Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция воспроизводства ценных генотипов овец

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция воспроизводства ценных генотипов овец"

1 ¿¿АЛ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Институт физиологи

На правах рукописи ЕА1ЫРХАН0В МЛРХАБЛТ СЕРШШ1ЕВИЧ

УДК 636.32/28:612.646.02

РЕГУЛЯЦИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА ЦЕННЫХ ГЕНОТИПОВ ОВЕЦ

03.00.13 - Физиология человека и кивотных (физиология сельскохозяйственных животных)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата - 2-992

Работа выполнена в лаборатории трансплантации (эмбрионов Института экспериментальной биологии АН Республики Казахстан

Научные руководители - член-корреспондент АН Республики

Казахстан, Доктор сельскохозяйственных наук II.Ы.Тойплбеков Кандидат биологических наук О.А.Яарионов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

А.-Ш.М.Амарбаэв

доктор биологических наук, профессор Г.У.Измайлов

Ведущая организация: Казахский научно-исследовательский, технологический институт овцеводства КазАСХН

Защита состоится " 199£>г».

в /У _часов на заседании Специализированного Совета KD08.2I.0I в Институте физиологии АН Республики Казахстан по адресу: 480032, г.Алма-Ата, 32 Академгородок.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АН Республики Казахстан, г.Алма-Ата, уя.Шевченко, 28

Автореферат разослан " 199; р.

Ученый секретарь Специализированного Совета, _ „ _

кандидат биологических наук Ж.К.Базаралцина

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. виртуальность теми. Разработка методов регуляции уровня вос-

трансплантации эмбрионов в настоящее время приобретает большую научно-прикладную актуальность.

Известно, что завезенные в наши регионы овцы породы австралийский меринос проходят трудный процесс адаптации к местным природно-климатическим условиям. В то же время трансплантация вибрионов, извлеченных от завозных, трудноакклкматизируемых маток овцематкам-реципиентам мэстних пород дает возможность их ускоренного размножения и получения более здорового их потомства.

Важнейшим звеном в процессе ускоренного размножения ценных генотипов овец путем трансплантации эмбрионов является индукция наиболее оптимального уровня овуляции яичников маток-доноров, когда создается возможность получения большого количества эмбрионов» пригодных для трансплантации. А это достигается применением гснадотропных гормонов, выделяемых в кровь аденогипофизсм (ЗСГ, ЛГ). По способу получения и очистки гормональные препараты значительно отличаются кезду собой по эффективности применения. Следовательно, возникает необходимость изучения применения зтих препаратов для установления наиболее оптимальных их доз и в зависимости ст возраста п генотипа обрабатываемых животных.

Приобретает определенную актуальность изучение характера развития ягнят-трансплантатов относительно новой популяции овец породи австралийский меринос выращенных в организме реципиентов .разных ■ «ютипов овец. Установление характера формирования и:: ссгиотип<\ позволяет выяснить вариабельность ах по основным хозяйственно-полезным признакам п планз шясншия вммеяиого влияния •па степень шс проявления организма матерей-реципиентов.

v т..

пр^з'аодства наиболее ценных в генетическом отношении животных с использованием биологически активных препаратов и метода

ш

Не менее важноэ значений имеет выявление возможного влияния на жизнеспособность эмбрионов предварительное обогащение организма матерей-доноров витаминами, действие которых на организм животных давно установлено.

Получение животных с новыми генетическими свойствами путем индукции генетических материалов в их геном с применением современных биотехнологических методов (генетическая инженерия) имеет огромную перспективную актуальность. В втой связи изучение влияния микроиньекции чужеродного ДНК как в цитоплазму, так и в про-нуклеус зигот овец представляет огромный научный интерес.

Цепь и задача исследования. Цель исследований заключалась в разработке наиболее эффективных схем гормонального вызывания сулеровуяяции у овцематок-доноров австралийских мериносов; в изучении влияния микроиньекции на жизнеспособность ранних эмбрионов' овец, а также изыскание возможностей получения трансгенных овец методом микроиньекции чужеродной ДНК.

Основные задачи .исследования состояли в следующем:

- отработать схемы гормонального вызывания суперовуляции путем применения новых препаратов;

- изучить влияние витаминов на уровень суперовуляции и качество эмбрионов;

- изучить биологические и продуктивные особенности ягнят-трансплантатов австралийских мериносов;

- выяснение влияния микроиньекции (в зиготы овец) гена ц* -интерферона человека и созданной на его основе генно-инженерной конструкции на выживаемость зигот, а также выяснение возможности интеграции в геном микроинъецированных фрагментов ДНК.

Научная новизна. Установлены наиболее оптимальные дозы гормональных препаратов и сроки их введения овцематкам австралийских

мериносов для индукции высокой степени полиовуляции; дана характеристика продуктивно-биологических качеств ягнят-трансплантатов; впервые изучено влияние на выживаемость зигот микрокнъекции гена ^-интерферона человека и х^ДНК этого-гена; впервые разработана схема гормональной обработки овцематок-доноров с целью получения от них зигот на стадии двух про нуклеусов.

Практическая ценность и реализация результатов исследований. Разработанные схемы кнжукции суперовуляции овец-доноров с применением различных типов гонадотропннх гормонов и витаминов дает возможность получения множества эмбрионов пригодных для трансплантации. Получение и пересадка эмбрионов по разработанным схемам дает высокую приживляемость (до 68$).

Отработанная схема гормональной обработки и датированного осеменения овцематок-доноров позволяет получать в 40-бЮй случаев зиготы на стадии двух прокуклеусов, что является необходимым условием для проведения генно-иняенерннх работ в животноводстве.

Основные положения диссертации» вшюсише на защиту.

. I. Разработанная схема гормональной индукции суперовуляции овцематок-доноров обеспечивает выход больного количества нормальных эмбрионов.

2. Микроинъекция чужеродного гена у-интерферона человека .в дозе 1-2 пкл оказывает отрицательное влияние на жизнеспособность эмбрионов, степень'которого сильно варьирует в зависимости от места аппликации ДНК (цитоплазма илилро нуклеус).

3. Разработана принципиально новая схема гормональной обработки ыаток-доноров, обеспечивающая высокий выход зигот на стадии. двух гсронуллеусов.

Апробация работа. Основные положения диссертации Долокекы:

- на Республиканской конференции "Интенсификация и повышение эффективности общественного производства на основе ускорения

■ научно-техничесkopû прогресса" (Алма-Ата, 1988 r.)ç

- на 3-й школе-семинаре во генетике и селекции кивотных, 2-х научных чтениях памяти академика Д.К.Беляева (Байск, 1989 г.)}

- на Всесоюзной конференции-совещании "Трансплантация вибрионов сельскохозяйственных животных" (Алма-Ата, I9B9 г. >;

- на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990 г.).

Объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 39 рисунками. Список литература содержит £94 наименований, б том числе 173 на иностранном языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная часть работы проводилась в 3985-1990 гг. в научно-производственной лаборатории Института экспериментальной биологии АН КазССР по следующей схеме {рис.1).

В опытах были использованы бараны-производители порода австралийский меринос, в.качестве доноров - высококровные австраяз-еированные овцематки в -количестве 20 голов, а в качестве реципиентов - овцематки эдияьбаевской породы. У подопытных животных учитывались основные показатели продуктивности - живая масса и иеретная продуктивность.

С целью индукции полиовуллции овцематки-доноры обрабатывались гормональными препаратами. Обработка проводилась в случной сезон по схеме: на 8-12-й день полового цикла маткам инъецировали СНК в дзае 1500-1700 и.е. .или пролозан в Дозе 1200-1800 ИЕ, на 15-й деаь шлаваго цикла вводили встрофан (в дозе 250 дат). В день

выявления доноров в стадии половой охоты и осеменения т вводили внутривенно хорионический гонадотропш (в дозе 1000 И). В опытах I935-IS8S гг. овцематок-доноров осеменяли искусственно охлаяденныы семенем чистопородного барана порода австралийский меринос, завезенного из колхоза им.Ленина Нарынкояьского района Алма-Атинской области.

В опытах 1988-1990 гг. еуперовуляцию у овцематок-доноров вызывали по следующей схеме: на 10-12 день полового цикла подкожно вводили дважды в день ФСГ (США) по 2,5 кг с интервалом в 12 часов, в течение 4-х дней. На 3-й день после начала введения äCF донорам внутримышечно вводили 250 мкг эстрофана. Маткаы-донорам в охоте вводили 1000 ЕД хорионического гонадотропина и осеменяли их баранами-производителями.

Хирургическую операцию по вымыванию ранних эмбрионов из репродуктивных органов овцематок-доноров и их трансплантацию проводили согласно методике, описанной ^.М.Мухдаедгалиевым и Др. (1981) и М.М.Тойншбековым (1985).

Дриживляемость ембрионов после их трансплантации устанавливали путем выявления овцематок-реципиентов в стадии половой охоты в следующем половом цикле (т.е. на 16-19-й день).

Изучение роста виной массы шшотных-трансплантатов осуществ--лялось взвешиванием: при рождении, в возрасте 4-4,5; б; 12 (и ярочек в 18 ыее.) месяцев. Вычисляли абсолютную (среднесуточный прирост) и относительную скорость роста. ,, Сравнительно в возрастном аспекте определяли эк^терьерныз особенности путем измерения промеров статей тела и вычисления индексов телосложения.

При изучении гистологической структуры, методом биопсии брали образцы кожи ь обгас-уя ботаа: при роадекии, в 4- и 12-месяч-

ном возрасте. Гистологические препараты образцов кожи готовили по методике Н.А.Диомидовой (1957) в модификации И.АЛагирова и В.И.Карповой (1958). Цифровой материал, подученный в процессе опытных работ, обрабатывали методом вариационной статистики (Н.А.Плохинский, 1970; Е.К.Меркурьеэа, Г.Н.Шангин-Березовский, 1983).

В качестве доноров и реципиентов з опытах по получению трансгенных тавотных были использованы овцы пород: архаромеринос, эдильбаевская, казахская тонкорунная и кроссбредная.

Эмбрионы овец на ранних стадиях развития извлекали из яйцеводов овцематок-доноров хирургическим путем через 14-26 часов после осеменения.

Качество эмбрионов оценивали под инвертированным микроскопам фирмы "Оптон" (ФРГ). Зиготы считали оплодотворенными, если у них были видны 2 направительных тельца и/или/ многочисленные сперматозоиды, прикрепленные к прозрачной оболочке.

Для микроииьекций в ранние эмбрионы свец использовали предоставленные Е. Д.Свердловым (Институт биоорганической химии Ш СССР) кольцевую плаэмиду ша. 322, содэржпцуш пошоразмерный ген у -интерферона человека, к в опытах I9S9 года жьевдргавали фрагмент ДНК рмст tf- б, состоящий из хта шт , к-ДйК гре^ и • последовательности ДНК - 40, содержащей интрон t антигена и сайт по лиодени лиро Еания для ранней - гурнк - Зтот фрагмент был сконструирован в груше трансгеноэа под руководством O.A. Ларионова (ИЕХ АН СССР).

При микроиньекциях использовали микроманипуляторы фирмы "Оптон". В пронуклеуо или цитоплазму зиготы овец инъецировали I-1,5 пл раствора чужеродной ДНК в концентрдцкя Х^г-мл. Введениз.

раствора ДНК обеспечивалось-с помощью пневматического ручного инъектора, а в последующем - автоматического пневматического • иньектора фирмы " вррепаог*

Микродаьецированные зиготы после оценки травыируекости трансплантировали овцематкам-реципиентам. Критерием травмируемости сдунияо появление видимых признаков нарушения целостности эмбрионов в течение 1-1,5 часов, непосредственно предшествующих трансплантации. Травмированные зиготы реципиентам не трансплантировали.

Кизнеспособность микроинъецированных и трансплантированных ранних оыбрионов оценивали по результатам окота реципиентов.

ДНК для анализа вьделяли из кусочков хвоста и ушей ягнят-транспяантатов, развившихся из инъецированных зигот {ра1т!Лег е1;..е1 » 1382). Наличие в реципиентом геноме последовательностей донорской ДНК определяли методом дот и блот гибридизации на нитроцеллкшозных фильтрах по методу, описанному в работе Маииа-тиса (1984).

' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Уровень суперовувяции у австрализярованных мериносов при применении различных гонадотропинов

На 3-х группах' овец австрализированных мериносов изучено влияние различных гонадотропинов на уровень суперовуляции. В наших исследованиях были применены следующие дозы гормональных препаратов: прояозана - 1200-1500 ИЕ, СШ - 1500-1700 м.е. и ЮГ - 20

Установлено, что при обработке овцематок-доноров данными гормонами лучшую суяеровуляторну» реакции показали животные, обра-^. ботанные пролоэаном и ®СГ в отличие от СЖ (табя.1). Так, положительно реагировало суперовуляцией 9?,2<£ животных от числа обрабо-

Таблица I

Уровень суперовуляции у овец австраяизированных мериносов в зависимости от типа гонадотропина

Показатели

Гонадотропин

пролоэан | С)Ж | ФСГ | всего

Обработано животных, 35 19 16 71 Реагировало иолиову-

ляцией а - % 35-97,2 15-78,9 16-100 66-92,9

Число овуляций всего 355 106 ■ 139 600

Числа овуляций на „ ' У Jv

донора 10,1*0,86* 7,1-1,02 9,6*1,16х 9,23*0,62*

Извлечено эмбрионов,

всего . 258 68 93 424

Процент извлеченных эмбрионов от числа

овуляций 72,67 64,2 70,5 70,6

Число эмбрионов на „ V . ^

донора 7,6*0,83 4,5*0,82х 6,5*0,89х 7,3*0,56х

х - Р<0,0Г

танных пролозаном, при введении ФСГ - 1001 и при инъекции СВК -78,9? животных.

Среднее число овуляций на донора было выше при обработке овцематок-доноров пролозаном (10,1*0,86) по сравнению с введением ФСГ (9,6*1,16) и СЖ (7,1*1,02).

Таким образом, в результате применения указанных схем гормональных обработок с пролозаном, ФСГ и СЖ для индукции суперовуляции у овцематок-доноров австралязированшх мериносов, положительно реагировало суперовуляцией 92,9$ обработанных животных, было получено 600 овуляций на 66 животных, что в среднем составило 9,23*0,62 овуляций на донора. При хирургическом вымывании эмбрионов было извлечено 70,6% зародышей от числа овуляций, т.е. в

среднем ?,31^0,56 эмбриона на донора.

Статистическая обработка данных после введения мерлносам различных гонадотропных гормонов катодом ХИ-квадрата показала достоверность различий мезду гормональными обработками овец про-лозаном и ФСГ (Р<0,01), а такке мекйу введением пролозана и СШ (Р<0,01), и недостоверную разницу мевду инъекциями 5СГ и СНК (0,5<Р<0,75).

При сравнении результатов разных гормональных обработок австрализированных мериносов с другими породами (казахская тонкорунная, эдильбаевская и кроссбредная) было выявлено, что они лучше реагируют на индукцию суперовуляцш (табл.2). Так, среднее число овуляций на донора было достоверно выше у австрализированных мериносов: 10,15-0,86, чем у кроссбредных - 6,7*1,03 (Р < 0,01).

Результаты анализа полученных данных показали, что матки мериносов и казахской тонкорунной породы лучше реагируют на введение гормонов, чем Другие группы маток. Причем установлено, что овцы казахской тонкорунной породы.хорошо реагирует на инъекциз .. ФСГ/иак в астральный, так и в анэстраньнай сезоны. Среднее количество овуляций у них составило 9,5-1,17 в сезон эструса и 8,3^ 1,98 в сезон анэструса,

Такке было установлено, что овцы эдкпьбаевской породы достоверно хуже реагируют на введение !ЗСГ (Р< 0,01) в отличие от тонкорунных овец (табл.2).

Таким образом, уровень суперовуляции у различных пород овец характеризуется высокой степень» изменчивости, которйя обуславливается радом факторов: породой животных-доноров, цх возрастом и кормлением, сезоном обработки, типом используемого гонадотропина и т.д.

Таблица 2

Уровень суперовуляции у овец разных пород при обработка пролозаном и £СГ

i

i_

Показатели j

I 8д:с

Обработано животных, 60 21 ' 11 12

Реагировало супер-озуляцией, п - Ъ 44-73,3 „ 21-100 7-63,7 10-83,3

Число овуляций всего 294 IS9 64 63

Число овуляций на донора 4,24±0,42 9,5*1,17 б,7±1,03

Извлечено зародышей, всего 226 158 51 60

Процент от числа овуляций 76,8 79,4 79,9 ' S5.2

Число зародышей на дснора 3,8710,37 7,4-1,18 7,3*1,19 4,6¿0,6I

х - эдильбаевская порода :сс - казахская тонкорунная порода :ссг - кроссбредная порода

Влияние витаминов на уровень.суперовуляции и качество эмбрионов

В наших исследованиях была сделана попытка выяснить эффективность индукции супйровуляши и получения вибрионов при обработке различными гснадогрошнаш в сочетании "с витаминами, пезытзяадамй их реактивность и потенциальные возможности.

В первый и 10-й дни полового цикла овцам опытной группы инъецировали иасяяный раствор тетравнта в обьема"'1 мл, который состоя« из витамина Л - БОООО Ш» Д - 25000 М$? Ё (токоферол) -£0 ир и У (яияенол) - 5 мг.

Обработка ШСГ !Обработка --¡пролозаном.

Í Кт'"'_j

¡----j {{«ллХ

ja еструс |в анэструс! ~

Экспериментальное испытание такой схемы обработки овец показало, что процент животных, реагировавших суперовуляцией, был несколько выше в опытной группе, чем в контрольной. Число овуляций на донора было в опытных группах больше на 16 и 14% (табл.3).

В опытных группах увеличивался выход нормальных эмбрионов и уменьшался процент дегенерированных эмбрионов на среднего донора, чем в контрольных группах. Кроме того, б данной работе было выяснено, «то обработка доноров витаминами способствовала повышению оплодотворяемости. Так, средний процент неоплодотворенных яйцеклеток на донора вше, в контрольных группах на 6,5 и 21,8% по сравнению с опытными.

Уровень овуляции и качество вибрионов у овцематок-доноров при применении пролозака (ГДР) и 2СП (США) в сочетании с витаминами

Таблица 3

Шролозак 1250 И.Е1 ■ ФСГ 20 мг

Показатели

I опытн. (контр. ! опыгн. ! контр.

Обработано кивотных, Реагировало суперовуляцией, а

, ц, IV Х<. г г

% 94,1 75,0 100 85,7

. 210 98 74 46

' ' 13,1 8,16 10,6 7,6

181 74 64 35

86,2 75,5 86,4 76,0

И, Э 6,2 9,14 5,8

17-16 7 7

16 12 7 7

Число овуляций, всего

Число овуляций на донора Извлечено ¡эмбрионов, всего Процент от числа овуляций Число омбрионов на донора

в т.ч. нормальных,

дегенерированных, ц

С

Ъ

"неоплодотворенных я яйцеклеток,

28 15 12 19

15,5 20,3 18,7 25,7

12 21 5 5

% 6,6 28,4 ' 7,8 14,3

Качество эмбрионов и их'приживляемость

Успех трансплантации эмбрионов овец зависит от степени при-живляемости зародышей, которая зависит от полноценности трансплантируемых эмбрионов.

Результаты морфологической оценки качества свеяеполученных шбрионов у овец-доноров показали, что из общего числа 424 полученных зародышей 252 были нормальные (60,0$), 126 (27,9%) деге-нерированные и 46 (10,В&) неоплодотворенные яйцеклетки (табл.4). При этом обнаружено, что атипичных и дегенерированных эмбрионов было больше среди 1-2- и 4-8-клеточных эмбрионов (48,1 и 35,7$), чем среди 26-32-кяеточных, поздних морул и бластоцист (36,0 и 19,6%).

Таблица 4 Морфологическая оценка эмбрионов

Стадии развития

¡Количество

Из них

нормальные ¡атипичные и деге-

!нов 1 ! ! ! ! п. .....1........ 1 % ! !" ! ! я ! ! ! 1

Неоплодотворенных яйцеклеток 46 _ _ _ _

I-2-клеточньго 52 27 51,9 25 48,1

4-8-клеточные 93 62 63,3 35 35,7

16-32-клеточные 235 86 63,2 49 36,0

Поздние морулы и бластоцисты 97 77 79,4 19 19,6

Установлено, что эмбрионы находившиеся перед трансплантацией

\

на разных стадиях развития, мевду собой различаются ir по степени приживляемости. Taie, самая низкая лрикивляеыость наблюдалась при пересадке I-2-клеточньж зигот (35,3%), самая высокая - при трансплантации поздних морул и бластоцист <68,ОЙ). Можно считать впол-

не высокой и степень пришвляемости ранних моруя (66,6%) (табл.5)

Таблица 5

Результата трансплантации ембрионов разных возрастов

Количество

Стадия

развития

эмбрионов

________ Окотивииеся Полу-

Гвеш- !певеса- трансплантатами чеио |()ВЦИ- шерес.а I г.й,тпмйНТИ ¡ягнят

!пяенгов!женных !■ реципиенты

!амбрио-! !нов !

