточной цитометрии (ПЦ) для анализа и стандартизации наиболее перспективных для практики линий клеток (Полетаев А.И., 1989; Мораска Л., 1989).

Методом ПЦ были охарактеризованы исходные и прошедшие 30 пассажей после криоконсервирования линии клеток FS и CRFK по размерам, гранулярности, фазам клеточного цикла и програмированной гибели клеток (ПКГ) - апоптозу.

Среднестатистические размеры клеток. Изменение размеров клеток в культуре свидетельствует, как правило, о нарушении условий пассирования и процессов деления клеток in vitro. Экспериментально установлено, что клетки линий FS и CRFK практически не изменились в течение 30 пассажей после криокон-сервирования и имели соответственно среднестатистические размеры равные 13,05± 2,75 и 11,84± 2,69 ЦМ, что характерно для исходных (3-4 пассажа) линий клеток кошек - 12,84± 2,67 и 11,55± 2,48 J1M.

Гранулярность. Показатель гранулярности характеризует состояние внутренней структуры клеток, соотношение ядра и цитоплазмы, а также свидетельствует о наличии аномальных и апоптотических клеток в культуре. Полученные результаты свидетельствуют о том, что по гранулярности клетки исследуемых линий 30 пассажа практически не отличались друг от друга и от исходных культур (3-4 пассажа), сохраняемых в жидком азоте. Эти данные достоверно отражают показатели MEAN для клеток линии CRFK (269,7 и 267,6) и FS (277,5 и 275,4) соответственно 3 и 30 пассажей и свидетельствуют о стабильности свойств и оптимальных условиях пассирования культур клеток in vitro.

Распределение ДНК по фазам клеточного цикла. Результаты сравнительного изучения фаз клеточного цикла линий FS и CRFK 4 и 30 пассажей свидетельствуют о том, что наиболее активно пролиферируют клетки линии FS. Этот факт подтверждается тем, что в процессе деления (S + G2 + М) находится 38,8% клеток, содержащих ДНК больше 2п. Напротив количество клеток линии CRFK, находящихся в стадии деления не превышало 35,9%. Несмотря на это культура характеризовалась удовлетворительными ростовыми свойствами, не содержала ми-коплазм и до 10 суток сохранялась в монослое без признаков дегенерации клеток в культуре.

Невысокие коэффициенты вариации (CV) по фазам клеточного цикла G1+G0 (6,4 и 6,6), S (26,2 и 28,5%), G2 + М (7,1 и 7,8) и практически равнозначные показатели соотношения G2/G1 (1,82 и 1,79) для линий клеток CRFK и FS 30 пассажа соответственно указывают на то, что в популяции указанных культур отсутствуют аномальные клетки с измененным количеством ДНК. С учетом полученных данных можно констатировать, что исследуемые линии клеток CRFK и FS 30 пассажа практически не отличаются от исходных культур клеток как по размерам и гранулярности, так и по распределению ДНК по фазам клеточного цикла и коэффициенту вариации в фазах G1+G0 и G2 + М.

Апоптоз (програмированная клеточная гибель). Показатель ПКГ характеризуется сморщиванием клеток, межнуклеосомной фрагментацией ДНК с последующей деградацией мембран. При оптимальных условиях культивирования ко-

личество клеток находящихся в состоянии апоптоза (ДНК меньше 2п) не должно превышать 20 %. Анализ гистограмм распределения клеток линий кошек в зависимости от содержания ДНК свидетельствует о том, что в культуре клеток CRFK количество апаптотических клеток достигает 19,7%, что характерно для нормально растущей культуры. У линии FS выявлено 21,3% апаптотических клеток, что по-видимому, связано с более длительным пассированием культуры или неадекватными условиями поддержания клеток in vitro. Поэтому для сохранения ростовых свойств и поддержания ПКГ линий клеток кошек на оптимальном уровне созданы эталонный и рабочий банки клеток в жидком азоте с целью последующего использования культур CRFK и FS в практических целях в течение не более 30 пассажей. Исходя из полученных данных, можно утверждать, что тестируемые методом ПЦ линии клеток CRFK и FS находятся в удовлетворительном состоянии и рекомендуются для практического использования.

3.4. Сравнительное изучение чувствительности исходных и деконтамини-рованных от микоплазменной инфекции линий клеток кошек к ВЭН. В результате заражения ПЛК микоплазмами возможны ингибиция роста и дегенерации клеток в культурах, изменения характера обмена веществ и хромосомные аб-берации клеток, а также ингибиция или стимуляция репродукции вирусов (Шней-дер М.А. и др., 1986). С учетом этих фактов оценивали влияние микоплазменной инфекции на уровень накопления штамма "Береговой" ВЭН, предварительно адаптированного к линиям клеток кошек в течение 3-х пассажей. Установлено, что очищенные от МК линии клеток CRFK и FS характеризовались наиболее высокой чувствительностью и обеспечивали максимальное накопление штамма "Береговой" 11,0-12,5 log2 в РГА, по сравнению с исходными культурами (9,6-10,0 log2 в РГА). Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс деконтами-нации оказывает существенное влияние на результативность культивирования ВЭН, так как применение в практике биологически чистых культур более перспективно и оправданно, появляется реальная возможность стандартизации ИБП по активности и безвредности в соответствии с требованиями ВОЗ (1988).

3.5. Влияние некоторых факторов на уровень накопления ВЭН в моно-слойных культурах клеток. В опытах изучали влияние 9 факторов на уровень накопления ВЭН в монослойных культурах клеток кошек. Анализ полученных данных показывает, что результативность культивирования вируса в разной степени зависит от исследуемых факторов. Наибольшее влияние на эффективность культивирования штаммов «Родники» и «Береговой» в линии клеток FS оказывают: концентрация клеток, доза и способ заражения, время адсорбции, качество СК и способ культивирования. Для получения максимальных титров ВЭН определены оптимальные значения факторов: посевная концентрация клеток 100 тыс/мл, заражение в суспензию в дозе 6,0 log? в РГА на мл ПС, время адсорбции вируса клетками не менее 60 мин при 37°С, применение СК не содержащей анти-гемагглютинирующих антител и культивирование вируса роллерным методом. При оптимальных значениях факторов титры ВЭН достигали 12,0-14,0 log2 в РГА, как в экспериментальных, так и производственных условиях. Применение в работе культурального вируса, в качестве посевного, более перспективно, по-сравнению с тканевым вирусом. Это связано с тем, что получение культурального антигена более экономично, он достаточно активен, стабилен в течение 2-х лет хранения при (-40°С), длительно пассируется и накапливается в ПЛК кошек в максимальных титрах.

Для повышения выхода ВЭН целесообразно применять СК животных, содержащие не более 3,0 log2 антигемагглютинирующих антител и питательную среду Игла MEM, к которой линия клеток FS адаптирована в течение длительного периода времени. Следует также отметить, что штамм «Береговой» накапливался в более высоких титрах (14,6 ± 0,01 log2 в РГА), чем штамм «Родники» (12,6+0,33 log2 в РГА). Стабильное изготовление стерильного антигена наиболее эффективно при обязательном использовании энрофлона-К (в дозе 5-10 мг/мл), обладающего выраженными антибактериальными и антимикоплазменными свойствами, что особенно важно при крупномасштабном производстве ПЛК, антигенов и ИБП.

3.6. Серийное пассирование ВЭН в клеточных культурах кошачьего происхождения. Изучали возможность серийного пассирования штамма «Береговой»

в культурах клеток FS, CRFK, СС-81 и ПК. Сравнительные испытания показали (табл.1), что для длительного пассирования наиболее чувствительной является линия клеток FS, обеспечивающая накопление антигена в титрах 12,0-15,0 log? в РГА в течение 25 пассажей и достаточно перспективная, в качестве субстрата, для получения ВЭН в больших объемах.

