Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибактериальное и иммуномодулирующее действие наночастиц серебра, углеродных нанотрубок на модели здоровых и инфицированных Mycobacterium tuberculosis мышей

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антибактериальное и иммуномодулирующее действие наночастиц серебра, углеродных нанотрубок на модели здоровых и инфицированных Mycobacterium tuberculosis мышей"

На правах рукописи

Калмантаева Ольга Валериевна

Антибактериальное н пммуномодулирующее действие наночастиц

серебра, углеродных нанотрубок на модели здоровых ii инфицированных

Mycobacterium tuberculosis мышей

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени ^ . 0|/у

кандидата биологических наук

005563516

0боленск-2015

005563516

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Фирстова Виктория Валерьевна Научный консультант:

Доктор биологических наук Потапов Василий Дмитриевич Официальные оппоненты:

Афанасьев Станислав Степанович - заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение пауки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Рос-потребнадзора, заместитель директора по биотехнологии

Черноусова Лариса Николаевна - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» РАМН, заведующая отделом микробиологии

Ведущая организация:

Государственное казенное учреждение здравоохранения "Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы"

Защита диссертации состоится «27» ноября 2015 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская область, Серпуховские район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологию) (ФБУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ Автореферат разослан « октября 2015 г.

Ученый секретарь диссертацион

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Туберкулез (ТБ) - является одной из социально значимых инфекций в мире. Несмотря на все проводимые мероприятия по борьбе с ТБ, уровень заболеваемости и смертности отданной инфекции остается высоким. По последним оценкам в 2013 году было установлено 9,0 миллионов новых случаев заболевания туберкулезом и 1,5 миллиона случаев смерти от ТБ в мире. Заболеваемость ТБ в России в 2013 году составляла 89 случаев на 100 тысяч человек, смертность - 12 случаев на 100 тысяч россиян (WHO, 2014). При этом стабильно высоким остается количество пациентов с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя туберкулеза: 37,5% среди больных ТБ органов дыхания (ФЦГиЭ Роспотребнадзора, 2013). Для лечения туберкулеза применяют пять основных противотуберкулезных препаратов: изониазид, ри-фампицин, пиразинамид, этамбутол и стрептомицин. Основными недостатками данной терапии являются: резистентность Mycobacterium tuberculosis к антибиотикам и побочные действия применяемых препаратов из-за длительности приема и отсутствия адресной доставки в пораженные органы. В случаях лекарственно устойчивого туберкулеза используют резервные противотуберкулезные препараты, комбинирование которых и длительность приема до сих пор носят в основном эмпирический характер. Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является поиск альтернативных способов лечения ТБ.

Сегодня в этой области разрабатываются несколько направлений, включающих использование моноклональных антител, бактериофагов, бактериальных вакцин и иммуномодуляторов. Одним из современных направлений борьбы с ТБ является использование нанотехнологических подходов. Нанотехнологии позволяют преодолевать сложности в терапии туберкулеза: доставлять антимикробное вещество непосредственно внутрь пораженных клеток, используя в качестве носителей наночасти-цы, и применять бактерицидный потенциал некоторых металлов в наноформе, к которым нет резистентности у патогенов (Andrade, 2013). Перспективными с этой точки зрения являются наночастицы серебра (НЧС) и углеродные нанотрубки (УНТ). Нано-частицы серебра характеризуются бактерицидностыо против широкого спектра гра-мотрицательных и грамположительных микроорганизмов (Sarsar, 2014; Wijnhoven, 2009), включая антибиотикорезистентные штаммы (Rai, 2012). Кроме того, наноча-

стицы серебра увеличивают антибактериальную активность различных антибиотиков (Shahverdi, 2007). Углеродные нанотрубки широко применяются для адресной доставки лекарств в пораженные органы (Madani, 2011). Имеются данные о бактерицидной активности углеродных нанотрубок (Dong, 2012; Tegos, 2012; Yang, 2010; Arias, 2009). Однако применение наночастиц в медицине подразумевает проведение предварительной тщательной оценки их безопасности и эффективности.

Степень разработанности темы исследования

В научной литературе существует большое количество работ, посвященных токсикологической оценке наночастиц серебра и углеродных нанотрубок и свидетельствующих о том, что токсичность данных наночастиц зависит от многих факторов, таких как размер, поверхностное покрытие, доза, способ и многократность введения (Maynard, 2011; Wijnhoven, 2009; Oberdorster, 2005). Однако на данный момент в литературе практически отсутствуют систематизированные данные о воздействии наночастиц на иммунную систему. Также редко проводятся комплексные исследования воздействия наночастиц на такие внутриклеточные бактерии как М. tuberculosis. Так, в научной литературе работы, посвященные изучению антимикобактериальной эффективности наночастиц серебра, немногочисленны и в основном показывают инги-бирующую рост М. tuberculosis активность данных наночастиц в экспериментах in vitro (Praba, 2013; Seth, 2011; Song, 2006). Исследований антимикобактериального действия наночастиц на животных моделях хронического ТБ с одновременной оценкой изменения иммунных показателей в доступной научной литературе нами обнаружено не было. Известно, что развитие туберкулеза сопровождается возникновением имун-нодефицитного состояния организма. В связи с вышесказанным, актуальным является комплексное изучение антимикобактериального действия наночастиц и иммунного статуса больных туберкулезом животных.