I

1-2-клеточные 18 22

4-8-клеточные 41 52

16-32-клеточные 66 84

Поздние морулы

и бластоцист.ы 59 72

6 26 49

46

%

44^4 63,4 74,2

84,8

¡трансплантатов

~~ в 26 56

43

Прижив-

пяемость,

%

36,3 50,3 66,6

68,0

Качество вародьшей и их приживляемость имело некоторую связь с типом гонадотропина, используемого для вызывания суперовуяяции. Так, наибольший выход нормальных ембрионов (62р8%) и высокая их приживляемость (61,7$) получено при применении пролозана (ГДР), чем в случаях использования £СГ и СЖ (табл.6).

Таблица 6

Морфологическая оценка эмбрионов и их приживляемость при различной гормональной обработке

Показатели

Гонедотропини__

|прояозан ] СЖ' | 5СР

Всего

1

Обработано животных,

Реагировало суперовуляцией, а - %

Извлечено ембрионов!

в т.ч. нормальных, п - %

дегенерированншс, п ~ %

неопподотворшиых яйцеклеток, л - %

Количество лояучешш; ягнят,а - $

36 25-9^2

19

15-78.9

16 16-100

71 66-92,9

162-62,8? 26-62,9$

74-28,7$ 21-30,8?

22«Э,5$ ■ 11-16,25

юо-бг^г, и~гв,т

64-55,1* 252-59, 31-31,&% 126-29,%

и-13,2% 46-10,8$

25-46,2?. 139-60,4%

Установлено, что использование пролозана дает наименьший выход дегенерированных эмбрионов (28,9%) и неоплодотворенных яйцеклеток (8,55), чем при введении ФСГ и СНК.

В результате проведенных экспериментов мы получили 139 ягнят-трансплантатов австрализированных мериносов от эдильбаевских овцематок-реципиентов, что составляет 60,4^ приживляемости.

Биологические свойства и продуктивность ярок и баранчиков трансплантатов австрализированных мериносов

Рост живой массы. Установлено, что рост живой массы австрализированных ярок-трансплантатов опытнкх и контрольных групп проходил вполне удовлетворительно (табл.7). Среднесуточный прирост етого показателя в подсосный период у баранчиков опытной группы составил 266 г, контрольной - 233 г; у ярок опытной группы -195 г, контрольной - 193 г. По живой массе баранчиков и ярочек опытных и контрольных групп в возрасте 4,5, 6 и 12 мес. (ярок и в 18 мес.) достоверной разницы не обнаружено. (Р<0,95).

Гистологическое строение ком. При рождении общая толщина кожи у животных опытной группы составила 2121-15,46; контрольной 2137,6^17,83, а з годовалом возраста - 2258,0*17,20; 2255,9±12,70. К годовалому возрасту животные всех групп шали относительно одинаковое число волосяных фолликулов на I ш? площади кожи (табл.8). Результаты проведенных исследований свидетельствует о том, что по общей толщине кожи и ее отдельных слозз, по числу первичных и вторичных фолликулов и их диаметру у животных опытных и контрольных групп достоверной разницы нэ наблюдается (Р<0,95).

Шерстная продуктивность. Основным показателем шерстной продуктивности овец является настриг шерсти и ее длина. Настриг шерсти в чистом волокне у трансплантатоа в возрасте 13 мес. составил: у

Таблица 7

Возрастная динамика живой массы овец-трансплантатов австрализированных мериносов 1986-1988 гг. рождения

Год рождения овец-

трансплантатов ¡животных } (мес.) \ 1986 г. ! 1987 г. I 1988 г.

I М± т . , , г I п ! I 1

! а М± ¡а ! а ! М± т

Баранчики При ровд. 5 4,78+0,06 22 4,4010,09 9 4,32+0,12

4,5 мес. 5 20,2+0,58 20 35,52+0,24 9 35,89+0,56

б. мае. 5 36,8+0,37 18 42,76+0,35 9 43,6640,66

12 мес. 5 48,510,47 18 53,77+0,51 8 53,75+0,86

Ярочки При рожд. 8 4,25±0,17 8 4,22+0,24 10 4,24+0,17

4,5 мес. б 30,0±0,77 7 30,43+0,89 8 30,40+0,67

6 мес. б 33,33+0,49 б 33,33+0,88 8 33,0+0,64

12 мес. 4 36,0+0,92 б 36,16+0,70 8 35,87+0,55

Контрольная группа

Баранчики При ровд. 16 3,99+0,14 17 4,30+0,11

4,5 мес. 14 35,21^0,29 10 35,70+0,49

б мес. 10 42,20^0,29 8 42,1220,72

12 мес. 3 51,3*0,20 5 53,40+1,36

Ярочки При рожд. 10 4,00±0,10 8 3,95+0,13

4,5 мес. 10 29,00±0,51 8 27,37+0,49

6 мес. 8 32,9СЙ0,48 8 31,75+0,59

12 мес. 6 36,00±0,3б 8 36,87+0,62

Группы

Таблица 8

Возрастные изменения густоты и диаметра волосяных фолликулов кожи австрализированных овец-трансплантатов

Количество фолликулов в I мм*

Т !

Т

общее ¡первичных j вторичных ; В/П 1 Min ] М^д 1

Mira

Диаметр фолликулов, мкм первичных ] вторичных

М± п

М±:

Опытная Контрольная

Опытная Контрольная

Опытная Контрольная

108,7*0,59 107,7*0,48

71,8*1,01 72,7i0,42

41,7*1,00 41,4*0,48

При рождении 9,010,09 99,7*0,62

9,4*0,08 98,3*0,48

4 месяца

5,0*0,21 66,7*0,98

5,3*0,12 67,3*0,46

12 месяцев

2,6*0,09 39,1*0,58

2,7*0,88 38,7*0,42

11,2*0,13 71,9*0,42 63,1*0,88

10,5*0,11 -71,8*0,41 63,4*0,79

13,3*0,60 64,7*0,66 58,1*0,28

12,5*0,33 66,4*0,46 57,8*0,29

15,0*0,32 61,4*0,32 56,0*0,26

14,3*0,60 61,3*0,28 55,4-0,48

ярок опытных групп в среднем 2,27 кг при длине 8,7 см, у баранчиков - 4,02 кг и 9,4 см; контрольной группы - 2,12 кг и 8,5 см; 3,8 кг и 9,3 сы соответственно.

Выживаемость ранних шбрионов овец после микроодгьекции

гена у-интерферона человека и фрагмента ДНК рМСТ у- 6.

Одной из задач ставилось выяснение возможности выживания зигот и эмбрионов овец после микроккьекции гена ^-интерферона человека, а также к-ДНК этого гена, находящегося под контролем промотора вируса опухоли молочной железы мыши.

Для этого было проведено три серии опытов (1987-1989 гг.).,В опытах 1987-1988 гг. после индукции суперовуляции у овцематок-доноров было получена 275 вибрионов, из которых 258 находились на стадии зиготы, 17 эмбрионов - на 2-, 4-, 6-клеточных стадиях развития. В пронуклеусы и цитоплазму полученных эигот, а также в одно из ядер бяаетомеров эмбрионов был инъецирован ген ¡С -интерферона человека (табл.9).

. Таблица 9 •

Выживаемость зигот и эмбрионов овец после инъекции гена ¿^-интерферона человека и фрагмента ДНК рц^у ¿•-б

1987-1988гг! 1989 г. Показатели , ■ |

| КаЛ-ВО| % jtCOfl-BO } %

Проииьецировано всего эмбрионов 275 100 300 100

из них: зигот 258 93,8 300 100

в пронуклеус зигог 21 10,9 . 127 42,3

2-клегочных ембрионов 2 0,72

4-клегочных ембрионов 24 5,09

6-клеточных эмбрионов I 0,36 Переаакшо зигот и ембрионов

реципиентам 225 81,8 219 73,0

Получено ягняг-траясплантагоЕ 30_ 13,3 15 6,9

225 проинъецированных зигот и эмбрионов (81,8$), признанных по морфологическим оценкам нормальными, были трансплантированы ■ в яйцеводы овцематок-реципиентов. В экспериментах двух лет было получено 30 ягнят-трансплантатов (16 баранчиков и 14 ярочек). Причем 4 реципиента принесли по двойне. Все 30 ягнят-трансплантатов родились от пере саке иных реципиентам зигот. Пришв ляемость зигот овец после микроинъекции гена ^ -интерферона человека составила 13,3$.

