Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирование роста дрожжей Candidа valida различными субстратами. Исследование стационарных и переходных состояний

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ингибирование роста дрожжей Candidа valida различными субстратами. Исследование стационарных и переходных состояний"

На правах рукописи

Андреев Сергей Вениаминович

ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА ДРОЖЖЕЙ Candida val Ida РАЗЛИЧНЫМИ СУБСТРАТАМИ. ИССЛЕДОВАНИЕ СТАЦИОНАРНЫХ И ПЕРЕХОДНЫХ СОСТОЯНИИ.

(специальность - оэ.00.07) Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино, 1995

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г.Пущино, Московская область

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Ерошин В.К.

кандидат физико-математических наук Минкевич И.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Головлев Е.Л.

кандидат биологических наук Ховрычев М.П.

Ведущая организация: Биологический ф-т МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится " Ф^р&лА. 1995 г. в ^^ часов на заседании Диссертационного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, Московская обл., г.Пущино, проспект Науки 5, ИБФМ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан " ^ " Х^^к 199$ г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.69.01 доктор биологических наук

В.М.Вагаоов

ВВЕДЕНИЕ

" Актуальность проблеш. К-настоящему времени накошен большой

объем научной информации о росте микроорганизмов в периодических условиях и в непрерывной культуре. Рост в установившихся режимах непрерывного культивирования обычно обнаруживает хорошо воспроизводимые закономерности. В реальности существует вероятность нарушения режима культивирования, что способно изменить тип и глубину лимитирования роста или вызвать его иыгибирование.

Исследование ингибирования микробного роста позволяет обнаружить реакцию микробных клеток на изменение внешних условий. Увеличивая концентрацию ингибирущего вещества в среде, можно создать условия, близкие экстремальным. Роль ингибитора может выполнять органический субстрат, что встречается при ферментации углеводов, получении биомассы из этанола в лимите по кислороду. Ингибируют рост и высокие концентрации минеральных компонентов (в частности, тяжелые металлы, накапливающиеся в очистных сооружениях). Различные химические реагенты широко используются в качестве антисептиков.

Интерес к исследованиям динамики переходных состояний микробного роста обусловлен тем, что механизмы регуляции роста в стационарном состоянии замаскированы или подстроены под другие процессы. В переходных процессах сложность поведения культуры резко возрастает. Нестационарные процессы при непрерывном культивировании представляют также перспективный путь получения различных продуктов.

Таким образом, знание закономерностей переходных процессов при ингибировании микробного роста будет способствовать обнаружению особенностей метаболизма, скрытых регуляторных механизмов клетки.

Цель и задачи исследования. Физиологические закономерности роста дрожжей candida valida в непрерывной культуре ранее изучали

при лимитировании этанолом и ингибировании минеральными элементам в установившихся режимах. Переходные процессы намного сложнее стационарных и для адекватного их изучения потребовались более сложнаг техника культивирования и измерений, развитая в лаборатории ферментационной микробиологии ИБФМ РАН, и выбор таких условий опытов, npi которых интересующие нас свойства провлялись бы как можно ярче.

Целью работы являлся поиск закономерностей ингибирования ростг дрожжей Candida valida органическим субстратом либо минерально компонентом среды в стационарных и переходных состояниях непрерывной культуры.

Для достижения этой цели решали следующие задачи:

1. Изучение ингибирования роста с.valida этанолом в стационарны; условиях роста.

2. Исследование переходных процессов в непрерывной культуре npi ингибировании роста субстратом, проявляющим токсичные свойства

3. Изучение ингибирования и лимитирования роста с.valida ионам! цинка в стационарных режимах, исключая двойное лимитирован® этанолом и цинком.

4. Выявление механизмов устойчивости дрожжей к этанолу.

Научная новизна работы. Показано, что основные физиологически! характеристики роста (удельная скорость и выход биомассы) отличают ся зависимостями сигмоидальной формы. Новым является наличие дву слагаемых в кинетической формуле |i(s).

Обнаружены различные тенденции зависимости выхода биомассы пр лимитировании и ингибировании этанолом. Зависимости обратных вели чин у^ и ц в обоих областях лежат вдоль отдельных прямых.

Ингибирование роста этанолом вызывает значительный рост расхо дов на поддержание клеток. Это явление имеет общебиологическо значение и отражает адаптивную реакцию организмов на неблагоприят

ные условия среда.

Содержание нуклеиновых кислот в стационарном состоянии определяется удельной скоростью роста и не зависит от того, происходит ли рост в условиях лимитирования или ингибирования этанолом.

Резкое увеличение концентрации ингибирувдего субстрата вызывает двуступенчатую реакцию у микробной культуры. При этом зависимости, полученные при стационарных режимах непрерывного роста, нарушаются. После устранения действия неблагоприятных условий культура восстанавливает стационарные характеристики роста.

Увеличение концентрации этанола вызывает увеличение ненасыщенности липидов дрожжей. Изменение жирнокислотного состава липидов характеризует адаптацию культуры дрожкей к ингибированию этанолом.

Лимитирование и ингибирование роста дрожжей цинком обнаруживает нелинейные зависимости содержания нуклеиновых кислот от удельной скорости роста.

Практическая ценность работы. Найдены закономерности ингибирования микробного роста этанолом и цинком, которые могут быть использованы как в ферментационных процессах, так и в области защиты окружающей среды, где ингибирущие и токсические субстраты являются серьезными факторами загрязнения. Знание баланса и кинетики микробного роста в искусственных экосистемах важно для предсказания хода процесса очистки.

Модель субстратного ингибирования микробного роста, основанная на простой физиологической гипотезе, позволяет удовлетворительно описывать экспериментальные результаты.

Найденнные закономерности нестационарного роста и переходных процессов при непрерывном культивировании указывают на возможность выращивания микробной биомассы с определенными свойствами и получения продуктов при отклонении процесса от стационарных характеристик

или их нарушениях. Это открывает перспективу разработки динамических режимов культивирования микроорганизмов, когда условия непреыв-ного роста изменяют по заранее сформулированной программе.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были пред ставлены на Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибировани роста микроорганизмов" в Пущине (1989), Европейском симпозиум! "Кинетика, динамика и физиология микробного роста" в Цюрихе, Швей цария (1992), на ежегодных сессиях научных работ (1992, 1994) : семинарах в ИБФМ РАН, Путцино.

По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 15€ страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков, 14 таблиц состоит из введения, 6 глав обзора литературы, 6 глав исследований заключения и выводов. Библиография включает 100 источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объект исследований. В работе использовали термотолерантны Штамм дрожжей Candida valida BKM-Y-2327.

Метода культивирования. Непрерывное культивирование дрожже осуществляли в рН-ауксостате (ферментер АК-э, СКБ БП РАН). Парамет ры культивирования (Э6°с, рН 4.4, р02 50% от насыщения воздухом поддерживали с помощью соответствующей аппаратуры. Во всех опытах кроме переходных процессов, отбор проб проводили после достикени культурой стационарного состояния. Критериями последнего счиго стабильность расхода титранта и постоянство оптической плотное! культуральной суспензии.

Использовали минеральную среду с этанолом, в которой изменял концентрацию этанола или ионов цинка. Среда содержала минимум азе та, титрантом служил раствор в воде. Было подобрано такое сооч ношение между потоками среда и титранта, чтобы при наименьшей i концентраций этанола, рН-ауксостат не входил в лимит по субстра1 [Мутафов,85Ь При изучении влиянии ионов цинка поддерживали услс вия, исключающие двойное лимитирование этанолом и цинком.

Химические анализы. Концентрацию этанола в пробах oпpeдeляJ методом газо-жидкостной хроматографии. Концентрацию ионов циш определяли методом атомно-адсорбционного анализа.

Содержание биомассы определяли гравиметрическим методом. Содержание белка в биомассе определяли по Лоури, суммарную концентрацию" нуклеиновых кислот по Спирину, кирнокислотный состав липидов по Султановичу. Анализ углерода, водорода и азота в биомассе был выполнен на автоматическом анализаторе. Золу определяли сжиганием биомассы в муфельной печи. Содержание кислорода подсчитывали вычитанием суммы углерода, водорода и азота из юо%.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами линейной и нелинейной регрессии. Разброс средних величин и коэффициентов линейной регрессии принимали равным удвоенному среднему квадратичному отклонению, что соответствует достоверности 95%.

1 Ингибированив роста Candida valida ЭТЯН0Л011

Зависимость удельной скорости роста от остаточной концентрации этанола s в культуральной жидкости приведена на рис.1. Имеется область з (0.4-20 г/л), в пределах которой ц мало зависит от концентрации этанола, и другая (20-45 г/л), в которой" увеличение з приводит к резкому падению ц.

Полученные нами результаты наиболее близки к сигмоидальной зависимости, согласно которой ц(з) асимптотически приближается к нулю

Известно лишь одно указание на подобную ъы 'ле.лмость, полученную для бактерий Aoetobao-ter зр., растущих на этаноле в непрерывной культуре. Величина параметра п (4), полученная нами и отвечающая за еигмоидальность формы кривой ц(з), практически равна аналогичному параметру ДЛЯ Aoetobaoter.

Для статистической обработки данных о выходе по массе y^s(3) и энергетическом выходе тцу) использовали ту же формулу, что и для ц(з). Регрессия дает:

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ц(3) =

(1 )

jyu, ЧАС"1

0.2

О ЛИМИТИРОВАНИЕ □ ИНГИБИРОВАНИЕ

1_» I '_' ' '_il''

20 30 40 50 60 S, Г/Л

Рио.1 Зависимость удельной скорости роста ц (час-1) от концентрации этанола я (г/л) согласно (5)

V = О.853 ^ г ч ч2.5

1 + ш

(2)

п = S2§1_3

(3)

1 +

Параметр п для ц выше, чем у г^ и г} (2.5 и 3), что говорит о меньшей крутизне снижения выходов в зоне их наиболее резкой зависимости от з по сравнению с ц.

Оценки максимальных значений ц, г^ и т] при Б, близком к нулю (ц = о.82 ч~1, у^ = 0.85, т| = 0.55) близки к ранее полученным для данного штамма при лимитировании этанолом [Крыницкая,87].

Концентрация остаточного этанола влияет на показатели состава биомассы с.valida, причем сильнее всего изменяется содержание нуклеиновых кислот (рис.2). Совокупности наших данных и данных, полученных ранее для этого штамма в области лимитирования этанолом и в

нк,%

о

10

8

б

4

О

О ингибирование

О

0.2

0.4

0.6 ^,ЧАСГ1

Рис.2 Зависимость содержания нуклеиновых кислот (НК, %)

в биомассе от удельной скорости роста ц

области, промежуточной между лимитированием и ингибированием, лежат близко друг к другу и частично перекрываются. Это говорит о том, что содержание нуклеиновых кислот в биомассе при заданных параметрах культивирования определяется удельной скоростью роста и не зависит от того, происходит ли рост в условиях лимитирования или ингибирования этанолом как субстратом.

Совместная обработка наших данных и данных, полученных ранее, методом линейной регрессии дала:

Если построить зависимость нк(з), то точки на графике будут лежать не вдоль прямой, а вдоль кривой, подобной приподнятой над

осью абсцисс на постоянную величину. Это является доказательством, что именно ц является фактором, определяющим содержание нуклеиновых

нш> = 4.29 + 6.41Ц

(4)

кислот в биомассе.

Содержание бежа (Б) и общего азота (N) в % от сухой Macci клеток зависит от s в гораздо меньшей мере, чем нуклеиновые кислот!

2 Влияние ингибирования этанолом на выход биомассы и поддержание клеток дрожжей

С точки зрения клеточной энергетики и кинетики роста микробнш культур большой интерес представляло определить одинакова ли зависимость расхода энергии на поддержание клеток при лимитировании i ингибировании этанолом, как это наблюдалось в случае нуклеиновых кислот; и если скорости расходов на поддержание различаются, тс какие условия культивирования влияют на это.

Для всего объема экспериментальных данных о росте с.valida предложена кинетическая формула, частным видом которой является (1 )

ц(з) =

hn1

И

1 + |^sl| 1 1 + fs2

1 +

1

(5)

(«П

где параметры равны: ^ = 0.672 час-1, ка1 = 0.0138 г/л, п1 = 2,

= 0.151 час-1, Ка2 = 1.773 г/Л, П2 = 4, У^ = 0.88, к. = 35.38 г/л, та1 = 0.033 час-1, тз2 = 0.013 час-1. Параметры тд1 и тд2 рассчитаны по формуле: тд = тз1 + та2ц (6)

Анализ экспериментальных данных и теоретических кривых показывает, что математическая модель адекватно отражает влияние концентрации ингибирукхцего субстрата на |А (рис.1) и выход у^. Найденные величины максимального выхода у^. и та близки тем, что определены для данного штамма при лимитировании этанолом.

График зависимости обратного выхода от обратной скорости роста имеет две ветви (рис.э). В области лимитирования субстратом точки против 1/ц лежат вдоль прямой (нижняя прямая), что известно из литературы. В области ингибирования субстратом точки, полученные

'Л

1 I I

Г

6 I

х/8

ИНГИБИРОВАНИЕ

а/т

ЛИМИТИРОВАНИЕ

_1_I_1_I_1_

10

20

1/^, ЧАС

Рио.э Зависимость величин 1/у^от 1/ц (час) во всей области ц(з)

в настоящей работе, также лежат возле прямой, но имеющей крутой наклон. В данном случае верхняя ветвь является новым элементом взаимосвязи ЦП

Зависимость от удельной скорости роста (рис.4) имеет две ветви, соответствующие зонам лимитирования и ингибирования. Часть кривой, которая изображает резкое снижение выхода при максимальных значениях ц (при концентрациях этанола 2-15 г/л находится плато |л(а;), отражает увеличение скорости затрат на поддержание клеток.

Найденное обычным образом (согласно уравнению Иерусалимского-Перта) значение скорости расхода энергии на поддержание т3 (0.62 ч~1) при ингибировании' этанолом необычно высоко. Это указывает на значительный рост затрат на поддержание клеток у с.ьаноа при ингибировании этанолом по сравнению с ш для лимитирования роста этано-

лом (о.оэ ч 1).

о 0.2 0.4 0.6 jit, ЧАС-1

Рио.4 Зависимость y^ от |а во всей области ц(з)

Увеличение расходов на поддержание клеток при ингибировании роста этанолом, по-видимому, связано с повышенной скоростью турновера белка и отражает один из аспектов адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды. Можно распространить этот вывод и на больший круг организмов, предположив, что затруднительные условия существования заставляют организм увеличить траты потребляемого субстрата на поддержание или выживание.

3 Икгибирование и лимитирование роста с. val ida цинком

В зависимости удельной скорости роста от концентрации цинка в культуральной суспензии можно выделить зоны лимитирования (0.5-4

мг/л zn2+) и ингибирования роста дрожжей (8-54 мг/л). Область лимитирования роста имеет вид кривой с плато, где удельная скорость - роста изменяется незначительно .

Данные о зависимости |i(Zn2+), соответствующие области лимитирования, были аппроксимированы зависимостью Моно. Она соответствует нашим данным при значении констант: максимальная удельная скорость роста 0.80 ± 0.08 ч-1, константа насыщения 0.19 ± 0.059 мг/л.

При остаточных концентрациях ионов цинка свыше 18 мг/л наблюдается резкое падение удельной скорости роста. Зависимость p,(Zn2+) в зоне ингибирования роста имеет сигмоидальную форму, отчасти похожую на кривую ингибирования роста этого штамма этанолом, но с более широким плато. Поведение непрерывной культуры дрожжей при ингибиро-вании ионами цинка по сравнению с этанолом различается в области замедления и прекращения роста. При концентрации ионов цинка в среде 0.Э2 г/л рост культуры прекратился.

Цинк- менее токсичный для с.valida субстрат, чем этанол. При ингибировании цинком расходы на поддержание клеток увеличились незначительно. В области концентраций Zn2+ от 0.4 до 27 да/л выделяется плато высоких значений выходов. Уменьшение yx/s происходит монотонно.

Зависимости нк(ц) в областях лимитирования и ингибирования цинком имеют сложную форму и не могут быть описаны известными уравнениями.

4 Динамическая реакция непрерывной культуры на пнгябпроваше этанолом

Замысел наших исследований потребовал проведения экспериментов, в которых путем резкого увеличения концентрации этанола нарушали стационарное состояния в непрерывной культуре и наблюдали зависимости удельной скорости роста и концентрации субстрата от вре-

мени. Это было необходимо для того, чтобы выяснить существует ли временное масштабирование переходного процесса и соблюдаются ли в течение этого процесса те взаимозависимости, которые культура показывает в стационарных условиях?

Изменение удельной скорости роста и концентрации субстрата во времени в прямом переходном процессе от низкой к высокой концентрации этанола показано на рис.5. Могао выделить две стадии:

1) быстрый переходный процесс, когда после полного прекращения роста восстанавливается ц равная той, что была до добавления этанола. После начала переходного процесса величина а скачкообразно увеличилась. Это привело к очень быстрому паданию скорости разбавления

Рио.5 Изменение удельной скорости роста и концентрации этанола в культуральной суспензии в прямом переходном процессе

до нуля. Однако затем скорость разбавления восстановила свое исход-

ное значение. Ввиду краткости быстрого переходного процесса (4 мин)

он не монет быть показан в масштабе рис.5.

2) медленный переходный процесс,- представляющий._собой отсроченную адаптационную реакцию на шоковое воздействие от ударного повышения концентрации этанола. В первые ю- 12 часов происходит снижение р. до минимального значения 0.08 ч~1, а затем повышение примерно до половины исходного значения

Взаимосвязь удельной скорости роста и концентрации субстрата прп прямом переходе показана на ряс.6. Толстая .пиния- зависимость р.(а), полученная ранее обычным способом в серии установившихся непрерывных режимов, тонкая линия соответствует переходному процессу.

Рис.6 Зависимость р. от з в прямом переходном процессе. Экспериментальные данные и ход зависимости согласно (7)

Видно, что отклонения от стационарной зависимости во время переходного процесса очень велики, и культура не успевает приблизиться к

ней за двое суток.

Выход биомассы резко упал до значений много меньших, чем в серии установившихся состояний, и остался на этом уровне (0.120.15). Очевидно, что резкое падение выхода биомассы при ингибирова-нии в большей степени связано не с увеличением т„, а с падением истинного выхода .

Взаимосвязь удельной скорости роста и содержания нуклеиновых кислот также оказалась нарушенной - нуклеиновые кислоты отставали от падения |л (рис.7).

НК,%

9

7

5

О 0.2 0.4 0.6 ЧАС-1

Рио.7 Зависимость содержания нуклеиновых кислот от р, в прямом переходном процессе

Анализируя данные опыта, мы предположили, что удельная скорость роста определяется содержанием некоторого ключевого вещества в клетках, причем это вещество различно при низких и высоких концент-

рациях этанола. При переходе от низких s к высоким первое вещество, став ненужным, экспоненциально исчезает, а содержание второго увеличивается согласно логистической кривой, широко распространенной в динамике биологических объектов

^p^-P.it-V.p.-^i^-y (7)

1 + P4eFa "о'

Параметры, входящие в это выражение были найдены путем статистической обработки данных. Теоретическая кривая хорошо отражает ход экспериментальных данных (рис.5).

В обратном переходном процессе от высокой к низкой концентрации этанола удельная скорость роста отставала от стационарной зависимости. Однако, скорость приближения к стационарной кривой ц(з) здесь существенно выше. Соотношение нуклеиновых кислот и ц было более близким к полученному в установившихся режимах роста, чем в прямом переходе.

Шок, вызванный резким увеличением концентрации ингибирущего субстрата, определяет двухступенчатую реакцию культуры. Для того, чтобы культура пришла к состоянию, которое достигалось в традиционных опытах после нескольких небольших шагов, здесь требуется гораздо большее время.

5 Биосинтез липидов с.valida при ингибировании этанолом

При ингибировании роста этанолом существенно увеличилась ненасыщенность внутриклеточных липидов. Считается, что ненасыщенность липидов характеризует микробную резистентность к неблагоприятным факторам среды. Уменьшение степени насыщенности (отношение суммы насыщенных жирных кислот к суше ненасыщенных) при увеличении концентрации этанола удовлетворительно описывается уравнением линейной регрессии. При увеличении з содержание пальмитиновой кислоты упало с 20 до ЮЯ5 от суммы липидов, олеиновой выросло с 31 до 59%.

ч

В прямом переходном процессе содержание липидов изменялось незначительно, ненасыщенность липидов варьировала в большей степени. Содержание олеиновой кислоты выросло с 23 до АА%, линолевой упало с 40 до 22?6.

Таким образом, в ответ на усиление действия неблагоприятного фактора среды (ингибирование этанолом) клетки дрожжей увеличивают ненасыщенность липидов. Быстрое изменение концентрации этанола в ходе переходных процессов оказало менее радикальное воздействие на жирнокислотный состав липидов, чем постепеное увеличение концентрации субстрата. Эта тенденция свидетельствует о существовании биохимических механизмов адаптации дрожжей к высоким концентрациям этанола путем модификации состава липидов мембран и других структур клетки.

ВЫВОДЫ:

1. Дрожки Candida val ida характеризуются сигмоидальной формой зависимостей удельной скорости роста и выхода биомассы при инги-бировании этанолом.

2. Содержание нуклеиновых кислот при росте на этаноле в стационарных режимах определяется удельной скоростью роста и не зависит от того, лимитируется или ингибируется рост субстратом. Подобная линейная зависимость при воздействии цинка не характерна.

3. Зависимости выхода биомассы от удельной скорости роста при инги-бировании и лимитировании этанолом различаются. Ингибирование этанолом приводит к росту расходов субстрата на поддержание. Цинк тф не увеличивает расходов на поддержание клеток.

4. Резкое увеличение концентрации ингибирувдего субстрата вызывает двухступенчатую реакцию микробной культуры в виде быстрого и медленного переходных процессов. Зависимости, полученные в ста-

ционарных состояниях непрерывного роста, нарушаются. После устранения неблагоприятных условий культура восстанавливает стационарные характеристики роста.

При адаптации клеток дрожжей к ингибировашш этанолом происходит увеличение ненасышенности внутриклеточных липидов и содержания в них олеиновой кислоты.

Список опубликованных работ по материалам диссертации:

Андреев С.В., Минкевич И.Г. Ингибирование роста Candida valida этанолом. В кн.: "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов": Тезисы докл. всесоюзной конференции, Пувдно, 1989 с.6

Андреев С.В., Минкевич И.Г. РОСТ Candida vnltda в условиях, близких двойному лимитированию аммонием и этанолом. В кн.: 'Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", Пудино, 1989 С.5

Андреев С.В., Минкевич И.Г., Ерошин В.К. Ингибирование роста дрожжей Candida valida этанолом. Прикладная биохимия и микробиология. 1991. т.27. No 5- 738-747

Minkevioh I.G., Andreyev S.V., Eroshin V.K. Difference between steady state and transient behavior of the yeast Candida valida in pH-auzostat under substrate inhibition. In: Working Party on Microbial Physiology "Kinetios, Dynamics and Physiology of Mio-robial Growth". Ruschlikon/Zurich, 1992 P.23