Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирование роста дрожжей Candida valida различными субстратами. Исследование стационарных и переходных состояний

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ингибирование роста дрожжей Candida valida различными субстратами. Исследование стационарных и переходных состояний"

г- п

V' -Ч

На правах рукописи

Андреев Сергей Вениаминович

НГИБИРОВАНИЕ РОСТА ДРОЖЖЕЙ Candida valida РАЗЛИЧНЫМИ СУБСТРАТАМИ. ИССЛЕДОВАНИЕ СТАЦИОНАРНЫХ И ПЕРЕХОДНЫХ СОСТОЯНИИ.

(специальность - 03.00.07) Микробиология

Автореферат . диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 1995

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г.Пущино, Московская область

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Ерошин В.К.

кандидат физико-математических наук Минкевич И.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Головлев Е.Л.

кандидат биологических наук Ховрычев М.П.

Ведущая организация: Биологический ф-т МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится " ^^ г> в п часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, Московская обл., г.Пущино, проспект Науки 5, ИБФМ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.69.01 доктор биологических наук

В.М.Вагабов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплен большой объем научной информации о росте микроорганизмов в периодических, условиях и в непрерывной культуре. Рост в установившихся режимах непрерывного культивирования обычно обнаруживает хорошо воспроизводимые закономерности. В реальности существует вероятность нарушения режима культивирования, что способно изменить тип и глубину лимитирования роста или вызвать его ингибирование.

Исследование ингибирования микробного роста позволяет обнаружить реакцию микробных клеток на изменение внешних условий. Увеличивая концентрацию ингибирувдего вещества в среде, можно создать условия, близкие экстремальным. Роль ингибитора может выполнять органический субстрат, что встречается при ферментации углеводов, получении биомассы из этанола в лимите по кислороду. Ингибируют рост и высокие концентрации минеральных компонентов (в частности, тяжелые металлы, накапливающиеся в очистных сооружениях). Различные химические реагенты широко используются в качестве антисептиков.

Интерес к исследованиям динамики переходных состояний микробного роста обусловлен тем, что механизмы регуляции роста в стационарном состоянии замаскированы или подстроены под другие процессы. В переходных процессах сложность поведения культуры резко возрастает. Нестационарные процессы при непрерывном культивировании представляют также перспективный путь получения различных продуктов.

Таким образом, знание закономерностей переходных процессов при ингибировании микробного роста будет способствовать обнаружению особенностей метаболизма, скрытых регуляторных механизмов клетки.

Цель и задачи исследования. Физиологические закономерности роста дрожжей candida valida в непрерывной культуре ранее изучали

при лимитировании этанолом и ингибировании минеральными элементам в установившихся рекимах. Переходные процессы намного сложнее ста ционарных и для адекватного их изучения потребовались более сложна техника культивирования и измерений, развитая в лаборатории фермен тационной микробиологии ИБФМ РАН, и выбор таких условий оштов, пр которых интересующие нас свойства провлялись бы как можно ярче.

Целью работы являлся поиск закономерностей ингибирования рост дрозккей candida valida органическим субстратом либо минеральны компонентом среды в стационарных и переходных состояниях непрерыв ной культуры.

Для достижения этой цели решали следующие задачи:

1. Изучение ингибирования роста с.valida этанолом в стационарны условиях роста.

2. Исследование переходных процессов в непрерывной культуре пр ингибировании роста субстратом, проявляющим токсичные свойства

3. Изучение ингибирования и лимитирования роста с.val (¿La иона& цинка в стационарных режимах, исключая двойное лимитирован! этанолом и цинком.

4. Выявление механизмов устойчивости дроккей к этанолу.

Научная новизна работы. Показано, что основные физиологичесю характеристики роста (удельная скорость и выход биомассы) отличат ся зависимостями сигмоидальной фэрмы. Новым является наличие двз слагаемых в кинетической формуле ц(з).

Обнаружены различные тенденции зависимости выхода биомассы п] лимитировании и ингибировании этанолом. Зависимости обратных вел] чин т^ и ц в обоих областях лекат вдоль отдельных прямых.

Ингибирование роста этанолом вызывает значительный рост расх< дов на поддержание клеток. Это явление имеет общебиологичесю значение и отражает адаптивную реакцию организмов на неблагоприя1

ные условия среда.

Содержание нуклеиновых кислот в стационарном состоянии определяется удельной скоростью роста и не зависит от того, происходит ли рост в условиях лимитирования или ингибирования этанолом.

Резкое' увеличение концентрации ингибирукщэго субстрата вызывает двуступенчатую реакцию у микробной культуры. При этом зависимости, полученные при стационарных режимах непрерывного роста, нарушаются. После устранения действия неблагоприятных условий культура восстанавливает стационарные характеристики роста.

Увеличение концентрации зтанола вызывает увеличение ненасыщенности лшвдов дрожжей. Изменение кирнокислотного состава липидов характеризует адаптацию культуры дрожжей к ингибированию этанолом.

Лимитирование и ингибирование роста дрожжей цинком обнаруживает нелинейные зависимости содержания нуклеиновых кислот от удельной скорости роста.

Практическая ценность работа. Найдены закономерности ингибирования микробного роста этанолом и цинком, которые могут быть использованы как в ферментационных процессах, так и в области защиты окружающей среда, где ингибиррхцие и токсические субстраты являются серьезными факторами загрязнения. Знание баланса и кинетики микробного роста в искусственных экосистемах важно для предсказания хода процесса очистки.

Модель субстратного ингибирования микробного роста, основанная на простой физиологической гипотезе, позволяет удовлетворительно описывать экспериментальные результаты.

Найденнные закономерности нестационарного роста и переходных процессов при непрерывном культивировании указывают на возможность выращивания"микробной биомассы с определенными свойствами и получения продуктов при отклонении процесса от стационарных характеристик

или их нарушениях. Это открывает перспективу разработки динамичес ких режимов культивирования микроорганизмов, когда условия непреьш ного роста изменяют по заранее сформулированной программе.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были прел ставлены на Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибироваш роста микроорганизмов" в Пущине (1989), Европейском симпозиум "Кинетика, динамика и физиология микробного роста" в Цюрихе, Шве£ цария (1992), на ежегодных сессиях научных работ (1992, 1994) семинарах в ИБШ РАН, Пущино.

По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 15( страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков, 14 таблиц состоит из введения, 6 глав обзора литературы, 6 глав исследованй заключения и выводов. Библиография включает 100 источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследований. В работе использовали термотолерантш штамм дрожжей Candida valida BKli-Y-2327.

Метода культивирования. Непрерывное культивирование дрожк* осуществляли в рН-ауксостате (ферментер АК-э. СКВ БП РАН). Парте' ры культивирования (эб°с, рН 4.4, р02 50# от насыщения воздухе! поддерживали с помощью соответствующей аппаратуры. Во всех опыта; кроме переходных процессов, отбор проб проводили после достижеи культурой стационарного состояния. Критериями последнего счит; стабильность расхода титранта и постоянство оптической плотное культуральной суспензии.

Использовали минеральную среду с этанолом, в которой изменя. концентрацию этанола или ионов цинка. Среда содержала минимум аз< та, титрантом служил раствор ННЭ в воде. Было подобрано такое соо1 ношение между потоками среда и титранта, чтобы при наименьшей i концентраций этанола, рН-ауксостат не входил в лимит по субстра1 [Мутафов.853. При изучении влиянии ионов цинка поддерживали уел вия, исключающие двойное лимитирование зтанолом и цинком.

Химические анализы. Концентрацию этанола в пробах определи методом газо-жидкостной хроматографии. Концентрацию ионов цин определяли методом атомно-адсорбционного анализа.

Содержание биомассы определяли гравиметрическим методом. Содержание белка в биомассе определяли по Лоури, суммарную концентрацию нуклеиновых кислот по Спирину, жирнокислотный состав липидов по Султановичу. Анализ углерода, водорода и азота в биомассе был выполнен на автоматическом анализаторе. Золу определяли сжиганием биомассы в муфельной печи. Содержание кислорода подсчитывали вычитанием суммы углерода, водорода и азота из юо%.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами линейной и нелинейной регрессии. Разброс средних величин и коэффициентов линейной регрессии принимали равным удвоенному среднему квадратичному отклонению, что соответствует достоверности 95%.

1 йнгибирование роста Candida valida ЭТЭНОЛОИ

Зависимость удельной скорости роста от остаточной концентрации этанола з в культуральной жидкости приведена на рис.1. Имеется область s (0.4-20 г/л), в пределах которой ц мало зависит от концентрации этанола, и другая (20-45 г/л), в которой увеличение з приводит к резкому падению ц.

Полученные нами результаты наиболее близки к сигмоидальной зависимости, согласно которой асимптотически приближается к нулю

Известно лишь одно указание на подобную зависимость, полученную для бактерий лсеьоъао-ьег ер., растущих на этаноле в непрерывной культуре. Величина параметра п (4), полученная наш и отвечающая за сигмоидальность формы кривой ц(з), практически равна аналогичному

Параметру ДЛЯ АоегоЪаоЪег.

Для статистической обработки данных о выходе по массе у^Сз) и энергетическом выходе 11(3) использовали ту же формулу, что и для ц(з). Регрессия дает:

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ц(3) = -

(1 )

0.8

0.6

0.4 '5

0.2

0 10 20 30 40

50 60 Б, Г/Л

Рис.1 Зависимость удельной скорости роста ц (час-1) от концентрации этанола з (г/л) согласно (5)

Параметр п для р. выше, чем у у^ и т} (2.5 и э). что говорит меньшей крутизне снижения выходов в зоне их наиболее резкой зависи мости от в по сравнению с ц..

Оценки максимальных значений ц, и г) при Б, близком к нул ((а = 0.82 ч~1, г^ = 0.85, т} = 0.55) близки к ранее полученным дл данного штамма при лимитировании этанолом [Крнницкая,87].

Концентрация остаточного этанола влияет на показатели состав биомассы с.иаНАа, причем сильнее всего изменяется содержание нук леиновых кислот (рис.2). Совокупности наших данных и данных, полу ченных ранее для этого штамма в области лимитирования этанолом и

у

М)

Рио.2 Зависимость содержания нуклеиновых кислот (НК, %) * в биомассе от удельной скорости роста ц

области, промежуточной между лимитированием и ингибированием, лежат близко друг к другу и частично перекрываются. Это говорит о том, что содержание нуклеиновых кислот в биомассе при заданных параметрах культивирования определяется удельной скоростью роста и не зависит от того, происходит ли рост в условиях лимитирования или ингибирования этанолом как субстратом.

Совместная обработка наших данных и данных, полученных ранее, методом линейной регрессии дала:

НК(*) = 4.29 + 6.41Ц (4)

Если построить зависимость нк(з), то точки на графике будут лежать не вдоль прямой, а вдоль кривой, подобной ц(8), приподнятой над ось» абсцисс на постоянную величину. Это является доказательством, что именно ц является фактором, определяющим содержание нуклеиновых

кислот в биомассе.

Содержание белка (Б) и общего азота (Н) в г от сухой масс; клеток зависит от з в гораздо меньшей мере, чем нуклеиновые кислот:

2 Влияние ингибирования этанолом на выход биомассы и поддержание клеток дрожжей

С точки зрения клеточной энергетики и кинетики роста микробни культур большой интерес представляло определить одинакова ли зависимость расхода энергии на поддержание клеток при лимитировании ] ингибировании этанолом, как это наблюдалось в случае нуклеиновьс кислот; и если скорости расходов на поддержание различаются, т< какие условия культивирования влияют на это.

Для всего объема экспериментальных данных о росте с.оанди предложена кинетическая формула, частным видом которой является (1

ц(з> =

1 + Г»1| ' 1 + к82

1 +

1

Ж (5)

(«9

И' т

где параметры равны: ^ = 0.672 час 1, кз1 = 0.0138 г/л, п1 = 2. ^ = 0.151 час"1, ка2 = 1.773 г/л, п£ = 4, = 0.88,

к. = 35.38 г/л, «а1 = о.озз час-1, та2 = 0.013 час-1. Параметры та1 и тв2 рассчитаны по формуле: тв = тз1 +■ тв2ц (6)

Анализ экспериментальных данных и теоретических кривых показывает, что математическая модель адекватно отражает влияние концентрации ингибирущего субстрата на ц (рис.1) и выход у^. Найденные величины максимального выхода у^ и т3 близки тем, что определен! для данного штамма при лимитировании этанолом.

График зависимости обратного выхода от обратной скорости ростг имеет две ветви (рис.Э). В области лимитирования субстратом точю 1/у^ против 1/ц лежат вдоль прямой (нижняя прямая), что известнс из литературы. В области ингибирования субстратом точки, полученные

x/s

/□

/ ИНГМБИРОВАНИЕ

а/т

о/

у О___о-

i i i ЛИМИТИРОВАНИЕ i i i

10

20

yh

ЧАС

Рио.з Зависимость величин 1/у^от 1/ц (час) во всей области ц(з)

в настоящей работе, также лежат возле прямой, но имеющей крутой наклон. В данном случае верхняя ветвь является новым элементом взаимосвязи ц и у^.

Зависимость у^ от удельной скорости роста (рис.4) имеет две ветви, соответствующе зонам лимитирования и ингибирования. Часть кривой, которая изображает резкое снижение выхода при максимальных значениях ц (при концентрациях этанола 2-15 г/л находится плато ), отражает увеличение скорости затрат на поддержание клеток. Найденное обычным образом (согласно уравнению Иерусалимского-Перта) значение скорости расхода энергии на поддержание т3 (0.62 ч~1) при ингибированш- этанолом необычно высоко. Это указывает на значительный рост затрат на поддержание клеток у c.vaxiaa при инги-бировании этанолом по сравнению с ms для лимитирования роста этано-

лом (о.оэ ч"1>.

Y

X/s

Puo.4 Зависимость у от ц во всей области |д(з)

Увеличение расходов на поддержание клеток при ингибированш роста этанолом, по-видимому, связано с повышенной скоростью турновера белка й отражает один из аспектов адаптации микроорганизмов г неблагоприятным условиям среда. Мокно распространить этот вывод i на больший круг организмов, предположив, что затруднительные условия существования заставляют организм увеличить траты потребляемой субстрата на поддержание или выживание.

Э Ингибировавие и лимитирование роста с.valida цинком В зависимости удельной скорости роста от концентрации цинка i культуральной суспензии мокно выделить зоны лимитирования (О.5-'

мг/л Zn2+) и ингибирования роста дрожжей (8-54 мг/л). Область лимитирования роста имеет вид кривой с плато, где удельная скорость роста изменяется незначительно.

Данные о зависимости ц(Zn2+), соответствующие области лимитирования, были аппроксимированы зависимостью Моно. Она соответствует нашим данным при значении констант: максимальная удельная скорость роста 0.80 ± 0.08 ч-1, константа насыщения 0.19 ± 0.059 мг/л.

При остаточных концентрациях ионов цинка свыше 18 мг/л наблюдается резкое падение удельной скорости роста. Зависимость p.(Zn2+) в зоне ингибирования роста имеет сигмоидальную форму, отчасти похожую на кривую ингибирования роста этого штамма этанолом, но с более широким плато. Поведение непрерывной культуры дрожжей при ингибиро-вании ионами цинка по сравнению с этанолом различается в области замедления и прекращения роста. При концентрации ионов цинка в среде 0.32 г/л рост культуры прекратился.

Цинк- менее токсичный для с.val ida субстрат, чем этанол. При ивгибировании цинком расхода на поддержание клеток увеличились незначительно. В области концентраций Zn2+ от 0.4 до 27 мг/л выделяется плато высоких значений выходов. Уменьшение yx/s происходит монотонно.

Зависимости нк(ц) в областях лимитирования и ингибирования цинком имеют сложную форму и не могут быть описаны известий® уравнениями.

4 Динамическая реакция непрерывной культуры на гагпгбирование этанолом

Замысел наших исследований потребовал проведения экспериментов, в которых путем резкого увеличения концентрации этанола нарушали стационарное состояния в непрерывной культуре и наблюдали зависимости удельной скорости роста и концентрации субстрата от вре-

мени. Это было необходимо для того, чтобы выяснить существует ш временное масштабирование переходного процесса и соблюдаются ли I течение этого процесса те взаимозависимости, которые культура показывает в стационарных условиях?

Изменение удельной скорости роста и концентрации субстрата вс времени в прямом переходном процессе от низкой к высокой концентрации этанола показано на рис.5. Можно выделить две стадии:

1) быстрый переходный процесс, когда после полного прекращен;« роста восстанавливается ц равная той, что была до добавления этанола. После начала переходного процесса величина а скачкообразно увеличилась. Это привело к очень быстрому падению скорости разбавлен®

Рио.5 Изменение удельной скорости роста и концентрации этанола в культуральной суспензии в прямом переходном процессе

до нуля. Однако затем скорость разбавления восстановила свое исход-

ное значение. Ввиду краткости быстрого переходного процесса (4 мин) он не может быть показан в масштабе рис.5.

2) медленный переходный процесс, представляющий собой отсроченную адаптационную реакцию на шоковое воздействие от ударного повышения концентрации этанола. В первые 10-12 часов происходит снижение (X до минимального значения 0.08 ч~1, а затем повышение примерно до половины исходного значения ц.

Взаимосвязь удельной скорости роста и концентрации субстрата при прямом переходе показана на рис.6. Толстая линия- зависимость р,(я), полученная ранее обычным способом в серии установившихся непрерывных режимов, тонкая линия соответствует переходному процессу.

Рис.6 Зависимость р. от а в прямом переходном процессе. Экспериментальные данные и ход зависимости согласно (7)

Видно, что отклонения от стационарной зависимости во время переходного процесса очень велики, и культура не успевает приблизиться к

ней за двое суток.

Выход биомассы резко упал до значений много меньших, чем в серии установившихся состояний, и остался на этом уровне (0.120.15). Очевидно, что резкое падение выхода биомассы при ингибирова-нии в большей степени связано не с увеличением т. а с падением истинного выхода у^,.

Взаимосвязь удельной скорости роста и содержания нуклеиновых кислот также оказалась нарушенной - нуклеиновые кислоты отставали от падения ц (рис.7).

нк,%

О 0.2 0.4 0.6 ЧАС-1

Рис.7 Зависимость содержания нуклеиновых кислот от ц в прямом переходном процессе

Анализируя данные опыта, мы предположили, что удельная скорость роста определяется содержанием некоторого ключевого вещества е клетках, причем это вещество различно при низких и высоких ковдент-

рациях этанола. При переходе от низких з к высоким первое вещество, став ненужным, экспоненциально исчезает, а содержание второго увеличивается согласно логистической кривой, широко распространенной в динамике биологических объектов

1 + ^ "о'

Параметры, входящие в это выражение были найдены путем статистической обработки данных. Теоретическая кривая хорошо отражает ход экспериментальных данных (рис.5).

В обратном переходном процессе от высокой к низкой концентрации этанола удельная скорость роста отставала от стационарной зависимости. Однако, скорость приближения к стационарной кривой ц(з) здесь существенно выше. Соотношение нуклеиновых кислот и ц было более близким к полученному в установившихся режимах роста, чем в прямом переходе.

Шок, вызванный резким увеличением концентрации ингибирующего субстрата, определяет двухступенчатую реакцию культуры. Для того, чтобы культура пршла к состоянию, которое достигалось в традиционных опытах после нескольких небольших шагов, здесь требуется гораздо большее время.

5 Биосинтез липидов с.valida при ингибировании этанолом

При ингибировании роста этанолом существенно увеличилась ненасыщенность внутриклеточных липидов. Считается, что ненасыщенность липидов характеризует микробную резистентность к неблагоприятным факторам среды. Уменьшение степени насыщенности (отношение суммы насыщенных жирных кислот к сумме ненасыщенных) при увеличении концентрации этанола удовлетворительно описывается уравнением линейной регрессии. При увеличении s содержание пальмитиновой кислоты упало с го до ЮЯ6 от суммы липидов, олеиновой выросло с 31 до 59%.

В прямом переходном процессе содержание липидов изменялось незначительно, ненасщенность липидов варьировала в большей степени Содержание олеиновой кислоты выросло с 2Э до 44Ж, линолевой упало < 40 до 22%.

Таким образом, в ответ на усиление действия неблагоприятное фактора среда (ингибирование этанолом) клетки дрожжей увеличиваю' ненасыщенность липидов. Быстрое изменение концентрации этанола ] ходе переходных процессов оказало менее радикальное воздействие в жирнокислотный состав липидов, чем постепеное увеличение концентра ции субстрата. Эта тенденция свидетельствует о существовании биохи мических механизмов адаптации дрожжей к высоким концентрациям эта нола путем модификации состава липидов мембран и других структу; клетки.

ВЫВОДЫ:

1. Дрожжи candida valida характеризуются сигмоидальной формо зависимостей удельной скорости роста и выхода биомассы при инги бировании этанолом.

2. Содержание нуклеиновых кислот при росте на этаноле в стационар ных режимах определяется удельной скоростью роста и не зависи от того, лимитируется им ингибируется рост субстратом. Подобна линейная зависимость при воздействии цинка не характерна.

3. Зависимости выхода биомассы от удельной скорости роста при инги бировании и лимитировании этанолом различаются. Ингибировани этанолом приводит к росту расходов субстрата на поддержание Цинк не не увеличивает расходов на поддержание клеток.

4. Резкое увеличение концентрации ингибируюцего субстрата вызывав двухступенчатую реакцию микробной культуры в виде быстрого медленного переходных процессов. Зависимости, полученные в ста

циояарннх состояниях непрерывного роста, нарушаются. После устранения неблагоприятных условий культура восстанавливает стационарные характеристики роста.

При адаптации клеток дрожжей к ингибированию этанолом происходит увеличение ненасыщенности внутриклеточных липидов и содержания в них олеиновой кислоты.

Список опубликованных работ по материалаи диссертации:

Андреев С.В., Минкевич И.Г. Ингибирование роста Candida vallda этанолом. В кн.: "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов": Тезисы докл. всесоюзной конференции, Пущино, 1989 0.6

Андреев С.В., Минкевич И.Г. Рост Candida vaiida в условиях, близких двойному лимитированию аммонием и этанолом. В кн.: 'Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", Пущино, 1989 С.5

Андреев С.В., Минкевич И.Г., Ерошин В.К. Ингибирование роста дрожжей Candida vaiida этанолом. Прикладная биохимия и микробиология, 1991- т.27. Ко 5. 738-747

Minkevioh. I.G., Andreyev S.Y., Eroshin V.K. Difference between steady state and transient behavior of the yea3t Candida vallda in pH-auxoatat under oubatrate inhibition. In: Working Party on Miorobial Physiology "Kinetics, Dynamios and Physiology of Microbial Growth". Ruschlikon/Zurioh, 1992 P.23