Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Информативность полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза легких
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Информативность полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза легких"
На правах рукописи
Ларионова Елена Евгеньевна
ИНФОРМАТИВНОСТЬ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ
03.00.07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2005
Работа выполнена в ГУ Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских Наук.
Научный руководитель
доктор биологических наук Черноусова Лариса Николаевна
Официальные оппоненты
Ведущая организация:
доктор медицинских наук Мазурова Изабелла Константиновна кандидат биологических наук Нестеренко Людмила Николаевна Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова, кафедра микробиологии.
Защита диссертации состоится "_"_2005 г. в_часов
на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в ГУ Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.
Автореферат разослан "_"_2005 г
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук С.Ю. Комбарова
Актуальность исследования.
Ежегодно в мире регистрируется два-три миллиона новых случаев туберкулеза. В России в 2003 году заболеваемость туберкулезом составила 83,2 человека на 100000 жителей смертность 21 человек на 100000. По данным ВОЗ за время жизни больной активным туберкулезом легких инфицирует 20 человек.
Длительное время туберкулез может протекать бессимптомно. Поэтому своевременная диагностика туберкулеза крайне актуальна. Основным критерием лабораторной диагностики туберкулеза остается выявление возбудителя - Mycobacterium tuberculosis в диагностическом материале.
Традиционные микробиологические методы выявления возбудителя не всегда позволяют подтвердить диагноз туберкулеза. Методы люминесцентной бактериоскопии и посева обладают низкой чувствительностью и обнаруживают M.tuberculosis только у 50-60% больных активным туберкулезом легких, в связи с этим внедрение методов быстрого и специфичного выявления M.tuberculosis чрезвычайно актуально [Хоменко А.Г. 1995; Оттен Т.Ф., 1997; Владимирский М.А., 1997; Стаханов ВА., 2000]. Поэтому широкое распространение получили методы диагностики инфекционных заболеваний на основе выявления специфической ДНК или РНК возбудителя методом полимеразной цепной реакции. Применению PCR для M.tuberculosis посвящены публикации в зарубежной и в отечественной печати, показана строгая специфичность этого метода исследования [Gyllensten U.B. et al., 1988; Abu Al-Soud W. et al., 1998; Boddinghaus B. et al., 1990; Ehlers S. et al., 1994; Вишневский Б.И., 1998; Бочкарев Е.Г., 2000]. Однако, в последнее время в некоторых работах отмечаются трудности, связанные с применением этой технологии в практических лабораториях. При лабораторной диагностике туберкулеза легких не всегда представляется возможным получить материал непосредственно из очага поражения. Отмечено, что ингибирование реакции, вызываемое компонентами различных диагностических образцов, значительно снижает её чувствительность, нередко обуславливая ложноотрицательные результаты [Wilson I.G., 1997; Honore-Bouakline S. et al., 2003].
Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности метода полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза легких при использовании различного диагностического материала и определение места PCR в комплексе диагностических лабораторных исследований. Научная новизна.
Наибольшая диагностическая значимость результатов PCR по сравнению с бактериоскопией и посевом выявлена для больных с ограниченными туберкулезными поражениями, такими как туберкулез внутригрудных лимфатических узлов, инфильтративный и очаговый туберкулез легких. Впервые показана диагностическая ценность PCR при выявлении M. tuberculosis из крови у больных туберкулезом легких. Основные положения, выносимые на защиту.
Информативность метода PCR для диагностики туберкулеза зависит от формы и распространенности туберкулезного процесса в легких, от способа предварительной обработки диагностических образцов и полноты выделения ДНК.
Результаты PCR могут служить лабораторным критерием для оценки эффективности проводимой терапии у больных туберкулезом легких с отрицательными результатами бактериоскопии и культурального посева. Диагностическая ценность результатов PCR для больных туберкулезом легких увеличивается при исследовании помимо мокроты, в качестве диагностического материала крови, мочи, плевральных экссудатов и биоптатов различных тканей, а также при предварительном культивировании мокроты. Апробация научных результатов. Основные положения диссертации доложены на 3 съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров (Екатеринбург, 1997), на II, III и IV Всероссийских конференциях "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний", (Москва, 1998, 2000, 2002), на IV и VII Всероссийском конгрессе 'Человек и лекарство" (Москва, 1997, 2002), на симпозиуме «Иммунодиагностика и иммунореабилитация при лепре, туберкулезе и других хронических заболеваниях» (Астрахань, 1998), на 9 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), на
Национальном конгрессе «Клинической иммунологии,
аллергологии и иммунореабилитации» (Алмааты, 1999), на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы туберкулеза и других гранулематозных заболеваний» (Москва, 2001), на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002,2003).
Работа апробирована на совместном заседании отдела микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (30.06.2004 г.)
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 12 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 200 источников, из них 29 отечественных и 171 зарубежных.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследуемый материал. Работа проведена с образцами мокроты (862), бронхоальвеолярных смывов (95), экссудатов (31), крови (466), мочи (84), биоптатов лимфоузлов (16), легких (20) от больных туберкулезом легких. Исследовали кровь, легкие и селезенку от 12 мышей линии BALB/C. В качестве отрицательных образцов использовали образцы мокроты от больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких, кровь, легкие и селезенку от интактных мышей.
Использовали штаммы: M.tuberculosis H37Rv (Pasteur), M.avium (институт туберкулеза Берлин, 1950), M.smegmatis (Институт государственного контроля вакцин и сывороток им. Л.А. Тарасевича, 1947), M.intracellulare (MMA им. М.А.Сеченова, 1959), М. bovis Bovinus-8 (Прага), M.bovis BCG, M.kansasii, M.fortuitum, M.vacca, M.intracellulare из музея ГУ ЦНИИТ РАМН. Методы выявления M.tuberculosis. Выявление M.tuberculosis из диагностического материала проводили после предварительной обработки с использованием методов люминесцентной бактериоскопии, посева на плотную
питательную среду Левенштейна- Йенсена и Финн-И, посева на жидкую питательную среду Middlebrook 12В (ВАСТЕС-460-ТВ) и 7Н9 (MGIT). Культуру стандартизовали определением числа колониеобразующих единиц (КОЕ), на агаре Дюбо в чашках Петри путем подсчета колоний на 3-4 день культивирования. ДНК MJuberculosis выявляли методом полимеразной цепной реакции.
Подготовка проб для проведения PCR.
Образцы мокроты обрабатывали 10% раствором Na^POi, инкубировали 1820 часов при 37°С. Экссудат центрифугировали, осадок отмывали деионизированной водой. Образцы венозной крови собрали в 150 мкл 0,2М EDTA, отмывали деионизированной водой. Образцы биоптатов измельчали в гомогенизаторе, с ТТЕ (тритон, трис, EDTA) - лизирующим буфером. К осадку добавляли разрушающий буфер, содержавший Тритон Х-100, и протеиназу-К. Инкубировали 18 часов при 60°С. Осадок суточной мочи центрифугировали, прогревали и промывали деионизированной водой.
Для экстракции ДНК MJuberculosis использовали методы: а) лизиса клеток ТТЕ и очисткой ДНК фенол-хлороформом, б) лизис клеток гуанидином с последующей сорбцией ДНК на диатомовой земле [Boom R, et al., 1990], в) простой лизис клеток ТТЕ буфером, г) простой хлороформный метод при замораживании и оттаивании [Маниатис Т. - 1994].
PCR проводили с использованием наборов: «МИКО-ГЕН» (Москва, НПФ «ДНК-технология»); GencPakTM DNA PCR test (Москва, «БИОКОМ»); «АмплиСенс МВТ» (Москва, ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ). Амплификациию фрагмента IS6110 проводили в термоциклере «Терцик» (ДНК-технология) и с помощью системы iCycler iQ™ Real-time PCR «BioRad».
Детекцию результатов PCR проводили методом электрофореза в агарозном геле, а также по генерации репортерной флуоресценции олигонуклеотидных зондов методом PCR Real-time. При анализе кинетической кривой PCR режиме Real-time учитывали начало экспоненциальной стадии, выражающееся в циклах амплификации, и показатель относительных единиц флуоресценции (RFU) в момент перехода в стадию насыщения «плато».
Статистическую обработку данных проводили по критерию у^ с
использованием программы статистической обработки данных
Primer of BIOSTATISTICS, Version 4.03, пособия С.А. Гланца «Медико-биологическая статистика», изд. «Практика», Москва, 1999, и пособия Б.Л. Ван дер Вардена «Математическая статистика», изд. «Иностранная литература», Москва, 1960.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Одной из основных задач современной лабораторной диагностики туберкулеза является повышение чувствительности обнаружения MJuberculosis, так как традиционные микробиологические методы не в полной мере отвечают потребностям фтизиатрии.
В России несколько крупных научных центров занимаются разработкой PCR тест-систем для выявления микобактерий туберкулеза. Поэтому оценка эффективности их использования в микобактериологии является важной научно-практической задачей.
1. Полимеразная цепная реакция с культурами M.tuberculosis.
Пороговую чувствительность трех PCR тест-систем устанавливали на культурах MJuberculosis, проводя реакцию согласно прописи фирм-изготовителей. При выборе диапазона значений исходили из того, что аналитическая чувствительность PCR составляет от 1 пг до 5 фг микобактериальной ДНК, а 1 клетка микобактерии содержит 2,75 фг ДНК [Wilson I.G., 1997]. Результаты показали, что все PCR тест-системы обладали высокой чувствительностью (от до .35x10" мкг ДНК) MJuberculosis,
что соответствует 2-40 клеткам в образце.
При выборе оптимального способа экстракции ДНК использовали: лизис клеток ТТЕ буфером с очисткой ДНК фенол-хлороформом, лизис клеток гуанидином с последующей сорбцией ДНК на диатомовой земле, простой лизис клеток ТТЕ буфером без очистки ДНК от белков и экстракцию ДНК простым хлороформным методом при замораживании - оттаивании клеток. На первом этапе методы отрабатывались на лабораторном штамме M tuberculosis H37Rv (Pasteur). Использовали стандартизованные образцы, содержавшие 1000 КОЕ/мл.
Результаты PCR (Real-time) с ДНК, выделенной различными способами (рис 1), показал, что метод лизиса клеток гуанидином с последующей сорбцией ДНК обеспечивал RFU=1200; начало экспоненциальной стадии на 18 цикле, лизис клеток ТТЕ буфером с очисткой фенол-хлороформом обеспечивал RFU=800; начало экспоненциальной стадии на 21 цикле. При простом хлороформном методе показатели составили RFU=800; начало экспоненциальной стадии на 24 цикле, а простой лизис с ТТЕ хлороформом обеспечивал только RFU=300; начало экспоненциальной стадии на 28 цикле.
1400
| 1200 ■ х 2
* а. 1000 3 х
• i 800 ? х Í | 600л и
1 & 400 х 0
g I 200
х 4
Б о
-200 «
№-1 лизис гуанидином, сорбция ДНК
№-2 лизис с ТТЕ очистка фенол-хлороформом
№-3 простой хлороформный
№-4 простой лизис с ТТЕ
Рис 1. Результаты PCR (Real-time) с ДНК, выделенной различными способами из образцов, содержащих 1000 КОЕ M.tuberculosis H37 Rv.
Поскольку чистота выделения ДНК и ее количество характеризовалась величиной относительных единиц флуоресценции RFU и началом экспоненциальной стадии, выражающееся в циклах, на основании анализа кинетических кривых был сделан вывод, что для выделения ДНК из культуры M.tuberculosis метод выделения гуанидином оказался наилучшим.
-72. Условия необходимые для проведения полимеразной цепной
реакции.
Для решения проблем, связанных с обеспечением чувствительности PCR, были исследованы способы обработки диагностического материала и выделения ДНК из образцов.
Для подготовки проб мокроты перед экстракцией ДНК M.tuberculosis использовали разжижение и деконтаминацию следующими реагентами: 6% H2S04, 4%NaOH, 10% Na3M)4 N-Acetyl-L-cysteine-NaOH.
Способы обработки мокроты оказывали существенное влияние на результаты PCR. Анализ кинетических кривых PCR Real-time показал, что стадия насыщения в пробах, обработанных 10% и NALC-NaOH,
фиксировалась на уровне 900 RFU, что указывало на содержание меньшего количества посторонних примесей по сравнению с пробами, обработанными 4% NaOH и 6% H2S04 (600-300 RFU). Так как обработка мокроты 10% Na3P04 и NALC-NaOH позволила получить одинаковые результаты, в дальнейшем разжижение мокроты проводили 10%
Для выбора оптимального способа выделения из мокроты, ДНК экстрагировали двумя методами: лизисом клеток ТТЕ буфером с очисткой фенол-хлороформом и лизисом гуанидином с последующей сорбцией ДНК. Результаты спектрофотометрического измерения показали, что чистота проб при выбранных методах выделения была достаточной, поглотительное соотношение составило при лизисе гуанидином 1.29, а при лизисе
ТТЕ с последующей очисткой фенол-хлороформом 1.58.
Результаты PCR Real-time показали, что начало экспоненциальной стадии при любом способе выделения фиксировалось на 22 цикле амплификации. В то же время относительная единица флюоресценции при лизисе клеток гуанидином с очисткой ДНК на сорбенте составила 1000 RFU, а при лизисе ТТЕ и очистке фенол-хлороформом 600 RFU. Кроме того, угол наклона кривой в пробах указывает на то, что при лизисе ТТЕ и очистке фенол-хлороформом ингибиторов амплификации остается больше, чем после лизиса гуанидином.
Результаты были подтверждена: на 20 образцах мокроты от больных с различной интенсивностью бактериовыделения. Было сделано заключение, что оптимальным для выделения ДНК M.tuberculosis из мокроты является метод, использующий в качестве лизирующего агента гуанидин, начало экспоненциальной стадии фиксировалось значительно раньше (на 23-33 циклах), чем при экстракции ДНК ТТЕ - лизирующим буфером с последующей очисткой ДНК фенол-хлороформ.
Для определения оптимального объема пробы мокроты, который можно использовать для исследования методом PCR, чтобы предотвратить ингибирование посторонними субстанциями, были взяты пробы 30 образцов мокроты объемом 300, 500, 800 и 1000 мкл. В образцах визуально хорошо были видны сгустки слизи, следы крови. Результаты показали, что начало экспоненциальной стадии в образцах объемом 300 мкл наблюдалось раньше (на 17-20 циклах), чем в образцах содержащих больший объем. Кроме того, было показано, что присутствие в мокроте субстанций, ингибирующих PCR (слизи, гноя и крови) приводит к получению ложноотрицательных результатов. Поэтому при обработке образцов всегда необходимо учитывать индивидуальные особенности образцов.
Специфичность тест-систем была подтверждена на лабораторных штаммах M.tuberculosis H37Rv, M.bovis Bovinus-8, M.bovis BCG, M.kansasii, MAntracelluIare, M.avium, M.fortuitum, M.vaccae, M.smegmatis, взятых в концентрации 1000 и 500 КОЕ/мл. Положительные результаты PCR наблюдались только в образцах, содержащих штаммы M.tuberculosis H37Rv, M.bovis Bovinus-8, M.bovis BCG, что подтвердило специфичность изучаемых тест-систем.
Сравнение диагностической чувствительности трех тест-систем для выявления M.tuberculosis в биологических образцах было проведено на 51 образце мокроты от больных туберкулезом легких.
Таблица№ 1
Сравнительные результаты выявления M.tuberculosis из образцов мокроты микробиологическими методами и тремя PCR тест-системами._
положительные результаты
БК посев PCR
№1 №2 №3
абс % абс % абс % абс % абс %
N 32 62,7± 3,4 35 68,6t 3,5 34 66,6± 3,5 35 68,6± 3,5 46 90,1± 40
2 пол. пол. — ... пол.
1 пол. — — ... пол.
туберкулез легких п-51 1 пол. — пол. пол. пол.
28 пол. пол. пол. пол. пол.
5 ... пол. пол. пол. пол.
1 — ... — пол. пол.
8 — — — ... пол.
5 — — — — -
ХНЗЛ 17 ... — ...
Таблица №1 иллюстрирует, что все тест-системы имели различную
чувствительность, так как число положительных реакций у больных туберкулезом варьировало от 66,6% до 90,1%, что может быть связано с недостаточной доработкой этапа амплификации в тест-системах № 1 и № 2.
Таким образом, для решения проблем, связанных с обеспечением чувствительности PCR, были выбраны способы обработки мокроты и выделения ДНК. Обработка мокроты трехзамещенным фосфатом натрия не снижала чувствительности PCR, и после выделения ДНК гуанидином из мокроты были получены наилучшие результаты PCR в режиме Real-time. Показано, что в мокроте со слизью, гноем и кровью присутствует большое количество субстанций, ингибирующих PCR, что приводило к получению ложноотрицательных результатов. Было определено, что для выделения ДНК объем пробы мокроты не должен превышать 300 мкл. 3. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза легких
Для оценки роли PCR в комплексных бактериологических исследованиях и выявления M. tuberculosis в диагностическом материале проведены исследования 372 образцов мокроты методами PCR, бактериоскопии и посева.
Таблица № 2
Сравнительные результаты комплексного бактериологического _исследования мокроты больных туберкулезом._
методы
I
распространенные процессы N=40
II
ограниченные процессы N=309
III
неспецифические заболевания легких N=24
положительные результаты
абс
%
абс
%
абс
%
А
бактериоскопия
17
43,6±7,9
61
19,8±2,3
отр.
В
посев
21
53,8±8,0
78
25,2±2,5
отр.
С PCR
35
89,7±4,9
211
68,3±2,6
отр.
Pl(A,B-C) <0.001 (=3(16.943, v=2; Р=0.000) Рп(А,в^ <0-001(^81.871, v=2;P=0.000)
Полученные результаты продемонстрировали (таблица 2), что метод PCR повышает чувствительность диагностики туберкулеза, особенно в группе больных с ограниченными туберкулезными процессами в легких и отрицательными результатами бактериоскопии и посева.
В мокроте больных с распространенными туберкулезными процессами в легких при исследовании методом бактериоскопии 43.6% образцов, при посеве в 53.8% образцов, а после исследования методом PCR в 89.7% образцов был получен положительный результат. Статистические различия в числе положительных результатов традиционных бактериологических (микроскопия и посев) и результатах PCR были достоверны (Р<0.05).
В образцах мокроты от больных с ограниченными туберкулезными процессами в легких чувствительность исследованных методов также достоверно отличалась (Р<0.05), положительные результаты были получены при исследовании методом бактериоскопии в 19.7% образцах мокроты, при посеве в 25.2% образцах, а при использовании метода PCR в 68.3% образцов был получен положительный результат.
Эффективность применяемых методов лабораторной диагностики для образцов мокроты от 372 больных с разными формами туберкулеза легких была оценена с использованием формулы [Griner H.F. et al. - 1981].
-11-
п + 0/п + лп+ло+о -100%
Где: П - число положительных результатов у больных туберкулезом, О - число отрицательных результатов у больных туберкулезом, ЛП - ложно положительные, ЛО - ложно отрицательные.
Таблица № 3
Эффективность диагностики туберкулеза легких методами
люминесцентной
бактериоскопии, посева и PCR эффективность
форма туберкулеза
N
по методу исследования
БК посе в PCR PCR-БК PCR-посев
диссеминированный 11 74,2 71,4 85,7 11,5 14,3
фиброзно-кавернозный туберкулез 29 73,6 83,0 100, 0 26,4 17,0
инфильтративный 142 37,3 50,6 81,3 44,0 30,7
очаговый 56 45,0 40,0 78,7 33,7 38,7
первичный туберкулезный комплекс 12 69,4 66,4 80,5 11,1 14,1
туберкулез внутригрудных лимфатических узлов 77 29,7 27,7 63,3 33,6 35,6
плеврит туберкулезной этиологии 11 77,1 80,0 85,7 8,6 5,7
туберкулема 11 71,4 74,2 85,7 14,3 11,5
сравнительная
При сравнении эффективности методов люминесцентной бактериоскопии, посева и PCR мокроты при разных формах туберкулеза легких (таблица 3) эффективность методов диагностики была различной, наибольшая диагностическая значимость PCR по сравнению с традиционными методами была получена для больных с инфильтративным, очаговым и туберкулезом внутригрудных лимфатических узлов.
Известно, что среди больных различных возрастных групп степень туберкулезного поражения различна. Поэтому был проведен анализ результатов традиционных микробиологических методов и PCR в образцах мокроты от 76 детей в возрасте от 3 до 12 лет, 89 подростков от 12 до 18 лет и 184 взрослых пациентов старше 18 лет.
Результаты PCR во всех группах статистически достоверно отличались от результатов бактериоскопии и посева (Р<0.05). Было показано, что для группы
детей и подростков, больных туберкулезом легких, применение метода PCR было наиболее оправданно, так как повышало число положительных результатов у детей и подростков с 1,3% и 19,1% при микроскопии и до 51,3% у детей и до 70,9% у подростков после PCR.
При оценке целесообразности использования метода PCR у больных туберкулезом легких в процессе лечения было проведено исследование 235 образцов мокроты в динамике. Мокроту исследовали методом люминесцентной бактериоскопии, посева и PCR до начала и в процессе лечения (через 3, 6, 9 и 11 месяцев).
Таблица № 4
Сравнительные результаты обнаружения Мtuberculosis туберкулеза в _мокроте больных в процессе лечения._
положительные результаты
группы сроки бактериоскопия посев PCR
А В С
абс % абс. % абс %
До лечения 9 100±10.0 9 100±10.0 9 100±10.0
I 3 мес. 4 44.4±16.6 5 55.5±16.6 6 66.7±15.7
(N=9) бмес. 3 33.3±15.7 2 22.2±13.9 6 66.7±15.7
9 мес. — — 1 11.1±10.5
11 мес. — — 1 11.1±10.5
до лечения 6 46.15±13.8 7 53.8±13.8 13 100±8.3
II 3 мес. 4 30.8±12.8 3 23.Ш1.7 9 69.2±12.8
(N=13) бмес. 3 23.Ш1.7 1 23.Ш1.7 9 69.2±12.8
9 мес. — — — — 2 15.4±10.0
11 мес. — — — — —
ДО лечения — ... ... — 24 100±6.1
III (N=24) 3 мес. — — — — 14 58.3±10.1
бмес. — ... ... — 13 54.2±10.2
9 мес. ... — ... — 1 4.2±4.1
11 мес. ... ... — ... 1 4.2±4.1
На основе полученных до начала лечения результатов больные были
разделены на три группы (таблица 4). Группа I - пациенты, мокрота у которых была положительной по результатам бактериоскопии посева и PCR. В группу II включены пациенты, мокрота у которых была положительной по результатам
посева или бактериоскопии, результаты PCR до начала лечения у всех больных были положительными. Группу III составляли пациенты, мокрота от которых была положительной только по результатам PCR.
В группе I не было выявлено достоверных отличий в числе положительных результатов, полученных методами бактериоскопии, посева и PCR при обследовании пациентов, как до лечения, так и после 3, 6, 9 и И месяцев лечения (Р>0.05). В данном случае применение традиционных микробиологических методов оказалось достаточным для контроля эффективности лечения.
У больных из группы II до лечения, через 3 и 6 месяцев число положительных результатов PCR достоверно преобладало над положительными результатами бактериоскопии и посева (Р<0.05), и только к 9-му месяцу лечения эта разница нивелировалась (Р>0.05).
Для больных группы III было показано, что число положительных результатов PCR по сравнению с традиционными бактериологическими исследованиями преобладало (Р<0.001). Достоверная разница сохранялась через 3 и 6 месяцев лечения, несмотря на то, что число больных с положительными результатами PCR снизилось более чем в 2 раза. Различия между результатами PCR и бактериологическими данными исчезли к 9 и 11 месяцам лечения (Р>0.05), так как к этому сроку в результате эффективной терапии произошло излечивание практически всех больных, кроме одного. Как показало исследование, именно для этой группы больных использование метода PCR особенно необходимо, так как только по результатам PCR можно было подтвердить наличие возбудителя и проследить за эффективностью проводимого лечения.
Таким образом, в исследовании проведена оценка контроля эффективности антимикобактериальной терапии с использованием, как традиционных бактериологических методов, так и метода PCR, позволяющего выявлять ДНК M.tuberculosis, и выделена группа больных, для которых использование метода PCR является целесообразным.
Как следует из предыдущих исследований, несмотря на чувствительность полимеразной цепной реакции, не у всех больных туберкулезом результаты
PCR были положительными.
Для повышения информативности реакции для диагностики туберкулеза легких нами был применен подход, сочетающий PCR-анализ с предварительным культивированием мокроты на жидких питательных средах (таблица 5). Были использованы среды, применяемые в коммерческих системах ВАСТЕС-460 и BBL MGIT.
В качестве диагностического материала использовали мокроту от 18 больных туберкулезом и 10 больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких. До культивирования мокроты только у 10 больных результаты PCR были положительными. Для дальнейшего исследования пробы на PCR асептически отбирали через день из пробирок BBL MGIT в течение всего периода культивирования.
Таблица № 5
Результаты выявления M.tuberculosis в образцах мокроты._
положительные результаты
I II III IV
PCR первичное ВАСТЕС MGIT PCR после подроста на MGIT
абс % абс % сутки абс % сутки абс % сутки
А PCR+ п=10 10 100 5 50,0 ±6.9 6-18 6 60,0 ±7.5 10-27 10 100 ±9.5 1
В PCR-п=18 0 — 3 16,6 13.0 15-28 4 22.2 ±3.5 18-46 10 55,5± 5.4 3-11
контроль п=10 0 — 0 — 0 — — 0 -- —
Сравнение времени получения положительных результатов показало, что в системе ВАСТЕС 460 рост микобактерий регистрировался, начиная с 6 дня и по 28 день с начала культивирования. В системе BBL MGIT рост регистрировался с 10 по 46 день от момента посева. Методом PCR ДНК микобактерий выявлялась с 3 по 11 день со дня посева.
Исследование показало, что у больных с первично отрицательными результатами PCR в системе ВАСТЕС 460 рост микобактерий был зарегистрирован в 3 образцах мокроты в течение 15-28 суток. В системе BBL MGIT флюоресценция наблюдалась в 4 образцах по прошествии 18-24 суток, а в одном образце на 46 день после посева. После подроста на среде 10 образцов были PCR-положительными уже на 3-11 сутки после посева. Число
положительных результатов PCR было достоверно выше (Р>0.05) числа положительных результатов при использовании диагностических систем BACTEC 460 И BBLMGIT.
Использование культурального посева на жидкую питательную среду позволило выявить возбудителя туберкулеза дополнительно в 55.5% образцах и сократить сроки получения результатов по сравнению с автоматизированными диагностическими системами до 3-11 суток.
Подводя итоги данному разделу исследований можно заключить, что:
1) В мокроте у больных туберкулезом с положительными результатами бактериоскопии и посева результаты PCR были также положительными. В мокроте у больных с отрицательными результатами бактериоскопии и посева в 40.6% образцов результаты PCR были положительными. Это свидетельствует о высокой чувствительности PCR метода.
2) Наибольшую информативность метод PCR имел для групп пациентов с ограниченными туберкулезными процессами в легких, которые, как правило, встречаются чаще у детей и подростков.
3) Оценку эффективности лечения целесообразно использовать по комплексу микробиологических методов, включающих бактериоскопию, посев и PCR. Особое значение приобретает метод PCR для оценки эффективности курса лечения больных с отрицательными результатами бактериоскопии и посева.
4. Использование различных образцов диагностического материала у больных туберкулезом легких.
Так как в некоторых случаях при туберкулезе легких адекватный диагностический материал не всегда доступен для исследования, целью этого раздела было выяснить эффективность диагностики туберкулеза с использованием метода PCR в результате обнаружения ДНК M.tuberculosis в нереспираторных образцах. При этом особое внимание было уделено подготовке проб и выделения ДНК из этих образцов.
Для выбора способа обработки биоптатов тканей, исследовали селезенку и легкие от мышей, зараженных M.tuberculosis H37Rv, и операционный материал (легкое) от больного активным туберкулезом.
Как показали результаты эксперимента, для получения положительных результатов PCR в образцах биоптатов, требуется использование буфера с протеолитическим ферментом протеиназой-К, который обеспечивает более полное разрушение тканей, так как сочетает глубокий лизис на основе гидролиза бежов. Последующую очистку пробы от ингибиторов реакции PCR обеспечивает применяемый способ выделения ДНК с гуанидином и диатомовой землей.
Для определения эффективности использования PCR с диагностическим материалом, полученным во время хирургического вмешательства, было исследовано 36 образцов. Образцы казеозной ткани легкого и участков ткани легкого от 10 больных туберкулезом и 16 образцов лимфатических узлов. Каждая проба исследовалась методом посева и PCR.
При посеве ткани казеоза 4 (40%) образца были положительны, при исследовании их методом PCR во всех 10 (100%) исследованных образцах результаты были положительными. Результаты были статистически достоверны (Р<0.05).
Из 10 образцов ткани легкого только 2 (20%) были положительными после посева, а при использовании метода PCR в 8 (80%) образцах была обнаружена ДНК M.tuberculosis. Полученные отличия имели высокую степень статистической достоверности (Р<0.001).
Среди 16 образцов лимфоузлов после посева ни один не был положительным. Однако применение метода PCR в 10 (62.5%) образцах позволило получить положительный резулыаг.
Таким образом, исследование образцов лимфатических узлов и тканей легких с высоким уровнем статистических различий (Р<0.001) подтверждает, что использование метода PCR является вполне оправданным, так как повышает чувствительность диагностики и существенно сокращает сроки получения результата исследования.
При отработке способов выделения ДНК из бронхоальвеолярных смывов, наиболее часто получаемых от пациентов с малыми формами туберкулезного поражения и скудным выделением мокроты, методом люминесцентной бактериоскопии и посева, а также методом PCR, было исследовано 52 образца.
Исследование показало, число положительных результатов PCR в 22 (42.3%) образцах БАС при лизисе гуанидином было выше числа положительных результатов, полученных при лизисе ТТЕ и очистке фенол-хлороформом -13 (25%). Кроме того, было показано, что применение PCR для образцов БАС с высокой степенью достоверности (Р<0.001) превышает число положительных результатов бактериоскопии 7.6% и посева 13,46%.
Способы предварительной обработки экссудатов исследовались на 31 образце экссудата от пациентов с верифицированным диагнозом туберкулез легких. Анализ полученных результатов показал, что число положительных результатов PCR в образцах экссудата (74.1%), отмытых деионизированной водой, было достоверно выше числа положительных результатов PCR в образцах экссудата (41.9%), не подвергавшихся предварительной отмывке (Р<0.05). Таким образом, предварительная обработка экссудата и отмывка его от ингибиторов реакции PCR существенно повысила чувствительность анализа с 41.9% до 74.1%.
Число положительных результатов PCR (74.1%.) с высокой степенью достоверности (РО.001) преобладало над числом положительных результатов бактериоскопии (6.4%) и посева (9.6%).
Исследование 84 образцов осадка суточной мочи от больных с верифицированным диагнозом туберкулез легких показало, что в образцах мочи, не подвергавшихся предварительной обработке, ДНК M.tuberculosis была обнаружена только в 22.6% образцов. Причем статистически достоверных различий по сравнению с бактериоскопией и посевом для данной группы образцов получено не было (Р>0.05), что иллюстрирует низкую эффективность этого способа обработки образцов.
Среди группы образцов, прогретых и отмытых деионизированной водой, 42.8% дали положительный результат. Были получены статистически значимые различия (Р<0.05) между числом положительных результатов PCR и числом положительных результатов бактериоскопии и посева. Таким образом, прогревание и отмывка осадка суточной мочи деионизированной водой от солей, являющихся ингибиторами реакции, существенно повысило чувствительность реакций PCR с 22.6% до 42.8%.
При использовании крови в качестве диагностического
материала был проведен эксперимент по заражению лабораторных мышей M.tuberculosis H37Rv и выявлению ДНК микобактерий в крови методом PCR. Параллельно у животных проводили посев паренхиматозных органов.
Результаты эксперимента показали, что на 20 день после заражения посев паренхиматозных органов на Mtuberculosis дал положительный результат у всех мышей. Результаты исследования паренхиматозных органов методом PCR также были положительными.
Для освобождения образцов крови от гемоглобина, сильного ингибитора PCR, использовали два способа. В одном случае образец отмывали деионизированной водой, во втором - использовали лизис ТТЕ буфером. Результаты показали (Рис 2), что у всех зараженных мышей в крови методом PCR была обнаружена ДНК M.tuberculosis. Причем, как при обработке крови деионизированной водой, так и ТТЕ буфером.
800
циклы амплификации ТЕ буфер -«-Н20
Рис. 2 Результаты PCR Real-time в крови, отмытой деионизированной водой и ТТЕ буфером, у мышей, зараженных M.tuberculosis H37Rv.
Анализ кинетических кривых показал, что в образцах крови, отмытых как деионизированной водой так ТТЕ - буфером начало экспоненциальной стадии фиксировалось приблизительно одновременно.
Однако, было отмечено, что при обработке клеток крови деионизированной водой уровень относительных единиц флюоресценции колебался в диапазоне 500-700 RFU и был значительно выше, чем в тех же
образцах крови после обработки ТТЕ буфером (100-350 RPU). Поэтому при дальнейших исследованиях кровь отмывали деионизированной водой.
Таким образом, в эксперименте было показано, что в крови зараженных M.tuberculosis H37Rv мышей методом PCR обнаруживается ДНК M. tuberculosis, что позволило заключить, что кровь может быть использована в качестве диагностического материала.
Для оценки результативности использования крови в качестве диагностического материала была исследована кровь и мокрота от 51 пациента с верифицированным диагнозом туберкулеза легких и с положительными результатами PCR в мокроте.
Как следует из результатов исследования, положительный результат PCR в крови был получен только в 47.0% образцов. Это связано с особенностями персистенции M.tuberculosis в организме и означает, что нельзя использовать кровь как единственный диагностический материал и полностью заменять ей материал, взятый из очага поражения.
Анализ результатов PCR и бактериоскопии в 372 образцах крови от больных туберкулезом легких, не выделяющих мокроту, показал, что положительные результаты бактериоскопического исследования в крови были положительными в 29 (7.8%), a PCR в 126 (33.8%) образцах крови. Что достоверно повысило чувствительность анализа на микобактерии туберкулеза при исследовании крови (Р<0.001).
Таким образом, исследование показало, что в группе пациентов с ограниченными туберкулезными процессами в легких, не выделяющих мокроту, использование крови для исследования методом PCR в качестве диагностического материала способствует постановке диагноза.
С целью повышения эффективности PCR у 43 подростков с ограниченными туберкулезными процессами, было проведено выявление ДНК M.tuberculosis в различных образцах диагностического материала, взятого от одного и того же больного туберкулезом.
Рис 3 Результаты PCR при одновременном определении ДНК M.tuberculosis в крови, мокроте и БАС у 43 больных туберкулезом.
Было показано, что только у 23 2% пациентов для исследования можно было взять какой-либо один диагностический материал (рис 3) Для большинства пациентов принципиальным являлся одновременный анализ разных диагностических образцов, когда положительные результаты могли быть получены в каком-то одном или двух из них.
Полученные результаты показали, что только в крови методом PCR ДНК M.tuberculosis была обнаружена у 7 (16.27%) пациентов Только в мокроте у 2 (4.65%) пациентов, только в бронхоальвеолярном смыве у 2 (4.65%) пациентов Одновременно в крови и бронхоальвеолярном смыве результаты положительны только у 1 пациента (2.32%), в БАС и мокроте у 8 (18.60%) пациентов, и у 10 (23.25%) пациентов результаты PCR одновременно во всех трех образцах были положительными А у 13 (30.23%) пациентов ни в крови, ни в мокроте, ни в БАС ДНК Mtuberculosis не была обнаружена Эти результаты означают, что только у 23.2% пациентов для исследования можно было взять какой-либо один диагностический материал
Заключая этот раздел работы, можно подчеркнуть, что для каждого диагностического материала существенным является способ подготовки проб и способ выделения ДНК. При работе с кровью и экссудатами освобождение
образцов от гемоглобина достаточно проводить методом
последовательной отмывки деионизированной водой. Предварительная отмывка осадка суточной мочи деионизированной водой от солей, являющихся ингибиторами PCR, существенно повышает чувствительность реакции. Была подтверждена возможность получения положительных результатов по обнаружению ДНК M.tuberculosis в крови и биоптатах методом PCR. Для подготовки проб биопсийного материала необходима отмывка ТТЕ буфером, если образец имеет следы крови, кроме того, для глубокого лизиса биоптат необходимо обработать протеиназой К.
У пациентов с ограниченными туберкулезными процессами в легких принципиальным являлся одновременный анализ разных образцов диагностического материала, когда положительные результаты могли быть получены в каком-либо одном или двух из них. ВЫВОДЫ:
1. Испытанные амплификационные PCR тест-систем позволяют выявлять от 5.35x10"8 до 5.35х10"'мкг ДНК, что соответствует 2-40 клеткам М. tuberculosis.
2. Лизис гуанидином с последующей сорбцией ДНК на диатомовой земле приводит к более полному выделению ДНК M.tuberculosis, а различные способы подготовки проб разного диагностического материала снижают влияние ингибиторов амплификации.
3. Эффективность PCR для диагностики туберкулеза легких превышает эффективность бактериоскопии и посева и составляет при диссеминированном туберкулезе 85.7%, фиброзно-кавернозном туберкулезе - 100%, инфильтративном - 81.3%, очаговом - 78.7%, плеврите - 85.7%, туберкулеме -85.7%, первичном туберкулезном комплексе - 80.5%, туберкулезе внутригрудных лимфоузлов - 63.3%.
4. Метод PCR является определяющим для лабораторного контроля эффективности противотуберкулезной химиотерапии у больных туберкулезом легких с отрицательными результатами бактериоскопии и посева, так как у 52.1% больных динамика абациллирования мокроты была установлена по результатам PCR.
-225. У 100% животных с экспериментальным туберкулезом и у 47 % больных с тяжелыми туберкулезными процессами в легких, а также у 33,8% больных с ограниченными туберкулезными процессами в легких методом PCR в крови выявлялась ДНК M.tuberculosis, что является основанием для использования крови в качестве дополнительного диагностического материала при выявлении туберкулеза.
6. Предварительное культивирование мокроты, а также одновременное исследование различных образцов: мокроты, крови, мочи, бронхоальвеолярных смывов и экссудатов увеличивало число положительных результатов PCR у абациллярных больных, что повышало эффективность диагностики туберкулеза легких.
Практическая значимость.
Выбраны способы подготовки проб, повышающие чувствительность полимеразной цепной реакции при выявлении ДНК MJuberculosis в различных диагностических образцах.
Показано что гуанидин как универсальный лизирующий агент способствует наиболее полному выходу ДНК M.tuberculosis, как из культур, так и любых диагностических образцов.
Применение PCR при диагностике и оценке эффективности химиотерапии туберкулеза целесообразно только для групп больных с отрицательными результатами традиционных бактериологических методов.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ДИССЕРТАЦИИ
1. Голышевская В.И., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Ларионова Е.Е. Современная лабораторная диагностика туберкулеза органов дыхания (обзор литературы) // Пульмонология, 1998г. №4
2. Голышевская В.И., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Ларионова Е.Е. Денисова Т.С., Говорун В.М., Бочкарев Е.Г. Применение ПЦР для диагностики туберкулеза легких // II Всероссийская конференция «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» Москва, 1998, 93 - 94.
3. Голышевская В.И., Шашкина Е.Ф., Коваленко О.О., Ларионова Е.Е. Фадеева Н.И. Лабораторная диагностика туберкулеза на современном этапе. // Тезисы IV Всероссийского конгресса «Человек и лекарство» 1997,191.
-234. Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. К вопросу о роли ПЦР-анализа в оценке эффективности противотуберкулезной терапии // Сборник материалов научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы туберкулеза и других гранулематозных заболеваний» Москва, 2001, 28-29
5. Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Васильева ИА, Черноусова Л.Н., Голышевская В. И. Сравнительная характеристика молекулярных и микробиологических методов контроля химиотерапии у впервые выявленных больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза. №6 2004, 37-41
6. Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Масленникова Ю.В., Коваленко О.О., Черноусова Л.Н. Применение ПНР для обнаружения M.tuberculosis у олигобациллярных больных после подращивания диагностического материала. //I национальный конгресс «Клиническая иммунология, аллергология и иммунореабилитация» Казахстан, Алмааты 1999, 114
7. Маренина Е.А., Овсянкина Е.С., Ларионова Е.Е., Калина МА, Демьяненко Н.В., Маркина А.И., Лебедева ГА Значение молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования в группе риска и у больных туберкулезом детей // Проблемы туберкулеза 2003, N 3, 30-33
8. Маренина Е.А., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Андреевская С.Н., Лебедева ГА, Маркина А.И. Роль ПНР в раннем выявлении, оценке течения и прогнозировании туберкулеза у детей.//Сб.тез. 4-й Всероссийская научно-практической конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний» 2002, 125-127.
9. Маренина Е.А., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Е. Результативность ПНР -диагностики у детей с внутригрудным туберкулезом // Материалы конференции поев. 75 летию МНПЦ борьбы с туберкулезом 2001 г.
10. Маренина Е.А., Овсянкина Е.С., Ларионова Е.Е. Результаты ПЦР в крови и мокроте у детей с распространенными и ограниченными формами туберкулеза // Тезисы Всероссийского конгресса «Человек и лекарство»
11. Пузанов ВА, Корнеев А.А, Юхименко Н.В., Ларионова Е.Е. Использование крови в диагностике туберкулеза // Сборник резюме III Всероссийского съезда фтизиатров, Екатеринбург, 1997, 552.
12. Севастьянова Э.В., Ларионова Е.Е., Масленникова Ю.В., Коваленко О.О., Голышевская В.И. Эффективность выявления M.tuberculosis в
диагностическом материале с использованием традиционных и современных методов лабораторной диагностики // 9 национальный конгресс по болезням органов дыхания 1999, 122.
13. Федотова М.В., Гаврилов А.А., Шаркова Т.И., Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Качалкина М.В. Клиническое значение выделения микобактерий туберкулеза в крови для диагностики туберкулеза у детей раннего и дошкольного возраста // Медицинский научный и учебно - методический журнал 2001, N1,90-96
14. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР - анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза, 2001 г, № 3,58-60
15. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Денисова Т.С., Генерозов Э.В., Бочкарев Е.Г., Голышевская В.И. Повышение эффективности диагностики абациллярного туберкулеза при сочетании ПЦР-анализа с культуральным посевом. // 3 Всероссийская НПК «Генодиагностика», 2000.
16. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Масленникова Ю.В. Обнаружение M.tuberculosis в мокроте больных с ограниченными формами туберкулеза легких методом ПЦР // «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы» Научные труды и материалы конференции, посвященной памяти М.М.Авербаха (к 75-летию со дня рождения), 2000, 89-90
17. Черноусова Л.Н., Николаева Г.М., Смирнова Т.Г., Савинкова С.Н., Ларионова Е.Е., Денисова Т.С., Генерозов Э.В., Бочкарев Е.Г., Говорун В.М. Определение содержания ДНК микобактерий в диагностическом материале от больных туберкулезом легких в процессе химиотерапии. // Сб. тез. док. Зй Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине»2000, 291-292.
18. Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Ларионова Е.Е., Коваленко 0.0., Голышевская В.И. Молекулярная диагностика туберкулеза органов дыхания // Российские медицинские вести 1998г. том Ш №3, 19-24.
19. Ovsyankina Е., Marenina Е., Andreevskaya S., Larionova E., Smirnova T. Diagnostic value of polymerase chain reaction (PCR) in the management of pediatric tuberculosis. // Eur.Resp.J, 2002, v.20, suppl. 38 p. 583.
Принято к исполнению 26/12/2004 Исполнено 26/12/2004
Заказ № 531 Тираж. 70 экз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru
f
/ »
/ r
1Ь OF^ ш
r?
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ларионова, Елена Евгеньевна
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Род микобактерий.
1.2. Микробиологические методы обнаружения и идентификации 11 микобактерий.
1.3. Молекулярно-генетические методы в детекции микобактерий.
1.4. Применение ПЦР в лабораторной диагностике туберкулеза.
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34-44 2.1. Материалы. 3 4 2.2 Методы.
Глава 3 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ С 45-59 КУЛЬТУРАМИ Mycobacterium tuberculosis
3.1. Пороговая чувствительность выявления ДНК М.tuberculosis.
3.2. Выделение ДНК из культуры М.tuberculosis H37Rv.
Глава 4 УСЛОВИЯ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ 60-73 ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
4.1. Подготовка образцов мокроты.
4.2. Выбор способа выделения ДНК из мокроты.
4.3. Установление оптимального объема образцов мокроты для 66 проведения ПЦР.
4.4. Сравнительное исследование чувствительности и 68 специфичности ПЦР тест-систем.
Глава 5 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В 74-91 ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ
5.1. Роль ПЦР в выявлении возбудителя в мокроте больных 74 разными формами туберкулеза легких.
5.2. Обнаружение ДНК M.tuberculosis у больных туберкулезом 83 легких в процессе лечения.
5.3. Повышение результативности ПЦР при дополнительном 87 культивировании мокроты.
Глава 6 ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ ПЦР 92-108 РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦОВ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ
6.1. Исследование биоптатов тканей.
6.2. Бронхоальвеолярные смывы, плевральные экссудаты и моча.
6.3. Использование крови в качестве диагностического материала.
6.4. Повышение результативности при использовании комплекса 105 диагностических образцов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 109
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Информативность полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза легких"
Актуальность исследования.
Туберкулез остается широко распространенным заболеванием. Ежегодно в мире регистрируется два-три миллиона новых случаев болезни, из них 10-12% составляют диссеминированные формы. Активные формы туберкулеза встречаются лишь у 0.5-1% населения земли. По данным ВОЗ за время жизни больной активным туберкулезом легких инфицирует 20 человек.
Длительное время туберкулез может протекать бессимптомно, а в ряде случаев заболевание диагностируется только после смерти. Таким образом, своевременная диагностика заболевания представляется весьма актуальной. Основным критерием лабораторной диагностики туберкулеза остается выявление возбудителя - Mycobacterium tuberculosis в диагностическом материале.
Традиционные микробиологические методы выявления возбудителя не всегда позволяют подтвердить диагноз туберкулез. Метод люминесцентной бактериоскопии и посева на питательные среды обладают низкой чувствительностью и обнаруживают М.tuberculosis в среднем лишь у 50-60% больных активным туберкулезом легких, в связи с этим внедрение методов быстрого и специфичного выявления М. tuberculosis может способствовать разрешению проблем обнаружения М tuberculosis. [Оттен Т.Ф., 1997].
В последнее десятилетие широкое распространение получили методы диагностики инфекционных заболеваний на основе выявления специфической ДНК или РНК возбудителя. Об этом свидетельствуют многочисленные исследования. [Gyllensten U.B., Cui X. et al., 1988; Cheab F.F., Kan Y.W. et al., 1989; Boddinghaus B. and Bottger E.C. et al., 1990; Ehlers S. and Hahn H. et al., 1994; Abu Al-Soud W., Radstrom P. et al., 1998; Honore-Bouakline S., and Herrmann J.L. et al., 2003].
В связи с этим внедрение в практику новых молекулярно-генетических методов исследования будет способствовать проведению диагностики туберкулеза в максимально короткие сроки и благодаря этому уменьшит уровень первичного инфицирования за счет раннего выявления больных и правильно организованной химиотерапии.
Поэтому целью настоящего исследования явилась оценка эффективности метода полимеразной цепной реакции для диагностики туберкулеза легких при использовании различного диагностического материала и определение места ПЦР в комплексе диагностических лабораторных исследований.
Задачи исследования;
• Оценить специфичность и аналитическую чувствительность ПЦР при выявлении ДНК М. tuberculosis с помощью различных отечественных тест-систем.
• Оптимизировать условия этапа подготовки проб и экстракции ДНК из различного диагностического материала от больных туберкулезом легких.
• Определить эффективность ПЦР в сравнении с традиционными микробиологическими методами люминесцентной бактериоскопии и культурального посева при диагностике различных форм туберкулеза легких.
• Изучить возможность использования ПЦР для контроля эффективности противотуберкулезной химиотерапии.
• Проанализировать возможность использования крови от больных туберкулезом легких для выявления ДНК M.tuberculosis методом ПЦР.
Научная новизна.
Наибольшая диагностическая значимость результатов ПЦР по сравнению с бактериоскопией и посевом выявлена для больных с ограниченными туберкулезными поражениями, такими как туберкулез внутригрудных лимфатических узлов, инфильтративный и очаговый туберкулез легких. Впервые показана диагностическая ценность ПЦР при выявлении M.tuberculosis из крови у больных туберкулезом легких.
Основные положения, выносимые на защиту.
• Информативность метода ПЦР для диагностики туберкулеза зависит от формы и распространенности туберкулезного процесса в легких, от способа предварительной обработки диагностических образцов и полноты выделения ДНК.
• Результаты ПЦР могут служить лабораторным критерием для оценки эффективности проводимой терапии у больных туберкулезом легких с отрицательными результатами бактериоскопии и культурального посева.
• Диагностическая ценность результатов ПЦР для больных туберкулезом легких увеличивается при предварительном культивировании мокроты, и использовании в качестве диагностического материала крови, мочи, плевральных экссудатов и биоптатов различных тканей.
Практическая значимость.
• Выбраны способы подготовки проб, повышающие чувствительность полимеразной цепной реакции при выявлении ДНК М. tuberculosis в различных диагностических образцах.
• Показано, что гуанидин как универсальный лизирующий агент способствует наиболее полному выходу ДНК М. tuberculosis, как из культур, так и любых диагностических образцов.
• Применение ПЦР при диагностике и оценке эффективности химиотерапии туберкулеза целесообразно только для групп больных с отрицательными результатами традиционных бактериологических методов.
Внедрение в практику.
Методические подходы, применяемые для повышения информативности результатов ПЦР, внедрены в работу отдела микробиологии ГУ ЦНИИТ РАМН.
Результаты диссертации используются при чтении цикла лекций в учебном центре ГУ ЦНИИТ РАМН для аспирантов и ординаторов и в курсе постдипломного образования для врачей и лаборантов по специальности микробиологическая диагностика туберкулеза легких.
Апробация диссертационного исследования, публикации. Основные положения диссертации представлены на 3 съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров (Екатеринбург, 1997), на II, III и IV Всероссийских конференциях "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний", (Москва, 1998, 2000, 2002), на IV и VII Всероссийском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997, 2002), на симпозиуме «Иммунодиагностика и иммунореабилитация при лепре, туберкулезе и других хронических заболеваниях» (Астрахань, 1998), на 9 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), на национальном конгрессе «Клинической иммунологии, аллергологии и иммунореабилитации» (Алма-Аты, 1999), на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы туберкулеза и других гранул ематозных заболеваний» (Москва, 2001), на заседании секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002, 2003).
Диссертационное исследование апробировано на совместном заседании отдела микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (30.06.2004 г.) По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ. Раздел 5.2. главы 5 выполнен совместно с д.м.н. Васильевой И.А. Раздел 5.3. главы 5 выполнен совместно с к.т.н. Севастьяновой Э.В. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 35 таблицами. Список литературы содержит 29 отечественных и 171 зарубежных источников.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ларионова, Елена Евгеньевна
ВЫВОДЫ:
1. Испытанные амплификационные ПЦР тест-систем позволяют выявлять от
7 9
1.07x10" до 5.35x10" мкг ДНК, что соответствует 2-40 клеткам M.tuberculosis.
2. Лизис гуанидином с последующей сорбцией ДНК на диатомовой земле приводит к более полному выделению ДНК M.tuberculosis, а адекватно выбранный метод пробоподготовки для различных видов клинического материала позволяет снизить содержание ингибиторов в образцах ДНК.
3. Эффективность ПЦР для диагностики туберкулеза легких превышает эффективность бактериоскопии и посева и составляет при диссеминированном туберкулезе 85.7%, фиброзно-кавернозном туберкулезе -100%, инфильтративном - 81.3%, очаговом - 78.7%, плеврите - 85.7%, туберкулеме - 85.7%, первичном туберкулезном комплексе - 80.5%, туберкулезе внутригрудных лимфоузлов - 63.3%.
4. Метод ПЦР является определяющим для лабораторного контроля эффективности противотуберкулезной химиотерапии у больных туберкулезом легких с отрицательными результатами бактериоскопии и посева, так как у 52.1% больных динамика абациллирования мокроты была установлена только по результатам ПЦР.
5. У 100% животных с экспериментальным туберкулезом и у 47 % больных с тяжелыми туберкулезными процессами в легких, а также у 33.8% больных с ограниченными туберкулезными процессами в легких методом ПЦР в крови выявлялась ДНК M.tuberculosis, что является основанием для использования крови в качестве дополнительного диагностического материала при выявлении туберкулеза.
6. Предварительное культивирование мокроты, а также одновременное исследование различных образцов: мокроты, крови, мочи, бронхоальвеолярных смывов и экссудатов увеличивало число положительных результатов ПЦР у абациллярных больных, что повышало эффективность диагностики туберкулеза легких.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:
1. Для повышения значимости ПЦР при диагностике туберкулеза легких необходимо диагностический материал подвергать адекватной подготовке перед выделением ДНК.
2. При постановке ПЦР с диагностическим материалом, содержащим M.tuberculosis, для лизиса клеток можно использовать гуанидиновый метод.
3. Для повышения результативности ПЦР у больных туберкулезом легких с отрицательными результатами бактериоскопии и посева необходимо кратковременное культивирование мокроты на жидких питательных средах для последующего исследования методом ПЦР.
4. У больных туберкулезом с ограниченными процессами в легких для исследования методом ПЦР необходимо одновременно использовать комплекс диагностических образцов, таких, как кровь, мочу, бронхоальвеолярные смывы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ларионова, Елена Евгеньевна, Москва
1. Андреевская С.Н. Генетическая вариабельность M.tuberculosis семейства W. Конференция молодых ученых. Актуальные вопросы фтизиопульмонологии // М., 2003. - стр. 6-8
2. Биргер М.О. Руководство по микробиологическим методам // М., Медицина., 1982. - стр. 80.
3. Барри Блум Р. Туберкулез патогенез, защита, контроль // Москва. Медицина. 2002
4. Бочкарев Е.Г. Актуальные вопросы генодиагностики туберкулеза. // Иммунопатология, аллергология, инфектология 2000 - № 1- стр. 92-96
5. Вейсфейлер Ж.Г. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии // Будапешт. Венгрия 1975
6. Вишневский Б.И., Оттен Т.Ф. Актуальные вопросы современной микобактериологии // Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем.- СПб.- 1998.- стр. 21-23
7. Владимирский М.А., Шипина Л.К. Молекулярно-биологические методы определения возбудителя туберкулеза // Реферативный сборник. Туберкулез. 1997.- № 2. - стр. 1-5
8. Голышевская В.И. Корнеев А.А., Черноусова Л.Н. Биологическая характеристика M.tuberculosis и трудности микробиологической диагностики туберкулеза // Пробл.Туб. 1995. - 2. - стр. 30-32
9. Голышевская В.И., Корнеев А. А., Черноусова Л.Н. Микробиологическая диагностика туберкулеза // Вестн.Рос.Акад.наук. 1995.-7. - стр. 16-18
10. Голышевская В.И., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф. и др. Применение ПЦР для диагностики туберкулеза легких // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. М., - 1998. - стр. 93-94
11. Демкин В.В., Скотникова О.И., Николаева Н.П. и др. Эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса тест-системой, основанной на использовании принципа nested ПЦР // Генодиагностика в современной медицине. М., - 2000. - стр. 268 - 271
12. Журавлев В.Ю., Соловьева Т.Н., Суворов А.Н., Трес А.С. Этиологическая диагностика олиго и абациллярного туберкулеза органов дыхания // Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. -2000.-стр. 71-73
13. Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Галкина К.Ю., Мороз A.M., Иртуганова И.Д. Использование Cobas Amplicor для подтверждения результатов при выявлении M.tuberculosis с помощью ВАСТЕС 960 // материалы VII съезда фтизиатров 2003.
14. Иртуганова О. А., Смирнова Н.С., Слогоцкая JI.B и др. Автоматизированные методы культурального определения M.tuberculosis на жидких средах // Пробл.Туб.- 2001. № 3. - стр. 53-56
15. Калюк А.Н. Комплексные бактериологические исследования в диагностике туберкулеза // Туберкулез и экология- 1995. 3. стр. 28-31
16. Козулицына Т.И. Микробиологические исследования. // руководство для врачей: Туберкулез органов дыхания. М.,- 1981. стр. 136-149
17. Корнеев А.А., Пузанов В.А., Гришина Т.Д., Черноусова JI.H.
18. S и R формы М tuberculosis как проблема получения клонированных и фенотипически компетентных штаммов // Пробл.Туб.- 1996.- 2.- стр. 36-40
19. Оттен Т.Ф. Микобактериозы легких в период ухудшения эпидемической обстановки по туберкулезу // Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем. — СПб. 1998.-2.- стр. 62-63.
20. Оттен Т.Ф. Нетуберкулезные микобактерий как возбудители заболеваний человека // Материалы VII съезда Всерос. общ. эпидемиол. микробиол.и паразитол.- М.- 1997. стр. 319 - 320
21. Покровский В.И., Подзеев O.K. Медицинская микробиология // .Гэотар медицина. 1999
22. Приказ МЗ РФ "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" №109 от 21.03.2003г.
23. Смирнова Т.Г., Черноусова JI.H., Андреевская С.Н., Николаева Г.М.
24. К характеристике экспериментальной модели эндогенно-реактивированного туберкулеза: определение ДНК микобактерий в процессе химиотерапии // Пробл.Туб.- 2002.- 12. стр. 52-56
25. Стаханов В. А., Леви Д.Т., Владимирский М.А. Диагностика туберкулеза методом полимеразной цепной реакции // В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. - 2000. - с. 85-87
26. Черноусова Л.Н., Николаева Г.М., Смирнова Т.Г. и др. // Определение содержания ДНК микобактерий в диагностическом материале от больных туберкулезом легких в процессе химиотерапии // Генодиагностика в современной медицине. М. - 2000.- стр. 291 - 292
27. Черноусова Л.Н., Севастьянова Э.В. и др. // Повышение эффективности диагностики абациллярного туберкулеза при сочетании ПНР-анализа с культуральным посевом // Генодиагностика в современной медицине. М.- 2000. - стр. 290-291
28. Черноусова Л.Н., Севастьянова Э.В. и др. Обнаружение M.tuberculosis в мокроте больных с ограниченными формами туберкулеза легких методом ПЦР // Туберкулез сегодня проблемы и перспективы. - М.-2000. - стр. 89-90.
29. Abu Al-Soud W., Radstrom P. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of ПЦР-inhibiting samples. //Appl.Environ.Microbiol. 1998: -64: -3748-3753
30. Abu Al-Soud W., Radstrom P. Purification and characterization of ПЦР-inhybitory components in blood cells. // J.Clin.Microbiol. 2001: -39: -485493
31. Ales Tichopad, Anamarija Dzidic Michael W. Pfaffl. Improving quantitative real-time RT-ПЦР reproducibility by boosting primer-linked amplification efficiency // Biotechnology Letters. 2002: -24: -2053-2056
32. Ales Tichopad, Michael Dilgerl, Gerhard Schwarz and Michael W. Pfafo. Standardized determination of real-time ПЦР efficiency from a single reaction set-up // Nucleic Acids Research 2003: Vol. 31. No. 2012
33. Alugupally S., Olsson В., Larsson L. Detection of 2-eicosanol by gas chromatography mass spectrometry in sputa from patients with pulmonary mycobacterial infections. // J.Clin.Microbiol - 1993:- 31:- 1575-1578
34. Bachrach G., Colston M.J., Bercovier H. et al. A new single-copy mycobacterial plasmid, from Mycobacterium fortuitum which is compatible with the pAL5000 replicon // Microbiology. 2000. - Vol. 146. - No. 2. - P. 297-303
35. Balinda A.J.Giesendore, Jacqueline A.M., Vet, Sanjay Tyagi, Ewald J.M.G. Mensink, Frans J.M. Trijbels and Henk J.Blom. Molecular beacons: a new approach for semiautomated mutation analysis // Clinical Chemistry 1998. -44.-3.-482-486
36. Baiter M. AIDS now World's fourth biggest killer // Science. 1999. - No. 3. -P.1101 - 1102.
37. Beggs M.L., Crawford J.T., Eisenach K.D. Isolation and sequencing of the replication region of Mycobacterium avium plasmid // J.Bacteriol. 1998.-Vol. 177. - No. 17. - P. 4836-4840.
38. Beige J., Lokies J., Schaberg Т., Finckh U., Fischer M., Mauch H., Lode H., Ko.Hler B. and Rolfs A. Clinical Evaluation of a Mycobacterium tuberculosis ПЦР // Assay J.Clin.Microbiol. 1995.-p. 90-95-Vol. 33,-No. 1
39. Bennedsen J., Larsen S.O. Examination for tubercle bacilli by fluorescence microscopy. Scand. J.Resp.Dis. 1966. - V.47.-P.114-120
40. Bloom B.R., and Murray C.J.L. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer// Science 1992.-257:-1055-1064
41. Boddinghaus В., Rogall Т., Flohr H., Blocker and Bottger E.C. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. // J.Clin. Microbiol. 1990. -28:-1751-1759
42. Bonnet G., Tyagi S., Libcha A., Russel F.K. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Biophysics 1999 -Vol. 96 -p 6171-6176
43. Boom R., Sol C. and Wertheim-van Dillen P. Rapid purification of ribosomal RNAs from neutral agarose gels. // Nucleic Acids Res. 1990. -25>2195
44. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.H. Rapid and simple method for purification of nucleic acid // J.Clin.Microb. 1990. - Vol. 28. - No. 2. - P. 495-503.
45. Buck G.E., O'Hara L.C. and Summersgill J.T. Rapid, simple method for treating clinical specimens containing Mycobacterium tuberculosis to remove ДНК for polymerase chain reaction. // J.Clin. Microbiol. 1992. -30:-1331- 1334
46. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // Journal of Molecular Endocrinology 2000 25, 169-193
47. Butler W.R., Jost K.S., Kilburn J.O. Identification of mycobacteria by high-performance liquid chromatography // J.Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29.-No. 13.-P.2468-2472
48. Catanzaro A. // Diagnosis, differentiating colonization, infection, and disease. // Clin. Chest Med. 2002. 23:599-601
49. Cheab F.F., Kan Y.W. // Detection of specific DNA sequences by fluorescence amplification: a color complementation assay // Proc.Nat.Acad.Sci 1989.-Vol. 86,-No. 17.-P. 9178-9182
50. Chedore P., Jamieson F.B. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis meningitis using the Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Detect Test in a large Canadian public health laboratory // J.Tuberc. Lung Dis -2002.- 6(10): -913-919
51. Chin D.P, Yajko D.M., Hadley W.K. et al. Clinical utility of a commercial test based on the polymerase chain reaction for detecting Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens // Am.J.Respir.Crit.Care Med. 1995. -Vol. 151.-No. 8.-P. 1872-1877
52. Chiyoji A., Kazue H., Tetsuo T. Rapid Identification of the Mycobacterium tuberculosis Complex by Immunochromatographic Assay Using Anti-MPB64 Monoclonal // Antibodies Journal of Clinical Microbiology 1999 -p. 3693-3697. -No. 11
53. Cirillo, J.D., Barletta R.G., Bloom B.R., and Jacobs W.R. A novel trans-poson trap for mycobacteria: isolation and characterization of S096. // J.Bacterial. 1991.- 173.-7772-7780.
54. Clad A. et al. Evidence of labile inhibitors in the detection of Chlamydia trachomatis in cervical specimens by polymerase chain reaction. // Eur J.Clin Microbiol Infect Dis 1996.- Sep. 15(9): -p744-747
55. Clark-Curtiss, J. E., Jacobs W.R., Do-cherty M.A., Ritchie L. R. and Curtiss I.R. Molecular analysis of DNA and construction ofgenomic libraries of Mycobacterium leprae. //J.Bacterial. 1985 -161 :-p 1093-1102
56. Clarridge J. E., Shawar R.M., Shinnick T.M. and Plikaytis B.B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. // J.Clin. Microbiol. -1993.-31 >2049-2056
57. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. 1998. V.393. №6685. P.537-544
58. Dailloux M., Laurain C. Value of nucleic acid amplification methods Amplicor (Roche) and Amplified MTD (Gen-Probe) for the rapid diagnosis of tuberculosis // Ann.Biol.Clin.Paris. 1996. - Vol. 54.-P. 297-301
59. D'Amato R.F., lsemberg H.D., Hochshtein L. et al. Evaluation of the Roshe Septi-Check AFB system for the recovery of mycobacteria // J.Clin.Microbiol. 1991 - Vol. 29. - No. 15. - P. 2906-2908
60. Dar L., Sharma S.K., Bhanu N.V. et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis by polymerase chain reaction for MPB 64 gene: an evaluation in a blind study // Indian J.Chest Dis.Allied Sci. 1998. - Vol. 40.-No. l.-P. 5-16
61. Deneer H.G., Knight I. Inhibition of the polymerase chain reaction by mucolytic agents. // Clin.Chem. 1994. -40: -P 171-172
62. Dooley S.W., Jams W.R., Martone W.J. and Snider D.E. Multi-drug resistant tuberculosis. // Ann. Intern. Med. 1992 - 117: - P 257-259
63. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. Quality Control of Polymerase Chain Reaction. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. // Washington: ASM Press; 1993. p. 160 - 8
64. Ehlers S., Ignatius R., Regnath T. and Hahn H. Diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test. // J.Clin.Microbiol. 1996. -N 34:-P 2275-2279
65. Ehlers S., Pirmann M., Zaki W. and Hahn H. Evaluation of a commercial rRNA target amplification assay for detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens. Eur. // J.Clin.Microbiol. Infect. Dis. 1994. - N 13. - P827-829
66. Eiglmeier K., Pascopella L., Honort N., Jacobs W. R. and Cole S. T. An ordered collection of shuttle cosmids representing the chromosome of Mycobacterium leprae: some practical applications. // Unpublished data
67. Eisenach K.D., Cave M.D., Sifford D., Bates J.H. and Crawford J.T. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical sputum samples using a polymerase chain reaction. // Am. Rev. Respir. Dis. 1991. 144:1160-1163
68. Eriich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J.Recent advances in the polymerase chain reaction // Science. 1991. - Vol. 252. - No. 10. - P. 1643 - 1651
69. Fiallo P., Williams D.L., Chan G.P., Gillis T.P. Effects of fixation on polymerase chain reaction detection of Mycobacterium leprae. // J.Clin. Microbiol. 1992. 30: 3095-3098
70. Forbes B.A. and Hicks K.E. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in a clinical laboratory by polymerase chain reaction. //J.Clin. Microbiol. 1993. 31:1688-1694
71. Fries J.W.U., Patel R.J., Piessens W.F. and Wirth D.F. Detection of untreated mycobacteria by using polymerase chain reaction and specific ДНК probes. //J.Clin. Microbiol. 1991.29:1744-1747
72. Frothingham R., Wilson K.H. Molecular phylogeny of the Mycobacterium avium complex demonstrates clinically meaningful divisions // J.Infect.Dis. 1994.-Vol. 169. - No. 2. - P. 305-312
73. Frothingham R., Wilson K.H. Sequence-based differentiation of strains in the Mycobacterium avium complex // J.Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - No. 13.-P. 2818-2825
74. Gambof F., Manterola J.Ma. et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens, blood and other non-respiratory specimens by amplification of rRNA // Tuberc. Lung Dis 1997 1(6): 542555
75. Garcia-Quintanilla A., Garcia L., Tudo G. et al. Single-tube balanced heminested ПЦР for detecting Mycobacterium tuberculosis in smear-negative samples // J.Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38.-No. 3.-P. 1166-1169
76. Ginesu F., Pirina P., Sechi L.A. et al. Microbiological diagnosis of tuberculosis: a comparison of old and new methods // J.Chemother. 1998. Vol. Ю.-No. 4.-P. 295 -300
77. Griner H.F., Mayewski R.G., Mushlin F.Y. Selection and interpretation of diagnosis tests and procedures // Ann.Internal. Med. 1981. Vol.94.-P.555-600
78. Guilhot C., Gicquel В., Davies J.and Martin C. Isolation and analysis of IS6120, a new insertion sequence from Mycobacterium smegmatis. // Mot. Microbiol. 1992 6:107-113
79. Hance A.J., Grandchamp В., Levy-Frebault V. et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA // Mol.Microbiol. 1989. Vol. 3. - No.5. - P. 843 - 849
80. Harrington B.J. 1966 J.gen. Microbiol 45.31.
81. Honore-Bouakline S., Vincensini J.P., Giacuzzo V., Lagrange P.H., and Herrmann J.L. Rapid Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis by ПЦР: Impact of Sample Preparation and DNA Extraction // J. Clin.Microbiol., June 2003. p. 2323-2329 Vol. 41, No. 6
82. Ieven M. and Goossens H. Relevance of nucleic acid amplification techniques for diagnosis of respiratory tract infections in the clinical laboratory. //Clin. Microbiol. Rev. 1997. 10:242-256
83. Jacobs W.R., Kalpana G.V., Cirillo J.D., Pascopella L., Snapper S.B., Udani R.A., Jones W., Barletta R.G. and Bloom B.R. Genetic systems for the mycobacteria. // Methods Ensymol. 1991 204: 537-555
84. Jacobsen C.S., Rasmussen O.F. Development and application of a new method to extract bacterial DNA from soil based on separation of bacteria from soil with cation-exchange resin. // Appl.Environ.Microbiol. 1992
85. Jatana S.K., Nair M.N., Lahiri K.K., Sarin N.P. Polymerase chain reaction in the diagnosis of tuberculosis // Indian Pediatr. 2000. - Vol. 37. - No. 4.-P. 375-382
86. Jonas V., Alden M.J., Curry J. et al. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA // J.Clin.Microbiol. 1993. - Vol. 31. - No. 10. - P. 2410-2416
87. Kado C.I. and Liu S.-T. Rapid Procedure for Detection and Isolation of Large and Small Plasmids // J.Bacteriology, Mar. 1981. p. 1365-1373 Vol. 145, No. 3
88. Kafwabulula M., Ahmed K., Nagatake Т., Gotoh J., Mitarai S., Oizumi K., Zumla A. Evaluation of ПЦР-based metohods for the diagnisis of tuberculosis by identification of mycobacteria DNA in urine samples Int. J.Tuberc. Lung Dis. 2004. 6(8):732-737
89. Kaneko K., Ondera O., Miyatake T. and Tsuji S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (ПЦР). // Neurology // 1990. 40: 1617-1618
90. Katila M.L., Katila P., Erkmjuntti-Pekkanen R. Accelerated detection and identification of mycobacteria with MGIT 960 and Cobas Amplicor systems // J.Clin.Microbiol. 2000. - Vol. 38.-No. 3.-P. 960 - 964
91. Katzman M. Use of oil overlays in "oil-free" ПЦР technology. // Bio-Techniques. 1993. 14: 36-40
92. Khan G., Kangro H.O., Coates P. J.and Heath R.B. Inhibitory effects of urine on the polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA. // J.Clin. Pathol. 1991.44:360-365
93. Kolattukudu P.E., Femandes N.D., Azad A.K. et al. Biochemistry and molecular gentics of cell-wall lipid biosynthesis in mycobacteria // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - No. 1. - P. 263 - 270
94. Kolk A.H., Kox L.F., van Leeuwen J. et al. Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis // Eur.Resp.J. 1998.-Vol. 11.-No. 6.-P. 1222-1226
95. Kramer F.R., Tyagi S., Alland D., Almadi O., Bratu D., Elhajj H. et al. Molecular Beacond Hybridization Probesfor the Detection of Nucleic Acids in Homogeneous Solutions
96. Kubica G.P., Dye W.E., Cohn M. L. and Middlebrook G. Sputum digestion and decontamination with N-acetyl-L-cysteinesodium hydroxide for culture of mycobacteria. // Am. Rev. Respir. Dis. 1963 87:775-779
97. Landegren U., Kaiser R., Caskey C.T., Hood L. DNA diagnostic: molecular techniques and automation // Science. 1988. - Vol. 242. - No. 1. - P. 229237
98. Lau J.Y.N., Qian K., Wu P.C., Davis G.L. Ribonucleotide vanadyl complexes inhibit polymerase chain reaction. // Nucleic Acids Res. 1993. 21: 2777
99. Le О.Ё., Bach K.H., Ho M.L. et al. Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Vietnam using IS6110 as probe // Tuberc. Lung Dis. 2000. - Vol. 80,-No. 2.-P. 75-83
100. Lebrun L., Espinasse F., Poveda J.D. et al. Evaluation of nonradioactive DNA probes for identification of mycobacteria // J.Clin.Microbiol. 1992. -Vol. 30.-No. 13.-P. 2476 - 2478
101. Li H., Gyllensten U.B., Cui X. et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells // Nature. 1988. - Vol. 335.-No.3.-P. 414 - 417
102. Linares M.J., Pelaez M.J., Casal M. Application of high-performance liquid chromatography for identification of atypical mycobacteria // Clin. Mycobacter. 1998. - P. 185-187
103. Liquin M. Et al. Evaluation of practical chromatographic procedures for identification of clinical isolates of mycobacteria. J.Clin.Microboil. Jan.- -1991. vol.29, No.l, p. 120-130
104. Lsenberg H.D., D'Amato R.F., Heifets L. et al. Collaborative feasibility study of a biphasic system (Roshe Septi-Check AFB) for rapid detection and isolation of mycobacteria // J.Clin.Microbiol. 1991. - Vol. 29. - No. 9. - P. 1719-1722
105. Mangiapan G., Vokurka M., Schoub L., Cadranel J., Lecossier D., Van Embden J.and Hance A. Sequence capture ПНР improves detection of mycobacterial ДНК in clinical specimens. // J.Clin. Microbiol. 1996. 34:1209-1215
106. Martin C., Timm J., Rauzier, Gomez-Lus R., Davies J.and Gieguel B. Transposition of an antibiotic resistance element in mycobacteria. // Nature (London) 1990 345:739-743
107. Martin G. and Lazarus A. Epidemiology and diagnosis of tuberculosis. // Postgrad. Med. 2000. 108:42-54
108. Marttila H. Molecular genetics of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. И Turku, - 1999 - 79
109. Marttila H., Soini H., Huovmen P., Viljanen M. katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients // Antimicr.Agents Chem. 1996. - Vol.40. - No.9. - P.2187-2189
110. McAdam R. A., Hermans P. W. M., van Soolingen D., Zainuddin Z. F., Catty D., van Embden J.D. A. and Dale J.W. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence belonging to the IS3 family. // Mol. Microbiol. 1990 4:1607-1613
111. Michael W. Pfaffl. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-ПЦР // Nucleic Acids Research, 2001 Vol. 29, No. 900
112. Miller A. Mastellone, Kim K., Colaninno P., Hochstein L. and D'Amato R. Rapid diagnosis of tuberculosis in various biopsy and body fluid specimens by the amplicor Mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction test. //Chest 1998.113:1190-1194
113. Mira-Guttierez J., Paredes-Salido F., Sasian-Matias P. et al. Value of a gas chromatography to identify some rapidly growing mycobacterial species // Clin. Mycobacter. 1998. - P. 193 - 198
114. Miyazaky Y, Koga H, Kohno S, Kaku M. Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. // J Clin Microbiol 1993; 31: 2228-2232
115. Moore D.F., Curry J.I. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by ligase chain reaction // J.Clin.Microbiol. 1998.-Vol. 36.-No. 4.-P. 1028-1031
116. Mordarska H., Mordarski M., Goodfellow M. Chemotaxonomic characters and classification of some nocardioform bacteria // J.Gen.Microbiol. 1972. -Vol. 71.-P.77-86
117. Morris A.J., Reller L.B. Reliability of cord formation in ВАСТЕС media for presumptive identification of mycobacteria // J.Clin.Microbiol. 1993. -Vol. 31 - No. 12 - P. 2533 - 2534
118. Newton C.R., Graham А. ПЦР. // Oxford: Bios Scientific Publishers; -1996. p.18-9
119. Nightingale S.D., Byrd L.T., Southern P.M. et al. Incidence of Mycobacterium avium-intracellulare complex in human immunodefeciency virus-positive patients. // J.lnf.Dis. 1992.-Vol.165. - No. 6. - P. 1082-1085
120. Nishimura N et al. Direct polymerase chain reaction from whole blood without DNA isolation // Ann Clin Biochem 2000 Sep;37 ( Pt 5):674-80
121. Nolte F.S, Metchock B. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A. et al. Mycobacterium // Manual of Clinical Microbiology Washingtone, 1995. -P.400 - 437
122. Panes M.G., Rauzier J.LaGranderie M. Gheorghiu M. and Gicquel B. Functional analysis of pAL5000, a plasmid Mycobacterium fortuitum: construction of a mini mycobacterium-Escherichia coli shuttie vector. // J.Bacterial. 1990 172:2793-2797
123. Pao C.C, Yen T.S.B, You J.B., Maa J.S., Fiss E.H., Chang C.H. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA amplification. // J Clin Microbiol 1990; 28: 1877-1880
124. Persing D.H, Cimino G.D. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. // Washington: ASM Press; 1993. p. 105 - 21
125. Pierre C, Lecossier D, Boussougant Y, et ell. // Use of a reamplification protocol improves sensitivity of detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by amplification of DNA. // J Clin Microbiol 1991; 29: 712-717
126. Portillo-Gomez, L., S. Morris, and A. Panduro. Rapid and efficient detection of extra-pulmonary Mycobacterium tuberculosis by ПЦР analysis. // Int. J.Tuberc. Lung Dis. 2000. 4:361-370
127. Querol J.M., Minguez J., Garcia-Sanchez E., Farga M.A., Gimeno C. and Garcia-de-Lomas J. Rapid diagnosis of pleural tuberculosis by polymerase chain reaction. // Am. J.Respir. Crit. Care Med. 1995.152:1977-1981
128. Rafi A., Naghily B. Efficiency of Polymerase Chan Reaction for The Diagnosis of Tuberculosis Meningitis // Back to Medical Jornal of IAS, -1998 v 11,4
129. Richter С., Kox L.F., Van-Leeuwen J.V. et al. ПЦР detection of mycobacteraemia in tanzanian patients with extrapulmonary tuberculosis // Eur.J.Clin.Microb.InfectDis. 1996.-Vol. 15.-No. 10.-P. 813-817
130. Rivera A., Tupasi T. Rapid and improved recovery rate of M.tuberculosis in mycobacteria growth indicator tube combined with solid Lowenstein Jensen medium // Int. J.Tubercle and Lung Diseases. 1997. - v. 1. -p. 454-459
131. Roberts G.D., Koneman E.W., Kim Y.K. Mycobacterium Manual of clinical microbiology//NY, 1991.-P. 304-309.
132. Rosenstraus M., Wang Z., Chang S. Y., DeBonville D. and Spadoro J.P. An internal control for routine diagnostic ПЦР: design, properties, and effect on clinical performance. // J.Clin. Microbiol. 1998. 36:191-197
133. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F.et al. Enzymatic amplification of P-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. - Vol. 230. - P. 1350-1354
134. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Eriich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with sequence-specific oligonucleotide probes // Proc.Nat.Acad.Sci. 1989. - Vol. 86. - P. 6230 - 6234
135. Salch A.F., Weyer В., Bruns U. Comparison of ВАСТЕС MGIT 960 with ВАСТЕС 460 and solid media for detection of mycobacteria in clinical specimens in clinical laboratory // Clin.Microb.and Infect. 1999. Vol.5, Suppl.3.-P.95.
136. Saltini C. Direct amplification of Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid in paucibacillary tuberculosis // Eur.Respir.J.- 1998. -Vol. II.-No. 6.-P. 1215-1217
137. Sanjay Tyagi, Salvatore A.E. Marras, Jacqueline A.M. Vet, and Fred Russell Kramer. Molecular Beacons: Hybridization Probs for Detection of Nucleic Acids in Homogeneous Solutions //
138. Satsangi J., Jewell D.P., Welsh K., Bunce M. and Bell J.I. Effect of heparin on polymerase chain reaction. // Lancet 1994 343:1509-1510
139. Sewell D.L., Rashad A.L., Rourke W.J. et al. Comparison of the Septi-Check AFB and ВАСТЕС systems and conventional culture for recovery of mycobacteria // J.Clin.Microbiol. 1993. Vol. 31 - No. 13 - P. 2689 - 2691
140. Shinnik T.M., Good R.C. Mycobacterial taxonomy // Eur.J.Cli.Microb. // Infect.Dis. 1994.-Vol. 13. -No.3. - P.884-901
141. Siddiqi S.H., Libonati J.P., Middlebrook G. Evaluation of a rapid radiometric method for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis //J.Clin.Microbiol. 1981 - Vol. 13. - No.4. - P. 908-912
142. Sjobring U., Mecklenburg M., Andersen A.B., Miomer H. Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis II J.Clin.Microbiol. -1990. Vol. 28.-No. 7.-P. 2- 200 2204
143. Small L.C., Ramakrishnan L., Falkow S. Remodeling schemesof intracellular pathogens. // Science. 1994 Vol. 263. No.2. - P.637-639
144. Snapper S.B., Lugosi L., Jekkel A., Melton R.E., Kieser Т., Bloom B.R., and Jacobs Jr. Lysogeny and transfomation in mycobacteria: stable expression foreign genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85:69876991
145. Snapper S.B., Melton R.E., Mustal S. Kieser Т., and Jacobs W.R., Jr. Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis. // Mol. Microbiol. 1990 4:1911-1919
146. Snider U.E. and Roper W. L. The new tuberculosis. // N. Engl. J.Med. -1992.326:703-705
147. Soini H. and Musser J.Molecular diagnosis of Mycobacteria. // Clin. Chem. -2001. 47:809-814
148. Sritharan V., Barker R. H. A simple method for diagnosis M.tuberculosis infection in clinical samples using ПЦР. Mol Cell Probes 1991; 5 ;3 85-395
149. Stager C.E., Libonati J.P., Siddiqi S.H. et al. Role of solid media when using in conjunction with the ВАСТЕС system for mycobacterial isolation and identification // J.Clin.Microbiol. 1991. - Vol. 29 - No. 1 - P. 154-157
150. Starnbach M.N., Falkow S., Tomkins L.S. Species-specific detection of Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization. J.Clin.Microbiol. 1989. 27: 1257-1261
151. Su W.J., Tsou A.P., Yang M.H. et al. Clinical experience in using polymerase chain reaction for rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis // Chung Hua I Hsueh Tsa Chin (Taipei). 2000. Vol. 63.-No. 7.-P. 521-526
152. Suffys P., Palomino J.C., Cardoso Leao S. et al. Evaluation of the polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis III Int.J.Tuberc.Lung Dis. 2000. Vol. 4.-No.2.-P. 179-183
153. Takagi N., Hasegawa Y., Lchiyama S., Shibagaki Т., Shimmokata K. Polymerase chain reaction of pleural biopsy specimens for rapid diagnosis of tuberculosis pleuritis Int. // J.Tuberc. Lung Dis. 1998. 4:338-341
154. Tan M.F., Ng W.C., Chan S.H. Comparative usefulness of ПЦР in the detection of Mycobacterium tuberculosis in different clinical specimens // J.Med.Microbiol. 1997 V. 46.-No. l.-P. 164-169
155. Tchernooussova L.N., Levy D.T., Savinkova S.N., Smirnova T.G.
156. Molecular typing of M.tuberculosis complex laboratory strains from Russia. // 21st Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Venna-Austria. July 2-5. 2000
157. Tchernooussova L.N., Levy D.T., Savinkova S.N., Smirnova T.G. Molecular typing of M. tuberculosis complex laboratory strains from Russia. // 21st Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, Venna-Austria, 2000, PMo70
158. Thibert L., Lapierre S. Routine application of high-performance liquid chromatography for identification of mycobacteria // J.Clin.Microbiol. -1993.-Vol. 31.-No. 9.-P. 1759-1763
159. Thierry D., Cave M.D., Eisenach K.D., Crawford J.T., Bates J.H., Gicquel B. and Guesdon J.L. IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex. //Nucleic Acids Res. 1990 18:188
160. Thierry D.A., Brisson-Noel A., Vincent-Levy-Frebault S. et al. Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence, IS 6110, and its application in diagnosis // J.Clin.Microb. 1990. Vol. 28. - No. 12.-P. 2668-2673
161. Truant J.P., Brett W.A. and Thomas W.Jr. Fluorescence microscopy of tubercle bacilli stained with auramine and rhodamine. // Henry Ford Hosp. Med. Bull. 1962 10:287-296
162. Viveiros M., Pinheiro S., Moreira P., Pacheco T. and Brum L. Evaluation of a commercial ligase chain reaction assay for the diagnosis of pulmonary andextra-pulmonary tuberculosis. // Int. J.Tuberc. Lung Dis.- 1999.-3:-508-514
163. Vlaspolder F., Singer P. and Roggeveen C. Diagnostic value of an amplification method (Gen-Probe) compared with that of culture for diagnosis of tuberculosis. //J.Clin. Microbiol. 1995. 33:2699-2703
164. Wahiberg J, Lundeberg J., Hultman Т., Uhlen M. General colorimetric method for DNA diagnostics allowing direct solid-phase genomic sequencing of the positive samples // Proc.Nat.Acad.Sci. 1990. -Vol. 87.-P. 6569 - 6573
165. Waleed Abu Al-Soud and Peter Radstrom. Purification and Characterization of ПЦР-Inhibitory Components in Blood Cells. // Journal of Clinical Microbiology, 2001. -p. 485-493, -Vol. 39, -No. 2
166. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. // Appl.Environ.Microbiol. 1997. -10: -3741-3751
167. Wilson K.H., Blitchington R.B., Green R.C. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. //j Clin Microbiol 1990; -28:-1942-1946
168. Wilson S.M., McNerney R., Nye P.M., Godfrey-Faussett P.D., Stoker N. G. and Voller A. Progress towards a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis. // J.Clin. Microbiol. 1993. -31 :-776-782
169. Winter N. M., Lagranderie, J.Rauzier, J.Timm, C. Leclerc B. Guy, M. P. Kieny, M. Gheorghiu, and B. Gicquel. Expression ofheterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: induction of a cellular response against HIV-1 Nef protein.//Gene 1991 109:47-54
170. Yagupsky P.V., Kaminski D.A., Palmer K.M., Nolte F.S. Cord formation in BACTEC 7H12 medium for rapid, presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex 1990. - Vol. 28. - No. 7. - P. 1451 -1453
171. Young D.B., and Cole S.T. Leprosy, tuberculosis and the new genetics. // J.Bacterial. 1993 -175:-1-6
172. Yuen K.Y., Chan K.S., Chan C.M. et al. Use of а ПЦР in routine diagnosis of treated and untreated pulmonary tuberculosis // J.Clin.Pathol. 1993 Vol. 46.-No. 3.-P. 318-322
173. Zainuddin Z.F., Dale J.W. Does Mycobacterium tuberculosis have plasmids? // Tubercle. 1990. Vol. 71. - No. 1. - P. 43-49
-
Ларионова, Елена Евгеньевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.07
- Современные ПЦР-системы для индикации и идентификации микобактерий и диагностическая значимость полимеразной цепной реакции при туберкулезе крупного рогатого скота
- Усовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
- Новые экспериментальные модели для биологической пробы при диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных
- Эпизоотологические и эпидемиологические особенности туберкулеза в Якутии, усовершенствование методов диагностики и специфической профилактики
- Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с исследованием L-трансформированных вариантов микобактерий