Таблица 1

Серийное пассирование штаммов «Родники» и «Береговой» ВЭН в перевиваемых линиях клеток кошек

п 05 | | Культуральная модель к 1 = §■0 S-8 м * в « с g. II И * С Ф Накопление вируса в пассажах tog > 1 РГА (п-3)

Номер пассажа

I 5 10 15 20 25

Родники FS 6,0 6 13,6 ±1,2 11,8 ±0,57 10,0 ±0,33 11,0 ±0,57 10,3 ±0,01 10,6 ±0,33

CRFK 10,6 ±0,63 8,3 ±0,33 7,6 ±0,1 9,0 ±0,33 9,6 ±0,08 9,0 ±0,57

Береговой FS 6,0 6 12,6 ±0,33 15,3 ±0,66 14,6 ±0,66 12,6 ±0,01 13,0 ±0,33 12,0 ±0,33

CRFK 11,0 ±0,57 11,0 ±0,57 10,3 ±0,33 10,6 ± 0,83 10,3 ±0,03 10,0 ±0,33

Линия клеток CRFK оказалась менее чувствительной моделью к ВЭН, где штамм «Береговой» накапливался в более низких титрах (10,0-11,0 Icg2 в РГА) на протяжении всех 25 пассажей. Таким образом, в результате сравнительных испытаний, для серийного пассирования ВЭН предложена высокочувствительная культуральная модель FS, обеспечивающая накопление гемагглютинирующего антигена в титрах 12,0-15,0 log2 в РГА в течение 25 пассажей и достаточно перспективная в качестве субстрата для получения вируса в больших объемах. 3.7. Опытно-промышленное производство ВЭН. Основным требованием производства ИБП является получение высокоактивных антигенов с минимальными затратами труда, средств и времени с использованием роллерного метода культивирования ВЭН на установке фирмы Weaton (USA) и пластиковых бутылей объе-

мом 2л фирмы Greiner bio-one (Germany). В бутыли и пластиковые матрасы (фирмы Greiner, объемом 0,6 л) вносили соответственно 300 и 100 мл суспензии линии клеток FS с концентрацией клеток 200 и 100 тыс/мл, ресуспендированных в среде Игла MEM с 2-5% фетальной сыворотки. Культуры заражали во взвесь клеток штаммом «Береговой» в дозе 6,0 Iog2 в РГА на мл суспензии и выращивали в течение 6 суток при 37°С. Экспериментально установлено, что культивирование ВЭН во вращающихся сосудах со скоростью 12 об/час в течение 6 суток было более эффективным и производительным, чем в стационарной культуре FS в пластиковых матрасах. Накопление штамма «Береговой» в роллерных бутылях достигало 14,6±0,01 Iog2 в РГА, в контроле - в матрасах не превышало 12,6 ± 0,33 log2 в РГА. Увеличение ГА активности ВЭН роллерным методом было получено за счет прироста полезной площади бутылей, интенсификации газообмена между клетками монослоя, ПС и газовой фазой, увеличения выхода клеток в 2,14 раза и существенного прироста популяции клеток, чувствительных к вирусу. Во вращающихся сосудах, кроме того, наблюдается практически 100%-ая адгезия клеток и формирование монослоя на 24 часа раньше, чем в контроле. Отмеченные преимущества роллерного метода обеспечили оптимальные условия для репродукции штамма «Береговой» ВЭН, увеличение объемов ГА антигена с активностью не ниже 14,6 log2 в РГА.

3.8. Лиофильное высушивание культурального ВЭН. Стабилизация вирус-содержащих антигенов обусловлена составом защитных сред (ЗС), режимами замораживания и лиофилизации. Экспериментальные данные по сушке культурального ВЭН весьма ограничены (Кобатов А.К., 1998).

В работе для стабилизации культурального штамма «Родники» ВЭН с активностью 12,5 log2 в РГА использовали 4 вида ЗС (обезжиренное молоко - ОМ, Среда ВГНКИ-№3, Среда №2 и Среда №4), оптимальные режимы замораживания и лиофилизации. Эксперименты проведены на базе ФГУ «ВГНКИ» совместно с к.б.н. Ю.Г. Опариным.

Полученные образцы ВЭН были представлены в форме аморфных «таблеток» светло-желтых тонов, не содержали «кратеров» и «каверн», имели цилиндриче-

скую форму и легко отделялись от стекла при встряхивании. Остаточная влажность сухих препаратов не превышала 3%. Стабильность ГА свойств сухих и жидких образцов вируса оценивали при температуре 20 и 37 С.

Статистическая обработка полученных результатов выполнена на ЭВМ совместно с ЕА Рубаном и ТА Скотниковой.

Установлено, что максимальным защитным эффектом характеризовалась ЗС №2. Снижение активности вируса у образцов с оптимальной ЗС составило в результате высушивания 0,5 в РГА, у других вариантов - 0,9 в РГА Результаты термоинактивации сухих образцов ВЭН при разных температурах подтвердили перспективность применения в практике стабилизатора №2. Анализ результатов термоинактивации сухих препаратов методом регрессивного анализа показал, что снижение ГА штамма «Родники» имеет линейный характер, зависит от температуры, времени и описывается уравнением первого порядка.

Выявленная закономерность позволила использовать показатели константы скорости инактивации (Кт) для количественной оценки стабильности образцов препарата, а также определения эффекта защиты (Эз), создаваемого различными стабилизаторами (табл.2).

Таблица 2

Оценка влияния защитных сред на стабильность сухих образцов штамма «Родники» вируса интерита норок

Температура хранения °с Наименование показателей Наименование ЗС

Без стабилизатора (контроль) ОМ Среда ВГНКИ-3 Среда №2 Среда №4

I II III IV V

20 К20(1/сут) 0,17 0,092 0,0348 0,029 0,0565

Эз - 4,9 5,9 3,0

37 К37(1/сут) 0,31 0,31 0,79 0,038 0,084

Эз - 1,0 3,9 8Д 3,7

Показатели: Кт - константа скорости инактивации ВЭН (приведены абсолютные значения по казателя без знака «минус») Эз - эффект защиты (определяется по соотношению Кт вируса высушенного без стабилизатора к Кт вируса лиофилизированного с стабилизатором).

При температуре 20 и 37°С показатели Кт и Эз для ЗС №2 были оптимальными на уровне 0,29 и 5,9; 0,038 и 8,2. Среды ВГНКИ - №3 и №4 характеризовались менее выраженным защитным эффектом как при 20°С (Эз 4,9 и 3,0), так и 37°С(Эз З,9иЗ,7).

Лиофилизированный штамм «Родники» с ЗС №2 сохранялся на исходном уровне в течение 2-х лет хранения при минус 20°С. В условиях бытового холодильника и в замороженном состоянии (при -20°С) нативный ВЭН инактивиро-вался в аналогичный период соответственно с 12,3 до 7,6 и 10,2 1с®2 в РГА. Полученные факты свидетельствуют о стабильности свойств и перспективности длительного хранения культурального штамма «Родники» ВЭН как в нативном, так и в лиофилизированном состоянии.

3.9. Изучение физико-химических свойств ВЭН.

Очистка, концентрирование и электроннаямикроскопия препаратов ВЭН. В результате очистки и концентрирования культуральных образцов штамма "Береговой" ВЭН различного уровня пассажа комбинированным методом (осаждение ПЭГ-6000, обработки хлороформом и центрифугирование в градиенте сахарозы-хлористого цезия) были выделены 2 фракции - нижняя (1,42-1,43 г/см3) и верхняя (1,30 - 1,34 г/см3). Нижняя фракция была подвергнута дополнительно диализу против 8ТЕ буфера в течение 12 часов и затем сконцентрирована высокоскоростным центрифугированием в 103'8 раза. В результате экспериментов не установлено существенной разницы в показателях степени очистки (99,8%) от балластных белков, уровне концентрирования как по общему белку (1,6 мг/мл), так и по ГА активности (1,0х103ГАЕ) культурального антигена 5 и 25 пассажей в культуре что подтверждает эффективность использованных методов и равноценность испытанных образцов вируса.

Методом электронной микроскопии в сконцентрированных и очищенных препаратах были выявлены 109-1010 преимущественно неповрежденных вирусных частиц диаметром 24-25 нм. Количество дефектных частиц и пустых капсидов было невелико. Вирусные капсиды состояли из 60 капсомеров и имели икосаэд-рическую структуру с характерными выступами, длиной 3-5 нм. Анализ морфоло-

гической характеристики частиц свидетельствует о том, что по структуре они соответствуют парвовирусам плотоядных.

Изучение структурных компонентов вирионов, количества и величины отдельных молекул культурального антигена ВЭН 5 и 25 пассажей проводили методом электрофореза в 7%-ом ДСН-ПААГе. В результате исследований выявлены вирусспецифические белки, характерные для зрелого вириона и определена их молекулярная масса: А - 77,7; В-63,5; С - 61,5 и D -53,9 кДа Большого протеина - предшественика (199,5 кДа) в треке вирусных протеинов не выявлено. Таким образом с помощью электрофореза достигнуто разделение всех описанных для ВЭН протеинов (Garman P.S. et.al., 1983), что подтверждает эффективность выбранной методики и свидетельствует об отсутствии значимых отличий в количестве и электрофоретической подвижности белков ВЭН 5 и 25 пассажей.

Выделение, очистка ДНК и анализ генома ВЭН В работе использовали метод электрофореза с целью получения доказательств принадлежности образцов к парвовирусам плотоядных и установления стабильности генома в процессе длительного пассирования штамма «Береговой».

Для сохранения нативности ДНК эффективно использован метод выделения нуклеиновой кислоты с помощью протеиназы К. В результате была получена од-ноцепочечная вирусная ДНК, которую затем анализировали методом электрофореза в 1,5%-ом агаровом геле, содержащем 20% формамида. На полученной форе-грамме было достигнуто разделение ДНК маркера и вируса. В треках образцов вирусной ДНК выявлена единственная фракция, соответствующая по величине примерно 5,1 тысяч нуклеотидов, что характерно для группы парвовирусов (Zhao X. et.al., 1993). В данных треках наблюдался также легкий шлейф низкомолекулярной ДНК возникший, вероятно, из-за частичной деградации образцов вирусного генома во время выделения и очистки нуклеиновой кислоты.

