Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсификация процесса биотрансформации глицерина в диоксиацетон уксуснокислыми бактериями

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсификация процесса биотрансформации глицерина в диоксиацетон уксуснокислыми бактериями"

РТЗ

На правах рукописи

ФЭНПИН

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА БИОТРАНСФОРМАЦИИ ГЛИЦЕРИНА В ДИОКСИАЦЕТОН УКСУСНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ

03. 00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва — 1996

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева на кафедре промышленной биотехнологии

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

Канаков Михаил Николаевич

кандидат технических наук, доцент

йарквичев Николай Семенович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ' ' профессор

Кощеенко Кира Алексадровна

' кандидат биологических наук, доцент

Захарчук Леонид Михайлович

Ведущая организация: Московская государственная

академия пищевых производств

Защрта диссертации состоится $'иши^ 1996 г-в /3 часов на заседании диссертационного Совета по биотехнологии Д. 053.34.13 в РХТУ им. Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, ул. Миуская пл., дом 9.

С диссертацией можно ознакомится в научно-информационном центре-РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан " ^ " ¿/¿-¿-¿У 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 053.34.13 Кандидат биологических наук

Гусева И. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Диоксиацетон (ДОА) в качестве промежуточного продукта участвует в процессах углеводного обмена клеток различных организмов и играет важную роль в окислительных реакциях. Вместе с тем, он является очень ценным химическим и биохимическим реактивом. Высокая реакционная способность ДОА делает его перспективным для применения в разнообразных областях народного хозяйства. ДОА широко используется в медицине, косметике, фармацевтической и текстильной промышленности, и также в производстве моющих средств и других соединений.

Известен способ получения ДОА микробиологическим путем при неполном окислении глицерина бактериями Асе^ЬасЬег БиЬохуйапз. Однако в известном способе выделение ДОА из среды затруднено из-за наличия в самой исходной среде и, соответственно, в культу-ральной жидкости других органических соединений. Это приводит к потерям целевого продукта и снижению производительности. Кроме того, культивирование свободных клеток не позволяет осуществить непрерывный процесс, т.к. скорость роста микроорганизмов значительно ниже скорости синтеза продукта.

Более перспективный метод получения диоксиацетона основан на применении мембранного биореактора (МБР). Использование МБР позволяет упростить выделение продукта и повысить его выход, дает возможность интенсифицировать процесс получения ДОА путем перехода на непрерывный режим. Другое важное преимущество такой технологии - уменьшение количества отходов, что позволяет считать ее экологически более чистой.

Поэтому разработка биосинтеза ДОА в непрерывной ферментации с применением мембранного биореактора является актуальной задачей.

Дель работы. Целью настоящей работы было изучение условий трансформации глицерина в ДОА свободными клетками АсеЬоЬа^ег зи-Ьохубапэ при периодическом культивировании, а также разработка биотехнологических основ непрерывного получения ДОА с использованием МБР, обеспечивающих максимальную продуктивность процесса и высокую операционную стабильность клеток.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1). Изучить влияние факторов роста на синтез ДОА и кинетику процесса при периодическом культивировании.

2). Исследовать оптимальные условия трансформации глицерина

- г -

в ДОА свободными клетками.

3). Изучить влияние условий культивирования на рост и кинетику процесса в МБР.

4). Изучить влияние факторов роста на непрерывное культивирование в МБР.

5). Исследовать возможность создания непрерывной системы синтеза ДОА с применением МБР.

Научная новизна. Научная новизна и значимость полученных нами результатов состоят в следующем.

В результате проведенных исследований изучена кинетика изменения концентраций факторов роста и глицерина при периодическом культивировании уксуснокислых бактерий АсеЬоЬа^ег зиЬохубапБ, проведена оптимизация состава исходной питательной среды для периодического культивирования.

Впервые исследована кинетика роста и трансформация ДОА при непрерывном культивировании в мембранном биореакторе. Показано, что синтез ДОА происходит как при росте микроорганизмов в МБР, так и при достижении ими стационарного состояния.Проведена оптимизация условий непрерывного культивирования бактерий и биосинтеза ДОА с использованием МБР. Показано влияние изменении начальной концентрации глицерина, субстрата факторов роста и скорости протока на концентрацию ДОА при культивировании в мембранном биореакторе. Осуществлена минимизация состава питательной среды в стационарном состоянии. Установлена возможность использования МБР для непрерывного получения ДОА уксуснокислыми бактериями АсеЬо-ЬаЫ:ег зиЬохуйапэ.

Практическая ценность. Практическое значение настоящей работы определяется тем, что на основании проведенных исследований разработан непрерывный микробиологический способ получения ДОА с применением мембранного биореактора. Оптимизированы составы питательной среды для трансформации ДОА в МБР, следствием этого явилось повышение степени использования субстрата и выхода конечного продукта - ДОА.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации докладывались и обсуждались на IX Международной конференции молодых ученых РХТУ им. Д.И.Менделеева (Москва, 1995).

Публикация. По результатам данной работы имеются 3 публикации.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и об-

суждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает таблицу и рисунков. Список используемой литературы содержит наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объект и методы исследований

Основным объектом исследований служил штамм уксуснокислых бактерий АсеЬоЬасЬег БиЬохубапБ из коллекции Государственного научно исследовательского института генетики и селекций промышленных микроорганизмов.

Культуру Асе1;оЬас1ег БиЬохус1апз поддерживали на агаризован-ной среде с мелом, содержащей кукурузный экстракт 5 г/л, дрожжевой экстракт 2 г/л, (Ш4)гНР04 1,5 г/л, М^БОа 0,25 г/л и глюкозу 30 г/л.

Стирилизацию питательных сред проводили в течение 30 минут при 0,5 ати.

Культуру выращивали при температуре 28-30 °С. Рабочий штамм раз в неделю пересевали.

Для проверки чистоты культуры использовали микроскопический контроль и высев на чашки Петри с агаром (на элективную среду с мелом).

Для трансформации использовали питательную среду следующего состава: кукурузный экстракт 5 г/л, гидролизад БВК 5 г/л, К2НРО4 2 г/л, (НЬЦ)2НРО4 1 г/л, 0,25 г/л, глицерин 30-90 г/л.

При приготовлении питательной среды рН регулировалось фосфорной кислотой до уровня рН 4,5 - 5,0. Питательную среду стерилизовали автоклавированием 30 минут при давлении 1 ати.

При простом периодическом культивировании ферментацию вели в колбах с объемом 300 мл (рабочий объем 50 мл.) на качалке при температуре 28-30 °С.

Культивирование непрерывным способом проводили в мембранном биореакторе с рабочим объемом 0,3 л с выносными ультрафильтрационными модулями на полых волокнах при 28 - 30 °С. Величину рН поддерживали на заданном уровне путем добавления 0,5%-ного раствора ИаОН. Установку стерилизовали 70%-ном спиртом.

Количество биомассы определяли нефелометрическим методом (светофильтр 490 нм) с предварительным построением калибровочного графика.

ДОА определяли колориметрическим методом с применением хло-

ристого трифенилтетразолия (светофильтр 540 нм) с предварительным построниеы калибровочного графика (Плакунова, 1962).

Все морфологические исследования проводили с использованием светового микроскопа, наблюдая фиксированные и окрашеные препараты.

Проведение периодического культивирования, в большинстве случаев, оказывается необходимым начальным этапом микробиологического исследования. Его лично считать моделью природных микробиологических процессов, поэтому и в нашем случае эксперименты по периодическому культивированию были первой ступенью в изучении процесса биосинтеза ДОА уксуснокислыми бактериями.

Рост культуры.

Культивирование бактерий АсейоЬасЬег зиЬохус!апз проводили на питательной среде, содержащей глицерин 60 г/л, при рН 4,0-5,0. Культуры пересевали из косяка в колбы с объемом питательной среды 50 мл, который помещали в термостатируемую качалку (160 об/мин., температура 28-30 °С).

2. Периодическое культивирование

60.00

60.00 л

0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 I час

20.00

40.00

X г/л

Рис. 1 Зависимость изменения кон-

Рис. 2 Зависимость изменения концентрации ДОА от изменения концентрации биомассы.

центрации ДОА и биомассы от времени.

На рис. 1 представлена кривая роста бактерий АсеЬоЬасЬег Би-Ьохуёапз. Рост бактерий происходит по стандартному закону. Кривая

имеет Б-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу линейного роста, стационарную фазу и фазу отмирания.

Эти фазы роста бактерий Асе1оЬас1ег БиЬохусЗапз отражают изменение состава питательной среды. Концентрация ДОА изменяется параллельно с концентрацией биомассы.Когда скорость роста биомассы достигает максимального значения, наблюдается максимальная скорость синтеза. Концентрация продукта ДОА достигает максимума при стационарном состоянии культуры. Скорость накопления продуктов в стационарной фазе развития микроорганизмов равна нулю.

На рис. 2 представлена зависимость концентрации продукта от концентрации биомассы. Видно, что концентрация ДОА линейно возрастает с увеличением концентрации биомассы. Эти результаты подтверждают, что ДОА является энергетическим метаболитом.

Оптимизация состава питательной среды.

Для определения оптимальных составов питательной среды были проведены опыты по культивированию бактерий Асе1:оЬасЬег эиЬоху-(Запэ с различными концентрациями кукурузного экстракта от 1 г/л до 6 г/л в составе питательной среды при постоянных концентрациях гидролизада БВК 5 г/л и глицерина 60 г/л. Концентрация других компонентов питательной среды оставалась постояной.

70.00 60.00

к

>50.00 X

д-40.00

30.00

Кон. ДОА, Р °°°°° Кон. бномассьг, X' 10

20.00 ] ч I I I I I I I | ч I I I I I I м I 11 I м 1 I I I I I м I и I п

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Р (ху) г/л

Рис. 3 Зависимость концентраций ДОА и биомассы от концентрации кукурузного экстракта в питательной среде.

60.00 Ч

50.00

К >

X 40.00

Оч"

30.00

20.00 0.00

..... Кон. ДОА. Р

ооаоа КОН. бИОМаССЫ, X • 10

2.00 4.00 'б.оо' 8.00 С (БВК) г/л

Рис. 4 Зависимость концентраций ДОА и биомассы от концентрации гидролизада БВК в питательной среде.

Результаты исследования показали, что концентрация биомассы и ДОА значительно увеличивается с повышением концентрации кукурузного экстракта, удельная скорость роста и синтеза также увеличивается. Максимальный урожай клеток и продукта наблюдался при содержании кукурузного экстракта 5 г/л (рис. 3).

Увеличение концентрации гидролизада БВК от 1 г/л до 6 г/л при концентрации кукурузного экстракта 5 г/л привело к увеличению концентрации продукта - ДОА, максимальные значения урожая клеток и концентрации ДОА наблюдаются при содержании гидролизада БВК 5 г/л (рис. 4).

Из рисунков видно, что изменение концентрации кукурузного экстракта более сильно влияет на рост бактерий и синтез ДОА, чем изменение концентрации гидролизада БВК. Более эффективной добавкой оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и других биологических активных веществ в легко ассимилируемых формах.

Оптимизация концентрации глицерина в исходной питательной среде.

Эксперименты по влиянию концентрации глицерина на рост и синтез ДОА проводили при содержании кукурузного экстракта и гидролизада БВК 5 г/л с различной концентрацией глицерина от 30 г/л до 90г/л. Остальные компоненты питательной среды и условия выращивания культуры остаются неизмененными.

Как видно из рис. 5, увеличение начальной концентрации глицерина от 30 г/л до 60 г/л привело к увеличению стационарной концентрации клеток и концентрации ДОА. Дальнейщее увеличение концентрации глицерина от 60 г/л до 90 г/л приводило к не пропорциональному увеличению выхода продукта ДОА и клеток. Можно предположить, что глицерин в концентрациях более 60 г/л начинает оказывать ингибирующее действие на рост микроорганизмов и трансформацию ДОА. Удельная скорость роста клеток при увеличении глицерина от 30 г/л до 60 г/л возрастает, а при концентрации глицерина от 60 г/л до 90 г/л немного падает. Степень трансформации ДОА при концентрациях от 30 г/л до 90 г/л понижается, а скорость синтеза ДОА повышается (рис. 6).

80.00

50.00

К и

х 40.00

Он

20.00

0.00

1.00

С7>

Е 0.50

■ь

0.00 20.00 40.00 60.00 80.00100.00 5" о г/л

0.00

***** Степень конверсия, в ООСОО Удельная скорость, и ч аото Скорость оянтеяа, д. Г'/л ■ ч

0.00

Рис. 5 Зависимость концентрации Д0А и биомассы от концентрации глицерина в питательной среде.

20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 6 о г/л

Рис. 6 Зависимость степени конверсии, удельной скорости и скорости синтеза ДОА от начальной концентрации глицерина в питательной среде.

Начальная концентрация глицерина в питательной среде непосредственно влияет на рост бактерий и синтез продукта ДОА: концентрация биомассы и ДОА увеличивается с повышением концентрации глицерина, но при высокой концентрации глицерина 90 г/л, не наблюдается резкого увеличения концентрации бактерий и продукта ДОА, так что оптимальной концентрацией глицерина в исходной питательной среде следует считать 60 г/л.

Для роста уксуснокислых бактерий необходимы факторы роста, содержащиеся в кукурузном экстракте и гидролизаде БВК. Однако количество этих компонентов может широко варьироваться в пределах от 1 г/л до 6 г/л. Увеличение концентрации кукурузного экстракта и гидролизада БВК в культуральной жидкости резко затрудняет последующие стадии выделения ДОА, и поэтому с технологической точки зрения их концентрация должна быть минимальной. Влияние минимального количества факторов роста (или их полного отсутствия) на рост А. зиЬохусЗапБ и синтез ДОА можно проверять при культивировании микроорганизмов в периодических и непрерывных условиях, включая культивирование в мембранном биореакторе. На первом этапе для проверки этого нами были поставлены эксперименты по культивированию ДОА на неростовых (неполных и голодных) средах.

Биосинтез ДОА уксуснокислыми бактериями Асе1:оЬас1ег эиЬоху-ёапБ в неполной и голодной питательной среде.

Для осуществления трансформации ДОА в неполной среде бактерии Асе1;оЬа^ег эиЬохуйапз сначала выращивали в полной питательной среде, содержащей кукурузный экстракт и гидролизад БВК. Затем бактерии отделяли центрифугированием и культивировали на неполной среде с различной начальной концентрацией кукурузного экстракта и гидролизада БВК - от 0 г/л до 5 г/л, при рН 4,0-5,0 с концентрацией глицерина 60 г/л.

Таблица 1

Результаты эксперимента с изменением концентраций кукурузного экстракта и гидролизада БВК в голодной среде

So г/л R г/л С г/л Хна Г/л Хко г/л Р г/л ot=P/S0 е=др//Уг г/л.час

60 0,00 0,00 0,62 4,26 49,5 0,83 0,68

0,25 0,25 0,63 4,34 50,5 0,84 0,69

0,50 0,50 0,60 4,19 49,3 0,82 0,68

So - начальная концентрация глицерина в питательной среде, г/л

R - начальная концентрация кукурузного экстракта в питательной среде, г/л С - начальная концентрация гидролизада БВК в питательной среде, г/л

ХНан_ начальная концентрация биомассы, г/л Хкон~ конечная концентрация биомассы, г/л Р - концентрация продукта - ДОА в стационарном состоянии, г/л

а - степень конверсии трансформации окисления, et = P/So G - производительность, 6 = ДР/Ät, г/л-час В таблице 1 представлены результаты экспериментов по культивированию в неполной среде с различными концентрациями кукурузного экстракта и гидролизада БВК. Из таблицы видно, что во всех случаях культура бактерий хорошо растет и выделяется ДОА, стационарная концентрация биомассы и ДОА почти не изменяется при увеличении концентрации кукурузного экстракта и гидролизада БВК от О

г/л до 0,5 г/л в питательной среде. Это подтверждало то, что синтез ДОА можно осуществлять при частичном и полном отсутствии факторов роста, т.е в голодной питательной среде. По сравнению с культивированием в полной питательной среде степень конверсии почти не изменяется, производительность повышается до 0,69 г/л-час (в простой периодической культуре производительность около 0,40 г/л час.) Повышение производительности вызвано тем, что выращивание культуры в голодной среде сокращает время перехода к стационарному состоянию и увеличивает скорость окисления глицерина в ДОА.

Для проверки возможности многократного культивирования в голодной питательной среде проведен следующий эксперимент: после выращивания в полной среде, пересеяли культуру в голодную среду (концентрация факторов роста равна 0 г/л). Рост культуры наблюдался и на голодной среде. После достижения стационарного состояния, культуру еще раз пересевали в новую голодную среду. При этом не наблюдалось роста клеток и синтеза ДОА. Затем, когда культуру выделяли и пересевали в питательную среду с добавлением факторов роста, культура вновь росла (таб. 2).

Таблица 2

Результаты эксперимента в условиях смены голодной и полной среды

Среда 5о, Г/л 1?, г/л С, г/л X, г/л Р, Г/Л Резу-льтат

1# 60 5,0 5,0 6,07 49,8 +

2# 60 0 0 4,26 48,5 +

3* 60 0 0 0,00 0 -

4* 60 0,5 0,5 5,46 46,1 +

X - концентрация биомассы в стационарном состоянии, г/л

1# - полная среда

2# - голодная среда

3# - голодная среда

4# - неполная среда

+ - наличие роста

- - отсутствие роста

Таким образом, возможно осуществление культивирования и синтеза ДОА в голодной среде глицерина только один цикл, после однократного культивирования культура больше не растет в голодной среде в отсутствии необходимых факторов роста, поэтому многократное использование клеток возможно только при добавлении какого-то количества фактора роста с определенной цикличностью. Тем не менее, осуществление культивирования бактерий в голодной среде дает возможность прогнозировать поведение микроорганизмов в мембранном биореакторе на минимимальной питательной среде.

3. Культивирование бактерий Асе^Ьас1ег 5иЬоху(1ап5 и биосинтез ДОА в мембранном биореакторе.

В последнее время внимание исследователей все более привлекает использование мембранного биореактора (МБР), который не только дает возможность осуществить непрерывное культивирование, но и позволяет повысить концентрацию биомассы и, как следствие, повысить продуктивность и степень использования субстрата, а также достигнуть высокой окислительной активности и максимальной эффективности.

Рост микроорганизмов в МБР.

Культивирование в МБР осуществлялось следующим образом: непрерывное культивирование проводили в мембранном биореакторе с рабочим объемом 0,3 л с выносными ультрафильтрационными модулями на полых волокнах при 28 - 30 °С с величиной рН 4,0-5,0 в строгих аэробных условиях. После первоначальной инокуляции (кагда культура развивается до середины экспоненциальной фазы), начинали включать проток - отбирать бесклеточную культуральную жидкость и подавать свежую питательную среду.

Кривые роста культуры и синтеза ДОА показали (рис. 7), что в МБР, когда отвод клеток из ферментера не происходит, рост клеток микроорганизмов можно сравнить с культивированием в периодических условиях, кривая роста микроорганизмов имеет Б-образную форму. После включения протока скорость роста микроорганизмов несколько снижалась, и в течение одной - двух генераций она была несколько ниже, чем скорость роста микроорганизмов в простых периодических условиях. Этот участок развития клеточной популяции называется "условной" лаг-фазой. Такое снижение скорости роста микроорганизмов вызвано увеличением концентрации субстрата.

Моментом окончания "условной" лаг-фазы можно считать время, когда скорость роста микроорганизмов достигнет величины, равной по значению скорости роста в периодическом режиме при тех же условиях культивирования. Наступающая затем фаза экспоненциального роста мало отличается от аналогичной фазы развития для периодических процессов, и через 2-3 генерации скорость роста стабилизируется; при достижении клетками определенной концентрации культура переходит в фазу линейного роста. Стационарное состояние достигается на 5-6-ые сутки культивирования, при этом в течение 3-5 суток в аппарате параметры процесса не изменялись.

Одновременно с ростом клетки А. эиЬохусЗапз трансформировали глицерин в ДОА. Изменение концентрации ДОА было пропорционально увеличению концентрации клеток. Максимальная концентрация ДОА достигалась при достижении стационарного состояния. В отличие от периодического культивирования в стационарном состоянии в МБР синтез ДОА происходил с постоянной скоростью (рис. 7).

| < час

вкл.

Рис. 7 Зависимость концентрации продукта—ДОА и биомассы от времени при начальной концентрации глицерина в питательной среде 30 г/л.

Известно, что в МБР переход в стадию лимитируемого роста и стационарную фазу вызван тем, что подводимого клеткам субстрата

не хватает для роста микроорганизмов с максимальной скоростью. Достижение стационарного состояния клетками АсеЬоЬас1ег эиЬоху-(Запэ при культивировании в МБР обьясняется тем, что энергия, образующаяся при неполном окислении глицерина в ДОА, тратится клетками на поддержание. Это подтверждается тем, что при изменении условий культивирования - увеличения количества субстрата, подводимого к клеткам - начинается рост клеток, и достигается новое стационарное состояние.

Изменение скорости протока питательной среды в МБР.

При изменении скорости протока питательной среды Б с 0,067 час-1 до 0,100 час"1 наблюдается развитие культуры, происходящее в соответствии с законами, характерными для роста в МБР. После линейного роста культура переходит в стационарное состояние и находится в ней до момента изменения скорости протока субстрата с 0,067 час-1 до 0,100 час-1. После изменения скорости протока вновь начинается рост микроорганизмов А. Б1йохус1аЬ5. Культура проходит через экспоненциальную фазу развития, фазу линейного роста, и переходит в новую стационарную фазу. Концентрация ДОА пропошонально изменяется с концентрацией клеток, достигает максимальной величны в стационарном состоянии и сохраняется до момента изменения скорости протока. После повышения скорости протока до 0,100 час -1, концентрация ДОА падает с возрастанием концентрации клеток.

Таблица 3

Результаты эксперимента с изменением скорости протока в мембранном биореакторе

и, ч~г 5о, г/л X, г/л Р, Г/Л (1, Ч-1 6=[р]-0,Г/л-час Ш

0,067 30 3,1 16,0 0,019 1,07 0,96

0,100 30 4,0 11,0 0,008 1,10 1,21

О - скорость протока, час-1

X - концентрация биомассы в стационарном состоянии, г/л р. - удельная скорость роста в экспонециальной фазе, час-1 ш - энергия поддержания, т = Х/([Р]-О-ЗАТР) В таблице 3 представлены результаты эксперимента при изменении скорости протока. Видно, что увеличение скорости протока при-

вело к увеличению производительности процесса. При снижении концентрации ДОА происходило увеличение энергии идущей на поддержание.

Рассматривая мембранный биореактор как систему для иммобилизации клеток, можно рассчитать операционную стабильность системы, исходя из объема культуральной жидкости, прошедщей через ферментер, отнесенной к объему самого ферментера. Операционная стабильность системы составляет 36 циклов.

При проведении же периодического процесса культивирования со свободными клетками в аналогичных условиях операционная стабильность не превышала 3-4 циклов.

Изменение начальной концентрации глицерина при проведении непрерывного культивирования в МБР.

Одной из возможностей интесификации производительности МБР является увеличение начальной концентрации субстрата, поэтому были проведены эксперименты с начальной концентрацией глицерина 30 г/л, 60 г/л, 90 г/л при разных скоростях протока.

Результаты экспериметов представлены на таблице 4. После изменения начальной концентрации глицерина с 30 г/л до 60 г/л рост бактерий продолжался. Культура вновь проходила экспонециальную фазу, фазу линейного роста, стационарную фазу. Увеличение концентрации глицерина с 60 г/л до 90 г/л проводило к аналогичному отклику в кривой роста. Концентрации ДОА изменялась в ходе процесса симбатно изменению концентрации клеток. Синтез ДОА происходил и в ходе роста, и в стационарной фазе.

Таблица 4

Результаты эксперимента с изменением начальной концентрации глицерина в питательной среде

0 Зо X Р IX ос=Р/Бо й=[Р]-0 ГП

час-1 г/л г/л г/л час-1 г/л-час

30 3,20 17,6 0,020 0,59 1,18 0,90

0,067 60 5,95 32,5 0,028 0,54 2,18 0,92

90 7,46 37,5 0,031 0,42 2,51 0,99

Как видно из таблицы 4, увеличение начальной концентрации

глицерина приводило к увеличению концентрации биомассы в стационарной фазе, однако удельная скорость роста микроорганизмов в экспоненциальной фазе развития уменьшалась с возрастанием начальной концентрации глицерина.

Одновременно с увеличением концентрации биомассы возрастала концентрация продукта, хотя возрастание концентрации ДОА не было пропорционально возрастанию концентрации глицерина, что может свидетельствовать об ингибирующем действии глицерина. Это подтверждается и возрастанием энергии, идущей на поддержание с 0,90 до 0,99.

Общая производительность процесса возрастает с увеличением начальной концентрации глицерина с 1,17 г/л-час до 2,51 г/л-час при начальной концентрации глицерина 30 г/л и 90 г/л соответственно.

Оперативная стабильность во всех случаях больше, чем в периодических условиях.

Изменение начальной концентрации кукурузного экстракта и ги-ролизада БВК при проведении непрерывного культивирования в МБР.

Проведены эксперименты по изменению концентрации кукурузного экстракта и гидролизада БВК в исходной питательной среде от 0,5 г/л до 5,0 г/л с концентрацией глицерина 30 г/л при скорости протока субстрата 0,067 час-1.

В условиях трансформации глицерина в ДОА в стационарном состоянии клетками Асе^ЬаЛег БиЬохус1апз в МБР большая часть образующейся энергии тратится клетками на поддержание. Активность анаболических процессов при этом существенно понижена, следовательно можно полагать, что при переходе клеток в стационарное состояние возможно существенно снизить концентрацию факторов роста - гидролизада БВК и кукурузного экстракта. Значение энергии, идущей на поддержание, различно при создании разных условий культивирования (изменение начальной концентрации субстрата и изменение скорости протока).

Снижение концентрации факторов роста проводили при достижений клетками стационарного состояния, концентрации факторов роста снижали в исходной питательной среде с 5,0 г/л до 2,5 г/л и 0,5 г/л. Концентрация клеток при этом на протяжении всех экспериментов не снижалась. Концентрация ДОА в культуральной жидкости, при изменении концентрации факторов роста снижалась (таб. 5), оставаясь постоянной до нового изменения концентрации факторов роста.

Таблица 5

Результаты эксперимента с изменением концентрации кукурузного экстракта и гидролихада БВК в питательной среде при начальной концентрации глицерина 30 г/л

0, Со, X, Р, И, а=Р/Бо 6=[Р]-0 Ш

час""1 г/л г/л Г/Л час-1. г/л-час

5,0 3,15 14,5 0,035 0,48 0,97 1,08

0,067 2,5 3,15 13,2 / 0,44 0,88 1,18

0,5 3,15 9,4 / 0,31 0,62 1,66

Уменьшение концентрации ДОА при снижении концентрации факторов роста свидетельствует о том, что в стационарном состоянии культура тратит часть энергии не только на поддержание, но и на репарационные процессы, которые тесно связаны с наличием в питательной среде факторов роста.

Уменьшение содержания факторов роста в питательной среде позволяет не только снизить расход субстрата на единицу получения продукта, но и существенно облегчить последующие стадии выделения продукта.

Операционная стабильность во всех процессах культивирования в МБР была существенно выше, чем в периодических условиях.

Таким образом, применение мембранного биореактора позволяет перейти к непрерывному процессу биотрансформации глицерина в ДОА нерастущими клетками Асе^Ьа^ег зиЬохус}апз на минимальной питательной среде с высокой операционной стабильностью. При этом производительность процесса возрастает в 8 - 10 раз в сравнении с периодическим процессом.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное изучение микробной трансформации глицерина в диоксиацетон под действием клеток Асе1оЬа^ег эиЬоху-с!апз в периодическом режиме и в условиях мембранного биореактора. Показано, что в периодических условиях при переходе в стационарное состояние культура теряет способность к трансформации, тогда

как в мембранном биореакторе в стационарном состоянии скорость биосинтеза максимальна.

2. Изучена кинетика роста Acetobacter suboxydans в периодических условиях, показано, что для биосинтеза диоксиацетона оптимальная концентрация гидролизада БВК и кукурузного экстракта - 5 г/л, глицерина - 60 г/л.

3. Изучена кинетика накопления Acetobacter suboxydans и биосинтеза диоксиацетона в мембранном биореакторе в интервале концентраций глицерина 30-90 г/л, скорости протока 0,03-0,10 ч"1; показано, что наибольшая производительность по диоксиацетону достигается при скорости протока 0,07 ч-1 и концентрации глицерина 60 г/л, и равно 2,18 г/л-час.

4. Сравнение роли факторов роста при периодическом культивировании и трансформации в мембранном биореакторе показало, что в условиях мембранного биореактора в стационарном состоянии факторы роста оказывают значительно меньшее влияние на процесс в целом и их концентрация может быть снижена с 5,0 г/л до 0,5 г/л.

5. Измерена оперативная стабильность культуры в периодическом и непрерывном режимах, показано, что при периодическом режиме культивирования она не превышает 3-5 циклов, а в стационарном режиме в мембранном биореакторе может достигать 30-40 циклов и ее величина определялась технологическими особенностями процесса.

6. Даны рекомендации по практическому осуществлению процесса трансформации глицерина в диоксиацетон в мембранном биореакторе.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Фэн Пин, Садовникова E.JI., Марквичев Н.С. Биотрансформация глицерина в диоксиацетон в мембранном биореакторе.// В сбор "Конференция молодых ученых РХТУ им. Д.И.Менделеева", 1996 г.

2. Фэн Пин, Марквичев Н.С., Манаков М.Н. Биосинтез диоксиацетона уксуснокислыми бактериями в мембранном биореакторе.// Биотехнология, 1996 г. N5.

3. Manakov M.N., Fen pin, Markvichov N.S. Glycerine transformation in dioxyacetone by Acetous bacteria immobilised in membrane bioreactor.// In ternational Conference on Biotechnology for industrial Production of Fine Chemicals. Zermatt, 1996 r.