Цель исследования — оценить антибактериальные, иммунобиологические и токсикологические свойства наночастиц серебра, углеродных нанотрубок и выявить особенности их действия на иммунную систему здоровых и инфицированных М. tuberculosis экспериментальных мышей, в зависимости от пути проникновения этих частиц в макроорганизм.

Задачи исследования

1. Оценить физические параметры углеродных нанотрубок и наночастиц серебра.

2. Изучить бактерицидные свойства углеродных нанотрубок и наночастиц серебра по отношению к возбудителям различных бактериальных инфекций в системе in vitro, в том числе к возбудителю туберкулеза.

3. Исследовать влияние углеродных нанотрубок и наночастиц серебра в системе in vitro на жизнеспособность, фагоцитарную и цитокиновую активности им-мунокомпетентных клеток.

4. Изучить влияние наночастиц серебра и углеродных нанотрубок на изменение функциональной активности иммунокомпетентных клеток мышей при различных путях введения препаратов.

5. Оценить влияние ингаляционного введения мышам наночастиц серебра на уровень обсемененности легких M.tubercuiosis у животных, больных хронической формой туберкулеза, а также изменение функциональной активности лейкоцитов.

Научная новизна

Выявлено, что ингаляционное применение наночастиц серебра, покрытых поли-винилпирролидоном, приводит к полной элиминации или значительному снижению концентрации возбудителя туберкулеза в легких экспериментальных животных.

Показано, что на 7 сут после ингаляционного введения наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, мышам, больным хроническим туберкулезом, в сыворотке крови и бронхолегочном лаваже у животных отмечается увеличение концентрации интерферона-гамма (ИФН-у) с последующим понижением уровня данного цитокина к 30 сут, что совпадает со снижением обсемененности М. tuberculosis в органах мышей.

Обнаружено, что ингаляционное введение наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, здоровым мышам не вызывает изменения иммунологических показателей и патоморфологических нарушений в органах животных.

Установлено, что подкожное введение наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, в дозе 0,1 мг/кг снижает процентное содержание лимфоцитов в селезенке, увеличивает в 3,6 раза относительное количество ИФН-у-продуцирующих Т-лимфоцитов в селезенке и в 1,7 раза содержание ИФН-у в сыворотке крови мышей.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработан аэрозольный метод применения суспензии наночастиц серебра для снижения концентрации М. tuberculosis в легких больных хроническим туберкулезом животных, отраженный в Методических рекомендациях «Порядок работы с аэрозолями наночастиц и микроорганизмов (с использованием установки Глас-Кол модели 099С А4224) (Учрежденческий уровень внедрения)».

Выявлены новые свойства наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидо-ном, (коммерческий препарат «Арговит»): бактерицидная активность против М. tuberculosis и иммуномодулирующее действие препарата на лимфоцитарное и фагоцитарное звенья иммунитета мышей. По материалам диссертации составлены Методические рекомендации «1.2.0052-11. Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета. Методические рекомендации — М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 - 42 с. (Федеральный уровень внедрения)».

Материалы диссертационной работы используются в курсе лекций «Основы общей токсикологии наноматериалов» по магистерской образовательной программе «Нанобиобезопасность» Пущинского государственного естественно-научного института (ПущГЕНИ) и в образовательной программе Московского физико-технического института (кафедра физико-технической информатики).

Методология и методы исследования На первом этапе диссертационного исследования провели оценку физических параметров и бактерицидной активности наночастиц в экспериментах in vitro; на втором этапе изучили цитотоксическое воздействие наночастиц на иммунные клетки мышей в экспериментах in vitro; на третьем этапе исследовали воздействие наночастиц на иммунную систему мышей in vivo в зависимости от пути введения; на четвертом этапе изучили антибактериальное действие наночастиц серебра на модели больных хроническим туберкулезом мышей и провели оценку иммунного статуса данных лабораторных животных. В диссертационной работе использовали микробиологические, биологические, биохимические, иммунологические, микроскопические и гистологические экспериментальные методы исследования, а также методы статистической обработки результатов. Для проведения экспериментов, представленных в диссертационной работе, использовали следующее оборудование: многофункциональный анализатор Victor ХЗ 2030, Perkin Elmer, Финляндия (программа WorkOut 2,5); проточный цитофлюориметр FACSCalibur, Becton Dickinson, США (программа CellQuest

Pro); электронный микроскоп «Hitachi» Н-500, Япония (программа Image Scope М); сканирующий зондовый микроскоп «Smart SPM», АИСТ-НТ, Россия (программа Gwiddion); микротом «Reichert-Jung» (Германия); микроскоп Nikon Eclipse 80i (Япония); аэрозольную установку СО 099С А4224 (GLAS-COL APPARATUS, США); автоматический счетчик клеток Countess™ («Invitrogen», Корея).

Положения, выносимые на защиту

1. Бактерицидное и цитотоксическое действия углеродных нанотрубок и наночастиц серебра прямо пропорциональны концентрации наночастиц и зависят от их размера, формы и наличия поверхностного покрытия.

2. Наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном, при введении мышам линии BALB/c ингаляционно или внутрижелудочно в дозе 0,1 мг/кг в течение одного месяца не оказывают токсического влияния на органы ретикуло-эндотелиальной системы.

3. Наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном, при ингаляционном введении мышам линии С57В1/6, больным хроническим туберкулезом, способствуют снижению обсемененности микобактериями или полной элиминации возбудителя туберкулеза из легких экспериментальных животных.

4. Наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном, оказывают иммуномодулирующее действие при их введении мышам линий BALB/c или С57В1/6, что выражается в изменении концентрации ИФН-у и ФНО-а в биологических жидкостях животных.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается использованием современных методов исследования и оборудования, поверенного и сертифицированного надлежащим образом, с привлечением статистических методов обработки данных. Материалы диссертации представлены на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2010); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); Fifth International Conference on Na-notechnology - Occupational and Environmental Health (США, 2011); 2-ой Международной школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011); VIII Между-

народной научно-практической конференции «Нанотехнологии - производству-2012» (Фрязино, 2012); Объединенном Иммунологическом Форуме (Нижний Новгород, 2013); 6th International Symposium on Nanotechnology - Occupational and Environment Health (Япония, 2013).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 публикациях, в том числе в трех статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и в 8 тезисах сообщений на научных конференциях.

Лнчный вклад соискателя. Планирование, организация, проведение экспериментов и исследований на лабораторных животных, выполнение исследований методами цитометрии, иммуноферментного анализа, атомно-силовой микроскопии, спек-трофотометрии, хемилюминесценции, статистическая обработка полученных данных и их интерпретация проведены лично автором под руководством к.б.н. Фирстовой В.В. и д.б.н. Потапова В.Д. Все изложенные в диссертации материалы получены непосредственно самим соискателем, или при его участии. Результаты, описанные в отдельных главах, получены в соавторстве с сотрудниками лаборатории аэробиологических испытаний: н.с. Грищенко Н.С., н.с. Рудницкой Т.И.; отдела иммунобиохимии: н.с. Ганиной Е.А.; лаборатории электронной микроскопии: зав. лабораторией д.б.н. Герасимовым В.Н.

Объем н структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 149 страницах, иллюстрированы 22 рисунками и 14 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 206 цитируемых работы, из которых 22 российских и 184 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микробиологические методы

Микроорганизмы. В работе использовали штаммы Mycobacterium tuberculosis H37Rv («ГКПМ - Оболенск» В-4825), Francisella tularensis 15 НИИЭГ («ГКПМ -Оболенск» В-4341), Salmonella Enteritidis 4412 («ГКПМ - Оболенск» В-7844). Культивирование S. Enteritidis 4412 проводили на плотной питательной среде ГРМ-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ), F. tularensis 15 НИИЭГ - на плотной питательной среде FT-arap (ФБУН ГНЦ ПМБ), М. tuberculosis H37Rv - на плотной питательной среде Middlebrook 7Н11 AgarBase (HiMedia, Индия).

Определение бактерицидной эффективности наночастиц in vitro в концентрациях 50; 25; 10; 1; 0,25 и 0,1 мг/л проводили на штаммах 5. Enteritidis 4412, F. tula-rensis 15 НИИЭГ, M. tuberculosis H37Rv («ГКПМ - Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ) суспензионным методом (МУ 3.5.2596-10).

Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) М. tuberculosis H37Rv в органах зараженных животных проводили высевом гомогенатов органов методом 10-кратных разведений в забуференном физиологическом растворе на плотную питательную среду Middelbrook 7Н11 (Himedia, Индия). Учет колоний проводили на 28 сут.

Изучение действия наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, на модели хронического туберкулеза j> мышей линии С57В1/6 проводили в аэрозольной камере СО 099С А4224 (GLAS-COL APPARATUS, США). Препарат наночастиц серебра в дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела животного вводили однократно ингаляционным способом. Микробиологические высевы из легких и селезенок проводили на 1, 10 и 30 сут после введения.

Биотехнологические методы

Наночастицы. В работе использовали три вида наночастиц: 1. НЧС-ПВП - водная дисперсия наночастиц серебра, стабилизированных низкомолекулярным полимером медицинского назначения поливинилпирролидоном (ПВП) (препарат «Арговит», ООО НПЦ «Вектор-Вита», Россия). 2. НЧС - коллоидный раствор наночастиц серебра в воде (Plasma Chem, Германия). 3. УНТ - углеродные однослойные нанотрубки (Институт метаплоорганической химии им. Г.А. Разуваева, РАН, Новгород, Россия).

Биологические методы

Лабораторные животные. В работе использовали мышей линии BALB/c и С57В1/6, самки в возрасте 7-8 недель, весом 18-20 г. («Научный центр биомедицинских технологий», Андреевка, Россия).

Обработка мышей наночастицами. НЧС-ПВП и УНТ вводили животным подкожно, внутрижелудочно или ингаляционно в дозах 0,1 мг наночастиц на 1 кг массы тела на протяжении 28 дней ежедневно. Ингаляционное введение осуществляли в аэрозольной установке СО 099С А4224 (GLAS-COL APPARATUS, США) в течение 20 мин в день.

Мышиная модель экспериментального хронического туберкулеза. Заражение мышей линии С57В1/6 осуществляли введением 0,2 мл суспензии клеток штамма

M tuberculosis H37Rv внутрибрюшинно в дозе 5 xlO4 КОЕ/животное. Через 4 месяца животных эвтаназировали ингаляцией С02, затем провели некропсию органов для микробиологических исследований.

Иммунологические методы

Первичные клеточные культуры. В работе использовали мышиные спленоциты и фагоциты (нейтрофилы и макрофаги) перитонеального экссудата, которые выделяли в ходе эксперимента общепринятыми методами (Coligan E.J., 2005).

