Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Индуцирование суперовуляции, извлечение и бисекция эмбрионов у казахских тонкорунных овец

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Индуцирование суперовуляции, извлечение и бисекция эмбрионов у казахских тонкорунных овец"

КАЗАХСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИСС.ЯЭДОВЛ-ТКШЖШ1 таГОЛОГИЧЕСКШ ИНСТИТУТ ОЬЦйВОДСТВА

На .правах, рукописи

МШ1АК02 Нурл.чн Ккласович

ИНДУЦИРОВАНИЕ С"ПЕГ0В57Л1.Ш, ИЗВЛЕЧЕНИЕ И Б!СЕКЦИЯ ЭМБРИОНОВ 7 КАЗАХСКИХ ТСНКОРУНШХ ОЕЕЦ

Специальность OR.02.01 - Рэзведэниз, селекция и воспроизводство сельскохозяйствен!?!«: животных

А ВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Работа выполнена в Казахском ордена ТруДового Краоного Знамени научно-исследовательском технологическом институте овцеводство.

Научний рукоыдитель - доктор сплъскохозяйст-

вешух паук КАСЫМОВ К.Т.

Официальный оппоненты- доктор биологических нау]

профессор ЕАШКЕЕВ Е.Д. -

кандидат сельскохозяйственных- наук КАРАВАЕВ Е.А,

Ведущая организация - институт эколериментальш

биологии АН Казахской CCI

Защита состоится " && " fU>JLè"h.Jl. 1991 года в

Оес '

___с?_часов на заседании специализированного Совета

К.020.72.01 при Казахском ордена'Трудового Краоного Знамени научно-исследовательском технологическом институте овцеводства.

G диссертацией можно ознакомиться в библиотеке .института: 483174, Алма-Атинская обл., Дяамбулский р-н, с.Мынбаево,

Автореферат разослан "â-f ■ HCÂÙjJSl _1Э91 г.

УчениИ секретарь специализированного Совета, кандидат сельскохозяйствен- </?г них наук t' Т.К.КАСЕНОВ

1. ОПЦЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тещ. Новейшие достижения биотехнологии воспроизводства шпотных, такие г.ак "чкокоисврвпровапие гамет и эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцитов, клонирование эмбрионов, получение трапогенных п хнг.ертшх животных, в сочетании с классическими мет ода г,"л разведения позволит интенсифицировать процесс генетического улучшения гадапюисоя пород и создания новых типов сельскохозяйственных ггивот№.х. Перечнслоннке биотохнологичеокне приема пеновияавтея нл использования в сговч арсенала метода трансплантации с-мбрпонсв. Поэтогу исследования в области согпрмгт!ствоту1ГЛ'я технологии трочешюктация огбрноноп приобретает б^л.-пое ппуное п прог.лппскоп яначрипз.

Ватным этапом трапеп чяптвпаи омбриочов в пецячодствс ярля-еюя гормональное хсэдтхшвл суперовуляпни у допоров. .Гпя этих целой чаге всего придтягтг гонадотрооип '"'íu. оол'п'куло тяулп-рупщ'П гормон f'JCD ил-пг> гнсокоЯ себестоимости и трудоемкости обработки нсиольеуггг рбда. Однако íCI индуцирует более с. .биль-нуя и качественную супэрову.*-чцпго. В связи с эт"" поиски умеиь-гееипя трудоемкости обработки овец 'КГ ярчдетанляит: актуалънр-

ГЛ1.

líe глппее птезтотвокивм' згонотл считают и хирургическое извлечение эчйряспг : v догорев. Совотегпотеовянпо методов извлечения ембрионов с цел: л увеличения их е^октявностп л угленкпепил трои'ирряонгя репродуктивных органов яатяете • ваглны для порр-ленля n/хода амбраовол я сохранения воспроизводительно'; способности опериговатпч'Х гявопвдх.

I'ciiyccTB' кмучегир »'.опозвготтоа блиокепот1, представ-

ляыцих большую данность при постановке сравнительных экспериментов производят путем маг.рохнрургичиского деления эмбрионов на две части, что позволяет в 1,г-2 раза по сравнению с пересадкой целых эмбрионов увеличить получение потомства от наибо ;ее ценных в генетическом отношении кивотных-доноров. Поэтому исследования по разработка практически приемлемых способов би-секции эмбрионов, в том числе без микг'шанипулятора, являются актуальными и позволят шире использовать этот метод в практике животноводства.

Цель н задачи исследований. Экспериментальная часть работы является составной частью научно-исследовательских работ лаборатории биотехнологии воспроизводства овец Казахского НИТИ ов-ц&Ы'Дства по теш ! ХНТ № 391 "Разработать биотехнологию создания высокопродуктивна* стад на основе размножения животных методом трансплантации эмбрионов. Усовершенствовать методы суперовуляции у овец" (1986-19Э0 гг., № Гос.регистрации 01^7.0. 0ЭУ381).

Цель исследований заушалась в усовершенствоваши методов индуцирования суларовулящш, разработка методов извлечения и бисекцпи эмбрионов у овец..В соответствии с этим были постав-лени следуицпе осноыше задачи:

1. Усовершенствовать метод вызывания суперовуляции с использованием фолликулостнмулпрувдею горшка.

2. Уоьвершенсг оватъ метод извлечения эмбрионов пз рога матки.

3 Разработать способ бисекции эмбрионов йез использования микромяшщ>лятора.

4. Колучпть потомство от пересадки целнх и нотавин эмбрио-

нов.

Натчнад довдзид,. Заключается в усовершенствовании методов вызывания суперовуляцпп у овец о 1.¿пользованием фоллх'тсулостп-мулярущего гормона. Разработан метод маточного "вымывания змбрчопов у овэц. Сконструирован я изготовлен микрогируг*1».веский скальпель, усовершенствован способ бпсекции эмбрионов. Новизна исследований подтверждена приоритетной справкой (ПС $ 4903555/15-6135 от 18.01.1991 г.) к тремя рационализаторскими предложениями.

Практическая значимость работы состоит: - в усовершенствовании метода гормонального .шзнвагшя суперовуляции фо:'ш!кулостлчулирушш гормоном (фоллптроппном), обеспечивающим множественную овуляцию у 93,овец при числе овуляций 10,7 р выходе нормальных эмбрионов 4,5 на донора;

- в разработке метода извтвчения эмбрионов из рога матки, г^зволягацего предохранять от травмирования фимбриальнум часть яйцевода п получать 58,1/? эмбрионов от чпса овуляций;

- в разработке микрохирургического скальпеля и усоворпенст-вовании способа бисекоСия, обеспечйваппими качественное делящие 89,5^ эмбрионов.

Осноез&о положения, тносилтыо на защиту:

1. Индуцирование супоровуляцы у овец по двухдневносхем» обработки фолллтропином в сочетании с простзглзндпном.

2. Хирургическое извлечение эмбрионов из рога матки с ису пользованием двух катетеров.

3. Способ бисокции эмбрионов на стадии бласгоцистн с помощью микроскальпеля, зафиксированного в трубке инъекционной иглы.

'аботн. Основные полокения диссертационной ра-

боты доложены и получили одобрение на:

- научно-методических конференциях аспирантов и молодых учаш"с Казахского НИТИ овцеводства (с.Нынбаево, март 1989, 1990 гг.);

- респуб исанском совещании по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных на ВДНХ Казахской ССР (г.Алма-Ата, ишь, 19Э0 г.).

Обь е?.1 работа г Диссертационная работа изложена на страница машинсписного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 8 рисунками. Состоит из вреден я, обзора литературы, материалов ч методов исследование, результатов исследований, обсуждения, виводов и практических предложений'. Список использованной литературы включает 167 источников, в том числа 10? иностранных.

Исследования по индуцированию суперовулчции, извлечению и микрохирургическому делпш.а эмбрионов были проведены в лаборатории биотехнологии воспроизводства овец КазШТИО в период с 1988 по 1591 гг. Экспериментальные работы проведены на, овдах карвхской тонкорунной и эднльбзевокой пород. '

Сулоровуляцию у овец-доноров индуцировали трем гонадотрои-нш/л препарп.лдп по следующим схемам:

1. На 11-12-и день экстрального шиша инъецировали 1000-1Й00 ИЕ натиьного препарата 0£К или сывороточного гонадогропв-т в через 48 часов - 250 мнг лростаглапдиьа 2а;

2. Фолллт] пиком (ФСГ производства Каунасского завода эндо-

л

. МАТЕРИ' и И МЕТО.ГЧ ИССЛЕДОВАНИИ

минных препаратов) обрабатывали по двухдневной схеме. Общую дозу 384 БД фоллитропина вводили через каждые К часов в четырех инъекциях а уменьшающихся дозах: 144, 120, 72 и 48 ЕД. Первую инъекции гормона делали на II-12-fi день астрального цикла рано утром. Вместе с третьей инъекцией вводили 250 мгк ястрр^ фана.

Охоту выявляли баранами-проб икаг" два раза в сутки: утром и вечерог. Овец-дворов случали с баранакп-производителягли дважды, через 12 и 24 часа посла выявления начала охотн.

Извлечение эмбрионов у доноров и их трансплантацию реципиентам проводили хирургическим методом чарез 6-10 суток после осеменения доноров. Эмбрионн вымывали трем способами:

1. В основании рот матки и в фимбрнальную часть яйцевода на глубину 1-2 см вставляли катетеры и фиксировали их соответственно, корнцангом и гемостато*\ на которые для уменьшения г. равмируемости надевали резиновые трубки. Промнвную жидкость нагнетали в основание рога и собирали через яйцевод.

2. В основании рога матки вставляли два катетера. Конец первого катетера оставляли в основании рога, в то время как конец второго катетера доводили через, ролость рога матки до верхушки. Для герметичности на основание рога и на матечно-труб-ное соединение ставили зажимы. С помощью первого катетера производили нагнетание, а с помощью второго - сбор про ~1Вной жидкости.

3. Извлечение эмбрионов производили аналогично с первым способом, только для сбора промывной жидкости из яйцевода использовали металлическую каншю с валйком, которую фиксировали дршя пальцами.

Извлеченные эмбрионы оценивали по морфологическим и качественным признакам. Бисекцию эмбрионов проводили в пластиковых чашках Петри или на предметной стекле без использования микрочанипулятора двумя способами:

1. ( помощью ,~1ух остро отточенных металлических игл.

2. С помощью микроскальпеля. Для преобразования макродвижений в микро- применяли принцип рычаг . В качестве точки опоры использовали точку соприкосновения задней части микроскальпеля с дном чашки Петри.

Цалые и полуэмбрионы пересаживали реципиентам. Показатели приживаемости эмбрионов оценивал по результатам ягнения.

3. РКЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Индуцирование суперовуляции у казахских тонкорунных овец

В исследованиях использовали 90 овец-доноров казахской тонкорунной породы. Множественную овуляцию введением 10ГЧ-1200 НЕ нативного препарата СЖК индуцировали у 61 донора. Из них 54 донора (88,5$) реагировали.суперовуляцией и имели по 4 и более овуляций (табл.1). От 61 донора было получено 600 овуляций или по 9,8^0,76 овуляций в расчете на одного донора, при лимите от О до 31. Из 245 эмбрионов, извлеченных на 6-10 сутки после осеменения, т32 были ицанени морфологически нормальными. Таким образом, при стимуляции сулеровуляции нативным препаратом СЖК было получено по 2,2^0,32 нормальных эмбриона в расчете на одного обработанного донора.

Супг 'овуляцию у 14 доноров индуцировали инъекцией 1000-1200

Таблица I

Уроезнь суперовуляцпп у казахских тонкорунных овец

нсгазнкл П'релач.г

± I ¡.юлучено оБуля- ■ Извлечено эмбрионов и оопятов

го & о ш 1

Е- д ! к :

со ход-!

-з о I к сн Ч !

Д ?>! I

'О О 1П о д -I

О К

68,5

о

на донора

о й

г т.ч. нормаль! ' | ных эмбрионов на донора !-----,-------

о я

J

р.

03

о д

■ на донора

:со

г.^О,^: 215 4,0^,38 132 2,2-0,32

I

-а 1

,1 - онаороточ::!.1:' гсг

78,6 102 7,3+1,13 49 3,5+0,97 39 2,8^,91

ТС О*"1

16:

■0,7±1,71 ПО .7,3^1,70

68

4,5+1,58

ИЬ сывороточного гонадотропина. Из 14 овец хорошую реакцию на введение гонадотропина имели II 178,6$). В среднем в расчете на донора было получено 7,3±1,13 овуляций, при лимите от 2 до 15, извлечено 3,5^0,97 эмбрионов, из которых 2,8^0,91 бйли морфологически но] ;алышми.

Саше высокие показатели были получены при вызывании суперовуляции фоллитропшшм и простагландинил по предложенной наш схемс двухдневной обработки. Из 15 стимулированных овец 14 (93,3$) реагировали множественной овуляцией. В расчете на одного обработанного донора получено 10,7_±1,71 овуляций, при лимите от I до 25, извлечено 7,3^1,70 эмбрионов, ив которых 4,5^ 1,58 были морфологически нормальными и по развитию соответствовали своему возрасту.

Распределение эмбрионов в зависимости от возраста, стадии развития и гормональной обработки, представленное в таблице 2, показывает, что у доноров, обработанных СЖК, эмбрионы заметно отставали в развитии по сравнению с эмбрионами от доноров, обработанных сывороточным ггчадотропином и фоллитропинм... Так, на 6-й дань после осеменения у овец первой группы 76,1$ эмбриоьов были на стадии компактной морулы, тогда как у овец второй и третьей групп 78,7 и 61,9$ эмбрионов, соответственно, были представлены экспандпрованными ола^ .'оцисташ и лишь 7,1$ - компактными морулаш. При сравнении развития эмбрионов от овец, сулеровулировавших под действием сывороточного гонадотропина и фоллитрспина, н^блщдается небольшое преимущество в пользу первых. Т.-.к, на 7-й день во второй группе эмбрпоной были на стадии вылупившейся ¡ластоцксты, в то йремя как в 3-й группе таких эмбрионов не было.

Таблица 2

Распределение эмбрионов согласно их мор&логическим признакам

Бозраст эмбрионов, сут.

Показатель го п р 6 7 ' 8 9

à Л 1 % п % п % п % п

Извлечено I 4Р 37

эмбрионог и 2 Ь 25

ооцитов 3 42 55

В т.ч.

компактных I 35 76, i

морул 2 I 7,1

3 3 7,1

34 10 13

12 32,4 -3 12,0 -7 12,V -

66

10

62

бластоцист 2 _ - 3,7 - 7,7 - -

3 . I 2,4 2 I - -

экспандиро- I -2 5,4 9 26, Ь _

ванных 2 II 78,7 13 52,0 4 40,0 - -

бластоцист 3 26 61,9 29 52,9 3 23,1 - -

вылупившихся I 7 _ 3. 8,8 39 59,1 44 71,0

бластоцист 2 — . - 28,0 3 30,0 - - - -

3 - - - .4 30,75 - -

дегенериро- I _ Н» 2 5,4 6 17,6 13 19,7 14 21,2

вать I 7,1 2 8,0 I 10,0 - - - -

эмбрионов 3 4 8,5 Д7 30,9 I 7,7 - - -

ооцитов Т II 23,9 21 56,8 16 47,1 14 21,2 12 19,3

2 I 7Д - - 2 20,0 - - _ _

3 8' 19,1 ' - 4 30,75 - -

При обработке фоллитропином наблвдялось статистически" достоверна увеличение доли дегенерировашшх эмбрионов с 6 на 7 сутки, соответственно, 9,5 и 30,9$ (г <0,001). Статистически недостоверное увеличение доли дегенерпрованнкх эмбрионов на 12,2^ наблэдалось с 7 на 8 сутки при обработке СЖК. У доноров,

стимулированных сывороточным гонадотропином процент дегенари-ровамшх эмбрионов с увеличением яозраста изшнялоя-незначительно.

При вызывании суперовуляции с помощью сывороточного гона-дотропинл доля нормальных эмбрионов была достоверно больше (Р < 0,001), чел при других обработках и составила 79,65? (табл. 3). Достоверно больше было получено наоплодотворвнных яйцеклеток при обработка ьать^ным препаратом С1К (Р < 0,001), а при обработке фоллитроиином - деганерированных эмбрионов (Р < 0,0и). По соотношению отставших в развитии эмбрионов разница между обработками была незначительной.

Резшируя результаты исследований, мокшо отметить, что индуцирование суперовуляции у казахских тонкорунных овец наивным препаратом СЖ в дозе 1000-1200 ИЕ сопровоздалось высоким выходом неоплодотворенных яйцеклеток, а эмбрионы, полученные при такой обработке, развивались медленнее, чем полученные при обработке сывороточным гонадотропином и фоллитропином. При использовании сывороточного гонадотропина в доза 1000-1200 ИЕ сунеровуляция у оъец отличалась выоокил процентным выходом-полноценных эмбрьонов. Тем на менее, при вызывании множаствен-нов овуляции фоллитропином по -Предложенной схеме':обработки в общей дозе 384 ЕД за счет более высок:го уровня суперовуляции и лучших результатов ввшвания было получено больше полноценных .мбрионов в расчете на одного донора. Введение 250 »да- проста-главдина через 21 часа после начала гормональной обработки не влияло отрицательно на количег 'во овуляцИ и качеств; эмбрионов.

Таблица 3

Частота получения у суперовулировавишх ойм нормальнг::, отставаниях в г~звитии, дегенори-рованных эмбрионов и ооцитов

Показатели

Группы

I 2

п 1 % п 1 * п

Извлечено эмбрионов, и ооцитов, всего

в т.ч. нормальных

. отстававших в развитии

д.егенориро-ванных

ооцитов

2"5 49

132 53,9 39

12 4,9 3

27 74 II,0 4 30,2хх) 3

100

НО

79,6хх) 68

6,1

8,2 6,1

22 12

100 61,8

7,3

20,0: 10,9

х)-Р<0,05; ^ - Р <0,001 N

3.2. Извлечение эмбрионов у доноров

Ответственным звоном технологии трансплантации эмбрионов, от которого зависит результативность последундих работ, является извлечение эмбрионов у животных-доноров.

В наших экспериментах извлечение эмбрионов у овец производили с 6 по 10 сутк" ипслэ осеменения тремя способами, представленными выше. Всего суперовуляцию пнду~чровзли у 90 доноров. Из них у 7 доноров, имевзих слабую реакции на введение гонаде гропинов, эмбрионы не вымывали.

По литературным данным уровень извлечения эмбрионов изменяется в зависимости от используемого, метода и составляет от 50 до 60$ для методов с промыванием рога матки ч от 70 до 80$

3

8

для методов с одновременным промыванием рога матки и яйцевода. Извлечение эмбрионов промыванием рога матки и яйцевода отличается высокой результативностью, однако при его использовании у доноров часто образуются спайки на я~чкике, яйцеводе или фимбриалъной част, яйцевода.

С целью повышения вымываемости эмбрионов и уменьшения травмирования репродуктивных органов доноров нами был разработан новый способ извлечения эмбрионов.из рога матки (удостоверение на рационализаторское предложение И 43 от 10.07.1989 г.). Этот, способ отличается от наиболее часто применяемого метс.;а маточного вымывания катетером Фолле,:, тем что в нем яа счет использования двух катетеров увеличивается участок промывания, что дает возможность более тщательно промывать рог матки. Манипуляции с яйцеводом и бахромкой яйцевода не производятся. Это предотвращает их от травмирования.

Было проведено сравнение вышваемости эмбрионов предложенным наш способом (способ 2) оо способами промывания рога матки и яйцевода с использованием двух катетеров (способ I) и с использованием катзтара и металлической канюш. с валиком (способ 3). ' .

Извлечение эмбрионов первым способом производили у 20 овец (табл.4). Вымываемость эмбрионов оставила 53,3 и 56,4%, соответственно, на 6 и 7 сутки и достоверно снижалась до 22,4$ на 3 сутки (Р< 0,001). В среднем первым способом бнло получено 32,6$ эмбрионов «1 ооцитов.

Таблица 4

Результаты извлечения эмбрионов первым способом

п о 1 а Количество ОБуляций Извлечено эгяЗрионов и ооцитов 63

^ о ' 1 си •я р ш а) о Э Р. Г) р. Е5

та N Рч Р. О: О £Ч>0 о а РЧ со Число норов всего на донора всего на д"юрр

6 2 15 7,5 4,0 53,3

7 3 39 13,0+3,06 22 7,3^0,88 56,4

8 5 76 15,2*4,44 17 3,4*0,87 22,4

9 4 60 15,0*2,80 ■ 27 6,8*1,89 45,0

10 6 аз 13,8*3,02 15 2,510,76 18,1

Итого: 20 •273 13,7*1,57 89 4,5^,64 32,6

Вторым способом эмбрионы извлекали от 44 доноров (табл.5).-Наиболее результативным ыллывание эмбрионов рторым способом было на 7 сутки и составило 66,7$. На 6 сутки результативность извлечения составила Разница меязду процентом пзвличения

эмбрионов на 6 и 7 сутки недостоверна. Уровень тзвлечония' эмбрионов достоверно уменьшался.с 7 на 8 сутки (Р < 0,001) и в последующие 9 и 10 сутки не превышал 44,8$. В среднем, вторым способом было извлечено 46,7^ эмбрионов л ооцитов.

Самые высокие .результаты бил и получены при извлечении эмбрионов третьим способом (табл.С). От 19 доноров, имевших з среднем по II,2^1,31 овуляций, на 6-8 сутки после осеменения извлекли 68,1% эмбрионов и ооцитов или по 7,6*1,34 ка кагдого донора. Как и при извлечении эмбрпо: :в первым и вторим способами, в этог.ч случае наблюдалось снижение гышваёг.ости эмбрионов на 8 сутки, однако оно было сгатистнчесгл недостоверным.

Таблица 5

Результаты извлечения эмбрионов вторым способом

и о 8 о ы Р.Р.О юхэ о а М ет 1 о ч О (Ч и о сЗ и Р1 К Количество овуляций Извлечено эмбрионов и ооцитов они р. со 3 ОНИ

всего • на донора всег | на донора

б 7 72 10,3*1,50 5,6*1,13 54,2

7 5 33 6,6*2,33 22 - 4,4*1.81 66,7

8 7 62 , 77 23 3,3д0,99 37,1

д 14 92 6,6*0,68 39 2,8*0,51 42,4

10 II 105 9,5*1,49 47 4,3*0,90 44,8

гого: 44 364 8,3^,59 170 3,8*0,42 36,7

Таблица 6

Результаты извлечения эмбрионов третьим способом

« о

ь т •

О О

р,Р,О гао о "А РЧ я

1

о «

о (Ц И о О Р, и о

гч

Количество овуляций

¡Есего на донора

Извлечено эмбрионов к ооцитов

всего

на донора

1

н ю « Р

&Ч а Й ц ДМ В

ааМ.

6

7

8

6 II

Итого: 19

73 106 28

213

13,2*2,38 9,6*1,39 14,0

11,2*1,31

55 73 17

145

9,2*3,35 6,6+1,46 8,5 ■

7,6*1,34

69.6 68,9

60.7

68,1

Эффективность трех способов извлечения и влияния типа го-кадотрошша на вкшваемость эмбрионов оценивали, используя даннт-е сбора эмбрионов на 6-7 сутки после осеменения. Так. как, во-первых, виттываег/.ость эмбрионов у овец значительно ухудшалась иосла 7 суток и, ьг чтсрет, третьим способом извлечение

эмбрионов на 9-10 сутки посла осеменения на производилось, а на 8 сутки - производилось только у .двух доноров. Сравнение эффективности трех способов извлечения эмбрионов на 6-7 сутки после осеменения представлено в хаб/ -цэ 7.

1 5 54 10,8^2,20 30 6,0±1,00 55,6

2 12 105 8,8^1,35 61 5,1^0,96 58,1 17 185 10,9±1,32 128 7,5^1,45 69,2

Наиболее эффективным бшю извлечение эмбрионов третьим способом я составило 69,2$, в то время как первым и вторим способами - соответственно 55,6 и 58,15?. Разница между показателями извлечения эмбрионов трем способами статистически недостоверна. Тем не менее, второй и третий способа отличались шсокой стабильностью. Коэффициент корреляции мв~ду количеством извлеченных эмбрионов и иоличеством овуляций при извлечении первым способом составил чО,34 (Р >0,1), вторым - 40,73 (Р< 0,01), третьим - +0,95 (Р< 0,001).

Было установлено, что тип гонадотропина не в~тл на вымы-ваемость эмбрионов (т'бл.8). Так,у ревц, обработанных натпзтщм препаратом СЖ пли сывороточным гоаадотропинсч, на 6-" иутги после осеменения вторым способом было извлечено, соответственно. 58,9 и 53,3$ эмбрионов я соцетов (Р>0,1). При изапечанпи

Таблица 7

Эффективность извлечения эмбрионов у овец тремя способами на 6-7 г,у£кр после осеменения

1 I Количество овуля- ¡Извлечено албри

ш М I ций нов и ооцитов

& . {Ц ' ___________________;___

<2 3 о о I 1 Т

Чй I :

и I ни ; в«бго на донора всего на донора

Р.И К Я

эмбрионов третьим способом от овец, обработанных сывороточным гонадотролином или йоллитропином, разница между показателями вымывэемости эмбрионов, которые составили, соответственно 67,4 и 69,8$, также статистически недостоверна.

Таблица 8

Эффективность извлечения эмбрионов у овец на 6-7 сутки после осеменения в зависимости от способа извлечешг и типа гонадотролина

Способ извлечения -гонадотропин

Юпериро-|вано овец

Количество овуляций, всего

Извлечено эмбрионов и ооцитов всего

Процент извлечения

I - нативнгй препарат 54

сж 5

2 - нагивный препарат

СЯК 9 90

2 - сывороточный гона- 3 15

дотропин

3 - сывороточный гона- 4 46

дотропин

3 - фоллитрынш 13 139

30 53

8

31 97

55,6 58,9

53.3

67.4 69,8

Таким образом, сравнение эффективности трех способов извлечения эмбрионов показало, что папболае.результативным был способ проливания рога матки и яйцевода с использованием катетера и канши с валиком. Эффективность его на 6-7 сутки после осе-, менения составила 69,2$. При использовании предложенного наш: способа извлечения эмбрионов не травмировались яйцевод и фимб-рия яйцевода, что предохраняло их от адгезии и позволяло сохранить воспроизводительную способность доноров, однако вшлывае-мость эмбрионов была ниже и на 6-7 сутки после осеменения составила 58,1$.

3.3. лисекция и трансплантация эмбрионов

Исследования по микрохирургическому делению эмбрионов животных показали, что эмбрионы, чмеп'.ие значительно уменьшенное количество клеток, способны развиваться и формировать полноценный организм.

В предыдущих эксперпмеь ах была продемонстирована возможность микрохирургического деления зародышей крупного рогатого скота с помощью острой иглы или мчкроскальлеля баз использования мак; ^манипулятора.

В наших исследованиях проверялась эффективность и пригодность в практическом использовании двух способов бисекции эмбрионов овец. Р"!секцию эмбрионов первым способом осуществляли двумя остро отточенными металлическими иглами. Еластоцисту помещали в каплю питательной среды таким образом, чт. ш эмбрт. -нальный диск находился сЕарху. Затем в каплю осторожно вводили две иглы. Левой иглой фиксировали эмбрион за край трофобласта. Правую иглу располагали над эмбриональным диск м, а ее острие -рядом с острием левой иглы, чтобы плоскость бисекции проходила через участок тр фобласта, который будет травмирован при фиксации. После этого бластоцисту делили симметрично пополам притиранием правой иглы к дну предметного стекла. Компактные морулн делили аналогичным способом, только при этом на било необходимости учитывать полярность эмбриона.

1С компактных морул и 16 шлупивпихся бластоцнст, извлеченных на сутки развития от обработанных натявшш препаратом С2К доноров, были разделены таким способом и пересажены 26 реципиентам. Есо реципиенты проявили повторную охоту, в том

числе у четырех из н::: (15,4%) перегулы наблюдались на 34-56 сутки эстрального цикча. Значительная задержка эструса у четырех реципиентов свидетельствует о возможном развитии половин змбрионов в течение этого периода.

Результаты эксперимента показали, что бисекция эмбрионов и получение яо неспособных половин могут быть успешными только при использовании иглы с очень тонким острием. Однако в некоторых случаях от неосторожного движения или от чрезмерного усилия обламывается острие иглы. При использовании же недостаточного тонкого острия происходит сильное травмирование эмбриона. Характеризуя метод деления эмбрионов с помощью двух металлических игл, необходимо отметить, что он является сложным и кропотливым, требует от исполнителя больпих навыков и мастерства.

Более эффективным является предлоге. якй нами способ бисек-цин эмбрионов микроскальпелем, в котором для преобразования макродвияоний в микро- в качестве точки опоры используется точка соприкосновения задней части микроскальпеля с дном чашки Потри (удосгс^рвшю на рационализаторское предложение № 46 от 29.04.1990 г.). '

'■/'лкрсхирургию эмбрионов этим способом производили следующим образом. Клэстоцнсту помещали в каплю среды. Затем правой рукой в каплю вводили микроскальпель, а левой рукой фиксировали чашку Петри л при необходимости корректировали резкость изображения или яркость подсветки. Переднюю часть микроскаль-поля располагали над эмбрионом, а заднюю - притамали к дну чашки Петри в использовали ее в качество упора при последующих манипуляциях. Бокоеэй стороной мякроспяльпеля бластоцисту устанавливали так, чтобы эмбриональны" диск находился сверху. Поело

этого перед"юю часть ьыкроскальпеля располагали над с.лбтшо-нальным диском, симметрично разделяя его на две половины. 3-тем носок скальпеля опускали 1 1 эмбрион, доводили до дна чашки и делали им несколько опуикааелы )-поднимательннх движений до полного разделения эмбриона. Таким способом микроскальпелем, изготовленным из лезвия безопасной бритвы и зафиксирован нкм в заюш цангового карандаша, боло разрезано 2 экспандиро-^.анных и 29 вылупившихся бластоцпст 7-10-суточного возраста, из них 25,или 80,6^, оыли разрезан'- симметрично на две равные половины. Микро;.ашшулнрованныа эмбрионы пересаживали реципиентам, часть половин эмбрионов до пересадки инкубировали в течение 30-40 минут в питательной среде при комнатной температуре. Сразу после микрохирургии половины бластоцист имели нескол: ко вытянутую форму. Через 20-30 минут они сжимались и становились округлыми. Края трофобласта, образованные скальпелем при бпсегции, в результате комиактизации сближались, а затем соединялись друг с другом за счет способности клеток трофобласта к прилипанию. В некоторых случаях, разрезая крушыо -0-дневные бластоцисты, наблюдали склеивание краев трофобласта непосредственно при бвсекции.

Результаты трансплантации целых и половин эмбрионов представлены в таблице 9. При обработка доноров нативним щ.епаратом СЖ наблвдалось снижение жизнеспособности змбрпсчов с увалг "9-нпеи их возраста. Так, лри-.швляемссть 6-г7"Оуточш1г интамиих эмбрионов составила 26,1$, в то время как трансплантация более взрослых зародыией была безуспешной. Пересе.,лка половин эмбрионов от доноров, обработанных СЛК также на имела успеха. При обработкэ доноров сывороточным гонадотропином прижик^-мость

7-6-суточных целых и разделенных эмбрионов была одинаковой и составила 25$. Одна ярочка казахской тонкорунной породы била получена в результате пересадки двух идентичных половин 7-су-точной вылупившейся Лластоцистн реципиенту № 03705 эдильбаев-ской порода. Эта ярочка имела нормальное развитие и -весила 5,5 кг при рождеш;-,.

Таблица 9

Результату трансплантации целых и половин эмбрионов от допоив, обработанных СжК и сывороточным гона-дотропином

Гонадотропин

Показатели сяк ( и* Всего

возраст эмбрионов,сут

6-У ( 8-10 | 7-8 1 1 .....

Пересажено эмбрионов 23 29 8 60

Число реципиентов 12 15 4 31

Реципиентов с перегулом на 25 и более сут.никла, я % ' Объягнилось реципиентов 4 3 20,0 I 25,0 4 12,9 5

Получено ягнят •6 - 2 8

При?/ :вляемость, % 26,1 - 25,0 13,3

Пересажено псдовпн эмбрионов 4 54 • -4 62

Число реципиентов I 19 2 22

Реципиентов с перегулоп на 25 и более сут-цикла, р /о - - I 50,0 I 4,5

Объяг::илось реципиентов - - I I

Получено ягнят 8 - I I

ПрлЕПвяяемость, % - - 25,0 1.6

ХСГ - сывороточный гонадстроппн

Цанговый карандаш хорошо фиксирует микроскальпсль, однако он негигиеничен и Це соответствует требованиям, предъявит"мп к инструментам для работы с эь Зрионаыи. Из-за частого соприкосновения с питательной средой внутренние металлические де'ха-ли карандаша подвергаются коррозии. Вследствие этого при микроманипуляции частички ржавчины попадают в каплю питательной среды, в которой находятся эмбрионы. В связи с этим на мл была предложена новая конструкция микрохирургического скальпеля, ь которой микронож фиксируют в трубка инъекционной иглы (ПС И 4903555/х5-613о от 18.01.1991 г.).

С Цомощью микроскальпеля, зафиксированного таким образом, было разрезано Г. ранних, 31 эксг.андированная и 5 вылупившихся блястоцист 6-8-суточного возраста. Из 38 эмбрионов 34 эмбриона, или 89были разрезаны на две равные половины, "кспандироган-нне и вылупившиеся бластоццсты были эластичными и легко рассн-кали.сь микроскальпелем вручную. В отличие от них ранние и только начинавшие экспансию бластоцисты были менее удобны для микрохирургии, так как они имели толстую зону пел^лцида, были упругими и при нажиме часто выскальзывали из под микрсскальпеля.

Результаты трансплантации целых и половин эмбрионов приведены в табл.10. Манипуляции с эмбрионами проводили в среде Дкгьбекко или Хенкса, обогащенными 20% инактиварованной овечьей сыворотки или А% бычьего сывороточного альбумига. Для микрохирургии использовали эмбрионы от доноров, обработанных сывороточным гонадотропином и фоллптропином, а такие от искусственно осемененных оевц со спонтанной охотой.

Таблица 10

Результаты трансплантации целых и половин пг/.брионов

Доноры

Показат- л суперовулировашие необработанные Бсет,о

среда Дшьбек- ко среда Хенкса среда Дгтоекко

Пересажено эмбрионов 16 8 - 24

Количество реципиентов 8 4 - 12

Реципиентов с перегулом на 25 и более сут.цикла,п 4 _ 4

/о 50,0 - - 33,3

0бъ:тнплось реципиентов - - - -

Поресатано половин эмбрионов 30 8 70

Количество реципиентов 15 16 4 35

Реципиентов с порог-улом на 25 и болео сут.цикла, я 7 4 2 ТЧ X О

<i я 46,7 25,0 50,0 37,1

Объягнилось реш1Пиентов - - £ I

Получено ягняг - - т I

Прпдавляемость, % - 12,5 1,4

В результате трансплантации целых г iid'iobíkj эмбрионов, швдечокннх от сулерояулироштгх доноров, суягностей не получено. Однако у ряигчшрнтов поело пегпсалгл долга: вмбрио-т'ов и у 4G,7;í реплпиентов после пересадки полоклр омбрлонов, мапипулкровапннх и среде Дшьбегхо, были зафиксированы пирегу-лн на я более сутки астрального ц:ц^'а. При использовании для мпчипудяцкп о зыбриокаии растрора Хзнпсч перегуд» с значительной задчр-кой иебящвлвгь только у Ки. ршшпгчнтов, кптотчй;

пересадили но одной пара .половин эмбрионов. По-видамо:.1у. среда Дшьбвкко вдя эмбрионов овец была б о да о физиологичной.

В связи с неудовлетворительными результатами, полученными при трансплантации эмбрионов от гор1 нально обработанных доноров, бнла предпринята попытка получения потомства путем микрохирургии эмбрионов от овец со спонтанной охотой. У 13 овец на 6-7 сутки после искусственного осеменения извлекли эмбрионы. При 14 овуляциях было обнаружено 9 эмбрионов и социтов, или 64,3$, в том числе I ранняя и 3 вылупившихся бластоцисты, 4 дегене^рованпых эмбриона и I социт. Четыре бластоцисты бгли разделены шкроскальпалем и пересажаны обратно четырем овцам, от которых они а :ли извлечены. Из четырех овец три перогуляли, в том числе две с значительной задержкой, одна стала суягной и объягнилась. Была получена ярочка живой массой 4,3 кг пря роадешш, которая имела нормальное развитие. Пшживляэмость половинок бластоцист от необработанных доноров составила 12,5$.

Таким образом, в результате трансплантации эмбрионов, разделенных Макроскальпелем без использования микрс^анипулятора, было получено два ягнонка-трансплантаита. Рассечение эмбрионального диска у бластоцист но привело к каким-либо неноршль-ностям и был получен полноценный приплод.

Результаты эксперимента показали, что для микрохирургии целесообразно использовать 6-7-сухсчнне эмбрион;; на стадии экопандированной и вылупившейся бластоцисты. Предложенный нами способ бисекции эмбрионов микроскальпелем, зарксированным в трубка инъекционной иглы, обеспечивает точное и бнстпое разрезание эмбрионов В1 чяую и позволяет получать жзнвспособнне лолоешы.

ШВОДО

1. Усовершенствованный способ индуцирования суперовуляции у казахских тонкорунных овец фоллитропином по двухдневной схеме обработки в общей дозе 384 ЕД в сочетании с инъекцией 250 мкг простагландина обеспечивает множественную овуляцию у 93,3$ орчц при среднем числе овуляций 10,7 и нормальных эмбрионов 4,5 на донора.

2. Предложенный метод извлечения эмбрионов из рога матки на 6-7 сутки после осеменения обеспечивает получение 58,1$ эмбрионов от общего числа овуляций, при этом не травмируются бахромка яйцевода и яйцевод, что положительно влияет на сохранено репродуктивной способности доноров.

3. Эффективность микрохирургического деления эмбрионов овец без ынкроманяпулятора в значительно!: степени определяется используемым для этого инструментом и стадией развития эмбрионов. Предложенные микрохирургический скальпель и способ би-секции обоспечиваот качественное деление 89,5$ эмбрионов. Для микрохирургии предпочтительны эмбрионы, извлеченные на 6-7 сутки развития на стадии эспандированной или вылупившейся бластоцисты.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для индуцирования суперовуляции у казахских тонкорунных овец предлагается двухдневная схема обработки фоллитропином в сочетании с простагландином.

2. Для хирургического извлечения эмбрионов у овец предлагается способ извлечения эмбрионов из рога матки с использова-

ниеы двух кате.херов, .уменьшающий стерзнь травмирования тканей матки.

3. Для ыи"рохирургичосдого деления эмбрионов предлагав', л способ бисекции эмбрионов микрохирургическим скальпелем.

Зсновные материалы диссертации j достаточной полнотой представлены в следующих работах:

1. Влияние состава промывной жидкости на приживлявиость эмбрионов у овзц. - В кн. -Трансплш лщил эмбрионов сельскохозяйственных животных. Алма-Ата.Наука,1989,с.29.

2. Опыт организации трансплантаций эмбрионов в овцеводстьь. В кн. Трансплантация эморионов сельскохозяйственных животные. (Соавторы: Арыяов М.К..Утесинов S..Касымов К.Т..Нурпеисов A.b., Умбеталиев Н.К.). Алма-Ата.Гылым,1991,с.133-138.

3. Бисег.з;а:я бластоцист овец шкроскальпелем.- Доклады ВАСШШ, 1991, № Ь, с.61 -64,

4. Извлечение эмбрионов у овац и коз. - Удостоверение на рационализаторское предложение J6 43 от 10 июля 1ЭЬ9 г. (сонь-горы: С.А.Аузбаев, К.Нуркаев).

5. Способ разделения'эмбрионов овец эмбриоскальпелем. -Удостоверение на рационализаторское предложение И 46 от 29 апреля 1990 г. (соавторы: К.Т.Каснмга, С.А.Аузбаев).

6. Двухдневная схема выбывания суперовуляции у овец фолли-ропином и простагландином. - Удостоверение на рационализаторское предложение № 47 от 25 декабря 1390 г.

7. Способ бисекции оластоглст овзц. ПС JS 400."Г>55/1 a-Gi35 от 18 января 1991 г. (соавтор К.Т.Касыков).

У

Mf