Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глюкозоизомераза из Streptomyces atrarus и её свойства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глюкозоизомераза из Streptomyces atrarus и её свойства"

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ГАШПУЛАТОВА Барно Анваровна

ГЛШОЗОИЗОМЕРАЗА ИЗ БТВКРТСМЮЕБ АТНАТОВ И ЕЕ СВОЙСТВА

(03.00.04 - биологическая химия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1991

Работа выполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института микробиологии АН Узбекской ССР

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор ДАВРАНОВ К. Д.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор ЮКЕЛЬСОН Л. Я.

доктор биологических наук, профессор РАХИМОВ М. М

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.

Защита диссертации состоится

»I99I г

(У часов на заседании специализированного совета Д.015.16.01 в Институте биохимии АН УзССР по адресу: 700143, Ташкент, проспект М. Горького, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН УзССР.

Автореферат разослан ход! г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

С. А. Бурханов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений современной биотехнологии в особенности для ее внедрения в различных областях народного хозяйства-и медицины, является получение и применение ферментов микробного происхождения. Узкая специфичность и высокая каталитическая эффективность фермент ев делают привлекательной идею использования их для нужд медицины и промышленности. Сказанное полностью относится к глюкоза:зоме-разе ( в-ксилозокетодизомераза ЕС 5.3.1.5), катализирущий реакцию изомеризации в -глюкозы в о -фруктозу. В настоящее время глюкозоизомераза широко используется в промышленности для производства глюкозо-фруктозннх сиропов (ГФС) с последующим получением кристаллической фруктозы, которая в свою очередь широко применяется в пищевой и других видах промышленности.

Практическое применение фермента требует знания его свойств. Поэтому- разработка высокоэффективного способа выделения и очистки, а также изучение физико-химических свойств высокоочи-щенной глккозоизомеразы является актуальной.

Цель и задачи исследования. Выделить из З^гвргоаусоа сгёздзив и дать развернутую характеристику физико-хишческих и каталитических параметров глюкозоиаомеразы.

В рамках настоящей цели работы были сформулированы следующие конкретные задачи:

- разработка оптимальной схемы получения гомогенного по физико-химическим параметрам фермента;

- физико-химическая и энзиматическая характеристика фермента;

- изучение влияния условий хранения на активность фермента.

Научная новизна работы. Разработана высокоэффективная и легко воспроизводимая методика получения высокоочищенной глюко-зоизомеразы. Впервые получена в высокоочшценном состоянии глю-козоизомераза из Б«гор*оя7сез а£г»*ив УзГИТ-1, а.с. М424339. Установлено, что она является олигомерным белком с молекулярной массой 160 кДа; в присутствии додецялсульфата натрия молекула

фермента распадается на 4 субъединицы, молекулярная масса каждой из них составляет 40 кДа. Изоэлектрическая точка подтверждает данные аминокислотного состава фермента и равна 5,2.

Показано, 'что молекула фермента имеет отдельные неконкурирующие участки для связывания ионов Со2+ .и 2+. Выявлены условия (рН, температура, концентрация субстрата и конов металлов) , обеспечивающие максимальную скорость ферментативной реакции. Установлено, что глюкозоизомераза из тлеет большое сродство к ксилозе к является истинной ксилозоизомера-зой. Подобраны оптимальные условия хранения фермента.

Практическая ценность работы и рекомендации к применению.

Разработана высокоэффективная методика выделения и очистки глюкозоизомеразы до гомогенного по физико-химнческим параметрам состояния, позволяющая сохранить высокую удельную ферментативную активность глзокозоизомеразы из 8£?.с&г&*из . Показана принципиальная возможность использовглия фермента в процессе получения глюкозо-фруктозного сиропа. Термостабильность выделенного фермента ысиет служить основой для выяснения механизма термостабильности глюкозоизомеразы.

Апробация работы. Материалы диссертации долокенн на 1У Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Республиканской конференции молодых ученых микробиологов Узбекистана "Биология культивирования и биотехнология микроорганизмов" (Ташкент, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 13 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен вопросам выделения, очистки и характеристике глюкозоизомеразы из различных микроорганизмов (Грачева И.И. и др., 1976, 1978; Гавристов A.B. и др., 1981; Улезло И.В., 1986).

Анализ мировой литературы свидетельотвует, что большинство из выделенных глюкозоизомераз имеет молекулярную массу от 120 до 230 кДа, pl от 4,0 до 7,6. Стабильны ферменты в широком диапазоне pH (оптимальным является pH от 7,0 до 9,5) и обладают температурным оптимумом действия от 60° до 90°С (Резчиков A.A. и др., 1980; Мосичев ГЛ. С - и. др., 1986; Михайлов, и др., 1986).

Активаторами глюкозоизомераз являются в основном ионы М 32+ и Со2+, для некоторых из них ионы n^1" ( Tnkaaa!t$. 1968; Оелпо , 1968, 1975; Твавпайа , 1968; Аяаничез A.B., 1983).

Отличительной особенностью глнкозонзомераз микроорганизмов является ах высокая термостабильность.

Глаза 2. Материалы и методы исследований

Объектом исследований служил фермент глюкозоизомераза ( в-ксплозокетолизомераза, ЕС - 5.3.1.5), выделенный из клеток 8«згвр$оаусва йЪз&Ъма , УзПТТ-1 (а.с. & 1424339). Штамм выделен из местной почвы, очищен, охарактеризован и депонирован в нейтральном музее прсмшленных микроорганизмов ВНИИ Генетика (ВКПМ - 751).

При изучении способности культуры синтезировать глхжозо-изоморазу (ГлП), культивировали в течение 3 суток глубинным способом а колбах Эрленмелера объемом 250 мл с 50 мл среды на

логической качалке (230 об/мин) при температуре 40Î 2°С. да имела следующий составив %): автолизат дрокяей - 1,0; g б04. 7 HgO - 0,05; СоС12 . 6Н20 - 0,01; BaCI - 0,2; ксилит-i.,C. С качестве посевного материала применяли 3 мл.водной сус-:зкзки спор штамма, выращенного на среде Чапека с ксилитом при

• лОп

I о •

ГлИ активность определяли по методу ( Cekac&ki , 1971). Реакционная смесь состояла из: 0,1 мл' I M раствора глюкозы .субстрат), 0,2 ш 0,2 M фосфатного буфера рН 7,8; 0,05 m О ДМ раствора 60^. 7Н20 и 0,1 мл фермента. Реакцию проводили при 75°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали добавлением I мл •Ш, а затем определяли количество образовавшейся d-фруктозы пстеин-карбазольным методом ( Dlochs et al , 1951). Для ^гого в реакционную смесь добавляли 6 мл дистиллированной вода, "тбирали пробу по 0^5 и вносили ОД мл 1,5%¿раствора солянокислого цистеина и 3 мл серной кислоты в воде (45:19), после быстрого перемешивания приливали ОД мл 12$ спиртового раствора кг^базола. Проявление окраски наблюдали, выдерживая смесь на водяной бане при 37 i 1,0°С в течение 20 мин. Реакцию останавливали быстрым охлаждением на ледяной воде. Интенсивность образовавшейся окраски измеряли при длине волны 540 нм на ФЭКе КЖ-2М. Количество образовавшейся фруктозы вычисляли, используя калибровочную кривую.

За единицу ГлИ активности принимали тш'.ое количество фермента, которое катализирует образование 1,0 мк моль фруктозы за I мин при 75°С, применяя в качестве субстрата глюкозу.

Определение белка, осуществляли методом Брэдфорда ( вгей-£ояй , 1976).

Гомогенность препарата ГлИ при очистке проверяли с помощью электрофореза в 7,5^ полиакриламидном геле (НАГ) по методу Дэвиса ( Da-rie , 1964).

Молекулярную массу ГлИ определяли методами гельфильтравди па колонке с сефадексом 0-100 (1,8 х 120 см), электрофореза в ПАГе в присутствии додецилсульфата натрия, используя стандарт-. :шс белки с известными молекулярными массами, и ультрацентрифугированием на аналитической ультрацентрифуге M0M-3I70 (Венгрия).

Определение молекулярной массы субъединиц Глй осуществляли с помощью электрофореза в 7,5$ ПАГе и ультрацентрифугирования в присутствии додецилсульфата натрия.

Изофокусировзние Глй проводили на приборе ХХВ 8101 (Швеция) на колонке объемом ПО см^ в зоне pH а».й>олинов от 4,0 до 8,0. Для образования градиента плотности использовали сахарозу (0-50£Ь

Определение аминокислотного состава проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе AAA-88I (Прага). Предварительно осуществляли гидролиз пептидных связей 6н HCl при Поб в течение 24, 48 и 72 часов. Содержание триптофана определяли спектрофотометрическн. ( Bdalhook , 1967).

Полученные экспериментальные материалы обрабатывали методом математической статистики (Урбах, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Выделение, очистка и характеристика глюкозоизомеразы из ßtr.atratua

Получение гомогенного препарата ГлИ изВйя» ataafraa

ГлИ ДЪз.аЪтаЪм является внутриклеточным ферментом, локализована она в периплазматичеоком пространстве и в клеточной стенке продуцента (Давранов и др., 1989 г.). Для выделения фермента использовали различные подходы разрушения клеток (обработка лизоцимом, перемешивание с селикагелем, растирание со стеклянным песком, заморатавание - оттаивание и т.д.). Было установлено, что наиболее эффективным способом выделения фермента из клеток является экстракция из лиофильно-высушенной биомассы. После двухчасовой экстракции при 25°С, осадок отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин. Над-осадочная жидкость, содержащая 1,77 ед ГлИ на мг белка, служила источником ГлИ.

Попытки хроматографпчески фракционировать полученный препарат на производных целлюлозы оказались малоэффективными,

поэтому с целью повышения эффективности хроматографпческих методов очистки, осуществляли предварительное фракционирование раствора фермента методом термообработки. При этом было замечено, что эффективность термообработки можно существенно повысить путем использования факторов, благоприятствующих терыостабиль-ности данного фергленга и оптимизаций условий проведения процесса. Было установлено, что эффективность возрастает при увеличении концентрации белка от 0,7 до 25 от/мл.

Немаловажную роль играет время проведения процесса термообработки. Наибольший- эффект наблюдался при инкубащш гомогена-та в течение 20 шн при температуре 75°С. В процессе такой термообработки была достигнута пятикратная очистка фермента. После термообработки, осадок отделяли центрифугорованием при 8000 об/мин-в течение 15 глин. Надосадочную жидкость диалвзовали в течение ночи на холоду против 0,05 Ш фосфатного буфера pH 7,8. После диализа (в случав помутнения повторяли центрифугирование.-в тех ке условиях), ферментный раствор наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлоз oii, предварительно уравновешанной выше указанным буфером. Неадсороировавшиеся.примеси смывали с колонки стартовым буфером. Десорбцию Г.лИ-зы осуществли градиентом BaCl от О до 0,5 М (рис.1).

Специфическая активность ГлИ после десорбции с колонки ДЗАЭ-целлюлозы возрастала до 23,5 ед/мг белка. Электрофорети-ческий анализ десорбированного препарата фермента обнаружил три белковые полосы, одна из которых принадлежит ГлИ-зе, а две другие - примесному белку.

Для отделения примесных белков осуществляли повторную лонообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50. Десорбцию :лков вели тем не способом, что и на ДЭАЭ-целлзолозе (рис.2). ..осл одним этапом очистки явилась гель-хроматография препарата

•рг.ента на колонке с сефадексом 0 -100 (рис. 3). В результате гельфильтрацир получали препарат ГлИ-зы, электрофоретический ■ седиментаци'онный анализ которого свидетельствовал о его гомо-чности. Схема очистки глюкозоизомеразы Str.ctratus до гомо-нкого состояния приведена в таблице I.

<¿0 гва 3,0 ■ 16 • 12-а,8-

10 20 ^О 40 50 ¿О 70 80 90 100 нот'.ера фракций

Рис.1. Ионообменная хроматография на ДЭАЗ-целлюлозе (колонке

4x20 см, скорость 60 мл/Час, элюция 0,1 1.1 фосфатнш буфером с градиентом н»С1 от 0 до 0,7 М): 1-белок, экстинкцня при 280 нм, 2 - фракции с ферментативной активностью.

Рис. 2. Рехроматография глккозоизомеразы на колонке о ДЭАЭ-сефадексом А-50 (колонка 2x25 см, скорость 30 мд/ч, злюцяя проведена тем же способом, что и на ДЭАЭ-

:;елл:хтазе).

1

0,Г М ФБ

ñ А/а C¿ ¿чд.

у 1,0

-2,0 -1,5

Л 0.5

-го

-0,5

Таблица I.

Схема очистки глюкозоизомеразы из fitsNsptosyceo ofesatue УзГИТ-I

Стадии очистки

Кол-во:Кол-во: Активность :Степень:Вы-ш :белка : об- ¡удельная:очистки:ход,

: мг :щая, : : Е

Ё/мг бел: ка

Гомогенат из лиофиль-

но высушенной 25 190,16 336,6 1,77

биомассы

Термообработка при температуре 70°С, 15 мин..

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефадексе

Гельфильтрашш на сефадексе в -100

100 20,864 260,8 12,5

I 100

7 . 77,5

100 9,22 216,8 23,5 13,8 64,5

100 5 192,2 38,4 21,7 57,1 30 4,2 174,3 41,5 23,5 51,8

Молекулярную массу глюкозоизомеразы определяли методами седиментационного равновесия и гельфильтращш, она равна 160 ■ ¿5,0 кДа. По этому значению фермент не отличается от большинства микробных глюкощоизомераз, молекулярная масса которых колеблется в зависимости от источника от 120 до 200 кДа.

Для анализа субъединичной структуры глюкозоизомеразы въг. afcsafrua осуществляли электрофорез и ультрацентрифугирование в додецилсульфате натрия. Из чего следует, что.Глй str. etratue состоит из четырех субъединиц. Субъединичная структура характерна для микробных глюкозоизомераз. Б основном они состоят из ~чётырех~ субъединиц (¿¿шо, 1970,Ho^»-Aaseietti.'1975,Pe34iiKOB А. и др., 1980 г.;Уосичев М.С. идр.,1986г, Улезло И.В.,1991).

Рис. 3. Гель-хроматография фракций фермента, полученных после рехроматографии на ДЭАЭ сефадексе А-50 (колонка 2 х 85 см, скорость 3S мл/ч). Элюцию проводили 0,005 М фосфатным буфером рН 7,8. На фоне электрофореграмма ГлИ в ПАГе, Efe 0,64.

Аминокислотный состав и изоэлектрическая точка глюкозо-изомеразы.

Аминокислотный, состав ГлИ Sfcr.at»»%u* незначительно отличается от ГлИ из микроорганизмов рода 8tr«ptoaarc«s (табл.2). Из приведенных в таблице 2 данных видно, что. ГлИ-за Strcptoayc*« *%r*tua содержит большое количество-кислых (аспарагиновая и глутаминовая) аминокислот и гидрофобных (аланина и лейцина).

Таблица 2.

Сравнительный анализ аминокислотного состава глюкозоиэоме-разы из микроорганизмов рода в*гвр%02уеви

- _ £Статков_на молекулу. _ _ _

Аминокислоты • о р • • о : В • % 1 : -г а • о : -5 § • о о : -и с : 1 : Й

■ гА , О • <ч о * н о . О N . ъ § •

• и % • о о • • й : о 4 С : -о А • в 1: о 5 • в и Э : « ц • й . *> : аз

' ев о аз В) о а ч. о _ 41 £ .

Лизин 84 40 25 66 52 40

Гистидан 27 40 22 ■ 25 - 38 104

Аргинин 88 132 73 42 128 80

Аспарагиновая

кислота 133 180 101 157 181 188

Треонин 44 56 46 59 79 48

Серин . 49 36 24 71 .36 36

Глутаминовая к-та 177 152 89 167 176 216

Пролин 27 72 46 34 87 64

Глицин 140 ■ 140 84 184 157 208

Алании 239 180 114 145 214 196

Цистеин 4 6

Балин 65 32 47 103 70 52

Метионда 61 32 46 25 29 12

Изолейцин 39 40 30 52 45 32

Лейцин * 145 144 88 III 166 128

Тирозин 27 36 19 27 37 28

Фенилаланин 56 92 49 47 97 80

Триптофан34 19 32 14 14 14 20

Общее количество 1443 1480 886 1327 1635 1552

к

Примечание: триптофан определяли сяектрофотометрически.

На основании анализа аминокислотного состава, т.е. того, что з молекуле глюкозоизомеразы преобладают гидрофобные аминокислоты над гидрофильными, можно предположить, что для этого фермента характерно существование гидрофобных взаимодействий,

которые в свою очередь могут служить одной из причин термостабильности фермента.

Превалирующее содержание кислых аминокислот приводит к предположению о нахождении изоэлектрической точки фермента в области кислых рН. Определенная(глюкозоизомеразы вйг.а4гайиа)1>1 равна 5,2.

Катал11тические_св0йствд глккозоизомеразы________

Зависимость глгкозоизомеразной активности и стабильности Фермента от рН. Изучали активность и стабильность глюкозоизо-меразы в растворе при различных рН и при температуре 75°С. Результаты экспериментов, приведенные на рис. 4, позволяют сделать вывод, что глюкозоизомераза 8«г.а&га*«а наиболее стабильна в широком .интервале рН. Следует отметить, что значения рН оптимума совпадает с интервалом наибольшей стабильности фермента, рН оптимум каталитической активности находится в интервале рН 8,0-9,5 (рис. 4а), наибольшая стабильность фермента наблюдается при рН 6,0-11,0 (рис. 46). Инкубация ГлИ-зы в этом интервале рН при 30°С в течение 15 мин не приводит к потере активности, тогда как. при рН 4,0-5,0 и выше 11,0 наблюдается быстрая потеря каталитической активности (рис.46).

Рис. 4. Влияние рН на ферментативную активность ГлИ: а - рН оптимум, б) рН - стабильность

Зависимость глюкозоизомвразной активности от температуры и термостабилыюсти фермента. Глюкозоизомераза из ВЪг.«%г«Ъиа является термостабильным ферментом. Оптимальной температурой для действия фермой;а является 75-80°С (рис. 5а). Инкубация ее при температуре 65-70°С в течение I часа не приводит к сколько-нибудь заметному падению каталитической активности.Начиная с 85°С наблюдалось падение каталитической активности, которая усиливалась с ростом температуры (рис. 56).

Рис. 5. Зависимость глюкозоизомеразной активности от температуры:

а) оптимальная температура;

б) стабильность фермента при высоких температурах.

Высокая термосгабнльность ГлИ делает их уникальными объектами для выяснения механизмов термостабильности и причин денатурации белков. Тот факт, что микроорганизмы, продуценты ГлИ, шея оптимальную температуру роста при 30-45°С, синтезируют ферменты, стабильные при 75-80°С, наводит на мысль о возможном присутствии.в реакционной среде дополнительных стабили-

зирующих факторов. В данном случае такими факторами служат ионы металлов.