Цитотаксичнастъ наночастиц выявляли в МТТ-тесте (Mosmann Т., 1983). Измерение оптической плотности растворов проводили при длине волны 595 нм на многоканальном спектрофотометре Victor ХЗ 2030 (Perkin Elmer, Финляндия).

Уровень продукции активных форм кислорода фагоцитами определяли методом хемилюминесценции (XJI). В каждую лунку 96-луночного планшета вносили суспензию нейтрофилов (5х106 кл/мл), для усиления XJI применялся раствор люми-нола с концентрацией 5,6x1o-4 M (BioChemika, Чехия). В качестве индуктора фагоцитоза использовали опсонизированный зимозан («Sigma», США). Значение XJI измеряли 6 раз (длительность одного измерения 10 мин) на приборе Victor ХЗ 2030 (Perkin Elmer, Финляндия) при 37 °С.

Определение субпопуляционного состава лимфоцитов и количества цито-кинпродуцирующих Т-лимфоцитов селезенки проводили методами проточной ци-тофлюорометрии. Спленоциты (5 * 106 кл/мл) опытных и контрольных групп мышей окрашивали моноклональными антителами CD3 PerCP, CD4 APC, CD8 РЕ, CD 19 APC, I FN-у FITC и TNF-a APC (eBioscience, США) в течение 20 мин в темноте при 20 °С в соответствии с инструкцией производителя. Полученные образцы отмывали в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 1 % раствором формалина. Образцы анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Процентное содержание субпопуляций клеток в образцах определяли с использованием программы «CellQuest Pro».

Определение количества ИФН-у и ФНО-а в надосадочной жидкости сплено-цитов мышей, в сыворотке крови и жидкости бронхо-легочного лаважа проводили методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «Mouse IFN-y ELISA» и «Mouse TNF-a ELISA» (Bender MedSystems, Австрия) в соответствии с руководством производителя. Оптическую плотность измеряли на планшетном много-

функциональном анализаторе Victor ХЗ 2030 (Perkin Elmer, Финляндия) при длине волны 450 нм.

Определение количества белка, содержащегося в жидкости бронхо-легочного лаважа, проводили с использованием набора Pierce™ ВСА Protein Assay Kit (Sigma, США). Оптическую плотность измеряли на планшетном многофункциональном анализаторе Victor ХЗ 2030 (Perkin Elmer, Финляндия) при длине волны 562 нм.

Гистологические методы исследования органов мышей: легких, печени, почек, селезенки, паховых лимфатических узлов, окрашенных гематоксилин-эозином после обезвоживания и парафинирования и заключенных в бальзам, проводили на микроскопе Nikon Eclipse 80i (Япония), оснащенном цифровой камерой Nikon DS-U2.

Микроскопические методы

Определение физических параметров (форма, размер) наночастиц проводили методами просвечивающей электронной микроскопии (с помощью электронного микроскопа «Hitachi» Н-500, Япония) с использованием техники негативного контрастирования при ускоряющем напряжении 75 кВ; и атомно-силовой микроскопии с помощью сканирующего зондового микроскопа «Smart SPM» («АИСТ-НТ», Россия) с использованием программы «Gwiddion».

Методы статистической обработки результатов

Количественные значения результатов экспериментов подвергали статистической обработке с помощью пакета офисных программ Microsoft Office Excel 2007. Достоверность различий определяли с помощью í-критерия Стьюдента. Различия между группами признавали достоверными при уровне значимости Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика наночастнц серебра и углеродных нанотрубок н изучение их бактерицидной активности в экспериментах in vitro

Результаты анализа микрофотографий НЧС-ПВП и НЧС позволили заключить, что данные наночастицы представлены частицами округлой формы. Средний диаметр НЧС-ПВП составил (43,6 ± 10,7) нм, НЧС - (10,3 ± 5,6) нм. УНТ имели диаметр (36,2 ± 4,8) нм. Наибольшей способностью к агрегации обладали УНТ, что отражалось в образовании ими крупных агрегатов трубчатой формы. Меньше агрегировали НЧС. НЧС-ПВП были равномерно распределены в препарате (рис. 1).

НЧС-ПВП НЧС УНТ

Рисунок 1 -Микрофотографии наночастиц, полученные на атомно-силовом «Smart SPM» «АИСТ-НТ» (Россия) (А) и электронном «Hitachi» Н-500 (Япония) (Б) микроскопах

Изучение бактерицидной активности наночастиц проводили в отношении штаммов: Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Francisella tularensis 15 НИИЭГ, Salmonella Enteritidis 4412. Выявили, что НЧС-ПВП проявляли наибольшую бактерицидную активность в отношении всех бактериальных штаммов по сравнению с НЧС и УНТ. Бактерицидная активность наночастиц в отношении M.tuberculosis H37Rv представлена в табл. 1.

Таблица 1 - Бактерицидная эффективность наночастиц в отношении M.tuberculosis H37Rv (%)*.

Штамм Концентрация наночастиц, мг/л

50 25 10 1 0,1

НЧС-ПВП 55,12±4,51 36,25±2,83 31,15±2,55 3,53±0,29 2,42±0,21

НЧС 30,61±4,31 24,23±2,45 20,04±2,17 8,56±0,96 0

УНТ 21,27±2 97 17,53±2,63 9,62±2,23 4,47±1,26 0

Примечание - * - Бактерицидную эффективность рассчитывали по показателям погибших КОЕ относительно контроля (образца без добавления НЧС-ПВП) в процентном соотношении.