3.10. Антигенные и иммуногенные свойства ВЭН различного уровня пассажей в культуре клеток FS.

В работе преследовали цель доказать возможность применения культурального штамма «Береговой» различного уровня пассажа в культуре клеток FS для из-

готовления нативных и инактивированных формалином образцов антигенов против ВЭН. В качестве контроля были испытаны аналогичные образцы антигенов из тканевого вируса. Опытные и контрольные препараты с активностью 10,0 1с^2 в РГА вводили кроликам внутримышечно в объеме 1 мл. Антигенную активность препаратов оценивали по динамике уровня гемагглютинирующих антител в сыворотках крови опытных и контрольных кроликов.

Показано, что исходные титры антител в СК интактных кроликов не превышали 1,0-2,0 Отмечено также, что по антигенным свойствам нативные и инактивированные формалином образцы антигенов из культурального штамма «Родники» ВЭН 5 и 25 пассажа были равноценными по активности и существенно не отличались от аналогичных препаратов тканевого происхождения. Титры антител в СК кроликов на 7 сутки после иммунизации были на уровне 5,0-5,5 к^2, к 14 суткам возрастали до 7,0-8,0 и к 21 дню достигали максимальных значений 9,0-10,0 Динамика антительного ответа в опытах с контрольными образцами тканевых антигенов была идентичной, отличаясь абсолютными значениями показателей титра антител не более, чем на 0,1

Иммуногенные свойства штамма «Береговой» ВЭН изучали на норках. Были сформированы 4 группы по 4 норки. Первая и вторая группы были иммунизированы инактивированным культуральным вирусом штамма «Береговой» 5 и 25 пассажей.Третья группа иммунизирована вакциной «Минвак» против чумы энтерита, ботулизма и псевдомоноза. В качестве контроля служила четвертая группа норок, которым вводили ФБР. Иммуногенность оценивали на 21 день по степени устойчивости норок к контрольному заражению вирулентным вирусом штамма «Береговой» с активностью 15,0 к)^ в РГА. Результаты представлены в таблице 3.

Испытания показали, что однократное введение препаратов вызывало у трех групп формирование вируснейтрализующих антител. Через 21 день после вакцинации было проведено экспериментальное заражение вакцинированных и контрольных животных вирулентным штаммом «Береговой». На протяжении всего срока наблюдения у вакцинированных норок не было отмечено отклонений от

физиологических норм в отличие от контрольных животных, у которых регистрировали клинические признаки, характериные для вируса энтерита норок. Из 4 контрольных норок после заражения на 5-6 сутки заболели все норки. Таким образом, препарат, приготовленный из культурального вируса 5 и 25 пассажей, обладает выраженными иммуногенными свойствами.

Таблищ 3

Иммуногенные свойства штамма «Береговой» различного уровня пассажей

Характери- Актив- Доза введения (мя) Коли- Результаты заражения на 21 сутки после иммунизации

№ групппь стика препарата Пассаж ность вируса Log: в РГА чество норок Штатi вируса Активность вируса logi в РГА Заболело Выжгто

1 Культураль- 5 4 0 4

2 ный вирус 25 8,0 4 0 4

3 Вакцина «Минвак» • - 1,0 4 1« 8. 15,0 0 4

4 Контроль - - 4 И д W 4 0

Анализ полученных результатов показывает, что в процессе 25-ти кратного пассирования в культуре FS, штамм «Береговой» сохраняет на исходном уровне выраженные антигенные и иммуногенные свойства, что указывает на перспективность и практическую пригодность аттестованной культуральной модели FS для получения ВЭН в промышленных объемах.

4. ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг первичной и перевиваемых линий клеток кошек, собак и норок. Установлена различная чувствительность перевиваемой линии клеток FS к вирусу энтерита норок. Наибольшей репродуктивной активностью характеризовался штамм "Береговой".

2. Разработан эффективный метод деконтаминации линий клеток кошачьего происхождения от микоплазм при помощи моно- и комбинированного препаратов на основе энрофлона-К и поверхностно-активных веществ. Изготовлены и паспортизированы эталонные и рабочие банки линий клеток FS и CRFK. После криоконсервирования линии клеток сохраняли ростовые свойства и чувствительность к вирусу энтерита норок.

3. Предложены оптимальные условия культивирования штамма «Береговой» вируса энтерита норок в культуре клеток FS стационарным и роллерным методами культивирования. Максимальное накопление вируса (14,6 ±0,01 log2 в РГА) происходит при посевной концентрации клеток 100 тыс/мл, заражении в суспензию из расчета 6,0 log2 в РГА, использовании питательной среды Игла MEM с 2% фетальной сывороткой крови и адсорбции вируса в течение 60 минут при 37°С.

4. Оптимизированы технологические параметры роллерного метода культивирования вируса энтерита норок. Установлено, что размножение вируса в линии клеток FS во вращающихся сосудах является более технологичным и производительным и обеспечивает двукратное увеличение гемагглютинирующей активности антигена, по сравнению с методом стационарных культур клеток.

5. Разработан метод очистки и концентрирования культурального вируса энтерита норок. Показано, что по размерам и морфологии частиц, характеристике белков и ДНК образцы вируса 5 и 25 пассажей, репродуцированные в культуре клеток FS, практически не отличались и соответствовали показателям парво-вирусов плотоядных.

6. Установлено, что штамм «Береговой» вируса энтерита норок 5 и 25 пассажей, культивируемый в линии клеток FS, обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами и при однократном введении кроликам вызывает на 21 сутки образование в сыворотке крови кроликов антигемагглютинины в титрах 9,0-10,0 log2. Вакцинированные инактивированными образцами вируса норки были устойчивы к заражению вирулентным штаммом «Береговой» вируса энтерита норок.

7. Установлено, что лучшим стабилизатором для лиофилизации культурального штамма «Родники» вируса энтерита норок, является среда № 2 на основе лактозы 5%, пептона 5% и солей фосфатов калия (0,15 М). Лиофилизированный вирус с защитной средой №2 сохранял иммунобиологические свойства в течение 2-х лет хранения при температуре -20 °С, а так же при температуре 4-8 °С.

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для практического использования предлагаются:

- «Методические рекомендации по поддержанию, хранению и контролю линии клеток ББ", утвержденные директором ФГУ «ВГНКИ» от 02.03.2004г.

- эталонный и рабочий криобанки линии клеток ББ, пригодные в качестве субстрата для крупномасштабного культивирования ВЭН, а так же для производства диагностических и вакцинных препаратов.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Батракова Т.В. Разработка оптимальных условий культивирования вируса энтерита норок в перевиваемых линиях клеток // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. докладов Междунар. конф. молодых ученых. - Щелково. - 2001. - С. 55-59.

2. Батракова Т.В., Груздев К.Н., Ночевный В.Т., Хайдуков СВ. Некоторые аспекты стандартизации и применения линий клеток кошек в качестве субстрата для получения вируса энтерита норок // Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства. Мат. Междунар.научно-практ. конф., посвященной 80-летию ВНИИОЗ (28-31 мая 2002 г.). - Киров. - 2002. - С.536-537.

3. Батракова Т.В., Ночевный В.Т., Груздев К.Н. Некоторые аспекты стандартизации линий клеток кошек методом проточной цитометрии // Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства России. Мат. метод, научно-практ. конф., посвященной 70-летию ГНУ НИИ ПЗК им. ВА Афанасьева. - Пос. Родники. -2002. -С.211-213.

4. Батракова Т.В., Перевозчикова НА, Ночевный В.Т., Груздев К.Н. Изучение биологических и физико-химических свойств различных пассажей вируса энтерита норок // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Мат. Междунар. научно-практ. конф., посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ. - Владимир. - 2003. - С. 496-497.

5. Батракова Т.В., Литенкова И.Ю., Груздев К.Н., Фомина ТА, Ночевный В.Т. Сравнительное изучение антигеной активности культуральных штаммов вирусов энтерита собак и норок // Ветеринарная патология. - 2003. - №1. - С. 119120.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», Тираж__экз., март 2005 г.

22 MAP 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ночевная, Татьяна Владимировна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Энтерит норок (историческая справка).

2.2. Физико-химические и биологические свойства вируса энтерита морок.

2.3. Культуральные свойства вируса энтерита норок.

2.4. Некоторые аспекты стандартизации перевиваемых линий клеток.

2.6. Стабилизация вирусов методом лиофильного высушивания.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств"

Вирусный энтерит норок (ВЭН) - одно из наиболее распространенных острозаразных заболеваний пушных зверей. Экономический ущерб, наносимый звероводству ВЭН, складывается из гибели молодняка норок (до 90%), нарушения функции воспроизводства, а также значительных затрат на вете-ринарно-санитарные мероприятия. Существенное место в борьбе с ВЭН занимает специфическая профилактика (27,43, 4, 83, 37,49, 140, 138).

За последние десятилетия ХХ-го века накоплен обширный материал по созданию противовирусных препаратов нового поколения: векторных, маркированных и синтетических. Однако, несмотря на значительные перспективы применения указанных видов вакцин, реальным на сегодняшний день остается профилактика ВЭН препаратами, изготовленными по традиционной технологии, с использованием первичных культур клеток ночек котят (27, 32, 25, 44, 103, 102, 21, 177, 186, 199). Необходимо, однако, отметить, что применение данной культуральной модели не перспективно по экономическим показателям, из-за сезонности получения доноров ткани, необходимости убоя котят, трудоемкости и длительности процесса трипсинизации ткани почек, опасности эндогенной контаминации суспензии клеток различными микроорганизмами и низкой производительностью метода стационарных мо-нослойных культур, а также невозможностью длительного пассирования вируса in vitro (89, 20,178).

Известно, что за последние 10-15 лет во всем мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток, в качестве субстрата, для производства противовирусных препаратов. Необходимо отметить, что используемые в практике линии клеток собак, кошек и норок характеризуются различной чувствительностью и не обеспечивают длительного поддержания ВЭН в пассажах (91, 80, 44, 102 ).

Тем не менее, при общей тенденции более широкого применения Г1ЛК в биотехнологии, существует целый ряд нерешенных и малоизученных прог, блем, тормозящих процессы разработки и совершенствования противовирусных препаратов, и в частности, вакцин против ВЭН. Важное место в решении этих задач занимают вопросы: выбора, контроля и стабилизации свойств новых высокочувствительных к ВЭН культуральных моделей, совершенствования технологии и длительности культивирования ПЛК и штаммов ВЭН в больших объемах, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, стабилизации свойств и условий хранения штаммов вируса, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур и противовирусных препаратов от бактерий и микоплазм (21, 59, 17, 91, 92, 127, 190).

Поэтому исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенные в качестве субстрата для получения ВЭН с выраженными антигенными свойствами представляют для науки и практики бесспорную актуальность.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлась оптимизация условий культивирования вируса энтерита норок в культуре клеток и изучение его биологических свойств.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительное изучение чувствительности первичных и перевиваемых линий клеток к штаммам ВЭН и отобрать наиболее перспективные из них ддя серийного пассирования вируса;

- деконтаминировать отобранные линии клеток от микоплазм и оптимизировать культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и рол-лерного культивирования;

- изучить физико-химические, антигенные и иммуногенные свойства куль-турального ВЭН различного уровня пассажей.

- определить условия стабилизации и хранения культурального ВЭН; Научная новизна. Определена и охарактеризована наиболее чувствительная к ВЭН линия клеток FS и доказана ее пригодность для получения активного гемагглютинирующего антигена в течение 25 пассажей.

Разработана рациональная схема деконтаминации ПЛК кошек от мико-илазменной инфекции при помощи фторхинолонов.

Оптимизировано культивирование клеток и вируса в условиях стационарного и роллерного культивирования.

Впервые показана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для изучения популяции линий клеток кошачьего происхождения, используемых в качестве субстрата для размножения вируса.

Практическая значимость. Предложена культуральная модель FS и оптимальные условия серийного пассирования ВЭН стационарным и роллер-ным методами.

Создан криобанк из линии клеток FS, очищенной от микоплазм.

Разработаны «Методические указания по поддержанию, хранению и контролю линии клеток FS», утвержденные дирекгором ФГУ «ВГНКИ» от 02. 03. 2004 г.

Предложены защитная среда оптимального состава, режимы лиофилп-зации и хранения сухих форм культурального вируса энтерита норок.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» в 2000-2004 гг.; международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - г. Щелково, 2001 г.; методической научно-практической конференции «Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства», посвященной 70-летию ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева, п. Родники Московской обл., 2002 г.; международной научно-практической конференции «Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства», посвященной 80-летию ВНИИОЗ. - г.Киров, 2002г.; международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ. - г.Владимир, 2003 г.; международной научной конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине». - г.Москва, 2003 г.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- теоретическое и практическое обоснование выбора ПЛК селезенки кошки (FS) и почки кошки (CRFK) для серийного пассирования ВЭН;

- практические предложения по очистке ПЛК кошек от микоплазменной контаминации при помощи фторхинолонов;

- способ и условия культивирования ВЭН в лабораторных и промышленных условиях;

- физико-химические свойства культурального ВЭН различных пассажей;

- условия стабилизации культурального ВЭН методом лиофильного высушивания.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Ночевная, Татьяна Владимировна

6. выводы

4. Оптимизированы технологические параметры роллерного метода культивирования вируса энтерита норок. Установлено, что размножение вируса в линии клеток FS во вращающихся сосудах является более технологичным и производительным и обеспечивает двукратное увеличение гемагглютииирующей активности антигена, но сравнению с методом стационарных культур клеток.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для практического использования предлагаются:

- «Методические рекомендации по поддержанию, хранению и контролю линии клеток FS", утвержденные директором ФГУ «ВГНКИ» от 02.03.2004г.

- эталонный и рабочий криобанки линии клеток FS, пригодные в качестве субстрата для крупномасштабного культивирования ВЭН, а так же для производства диагностических и вакцинных препаратов.

Заключение

Сравнительный анализ данных литературы свидетельствует о том, что лишь незначительное количество работ посвящено комплексному изучению культуральных, антигенных, физико-химических свойств и вопросов стабилизации ВЭН методом лиофильного высушивания. Реализация этих задач будет способствовать решению одной из наиболее важных проблем биотех пологий - созданию эффективных, безопасных и стабильных при хранении вакцин для звероводства.

Данные литературы подтверждают, что особое внимание авторов концентрируется на вопросах культивирования ВЭН. В опытах прослеживается зависимость репродукции вируса от состояния клеточного ядра: инфицируются только те клетки, которые находятся в состоянии активного митоза. Поэтому инфицирование культур следует проводить в суспензию клеток. Первостепенной задачей при разработке и производстве вирусных препаратов является выбор высокочувствительной культуры клеток и отработка оптимальных условий выращивания вируса. Оцениваются также вопросы контаминации и чувствительности культур клеток к вирусам, доступности источников ткани в любое время года, потенциальные возможности и перспективность использования клеточного субстрата, а также влияние клеточной культуры на антигенные и иммуногенные свойства в процессе серийного пасси-ровапия вирусов. Показано также, что успешное культивирование вируса наиболее перспективно в линиях клеток кошачьего происхождения, где ге-магглютинирующие свойства ВЭН сохранялись в течение 4-5 пассажей. Однако получаемые при этом антигены имели незначительную активность (5,0 -9,0 log2rAE), что, вероятно, связано с низкой чувствительностью или иеои-тимальпыми условиями культивирования вируса. Эти факты являются основанием для поиска более чувствительной культуральной модели, пригодной для серийного пассирования ВЭН и получения антигенов с максимально высокими титрами.

Изучение микоплазменной инфекции культур клеток, рекомендуемых в последние годы, в качестве субстрата для производства противовирусных препаратов и БАВ представляет для науки и практики несомненный интерес. Это связано с тем, что микоплазменная инфекция оказывают существенное влияние на результативность вирусологических, биохимических, цитогени-ческих и иммунологических исследований.

Наиболее широко для очистки линий клеток от микоплазмепной инфекции применяют антибиотики, ингибирующие синтез белка, РНК и ДИК. В то же время мпогочислепыми исследованиями показано, что многие антибиотики термолабильны, токсичны и недостаточно эффективны, а при длительном применении способствуют образованию антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов. Эти факты и послужили основанием для поиска более эффективных средств и методов профилактики и деконтаминации ПЛК от микоплазм. Наиболее перспективными в этом плане считают препараты фтор-хпполопового ряда. Следует, однако, отметить, что препараты этого класса в вирусологии практически не используются. В тоже время ФХЛ умеренно токсичны, стабильны в течение длительного периода времени при температуре 37°С, легко проникают через клеточные мембраны, практически не связываются с белками и проявляют бактерицидные свойства в отношении широко спектра микроорганизмов-контаминантов. Литературные данные и практические предложения по затронутым проблемам весьма ограничены. Поэтому вопросы предварительного отбора и изучения эффективности препаратов фторхинолонового ряда, а также разработки рациональных схем профилактики и деконтаминации ПЛК от микоплазменной инфекции представляют для вирусологической практики бесспорную актуальность.

Практического решения требуют и вопросы стабилизации вирусных антигенов методом лиофилизации. К сожалению, сведения об оптимальных условиях лиофилизации ВЭН весьма ограничены. Поэтому с учетом данных литературы целесообразно было бы подобрать ЗС, изучить режимы лиофилизации и условия длительного хранения сухих препаратов ВЭН.

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы

Работа выполнена в 2000-2003 гг. в лаборатории "Культур тканей, питательных сред и растворов" и "Отделе вирусных ветеринарных препаратов" ФГУ «ВГНКИ» ветеринарных препаратов.

3.1.1. Культуры клеток

Первично-трипсинизированная культура клеток почки котенка (ПК);

Перевиваемые линии клеток: почки кошки (CRFK), селезенки кошки (FS), фибробластов эмбриона кошки (CC-8I), почки американской норки (mVILu), почки собаки (МДСК) хранящиеся в музее клеточных культур в условиях жидкого азота.

3.1.2. Питательные среды и растворы

- Игла MEM без глютамина; среда 199; ГЛА на растворе Хенкса и раствор Хенкса (рН 7,2-7,4);

- сыворотки крови: крупного рогатого скота (КРС), телят и фетальную фирмы "Sigma"(CUlA);

- забуфереппый физиологический раствор (ЗФР) рН 7,2-7,4; 3% раствор глютамина, диметилсульфоксид (DMSO);

- 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор версена.

3.1.3. Фторхинолоны (ФХЛ)

В работе были использованы: энрофлон-К (ТУ 934343-016-4761190000), изготовленный на основе энрофлоксацина в дозе 5-10 мкг/мл и 2 комплексных препарата на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и энрофлона-К (35 мкг/мл) с поверхностно-активными веществами. Общие сведения об испытанных ФХЛ представлены выше (табл. 1). Маточные растворы Энрофлона-К (Э-к) и норфлоксацина (Н) в концентрации 10000 мкг/мл готовили с использованием в качестве растворителя диметилформамида. Растворы хранили не более 3 месяцев при температуре 4-6°С. Маточные растворы ФХЛ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ночевная, Татьяна Владимировна, Москва

1. Андреева Е.П., Иванова Е.В., Стукалова Н.П. Изучение механизма влияния сахарозы на процесс гидратации b-двух и трех Са силикатов в разбавленных суспензиях // Коллоидная теория.-1980.-Т.42,№1 .-С.3-10.

2. Апоптоз: начало будущего / Маянский А.Н., Маянский Н.А., Абаджиди М.А., Заславская М.И.//Журн. микробиол.-1997.-№2.-С.88-94.

3. А.с. 1761000 СССР, МКИ5 С 12N 7/00. Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе культурального вируса венесуэльского энцефаломилита лошадей / Гусев Ю.М., Фролов В.Г., Жуков В.А. и др.

4. Букина Н.С. Вирусный энтерит норок. Парвовирусный энтерит // Кролиководство и звероводство.-1993 .-№1.-С.23.

5. Вахромеева В.В. Антигенная структура и анализ межштаммовых различий парвовирусов плотоядных: Дис. канд. биол. наук.- Покров, 2000.

6. Веиедягип Г.В. Общая методика экспериментального исследования и обработки опытных данных. М.: Колос, 1973.-199с.

7. Вишневская В.И. Механизмы повреждения и криопротекции биологических структур.-Киев, 1977-С.11-12.

8. Вирусные болезни животных / СюринВ.Н., Самуйленко А .Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. М.: ВНиТИБП.- С.586-588.

9. Восприимчивость соболей к вирусному энтериту норок и ботулизму / Аулова С.В., Букина Н.С., Кириллов А.К., Слугин B.C. //Ветеринария.-1989.-№.9.-С.28-30.

10. Голубев Д. Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии,- Д.: Медицина, 1976.- 224с.

11. П.Грачев В.П., Петриччиани Д. Оценка перевиваемых клеточных линий, как субстрата, для производства биологически активных веществ //ЖМЭИ.-1985.-№2.-С.276-277.

12. Грейфф Д. Факторы, влияющие на устойчивость биологических материалов // Аннотации зарубежн. докл.: 14 метод. Конгр. по холоду.- М., 1975.-С.177.

13. Гриве Р. Лиофилизация вирусов: Доклад на симпозиуме по лиофилизации.-Лион, 1968.

14. Н.Данилова Е.П. Болезни пушных зверей.-Изд.З-е.-М.: Колос, 1984.-С. 87.

15. Демидова С.А., Ритова Н.М. Контаминанты клеточных культур // Вопр.вирусол.-1974 .-№5 .-С.521-527.

16. Доссер Е.М. Метод культуры тканей применительно к вирусологии/Итоги науки и техники. ВИНИТИ.- М., 1970.

17. Дьяконов Л.П., Поздняков А.А., Гололобова М.Т. Результаты исследований по диагностике микоплазма-контаминации и деконтаминации культур клеток // Тр. ВИЭВ.-1981.-Т.53.-С.63-67.

18. Дубовая Р.Г. К вопросу о биологических свойствах вируса энтерита норок // Науч.тр. НИИПЗК.- 1972.- Т.П.- С.373-379.

19. Дубовая Р.Г. Экспресс-диагностика вирусного энтерита норок с помощью реакции диффузной преципитации в агаровом геле. Кролиководство и звероводство, 1977.-№2.

20. Дурыманов А.Г., Шестопалов А.В. Новая перевиваемая культура клеток почки кошки (ПК-91), перспективная для репродукции парвовирусов плотоядных // Биотехнология.-1999.- №6.-С.42-44.

21. Егорова А.И., Морозов Н.В., Фоменко В.Ю. Изучение культуральных свойств возбудителей болезней плотоядных, входящих в состав ассоциированных вакцин// Золотое кольцо России: Матер. IV региональн. Конф., Владимир, 2001.-С.41.

22. Епифанова О.И., Полуновский В.А., Терских В.В. Регуляция размножения клеток в процессе специализации, старения и неопластической трансформации // Итоги науки и техники: ВИНИТИ,Т. 11., М.,1988.

23. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. М.: Компания Спутник+, 2000.-400с.

24. Каган Г.Я., Раковская И.В. Микоплазма-инфекция в культурах клеток.-Л.-.Медицина, 1968.-173с.

25. Карпухина О.Г. Энрофлон-К как средство для профилактики и декон-таминации клеточных культур и иммунобиологических препаратов от бактериальной и микоплазменной инфекции: Дис. канд. мед. наук. -М., 2003.

26. Кириллов А.К., Егоров А.А. Вирусный энтерит норок // Ветеринария.-1971.-№4.- С.60-63.

27. Кириллов А.К. Внутриклеточные включения при вирусном энтерите норок // Науч. тр. НИИПЗК.- 1972.- Т.П.- С.363-369.

28. Кириллов А.К. Выделение вируса энтерите норок в культуре тканей // Конф. молодых ученых по звероводству и кролиководству НИИПЗК.-М., 1973.- Вып.1.- С.150-152.

29. Кириллов А.К. Применение метода флуоресцирующих антител для изучения вируса энтерита норок// Матер. VI Всесоюз. конф. по пагана-томии животных. Тарту, 1975.- C.149-15I.

30. Кириллов А.К. Цитопатология культур клеток ири заражении их вирусом энтерита норок // Актуальные проблемы вет. вирусологии НИ-ИПЗК.- М., 1978.- Вып.5,- С.192-195.

31. Кириллов А.К., Сулимов А.А., Селиванов А.В. Изучение восприимчивости животных к вирусу энтерита норок // Тез. III Всезоюз. Науч. конф. по биологии и патологии пушных зверей.- Петрозаводск, 1981.-Т.2.- С.284-285.

32. Кириллов А.К. Применение реакций гемагглютинации и задержки ге-магглютииации для диагностики вирусного энтерита норок // Биология и патология пушных зверей: Тез. докл. III Всесоюз. науч. конф.- Петрозаводск, 1981.-С. 14-15.

33. Кириллов А.К. Профилактика вирусного энтерита и ботулизма норок // Кролиководство и звероводство. 1998.-№1 .-С.23-26.

34. Кириллов А.К. Вирусный энтерит норок // Кролиководство и звероводство.- 2000.- №5.- С.24-25.

35. Кобатов А.И., Виноходов В.О., Виноходов Д.О. Сублимационное высушивание вирусных препаратов // Приложение к тому I (48) «Архив ветеринарных наук».-СПб; Ломоносов, 1998.

36. Ковальская Л.А. Защитная среда для вирус-вакцины против ньюкасл-ской болезни птиц (штамм Ла-сота): Автореф. дис. .канд. биол. наук. -М., 1986.-16с.

37. Колышкин В.М. разработка и совершенствование средств диагностики, профилактики и терапии при чуме плотоядных: Дис. канд. Биол. Наук.-М., 1999.

38. Коллир Л.Х. Соответствующая технология изготовления лиофилизиро-ванной оспенной вакцины // Хроника B03.-1980.-T.34, №9.-С.434-435.

39. Комарова Г.А. Производственное испытание ассоциированной вакцины против псевдомоноза и вирусного энтерита норок // Конф. молод, ученых. -М.,1985.-С.8.

40. Культивирование вируса энтерита норок в культурах клеток / Борисов А.В., Старов С.К., Хлыбова Т.В., Куляшбекова Ш.К. // Вирусные болезни с.-х животных: Тез. докл. науч.-практ. конф./ВНИИЗЖ.-Владимир, 1995.-С.79.

41. Культура клеток и тканей животных / Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А. и др.: Учебно-методическое пособие.-Ставроноль: Ставропольская правда, 1980.- 112 с.

