Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация глицерина в диоксиацетон неразмножающимися клетками GLUCONOBASTER OXYDANS

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Трансформация глицерина в диоксиацетон неразмножающимися клетками GLUCONOBASTER OXYDANS"

о од

, „.--., НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

! 1 : ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ

ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.188.54:577-088

КУСТОВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА

ТРАНСФОРМАЦИЯ ГЛИЦЕРИНА ВДИОКСИАЦЕТОН НЕРАЗМНОЖАЮЩИМИСЯ КЛЕТКАМИ ОЬ11С(ЖОВАСТЕР ОХУОА^

03.00.23 — Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в Московской государственной акадс мии химического машиностроения.

Научные руководители: доктор технических наук, профессор П. И. НИКОЛАЕВ кандидат биологических наук Н. В. ПОМОРЦЕВА.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И. Н. ПОЗМОГОВА, кандида биологических наук В. А. МИРОНОВ,

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследова тельский институт пищевой биотехнологии.

Защита диссертации состоится « февраля 1994 г в Н.ЗО часов на заседании специализированного совета ш биотехнологии Д.098.00.01 по адресу: 125299, Москва ул. К- Цеткин д. 4/6, НПО «Биомаш».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Науч но-исследовательского проектно-конструкторского институте прикладной биохимии.

Автореферат разослан « /3 » января 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета

и: И. ГУСЕВА

ОЕИМ ХАРАКТЕРИСТИКА НАШИ

Актуальность темы. Диоксиацетон - 1,3-днгидрокси-2-пропа-нон - представляет собой высокореактивнуи кетотриозу, перспективы применения которой широки и разнообразии. Это вещество является промежуточным продуктом углеводного обмена в клетках различных организмов и играет вакную роль в окислитетышх процессах. При нанесении на коку человека циокспацехон (ДоА) реагирует со свободными аминогруппами в'бе^-аХ эпидермиса с образованием окрашенных в коричневый цвет соединении. На высоко,", р -.¿кциониой способности ДОА основана г-зыохность его применения в медицине, парфшерии, текотильной промышленности и других областях народного хозяСс ;а.

В Российской Федерации ДОА в промышленном масштабе не про-■ ; вводится. ' ' -

Известные микробиологические пособи получения ДОА используют глицероддегидрогеназную активность развивавдейс в полно. ценной питательной среде культуры уксуснокислых бактерии. Процессы, основашше на ферментативной деятельности неразмнохающх-оя клеток, пожар вести на более простой по составу среде, что упрощает выделение продукта, повышает его выход и одновременно ведет к снижению его себестоимости Важное преимущество такого рода процессов - уменьшение количества отходов, что позволяет считать их экологически более чистыми. Поэтому разработка процесса биотрансфо^ции глицерина с использованием неразмножаю-щихоя клеток бактерий и явилась основой настоящей работы.

Паль таботи. Цельп настоящей работы было изгчение условий тдассфодоацш глицерина в ДОА свободными неразмножавдимися клет-каш с1иооаоЬав1«1> охуйша , обеспечивающих максимальную про-г/ктивность процесса и операционнуюотабильность клеток бактерий, а также исследование в- зиожност* непре^вного полу', .аия ДО! с использоваш-. неразыножаицвхся клеток. -

, . Задача исследования. Для достижения поставленноп цели необходимо било ропить следуваде задачи:

1. изучить влияние условий культивирования на рост и активность клеток бактерий.

2. Изучить влияние ^¿ктс^ов регуляции гдвцеролдегвдрогеказ-ноа активности неразтюхающяхся клеток бактерия.

3. Определить операционную стабильность неравмножагоихся клегок шогокрагноы использовании биомассы.

4. Исследовать возможности непрерывного получения „ОА йе-размнонавдиыися клетками с рециркуляцией биомассы п; . использовании мембранной технологии.

Научная новизна и значимость полученных результатов. В результате проведешшх исследований определены кинетические кон- ■ ' станти со кислороду и глицерину. Предложен метод определения коэффициента поддержания кизнедеятольности по кислороду явя не-размногаЕШхся клеток. Измерена удельная скорость потребления кислорода и коэффициент поддержания жизнедеятельности по кислороду. Показано, что обогащение воздуха кислородом приводах к . увеличению продуктивности процесса трансформации. Изучена зависимость продуктивности к удельно;; скорости образования продукта ох концентрации глицерина в среде и от количества реакционных циклов.

Установлено, что жизнеспособность бактерий в условиях лимита по азоту снижалась в зависимости ох концентрации глицерина в ореде и количества реакционных циклов. Бактерии, утративши^ способность к размнокению, оставались метаболически активными в течение длительного времени. . ^ V ■ .

Показана- возможность использования свободах неразмнокаю-цихся клеток бактерий для непрерывного получения Д0А о модулем' микрофильтрации.

Практическая гетшеть. На основании проведешшх исследований разработано несколько микробиологических способов получения ДОА с применением ке^азмнокающцхся клеток. Составлен регламент на производство ДОА керазмножаваимися клетками бактерия. Технология внедрена в производство, внпущзво несколько коммерческих партия диоксиадетона на опытяо-промыоленноЯ установке.

Апробация тойоты. Основные положения работы дохладавались на а Всесоюзной конференции "Теория и практика управляемого культивирования" (Киев, 1981г.), на П ВсесовзноЗ конференции "Управляемое культивирование" (Путано, 1986г.), на Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболия»" (Питало, 1989г.), на УП Всесоюзном симпозиуме "Инженерная знзккологкя" (Москва, 1931г.),• на Научно-технических хон$ереншипс ШШД фосива,1987

- з -

а КЭЗгг.Ч

Пуб.тпгагглп. По гокэ дассортадяи опубликовано 14 рабо?,' ь геи числа 4 авторских свидетельства на нзобргтения..

У Объем таботи. Дте. эргаци состоят па вводкшя, обгорз легс-рэтзрп, окспортасагальпои частя, обсуздзшгя результатов п выводов. Рлбога налоге!» гл 143 стрги—цах к-гпгшсапспогй текста,.со-дэрзяг 25 рпсупио п 1б гайяиц. Сппсок литература вютеюг1£5 рзбог огезссгвошш и саиба да авторов,

ССШЗЗШЗ СОДЕЕШШ Р.ШШ1 i. обыииг. п'кпгост есслсеовпияз

(Зсиозпым сбъоиси- кссадовфж" слрт« сгз!.:л уксусвокзолЕ бз::торз2 сгизоаоЪаогвр охуасдэ 'I 621, лсбззно вродоставлошшй проЭ, ЛП Ц,С.ЛойвшскоЗ. • | ,

Культуру о. окуйопа поддзрфязпда кз агаряроваппоз срэдо, содзрг авД С% глисвр-на, ¡¿{^ГО^ к 0,.°"! по сухкм вепесгпау дратквоЯ вода. Сосгаа ядаой яагзтвдькоЯ среда определялся нежа экспврт-теям. Спока для граиг^ор^пгл! по содарглла дроггд-псЗ сод!. Та г.;?.? эбразои,.бокхаргя прл трансформации из егзли г.с-го'спггл сзога п «пгажшз - субстрэ-а пшсгруктивного сбкзпа <, (СКО).' I

Культуру сирзетсазп' пр.. тпгзрагурз 30°С 1 колбах па гачзл-::о. огдсдлля цои?р::$угаропзп::е:5, пуо^залп водоЗ я хра-

пал пт:л 0~;°С а пслглестпо срзда дм транспорт цгпг.

3 опигах о ;:пого::рпг:2г! ;хЕОДьгоэз!П!с:з бьонасси бзктерав „где-дш цгагрзАук'роазпсом посла яггаого цикла окисления, врогива-ял яодо£ ¡1 сроден дгт ^ралс^ор^оцдя, затем помешл™ в сзо^уя . сроду а проводила слодугстА 'цяхл оклслея:;".

Эглпзряыснгн с нераклгс тгаггася глотками выполнялись в на качал.» я в баорзакторз с юшшсшшам гассооб^идо». Урезонь аэрация а бяореакгоре варытровалц путем пзм гения чксла оборотов игылкя: п шЬ^лонзс • частого кислорода к аэрир^-т^у воздуху. Гл?окс:!Шоо?ь аэрация вмрзяалн величиной сульфитного числа «1>1ы.нолл, ЫеЯнелл, 1957). Колччоство раств ^ешгого кислорода определил» с помогая кембрг него датчика р02 п льва пресного т;ша. Зпачеши лабиального давления кислорода пересчитывали на коиценграсп» раетворекког г"олорода. Для э^ого балп проведены опнти по определенна растворимости кислорода в водной

| раствора глицерина и ДрД (3£-ных растворов) по методу П.П.1 кеева о соавт. (1973). Растворимость кислорода в зии уело: соотайила 7,086 мг'л.

Для экспериментов по определению материального баланс* кислород герметичность ферментера определяли ыаноыр"ричес1 методом. Зна\ лше pH в "ерыентере контролировали с помог».» метре ПВУ-5256. Для поддерк: :ия заданного значения ?а в :ер дозировал IO^-ннЕ раствор КОН. .

Посевным материалом сяужшш югетки, находящиеся а фаз« медлендя роста. Объем посевного материала составлял 4-5/5 ps чего объема. '

Количество биомассы определяли нефелоыетрическш него; во светофильтром 55L нм с предварительным построением .дхп< вочвой xapt геристикн.

Диоксяацетон определяли фотокодометрическим из годом о делением хлористого трифенилтетразолия, светофильтр 550 ни (В.Е.Плакунова, 1962).

Измерения концентрации сухих веществ в питательных ср* проводили рефрактометрическим методом.

Жизнеспособноеть бактерий определяли вряшш методом bj ва на н-ютную среду в подсчетом выросших колонке.

Для выделения А1Ф из лиофильно высушенной биомассы noi зовали обработку в ншшаей воде в кипячение в течение 10 и в дистиллнрованнс"*. воде. Биомассу после обработка.отдаляли трифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Величину су^ернатанта доводили до 7,8. Количество АТФ в пробе игмер биолшинесцентным лщиферин-%гаоциферазнш1 методом (Стрелер i с авт., 19*2). Результаты приводили к I г "ухо^ биомасса б терий.

Полифосфаты экстрагировали кв клеток по котоду Ы.А.Не яновой (Несмеянова и др., 1973). Фоофор во всех опытах опр ляли по методу Беренблша и Чейна в модификации Вейль-Ыале и 1*рана (1951). •

1анк_е, представленные в таблицах и рисунках, являйте статистически обработанными результатами экспериментов.

2. Влияние условий культивирования на рост tt.oxvdana и образование ДОА растущей культурой

Mi-чробиологическай способ получения даокснацетона нер

ынагавдвыг^я клетками (Н.В.Еоиорцова, Т.Н.^.раоильникова и др.; 1974) основан на способности бактериР осуществлять трансформацию глицерина в среда, не содержащей источников азота в вигаии-* в, в. При атом скорость .рансфориацпи глицерина кера зынохавдими-ся бактериями сравнима или даао превосходит скорость трансформации глицерина растущей культуроЬ. \ ' ; . •

Для получения JÜ0A неразынохашлошся клетками необходимо предварительно нарастать даст ючное количество активно!! <5г пассы. При выращивании бактерий в питательную сред? вносят глицерин , субстрат конструктивного.обмена (СКО), в состав которого входят азотсодержащие вещества, витаг-шны и другие соединения, отвыулируицде рост бактерв*. В кач^чтве СКО при выращивании G oxydana обычно применяют среды, содержание кукурузный экстракт (Коаерчек, 1965; Грин, 1967), дрокхевой ь«>стракт (Саттлвр, 1965) или дроякевув поду (Н.о.По^орцева, 1974). Подбор питательных cpf, различными исследователями ранее ' оуществляяся по признаку скорости окисления глицерина и степени его превращения в ДОЛ (В.А.Янсон, 1979;-М.В.Оверченко и др., Г981). В наших экспериментах пнтат-льнуп сроду подбирали по признаку иаксимально-/о уроаая g. oxydfie . максимальной скорости роста н проверяли' влияние условий культивирования на удельную скоррсть образования ДОА неразиножающшися ш^ткаыи.

Изучек-о влияния дрожкевоц вода на рост клеток показало, что концентрация биомасс! значительно возрастала при увеличении количества дрою^вой вода от 0,15 до 1,53 по сухиы ве^ст-ваы (рвс.1). j

При содерканпп дрохкевой водаот 1,5 до 3% ургтай клеток составил 1,9-2,2 г/л. Кзэфйццсснг скоростг роста увеличивался гиперболе при небольшом содержании дроаяевс£ вода, бистро приблизился к величине J* « 0,1 ч"1 цри концентрации дрожкечоа вода около IÍÍ и значения 0,14 ч при конце :радаш

СКО. кивноЛ 3/. J^cJítía* скорг ль образования ДОА круто cr isa-лась C 2G.0 г ДОА/г с;£-ч до 5,1-г ДОД/г СЕ-ч при увеличении соде гаик- г дгшяево;; вода с 0,15 до 3,0%. Дальнейшее увеличение . кси -'ррлцли СКО прпвод-'ло к плавному уиеньшэшг уде"ьно£ reo-; Р-^гии.оо]2ое'Л!;'я продукта. Степень окисления глицерина в ДОА « . по мере увелнч-яп* концентрации -роюевоР.

.зависимость роста бактерий от концентрации

ростового фактора найявлали при вспаямования в пачоогво СКО дрожжевого окетракта. Добавление в ередо, содерващоЕ дрш аевого .экстракте, сернокислого аыыошш в количества 1,0; 2,0 I 3,0 г/л во привело к увеличевап урожая клеток. Вырощтзвяо Сзд терей на "редок с ра&тгшыы содоргашюз СНО но ссааалооь ез транс$ор«ациа -'лацврпна э ДОЛ неразмноЕавгщшся клоткаш.

^воЛ. Влияние концентрации дрогаевой воды на накопление бяо-ыассы (I;, удельную скорость роста (2), удвльяу» скорость обр эоэаиия ДОА (3) и степень деления глацервиа (4).

Изменение концентрат« глицерина от 6 до во влоае? в рост биомассы при .¿держания СКО в среда около 0,15 (Поводов в "Р., 1974). При содержании в среде 0,5% СН) увеличение еспп транши глицерина с 2 до 1055 увеличивает конечные урожай блкгс рай с I г/л до 1,5 г/л (рис.2).

Такиы - Зразой, главный фактором, влиязим на рост бах»! в среда с глицерином, является концентрация СКО.

Одним иа способов повввения синтеза метаболитов ынкроорз вазшча, не связанными —:а частично связанными с ростом, дои ся применение ингибиторов (И.Л.Работнова, 1980).

Наш проведены аксверииевти во влияназ ингибитора белхо; синтеза - лавоыицетина - на биотрансфорцацив глице* .та. йока; что девоыицетив в концентрацаа 25 кг/л увеличивает удельную < рооть образования ДОА в 1,5 раза, а в-концентрации 50 кг/л -2,5 раза при замедлении роста бактерии. При трансформации гл

рина нервзмноиаввишгся клвгкаия о условкг^ : -вгаешиЛ аэрация был ва 30£ ьипе, чей в опыте без левоизцетипа. Известно,г о в результате ингибпромвия синтеза злков левокицеТином (хлор-амфениколом) меняется ыегаболвзм клеток: происходи накопление свободных аминокислот (Шульговская а др., 1980), замедляется обновленке белка в распад ферментов (Перт, 1978). V

Ингибитор окислительного $оо4ор;1лированвя, 2,4-данятро$о-нол в концентрации 30, 50 и 100 ыкг/л, сникает урожай бактерий' в 1,5, 2 в 3,5 ;аза соответственно, но увеличивает удельна скорость образования ДОЛ от 3,3 г ДРД/гСБ'ч 'в контроле) до 14 г ДОл/'г СБ'ч пра концентрация 2,4-ДЦФ 100 мкг/л. Действие зто-> то ингибитора на окислительную активность веразыножавдихся клеток било незначительным. '!

* Такай образом, различные свособи подав-г• тля сяпгетическвх процессов в клетках могут ' ривебта к увеличению активности формантов катаболизма следовательно, к увеличс ли удельной скорости образования ДОА. |

| «

3. Факторы увпллулп активности неваг-чножастохся клеток :си тсана^ошацки глицерина в ДОА

Влияние аэраняа. Вирачзванае бактерий ври пнтвнсивноста аэрации 1,1 а 2,0 г 02/л«ч показало, что коэф£"тяент скорости роста " обоих вариантах Сад о; наковиы и составлял 0,12 ч~*,а удолзшая скорость образования продукта была в 1,7 раза внпе щ . болызоИ интеисптк :в аэрацая (2,1 в 3,5 г ДОА/г СБ*- ^.

. Удздйнзя скорость образования дпопяшцэгона верагмно-■гашимися клег^ама вря увеличен. пнтенспвкоота аэрация от 0,5 до 8,4 г О^/л'Ч увеличивалась в 10 раз. Дазъпайзз*. увеличение интенсивности аз: ют до 15 г О^/л-ч несобственно увеличивало а^(таблЛ).

Значение "сульфатного числа" характеризует скорость пос-тушгчия кислорода в с. чду, но по позволяет судить об изменена« содераиыая к;;сгсрсда в результате потребления его мякрсор-гаш:жш.: . Поэте:;.-,' п ошгазс по трзнс^'орицпи глзг-чррлм нарзвмно-к.-«ткги:ц йактогп;: изкегя . конценграц.'ш то с творенного

•'•'.■■ " 8 - ' . г-'" - ' ■

- . ■ . '•'/ Таблиц?»' I •

Зависимость удельной схоростч образования ДОА' ^ неразмножаицг тся клетками в концентрации кислорода от интенсивности аэрации .

Скорость вращения ыепалки, об/ман ..лтенсивш ть аэрации .. . ("сульфитное число"), ; ыг о2/л.ч Удельная скорость образования ' продукта, г доа/г СБ'ч Ыинимальная » концен"рация растворенного кисло сю^, мгД

0 ■ , 0,5 | : ■ . . .1,0 0,05 ,

:. 8оо 2,2; ' , 3,1 0,21

■ 1500- ■ ■V; 6,11 1 5,2 0,4-

; /1500 • 8,4 10,0 0,94

2000. 15,0 Ю,б. 1,46 .

Установлено, что при концентрации кислорода в сред- 0,94 -«г/л достигается >акояшкьвав окислительная активность клеток при 'исходной концентрация мицерина 60 г/л и плотности бактериальной суспензии - 2 г/л.;

Показано» что ^кспараыенташше соотношения меядуконцав-трацией кислорода и удельной скоростью образования ДОЛ удовлетворяют уравнению Ыихаэлиса - Ыентен, а константа К^ по кислороду равна 0,898 иг 02/л. ^ \ • • . Прн трансфор. .цпи глицерина суопенэиеЛ неразмнокаювшхся клеток различное плотности определение концентрации растворенного кислорода показало значительную зависимость ее от концентрации биомассы (рио.З). '

Для же знсифакации процесса трансфорыа-ян глицерина'в ДОА было исследовано влияние обогащения кислородом воздуха, используемого для аэрации. Увеличение концентрации кислорода в этих опытах , до 1,8 шЬ.^л сказалось на процессе транс$01адщш двояким образом (табя.2): в опытах с меньшей концентрацией биомасса увеличилась удельная скорость образования ДОА, а в опатах о . большей плотностью клеток увеличилась : продуктовое« по сравнению с данными, представленными в табл. I.

Ть-лигв 2

Технологические показатели процесса трансформации глицерина в ДОА неразиножаодимис* клетками в огштах с обогащенном аэраг-в кислородом

Концентрация биомассы, г СБ/л Продолжительность опыта, ч Удельная скорость образования, г ДОА/ СЪ-ч Скорость накопления ДОА, , г дод/л'ч СтЭпень "окисления глпп|рина.

5,0 2,1 5,4 26,9 93,5 .'.

2,2Ь 2,0 12,4 , 28,0 93,3

1,35 2,9 12,7 ! 17,3 - . 82,4

В условиях повышенной концентрация ^створенного кислорода била-поставлены опыта по определению.ьатерцалы.л'о баланса кно-, лорода при трансформации глицерина нерззмног^вщрт яся клетками, привод' гар^отичного ферментера, с на (Зленного чеша^исой, осущесг-' влялся от двигателя пост-энного тока через магнитную муфту. Газовая смесь циркулировала в замкнутом контуре: компрессор -ферментер - газог/^тр - компрессор. Концентрация растворенного ; :слорода лоддоряивалась на уровне 1,5-1,7 кг/л добавлением чистого кислорода' из газометра по море его потребления. Процесс окисления считали законченны... когда концентрации -растворенного кислородг. е чпяаля увеличиваться, без добавления новой погни кислорода.

процесс трансформации глицерина в ДОА происходит по ур^в-нешэ:

си. он • . ■ ■ сн2са

2 ШОН . + 02 ,„. 2 с ~ 0 + 2а20 / I /

СН20Н СН^Н

Кислород потребляется в процессе реакции (I) и на под«,-рга-' ■ нае аизнедеятелыгости бактерий. Вкчигввая из общего к-, -.кчёстаа кислорс ..1, не еблотюго летк?-,и, кислород, посэдияй на оС эзо-ванив ДОА, определяли коэуйкцпенг поддержания кпзцедеятельностп по кислг-ю^ т^. Сбкзру^на коррэляг"я удельной с: ¿ост образован™ ¿ОА с удельно}' скоросгьа потребления-киг-орог^. Эта ког-реляи.л .может бить предс^заиа теоретически, исходя из стехиометрии расходована кислорода на образование ДОА с учетом допо. нигелъг.оЗ величины. т0 . Для неразкно;»аюкеГ;ся-культуры удельная.

oxopooTi потребления кислорода

Ховффидаент поддержания жизнедеятельности со кислороду для и размножа...досоя клеток составляет 0,84 + 0,37 г О^/г На рис.4 представлен график, на котором Мщ принят из акспер нм талышх данных, а отахяонегр..ческий коэффициент«^. " О, г 02/г ДОА. llj графика видно, что ш.2дешше экспериментальны цчения соогветствупт теоретически рассчхтакной «авгоимоств погрешностью ± 3,8^ «ли + 0,23 г О-Уг СЕ-ч.

Вдляииа ufl. Для определения оптшйашюП величины рН оря трансформация глицерина в ДОА но1взмно»дааим"ся клетками в s висиыости от количества реакционных циклов была поставлены о ш в фермен-чре. Заданное значение рН в интервале or 5,0 до поддерживали добавлением ICit-ro раствора гидроокиси ши. П различных цкг~ах окисления влияние рН на удельную с коре ть о разовавия ДОА проявлялось по-разному (рис.5). Обсвя картина ввсямостн удельной окоросгл образования ДОЖ от велнчены pli а многократном использовании биомассы подтверждает наличие дву глицерогпегадрогеназ. Сныти, проведенные совместно с ШО "Ь* мины* (Ъ'.Лнбер), показали быстро исчезающую удельную активно НАД-зависимой дегадрогеназы (табд.З).

Таблица 3

Удельная акт. лность 11АД-зависиио1! глицерол-дегидрогеназы s биомассе с.одуйап»

Биомасса Удельная активность "АД-зависамой гл;:церг идро-геиазы, мкЦД'г селка'мин

Исходная 0,00^76

После I цикла

окисления 0.0UG643

После 3 цикла .0

окисления

Вероятно, при центрифугировании и прот наи биомассы растворимая фракция глицеролдегидрогенази 'бистро теряла сво! активность, и основное влияние на удельную скорость образов* ДОА начинала оказывать "кислая" дегядрогенага, в связи с чег уже с г.етьего цикла окисления оптимум рН сдвкгался в кислу«

зону.

Или дня *з уонцо|г:..1г.пц субсу^ятп и грдуктп« ¿дд оцрамдеиил зависимости схороста основания ДОА. о: ¿днцентаацаа гляцораиа была проведена сорил опытов d лабораторном <£opueutep« при ком-ц'знгрпцяа гллцорши ог 5,0 до 150 г/л. Но агбезшикв лпмата^огз-нля по кислороду (ряс. 3) для обработка результате» отобрала эксперименты с хонцвнтраэгоД бакторгилышх клеток от 0,Й до I,Q г СБ/л. ¡¡оказано, что завиашють удельно* скоройга обре ДОА ог начальной концентрации глицерина а оуодв подставляет собоЯ гиперболу. Сдедовцтедьио, iîojtho утверядать, что прогаеа транс^ориапия ^лацерякц о ДОА подчиняв гея уравнению Уахаэлаоа -Ыентоа. Результаты а тих вкспера^онтсн, обработанные гри£о-сша-ЛИТ1ГЧОСК1Ш методом Хлйнуадврз - Барка, подтверждают это предположение а позволяет вычислить со глицерину, которая раин л 28,6 Г/л.

Динамика образования дяокевзцетока иоуазмножлпзшасп бактериями обнаруживает заыодло:-ше реакции а кошм киздо!! крявоа (ряа.6). Это CHiuteiuj скорости накопления ДОА вызывается как xt-ынтпрукиш влиянием низкого содс;хзшш глицерина в конце каждого цикла, так и, вероятно, яетибярумкм влиянием продукта трансформация - ïi)А. Результаты опытов по добавления ДОА в количестве от 5,0 до 50,0 г/л в обычную среду для грэнофорщиш! обнаруживают пнгибировиние продуктом. Кмнотике Иерусалимского ото ингиби-poL^ime не подчиняется.

Влияние концонтгаган блы-мс^ц. Обнаруженная зависимость удельноа скорости образопанпя ДОА ог концентрации 6:t. -¡accu (ряс. 7) по сорие напоминает зависимость концентрации растворенного каслоролаогхэдгчестпа бактериальных ксеток (риа.Э), Вероятно, этот и определяет запас лшатъ ог концентрации биомас-

сы. Поскольку ддл расчета производительности вшговедо параметром является продуктивность процесса, била определена савкоп-ыость продуктивности образования ДОА от кшшеотиа бактерий. Из рис.7 видно, «но какекмадьную продуктивность проц jco в дашшх условиях аэрации обчспачиняетшнпйнтрацил баоиассы не ионее 0,4 г СБ/л.

с,в

Ш

Л

6

* й

• уУ

- 4

40

, глицерин, %

Рис.2. Влияние концентрации Рис.3. Зависимость глицзрина на рост биомассы (I) мольной «онцентраци и образование ДОА (2). творённого кислород • конщ -грации бисмас

"Г

0 Т 3 Ж 16 ^

,Рис,4. Зависимость удельной скоросг потребг чик кислорода ( 1-02/г СБ-ч ) от уд г.. лой скорости образования ДОА % ( г ДОА/г СБ-ч ) нераз-ыножаючкмися клетками т^- коэффициент поддержания * iнeдeятeльнocти по кислороду, р 0^/г-СБ-ч. ' . '

\ ,

Г з .5. Влияние рН на у, скорость об; -.зования Д при трансформации гляц неразмножаэдиыися клет в последовательных цик окисления I 1,2,3 ).

■; i- ..хэ-» ■

4.' .Зяогократкое использование биомассы негазцарждвютхсд ' '' клеток рря грапсдошац' " глпгерина в ДОД рянаипка АТлМг,..-) - полид:ос4'агов г -летках» Проведена Жбыо-решш с "дёргания А1Ф-пула в клетках различного фвааологйчеокого состояния и после ыногократвого использования неразмножадщдя клеток (табл.4). Определение AW-пула показало гтмчнуг данамй-íy накопления этого соедтшеняя при росте бакгервЛ в пгтагельпо2 рреде.

Показано, что ~одерзанпе различных (;ракапЯ,полв$оо4,~ toe зависит от возраста культуры в содераания фосфора в среде. Наибольшее колачестзо поля$ос£;атов накапливается в экспоненциальной фаза роста. Уровень внутриклеточного оргофос&ата в завяон-ííocth от возраста культуры изменяется незначительно. Только в, бго!дзссе неразмнсягюпихся бактерий посла пятя циклов окисления в ореде с $оа&тадм буфером количество орто$осЗата саьзтно уве-ч дичилось. В этой же пробе сильно возросло количество наакоколек куляршас пода^ос^атов (таб.7 5). v ¡ * , . : ■••• ," •v ' • .*": Таблпта 4

Содержание ATO в клетках О. oxydaaa , , р.', ..]{',

• Физиологическое состояние Количество ATO. мкг/г

культуры X ОШ1Г ¿ опыт

Качало экспоненциальной йазз 240

Середина экспоненциальной фазы • - 402"'.."

Конец экспоненциальной £азы , 150 л 409 ^

Стационарная фаза ао ■■ 1% .

Биомасса после 3 циклов окисления 170

Еяоиасса после 2 циклов окисления 309 -

Примечание: Еяоиасса для 1-го опыта о неразыкоааадиыися клетками взята кз конца экспоненциальной фазы роста, а для 2 -из стационарной, , ; , ' ? ,

Результаты этих экспериментов подтверздаюг выводы исследователей о том, что при неблагоприятных условиях, когда рост ва-медден, энергетические процессы прододааются (И..'..?абогкова, 1975), а не сокращаются в соответствии о сокративикиися потребностями на биосинтез биоиассн.

Операционная стабильность бпокатализатора- Для определения стабильности окислительной активности бактерий я продуктивное-

та rpaüoi&.^üxa глицерина нсразкнохагжймися, клетками били с водоцы аксперименгы по ывогокрагной г^!!с$охза"лп глицерина ЛОА n¡« концентрации глливри. j о cper? от 40| г/л до 100 г/л. Продуктивь-оть процесса при начальной коицвцтрашш гляцвряп среде 40 г/л сохраняется практически на одной уровне в гечег II циклоп, при !шча ной концентр; лв глицерина « среде 80 1 в течение 7 югхлов и при концентрации глицерина в среде 100 - в течение 5 циклов. '

Таблица 5

Содерюняе различных (¡ори фосфорных соединвярЯ в кдегк

Физиологическое * «^стояние . ^дьтур* Внугрииегоч-ныг. орто£сс- иг/г СБ Нязкомолску-лярные поли-iociaru, мг/г СЬ Высокомоле! лярнне пол "осфати, дт/г СБ

^кспоыенц.фз8а 7,18 : 18,07 6.3Ó

Ьтационар.^аго 7,70 . 2,20 2,54

росло 5 циклов окхсл 9,36 ■ 6Ь,4. 2,47

Технологические показателе, хт-охтеризуиссе операцяонн; стабильность бсокаталязаторв при различной конденсации гли на в с.оде, выест обспе черты во всех опытах (рас.8). Конце цел биомассы а течение 4-5 циклов окисления сохраняется поч "п постоянном уровне, несмог¡я на потеря при пентрс{угирова и в процессе отбе* проб, вероятно, вследствие кркптогенпог ста (Роуз, 1971). Затеи происходит резкое, падение концентра блошссы - щ ¡шорно в 2 раза за кавдые 4 цшиа окисления. li дуктшшость снпгается незначительно только к 12-ому циклу о ления, о удельная скорость образования ДСА даае увеличивает по мог« укешления количества биомассы, что связано, ве^ях с улушенгеы снабжения клелородог оеггвпяхея: клеток.

От чдедениг мзнеспособности поразит.* -ощахся клеток в вгеикостп oî количества реакпвошшх даю.ов в концентрации г PBj..,' (рнс.9) показало, что количество звзнеспособлых клетег уменьшилось более резко, чем продуктивность л удельная си образования продукте. Из ?того мохно. сделать вывод, «-о нле системы, прлшаалсве участие в процессах репродуку.г., с ее терярг свою активность в усовгях голодания по СНО по с нению с ферментами, учяствуьош! в процессах ката б ел;:::.'«-,, i

У г/ ш

0Р5

у

Ч^Ч

Рис.в. Динамика образования

ДОА ц9£ззш!гсе1вдж;*ся клетками 0. охуйааз пц: различных концентравдях биоиассы< г/л).

Гкоиасса, г/л

Ряс.7. Зззиспкость уделънк схоросгг ой1зэовалия ДСА и продуктивности (2) от кои^сит^ог^п б:!о:.:псси

4. 21 3

количество

и и

циклов

Рис.8. Зав!!си1ясть удельной скорости образования ДОА (I), продуктивности (2) и концентрации биоглса: (3) от количества реакционных циклов, концентрация глицерина в среден 60 г/л.

Н 6 ю

количество циклов

Ряс.9. Зависимость жизнеспособности неразинонагавх-ся алеток от количества реакционных ци...оа при различных концентрациях глицерина, -г/л.

но гаком; же воздействию супраоптимальных температур (Н.Н.П< могова, 1974). |

5. Î: »ледование возможности непрерывного пропесоа биосинтеза ДСА нетазмнояаюаикися клетками , Do.tyiienpeçiibh^'t процесс о гуиркуляцпвй бл ассы. Проц( осусоствгллл таким образец, что при окислении £0-Щ2 задана количества субстрат: ?асть суспензии отбирали, бактерии отд< ли от раствора и возвраоалЕ в бпореактор с ;новой порцией ор< для окисления. Показано, что неразхноаашаеся клетки сохрани высоко глицеролдегпдрогеназную активность. При ».онцентрацш глицерина в среде 6С г/л проведено 17 циклов с возвратом бш си. при этом условный коэ&сцаент разбавления составил в ср< нем 0,44 ч"1, удельная скорость о ."•азовакия ДОА - 6,8 гД0А/: СБ*ч, а ародуктивпость - 16,2 г ДОА/л'ч. Пр.. конпентпаг*и г. рина 80 г/ч ксэС^игюент разбавления составпл 0,29 ч , удел: скорость w-рвзоракля ДОА - 13,Ь гДОД/г *ч, а продуктивное; 18,4 г ДОА/л"7. Î

Кептчзгивзш}; пуоцссс синтеза 'ОА с У дерганием биомассы i бтреактого путе:.: цпкго:Тггътгацги. Опыты проводил., в бкореа: ре с выносной ы vrpojг.л.ьтрацпонно:! ячеГкой, содержащей полуи; цццаемуо ядерную мембрану из лавсанового волокна с диаметре! пор 0,5+0,03 маз. Культуролькая еидкость постоянно цгр!^лир< ла через, кг гойг'т.гращюннуь ячейку, прк этом тетки возвра! лнсь в биореактор, перысат собирали в приемную емкость, а в реак* ? непрерывно подавали среду дая трансформации. Основго технологические показатели непрерывного синтеза ДОА керазмш цшцея кгеткаки (табл.6) позволяют сдатять вывод о возможно! осуссгвления непр^рывн 'о способа получгпяя ДОА.

■Таблица 6

Осяовные технологические показателе г трерквного ьрицечеа пилученщт 1РА с применена ал мпкро^ильтраотя

Кача.ш. i кон^ентрасил глицерине в среде, г/.- 40 É£> 80 100 îïo

Средняя продукпц'нс гь, г ДОА/л-ч Г-«Х0Д „ОА, $ 8,3 В9,„ 14,L 78,5 17,5 81,0 e5,ie Ъ.З С/,о "Ц

Переход :: вепре; лго:лу сгособу получ«н::я ДС'л

í

кскигг-ь использование дорогостоящего оборудования, уменьгашт-оя потере биомасса и увеличивается производвтельнс ть процесса.

ОСНОЬ. JE -"ШОШ И ЕВЗШГ ТЫ

1. Подобраны условия культивирования ciuconobaotor ахуйеа, обеспечиваиияе максимальный уогай клеток п скорость роста.

2. Определены кинетические константы Ку для кислорода, равняй 0,898 иг/з и коэффициент поддерганпя хдакедеяидьностя пй кислороду, равный 0,84+0,17 г 02/г СБ-ч.

3. Проведена юпераментв с повыпенвой кондантрацаег. кяс-лорода в воздухе, используемом для аэрации, к подтверждено положительное влияние этого приема на скорость биосинтеза ДОА.

4. Предложен метод изучения баланса каслородз в процессе хрзнсфор/лцзи гляцерзна в замкнутом контуре о регулярояанвем постоянной концентрации растворенного кислорода подачей газообразного кислорода я'з газометра.

5. Покааано, что кинетика процесса трансформация гллцарягс» неразмнояапцикяся бактерия..: подгоняется- уравнению Ьйхазлпса -Ментен. Определена ..онстлнга , равная 28,6 г/л. Выявлено вп~ гибируюиее влияние повивенних концентраций J3DA па продуктивность "процесса.

6. Обнаружено, что величина рН, оптимальная по староста образования ДОА неравкножагадаяся клоткани, меняется в заятск-иости от цикла грансфоркагиа.

7. Показана, чтэ сперадаоЕная стабильность паразиясгагсях-ся клеток зависит от концентрации глицерина и количества реакционных циклов. *

8. Выявлено, что в процессе многократного пепользоваязя" неразмноваоцахся клеток число жизнеспособных бактерий ензззетед значительно быстрее, чем продуктивность. Бактерия, утративпиа

\ способность к размножению, в'присутствии источника энергия: остаются метаболическа активными.

S. Показана возможность организации непрерывного процесса получения ДОА свободными неразмножавпщмися клеткг. .1 с преиене-ием кикрофильтрацип.

10. На основе проведенных исследований разработан регламент технологии производства.ДОА. Технология реализована как d лабораторных, так и а опытно—промыслен.. jx условиях с получением

коюгсрческцх партий продукта, использованного в качестве вента косметических кр.-юв ; цабрак» "1&ТКЛ

По ït-e диссертация опубликованы сдедурапо работа:

1. И.А.1&сгова,-Н.В.Поиорцева, Т.К.КрзсЕЛЬвнкова, П.И.Цгл

- йлаяше аэрзц:*:* на образована дяокслацето: i пз тлш Ciuconobacter oxvuoqo • - Ш<£КЛ.ба0Х.; И ЫЕКрОбИОЛ.,

15, ü I, С.51-55. . '

2. Т.А..'лхогк;:на, Л.Ь.По-ордсш, Л.Е.Лоуова, П.Л.Шшшк H.A.l-^сгсва, ß.n.toKOvJ, Т.А.Шропсва, Б.Н.иаксшенко. Способ пйг,учегп!я-даошшцегона* - A.c. ¿787462 ог 14.(

3. Н.А.Кустова, И.Е.Локсва, П.И.Николаев.- Влияв: рй ср; процесс траис^орглацал глицерина в дооксизцетон керзсг; клетками CluoonoJ 'stor oxydons . - Тезисы докя.Ш £с< шферош&и "Теория R практика управляемого культивар« ■цкрооргаццзион", ч.1. - Каев, ¿Sölr.

4. D.B.iiroHiai, Т.А.Ыахоткана, Н.А..^сгова, Р.'А.Еропш, В. сккенко, В.С.Еарбот, И.ЕДоиопа, И.И.Нг.Ки-шсв. - Ско"<

. лучения даокснацотока. - A.c. ¡> ÏI57847.EJ Л 19,

5. B.A.Epi ¡г:, Н.А.Кустова, й.Е.Лоуева, П колаов, Д.х.Зикоа. - Способ получения, даошшцетоиа. -A.c. й IU«t>87, EJ Ü 24, ISB5T. .

6. Н.А.Кустова, И.П.^аксев, П.Й.Нг'.оласв. - Баланс г-'.сло при оп:слеш:и глицерина в дцошгацогон перазцн'тагс;^ чдоткаиа Giuconotactor oiydaaa • - ÏC3GCU ДОКЛ. 1У ¿С

ко: ..орешка прав чжое культиацровзнм кпкрооргаавс Цукано, 1985г. '

7. И.Е.Доыова, Н.А.Кустова, Т.А.Лахоткана. - Полупаврзра кетод получения даошшцг^ока^окислэнг.ем глЕвдслка но ааетшас- кле-шш бактерий Ciucoao&5-cior »-vi tos с

• цуйшией 6r.cu.ccu.- Тезасц цокд.ХУ Всгсоззп.конторою ровляевое культивирование •)шкроэрганзз>.:оз". -, Душго,

8. В. .Барбот, Д.К.£иков, П.И.Николаев, Н.А.Кустова, П.Е

- Способ получения гганул о еасбилисовашалм iuösixj. терц!;.- A.c. К 135Э2Э9/Е1 S 46,. 198?г.

9. il.Е. Лобова, Н.4.. .(усто^о, b.K.UawoHTOB.- Влшзйе bl'coi С"ч:: вороакэв па окки.енке глицерина в диоксг* -етог ' и-и,- Тезиса докл. У Всесовзг юаспания "Ллаз^нкиа г в крталдтог;',п и технологии неирганичеокгх материалов' Нос XwSô. •

Ю. Н.А.Кустова, Т.Н.Красилыакова.- Влияние некоторых & .замедления роста на трансфоркзцаю глицерана культурой nobact охуааао ■. - Тезиса дскл.Всесовзн.ков^ерен: шррование и пнгибирование pocv„ микроорганизмов".-

(I. Н.А.Кустова, -Т.А..(!ахогкпна, Е.Д.Галкина.- Еизнеспосо! ферментативная активность £Упток ciuconobacter oxydai многократно!1 трансформации .лице гена в условиях гол! Тезисы докд.^сесоюпн.ког еренцик "Л^лтироват:» и наа роста :~:кросрг. .usrW. Пугглю, 19о9г»

" .■■ - Ю-

12. Н.А.Кусгова. - Полифосфагн в АТФ-пул в размножающихся и Ьт» мытых клетках oiuconpbacter oxydeag при окислении глицерина. - Тезисы докл1Всесоозн. конференции "Регуляция микробного мегаболЕЗш". - Пущине, 1989г.

13. Ы.А.Куогова, 41.В.'.1омова. - Влияние рада анионов и катионов на стабильность глицеролдегидрогеназноЯ активности клеток

Gluocnobaetisr oxydons. - Тезисы докл.Л! Всесоюзн.сшдаозиу-ма "Инкенераая знзнмология" (получение а применение биока-галпзагорон в народном хозяйстве и медицине). - с. 194, Москва, 1991г. ; ;

14. Ы.Ц.Крылов, В.С.Барбот, Н.А.Галактнонова, Н.А.Кусгова; Ъ.А.Еропкн. - Базисные модели в описания гетерогенно-ка галл гическпг процессов с демобилизацией. - Тезисы докл.УП Всесопзн.сшшозиума "¿¡наенерная энзимология" (получение и применение бпохаталпзаторов в народном хозяйстве и медицине), о. 195. - Москва, 1991г. '