Изучение воздействия наночастиц серебра и углеродных нанотрубок на иммунные клетки в экспериментах in vitra

Результаты МТТ-теста показали, что наименьшее цитотоксическое воздействие на митохондриальную активность перитонеальных макрофагов, нейтрофилов и спле-ноцитов оказывали НЧС-ПВП, а наиболее цитотоксичными оказались НЧС. Цитоток-сические свойства УНТ проявлялись в концентрациях, превышающих 5 мг/л (рис. 2).

% 120

100 80 60 40 20 о

-нчс-пвп -нчс

-УНТ

0,05 0,25 0,5 5 10 50 Концентрация наночастиц, мг/л

Рисунок 2 - Уровень активности митохондриальных дегидрогеназ перитонеальных макрофагов мышей после 24 ч инкубации в присутствии изучаемых наночастиц в МТТ-тесте. Контроль - интактные клетки

Уровень продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами в присутствии всех изученных наночастиц при низкой концентрации (10 мг/л) не отличался от уровня контрольных значений. НЧС в дозе 100 мг/л увеличивали продукцию АФК нейтрофилами мыши в 3,75 раза, что может быть причиной окислительного стресса в клетках (рис. 3).

250000 1

л

IL

I

Рисунок 3 - Уровень продукции АФК нейтрофилами мышей в присутствии наночастиц в концентрации 100 мг/л. Контроль - интактные клетки. * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (Р<0,001)

Продукция АФК нейтрофилами в ответ на зимозан, опсонизированный мышиной сывороткой, моделирует ответ фагоцитов на чужеродный патоген и отражает бактерицидный потенциал нейтрофилов. Уровень продукции АФК нейтрофилов в ответ на зимозан, в присутствии НЧС-ПВП в концентрации 100 мг/л не отличался от контрольных клеток. НЧС и УНТ (100 мг/л) снижали уровень индукции АФК нейтрофилами в присутствии зимозана в 4 и 5,8 раз, соответственно (Р<0,001), по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении бактерицидного потенциала нейтрофилов (рис. 4).

Цитотоксичность НЧС без покрытия может быть опосредована через окислительный стресс, в то время как НЧС, покрытые ПВП, способны вызывать цитотокси-ческие эффекты через воспалительные пути увеличением продукции цитокинов (Nguyen, 2013). Поэтому для исключения, возможно, другого механизма цитотоксич-ности НЧС-ПВП провели эксперименты по изучению его влияния на продукцию про-воспалительных цитокинов спленоцитами мышей. Добавление к спленоцитам НЧС-ПВП в концентрациях от 0,5 мг/л до 50 мг/л не влияло на выработку ИФН-у и ФНО-а лимфоцитами in vitro, что позволило заключить об отсутствии инициации провоспа-лительного ответа иммунных клеток.

600000

Контроль НЧС-ПВП НЧС УНТ

Рисунок 4 - Уровень продукции АФК нейтрофилами мышей в ответ на добавление зимозана в присутствии наночастиц в концентрации 100 мг/л. Контроль -интактные клетки. * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (Р<0,001)

Изучение воздействия наночастиц серебра и углеродных нанотрубок иа иммунную систему мышей в зависимости от пути введения

На следующем этапе изучили многократное воздействие НЧС-ПВП и УНТ при ингаляционном, подкожном или внутрижелудочном введении животным. Гистологическое исследование легких, печени, почек, селезенок, паховых лимфатических узлов мышей линии ВАЬВ/с после ингаляционного и внутрижелудочного введения наночастиц серебра в течение 28 дней не показало наличия в них патологических изменений. Подкожное введение НЧС-ПВП приводило к изменению состава иммунокомпетент-ных клеток в селезенке, печени и паховых лимфатических узлах, а также гиперплазии красной пульпы селезенки, увеличению количества активированных макрофагов и гнездных скоплений полиморфноядерных лейкоцитов, интенсивной лимфоцитарной инфильтрации, что является показателем активации иммунокомпетентных клеток организма животного (рис. 5).

А. Б.

Рисунок 5 - Красная пульпа селезенки мыши после подкожного введения физиологического раствора (А) и НЧС-ПВП (Б). А. Преобладание лимфоцитов. Б. Обширное скопление полиморфноядерных лейкоцитов на фоне активированных макрофагов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х40

При введении НЧС-ПВП мышам жизнеспособность спленоцитов. полученных от животных всех экспериментальных групп, достоверно не отличалась и составляла в среднем (94,26±4,47) %. При ингаляционном и внутрижелудочном введении НЧС-ПВП соотношение Т- и В-лимфоцитов, содержание ИФН-у и ФНО-а-продуцирующих Т-лимфоцитов не отличались от контрольных показателей, а после подкожного введения отмечали снижение относительного количества В-лимфоцитов в селезенке жи-

вотных до (33,84±2,4) % по сравнению с контролем ((50,26±1,6) %) и наблюдали тенденцию к снижению содержания Т-лимфоцитов (табл. 2). Таблица 2 - Содержание субпопуляций лимфоцитов в селезенке мышей, %

Способ введения НЧС-ПВП Т- лимфоциты Т-хелперы Цитотоксические лимфоциты В- лимфоциты

Ингаляционный 31,99±3,7 20,04±2,5 9,33±1,2 40,06±2,6

Подкожный 24,22±1,4 12,97±2,1 7,20±0,6 33,84±2,4

Внутрижелудочный 32,24±3,2 19,38±1,6 8,57±1,4 44,32±1,8

Контроль 30,56±2,8 18,56±1,2 9,77±0,8 50,26±1,6

При подкожном способе введения НЧС-ПВП мышам содержание ИФН-у -продуцирующих Т-лимфоцитов возрастало в 3,6 раза ((30,63±6,4) %) по сравнению с контролем ((8,38±4,8) %) (Р<0,05). В сыворотке крови при подкожном способе введения НЧС-ПВП также увеличивалось содержание ИФН-у до (125±9,2) пг/мл относительно контрольной группы животных ((74,5±6,4) пг/мл) (Р<0,05). Одним из критериев развития воспаления при ингаляционном введении препарата может быть увеличение белка в жидкости бронхо-легочного лаважа (БЛЛ). При ингаляционном введении НЧС-ПВП мышам достоверного увеличения количества белка в жидкости БЛЛ не обнаружили. При введении животным ПВП различными способами изменений иммунологических показателей и морфологической структуры органов не обнаружили.

Гистологическое исследование органов мышей после многократного ингаляционного воздействия углеродных нанотрубок показало, что изменения патологического характера ограничены местом введения (легкими) и проявляются преимущественно диффузным утолщением межальвеолярных перегородок и образованием обширных гранулем из эпителиоидных клеток. Также выявили увеличение количества белка в жидкости бронхо-легочного лаважа до (1380,2±151,6) мг/л по сравнению с контролем ((660,4±94,8) мг/л) (Р<0,05), что свидетельствует о воспалительном процессе в легких. Ингаляционное введение углеродных нанотрубок снижало на 30 % количество жизнеспособных клеток в селезенке экспериментальных мышей. При этом наблюдали тенденцию к увеличению процентного содержания Т-лимфоцитов в селезенке ((40,66±2,3) %), в равной степени за счет Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов. Хотя достоверного изменения относительного количества ИФН-у- и ФНО-а-продуцирующих Т-клеток в селезенке животных не выявили.

Изучение антибактериального действия наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, на модели хронического туберкулеза мышей линии C57BI/6

Учитывая высокую бактерицидную активность НЧС-ПВГ1 в отношении M.tuberculosis в экспериментах in vitro и отсутствие иммунопатологических изменений у экспериментальных животных при ингаляционном введении данных наночастиц. на следующем этапе оценили влияние НЧС-ПВП на обсемененность легких и селезенок микобактериями у хронически больных туберкулезом мышей линии С57В1/6. Микробиологические высевы показали выраженное снижение обсемененно-сти органов бактериями М. tuberculosis у больных туберкулезом мышей после их ингаляционной обработки НЧС-ПВП: из органов высевались единичные колонии, либо М. tuberculosis полностью отсутствовали (рис. 6).

сутки после введения НЧС-ПВП

Рисунок б - Динамика снижения обсемененности органов М. tuberculosis у мышей, больных хроническим ТБ, в течение месяца после ингаляционного воздействия НЧС-ПВП. Контроль - обсемененность органов М. tuberculosis в течение месяца в группе мышей, больных хроническим ТБ, без введения НЧС-ПВП

Оценка иммунологических показателей больных хроническим туберкулезом мышей после ингаляционного введения наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном

Провели оценку соотношения основных субпопуляций лимфоцитов, способность лимфоцитов к продукции цитокинов (количество ИФН-у- и ФНО-а - продуцирующих Т-лимфоцитов), содержание цитокинов в биологических жидкостях, количество белка в жидкости бронхо-легочного лаважа и бактерицидный потенциал фагоцитов.

Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов у мышей с хронической формой ТБ показала увеличение содержания Т-лимфоцитов на 5.77 % (Р<0.05) и снижение содержания В-лимфоцитов на 8.27 % (Р<0.05). После введения НЧС-ПВП больным ТБ мышам относительное количество Т- и В-лимфоцитов достоверно не отличалось от значений данных показателей в контрольной группе животных. Увеличенное в 2 раза содержание ИФН-у-продуцирующих Т-хелперов в селезенках больных ТБ мышей снижалось после ингаляционного воздействия НЧС-ПВП. Относительное количество ФНО-а-продуцирующих Т-хелперов в группах здоровых и больных ТБ мышей достоверно не отличалось друг от друга. Ингаляционное воздействие НЧС-ПВП приводило к увеличению содержания ФНО-а-продуцирующих Т-хелперов в селезенках больных ТБ мышей в 2 раза (Р<0,05) (рис. 7).

% 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

Контроль ТБ ТБ+НЧС-ПВП

Рисунок 7 - Содержание цитокинпродуцирующих Т-хелперов (СВЗ С04~)в селезенке мышей. Контроль - группа здоровых мышей, ТБ - группа больных ТБ мышей, ТБ+НЧС-ПВП - группа больных ТБ мышей через месяц после введения НЧС-ПВП. * - результат статистически достоверен по сравнению с группой мышей, больных ТБ (Р<0,05)

Оценка динамики изменения содержания ИФН-у в сыворотке крови мышей показала достоверное увеличение количества данного цитокина на 7 сут после воздействия с последующим его снижением к 30 сут (но достоверно выше показателей контрольной группы и группы мышей, больных ТБ) (рис. 8). Известно, что у больных активной формой туберкулеза уровень ИФН-у в крови может быть снижен или повышен по сравнению со здоровыми лицами, а лечение туберкулеза сопровождается повышением сывороточного уровня ИФН-у (Лядова, 2009).

Рисунок 8 - Динамика изменения содержания ИФН-у в сыворотке крови мышей в течение месяца

Контроль - здоровые мыши, ТБ - больные ТБ мыши, ТБ+НЧС-ПВП - больные ТБ мыши после введения НЧС-ПВП

Время наблюдений,суг

В жидкости бронхо-легочного лаважа (БЛЛ) больных ТБ мышей на 7 сут после введения НЧС-ПВП также наблюдали значительное увеличение содержания гамма-интерферона до значения (85,00±5,68) пг/мл по сравнению с уровнем данного цито-кина до введения НЧС-ПВП ((50,01±3,33) пг/мл, Р<0,05). Через 30 сут после введения НЧС-ПВП уровень гамма-ИФН снижался и был достоверно ниже данного показателя в группе больных ТБ мышей (Р<0,05) (рис. 9).

Рисунок 9 - Динамика изменения содержания ИФН-у в жидкости БЛЛ мышей в течение месяца

Контроль - здоровые мыши, ТБ - больные ТБ мыши, ТБ+НЧС-ПВП - больные ТБ мыши после введения НЧС-ПВП

Время наблюдений, сут

Повышенное содержание ФНО-а в сыворотке крови и жидкости БЛЛ больных ТБ мышей через 30 сут после введения НЧС-ПВП снижалось в 2,3 и 2 раза, соответственно. У больных ТБ мышей наблюдали значительное увеличение содержания ин-терлейкина-4 (ИЛ-4) в сыворотке крови и в жидкости БЛЛ в 6 и 17 раз, соответственно, относительно значений данных показателей в контрольной группе ((3,67±0,72) и (4,12±0,64) пг/мл, Р<0,001). Через 30 сут после введения НЧС-ПВП у мышей, больных ТБ, уровень ИЛ-4 достоверно не отличался от содержания данного цитокина в исследованных биологических жидкостях животных контрольной группы.

19

У мышей, больных ТБ. наблюдали повышение содержания белка в жидкости бронхо-легочного лаважа до (3826.8±215,3) мг/л по сравнению с таковым показателем в контрольной группе животных (926,7±76,3) мг/л (увеличение в 4 раза) (Р<0,001). После воздействия НЧС-ПВП количество белка в жидкости БЛЛ больных ТБ мышей снижалось в два раза до показателя (1908,5±105,7) мг/л (Р<0,001), что отражало уменьшение воспаления в легких. У здоровых животных ингаляционное введение НЧС-ПВП достоверно не изменяло количества белка в жидкости бронхо-легочного лаважа.

Интенсивность продукции АФК нейтрофилами больных ТБ мышей была снижена по сравнению со значениями данного показателя в группе контрольных животных (Р<0,001). Через 30 сут после ингаляционного введения НЧС-ПВП наблюдали увеличение в 2,5 раза уровня продукции АФК нейтрофилами больных ТБ мышей (Р<0,001) (рис. 10), что отражает усиление бактерицидного потенциала данных клеток, играющего ключевую роль в иммунопатогенезе туберкулеза.

90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

1 СУТ

-ь

Г*1

ТБ+НЧС-ПВП

30 сут

ТБ+НЧС-ПВП

Рисунок 10 - Уровень продукции АФК нейтрофилами мышей. Контроль - здоровые мыши; ТБ - больные ТБ мыши; ТБ+НЧС-ПВП — больные ТБ мыши после введения НЧС-ПВП. * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем (Р<0,001); ** - результат статистически достоверен по сравнению с группой мышей, больных ТБ (Р<0,001)

выводы

1. Наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном, и наночастицы серебра без покрытия характеризуются устойчивостью к агрегации и гомогенно распределяются в растворе. Углеродные нанотрубки формируют в растворе агрегаты.

2. Наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном, обладают выраженным бактерицидным эффектом по отношению к микроорганизмам М. tuberculosis H37Rv, F. tularensis 15 НИИЭГ, S. Enteritidis 4412. Наночастицы серебра без покрытия характеризуются менее выраженной бактерицидной активностью, а углеродные нанотрубки практически не оказывают бактерицидного действия на исследуемые патогены.

3. Наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном, в концентрациях от 0,05 до 50 мг/л не оказывают цитотоксического действия на иммунокомпетент-ные клетки мышей in vitro. Наночастицы серебра без покрытия и углеродные нанотрубки снижают жизнеспособность и функциональную активность иммунных клеток.

4. Многократное ингаляционное и внутрижелудочное введение наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, мышам линии BALB/c в дозе 0,1 мг/кг не изменяет функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Подкожное введение наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, в дозе 0,1 мг/кг вызывает изменение субпопуляционного состава лимфоцитов, увеличивает количество ИФН-у-продуцирующих Т-лимфоцитов в селезенке в 3,6 раза по сравнению с контролем, а также повышает содержание ИФН-у в сыворотке крови мышей до (125±9,2) пг/мл по сравнению с контролем ((74,5±6,4) пг/мл).

5. Установлен противотуберкулезный эффект наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном: ингаляционное введение данных наночастиц мышам, больным туберкулезом, обеспечивало снижение обсемененности органов М. tuberculosis на два порядка до полной элиминации бактерий у отдельных животных. Показано, что на 30 сут после введения наночастиц серебра, покрытых поливинилпирролидоном, больным туберкулезом мышам наблюдается снижение количества белка в жидкости бронхо-легочного лаважа в два раза, восстановление баланса цитокинов и соотношения популяций лимфоцитов в селезенке, а также усиление бактерицидного потенциала нейтрофилов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК

1. Фирстова, В.В. Влияние углеродных нанотрубок на жизнеспособность спленощггов и субпопуляционный состав лимфоцитов мышей линии BALB/C в зависимости от пути их проникновения в организм / В.В. Фирстова, В.Д. Потапов, В.Н. Герасимов, О.В, Полежаева*, Е.В. Зырина// Здоровье населения и среда обитания. - 2011. - № 5 (218). - С. 4043.

2. Калмаптаева, О.В. Особенности воздействия наночастиц серебра на иммунную систему мышей в зависимости от пути введения / О.В. Калмантаева, В.В. Фирстова, В.Д. Потапов, Е.В. Зырина, В.Н. Герасимов, Е.А. Ганина, В.А. Бурмистров, A.B. Борисов // Российские нанотехнологии. - 2014. - Т. 9, № 9-10. - С. 78-82. (Импакт-фактор 151/РИНЦ-1,137) Англ. издание: Kalmantaeva, O.V. Silver-Nanoparticle Exposure on Immune System of Mice Depending on the Route of Administration / O.V. Kalmantaeva, V.V. Firstova, V.D. Potapov, E.V. Zyrina, V.N. Gerasimov, E.A. Ganina, V. A. Burmistrov, A.V. Borisov // Nanotechnologies in Russia. - 2014. - Vol. 9, N. 9-10. - P. 571-576 (Scopus SJR - 0,229).

3. Фирстова, В.В. Использование методов цитометрии для оценки специфического клеточного иммунитета / В.В. Фирстова, О.В. Калмантаева, П.Х. Копылов, A.A. Горбатов, В.М. Павлов, С.А. Иванов, С В. Дентовская, А.П. Анисимов // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9 (18), № 2 (2). - С. 120-122.

Тезисы докладов на научных конференциях

4. Полежаева, О.В. Влияние углеродных нанотрубок в составе аэрозоля на течение хронического туберкулеза у мышей, зараженных штаммом H37RV / О.В. Полежаева, В.Д. Потапов, В.В. Фирстова, Н.С. Грищенко, В.В. Мочалов // Материалы 14 Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, 2010.

5. Полежаева, О.В. Анализ интегральной токсичности наноматериалов в модельных условиях / О.В. Полежаева, A.C. Бутыркина, Е.В. Зырина, В.Н. Герасимов, В.В. Фирстова, И В. Бахтеева, Г.М. Титарева, В.Д. Потапов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности. Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 92-95.

6. Фирстова, В.В. Оценка биобезопасности применения наносеребра в разных формах / В.В. Фирстова, О.В. Полежаева, В.Д. Потапов, Г.М. Титарева, И В. Бахтеева // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010». - 2010. - Т. 4. - С. 444-446.

7. Firstova, V.V. Cytoxicity of multi-wall carbon nanotubes depend on the route of administration / V.V. Firstova, O.V. Polezhaeva, V.N. Gerasimov, V.D. Potapov // Fifth International Conference on Nanotechnology - Occupational and Environmental Health. - USA, 2011. - P. 209.

8. Полежаева, О.В. Применение метода проточной цитофлюориметрии для оценки иммунобиологических свойств углеродных нанотрубок / О.В. Полежаева, Е.В. Зырина, В.В. Фирстова // Сборник тезисов 2-ой Международной школы по практической проточной цитометрии. - Москва, 2011. - С. 77-78.

9. Калмантаева, О.В. Влияние наночастиц серебра на продукцию активных форм кислорода фагоцитирующими клетками мышей /О.В. Калмантаева, В.В. Фирстова, В.Д. Потапов, Н.С. Грищенко, В.Н. Герасимов // Тезисы докладов VIII Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии - производству». - Фрязино, 2012. - С. 11-12.

10. Калмантаева, О.В. Изучение антимикробных свойств наночастиц серебра и их влияния на цитокиновый ответ Т-лимфоцитов мышей линии C57BI с хроническим течением туберкулеза / О.В. Калмантаева, Е.В. Зырина, В.В. Фирстова, Н.С. Грищенко, В.Д. Потапов // Российский иммунологический журнал. - 2013.- Т. 7 (16), № 2-3. - С. 248.

И. Firstova, V.V. Toxicity of silver nanoparticles and their routes of exposures / V.V. Firstova, O.V. Kalmantaeva, E.Yu. Zyrina, T.Yu. Zavistyaeva, V.D. Potapov // 6th International Sym-posiumon Nanotechnology, Occupational and Environment Health. - Япония, 2013. - P. 75.

* Фамилия Калмантаевой О.В. до 2011 года.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИ1ШЦ И ТЕРМИНОВ

АФК активные формы кислорода

БЛЛ бронхо-легочный лаваж

ГКПМ - Оболенск Государствеш1ая коллекция патогенных микроорганизмов и

клеточных культур — Оболенск

ИЛ-4 интерлейкин 4

ИФП-у интерферон-гамма

НЧС наночастицы серебра

НЧС-ПВП наночастицы серебра, покрытые поливинилпирролидоном

ПВП поливинилпирролидон

ТБ туберкулез

УНТ углеродные нанотрубки

ФНО-а фактор некроза опухоли-альфа

ХЛ хемилюминесценция

Подписано в печать:

06.10.2015

Заказ № 10921 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru