Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсификация получения ферментного препарата глюкозоизомеразы путем воздействия твинов и хелатирующих агентов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсификация получения ферментного препарата глюкозоизомеразы путем воздействия твинов и хелатирующих агентов"

РГБ ОД

1 О ФЕВ 1998

На правах рукописи

БОРИСОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ ПУТЕМ ВОЗДЕЙСТВИЯ ТВИНОВ И ХЕЛАТИРУЮЩИХ АГЕНТОВ

03.00.23. - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Казань -1998

Работа выполнена на кафедре промышленной биотехнологии Казанского государственного технологического университета

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна

кандидат биологических наук, доцент Крыницкая Алла Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каримова Фатима Габдуллазяновна

доктор технических наук, профессор Герасимов Михаил Кузьмич

Ведущая организация:

Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина

Защита состоится СрьЩ'^И'Л 1998 г. в 14.00. часов

на заседании диссертационного Совета Д 063.37.05 при Казанском государственном технологическом университете.

Отзывы в 1-ом экземпляре, заверенные гербовой печатью, просим направить по адресу: 420015, г.Казань, ул.К.Маркса, 68, КГТУ, Ученый совет.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного

совета, кандидат технических наук,// ;

доцент А.С.Сироткин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для нормального функционирования человеческого организма необходимо введение в состав питания углеводных компонентов. В нашей стране традиционно основным элементом углеводного питания является сахар. Потребность в данном продукте ежегодно возрастает. Сырьевая база и мощности сахарной промышленности нуждаются в постоянном расширении в связи с необходимостью покрытия потребностей в сахаристом продукте. В настоящее время ведутся поиски как более дешевых источников сырья, необходимого для производства подсластителей, так и различных заменителей сахара. Уже получены подстластители, имеющие белковую (аспартам) и углеводную (глюкозо-фруктозный сироп (ГФС), инвертный сахар, кристаллическая глюкоза) природу. ГФС по своим медико-биологическим и технологическим свойствам значительно превосходит традиционно используемый сахар: он менее калориен, в меньшей степени способствует образованию кариеса, при производстве кондитерских изделий не требует предварительного растворения, при хранении джемы и повидла, содержащие ГФС, долго не засахариваются.

За рубежом, в странах с высокоразвитой экономикой, предложены технологии получения ГФС. Сырьем для получения ГФС служит крахмал, подвергаемый обработке с помощью ферментов ос-амилазы, глюкоамилазы, изоамилазы и глюкозоизомеразы (ГлИ). В нашей стране существуют отлаженные производства первых трех ферментов. Для получения ГлИ промышленных аналогов нет.

ГлИ - фермент, катализирующий реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу. Данная стадия лимитирует процесс получения ГФС в целом. ГлИ - фермент продуцируемый микроорганизмами. Это в подавляющем большинстве случаев эндофермент. За рубежом предлагаются технологии, включающие как использование фермента различной степени очистки, так и использование интакт-ных клеток микроорганизмов. В основном исследования направлены на оптимизацию питательных сред, разработку щадящих методов выделения и очистки фермента, создание генетически сконструированных высокопродуктивных штаммов. Последние два перечисленных пункта дорогостоящи, к тому же мутантные штаммы не устойчивы и через несколько пассажей происходит реверсия, при иммобилизации может значительно теряться активность фермента. Однако известны другие методы воздействия на культуры-продуценты с целью повышения их продуктивности, включающие использование различных физических факторов и химических агентов.

В связи с отсутствием в стране производства ГлИ представляет интерес поиск новых микроорганизмов, обладающих достаточ-

ной ГлИ активностью, использование различных добавок для повышения продуктивности штаммов-продуцентов ГлИ, разработка принципиальной технологии получения ферментного препарата ГлИ

Работа выполнена в соответствии с межвузовской научно-технической программой «Биотехнология», направление «Промышленный биосинтез и биотрансформация», а также в соответствии с научно-технической программой «Конверсия». Целью работы является выбор штамма микроорганизмов, обладающего достаточной ГлИ активностью, соизмеримой с уже используемыми промышленными штаммами-продуцентами ГлИ, а также последующая интенсификация продуктивности штамма в отноше-' нии ГлИ активности воздействием неионогенных поверхностно-активных веществ (нПАВ) и хелатирующих агентов, исследование влияния хелатирующих агентов на транспортСа2+, 1С в клетках Э^ерЬтусез гиЫдтоБиз Ас 836, разработка принципиальной технологической схемы получения ферментного препарата ГлИ. Научная новизна. Исследовано воздействие твинов и хелатирующих агентов на рост и ГлИ активность стрептомицетов.

^ Обнаружено,-что/использованные добавки, несмотря на их различную химическую природу,.оказывают воздействие на клеточные оболочки стрептомицетов*; что проявляется в изменении ГлИ активности; концентрации биомассы и транспорта Са2\ №+, К*. Это, в свою очередь, приводит к изменению метаболизма в целом. Поэтому данные химические соединения могут рассматриваться в качестве косвенных регуляторов клеточного метаболизма.

Впервые показано изменение трансмембранного транспорта ионов металлов: Саг\ №\ К+ в присутствии хелатирующих агентов в клетках стрептомицетов.

Практическая значимость работы. В результате исследований был выбран штрамм Б^еркзтусез гиЫдтоэиэ Ас 836, обладающий ГлИ активностью, сравнимой с описанными в литературе продуцентами фермента. Показано, что при использовании добавок (твина-40, твина-80, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), гидро-ксиэтилидендифосфоновой кислоты (ГОЭДФК), этиленгликоль-бис-(Р-аминоэтиловый эфир)Ы,М^',Ы'тетрауксусной кислоты (ЭГТА)) в оптимальных концентрациях ГлИ активность исследуемых стрептомицетов значительно повышается и находится на уровне известных - : промышленных зарубежных штаммов.

Продемонстрирована возможность использования добавок: твина-40, ГОЭДФК, в оптимальных концентрациях для получения высокоактивных ферментных препаратов ГпИ.

Предложена принципиальная технологическая схема получения ферментного препарата ГлИ с использованием добавок.

Апробация работы. Основные положения диссертационной ¡работы доложены на ежегодных отчетных конференциях КГТУ

(1991-1997), на IV, VII, VIII Межреспубликанских конференциях «Синтез, исследований свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Казань, 1991,1994,1996), на Международной конференции «Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности» (Краснодар, 1994), на IX Международной конференции «МКХТ-1995» (Москва, 1995), на Межрегиональной конференции «Пищевая промышленность-2000» (Казань, 1996). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ. Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 36 рисунков. Список литературы включает 185 источников.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований служили дрожжевые и бактериальные штаммы микроорганизмов. Среди них 3 штамма, относящихся к роду Candida, 8 - к роду Saccharomyces, а также бактериальные штаммы: Arthrobacter sp., Lactobacillus plantarum В 578, Streptomyces fradiae Ac 778, Streptomyces rubigiriosus Ac 836. Культивирование микроорганизмов осуществлялось периодическим способом в соответствии с технологическим регламентом.

В качестве добавок использовали нПАВ: твин-40 и твин-80, хе-латирующие агенты ЭГТА, ЭДТА, ГОЭДФК. Все используемые добавки вносили в виде водных растворов. Контролем служили клетки, выращенные в аналогичных опытным условиях без добавок.

Концентрацию биомассы определяли весовым методом, концентрацию белка - по методу Лоури, а ГлИ активность оценивали по количеству фруктозы, определяемой спиртово-резорциновым методом. При изучении транспорта Са2+ в клетки стрептомицетов использовали изотоп 45Са2+ концентрацию вышедших Na+, К+ из клеток стрептомицетов определяли на пламенном фотометре ПФМ-4 А (ГДР).

При статистической оценке экспериментальных данных использовали параметрический критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор штамма микроорганизмов как продуцента ГлИ

Из литературы известно, что существует довольно широкий спектр штаммов микроорганизмов, использующихся в качестве продуцентов ГлИ. В связи с технологичностью и простотой использова-

ния, а также, опираясь на литературные данные, выбор пал на дрожжи. Предварительные исследования показали, что дрожжи р.СапсПс1а обладают высокой трансформационной способностью.

Таблица 1

Параметры культивирования микроорганизмов_

Штамм микроорганизмов Концентрация биомассы, г/л Активность ГлИ

Биомасса, ед/гАСБ КЖ, ед/г

1 2 3 4

1. Candida valida BKM-Y-2327 6.00 1.23 0.010

2. Candida ethanolica BKM-Y-524 6.69 1.44 0.000

3. Candida utilis ВСБ-651 4.26 0.43 0.004

4. Saccharomyces vini BKM-Y-2566 6.90 0.27 0.000

5. Saccharomyces cerevisiae BKMrY-409 4.26 0.26 0.000

6: Saccharomyces cerevisiae BKM-Y-504 ; 7.35 0.40 0.004

7. Saccharomyces cerevisiae BKM-Y-509 6.90 0.35 0.004

8. Saccharomyces cerevisiae BKM-Y-717 5.16 0.83 0.004

9. Saccharomyces cerevisiae BKM-Y-776 5.19 1.41 0.000

10. Saccharomyces cerevisiae BKM-Y-823 4.02 3.06 0.000

11. Saccharomyces cerevisiae LK-14 4.95 2.43 0.000

12. Arthrobacter species 3.32 1.20 0.000

13. Lactobacillus plantarum B-578 2.80 25.77 0.008

14. Streptomyces fradiae Ac 789 3.00 27.75 0.009

15. Streptomyces rubiginosus Ac 836 2.96 88.00 . 0.010

Нами было апробировано 8 штаммов р.ЗассИаготусеэ и 3 штамма р.СапсМа. Но, как показали результаты исследований (табл.1), ни один из дрожжевых штаммов не обладал достаточной ГлИ активностью.

Дальнейшие исследования были проведены с использованием бактериальных штаммов. Как видно из табл. 1, наибольшей ГлИ ак-

тивностью, соизмеримой с известными штаммами-продуцентами обладал штамм 51герк)тусез гиЫдтозиэ Ас 836 (88 ед/г).

В результате дальнейших исследований было установлено: 1) продолжительность фаз роста стрептомицетов (длительность лаг-фазы -6 ч, лог-фазы - 30 ч, стационарной фазы - 30 ч); это позволило определить время внесения химических добавок при проведении дальнейших экспериментов; 2) накопление фермента ГлЙ происходит с запаздыванием по сравнению с ростом биомассы; 3) наибольшей ГлИ активностью стрептомицеты обладали в стационарную фазу роста (42-66 ч).

2. Влияние твинов на биомассу и ГлИ активность БкерклиусеБ гиЫдтоэиэ Ас 836

Широко используются нПАВ для интенсификации микробного роста. Среди нПАВ класс твинов наименее токсичен, некоторые из них применяются в пищевой промышленности. В работе были использованы твин-40 и твин-80 для интенсификации физиологической активности гиЫдтозиэ, добавление которых осуществлялось в начале культивирования, в периоды экспоненциальной и стационарной фаз роста.

Влияние различных концентраций твинов на рост стрептомицетов приведено на рис.1. Причем наибольшая концентрация биомассы наблюдалась в присутствии твина-40 в период экспоненциальной фазы роста (136%), а твина-80 - стационарной (155%).

На рис.2 приведены данные о влиянии различных концентраций твинов на ГлИ активность. Как видно из рисунка, почти во всех вариантах наблюдалась экстремальная зависимость ГлИ активности от концентрации твинов. Причем наибольшие значения ГлИ активности имели место в концентрации обоих твинов 0.1 г/л, но при их добавлении в разные периоды.

Как видно из рисунков, твин-40, в сравнении с твином-80, в большей степени оказывал влияние на рост и ГлИ активность стрептомицетов, что вполне согласуется с литературными данными о более активном взаимодействии твина-40 с клеточными компонентами мембран. Гидрофобно-гидрофильные взаимодействия твинов с клетками стрептомицетов ведут к структурной модификации клеточной стенки (КС) и цитоплазматической мембраны (ЦПМ), в результате усиливается проницаемость клеточных оболочек и происходят определенные конформационные изменения их компонентов. Все это приводит к изменению метаболизма в целом, в том числе и к возможному усилению биосинтеза ГлИ и изменению ГлИ активности.

Таким образом, действие твинов может носить кооперативный характер: с одной стороны, структурные модификации клеточных

0,1 1 2 Концентрация твинов С, г/л

Концентрация твинов С, г/л

□ Твин-40 ■ Твин-80

0,001 0,01

0,1 12 5 Концентрация твинов С, г/л

Рис.1. Влияние твинов на концентрацию биомассы Б^.гиЫдтозиэ Ас 836 (А - начальная фаза роста, Б - экспоненциальная фаза роста, В - стационарная фаза роста).

Г1

& и

га * Я

100

250 -

ш

л и 2 с 200 -

о X а о 150 -

| о ж 100 -

(0 ж

з: £ о4 50 -

0,001 0,01 0,1 1 2

Концентрация твинов С, г/л

0,001 0,01 0,1 1 2 5

Концентрация твинов С, г/л

ш

X

Й о

Ж

о

5

Ё я

К

с

200

150 •

100 -

50 -

□ Твин-40 ВТвин-80

0,001

1——■ 0,1 1 2 5

Концентрация твинов С, г/л

Рис.2. Влияние твинов на ГлИ активность вй.гиЫдтозиз Ас 836 (А -начальная фаза роста, Б - экспоненциальная фаза роста, В - стационарная фаза роста).

оболочек способны вызывать конформационные изменения ГлИ, проявляющиеся в активации или частичном ингибировании фермента; с другой стороны, возможно влияние твинов и на биосинтез самой ГлИ.

3. Влияние хелатирующих агентов на биомассу и ГлИ активность ¿Игериэтусев гиЫдтоэиз Ас 836

В биологических процессах важная роль отводится неорганическим ионам. Накопленные в литературе данные позволяют рассматривать неорганические ионы как систему, посредством которой можно управлять клеточным метаболизмом. Потребность микроорганизмов в ионах металлов в процессе выращивания меняется. В связи с этим представляло интерес использование хелатирующих агентов с целью управления минеральным составом ПС. Для того, чтобы приблизить условия культивирования стрептомицетов к промышленным, эксперименты проводили с использованием ПС, приготовленных на водопроводной воде. В работе были использованы хелатирующие агенты универсального (ЭДТА, ГОЭДФК) и специфического в отношении Са2+ (ЭГТА) действия. Их добавление производили в период экспоненциальной и стационарной фаз роста.

Результаты исследований показали, что присутствие хелатирующих агентов независимо от их специфичности в целом стимулировало рост биомассы (рис.3). Состав водопроводной воды сложен, в ней содержится значительное количество солей жесткости, а также по данным литературы в результате антропогенного воздействия ионов тяжелых металлов и токсикантов. Введение хелатирующих агентов способно нейтрализовать отрицательное воздействие этих компонентов и создать оптимальные условия за счет хелатирования избытка катионов водопроводной воды, нежелательного для развития стрептомицетов.

Таким образом, присутствие хелатирующих агентов в целом стимулировало рост стрептомицетов.

Исследования показали, что характер изменения ГлИ активности от концентрации добавляемых хелатирующих агентов определялся их специфичностью. Так, для хелатирующих агентов универсального действия ЭДТА и ГОЭДФК независимо от периода добавления наблюдалась экстремальная зависимость ГлИ активности от их концентрации (рис.4):

Добавление ЭДТА и ГОЭДФК в период экспоненциальной фазы роста вызывало оптимум ГлИ активности в концентрации 0.3 г/л, а - стационарной фазы роста - 0.6гг/л (рис.6), что объясняется избыточным содержанием двухвалентных катионов в водопроводной воде, которые могут выступать в качестве ингибиторов ГлИ.

0,01 0,1 0,3 0,6 1,2

концентрация хелатирующих агентов с, г/п

Рис.3. Влияние хелатирующих агентов на концентрацию биомассы Б^.гиЫдтозиз Ас 836 (А - экспоненциальная фаза, Б - стационарная фаза).

А

0.01 0,1 0,3 0,6 1,2 2

концентрация хелатирующих агентов с, г/л

□ ЭГТА ■ ЭДТА

□ ГОЭДФК

0.01 0,1 0,3 0,6 1,2 2

концентрация хелатирующих агентов с, г/л

Рис.4. Влияние хелатирующих агентов на ГлИ активность Str.ru-ЫдтоБиэ Ас 836 (А - экспоненциальная фаза, Б - стационарная фаза).

В случае использования ЭГТА имел значение и период его добавления. В период экспоненциальной фазы роста присутствие ЭГТА не оказывало влияния на ГлИ активность, в то время как в период стационарной фазы роста имело место возрастание ГлИ активности с увеличением концентрации ЭГТА.

Вполне возможно, что повышение ГлИ активности в данную фазу роста связано с накоплением самого фермента. Ведь максимальный уровень ГпИ активности и концентрации биомассы наблюдались в одной и той же концентрации 2 г/л. Присутствие же ЭГТА, очевидно, снимало эффект высоких концентраций Са2+, являющихся ингибитором активного центра ГлИ, вытесняющих Мд2+.

Таким образом, сравнивая результаты при использовании универсальных хелатирующих агентов ЭДТА и ГОЭДФК и специфического к Са2* - ЭГТА можно сделать вывод о том, что направление их действия начинает различаться в области высоких концентраций. В случае ЭДТА и ГОЭДФК наблюдалось снижение ГлИ активности, ЭГТА оказывал стимулирующее действие на ГлИ активность во всем исследованном концентрационном интервале. Следовательно, концентрация Са2+ существенным образом влияет на ГлИ активность, что согласуется с данными литературы.

4. Биохимические аспекты взаимодействия хелатирующих агентов с клетками Б^ериэтусез гиЫдтоБиэ Ас 836

Известна роль свободных Са2* в регуляции биохимических процессов живых клеток в качестве вторичного мессенджера. Установлено, по меньшей мере, наличие семи систем, работа которых основана на четырех биохимических механизмах, регулирующих концентрацию Са2+ в клетке. Изменение внутриклеточного содержания Са2+ не может не отразиться на уровне ионного гомеостаза клеток, что непосредственно связано с регуляцией клеточного метаболизма в целом;"

В соответствии с выше изложенным представляло интерес изучение влияния хелатирующих агентов ЭДТА и ЭГТА на биомассу и активность ГлИ З^.гиЫдтозив, а также транспорт Са2\ Ыа+, К*. Эксперименты проводили в экспоненциальную фазу роста на дистиллированной воде- -;

Как видно из рис.5, оба хелатирующих агента вызывали угнетение роста стрептомицетов.

Такой эффект, вероятно, связан с тем, что ионы металлов входят в состав активных центров ферментов клеточного метаболизма. ЭДТА, являясь универсальным хелатирующим агентом, извлекает катионы из среды, что, в свою очередь, оказывает влияние на ферментные системы микроорганизмов.

120 л

х- 210°

Л (10 о 80 о о.

ё £ во

2 О

° " 40

X X

Ш чР

20 н о

—I-1-1-1-1

0,01 0,1 0,3 0,6 1,2 2 -ЭГТА концентрация хелати-• ЭДТА рующего агента С, гГл

Л н 2 200 -

о о §

I а 5 а.150-

£ л 2100

X £ ё? 50-

0,01 0,1 0,3 0,6 1,2 2

- ЭГТА концентрация хелати-■ ЭДТА рующего агента С, г/л

Рис.5. Влияние хелатирующих агентов на биомассу и ГлИ активность (Б) Б^.гиЫдюозиз Ас 836 (А).

Присутствие ЭГТА, в отличие от ЭДТА, в меньшей степени оказывало влияние на рост стрептомицетов, который мало зависел от величины концентрации этого хелатирующего агента (рис.5), что может быть связано с высокой специфичностью ЭГТА в отношении Са2+.

На рис. 5 Б представлены результаты экспериментов изменения ГлИ активности от концентраций ЭДТА и ЭГТА.

Как видно из рисунка, в присутствии ЭДТА в концентрации 0.1 г/л наблюдался резкий всплеск ГлИ активности. В этой же концентрации данного хелатирующего агента наблюдалось и максимальное поглощение Са2+ клетками стрептомицетов (рис.6). Такой характер зависимостей объясняется тем, что регуляция поступления Са2* в клетки стрептомицетов м увеличение ГлИ активности может быть связано с Са2*- зависимым фосфорилированием белков, участвующих в синтезе фермента ГлИ.

В присутствии малых концентраций ЭГТА (0.01-0.6 г/л) зависимости изменения ГлИ активности и поступления Са2+ в клетки носили противоположный характер (рис.5 Б, 6). То есть снижение поступления Са2+ в клетки с увеличением концентрации ЭГТА до 0.6 г/л сопровождалось увеличением активности ГлИ. Это возможно в случае увеличения активности фермента за счет снижения ингибирующего влияния Са2*. При дальнейшем повышении концентрации ЭГТА скорость поступления Са2+ в клетки и ГлИ активность увеличивались, что могло быть связано с усилением биосинтеза фермента ГлИ, как в случае с ЭДТА.

0,01

Транспорт Са2+ в клетках тесно связан с транспортом других ионов, например, активность №7Са2+-антипортера связывает транспорт Са2+ и а К+/№*-АТФаза -транспорт К* с №\ Данные о транспорте К+ представлены на рис.7. Увеличение поглощения Са2*(рис.6) в присутствии ЭГТА (0.6-2.0 г/л) сопровождалось выходом (рис.7, А). Можно было бы говорить об активации №7Са2+-антипортера, если бы не соотношение Са2*: N8*. равное практически 1 : 1, а у обменника оно равно 1 : (23). Это отношение может быть снижено вследствие одновременного выхода К+ из клеток, который связан с транспортом Са2* и через Са27Н+, Са2+/К+, К7Н+-антипортеры и К*/Ыа*-АТФазу.

ЭГГА ЭДТА

0,1 0,3 0,6 1,2 2 концентрация хелати-рующего агента С, г/л

Рис.6 Влиянйё хелатирующих агентов на поступление Са2+ в клетки Str. rubigino-sus Ас -836.

0,1 0,3 0,6 1,2 2 концентрация хелати-рующего агента С, г/л

0,01 0,1 0,3 0,6 1,2 2

■ ЭГТА концентрация хелати-

■ ЭДТА рующего агента С) г/л

Рис.7. Влияние хелатирующих агентов на выход Na+ (А) и К+(Б) из клеток Str. rubiginosus Ас 836.

Таким образом, регуляция активности ГлИ имеет сложный характер. Транспорт Са5+ связан с транспортом (С и Результаты экспериментов показали, что ГлИ активность стрепТомицетов регулируется посредством Са2\ очевидно, через Са2+-зависимое фос-

лируется посредством Са2+, очевидно, через Са2+-зависимое фос-форилирование или самого фермента ГлИ, или белков участвующих в синтезе ГлИ, хотя литературных данных о транспорте Са " в клетках стрептомицетов обнаружено не было.

5. Использование добавок в технологии производства ферментного препарата ГлИ

Предыдущие разделы диссертационной работы, посвященные подробному изучению влияния химических добавок различной природы на рост и ГлИ активность стрептомицетов, позволили выявить оптимальные концентрации используемых добавок. Причем обращает на себя внимание тот факт, что не во всех случаях концентрация добавки, приводящая к наибольшему значению ГлИ активности, оптимальна для накопления биомассы стрептомицетов.

Таблица 2

Влияние добавок на продуктивность

стрептомицетов __

Концент- Концент- Удельная Общая

Название Период рация рация ГлИ акти- ГлИ акти-

добавки внесения, добавки, биомассы вность, вность.

ч г/л г/л ед/г АСБ ед

1. Контроль - - 2.97 88.0 261.4

2. Твин-40 24 0.1 4.03 180.0 725.4

3. Твин-80 36 0.1 3.65 154.0 562.6

4.ЭДТА 24 0.3 3.84 141.0 541.1

5. ЭГТА 36 2.0 4.32 141.0 609.1

6. ГОЭДФК 24 0.3 4.14 192.0 794.8

Как видно из табл.2, все исследованные добавки в значительной степени повышали общую ГлИ активность исследуемых стрептомицетов. Наибольшая активность ферментного препарата ГлИ обеспечивалась внесением в среду культивирования твина-40 (725.4 ед) и ГОЭДФК (794.8 ед).

На основании результатов исследований была предложена принципиальная схема получения ферментного препарата ГлИ (рис.8).

Данная технологическая схема апробирована в условиях АООТ «Таткрахмалопатока». Получена опытно-промышленная партия ферментного препарата ГлИ в количестве 1 кг. На основании испытаний составлен лабораторный регламент.

' Приведены расчеты предварительного экономического эффекта от; применения добавок при получении ферментного препарата

Рис.8. Принципиальная схема получения ферментного препарата ГлИ. Стадии процесса: 1 - проращивание спор; 2 - посев на плотную питательную среду; 3 - выращивание посевного материала; А - получение икокупята; 5 - основная ферментация; б - фильтрация и 3-кратная промывка биомассы; 7 - сушка биомассы. ОГ - отходящие газы; КК - кудьтуральная жидкость; «?П ГлИ - ферментный препарат ГлИ.

ГлИ. Расчеты экономической эффективности подтвердили перспективность использования этих добавок в качестве стимуляторов. Их использование позволяет снизить затраты на производство ферментного препарата в среднем в 1.8 раза.

ВЫВОДЫ

1. Наибольшей ГлИ активностью, сравнимой с активностью известных продуцентов, из апробированных штаммов микроорганизмов обладал штамм Streptomyces rubiginosus Ас 836.

2. Используемые добавки: твин-40, твин-80, ЭДТА, ЭГТА и ГОЭДФК в оптимальных концентрациях оказывали стимулирующее действие на рост Streptomyces rubiginosus Ас 836, увеличивая уровень биомассы на 10-55 %.

3. Величина ГлИ активности зависела не только от типа и концентрации используемого твина, но и от периода его внесения. Оптимальная концентрация как твина-40, так и твина-80 составляла 0.1 г/л, стимулируя ГлИ активность на 104 % и 75 %, соответственно.

4. Характер ГлИ активности определялся специфичностью хе-латирующего агента и не зависел от периода его внесения: в присутствии ЭДТА и ГОЭДФК наблюдалась экстремальная зависимость ГлИ активности в интервале исследованных концентраций, в присутствии ЭГТА наблюдалось возрастание ферментативной активности с увеличением его концентрации; ГлИ активность в присутствии хелатирующих агентов в целом возрастала в 1.05 - 2 раза.

5. Выявлено влияние ЭДТА и ЭГТА на транспорт Са2\ Na\ К* в клетках исследуемых стрептомицетов.

6. Предложено использовать твин-40 и ГОЭДФК в качестве добавок, позволяющих повысить активность ферментного препарата ГлИ в среднем в 2.9 раз.

7. Предложена принципиальная технологическая схема получения ферментного препарата ГлИ с использованием добавок.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Исследование микробиологической трансформации I Е.Г.Каневская, Н.С.Асакасинская, С.В.Борисова, А.Ю.Крыницкая // Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений: Тез. докл. на IV Межреспубл. студенческой конф. - Казань, 1991. - С. 133.

2. Выбор оптимального метода определения фруктозы в смеси Сахаров / Е.П.Павлова, Л.В.Грохольская, С.В.Борисова, А.Ю.Крыницкая // Синтез, исследование свойств, модификация и

переработка высокомолекулярных соединений: Тез. докл. на VII Межреспубл. студенческой конф. - Казань, 1994. - С.90.

3. Особенности роста микробной культуры на средах, содержащих электро-химически обработанные растворы / Г.Х.Хайруллина, Л.В.Грохольская, С.В.Борисова, А.Ю.Крыницкая //Тамже. - С.91.

4. Зиновьева М.В., Борисова C.B., Крыницкая А.Ю. Способы выделения фермента глюкозоизомеразы из микроорганизма-продуцента// Там же. - С.94.

5. Борисова C.B., Крыницкая А.Ю. Рост продуцента глюкозоизомеразы в присутствии ионола// Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности : Тез. докл. Междунар. науч. конф. - Краснодар, 1994. - С.27.

6. Проведение сравнительного изучения продуцента глюкозоизомеразы с целью получения диетических продуктов / Л.В.Грохольская, Е.А.Афонова, Н.В.Гаврилова, С.В.Борисова, А.Ю.Крыницкая // Тез.докл.научн.конф.студентов вузов республики Татарстан. - Казань, 1995. - С.25.

7. Усовершенствование технологии производства ГФС / С.В.Борисова, Н.В.Гаврилова, А.Ю.Крыницкая, В.С.Гамаюрова // IX Междунар.конф.молодых ученых по химии и хим.технол. МКХТ-95 : Тез.докл. Ч.П. - М„ 1995. - С.195.

8. Борисова C.B., Крыницкая А.Ю., Гамаюрова B.C. Влияние ЭДТА на функционирование биополимерной системы // Межвузовский сборник научных трудов : Химия, технология элементоор-ганических соединений и полимеров. - Казань, 1995. - С.7-14.

9. Влияние комплексонов на ферменты глюкозоизомеразы / С.В.Борисова, О.Ю.Старостина, А.Ю.Крыницкая, В.С.Гамаюрова // Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений : Тез.доклЛ/lll Междунар.конф.молодых ученых. - Казань, 1996. - С.150-151.

10. Микробиологическая модификация олигомеров дрожжами / С.В.Борисова, А.Ю.Крыницкая, Т.И.Лонщакова, Д.Г.Победим-ский // Биотехнология. - 1995. - № 5-6. - С. 16-18.

11. Борисова C.B., Крыницкая А.Ю., Гамаюрова B.C. Поиск продуцентов глюкозоизомеразы среди дрожжевых штаммов.// Деп.в ВИНИТИ № 1103 - В96

12. Борисова C.B., Крыницкая А.Ю., Гамаюрова B.C. Неионо-генный ПАВ - стимулятор активности глюкозоизомеразы // Пищевая промышленность - 2000 Тез.докл.межрегион.научно-практ.конф. - Казань, 1996. - С. 100.

Соискатель С.В.Борисова