42. Кушнир С.Д., Юрков С.Г., Зубаиров М.М. Опыт использования пеф-локсацина для деконтаминации клеточных культур от микоплазм // Ди-агн. профил. и меры борьбы с особо опасными болезнями животных: Матер. Междунар. конф. Покров, 1998.-С. 125-126.

43. Лакин Г.Ф. Биометрия.-М.: Высш. Школа, 1990.-352 с.

44. Левашев B.C., Цилинский Я.Я. Загрязнение культур тканей плевропневмонией подобными организмами (PPLO) // ЖМЭИ.-1964.-.N^4.-C.lI5-l18.

45. Литвинов A.M., Яременко H.A. Контагиозные болезни пушных зверей и их профилактика // Ветеринария, 1998. №11. - С.3-5.

46. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-187 с.

47. Методические рекомендации по получению, культивированию и использованию в производственных ветеринарных лабораториях первичных, перевиваемых и диплоидных культур клеток животного происхо-ждения.-Одобрены ГУВ МСХ СССР 26 января 1978 г, №116-8.

48. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания -высушивания биологических препаратов / Звягин И.В., Хорьков И.А., Токарик Э.Ф. и др. М.,-1981.-34с.

49. Методические рекомендации по лиофилизации различных групп вирусов для целей длительного хранения / Селезнева А.Ю., Фадеева А.А., Николаева О.В. и др. М., 1982.-38 с.

50. Морити Т. Обезвоживание живых клеток замораживанием // Рейто рефриджерэйшн.- 1973.- Т.48, №549.- С.723-730.

51. Мораска Л., Эрба Э. Проточная цитометрия // Культура животных клеток. Методы.- М., 1989.- С.182-213.

52. Нежута А.А. Экспериментальное обоснование и совершенствование режимов сублимационной сушки биопрепаратов: Автореф. дис.канд. техн. наук. Одесса, 1981.-25с.

53. Некоторые биологические и физико-химические свойства вируса энтерита норок / Зеленов Е.Ю., Сулимов А.А., Николаева Н.П., Могильный Ю.И.; Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными организмами. Тез. конф.: Канев, 1982.-С.42-49.

54. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. -М.: Колос, 1971.-342 с.

55. Новохатский Л.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии // Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. Сер. Вирусология.-1979.-Т.8.- С.3-134.

56. Ночевный В.Т., Хайдуков С.В. Культура клеток кожи перепелиных эмбрионов // Аграрная наука.-2001.-№6.-С.22-24.

57. Ночевный В.Т., Виолин Б.В., Карпухина О.Г. Влияние фторхинолонов на репродукцию некоторых вирусов// «Золотое кольцо России»: Матер. IV региональн. конф., Владимир, 2001:-С.29.

58. Ночевный В.Т., Новохатский А.С., Карпухина О.Г. Профилактика и методы деконтаминации клеточных культур от бактерий и микоплазм при помощи фторхинолонов (обзор) // Клеточные культуры. Информ. бюл. СПб, 2002.-Вып.17.- С.9-15.

59. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Фторхинолоны.- М.: Биоинформ, 1995.-208с.

60. Париж Б.М., Балик Р.Л., Парубель А.А. Изучение стабильности лиофи-лизированного вируса гриппа // Матер. XXII науч. сессии ин-та вирусологии АМН СССР.-М., 1964.-Т.2.- С.23-24.

61. Перспективы использования метода проточной цитометрии для стандартизации перевиваемых линий клеток / Ночевный В.Т., Колышкин

62. B.М., Попов В.Ф., Хайдуков С.В.// Актуальн. Пробл. Инфекц. Патологии животных: Матер. Междун. науч. конф.- Владимир, 2003.-С.498.

63. Поздняков А.А. Размножение некоторых вирусов в суспензии трипси-низированных клеток ткани куриного эмбриона: Дис. канд. биол. наук. -М., 1966.

64. Поздняков А.А., Хорков И.А. Современные методы культивирования клеток животных // Бюл. ВИЭВ.- 1983.- Вып.49.- С.21-26.

65. Поляков А.А. Ветеринарная дезинфекция.- Изд.4-е.- М.: Колос, 1975.

66. Полетаев А.И. Проточные системы и автоматические сортировщики // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Цитология- М., 1985.-Т.4,1. C.101-117.

67. Полетаев А.И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии , биотехнологии и медицине // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Общие проблемы физико-химической биологии.-М., 1989, Т.12.-С.З-87.

68. Полетаев А.И., Гнучев Н.В., Зеленин А.В. Проточная цитометрия и сортировка клеток: современное состояние и перспективы использования в молекулярной биологии // Молекулярная биология. 1987, T.2I, Вып.1.- С.23-27.

69. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. Влияние микоплазменной контаминации и деконтаминации с помощью ципрофлоксацина на кариотипиче-скую структуру клеточной линии легкого китайского хомячка V-79 // Цитология.-1993.-Т.35,№8.-С.71-78.

70. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Артамонова Т.Н. электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в неконцентрированпых ви-руссодержащих суспензиях // Вестник РАСХН.-2002.-№2.-С.74-77.

71. Раковская И.В. Биологическая характеристика микоплазм-контаминантов тканевых культур: Дис. канд. мед. наук.- М., 1966.-215с.

72. Саутина Т.Д. Определение восприимчивости новорожденных белых мышей и белых крыс к вирусному агенту, выделенному от больных энтеритом норок // Науч. тр. Ленинградского вет. ин-та. 1975.-Вып.40.-С.113-115.

73. Сафронская Н.З. Сравнительная оценка методов выделения вируса энтерита норок и котят // Сб. науч. работ по пушному звероводству и кролиководству. М., 1967.- С.49-51.

74. Сергеев В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани.- М.: Колос, 1966.-311с.

75. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных.- М.: Колос, 1976.- С.223-237.

76. Сергеев В.Д., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных.-М.: Колос, 1983.- С.135-144.

77. Соловьев В.Д., Бектемиров Г.А. Тканевые культуры в вирусологии.-М.: Медицина, 1963.- С.5-8.

78. Специфическая профилактика инфекционных болезней животных / Селиванов А.В., Кириллов А.К., Кириллов Л.В., Уласов

79. B.И.//Ветеринария.- 1997.-№5.-С. 17-20.

80. Спиера Р.Е., Гриффите Дж. Б. Биотехнология клеток животных. Т. 1. М.: Агропромиздат, 1989.- С.19.

81. Стейнкамп Дж. А. Приборы для научных исследований.- 1984.-№9.1. C.3-35.

82. Сунгуров А.Ю. Разделение и анализ клеток физическими методами // Итоги науки и техники ВИНИТИ, Сер. Цитол. М.- 1985.-Т4.-С.101-115.

83. Сулимов А.А. Селиванов А.В. Биологические свойства парвовируса собак// Ветеринария.- 1992.-№7-8.- С.21-26.

84. Сулимов А.А., Селиванов А.В., Гельман Б.Г. Изучение гемагглютини-рующих свойств вируса энтерита норок // Тез. Всесоюз. науч. конф. «Разработка, апробация и госконтроль вет. препаратов»,- М.,1981,-С.59-61.

85. Сулимов А.А., Селиванов А.В., Груздев К.Н. Парвовирусный энтерит собак // Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными организмами: Тез. конф.- Киев, 1981.- С.32-41.

86. Сюрин В.Н. Некоторые проблемы молекулярной биологии вирусов животных // Ветеринария.- 1976.- №1.- С.40-43.91 .Тарасов В.Н. Клеточные культуры в вирусологии // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Вирусология. -М., 1990.-Т. 19.-167с.

87. Тарасов В.Н. Клеточные культуры в производстве биопрепаратов// Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Вирусология. М., 1991.-№.21.-172с.

88. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Семейство Mycoplasmataceae и L-формы бактерий.- М.: Медицина, 1967.- 392с.

89. Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии М.: Колос, 2000.

90. Универсальная роллерная технология культивирования перевиваемых клеток животных / Юрков С.Г., Курносов А.Н., Витина С.А. и др.// Ве-теринария.-1995.-№9.-С.29-34.

91. Усовершенствование технологии изготовления вакцин против вирусного энтерита норок / Уласов В.И., Элизбарашвили Э.И., Рахманина М.М. и др.// Производство и контроль мед., вет. препаратов, опыт применения и реализации в странах СНГ.- Покров, 1999.- 18с.

92. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения //ЖМЭИ.- 1968.- №2.- С.59-66.

93. Фаррант Д. Пересмотр некоторых криобиологических концепций // Криобиология и криомедицина.- Киев, 1977.-Вып.З.- С. 12-20.

94. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак,- Киев: Морион, 1999.-184с.

95. Хаертынов С.Х., Дьяконов Л.П., Курнос'ов А.Н. Рекомендации по профилактике, диагностике контаминирования культур клеток микроорганизмами и мерам их деконтаминации.-Казань, 1988.-ЗЗс.

96. Чертович Н.Ф. Устойчивость вируса энтерита норок к химическим де-зинфектантам.- М., 1988.- 7 с.

97. Шестопалов A.M., Кисурина М.И., Дурыманов А.Г. Сравнительная характеристика некоторых парвовирусов плотоядных // Вопр. вирусол. -1998.-№.35.-С.199-204.

98. Шнейдер М.А., Чижов Н.П. Противовирусное действие антибиотиков// Вопр. вирусол .-1986 .-№ 1 .-С. 18-31.

99. Энрофлон-К эффективное средство для профилактики и деконтамипа-ции линий клеток от микогшазменной и бактериальной инфекций / Но-чевный В.Т., Виолин Б.В., Карпухина О.Г., Яковлева J1.A. //Аграрная наука.-2003.-№6.-С. 13-16.

100. Юрков С.Г. О перекрестной контаминации перевиваемых культур кле ток//Вопр. вирусол.- 1995.-№5 .-С.225-227.

101. Аоеппапп О. Virus-Enteritis der Nerzeeine Gefalir fur Nerzrucht // Die Blaue Hefre fur den Tierarzt.- 1960 P.361-362.

102. Anderson S.M., Young N.S. Erythrocyte Pantigen: cellular receptor for B19 parvovirus // Science.-l993.-Vol.262. P.114-117.

103. Astel C.R., Thomas H., Chow M.B., Ward D.C. Mutations adjacent to the dimple of minute virus of mouse DNA // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.-1982.-Vol.47.-P.751.

104. Basak S., Compans A.W. Polarized entry of canine parvovirus in an epitelial cell line // J.Virol.-1989.-Vol.63, №7.- P.3164-3167.

105. Basak S., Turner H. Infetious entry pathway for canine parvovirus // Virol-ogy.-1992. Vol.186, №1.-P. 368-376.

106. Binn L.N., Lazar E.C., Eddy G.A. Recovery and characterization of a minute virus of canines // Infect. Immun. 1970.- Vol.1.- P. 503-508.

107. Biim L.N., Harchwiki R.N., Stephenson E.N. Establishment of a canine cell line: derivation, characterization and viral spectrum// Am. J. Vet.Res. -1980.- Vol.41, №6.-P.855-860.

108. Birch J. Suppression of programmed cell death in industrial scale biological production systems, demonstration project within EC-framework V //Quality of Life and Managemmt of Living Resources, 2002.-P. 135-140.

109. Bittle J.Z. Importance of freeze-drying of biological products // Develop. Biol. Stand.- 1977,- Vol.36.- P. 5-6.

110. Bolin V.S. The cultivation of panleukopenia virus in tissue culture // Virol-ogy.-1957.-Vol.4, №2 .-P.389-390.

111. Boulliant A., Hauson R.P. Epizootology of mink enteritis: 3- Carrier state in mink // Canad. J. Сотр. Med. Vet. Sci.- 1965.- Vol.29,№7.- P. 183-189.

112. Bronn T.T. Laboratory evaluation of selected Disinfections as virucidae agents, against porcue parvovirus // Am. J. Vet. Res.- 1980.- Vol.42,№6.- P. 1033-1035.

113. Burger D., Gorham S.R., Ott R.L. A further note on the relationship of pan-leucopenia to mink virus enteritis // Nat. Eur. News.- 1964.- Vol.36,№3.-P.12, 36.

114. Burtonboy G., Bazin H. Canine haemorrhagic enteritis: detection of particles by electron microscopy // Arch.Virol.-l982.-Vol.71,№4.- P.291-302.

115. Carman P.S., Povey R.C. Comparison of the viral protein of canine parvoviruses -2, mink enteritis virus and feline panleucopenia virus // Vet. Micro-biol.-l 983.-Vol.8, №5.-P.423-435.

116. Carlson J.H., Scott F.W., Duncan J.R. Feline panleucopenia 3. Developmentof lesions in the lymphoid tissues// Vet. Patliol.-1978.-Vol. 15,№3.-P.383-392.

117. Carmichael L.E., Jolubert J.C., Polloch R.V.H. Hemmaglutination by canine parvovirus serologic studies and diagnostic applications // Cornell. Vet.-1981.- Vol.71,№4.- P.408-427.

118. Coriell L. Methods of prevention of bacterial, fungal and other contaminations // Contamination of Tissue Culture.-NY; London, 1973.-P.308-345.

119. Colo H., Taneda A., Shinagawa M., Hama E. Biological and physical comparison of mink enteritis virus with feline panleucopenia virus and canine parvovirus //Japan. J. Vet. Sc., 1986.- Vol.48,№5.- P. 1025-1028.

120. Cotmore S.F., Tattersall P. The autonomously replicating parvoviruses of vertebrates // Adv. Virus Res. 1987.-Vol.33,№1.- P.91-97.

121. Characterisation of replicative form DNA of the autonomous parvovirusmink enteritis virus / Shinagava M., Normula Y., Kariatumari T. et.al.- Microbiol. Immunol.-1989.-Vol.33,№9.-P.721 -732.

122. Das-Hay Yu. Inhibitory factor of inclusion body formation and hemagglutination by mink enteritis virus in bovine serum // Japan. Vet. Med. Assn., 1985.-T.38,№5.-P.305-309.

123. De Jong A. Evolution of the fluoroquinolones // Europ. Poultry Symp.1.verkusen, Germany, 1995.-P.5-14.

124. Durimanov A.G., Shestopalov A.M., Trapezov O.V. A new continuous feline kidney cell culture (FK-91) for reproduction of the carnivore parvoviruses // Intern. Sci. Congr. on Animal Production, 60th; Proc.-Warsawa, 1996.-P. 173-175.

125. Efimenh A.H. Freeze-drying , its role and future // Deltion Haellinikis Ptinijitrikis Alterias.- 1980.- Vol.31 ,№4.- P.259-269.

126. Epitope mapping of a monoclonal antibody specific to feline panleucopeniavirus and mink enteritis virus / Horiuchi V., Mochizuki m., Ishiguro N. Et.al.-J. Vet. Med. Sci., 1997.-Vol.59,№2.-P.133-136.

127. Flagstad A. Feline panleucopenia virus. A serological study // Acta. Vet. Scand.- 1977.-Vol. 18,№U.- P.1-9.

128. Ford R.B. Enrofloxacin: a new antimicrobial strategy in small animal practice//Western Veter. Conf. (Nevada), 1988.-P. 17-24.

129. Fleckenstein E., Orexler Y.G. Elimination of mycoplasma contamination incell cultures // Bichemica.-1996.-Vol.l.-P.48-51.

130. Fiower L.R., Wilcax G.E., Robinson W.F. Antigenic differences betweencanine parvoviruses and feline panleucopenia virus // Vet. Rec. 1980, Vol.107.- P.254-256.

131. Greiff D. Stabilities of suspension of influensa virus dried by sublimation ofice in vacuo to different contents of residual moisture and sealed under different gases // Appl. Microbiol.- 1970.-№6.- P.935-938.

132. Gorski J. Immunoprofilaktyka chorob wirusowych zwierzat futerkowych // Hodowca brobn. Invent.-1987.-Vol.35,№5.-P.4-8.

133. Gorham J.R., Hartsought G.R., Sato N., Lust S. Studies on cell cultureadapted feline panleucopenia virus -vims neutralisation and antigenic extinction // Vet. Med.- 1969,- Vol.61, №1.-P.35-40.

134. Gorman A.M., Samali A., Mc Gowan A.J., Cotter T.G. Use of flow cytometry technigues in studying mechanisms off apoptosis in leukemic cells // Cytometry.- 1997.- Vol.29.-P.97-105.

135. Haeltermann E.O. Immunity to parvoviruses // Vet. Med. Small. Clin.-1975.- P.715-717.

136. Hayflick L., Chanock R.M. Mycoplasma species of man // Bact. Rev.-1965.1. V.29.-P. 185-221.

137. Johnson R.H. Feline panleucopenia virus in vitro comparison of strains witha mink enteritis virus // J.Smal. Animall Pract.- 1967.- Vol.8.- P.319-324.

138. Jensen M.D. The application of environmental control to continuous cultureand vaccine production NY: Acad. Press.- 1979,- P. 115-136.

139. Johnson F.B., Hogga M. D. Structural proteins of HADEN- virus // Virology. 1973.-Vol.51, №1.-P. 129-137.

140. Johnson R.H., Siegl G., Gautsohi M. Characteristics of feline panleucopeniavirus starins enabling definitive classification as parvovirus // Arch. ges. Virusforsch.- 1974.-Vol.46- P.315-324.

141. Knox B. Outbreaks of virus enteritis in mink in Denmark // Nat. Eur News.1960.- Vol.32,№11.- P. 17,42.

142. Kruse P.F., Patterson M.K. Tissue culture: methods and applications-NY;London Acad. Press., 1973.- P.217.

143. Kenny G., Cartwriht F.D. The susceptibilities of Mycoplasma hominis and

144. Ureaplasma urealyticym to the never guinolones // 7th Int. Congr. Int. Organ. Mycoplasmol. (JOW). Baden near Vienna, June 2-9, 1988: Compend. Abstr. Wien., S.A.-P.9.

145. Kangas J., Kariainen L., Keranen S. Demostration of mink virus enteritis antibodies by complementification test // Nord. Vet. Med.- 1972, Vol.24,№3.- P. 146-150.

146. Kerr J.F.R., Wyllie A.Y., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implication in tissue kinetics // Br. J. Cancer. -1972.- №26.- P.239-257.

147. Kariatsumari Т., Horiuchi M., Hama E. Construction and nucleotide seguence analysis of an infectious DNA clone ov the autonomous parvovirus, mink enteritis virus // J. gen. Virol.-1991.-Vol.72,№4.-P.867-875.

148. Kenyon A.J., Gardner J.E., Lopez C., Good C.A. Isolation of Aleutian minkdisease virus affinity chromatograthy // Science.-1973.-Vol. 179, №4069.-P. 187-189.

149. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of (lie head of the bacteriophage T4 //Nature.-1970.-Vol.227.-P.680-685.

150. Lazarowits S.G., Compons R.W., Choppin P.W. Influenza virus structuraland nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes // Virology.-1971.-Vol.46.-830s.

151. Mac Kenzie A.P. The physicochemical basis for the freeze-drying process //

152. Develop. Biol. Stand.- 1977.- Vol.36.- P.51-67.

153. Mac Pherson L.W. Feline enteritis virus-its, transmission to mink undernatural and experimental conditions // Can. J. Camp. Med.- 1980.- Vol.20.-P. 197-202.

154. Mazur P. Limits to life at low temperstures and at reducted water contents and water activities // Orid. Life.- 1980.- Vol.10, №2.- P. 137-159.

155. Mowles J.M. The use of ciprofloxacin for the elimination of mycoplasma from naturally infected cell lines // Cytotechnology.-1988.-Vol.l.-P.355^ 358.

156. Myers W.L., Alberts S.O., Brandly C.A. Certain characteristics of the virusof infectious enteritis of mink and observations on pathogenesis of the disease. Preliminary report // Canad. J. Сотр. Med. Vet. Sci.- 1959.-Vol.23,№9.- P.282-297.

157. Mengeling W.L., Ridpath J.F., Vorwald A.C. Size and antigenic comparisons among the structural proteins of selected autonomous parvoviruses // J. gen Virol.-1988.-Vol.69,№4-P.825-837.

158. Mocliizuki M., Konishi S., Agata M. Studies in feline panleucopenia: 2. Antigenicities of the virus // Jap. J. Vet. Sci.- 1978.-Vol.40.-P.375-383.

159. Moraillon A., Moraillon R., Person J.M, Parod A.L. Parvovirose canine: L'ingestion d'organes de vison attaint d'enterite // Rec. Med. Vet.- 1980.-Vol.l56,№7/8.- P.539-548.

160. Mc Master G.K., Hirt В., Tratsohin J.D., Slegl G. Comparison og canine

161. CPV) with mink enteritis virus (MEV) // Experientia.- 1981.- Vol.37,№6.-P.653.

162. Mink enteritis in Japan. 1. Isolation and characterization of the causative virus and its pathogeheti in lat / Higashinara Т., Isarva H., Onuma M. et.al.-Jap. J. Vet. Sci. 1981.- Vol.43.-P. 741-851.

163. Panina G.F. Media and serum for the large-scale production of BHK cells //

164. Rep. Meet. FMD Eur. Comm-Rome, 1975.- P.60-65.

165. Paradiso P.R. The infectious process of the parvovirus H-l: correlation of protein content, particle density and viral infectivity.// J.Virol.-1981 Vol.39, №3.-p.800-807.

166. Parrish C.R. Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleucopenia virus using infectious plasmid clones // Virology.-l 991 .-Vol. 183, №1 -P. 195-205.

167. Parrish C.R., Carmichael L.E. Antigenic structure and variation of canine parvovirus typr-2, feline panleucopenia virus and inink enteritis virus // Vi-rology.-1983.-Vol.129, №2.-P.401-414.

168. Paradiso P.R., Rhode S.L., Singer I.I. Canine parvovirus : A biochemicaland ultrastnictural characterization // J.gen.Virol.-l982.-Vol.62,№1.-P.l 13-125.

169. Philips B.A., Lundguist R.E., Maizel J.V. Absence of subviral particles, assembly activity in Hela cells infected with defective- interfering (Dj) Particles of poliovirus // Virology.- 1980.- Vol.100.- P.l 16-124.

170. Parrish C.R., Aquado C.F., Carmichael L.E. Canine host range and specificepitope along with variant sequences in the capside protein gene of canine parvovirus and related feline, mink and raccoon parvovims // Virology.-1988.-Vol. 166, №2.-P.293-307.

171. Purification of infectious canine parvovirus from cell culture by affinitychromatography with monoclonal antibodies / Rimmelzwaan G.F., Groen J., Juntti N. et. al. J. Virol.- 1987.- Vol.15, №4.- P.313-322.

172. Ruedinger S. Untersuchungen uber die VP Eignung von Enrofloxacin (Bay VP 2674) als antibacterielles Yusats zum Zellkultuz medium: Inaug.Dis. -Giessen, 1989.- 89s.

173. Robinson L., Wichelhausen R., Roisman B. Contamination of human cellcultures by PPLO // Science. -1956.-V.124.-P.1147-1148.

174. Ridgway G.L., Muntaz G., Gabriel F.G. The activity of cyprofloxacine andother 4-quinolones against chlamydia trachomatis and mycoplasma in vitro // Eur. J. Clin. Microbiol.-1984.-V.3.-P.344-346.

175. Schofield F.W. Virus enteritis in mink // The North Am. Vet.- 1949.- Vol.30, №10,- P.651-654.

176. Schroder Y. Enrofloxacina: a new antimicrobial agents // Aft. Vet. Ver.1989.-V.61,№2.-P. 122-124.

177. Schwartz T.M. Nerw virus enteritis-vakzination // DT. Pelztiersuchter.1989, Bd.63, №78.- S.103-105.

178. Sethi K.K., Teschner M. Mycoplasma interactions with cell cultures, unculturaded living cells and the probrems posed by their presence in tissue cultures // Klin. Wscht.-1972.-Bd.50,№2.-S.26-33.

179. Studdert M.S., Peterson J.E. Some properties of feline panleucopenia virus //

180. Arch. ges. Virusforsch.- 1973.- Bd.42.- S.346-354.

181. Salzinan L.A., White W.L. Structural proteins of Kilhain rat virus // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1979.-V. 41.- P.1551.

182. Siegl G., Kronauer G.A. A plague assay for feline panleucopenia virus // J.gen. Virol.- 1980.- VoI.46.-P.211-218.

183. Scott F.W., Csiza C.K., Gillespie J.H. Feline virus.4. Isolation and characterization of feline panleukopenia virus in tissue culture and comparison of cytopathogenicity with feline picornavirus // Cornell. Vet.- 1970.- Vol. 60, №1-P. 165-183.

184. Sedrnak J., Gameson P., Crossberg S.E. Procedurs for stabilization of interferons // Meth. Enzym.- 1981.- Vol.78.- P.591-595.

185. Sarlaque J., Pouters F., Benaudin H. Assay the several antibiotic treatmentelimination of mycoplasmas from cell cultures // JOM LETT.-1992.-Vol .2-P.312-320.

186. Tsao J., Chapman M.S., Agbandje M. The three-dimensional structure of canine parvovirus and its functional implication// Science.-1991.-Vol.251; №5000.-P. 1456-1463.

187. Wills G.G. Notes on infections enteritis of mink and its relationship to felineenteritis // Canad. J. Сотр. Med.- 1952.- Vol.16.- P.419-420.

188. Walter S., Richards R., Armentrout R.W. Cell cycle-dependent replicationof the DNA of minute virus of mice, a parvovirus // Biochim. Byophys. Acta. -1980-V.607.-P.420.

189. Ziminermann H. Virus enteritis des Nerres // Beer Infections krankheiten der Haustiere.- Jena, 1980.-S.198-199.

190. Zhao X., Yin Z., Zhao Y. et.al. Nucleotide sequence and genome structureof mink enteritis virus (article in Chinese) // Yi Chuan Xue Bao.-l993.-Vo!.20,№3.-P.279-284.

191. Zuffa T. Rast atenuovanych kmenov parvovirus psov, virusovej enteritidy noriek a panleukopenie maciek a virusi psinky na rosdielnych druhoch bunkovych kultur// Vet. Med. (Prana).-1987.-Vol.32,№32.-P633-640.

192. Zhang Deli. Clinical immune efficiency of inactivaded vac ciness from serum-free cell cultures of mink enteritis virus (MEV) // Acta. Vet. zootechm. Sinica.-1991.-Vol.22.,№4.-P.361-364.

Информация о работе

Ночевная, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.06

Диссертация

Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы