Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов с аминами в присутствии белков

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов с аминами в присутствии белков"

4В41>£' 1

на правах рукописи

ПОНОМАРЕВА ВИКТОРИЯ ДМИТРИЕВНА

ИНГИБИРОВАНИЕ ДИОКСИДОМ УГЛЕРОДА ВОЗДУХА ОБРАЗОВАНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА ИЗ КОМПЛЕКСОВ С АМИНАМИ В ПРИСУТСТВИИ БЕЛКОВ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 0 мдр 2011

Москва-2011

4840271

Работа выполнена в лаборатории регуляции биосинтеза белка Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.Г. Малыгин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

А.А. Ревина

доктор биологических наук Н.А. Чеботарева

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «у^» 2011 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного кандидат биологических наук

2011 года

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Частицы серебра с размерами от 1 до 500 нанометров находят применение в различных областях науки и техники. Особый интерес представляет их использование в биологии и медицине.

Свойство некоторых химических групп органических соединений инициировать образование светопоглощающих наночастиц серебра обеспечивает высокую чувствительность серебряных методов окрашивания тканевых структур в гистологии и биополимеров в полиакриламидном геле (ПААГ). Чувствительность этих методов многократно превосходит чувствительность методов, основанных на избирательной сорбции как обычных, так и флюоресцирующих органических красителей. В то же время, методы окраски серебром имеют недостаток, который не удается преодолеть на протяжении более ста лет - они плохо воспроизводимы. Нестабильность результатов проявления серебром, связана с тем, что не выявлены и поэтому не контролируются все существенные параметры, влияющие на процесс образования наночастиц серебра.

Способность серебра избирательно поражать микроорганизмы, оставляя при этом нетронутыми клетки хозяина, давно применяется для создания дезинфицирующих растворов, антибактериальных и противовирусных препаратов широкого спектра действия. Однако в отношении оценки эффективных доз этих препаратов в литературе сохраняется большая неопределенность.

Обнаруженный в Лаборатории регуляции биосинтеза белка эффект ингибирования восстановления серебра из его комплексов с аминами (Малыгин и Султанова, 2002) низкими концентрациями диоксида углерода (С02) позволил предположить, что колебания концентрации С02 в воздухе могут быть причиной плохой воспроизводимости известных методик окрашивания серебром в биологических исследованиях, а также отражаться на его бактерицидных свойствах.

Актуальность темы диссертации обусловлена необходимостью систематического исследования эффекта ингибирующего действия С02 на образование наночастиц серебра и выявления тех областей практического использования коллоидного серебра, где этот эффект следует учитывать.

Цели и задачи исследования. Целью работы было систематическое исследование ингибирующего эффекта низких концентраций С02 на инициируемое белками образование наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и с различными органическими аминами. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать простой химический метод для точного определения абсолютного содержания С02 в воздухе.

2. Изучить влияние воздуха, содержащего С02, на окрашивание белков в ПААГ методом восстановления серебра из комплекса с алифатическими аминоспиртами и аммиаком.

3. Исследовать в гомогенной системе эффект ингибирования низкими концентрациями диоксида углерода образования наночастиц серебра из комплексов ионов серебра с аминами.

4. Исследовать влияние С02 на окрашивание серебром гистологических препаратов мозга крысы и на образование наночастиц серебра из комплексов с биогенными аминами: норадреналином, серотонином и гистамином.

5. Выяснить влияние С02 на бактерицидные свойства серебра на примере Escherichia coli.

Научная новизна работы. Подтверждено, что свободный контакт воздуха, содержащего 0,06 - 0,08 объемных % С02, с раствором комплекса серебра с аммиаком, используемого на первой стадии методики проявления белков в ПААГ, ингибирует восстановление серебра формальдегидом на последней стадии проявления. В прямых опытах доказано, что низкие концентраций С02 в воздухе ингибируют образование наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и алифатическими аминоспиртами: этаноламином и 3-аминопропанолом-1 - в гомогенных растворах белка. Продемонстрировано ингибирующее действие С02 на восстановление серебра из комплексов с биогенными аминами нервной ткани: норадреналином, серотонином, гистамином - в растворе белка. Получены кинетические кривые ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра из комплексов с аминами и рассмотрен возможный механизм этого процесса. Показано, что колебания содержания С02 в воздухе могут быть причиной недостаточной воспроизводимости серебряных методов окрашивания срезов тканей мозга. Обнаружено, что повышенные концентрации С02 в воздухе усиливают токсичное действие серебра на клетки бактерии E.coli.

Научно-практическая ценность работы. Разработан простой химический метод определения низких концентраций С02 в воздухе и способ оценки точности метода при помощи калибровочных смесей с переменной концентрацией С02. Метод может быть использован как для определения низких концентраций С02 в воздухе с погрешностью до 0,002 объемных %, так и для контроля и градуировки инструментальных методов определения содержания газообразного С02. Результаты исследования ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра в ПААГ позволяют решить проблему недостаточной воспроизводимости методик окрашивания

гелей серебром. Данные об ингибировании диоксидом углерода восстановления серебра из комплексов с биогенными аминами и о влиянии С02 на окрашивание серебром срезов мозга, могут быть использованы для совершенствования соответствующих методик в гистологии. Усиление бактерицидного действия серебра повышенными концентрациями С02 в газовой фазе может учитываться при применении соединений серебра для дезинфекции в пищевой промышленности, ветеринарии и медицине.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 10 научных конференциях. В частности, соискателем они доложены на: III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosystems» (Pushchino, 2006); IV Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2006); III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007); VIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007); X Молодежной конференции по органической химии (Уфа, 2007); XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции «БиотехнологияГВода и пищевые продукты» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 10 тезисов в материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (Jj¡3 источников). Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунка и таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы и обоснована актуальность темы.

В первой главе представлен обзор литературы. В обзоре литературы дана общая характеристика биологического действия серебра, изложены современные представления о бактерицидном действии ионного и наноразмерного серебра. Рассмотрено развитие методов окрашивания серебром в биологических исследованиях. Дан краткий обзор

фотохимических свойств серебра. Рассмотрен механизм образования серебряных кластеров, предшественников светопоглощающих частиц серебра. Описан процесс окрашивания серебром белковых зон в ПААГ. Приведены полученные ранее в лаборатории данные по влиянию ССЬ воздуха на проявление белков серебром в ПААГ. Проведен сравнительный анализ существующих способов определения концентрации СО2 в воздухе.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Материалы и методы исследования.

Электрофорез сыворотки крови в ПААГ. Электрофорез белков в ПААГ осуществляли по частично модифицированному методу Лэммли (Малыгин, 1993; ЬаештН, 1970).

Проявление белковых зон в ПААГ серебром. Белки в ПААГ проявляли по несколько измененной методике Рея (\Vray, 1981). Проявление осуществляли в три стадии: 1) стадия насыщения полосок геля (150x9x1,5 мм) в течение часа раствором, содержащим 3 мМ AgNOз, 9 мМ ЫН4ОН, 2,4 мМ ИаОН; 2) стадия отмывки бидистиллированной водой - 20 минут; 3) стадия восстановления 72 мМ раствором формальдегида и 0,17 мМ раствором лимонной кислоты - около 10 мин. Объем растворов на всех стадиях составлял 25 мл. Проявление осуществляли параллельно в четырех стеклянных кюветах. Чтобы ограничить проникновение в растворы СО2 из окружающего воздуха, кюветы закрывали пришлифованными стеклянными пластинами. Концентрация С02 в воздухе в процессе осуществления эксперимента составляла 0,06 - 0,08 объемных %.

Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с этаноламином и З-аминопропанолом-1. Для получения комплекса серебра с этаноламином к 8 мл 0,1 М раствора А§>Ю3 добавляли 230 мкл 50% этаноламина. К приготовленному раствору добавляли 0,4 мл раствора белка в воде (альбумина или гексокиназы) с концентрацией 1 мг/мл. Полученный раствор разливали в пробирки по 1 мл в каждую. Раствор изолировали от контакта с воздухом атмосферы резиновыми пробками. В случае З-аминопропанола-1 используемая концентрация серебра была в два раза ниже.

Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с аммиаком. К

7,6 мл 0,2 мг/мл раствора одного из названных ниже белков добавляли 105 мкл смеси, содержащей 40 мМ AgNOз и 40 мМ (ЫН4)2804. Раствор перемешивали и разливали в пробирки по 480 мкл. Оптимальный объем смеси 50 мМ ИагСОз и 50 мМ ЫаНС03, добавляемый в каждую пробирку, для альбумина составлял 21 мкл (конечная концентрация 1,2 мМ), для

гексокиназы - 35 мкл (2,3 мМ), для гиалуронидазы - 28 мкл (1,8 мМ), для глюкозоксидазы - 21 мкл (1,2 мМ). Реакцию запускали добавлением в пробирки по 250 мкл 7,3 мМ свежеприготовленного раствора формальдегида.

Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с серотонином, норадреналином и гистамином. К 7,6 мл 0,2 мг/мл раствора гексокиназы добавляли 105 мкл раствора 40 мМ AgNC>3 и 105 мкл 40 мМ раствора креатининсульфатного комплекса серотонина или гистамина или 210 мкл 40 мМ раствора артеренол битартратмоногидрата (норадреналин). Полученную смесь перемешивали и разливали в полистирольные пробирки по 960 мкл. Щелочную среду создавали добавлением эквимолярного раствора ИагСОз и NaHC03. Оптимальный объем смеси 50 мМ ЫагС03 и 50 мМ NaHC03 для серотонина составлял 45 мкл (конечная концентрация 1,5 мМ), для гистамина

- 30 мкл (2 мМ). Для норадреналина использовали смесь 25 мМ Na2C03 и 25 мМ ИаНСОз объемом 20 мкл (0,5 мМ). В пробирки добавляли по 500 мкл 7,3 мМ свежеприготовленного раствора формальдегида (в случае норадреналина

- дистиллированной воды).

Импрегнация серебром образцов тканей мозга по методу Гольджи.

Образцы ткани мозга крысы обрабатывали по методу Гольджи в модификации Антоновой (Антонова, 1967).

Определение влияния С02 на токсичность серебра в отношении культуры клеток E.coli. Использовали штамм Escherichia coli (E.coli) BL21, производный штамма В, культивируемый в жидкой среде LB. Выращенную до стационарной фазы культуру E.coli с титром 108 - 109 клеток/мл разливали по 10 мкл в стерильные пробирки объемом 10 мл, содержащие по 2 мл стерильной дистиллированной воды. В пробирки, если необходимо, добавляли различные объемы 0,2 мМ раствора AgN03 и закрывали пробками. Требуемая концентрация СОг создавалась введением в пробирки необходимого объема чистого СО2. После инкубации в течение часа при температуре 15°С исследуемые культуры E.coli разбавляли в 100 и 1000 раз стерильной дистиллированной водой и высевали на чашки Петри с LB-агаром. Колонии растили при температуре +32°С и подсчитывали.

Электронная микроскопия. Препараты коллоидного серебра или его конъюгатов наносили на сеточки, покрытые формваровой пленкой. Изображения наночастиц получали с помощью электронного микроскопа СХ-100 («Jeol», Япония).

Спектральные исследования. Спектры оптического поглощения растворов наночастиц серебра в видимой области (30-14 х 1000см"1) снимали при комнатной температуре на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия).

Получение С02. Получение С02 осуществляли разложением гидрокарбоната натрия серной кислотой (Карякин и Ангелов, 1974) в газометре.

Получение и воздуха, очищенного от СОг. Очистку воздуха от С02 осуществляли выдерживанием над 3 - 5% раствором едкого калия в газометре в течение 20 - 30 минут. В результате содержание С02 в газометре не превышало 0,001%.

Получение и очистка от С02 кислорода. Кислород получали разложением КМПО4 при нагревании и очищали от примеси С02 пропусканием через гранулы КОН.

В третьей главе приводятся собственные результаты и их обсуждение.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Разработка метода определения низких концентраций С02 в воздухе.

Для исследования процесса ингибирования восстановления серебра низкими концентрациями С02 необходимо точно контролировать эти концентрации в воздухе. Поэтому важную часть исследования составляла разработка простого химического метода определения низких концентраций С02 в воздухе. В основе метода лежала реакция нейтрализации насыщенного водного раствора Ва(ОН)2 содержащимся в воздухе С02:

Ва+2 + 20Н" + С02 = ВаС031 + Н20

ВаСОз + С02+ Н20 = Ва2+ + 2НС03"

Объем воздуха, соответствующий точке эквивалентности между количеством поглощенного С02 и исходным количеством катионов Ва2+ в первой реакции, определяли по минимуму электропроводности в процессе пропускания через раствор воздуха, содержащего С02.

Устройство прибора и методика определения СО*

Основной функциональной частью прибора (рис. 1) служит стеклянная трубка, в которой происходит поглощение С02 из воздуха. В центральную часть трубки впаяны два платиновых электрода. В нижнюю часть трубки помещается необходимый объем раствора Ва(ОН)2. Диоксид углерода сорбируется на внутренней поверхности трубки, смачиваемой столбиком раствора Ва(ОН)2, который перемещается вверх по трубке по мере поступления в нее воздуха. По достижении верхних полостей трубки столбик жидкости разрушается и его содержимое стекает по стенкам трубки навстречу поступающему воздуху, создавая эффект поглощения в противотоке. Электропроводность жидкости в трубке измеряли

кондуктометром. Объем прошедшего через трубку воздуха определяли по объему вытесненной им воды из перевернутого мерного цилиндра.

Рис. 1. Прибор для определения С02 в воздухе: 1 - сорбционная трубка; 2 - аликвота раствора Ва(ОН)2 известной концентрации; 3 - платиновые электроды; 4 -ребра жесткости; 5 - стеклянный капилляр; 6 - мерный цилиндр; 7 -стеклянная трубка внутри цилиндра; 8 - склянка для уравновешивания давления; 9 -шланги из красной резины; 10 -кондуктометр. Стрелками указано движение анализируемого воздуха в приборе.

Для точного вычисления объемных процентов С02 в пересчете на сухой воздух использовали формулу:

С = ЮО/(РУШ(КТ[Ва(ОН)2]Ува(он)2)+1). (1)

Если концентрация С02 в воздухе не превышала 0,1% по объему, то концентрацию С02 вычисляли по упрощенной формуле: С = ЮО[Ва(ОН)2]Ува(он)2^Т /(РУкЬ), (2)

где V - кажущийся объем поступившего в цилиндр воздуха, измеренный по градуировке цилиндра без учета объема трубки внутри цилиндра (в литрах); [Ва(ОН)2] - исходная концентрация Ва(ОН)2 в растворе (в молях); УВа(он)2 -объем раствора Ва(ОН)2, помещаемого в сорбционную трубку (в литрах); к=1-(12/В2; (1 - внешний диаметр трубки внутри цилиндра; Б - внутренний диаметр цилиндра; Ь=(1-рн/Р); р„ - давление насыщенных паров воды (находилось по справочнику); Р - атмосферное давление (в атмосферах); Я -универсальная газовая постоянная (0,08206 л-атм/моль-град); Т - абсолютная температура (в градусах Кельвина).

Способ приготовления градуировочных смесей с переменной концентрацией СО2

Для оценки точности метода определения низких концентраций С02 в воздухе были использованы воздушные градуировочные смеси с изменяющейся концентрацией С02. Для их приготовления разработали устройство, в котором через заполненный воздухом сстеклянный сосуд с заданной начальной концентрацией С02 пропускали очищенный от С02 воздух. Очищенный воздух по мере поступления в колбу перемешивался с ее содержимым. При этом концентрация С02 на выходе описывалась обратной

экспоненциальной зависимостью от объема пропущенного воздуха, которую при заданных начальных условиях выводили теоретически. Значения средних теоретических концентраций С02 вычисляли по формуле, полученной делением интеграла этой зависимости на объем пропущенного воздуха:

С'ср=100У'со2(ехр(-УпШ(Ук(1-С'п/Ю0)))-ехр(-Уп+1Ш(Ук(1-С'п+1/100))))/((Уп+1/(1-С,п+1/100)-Уп/(1-С'п/100))кЬ), (3)

где УСо2 - начальный объем вводимого в колбу С02 (в литрах); Ук - объем колбы; Уп - начальный объем градуировочной смеси; У„+1 - конечный объем градуировочной смеси; С'„ - начальная концентрация С02 в колбе (в объемных %); С'п+1 - конечная концентрация С02 в колбе.

Вычисления и построение графиков осуществляли при помощи программы С^тЬаЬ.

Оценка точности определения концентраций С02 в воздухе разработанным методом.

Результаты сравнения теоретических значений (вычисленные по формуле 3) с экспериментально полученными (вычисленные по формуле 2) для концентраций С02 в интервале от 0,02 до 0,1% показывают, что расхождение между ними не превышает 2% (рис. 2а), а в интервале концентраций от 0,1 до 0,9 % (вычисленные по формуле 1) - не превышает 1% (рис. 26) от исходно заданной концентрации С02 (С'о).

с„.об.% (а) (б)

Рис.2. Сравнение средних экспериментальных значений концентраций ССЬ с теоретическими в порциях градуировочной смеси в интервале концентраций: а) от 0,01 до 0,11% и б) от 0,1 до 0,9%.

Разработанный метод в техническом оформлении проще и доступнее всех ранее описанных методов определения абсолютных концентраций С02 в воздухе с погрешностью измерения до 1 - 2% от его содержания.

Для проведения непрерывного измерения СОг в воздухе использовали коммерческий газоанализатор ПКУ-4-Р-МК («ПрактикНЦ», Россия), который был откалиброван с применением разработанного нами метода определения ССЬ. Установлено, что систематическое отклонение показаний газоанализатора ПКУ-4-Р-МК, которое необходимо учитывать, меняет свой знак в зависимости от интервала измерения. При этом, в интервале от 0,01 до 0,05% СОг максимальное отклонение составляет +40% от измеряемой величины, а в интервале от 0,05 до 0,8% С02 достигает -20%.

2. Ингибирующее действие контакта воздуха с раствором комплекса [Ag(NHз)2]+ на проявление белков в ПААГ серебром.

В работе (Малыгин и Султанова, 2002) описано ингибирование восстановления серебра в ПААГ при свободном контакте проявляющих растворов с воздухом, содержащим С02. При этом продемонстрированы результаты опытов с использованием комплекса ионов серебра с этаноламином и лишь упомянуто об аналогичных результатах при использовании комплекса [А§(ТЧНз)2]+. Поскольку при проявлении белков в гелях обычно используют раствор комплекса [Ag(NHз)2]+, то в настоящей работе более детально изучено влияние контакта этого раствора с воздухом на процесс проявления. Закрытые кюветы с растворами, в которые были помещены гели, открывали на разных стадиях проявления для свободного контакта растворов с воздухом. Показано, что контакт раствора с воздухом, содержащим 0,06 - 0,08% С02, на первой стадии проявления (насыщение гелей комплексом )з] ) ингибирует процесс проявления. В то время

как на других стадиях (отмывание водой и восстановление серебра формальдегидом) контакт с воздухом не оказывает заметного влияния на проявление (рис. 3).

Рис. 3. Результаты проявления белков сыворотки крови в полосках ПААГ с использованием комплекса [А§(ЫНз)2]+ в кюветах, открытых только на стадии насыщения гелей раствором [А§(МНз)г]+ (1 ;2), только на стадии отмывания водой (3;4), только на стадии восстановления формальдегидом (5;6) - и в кюветах, закрытых на всех стадиях (контроль) (7;8).

Полученный результат можно объяснить тем, что ССЬ ингибирует на первой стадии проявления (насыщение гелей раствором [А§(>Щ3)2]+) образование кластеров серебра, инициирующих процесс восстановления серебра, и не влияет на рост кластеров до размеров светопоглощающих наночастиц серебра на последующих стадиях (отмывка водой и восстановление формальдегидом).

1 2 3 4 5 6 7 8

3. Изучение влияния С02 воздуха на восстановление Ag+ в гомогенной системе.

Чтобы упросить изучение процесса ингибирования диоксидом углерода проявления белков в ПААГ серебром, были исследованы условия осуществления этого процесса в гомогенной системе с комплексами А§+ с этаноламином, З-аминопропанолом-1 и аммиаком.

Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов серебра с алифатическими аминоспиртами.

Ингибирование диоксидом углерода осаждения металлического серебра на стенках пробирок, которое было ранее продемонстрировано в системе с нелетучим этаноламином (Малыгин и Султанова, 2002), сочетающим в себе функции лиганда в комплексе с Ag+ и восстановителя, нельзя считать достаточным доказательством участия С02 в ингибировании инициирования восстановления серебра белками в геле. Кроме того, образование в реакции нерастворимой фазы металлического серебра затрудняет исследование процесса ингибирования. Поэтому в настоящей работе для инициации образования наночастиц серебра в объеме раствора в систему восстановления Ag+ из комплекса с этаноламином вводили различные белки в низких концентрациях.

На рис. 4 видно, что ингибирование образования наночастиц серебра из комплекса Ag+ с этаноламином происходит при контакте растворов с воздухом и отсутствует при изолировании этих растворов от контакта с воздухом. При этом в присутствии глюкозоксидазы реакция восстановления серебра более выражена, чем в присутствии гиалуронидазы.

Рис. 4. Влияние контакта с воздухом на восстановление Ag+ из комплекса с этаноламином в присутствии глюкозоксидазы (1-4) и гиалуронидазы (5-8). На вторые сутки инкубации в закрытых пробирках серебро восстанавливалось (1;2;5;6), в то время как в открытых - реакция была подавлена (3;4;7;8).

Таким образом, установлено, что, хотя различные белки с разной эффективностью инициируют восстановление серебра в растворе, ингибирование этого процесса контактом с воздухом, содержащим С02, не зависит от природы белка.

Представленные на рис. 5 спектры поглощения растворов наночастиц серебра, образующихся при восстановлении Ag' из комплекса с этаноламином в присутствии гексокиназы, подтверждают вывод, что контакт с внешним воздухом подавляет образование наночастиц серебра в растворе.

0,60п

0,55-

0,50-

2 0,45-

X о 0,40-

ю 0,35-

ш 0,30-

О 0,25-

0,20-

0,15-

0,10-

0,05-

0,00-

30 28 26 24 22 20 18

16 14 12 10 х 1000 см"1

Рис. 5. Спектры поглощения в видимой области (30-14 х 1000см"') коллоидного раствора серебра, полученного при восстановлении Ag+ из комплекса с этаноламином в присутствии гексокиназьг в закрытых пробирках (1) и в открытых пробирках (2).

При изучении скорости восстановлении Ag+ из комплекса с этаноламином в присутствии альбумина (рис. 6) обнаружено, что зависимость увеличения оптической плотности раствора наночастиц серебра от времени в закрытых пробирках носит явно выраженный двухстадийный характер. В первой стадии осуществляется процесс образования центров инициации (кластеров), подобно тому, как это происходит при кристаллизации веществ из растворов. На второй стадии, при достижении кластерами критической величины, происходит лавинообразный рост размера частиц, заканчивающийся исчерпанием растворенного вещества.

Рис. 6. Изменение оптической плотности от времени окрашенных коллоидов серебра, образующихся при восстановлении Ag+ из комплекса с этаноламином в присутствии альбумина в условиях свободного контакта раствора с воздухом (1) и изоляции от воздуха (2).

время, час

В сходных опытах с алифатическим гомологом этаноламина - 3-аминопропанолом-1 были получены аналогичные результаты.

Прямым доказательством участия С02 в ингибировании образования наночастиц серебра было замедление потемнения растворов комплекса серебра с этаноламином в пробирках с добавленным ССь по сравнению с пробирками, в которые ССЬ не добавляли. Отсутствие градиента оптической плотности раствора образующихся наночастиц серебра в длинных пробирках (35см) указывало на то, что скорость диффузии С02 в растворе намного превышает скорость восстановления Ag+ и на нее существенно не влияет.

Высокая скорость диффузии СОг в системе также подтверждается кривой поглощения СОг из воздуха. На рис. 7 видно, что достижение равновесия между газовой фазой и раствором занимает не более 15 мин, в то время как для завершения реакции восстановления серебра из комплекса с этаноламином требовалось более суток.

Рис. 7. Кинетика уравновешивания концентрации СОг в воздухе с раствором, содержащим комплекс Ag+ с этаноламином, в замкнутом объеме при соотношении объемов раствора и воздуха 2/3. Кривая (1) - поглощение СОг из воздуха при начальной концентрации 0,036%; кривая (2) -последующее выделение СОг из раствора в воздух, очищенный от ССЬ.

Таким образом, в простой гомогенной системе показано, что СО2 воздуха ингибирует инициируемое белками образование наночастиц серебра из комплекса с алифатическими аминами.

Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплекса [Ag(NHз)2l+.

Для доказательства того, что СОг ингибирует образование наночастиц серебра из комплекса [А§(ЫН3)2]' использовали систему с формальдегидом в качестве восстановителя. Источником аммиака в системе служил раствор нелетучего сульфата аммония в щелочной среде. Количество щелочного буфера в виде эквимолярной смеси ИаНСОз и Ка2С03 подбирали так, чтобы скорость восстановления серебра из комплекса [Ag(NH3)2]+ была сопоставима со скоростью реакции восстановления А§+ из комплекса с этаноламином. Эксперименты в закрытых и открытых полистирольных пробирках со всеми используемыми белками (альбумин, гексокиназа, глюкозоксидаза, гиалуронидаза) дали сходные результаты: в закрытых пробирках образуется гомогенный раствор коллоидного серебра, в то время как в открытых - реакция подавляется, как это показано на рис. 8.

Рис. 8. Влияние контакта с воздухом на восстановление Ag+ из комплекса [Ag(NHз)2]+ в присутствии глюкозоксидазы (1-4) и гиалуронидазы (5-8). На вторые сутки инкубации растворы в закрытых пробирках окрашивались интенсивнее (3;4;7;8), чем в открытых (1;2;5;6).

1 2 3 4 5 6 7 8

Как видно из сравнения рис. 5 и 9, спектры поглощения продуктов реакции в гомогенной системе в видимой области имеют одинаковый

колоколообразный вид с максимумом поглощения при длине волны около 450 нм. Это говорит о схожести процессов, идущих как в системе с этаноламином, так и при замене последнего на аммиак.

30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 X 1000 см "1

Рис. 9. Спектры поглощения в видимой области (30-14 х 1000см"1) коллоидного раствора серебра, полученного при восстановлении Ag+ из комплекса [А§(ЫНз)г]+ в присутствии гексокиназы в закрытых (1) и открытых (2) пробирках.

Из рис. 6 и 10 следует, что свободный контакт с воздухом, содержащим С02, растворов комплекса |^(ННз)2]+ (рис. 10) и комплекса Ag+ с этаноламином (рис. 6) приводит к ингибированию реакции образования наночастиц серебра.

ю

20 30 40 50

время, час.

60

Рис. 10. Изменение оптической плотности от времени окрашенных коллоидов серебра, образующихся при восстановлении из комплекса

[А§(МНз)2]+ в присутствии гексокиназы в условиях свободного контакта раствора с воздухом (1) и изоляции от воздуха (2).

В опытах с [А§(ЫНз)2]+ был показан лишь факт ингибирования реакции восстановления серебра при контакте реакционной смеси с атмосферным воздухом, содержащим С02. В радиохимии при синтезе кластеров серебра обычно проводят деаэрацию растворов, предполагая, что на ход реакции влияет кислород воздуха (Негуст, 1991; ЕгбЬоу, 1998). Для доказательства того, что в гомогенной системе ингибирующим фактором является не кислород, а содержащийся в воздухе С02, были проведены прямые опыты с добавлением в систему различных количеств С02 и очищенного от С02 кислорода. Опыты проводили с глюкозоксидазой и гексокиназой.

Результаты других опытов (рис. 11) показывают, что свободный контакт содержимого пробирок с воздухом (0,08% С02), а также 2,68

мкмолей (капилляры на 60 мкл) и 5,36 мкмолей (капилляры на 120 мкл) С02 в пробирках полностью ингибируют образование наночастиц серебра в системе, в то время как количество С02 в воздухе, ограниченном объемом пробирок (0,11 мкмолей), не оказывает заметного ингибирующего действия. Очищенный кислород также не обнаруживает ингибирующих свойств.

I 111

ч и, и, ^ I 1 1

ИаДиК

1234 567 89 10

Рис. 11. Прямое доказательство участия ССЪ в ингибировании восстановления серебра из комплекса [^(1\(Нз)2]+ в присутствии глюкозоксидазы (через 24 часа). В открытых пробирках (1;2), в пробирках с капиллярами на 60 мкл (3;4) и с капиллярами на 120 мкл (5;6), заполненными ССЪ - реакция подавлена. В закрытых пробирках, заполненных воздухом (7;8) и заполненных очищенным от СОг кислородом (9; 10), наблюдали образование наночастиц серебра.

Рис. 12. Ингибирующее влияние малых количеств СОг воздуха на восстановление серебра из комплекса [Ag(NHз)2]+ в присутствии гексокиназы (через 12 часов). В пробирках (1;2), соединенных с пробирками без Ва(ОН)2, реакция подавлена. В пробирках (3;4), соединенных с пробирками, содержащими 1 мл 0,08 М раствор Ва(ОН)г, наблюдали образование наночастиц серебра. Исходная концентрация СОг в пробирках - 0,08%.

Чтобы доказать, что ингибирование образования наночастиц серебра из комплекса [А§(ТЧНз)2]+ может происходить и при более низких концентрациях С02, провели сравнение развития реакции в системе, заполненной воздухом (0,22 мкмолей С02 в пробирке), и в системе, где СО? удалялся раствором Ва(ОН)2 (рис. 12). Опыты проводились с гексокиназой и гиалуронидазой. В результате установлено, что С02 ингибирует образование наночастиц серебра из комплекса [Ag(NHз)2]+ не только при неограниченном поступлении из воздуха помещения, но и при его весьма малых количествах, ограниченных объемами пробирок, при той же концентрации С02.

Чтобы получить сопоставимые результаты исследований процессов в гомогенной системе и в геле, скорость образования наночастиц серебра из комплекса [А§(ЫН3)2]! была увеличена в гомогенной системе посредством повышения рН и буферной емкости растворов заменой смеси МаНС03 и 1Ча2С03 на раствор Ка2С03. Повышение скорости реакции, сократило время опыта с 60 до 3 часов (рис. 10, 13) и таким образом помогло установить, что добавление С02 в систему увеличивает время задержки образования наночастиц серебра, но не влияет на скорость их образования после начала процесса.

Рис. 13. Изменение оптической плотности окрашенных коллоидов серебра от времени, образующихся при восстановлении Ag+ из комплекса [А§(ЫНз)2]+, в условиях увеличения буферной емкости и рН системы в присутствии гексокиназы в условиях свободного контакта раствора с воздухом (1) и изоляции от воздуха (2).

время(мин)

Этот факт согласуется с приведенным выше наблюдением, что ингибирование проявления белков в геле происходит при свободном контакте с воздухом только на первой стадии проявления, когда образуются кластеры серебра, выполняющие функции затравок, в то время как на процесс формирования наночастиц серебра более крупного размера, осуществляющийся на второй и третьей стадиях проявления, контакт с воздухом не оказывает влияния.

Этот вывод подтверждается электронномикроскопическим исследованием размеров наночастиц серебра (рис. 14). Изолирование раствора от контакта с внешним воздухом способствует формированию и росту наночастиц серебра, в то время как свободный контакт с воздухом и особенно ввод в пробирки дополнительного количества С02 замедляет рост наночастиц и, соответственно, заметно уменьшает их размеры.

А Б В

О ' 50 100 150 200

< V - *

V* . . 100нм

Рис. 14. Наночастицы серебра, образующиеся при восстановлении Ag+ из комплекса [Ag(NHз)2]+ в присутствии гексокиназы в закрытых от воздуха пробирках (А), открытых (Б) и закрытых с 4% СОг (5,41 мкмолей) (В).

Известно, что концентрация С02 в результате жизнедеятельности человека в закрытом помещении может изменяться на два порядка (от 0,03 до 3%). Поскольку выше было показано, что низкие концентрации С02 ингибируют восстановление серебра в ПААГ и серебросодержащих

растворах, то необходимо было оценить, как меняется концентрация С02 в зоне работы экспериментатора.

Измерение концентрации С02 в воздухе на разных расстояниях от лица экспериментатора показало пятикратное увеличение концентрации на расстоянии 30 см, полуторократное - на расстоянии 50 см и пренебрежимо малое - на расстоянии 1 м (рис. 15).

Рис. 15. Результаты замеров концентрации С02 на рабочем месте экспериментатора. Замеры при удалении лица экспериментатора на 50 и 30 см. Фоновая концентрация С02 в помещении 0,08%.

Из опытов, проведенных с использованием гомогенной системы следует, что уже пятикратное увеличение концентрации С02 по сравнению с фоновым вызывает значительное подавление восстановления серебра. Таким образом, колебания концентрации С02 в воздухе могут являться главным неконтролируемым параметром, влияющим на воспроизводимость методик проявления серебром белков в ПААГ.

Возможный механизм ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра из комплексов с аминами.

Поскольку диоксид углерода легко образует с аминами в щелочной среде карбонаты, гидрокарбонаты, а также соли карбаминовых кислот, то можно было предположить, что ингибирование восстановления серебра осуществляется не свободным С02, а его производными. Однако наши опыты и опубликованные ранее данные (Малыгин и Султанова, 2002) показывают, что Иа2СОз не только не ингибирует, а напротив, ускоряет реакцию восстановления серебра из комплексов с аминами. Опыты с КаНСОз и карбаматом аммония также не подтвердили их ингибирующее действие.

Другое, на первый взгляд очевидное предположение состоит в том, что С02 закисляет реакционную среду и посредством этого тормозит реакцию восстановления серебра. Действительно, увеличением рН среды посредством замены смеси ИаНСОз и Ыа2С03 на №2С03 и двукратным увеличением буферной емкости раствора удалось многократно увеличить скорость реакции восстановления серебра из комплекса [^(МН3)2]+ (рис. 10 и 13), что свидетельствует в пользу механизма ингибирования восстановления серебра

за счет закисления реакционной среды. Однако в прямом опыте при эквимолярной замене С02 на серную или уксусную кислоту ингибирование реакции восстановления серебра из комплекса с этаноламином было менее выражено, чем в случае использования газообразного С02. Последнее обстоятельство ставит под сомнение механизм ингибирования восстановления Ag+ за счет закисления среды диоксидом углерода и допускает возможность прямого участия молекулярного С02 в процессе ингибирования. Если предположить, что в восстановлении участвует анион-радикал диоксида углерода (С02"), согласно описанной радиохимиками равновесной реакции (ЕгеЬоу et а1., 1993)

А§+ + С02'-<-> Аё°+С02, которая открывает каскад реакций, приводящих к последующему образованию описанных в литературе кластеров: Ag2+, Agз2+, Ag42+, Ag82+ и далее наночастиц серебра (Ершов, 2002), - то обращение этой реакции при избытке С02 в системе должно приводить к перехвату Ag0, ингибированию каскада реакций и, как следствие, торможению образования наночастиц серебра.

Таким образом, содержащийся в воздухе С02 на первой стадии проявления белков в ПААГ препятствует образованию кластеров, инициирующих осаждение серебра. При этом амины, связывая Ag+, обращают реакцию восстановления А§+ ананион-радикалом С02" и тем самым способствуют превращению продукта реакции - С02 в ее ингибитор.

4. Влияние С02 воздуха на образование наночастиц серебра из комплексов серебра с серотонином, норадреналином и гистамином, а также на окрашивание серебром препаратов мозга крысы.

Поскольку в гистохимии методы с применением серебра используются для вьивления в нервной ткани биогенных аминов (Луппа, 1980), то прежде чем выяснить влияние С02 на окрашивание серебром препаратов тканей мозга, было изучено ингибирующее действие С02 на образование наночастиц серебра в пробирках из комплексов ионов серебра с биогенными аминами: серотонином, норадреналином и гистамином.

Опыты с норадреналином показали, что серебро в пробирках, заполненных воздухом с начальной концентрацией С02 0,05%, восстанавливалось быстрее, чем в пробирках с начальной концентрацией С02 4% (рис. 16 А). В опытах с серотонином, где в отличие от опытов с норадреналином восстановителем служил не сам амин, а добавленный в систему формальдегид, результаты были аналогичными (рис. 16 Б). Сходные результаты были получены при восстановлении серебра из комплексов с гистамином в присутствии формальдегида.

А

Б

Рис. 16. Спектры поглощения в видимой области (30-14 х 1000см'1) коллоидных растворов серебра, полученных при восстановлении Ag+ из комплексов: с норадреналином (А) и с серотонином (Б) в присутствии гексокиназы в закрытых пробирках, заполненных воздухом с начальной концентрацией СОг 0,05% (1) и с начальной концентрацией СОг 4% (2).

В гистологии различают два типа окрашивания серебром: аргентаффинное, при котором окрашивание структур ткани происходит без участия внешнего восстановителя, и аргирофильное, требующее присутствия внешнего восстановителя. Образование наночастиц серебра из комплексов с норадреналином и алифатическими аминоспиртами (этаноламин и 3-аминопропанол-1) соответствует аргентаффинному типу окрашивания, тогда как из комплексов с серотонином, гистамином и аммиаком -аргирофильному. Поэтому результаты, представленные на графиках (рис. 16), позволяют сделать вывод, что С02 ингибирует как аргентаффинную, так и аргирофильную реакции восстановления серебра в тканях.

Чтобы выяснить влияние СОг на окрашивание серебром нервной ткани, препараты ткани мозга крысы окрашивали серебром по методу Гольджи (методика Антоновой, модифицированная), причем стадию пропитки образцов раствором AgNOз осуществляли при разных концентрациях С02 в воздухе над раствором.

В результате обнаружено, что при изменении концентрации С02 окрашивание серебром структурных элементов ткани происходит неодинаково.

Таблица. Зависимость окрашивания серебром структурных элементов препаратов мозга крысы от концентрации СОг.

Начальная концентрация СО2 (над раствором AgNOз в воздухе пробирки)в об. % Среднее число окрашенных нейронов на мм2 Площадь, занимаемая окрашенными капиллярами

0,06 % 0,07 + 0,04* 0,37 ± 0,07*

4% 0,96 ± 0,20 0,06 + 0,04

Примечание: * р<0,05 (степень окрашивания в среде с 0,06% СОг против 4% СО2). Подсчет производили в области сенсомоторной коры больших полушарий мозга при толщине срезов 90 мкм и площади исследуемой зоны 1200 мм2.

Как видно из таблицы и рис. 17, при обработке препаратов мозга азотнокислым серебром в присутствии 0,06% С02 окрашиваются преимущественно капилляры, в то время как в присутствии 4% С02 интенсивнее окрашиваются нейроны. А Б

^ Рис. 17. Результаты окрашивания

' серебром (метод Гольджи) нервной

ткани крыс при разных

Ш концентрация СО2 в воздухе: А - при

экспонировании с 0,06% СОг (окрашены капилляры); Б - при экспонировании с 4% С02 (окрашены нейроны).

Полученные результаты можно объяснить сорбцией и восстановлением ионов серебра стенками капилляров при низкой концентрации С02 (0,06%), вследствие чего ионы серебра не достигают нейронов, которые остаются неокрашенными. В случае повышенной концентрации СОг (4%) центры инициации на стенках капилляров подавляются, и ионы серебра беспрепятственно диффундируют к нейронам, которые, восстанавливая окрашиваются.

Таким образом, установленный факт усиления окрашивания серебром нейронов и ослабления окрашивания капилляров в гистологических препаратах мозга крысы диоксидом углерода объясняется ингибирующим действием СОг на образование наночастиц серебра. Это указывает на общность эффекта влияния С02 на окрашивание тканевых препаратов серебром в гистологии с ингибированием диоксидом углерода окраски серебром белков в ПААГ. Следовательно, как и в случае проявления белков в ПААГ, колебания С02 в воздухе могут быть причиной нестабильности результатов окрашивания серебром гистологических препаратов.

5. Влияние СС>2 на токсичность серебра в отношении клеток Escherichia coli.

Учитывая описанный выше эффект ингибирования образования наночастиц серебра низкими концентрациями СОг, логично было предположить, что С02 может влиять на токсические свойства серебра по отношению к микроорганизмам. Для выяснения этого в качестве объекта исследования использовали клеточную культуру E.coli.

Культуру E.coli разливали по пробиркам, содержащим стерилизованную дистиллированную воду, и добавляли раствор AgN03. Были подобраны такие концентрации AgNCb, которые приводят к частичному снижению выживаемости клеток E.coli. В пробирки добавляли необходимые количества С02 и закрывали. Пониженная температура (+15°С) и низкий титр бактерий (108-109 клеток/мл) в инкубационной среде способствовали сведению к минимуму концентрации эндогенного С02 и тем самым уменьшали его влияние на токсичность растворенного серебра. После серии разведений культуры E.coli из пробирок высевали на чашки Петри с агаром LB. Число образовавших колонии клеток подсчитывали через двое суток.

Как следует из рис. 18, выживаемость бактерий в присутствии 0,01 мМ AgN03 снижается до 44%, по сравнению с пробами, где серебро отсутствует.

Увеличение токсического действия 0,01 мМ AgN03 на клетки E.coli начинает проявляться при концентрации С02 в воздухе равной 1% и достигает максимума при 6 % (рис. 19). В контрольных опытах изменение концентрации С02 над суспензией Е. coli в отсутствии Ag+ в пределах ошибки опыта не влияет на выживаемость бактериальных клеток. Из этого следует, что наблюдаемое увеличение цитотоксичности обусловлено не С02 как таковым, а его взаимодействием с серебром.

Рис. 18. Выживаемость клеток E.coli, инкубированных в течение часа в чистой воде и в воде с добавкой AgN03, при обычной и повышенной концентрациях С02 в воздухе. 1) Среднее число образующих колонии клеток после инкубации при 0,06% С02 в отсутствии AgNC>3 (контрольный опыт) принято за 100%. Число образующих колонии клеток после инкубации бактерий в условиях: 2) 6,0% С02; 3) 0,07% С02 с 0,01 мМ AgN03; 4) 6,0% С02 с 0,01 мМ AgN03.

Рис. 19. Зависимость выживаемости клеток E.coli, инкубированных в течение часа в 0,01 мМ водном растворе AgN03, от начальной концентрации СОг в пробирках над раствором.

Концентрация СОг на оси абсцисс представлена в объемных процентах в логарифмическом масштабе. По оси ординат отложен средний процент числа образующих колонии клеток после инкубации бактерий в условиях возрастающих концентраций СОг в присутствии 0,01 мМ AgNCh от числа образующих колонии клеток после инкубации в чистой воде при 0,07% С02.

Таким образом, на примере культуры E.coli показано, что С02 усиливает токсическое действие серебра на клетки прокариот.

ВЫВОДЫ

1. Разработан простой химический метод определения низких концентраций С02 в воздухе с точностью до 0,002%, а также способ оценки его точности при помощи калибровочных смесей с переменным содержанием С02.

2. Подтверждено, что ингибирование проявления белков в ПААГ серебром происходит только при контакте содержащего С02 воздуха с раствором комплекса ионов серебра с аммиаком на стадии насыщения им гелей и отсутствует при контакте воздуха с растворами на последующих стадиях обработки гелей.

3. Опытами по восстановлению ионов серебра из комплексов с аммиаком и органическими аминами в гомогенной системе доказано, что образование наночастиц серебра ингибируется содержащимся в воздухе С02 в то время как кислород в этом процессе не участвует.

4. Показано, что ингибирование диоксидом углерода восстановления ионов серебра из комплексов с аминами в гомогенной системе происходит на стадии инициации образования наночастиц серебра.

5. Показано, что С02 воздуха ингибирует восстановление серебра из комплексов с аминами нервной ткани: серотонином, норадреналином, гистамином - а также установлено, что С02 усиливает окрашивание серебром нейронов и ослабляет окрашивание капилляров в гистологических препаратах мозга крысы.

3020-

СО ,%v/v

6. Обнаружен эффект усиления токсических свойств серебра диоксидом углерода в отношении бактерии Escherichia coli.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Простой химический метод определения диоксида углерода в воздухе. // Журнал аналитической химии. 2007. Т. 62. №1. С. 23-31.

2. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Диоксид углерода воздуха подавляет инициируемое белками образование наночастиц серебра в полиакриламидном геле и в растворе. // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. №6. С. 764-772.

3. Пономарева В.Д.. Пшенникова Е.С., Малыгин А.Г. Диоксид углерода усиливает цитотоксическое действие серебра на бактерии E.coli. // Вода: химия и экология. 2008. №5. С. 26-28.

Тезисы докладов:

4. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Низкие концентрации диоксида углерода ингибируют инициируемое белками образование коллоидов металлического серебра. // III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж .Тезисы докладов. ТI. С. 250-251.

5. V.D. Ponomareva and A.G. Malygin. Method of Carbon Dioxide Determination in Air Applicable in Investigations of Photosynthesis. // International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosystems». August 20-26 2006. Pushchino. Institute of Basic Biological Problems. P. 224.

6. Пономарева В.Д.. Малыгин А.Г. Общедоступный метод определения концентрации диоксида углерода в воздухе экосистем. // IV Международная научная конференция «Биотехнология - охране окружающей среды». 18-20 ноября 2006 г. Москва. МГУ. Тезисы докладов. Т. 39. С. 245.

7. Малыгин А.Г., Пономарева В.Д. Простой химический метод определения абсолютного содержания диоксида углерода в атмосфере. // III Международная конференция «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». 4-8 июня 2007 г. Московская обл.,

г. Пущино. ИФХ и БПП РАН. Тезисы докладов. С. 51.

8. Пономарева В.Д.. Малыгин А.Г. Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования коллоидов металлического серебра, инициируемого белками. // III Российский симпозиум «Белки и пептиды». 16-21 сентября 2007 г. Московская обл., г. Пущино. ИБХ РАН. Тезисы докладов. С. 53.

9. Пономарева В.Д.. Малыгин А.Г. Химический метод прямого определения низких концентраций диоксида углерода в воздухе. // VIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 23-28 сентября 2007 г. Москва. Тезисы докладов. Т. 4. С. 199.

10. Пономарева В.Д., Малыгин А.Г. Проявление серебром белков, полученных методом электрофореза в полиакриламидных гелях, ингибируется диоксидом углерода воздуха. // X Молодежная конференция по органической химии. 26-30 ноября 2007 г. Уфа. Тезисы докладов. С. 243.

11. Пономарева В.Д.. Малыгин А.Г. Диоксид углерода воздуха как перспективный регулятор реакции образования наночастиц серебра в растворе и в полиакриламидном геле. // XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 11-15 февраля 2008 г. Москва. ИБХ. Тезисы докладов. С. 101.

12. Пономарева В.Д.. Малыгин А.Г. Диоксид углерода воздуха, как перспективный регулятор обеззараживания воды наночастицами серебра. // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 марта 2008 г. Москва. Тезисы докладов. С. 357.

13. Филиппович С.Ю., Пшенникова Е.С., Бачурина Г.П., Пономарева В.Д.. Малыгин А.Г. Чувствительность гриба и бактерии к токсическому действию серебра при различных концентрациях диоксида углерода. // Тезисы в журнале «Иммунопатология, аллергология, инфектология». 2010. №1. С. 231232.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-00864).

Работа отмечена:

Дипломом на XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 11-15 февраля 2008 г. Москва.

Медалью и дипломом на Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 марта 2008 г. Москва.

Подписано в печать: 26.01.11 Формат 60 х 90 х1\б Тираж 100 экз. Объем 1,5 п.л. Заказ 2956

Отпечатано с готовых оригинал-макетов в типографии Издательского Дома МИСиС, 119049, Москва, Ленинский пр-т, 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пономарева, Виктория Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Биологическое действие серебра.

1.1.1. Обеззараживание воды и пищевых продуктов серебром.

1.1.2. Препараты серебра в медицинской практике.

1.1.3 Токсическое воздействие серебра на организм человека.

1.1.4. О механизме антимикробного действия серебра.

1.2. Фотохимические свойства серебра.

1.3. Методы окрашивания серебром в биологических исследованиях.

1.3.1. Окрашивание серебром гистологических препаратов.

1.3.2. Окрашивание серебром белков в ПААГ.

1.4. Кластерная структура серебра.

1.5. Природа химических процессов в ПААГ.

1.6. Влияние СОг воздуха на проявление белков серебром в ПААГ.

1.7. Методы определения низких концентраций СОг в воздухе.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение СОг.

2.2.2. Получение кислорода, очищенного от СОг.

2.2.3. Очистка воздуха от СОг.•.

2.2.4. Электрофорез белков сыворотки крови в ПААГ.

2.2.5. Проявление белковых зон в ПААГ серебром.

2.2.6. Определение концентрации ионов серебра потенциометрическим методом.

2.2.7. Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с этаноламином и З-аминопропанолом-1.

2.2.8. Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с аммиаком.

2.2.9. Спектральные исследования.

2.2.10. Электронная микроскопия.

2.2.11. Приготовление абсолютного этилового спирта.

2.2.12. Синтез карбамата аммония.

2.2.13. Восстановление ионов серебра в растворе из комплекса с серотонином, норадреналином и гистамином.

2.2.14. Импрегнация серебром образцов тканей мозга по методу Гольджи.

2.2.15. Определение влияния СОг на токсичность серебра в отношении культуры клеток Е.соН.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка метода определения низких концентраций СОг в воздухе.

3.2. Ингибирующее действие воздуха при контакте с раствором комплекса [Ад(ЫНз)2]"н на проявление белков в ПААГ серебром.

3.3. Изучение влияния СОг воздуха на восстановление Ад+ в гомогенной системе.

3.3.1. Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов с алифатическими аминоспиртами.

3.3.2. Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплекса [Ад(1МНз)2]+.

3.3.3. Возможный механизм ингибирования диоксидом углерода образования наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и органическими аминами.

3.4. Воздействие СОг воздуха на окрашивание серебром гистологических препаратов.

3.4.1. Влияние СОг воздуха на образование наночастиц серебра из комплексов серебра с серотонином, норадреналином и гистамином.

3.4.2. Влияние СО2 воздуха на окрашивание серебром препаратов мозга крыс.

3.5. Влияние СОг на токсичность серебра в отношении клеток E.coli.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ингибирование диоксидом углерода воздуха образования наночастиц серебра из комплексов с аминами в присутствии белков"

Изучением частиц ультрамалых размеров до недавнего времени занималась коллоидная химия, а их практическим применением - технологии высокодисперсных материалов. Особые свойства высокодисперсных материалов, отличающие их от массивных твердых тел, обусловлены большой величиной отношения поверхности частиц к их объему.

Изучение и практическое применение наночастиц - частиц размером от 1 до 100 нм - в последнее время выделяют в отдельную область, получившую название нанотехнологий, что связано с появлением новых микроскопических методов исследования, позволяющих соотносить наблюдаемые размеры и форму частиц с их уникальными свойствами [Алфимов и др., 2010; Разумовский и Калюжный, 2010]. Получаемая этими методами информация позволяет контролировать процессы образования наночастиц и тем самым открывает широкие возможности для создания принципиально новых конструкционных и функциональных материалов с оптимальными физическими и химическими параметрами. В связи с этим правительством Российской Федерации была разработана концепция развития в области нанотехнологий до 2010 г и принята целевая программа по развитию наноиндустрии до 2015 г [Раткин, 2008; Алфимов и др., 2010].

Важную область в нанотехнологиях занимают исследования наночастиц металлов. Изучение свойств этих частиц принято отсчитывать с работ Майкла Фарадея, описавшего свойства золота и других металлов в коллоидном состоянии [Faraday, 1857]. От конденсированного состояния металлы в виде наночастиц отличаются особенностями строения кристаллической решетки, тепловыми, электрическими и магнитными свойствами. Характерным свойством металлических наночастиц является также их высокая реакционная способность, выражающаяся в повышенной склонности к ионному и атомному обмену, адсорбции на различных поверхностях, взаимодействием с другими адсорбирующимися частицами

Гусев, 2007; Киреев, 2008; Суздалев, 2009]. Специфические свойства нанометаллов открывают широкие возможности для создания новых эффективных катализаторов, сенсорных систем, препаратов с высокой биологической активностью для1применения в медицине, ветеринарии; сельском-хозяйстве и других областях. Примерами могут служить: использование наночастиц кобальта и никеля в радиотехнической и металлургической промышленности [Москвичев и Фельдблюм, 2007], палладия, родия и меди - в химическом катализе [Weixia Tua et al., 2000; Москвичев и Фельдблюм, 2007], золота и серебра - в,медицине и биологических исследованиях [Salata, 2004; «Применение препаратов серебра в медицине», 2004; Щербаков; 2006; Щербаков, 2007; Дыкман и Богатырев, 2007]. Властности, нанозолото успешно применяют в диагностике и лечении злокачественных опухолей, для борьбы с внутриклеточными паразитами и некоторыми грибковыми заболеваниями [CHeung et al., 1999; Mukherjee étal., 2005; Мосин, 2007].

Наносеребро давно используют для дезинфекции растворов, создания-бактерицидных покрытий, антибактериальных и противовирусных препаратов широкого спектра действия; косметических средств нового поколения. Способность серебра избирательно поражать микроорганизмы, оставляя при этом нетронутыми клетки хозяина, заметно выделяет его из остальных тяжелых металлов. Однако в отношении оценки эффективных доз препаратов серебра до сих пор существует большая неопределенность.

В биологических исследованиях широко используют свойство некоторых химических групп органических соединений инициировать образование светопоглощающих наночастиц серебра в растворе. Разработанные первоначально в гистохимии методики окрашивания биологических препаратов серебром нашли в дальнейшем применение для проявления белков в полиакриламидном геле (ПААГ). Преимущество методов серебряного окрашивания состоит в высокой чувствительности, сравнимой с чувствительностью методик, использующих радиоактивную метку. Однако проявление серебром биополимеров в ПААГ и окрашивание тканевых препаратов в гистологии имеет один существенный недостаток -оно не всегда воспроизводимо.

Плохую воспроизводимость окраски серебром пытались преодолеть многие исследователи. Но за более чем сто лет использования методик окраски серебром не удалось выявить причину этой невоспроизводимости. В то же время развитие биологических исследований требует количественных характеристик результатов анализа. Ввиду этого необходимость разработки методов, сочетающих высокую чувствительность и воспроизводимость окрашивания серебром, в биологии сохраняет свою актуальность.

Очевидно, что нестабильность результатов проявления серебром связана с тем, что не выявлены и поэтому не контролируются все существенные параметры, влияющие на процесс образования наночастиц серебра. Обнаруженный в Лаборатории регуляции биосинтеза белка Института биохимии им. А.Н.Баха РАН эффект ингибирования восстановления серебра из его комплексов с аминами [Малыгин и Султанова, 2002] низкими концентрациями диоксида углерода (С02) позволил предположить, что колебания концентрации С02 в воздухе могут быть причиной плохой воспроизводимости известных биологических методик окрашивания серебром, а также отражаться на его бактерицидных свойствах.

Актуальность темы диссертации обусловлена необходимостью исследования эффекта ингибирующего действия С02 на образование наночастиц серебра и выявления тех областей практического использования коллоидного серебра, где этот эффект следует учитывать.

Исходя из этого, целью диссертационной работы было систематическое исследование ингибирующего эффекта низких концентраций СО2 на инициируемое белками образование наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и с различными органическими аминами. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать простой химический метод для точного определения абсолютного содержания СО2 в воздухе.

2. Изучить влияние воздуха, содержащего СО2, на окрашивание белков в ПААГ методом восстановления серебра из комплекса с алифатическими аминоспиртами и аммиаком.

3. Исследовать в гомогенной системе эффект ингибирования низкими концентрациями диоксида углерода образования наночастиц серебра из комплексов ионов серебра с аминами.

4. Исследовать влияние СО2 на окрашивание серебром гистологических препаратов мозга крысы и на образование наночастиц серебра из комплексов с биогенными аминами: норадреналином, серотонином и гистамином.

5. Выяснить влияние СОг на бактерицидные свойства серебра на примере Escherichia coli.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Поскольку настоящая диссертация посвящена систематическому исследованию ингибирующего действия СО2 на образование наночастиц серебра, то в литературном обзоре первоочередное внимание было уделено сбору и обобщению информации о применении серебра там, где этот эффект может иметь практическое значение. В частности, рассмотрено применение соединений серебра в качестве дезинфицирующих и лекарственных средств, а также для окрашивания серебром тканевых препаратов в гистологии и проявления белков в ПААГ. С целью объяснения наблюдаемых при действии С02 эффектов на окрашивание серебром белков и гистологических препаратов разобраны процессы образования и проявления скрытого изображения в фотографическом процессе и приведены имеющиеся в литературе сведения о структуре и механизме образования наночастиц серебра из комплексов с аммиаком и органическими аминами. Рассмотрены результаты ранних исследований по ингибированию восстановления серебра диоксидом углерода и проанализированы существующие способы определения последнего в атмосферном воздухе. В связи с этим обзор литературы имеет следующую структуру.

В первом разделе обзора изложены современные представления о биологическом действии серебра на низшие и высшие организмы, а также о механизмах, лежащих в основе этого действия. Второй раздел содержит сведения о значении белковой основы фотографических эмульсий для образования центров инициации восстановления серебра при проявлении и о механизме диффузионного проявления, который в дальнейшем используется для объяснения результатов, полученных при воздействии СО2 на окраску серебром гистологических препаратов. В третьем разделе рассмотрены существующие методы окрашивания гистологических препаратов и проявления белков серебром в ПААГ. В четвертом и пятом разделах приведены литературные данные о кластерной структуре серебра и разобрана природа химических процессов при проявлении белков в ПААГ с позиций инициации процесса проявления кластерами серебра. В шестом разделе описаны результаты предыдущих исследований обнаруженного феномена ингибирующего влияния СО2 на окрашивание белков серебром в ПААГ. В последнем, седьмом разделе литературного обзора, проведен сравнительный анализ существующих способов определения концентрации С02 в воздухе и сделан вывод о необходимости разработки нового чувствительного метода определения низких концентраций СОг, отвечающего требованиям решения поставленных в диссертации задач.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пономарева, Виктория Дмитриевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработан простой химический-метод определения низких концентраций С02 в воздухе с точностью до 0,002%, а также способ оценки его точности при помощи калибровочных смесей с переменным содержанием С02.

2. Подтверждено, что ингибирование проявления белков в ПААГ серебром происходит только при контакте содержащего С02 воздуха с раствором комплекса ионов серебра с аммиаком на стадии насыщения им гелей и отсутствует при контакте воздуха с растворами на последующих стадиях обработки гелей.

3. Опытами по восстановлению ионов серебра из комплексов с аммиаком и органическими аминами в гомогенной системе доказано, что образование наночастиц серебра ингибируется содержащимся в воздухе С02 в то время как кислород в этом процессе не участвует.

4. Показано, что ингибирование диоксидом углерода восстановления ионов серебра из комплексов^ с аминами^ в гомогенной системе происходит на стадии инициации образования наночастиц серебра.

5. Показано, что С02 воздуха ингибирует восстановление серебра из комплексов с аминами нервной ткани: серотонином, норадреналином, гистамином - а также установлено, что С02 усиливает окрашивание серебром нейронов и ослабляет окрашивание капилляров, в гистологических препаратах мозга крысы.

6. Обнаружен эффект усиления токсических свойств серебра диоксидом углерода в отношении бактерии Escherichia coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пономарева, Виктория Дмитриевна, Москва

1. Акопова Э.Г., Каде А.Х., Курносенкова Е.Ф., Егорова Н.Г., Губарева Е.А. (2007) Серебро — польза и вред. Кубанский научный медицинский вестник, № 1-2, 8-11.

2. Алфимов М.В., Гохберг Л.М., Фурсов К.С. (2010) Нанотехнологии: определения и классификация. Российские нанотехнологии, 5, 8-15.

3. Антонова A.M. (1967) Модификация метода Гольджи с применением вольфрамовокислого натрия. Бюлл. эксперим. Биологии, 63, 123.

4. Арчаков А.И. (2000) «Что за геномикой? Протеомика». Вопросы медицинской химии, 46, 335-343.

5. Бабич Л.В., Балдин С.А. (1991) Практикум по неорганической химии. «Просвещение», М., 321 с.

6. Баранова Е.К., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Ревина A.A., Эль-Регистан Г.И. (2005) Взаимодействие ионов и кластеров серебра в водных и водно-органических растворах с клетками Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae. Наукоемкие технологии, № 5, 33-37.

7. Берберова Н.Т. (1999) Роль неорганических ион-радикалов в органических и неорганических реакциях. Соросовский образовательный журнал, № 1, 28-34.

8. Благитко Е.М., Бурмистров В.А., Колесников А.П., Михайлов Ю.Н., Радионов П.П. (2004) Серебро в медицине. Наука-центр, Новосибирск, 254с.

9. Большая медицинская энциклопедия. (1959) Под. Ред. Бакулева А.Н. М: «Большая советская энциклопедия». Т. 12. С. 241-242, Т. 11. С. 346.

10. Бурмистров;В:А. (2009) Антибактериальные препараты .серебра, полученные с использованием? нанотехнологий. Материалы; Конференции «Оздоровительная медицина, профилактическая и клиническая морфология», Новосибирск, 1-8 июня 2009.

11. Быховская Mi(S.: (1966)- Методы» определения вредных веществ в воздухе.5 «Медицина»; М., 596 с.

12. Валихова* G.C., Вольский Н1Щ, Орловский BiF., Орловский; Е.В!, Полещук: ВШЕ,: Родионов? ПШ, Ярохно В"И> (2002)? Способ» лечения* вич-инфицированных больных. Росс.Патент Л"« 2192870., 20.11.2002.

13. Верников ВМ!,, Емошинскиш ИШ!,. Хотимченко C.Av (2009) Наночастицы. серебра* в. природе; промышленности, упаковочных: материалах, предназначенных для- пищевых продуктов:: характеристика: возможных: рисков».Вопросы питания, 78, 13-20.

14. Винокуров (BtMi (1950) Химические методы серебрешшзеркал. «Оборонгис», Mf,,100-c. •

15. Войнар- A.Hi (1962)'Микроэлементы в', живот природе; «Высш. Школа», М., 94 с. '

16. Воскресенский П.И. (1941) Техника лабораторных работ. «Издательство химическойшитературы», М.-Л., 268 с.

17. Воюцкий С.С. (1964) Курс коллоидной химии. «Химия», М., 574.

18. Гансбургский А.Н. (2004) Пятый международный научный симпозиум "Применение современных методов! анализа в изучении структуры и функции клетки". Морфология, 125,. 89-91.

19. Еанстон Ф.Д. (1963) Методы гидроксилирования. Успехи органической химии, под ред. Кнунянца, Т. 1, «Издательство иностранной литературы», М., С. 114-162.

20. Голубович В.Н., Работнова И.Л. (1974) Кинетика подавления роста Candida udlus ионами серебра .Микробиология, 43, 1115-1117.

21. Губин A.C. (1987) Химия кластеров. Основы классификации и строение. М., 263 с.

22. Гусев А. И. (2007) Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. «ФИЗМАТЛИТ», М., 416 с.

23. Денисов В.В., Гутенев В.В., Денисова И.А. (2002) Способ консервирования молока. Росс.Патент № 2193326., 27.11.2002.

24. Дмитриева М.Б., Чмутин И.А., Яровая М.С., Линник М.А. (2009) Определение фунгицидной активности препаратов на основе наночастиц серебра. Нанотехника, № 4, 45.

25. Дриго Ю.А., Выходцев В.В., Осипко О.Г., Рощупкина Н.В., Демешкина A.B. (2001) Способ консервирования питьевой воды. Росс.Патент № 2166885., 20.05.2001.

26. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. (2007) Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии. Успехи химиии, 76, 199-213.

27. Ершов Б.Г. (1981) Ионы металлов в необычных и неустойчивых состояниях окисления и стадийность электрохимических реакций. Успехи химии, 50, 2137-2166.

28. Ершов Б.Г. (1997) Ионы металлов в необычных и неустойчивых состояниях окисления в водных растворах: получение и свойства. Успехи химии, 66, 103-116.

29. Ершов Б.Г. (1999) Короткоживущие малые кластеры металлов в водных растворах: получение, идентификация и свойства. Изв.А.Н.Росии. Серия1. Химическая, № 1, 1-15.

30. Ершов Б.Г. (2001) Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические, и каталитические свойства. Журн. Рус. хим. о-ва, № 3, 20-30.

31. Ершов Б.Г. (2002) Атомы, ионы в необычных состояних окисления и малые кластеры металлов в водных растворах. Жур. Неорг. Хим., 47, 644-653.

32. Ершов Б.Г., Абхалимов Е.В. (2006) Механизм нуклеации серебра при радиационно-химическом восстановлении его ионов в водных растворах, содержащих полифосфат. Коллоидный журнал, 64, 459.

33. Ершов Б.Г., Абхалимов E.B. (2007) Нуклеация серебра при восстановлении водородом; в водных растворах,- содержащих полифосфат: образование кластеров^наночастиц.Коллоидныйжурнал, 69, 620-625.

34. ЕршовШ;Г.,, Абхалимов; Е.В:,, €^ов Н.Л1,(2005) Образование:долгоживущих кластеров? и нуклеация серебра^ при У-облучении водных растворов AgClO.}, содержащих полифосфат. А'гшг/я высоких энергий, 39, 55-59.

35. Ершов БТ., Ионова Т.В., Киселева A.A. (1995) Кластеры серебра: расчеты; оптических переходов,\образование и свойства "магических" положительно: заряженных кластеров. Журн. фаз. хим., 691260.

36. Ершов Сухов5Н;Л^(1996)«Лйнейные кластеры серебра в водном растворе: (кластериты): радиационно-химический/синтез; и:их свойства; Изв.А.Н.Росии. Серия Хил ! и ческая, Л^'6, 1429-1435.

37. Жидкостная;колончатая хроматография1.(1978) Г1од.ред. Дейла'3v, Мацека^К., ЯнакаЯ. «Мир», M., Т. 1, 554 с.

38. Исавцев^ KLEB,-. Лущик: В1А., Сажнев^ Н.К., (2001;)? Консервант для? пищевых! продуктовФосс.Жатент:№ 2164072:,,20i03i2001t

39. Карандеев К.Б. ( 1974) Методы электрических измерений: «Химия», М., 152 с:

40. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. (1974) Чистые химические вещества. «Химия», М., 408 с.

41. Киреев В. (2008) Нанотехнолопш: История возникновения? и развития; Наноиндустрия; 2, 2-10.

42. Кирюхин М.В., Сергеев Б.М., Прусов А.Н., Сергеев: В.Г. (2000) Фотохимическое восстановление катионов серебра. Высокомолек. Соед., 42\ 1069-1073;

43. Климова Е.В. (2010) Проблемы; оценки бёзопасности наноматериалов, применяемых в упаковке, пищевых; продуктов; Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал, №1,17.

44. Коликов В.А., Курочкин В.Е., Паина Л.К., Рутберг А.Ф., Рутберг Ф.Г., Снетов В.Н., Стогов А;Ю. (2007)Пролонгированная микробная,устойчивость-воды, обработанной импульсными электрическими разрядами. Журнал технической физики, 77, 118-125.

45. Коллоидное серебро. Физико-химические свойства. Применение в медицине (1992) Отв.ред. Богданчикова Н.Е. Институт катализа им.ГК.Борескова, Новосибирск, 80 с.

46. Крисс Е.Е., Яцимирский К.Б. (1966) Взаимодействие нуклеиновых кислот с металлами. Успехи химии, 35, 349-365.

47. Крутяков Ю.А., Кудринский A.A., Оленин А.Ю., Лисичкин Г.В. (2008) Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы. Успехи химии, 77, 242-269.

48. Кульский Л.А. (1987) Серебряная вода. «Наукова Думка», Киев., 134 с.

49. Лилли Р. (1969) Патогистологическая техника и практическая гистохимия. «Мир», М., 645 с.

50. Линьков П. А., Егорова Е.М. (2010) Ткани, модифицированные наночастицами серебра. Нанотехнологии в текстильной и легкой промышленности от разработки до внедрения, Москва, 11 марта 2010, 5152.

51. Луппа X. (1980) Основы гистохимии. «Мир», М., 343 с.

52. Малыгин А.Г. (1993) Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле: состояние, перспективы, технология. Успехи биол. Химии, 33, 173-213.

53. Малыгин А.Г. (1998) Воздействие света на образование окрашенных коллоидов серебра в растворах белков. Биохимия, 63, 627-630.

54. Малыгин А.Г., Дорохина Н.И., Ганцерова И.Н. (1992) Механизм проявления белков серебром в полиакриламидном геле. Биохимия, 57, 518-520.

55. Малыгин А.Г., Султанова Д.О. (2002) Углекислый газ воздуха подавляет проявление белков серебром в полиакриламидном геле. Доклады Академии Наук, 386, 1-3.

56. Машковский М.Д. (1977) Лекарственные средства. М., 353 с. Мелентьева Г.А. (1968) Фармацевтическая химия. «Медицина», М., 769 с. Менделеев Д.И. (1895) Основы химии. СПб, 353 с.

57. Метелева Ю.В. (2002) Пленки CdXZnl-XS: получение, свойства и реакции заряженных частиц. Дисс. канд. хим. наук, ИПХФ РАН, Черноголовка.

58. Минх В.А. (1961) Методы гигиенических исследований. М., 484 с.

59. Митчел Э. (1988) Фотография. «Мир», М., 420 с.

60. Михайлов Г.М., Лебедева М.Ф. (2007) Способы получения волокон на основе хитина. Журн. прикладной химии, 80, 705-715.

61. Мороз О.Г., Кульский Л.А., Проскурякова Н.Б., Руденко A.B., Флоренсова K.M. (1980) Химия и технология воды. Выпуск 2. №3.

62. Мосин О.В. (2007) Способ введения золота в биологическую ткань. «Нанотехнологии и наноматериалы в медицине», Новосибирск, 11-12 ноября 2007.

63. Москвичев Ю.А., Фельдблюм В.Ш. (2007) Химия в нашей жизни. ЯГТУ, 411 с.

64. Нанотехнологический словарь РОСНАНО. (2009)

65. Официальный сайт ГК «Российская Корпорация нанотехнологий», (http://thesaurus.rusnano.com/wiki).

66. Неблит К.Б. (1958) Фотография. «Искусство», М., 675 с.

67. Некрасов Б.В. (1967) Основы общей химии. «Химия», М., 399 с.

68. Несмеянов А.Н., Несмеянов H.A. (1969) Начала органической химии. «Химия», М,, Т. 1,666 с.

69. Новиков Г.Ф. (2001) Первичные элементарные акты галогенсеребряного фотографического процесса. Количественные характеристики. Труды конференции "Научные исследования в наукоградах Московской области", Черноголовка, 1-4 октября 2001, 18.

70. Обухов A.B. (1994) Перспективы применения препаратов серебра для лечения ВИЧ-инфекции. Применение препаратов серебра в медицине. Институт клинич. иммунологии РАМН. Сиб. отд. РАН. Новосибирск, 6-12.

71. Оганесов В.Е.; Драгомиров В.Н.; Серпокрылов Н.С. (2002) Дезинфицирующий водный раствор. Росс.Патент № 2179155., 10.02.2002.

72. Орловский Е.В., Радионов П.П. (2003) Антивирусная композиция для лечения ВИЧ-инфицированных больных с высокой вирусной нагрузкой. Росс.Патент № 2209072., 27.07.2003.

73. Остерман JI.A. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. «Наука», М., 288 с.

74. Першин Г.Н. (1952) Влияние химеотерапевтических веществ на бактериальные ферменты. «Медгиз», М., 228 с.

75. Петров Ю.И. (1986) Кластеры и малые частицы. М., 366 с.

76. Пирс Э. (1962) Гистохимия. «Издательство иностранной литературы», М., 964 с.

77. Применение препаратов серебра в медицине. (2004) Сборник трудов по материалам научно практической конференции «Новые химические системы и процессы в медицине». Под.ред. Благидко Е.М. Новосибирск, 116 с.

78. Рабинович Е. (1951) Фотосинтез. «Иностранная литература», М., 536 с.

79. Радычев H.A. (2006) Исследование процессов генерации и гибели заряженных частиц в поликристаллических галогенидах и халькогенидах Ag, Cd, Zn методами СВЧ-фотопроводимости и диэлектрической спектометрии. Дисс. канд. хим. наук. ИПХФ РАН, Черноголовка.

80. Разумовский A.C., Калюжный С.В. (2010) Что такое «нанотехнологии»? Российские нанотехнологгш, 5, 14-16.

81. Раткин JI. (2008) Нанотехнологии: История возникновения и развития. Наноиндустрш, № 2, 26-30.

82. Рамайя JI.K., Орджоникидзе К.Г., Егорова Е.М. Рубанович A.B. (2009) Генотоксические эффекты наночастиц серебра при воздействии на млекопитающих in vivo. A eta Naturae, №3, 109-112.

83. Ревина A.A., Баранова Е.К., Мулюкин A.JI., Сорокин В.В. (2005) Некоторые особенности воздействия кластерного серебра на дрожжевые клетки Candida-utilis. Эл.науч.жур. «Исследовано в России», 3, 10-14.

84. Рейтлингер С.А. (1974) Проницаемость полимерных материалов. «Химия», М., 269 с.

85. Ромейс Б. (1953) Микроскопическая техника. «Издательство иностранной литературы», М., 718 с.

86. Руководство по контролю качества питьевой воды» (1994) Изд. «Медицина» по поручению Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности РФ, Т. 1, 200 с.

87. Рыжонков Д.И., Левина В.В., Дзидзигури Э.Л. (2008) Наноматериалы. Серия: Нанотехнологии. «БИНОМ. Лаборатория знаний», М., 365 с.

88. Серов A.B., Шипулин В.И., Шевченко И.М. (2010) Антимикобный препарат на основе наносеребра для защиты колбас. Мясная индустрия, № 2, 29-32.

89. Справочник химика. (1967) Под.ред. Никольского Б.П. «Химия», М.-Л., Т. 4, 920 с.

90. Суздалев И.П. (2009) Нанотехнология: Физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. Синергетика: от прошлого к будущему. «ЛИБРОКОМ», М., 592 с.

91. Суздалев И.П., Суздалев П.И. (2001) Нанокластеры и нанокластерные системы. Организация, взаимодействие, свойства*. Успехи химии, 70, 203-240.

92. Сумм Б.Д., Иванова Н.И. (2000) Объекты и методы коллоидной химии в нанохимии. Успехи химии, 69, 995-1007.

93. Технический паспорт генератора коллоидных ионов серебра «Георгий». РКЖИ.066619.003 ПС.

94. Толгская М.С., Чумаков A.A. (1984) Аргироз. Большая медицинская энциклопедия. Под ред. Петровского Б.В. 3-е изд. «Советская энциклопедия», М.,Т. 2, 142-143.

95. Третьяков В.В., Третьякова О.В., Жевачевский Н.Г. (2002) Способ лечения вич-инфекций. Росс.Патент № 2195277., 27.12.2002.

96. Трофимов A.B., Князькин И.В., Кветной И.М. (2005)' Нейроэндокринные клетки желудочно-кишечного тракта в моделях преждевременного старения. Науч.серия «Молекулярная нейроиммуноэндокринология». Санкт-Петербург. 205 с.

97. Уэйли У. (1978) Аппарат Гольджи. «Мир», М., 248 с.

98. Фролов Ю. (2008) Археология фотографии. Наука и жизнь, № 1,108-109.

99. Хлебцов Б.Н., Ханадеев В.А., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Н.Г. (2008) Использование золотых нанооболочек в твердофазном имуноанализе. Российские нанотехнологии, 3, 50-63.

100. Хлебцов Б.Н., Ханадеев В.А., Максимова И.Л., Терентюк Г.С., Хлебцов Н.Г. (2010) Серебряные нанокубики и золотые наноклетки: синтез, оптические и фототермические свойства. Российские нанотехнологии, 5, 54-62.

101. Цыпленков П.В., Морозов В.И., Рогозкин В.А. (1987) Флуороиммунный анализ белка. Биорганическая химия, 13, 1605-1618.

102. Чарт Т. (1981) Радиоиммунологические методы. «Мир», М., 246 с.

103. Широкова JI.H., Александрова В.А., Егорова Е.М., Вихорева Г.А. (2009) Макромолекулярные системы и бактерицидные пленки на основе производного хитина и наночастиц серебра. Прикладная биохимия и микробиология, 45, 422-426.

104. Щербаков А.Б. (2006) Препараты серебра: вчера, сегодня и завтра. Фармацевтический журнал, Киев, №5, 45-57.

105. Щербаков А.Б. (2007) Препараты золота: вчера, сегодня и завтра. «МАУП», Киев, 63 с.

106. Яцимирский К.Б., Крисс Е.Е. (1966) Молекулярные основы жизненных процессов. Киев, 47 с.

107. Arakawa Н., Neault J.F., Tajmir-Riahi Н.А. (2001) Complexes with DNA and RNA Stadied by Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Capillary Electrophoresis. Biophys J., 81, 1580-1587.

108. Assembly of Life Sciences (1980) Safe Drinking Water Committee. Drinking Water and Health. National Academy Press., Washington. D.C., V. 2.

109. Beveridge T.J., Hughes M.N., Lee H. H., Leung K.T., Poole R.K., Savvaidis I., Silver S. & Trevors J.T. (1997) Metal-microbe interactions: contemporary approaches. Adv. Microbial. Physiology, 38, 111- 243.

110. Brauni I., Rrushe F., Kurth C. (1957) Die Trinkwassersilberung R. Oldenbour. Munchen.

111. Carr, Howard S., Wlodkowski, Theodore J., Rosenkranz, Herbert S. (1973) Silver sulfadiazine: in vitro antibacterial activity. Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 4, 585-587.

112. Charles L., Fox Jr., Shanta M. Modak (1974) Mechanism of silver sulfadiazin action on burn wound infections. Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 5, 582588.

113. Chevallet M., Luche S., Rabilloud T. (2006) Silver staining of proteins in polyacrylmide gels. Nat. Protoc., 1, 1852-1858.

114. Choi O., Deng K.K., Kim N.-J., L. Ross Jr., Surampalli R.Y., Hu Z. (2008) The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth. Water Research., 42, 3066-3074.

115. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.H. (1941) Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med., 47, 200-202.

116. Crede B. (1897) Silber als aussers und inners Antisepticum. Arch. Klin, chir., Bd. 55, Heft 4.

117. Daniel W.E.Green (1997) Instruction on supervision of comets.

118. Darrell RW, Moda k SM, Fox CL Jr (1984) Norfloxacin and silver norfloxacin in the treatment of Pseudomonas corneal ulcer in the rabbit. Trans. Am. Ophthalmol. Soc., 82, 75-91.

119. Davis I.J., Richards H., Mullany P. (2005) Isolation of silver and antibiotic-resistant Enterobacter cloacae from teeth. Oral. Microbiol. Immunol., 20, 191-194.

120. Debs-Louka E., Louka N., Abraham G., Chabot V., and Allaff K. (1999) Effect of Compressed Carbon Dioxide on Microbial Cell Viability. Appl. Environ. Microbiol., 65, 626-631.

121. Dibrov P., Dzioba J., Gosink K.K., Hase C.C. (2002) Chemiosmotic mechanism of antimicrobial activity of Ag+ in Vibrio cholerae. American Society for Microbiology, 46, 2668-2670.

122. Dictionary of Nanotechnology, Colloid and Interface Science. (2008) John Wiley and Sons Ltd., 308 p.

123. Dunn M.J., Crisp S.J. (1994) Detection of proteins in polyacrylamide gels using an ultrasensitive silver staining technique. Method in Molecular Biology, 32, 113-118.

124. Ershov B.G. Janata E., Henglein A., Fojtic A. (1993) Silver atoms and clusters in aqueous solution: absorption spectra and the particle growth in the absence of stabilizing Ag+ ions. J. Phys. Chem., 97, 4589-4594.

125. Ershov B.G., Henglein A. (1998) Reduction of Ag+ on polyacrylate chains in aqueous solution. J. Phys. Chem., 102, 10663-10666.

126. Ershov B.G., Henglein A. (1998) Time-resolved investigation of early processes in the reduction of Ag+ on polyaciylate in aqueous solution. J. Phys. Chem., 102, 10667-10671.

127. Ershov B.G., Janata E., Henglein A. (1993) Growth of silver particles in aqueous solution: long-lived «Magic» clusters and ionic strength effects. J. Phys. Chem., 97, 339-343.

128. Faraday M.E. (1857) Experimental relations of gold (and others metals) to light. Philos. Trans. Roy. Soc. London., 147, 145-181.

129. Fox CL.Jr. (1983) Topical therapy and the development of silver sulfadiazine. Surg. Gynecol. Obstet., 157, 82-88.

130. Fox Jr. (1973) Silver Sulfadiazin used in the treatment of burns. US Patent: 3,761,590. Sept 25-, 1973.

131. Gorg A. (2000) Advances in 2D gel techniques. Proteomics: A Trends Guide, Jule, 3-6.

132. Gottlieb M.S., Carr J.K., Morris D.T. (1981) Cancer and drinking water in Lousiana: colon and rectum. Internatl. J. Epidemiol., 10, 117-125.

133. Graham-Otto. (1868) Ammonium carbamate und carbamins. Ammonium. Lehrbuch d. Chemie. Abth., 446, 687.

134. Granier Fabienne, Dominique de Vienne. (1986) Silver staining of proteins: standardized procedure for two-dimensional gels bound to polyester sheets. Anal. Biochem., 155, 45-50.

135. Greulich C., Kittler S., Epple M., Koller M. (2009) Studies on biocompatibility and interaction of silver nanoparticles on human mesenchymal stem cells (hMSCs). Chirurgisches Forum und DGAV Forum. Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie, 38, 11-13.

136. Gupta A., Matsui K., Lo J.F., Silver S. (1999) Molecular basis for resistance to silver cations in Salmonella. Nat. Med., 5, 183-188.

137. Hall N.P., Cornelius M.J., Keys A.J. (1983) The enzymatic determination of bicarbonate and CO, in reagents and buffer solutions. Anal.Biochem., 132, 152157.

138. Henglein A. (1989) Non-metallic silver clusters in aqueous solution: stabilization and chemical reactions. Chem. Phys. Lett., 154, 473-476.

139. Henglein A. (1998) Spectrophotometric observations of the adsorption of organosulfur compounds on colloidal silver nanoparticles. J. Phys. Chem., 102, 8364-8366.

140. Henglein A. (1991) Chemistry of Agn aggregates in aqueous solution: non-metallic oligomeric clusters and metallic particles. Faraday Discuss., 92, 31-44.

141. Hoffmann S. (1984) Silver sulfadiazine: an antibacterial agent for topical use in burns. A review of the literature. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg., 18, 119-126.

142. Hollinger M.A. (1996) Toxicological aspects of topical silver pharmaceuticals. Crit.Rev. Toxicol, 26, 255-260.

143. Humberto H. Lara, Nilda V. Ayala-Nunez, Liliana Ixtepan-Turrent, Cristina Rodriguez-Padilla (2010) Mode of antiviral action of silver nanoparticles against HTV-1 J. Nanobiotechnology, 8, 1-10.

144. Hui Yahg, Chao Liu, Danfeng Yang, Yuashan Zhang, Zhuge Xi (2009) Comparative study of cytotoxicity, oxidative stress and genotoxicity induced by four typical nanomaterials: the role of particle size, shape and composition. J. Appl. Toxicol., 29, 69-78.

145. Janata E., Henglein A., Ershov B.G. (1994) First clusters of Ag+ ion reduction in aqueous solution. J. Phys. Chem., 98, 10888-10890.

146. Joncich, M.j., Soika, B.H., Bower, J.E. (1967). J. Chem. Ed., 44, 598.

147. Kareen I. Batarseh (2004) Anomaly and correlation of killing in the therapeutic properties of silver (I) chelation with glutamic and tartaric acids. J. of Antimicrobial. Chemotherapy., 54, 546-548.

148. Kim K.J., Sung W.S., Moon S.K., Choi J.S., Kim J.G., Lee D.G. (2008) Antifungal effect of silver nanoparticles on dermatophytes. J. Microbiol. Biotechnol., 18, 14821484.

149. Kim K.J., Sung W.S., Suh B.K., Moon S.K., Choi J.S., Kim J.G., Lee D.G. (2009) Antifungal activity and mode of action of silver nano-particles on Candida albicans. Biometals., 22, 235-242.

150. KODAK Publication. Telecine Analysis Film Users Guide. No. H-822.

151. Ma Hongbao, Hong Deng-Nan, Cherng Shen (2007) Colloidal Silver. J Americ Scien., 3, 74-77.

152. McCall Richard C., Hootman Harry E. (1978) Heavy Metal Shielding For Neutron Sources. Health Phys., 35, 570-571.

153. Merril C.R., Goldman D.,Margaret L.Yan Keuren (1983) Silver staining method for polyacrylamide gel electrophoresis. Methods Enzymol., 96, 230-239.

154. Merril C.R., Goldman D., Van Keuren M. (1982) Simplified silver protein detection and image enhancement methods in polyacrylamide gels. Electrophoresis, 3, 17-23.

155. Merril C.R. (1988) Protein detection by silver staining: Mechanisms and applications. Electrophoresis, 9, 632.

156. Merril C.R., Bisher M.E., Harrington M., Steven A.S. (1998) Coloration of silver-stained protein bands in polyacrylamide gels is caused by light scattering from silver grains of characteristic sizes. Biophys., 85, 453-457.

157. Merril C.R., Dunau M.L., Goldman D. (1981) A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem., 110, 201-207.

158. Merril C.R., Switzer R.C., Van Keuren M.L. (1979) Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 76, 4335-4339.

159. Morrissey J.H. (1981) Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitivy. Anal. Biochem., 117, 307-310.

160. Mostafavi M., Delcourt M.O., Picq G. (1993) Study of the interaction between polyacrylate and silver oligomer clusters. J. Phys. Chem., 41, 453-459.

161. Moulvany P., Henglein A. (1990) Formation of unstabilized oligomeric silver clusters during the reduction of Ag+ ions in aqueous solution. J. Phys. Chem., 168, 391-394.

162. Mukherjee P., Bhattacharya R., Wang P., Wang L, Basu S., Nagy J.A., Atala A., Mukhopadhyay D., Soker S. (2005) Antiangiogenic properties of gold nanoparticles. Clin. Cancer. Res., 11, 3530-3524.

163. Muzzarelli R.A.A. (1986) Chitin in Nature and Technology. New York: Plenum Press. 583 p.

164. Oakley B., Kirsh D.R., Morris D. (1980) Simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in acrylamide gels. Anal. Biochem., 105, 361-363.

165. Ochs D.C., McConkey E.H., Sammons D.W. (1981) Silver stains for proteins in Polyacrylamide gels: a comparison of six methods. Electrophoresis, 2, 304-307.

166. Perelshtein H., Applerot G., Perkas N., Guibert G., Mikhailov S., Gedanken A. (2008) Sonochemical coating of silver nanoparticles on textile fabrics (nylon, polyester and cotton) and their antibacterial activity. Nanotechnology, 19, 1-6.

167. Recklinghausen F. (1862) Die Lymphgefasse und ihre Beziehung zum Bindegewebe. Berlin.

168. Reda M. El-Shishtawy, Abdullah M. Asiri, Nayera A. M. Abdelwahed and Maha M. Al-Otaibi. (2011) In situ production of silver nanoparticle on cotton fabric and its antimicrobial evaluation. Cellulose, 18, 75-82.

169. Saber Hussain, Rolf M. Anner, Beatrice M. Anner. (1992) Cysteine protects Na,K-ATPase and isolated human lymphocytes from silver toxicity. Biochemical and biophysical research communications, 189, 1444-1449.

170. Salata ON. (2004) Applications of nanoparticles in biology and medicine. Journal ofNanobiotechology, 2, 1-6.

171. Sammons D.W., Adams L.D., Nishizawa E.E. (1981) Ultrasensitive silver-based color staining of polypeptides in polyacrylamide gels. Electrophoresis, 2, 135-141.

172. Senjen R (2007) Nanosilver a threat to soil, water and human health. Friends of the Earth Australia. March. (Available at: http://nano.foe.org.au/node/190).

173. Senjen R (2009) Nano and biocidal silver: extreme germ killers present a growing threat to public health. Friends of the Earth Australia. March. (Available at: http://nano.foe. org. au/node/332).

174. Shrivastava S., Bera T., Roy A., Singh G., Ramachandrarao P., Dash D. (2007) Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles. Nanotechnology, 18, 1-9.

175. Siegel H. (1986) Metal ions in biological systems. Concepts on metal ion toxicity. N. Ed. SigelH. N.Y.: MarcelDekker, 20, 30-42.

176. Silver S. (2003) Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver compounds. FEMS Microbiol. Rev., 27, 341-353.

177. Silver S., Gupta A., Kazuaki Matsui, and Jeng-Fan Lo (1999) Resistance to Ag(I) Cations in Bacteria: Environments, Genes and-Proteins. Met Based Drugs, 6, 315— 320.

178. Silver S., Jeng-Fan Lo, Gupta A. (1999) Silver cations as an antimicrobial agent: clinical uses and bacterial resistance. APUA Newsletter, 17, 1-3.

179. Silver S., Le T.Phung, Silver G. (2006) Silver as biocides in burn and wound dressings and bacterial resistance to silver compounds. J.Ind. Microbiol Biotechnol., 33, 627-634.

180. Silvestry-Rodriguez N., Sicairos-Ruelas E., Gerba C.P., Bright K.R. (2007) Silver as a Disinfectant. Rev. Environ. Contain. Toxicol., 191, 23-45.

181. Sondi I., Salopek-Sondi B. (2004) Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E.coli as a model for gram-negative bacteria. J. Colloid and Interface Science, 275, 177-182.

182. Spratt D.A., Pratten J., Wilson M., Gulabivala K. (2001) An in vitro evaluation of the antimicrobial efficacy of irrigants on biofilms of root canal isolates. Int. Endod. J., 34, 300-307.

183. Starodub M.E., Trevors J.T. (1990) Mobilization of Escherichia coli R1 silver-resistance plasmid pJTl by Tn5-Mob into Escherichia coli C600. Biol. Metals3, 24-27.

184. Sukdep Pal, Yu Kyung Tak, Joon Myong Song (2007) Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticles? A stady of the gram-negative bacterium Escherichia coli. Amer.Soc.Microbiol., Mart, 17121720.

185. Switzer, R.C., Merril, C. and Shifrin, S. (1979) A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Analyt. Biochem., 98, 231237.

186. Tonley K., Wilson H. (1955) Desinfection principles of bacteriology and immunity. J. Bacteriol., 155, 119-162.

187. Trevors J.T. (1987) Silver resistance and accumulation in bacteria. Enzyme Microb. Technol., 9, 331-333.

188. Van Hasselt, Gashe B.A., Ahmad J. (2004) Colloidal silver as an antimicrobial agent: fact or fiction? J. Wound Care, 13, 154-155.

189. Weixia Tua, Hanfan Liua, Kong Yong Liewb (2000) Preparation and Catalytic Properties of Amphiphilic Copolymer-Stabilized Platinum Metals Colloids. J. Colloid and Interface Sci., 229, 453-461.

190. Woo Kyung Jung, Hye Cheong Koo, Ki Woo Kim, Sook Shin, So Hyun Kim, Yong Ho Park. (2008) Antibacterial Activity and Mechanism of Action of the Silver Ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Appl Environ. Microbiol., 74, 2171-2178.

191. Wood R.A., Keen A.B., Mitchell J.F.B., Gregory J.M. (1999) Changing spatial structure of the thermohaline circulation in response to atmospheric C02 forcing in climate model. Nature, 399, 572-575.

192. Woods E.J., Cochrane C.A., Percival S.L. (2009) Prevalence of silver resistance genes in bacteria isolated from human and horse wounds. Vet Microbiol, 138, 325329.

193. Wray W., Boulikas T., Virginia P., Hancoock R. (1981) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Analyt. Biochem., 118, 197-203.

194. Wright J.B., Lam K., Hansen D., Burrell R.E. (1999). Efficacy of topical silver against fungal bum wound pathogens. J.Infect.Control., 27, 344-450.

195. Wuhrmann K. (1958) Uber den Mechanismus der Abwasserreinigung mit Belebtschlamm und den Einfluss einiger Betriebsparameter auf die Leistung von Belebtschlammanlagen. Abstract Habschr. ETH. Zurich.

196. Xian-Zhi Li, Nikaido H., Williams K.E. (1997) Silver-resistant mutants of Escherichia coli display active efflux of Ag+ and are deficient in porins. J.Bacteriol., 179, 6127-6132.

197. Xian-Zhi Li, Hiroshi Nikaido (2004) Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drags, 64, 159-204.

198. Yong Ho Park (2008) Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 74, 2171-2178.

199. Yong-Ki Jo (2009) Antifungal activity of silver ions and nanoparticles on phytopathogenic fungi. Plant.Dis., 93, 1037-1043.

200. Zhang Q, Li W., Moran C., Zeng J., Chen J., Wen L-P., Xia Y. (2010) Seed-Mediated Synthesis of Ag Nanocubes with Controllable Edge Lengths in the Range of 30-200 nm and Comparison of Their Optical Properties. J.Am.Chem.Soc., 132, 11372-11378.

201. Zhang S. and Crow S.A. Jr. (2001) Toxic Effects of Ag(I) and Hg(II) on Candida albicans and C. maltosa: a Flow Cytometric Evaluation. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 67,403 0-403 5.

202. Zimmermann W., Zobrist F. (1958) Bactericidal effect of silver in water. Schrift. Hydrol., 20, 218-254.

203. Zoeteman B.C., Hrubec J., de Greef E., Kool H.J. (1982) Mutagenic activity associated with by-products of drinking water disinfection by chlorine, chlorine dioxide, ozone and UV-irradiation. Environ. Health. Perspect., 46, 197-205.1. БЛАГОДАРНОСТИ

204. Автор выражает благодарность:

205. Автор выражает глубокую признательность Александру Александровичу Шувалову.

206. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-00864).1. Работа отмечена:

207. Медалью и дипломом на Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 марта 2008 г. Москва.

208. Дипломом на XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 11-15 февраля 2008 г. Москва.