Влияние ионов металлов на активность глюкозоизомеразн. Из литературных данных известно, что ионы % 2+ и Со2+ оказывают активирующее влияние на ГлИ многих микроорганизмов, при этом ионы 2+ обладают более сильным активирующим эффектом, чем ионы Со .

Нами было подтверждено, что ионы М в2+ и Со2'1" действительно являются необходимыми элементами для проявления ГлИ активности. Удаление этих ионов путем диализа реакционной смеси против 0,01 М раствора ЭДГА приводило к полному исчезновению ГлИ активности. Эти данные свидетельствуют о непрочности связи мек-ду металлами и ферментом.

Как показано вт таблице 3 наиболее эффективное активирование реакции изомеризации глюкозы во фруктозу наблюдалось ионами %2+ и в меньшей степени ионами Со2+, еще слабее действовали ионы Мз2+. Почти никакого влияния не оказывали ионы ре2+ иП12+, , Си2+, тогда как Са2+, и Ад2+ оказывали ингибируйцее действие. Ингибирующий эффект ионов начинает проявляться при их концентрации в реакционной смеси. 10"®-и достигает 50% при концентрации 10~% (для ионов Са2*) и Ю~% (для ионов Нз2+ и Аз +). Активирующий эффект ионов М а2"1", Со2+ и Мз2^ также зависит от их концентрации, тате, например, оптимальной концентрацией ионов Мз2+ является 0,1 М, а для ионов Со2+ - I мМ (рис.6).

Таблица 3.

Влияние некоторых ионов металлов на активность глюкозо-изомеразы

Соли металлов :Концентрация мМ:Оставшаяся активность,$

I 35

I 40

ВвВМ I 43

СиБ04 I 15

СвС1г I 28

нево,. I 100

Продолжение таблицы 3. Соли металлов ¡Концентрация мМ: Оставшаяся активность,$

Ив012 I 50

СоС12 I 70

HgCl2 I 5

РЬС12 Г 41

BiSO^ I 45

AgHO, I 7

Вычислены константы Михаэлиса-Ментен при различных концентрациях ионов и Со^+. Установлено, что Км в присутствии ионов Mg^+ равна 25 мМ, а при добавлении ионов Со^+ - 0,15 мМ

Было замечено, что действие ионов металлов зависит от температуры. Активирующее действие ионов начинает выражаться с 40°С и достигает максимума при температурах 60-75°С.

В ходе экспериментов нами были получены, данные, свидетельствующие о том, что фермент имеет различные участки связывания ионов и Со^+. Были подсчитаны каталитические параметры действия ионов Mgp+ и Со^+ на глюкозоизомеразную активность фермента Str.«tratua , используя линейные уравнения и координаты графиков, построенных по Лайнуивера-Берка ( Xisawtu ахЛ Burk 1934) и Диксона ( Dixoa , 1953). Определенные значения Кд^, и заглетно увеличивались с повышением концентрации ионов Mgr . Из этого следует, что ионы Mg приводят к конформа-ционныи изменениям молекулы фермента, образуя активный тройной комплекс - Е - 8.3 отличие от ионов Mg"+, ионы Со2+ не приводят к изменению величин указанных выше параметров, что указывает на стабилизирующую роль этого металла. А по определенныгл значениям Км для этих ионов металлов установлено, что ГлИ Б»г. atxatua имеет большое сродство к ионам Со^+.

Субстратная специфичность глюкозоизомеразы Str.«tr«tu» Нале изучена субстратная специфичность гомогенной глюкозоизомеразы из Str.atratua по отношению ряда альдосахаров и установлено, что фермент катализирует реакцию изомеризации в -ксилозы, D - глюкозы, л-рибозы, ю-арабинозы, D-аллозы и ю-рамнозы в их соответствующие кетозы. Исследование зависимости скорости

[Ме**] -

Рис. 6. Влияние различных ионов двухвалентных металлов на активность глккозоизомеразы I) М2) Со2+, 3) Ма2+

реакции от концентрации субстратов позволило определить основные кинетические константы этого процесса. Для О -ксилозы и

9 -глюкозы определенные значения константы Михаэлиса (Км) соответегвенно равны 0,05 .И и 0,14 Ы, а величины 7мах - 67 и 17 мк моль/к мин на мг белка. По этш значениям видно, что наибольшее сродство данный фермент оказывает к К -ксилозе, а это указывает на то, что ГлИ из 8*х.а<:гат* является типичной В-ксилозо/кетол/изомеразой. Зависимость скорости реакции от концентрации субстратов представлены на рисунке 7 (I я 2).

О- глюкоза (М)

Рис. 7. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (I- в-глюкоза; - 2 - В-ксидоза)

а) в координатах Михаэлиса-Ментея

б) в координатах Лайнуивера-Берка

Подбор условий хранения глюкозоизомеразы Для ферментов, применяемых или рекомендуемых для применения, подбор оптимальных условий их хранения является необходимым и ванным этапом исследования.

В ходе выполнения настоящей работы нами установлено, что ГлИ в лиофильно-внсушенном состоянии может храниться на протяжении трех лет без потери активности, тогда как в растворе она не стабильна и сравнительно быстро теряет свою активность. Для выяснения оптимальных условий хранения Mi ßtr.afcratuo наш были апробированы более 50 вариантов сред. ГлИ хранили в бидис-тиллированной воде и в буферных растворах различной молярности со стабилизирующими добавками, в качестве которых использовали ЭГГА (этилен-гуанинотетраацетат), 2-меркаптоэтанол, этанол, толуол, глицерин, бутанол, хлорид натрия, олеиновую кислоту, бен-'-зоат калия и т.д. Растворы фермента хранили при комнатной температуре и в условиях холодильника (при 4°С) в течение 120 суток.

Было установлено, что для хранения ГлИ в растворе в течение 30 дней в условиях холодильника достаточно добавить в буфер 0,005 М ЭГГА и 0,001 М 2-меркаптоэтанола. Неплохие результаты были получены при добавлении в раствор фермента 25^ этанола. Тем не менее хранение ГлИ-зы в растворе более 30 дней приводит к потере ее активности из-за микробного загрязнения. Следовательно, при длительном хранении фермента в растворе необходимо введение в состав раствора антимикробных веществ (табл.4).

Таблица 4,

Изменение каталитической активности глюкозоизомеразы • при хранении

Время хранения, _ сутки _

I ~ "

Глдкозоизомеразная_активность,^ от_исходной__

I ~ ~ 2 : 3 ~ 4 5~:6 : 7

I 100 100 100 100 100 100 100

5 100 100 100 100 95 100 100

10 100 100 100 95 80 100 100

15 100 100 100 95 60 S5 100

Продолжение таблицы 4.

I : 2 : : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8

20 100 100 100 87 50 90 100

25 100 100 100 78 42 82 97

30 100 100 100 70 30 87 95

60 90 97 95 62 0 78 92

90 78 85 80 55 0 70 92

120 61 72 75 40 0 65 90

150 57 64 70 32 0 60 85

180 52 ' 57 55 23 0 60 80

Примечание: состав среды, в которых хранилась ГлИ:

1 - азид натрия (0,0151), 2 - меркаптоэтанол (0,001 И), (0,051,1), Со2+ (0,1 мМ) в 1/15 М К, На-фосфатном буфере рН 8,0

2 - То же, что и I + ЭГГА (0,001 М).

3 - То же, что и I + олеиновая кислота (0,005$).

4 - бензоат калия (0,001 М), 2- меркаптоэтанол (0,001 М) в

1/15 М К, На, фосфатном буфере рК 8,0.

5 - толуол (О.ООШ с ионами !ЛБ2+ (0,05 М), Со2+(0,1 мМ),

в 1Д5 М, К, ю-фосфатном буфере рН 8,0.

6 - этанол (25^) в 1Д5 К, да-фосфатном буфере рН 8,0.

7 - То ке, что и 6 + ЭГГА (0,001 М).

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема очистки гликозоизомеразы из гомоге-ната мицелия, включающая термообработку, два этапа ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюозе и на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и гель-фильтрацию на сефадексе о-150. Получен гомогенный препарат (по данным электрофоретического и седиментационного анализа) глюкозонзоморазы с удельной активностью 41,5 Е/мг белка.

2. Методами гсльфильтравди, электрофоретического анализа и седиментанионного равновесия определена молекулярная масса гликозоизомеразы, равная 160 кДа. Методами дискэлектрофореза,

а такке электрофореза на тонком слое и седиментационного равновесия в присутствии додецилсульфата натрия установлено, что глюкозоизомераза состоит из 4-х субъединиц с молекулярной массой 40 кДа. Определен аминокислотный состав высокоочищенной гликозоизомеразы, изоэлектрическая точка данного фермента составляет 5,2.

3. Определены основные кинетические параметры действия ГлИ. Установлено, что рН оптимум гликозоизомеразы находится при рН 8,0-9,0, максимальная скорость изомеризации глюкозы во фруктозу достигается при 80^С, скорость реакции зависит от состава и природы буферного раствора, от концентрации субстрата и продукта реакции.

4. Изучена субстратная специфичность фермента и установлено, что глюкозоизомераза str.atratus обладает групповой субстратной специфичностью. Км для в-глюкозы равен 0,14 L1, для

D-ксилозы- 0,05 М.

5. Установлено, что ГлИ Bts.atratus является металл»ззависимой, активность ее зависит от концентрации ионов í.h2+ и Со2+. Ионы Со2+ являются стабилизаторами, тогда как ионы М g+- активаторами фермента. ' •

6. Разработаны условия хранения фермента в растворе. Установлено, что наличия ионов M¡j , Со2+, 2-меркаятоэтаяола, ЭГТА и азида натрия способствуют сохранению каталитической активности фермента в растворе.

Список работ. опубликованных по материалам диссертации

1. Перспективы использования микробного препарата гиат-рина для получения глюкозо-фруктозного сиропа / Султанова И.Г., Диеров Ж.Х., Давранов К.Д., Ташпулатова Б.А. //Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез.докл. У Всесоюзной конференции. 19-20 сентября.-Ташкент, 1988. - С.19-20.

2. Ташпулатова Б.А., Диеров Ж.Х., Ахыедова З.Р. Очистка и некоторая характеристика глюкозоизомеразы из Б*;гер1;о-шусез аЬга^иэ // Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов.: Тез. докл. 1У республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и специалистов микробиологов. 24-26 мая 198У г. - Ташкент, 1989. - С.61-62.

3. Ташпулатова Б.А., Давранов К.Д., Диеров Ж.Х. Выделение, очисткаи некоторые физико-химические свойства глюкозоизомеразы ИЗ Б1;гер1;отусеа аЬга^Б / ХИМИЯ природных соединений.-1991- «4. - С.524-528.

4. Ташпулатова Б.А., Давранов К.Д., Межлумян Д.Г. Характеристика глюкозоизомеразы Б-ьг.аЪга-ьиз //Химия природных соединений. -1991. - № 6. - С.655-657.

5. Ташпулатова Б.А., Давранов К,Д. Влияние ионов металлов на активность и стабильность глюкозоизомеразы изБЪгер-Ьотусеб а-ЬгаЪиБ / Химия природных соединений.. - 1991. - !5 6, -

С. 657-660.

6. Давранов К.Д., Ташпулатова Б.А., Диеров &.Х. Зцделение, очистка и иммобилизация глюкозоизомеразы из. БЪверЪотусев а1;га-1;из // Инженерная энзимология.: Тез. докл. УП Всесоюзного симпозиума. 8-12 апреля,- Москва, 1У91. - С.35-36.