В опытах 1989 года было прошгьецировано фрагментом ДНКрмот 300 зигот, из них в пронуклеусы 127 зигот (42,3%), Весной 1990 года было получено 15 ягнят-трансплантатов (9 баранчиков и 6 ярочек). То есть была получена щшшвляемость зигот после^мнк-роинъекции фрагментом ДНК рми" - 6,3^ (табл.Э).

Анализ полученных данных показывает, что в опытах двух лет получили довольно высокую выживаемость овечьих зигот (13,3%) после ыикроиньекции полноразмерного гена £ -интерферона человека. Однако, выживаемость зигот после ыикроиньекции фрагмента' ДНК рицу у-б снизилась до 6,9%. Это ыояет быть связано с тем, что в опытах первых двух лет ген у-интерферона человека инъецировали в цитоплазму, а в последних опытах инъецировали фрагмент ДНК рнот 5 в основном в яронуклеуо зигот.

Образцы тканей или органов 45 ягнят-трансплантатов и образцы сыворотки крови 30 тавотных подвергали анализу на интеграцию и/или/ экспрессию чужеродных генов. Анализ полученных данных показал, что интеграции гена у -интерферона человека в геном овец не произошло ни у одного ягненка, А яшята-трансплантатьг, полученные в 1990 году в данное время проверяются на интеграцию в геном фрагмента ДНК рМСТ б »

<■- Необходимым предварительным условием для получения трансген-

ных животных является получение зигот ва стадии двух пронуклеу-сов с последующей микроикьекцией ДНК в про нуклеус зиготы.

Зиготы с четко видимыми пронукяаусами в наших первоначальных экспериментах удавалось получать не всегда, поскольку полученные ембрионы находились на разных стадиях развития. Зиготы для визуализации про нуклеус ос центрифугировали при 15000 об/мии в течение 3-х минут, однако пронуклеусы и в этом случае на были видны. Поэтому в следующей серии експершентов для снижения вариабельности в стадии развития эмбрионов, а также для получения большего числа зигот на пронуклеусной стадии нами была сделана попытка несколько модифицировать схему гормональной обработки, предлоненной Еримстероы о соавторами (ВПпаЬег е*. а1. » 1985). В данную схему индукции суперовувддеи у овец включили хо-рионический гонадотропин как средство, способствующее синхронной овуляции созревших фолликулов. Хорнзнический гонадотропш иньеци-' роваяи внутривенно в дозе 1000 ВД овцематкам-донорам сразу поо-ло выявления у них стадии половой охоты. Осеменяли ''овцематок : спустя 6-7 часов посла введения этого гормона. Учитывая, что оплодотворение яйцеклеток происходит спустя 4-6 часов посла осеме- -нения (Лопырин, Д971), хирургическое вымывание эмбрионов производили через 14-16 часов после осеменения или через 24-26 часов после ишьекции ХГ.

Б результате в 42-60? случаев иы получали зиготы с двумя пронуклвусами (пронуклеусы идентифицировали с помощью оптики Нсмарскогс) (табл.9,10).

Таблица 10

Результаты гормональной обработки доноров по модифицированной схеме

! г

Показатели ! %

_____!__I___

Обработано ¡кивотнше, И 100

Реагировало суперовуляцией 10 90,0

Число овуляций, всего 104

Число овуляций на донора 104

Извлечено эмбрионов 86 82,6

Количество эмбрионов на стадии зигот 86 100

Количество зигот с видимыми пронуклеусами 53 61,6

Количество зигот без видимых пронунлеусов 33 38,4

ВЫВОДИ

1. Овцематки различных пород отличаются различной реактивностью на инъекцию одинаковой дозы одного и того же гормона. Австрализированные мериносы отличаются более высокой чувствительностью на введение экзогенных гормонов, чем овцематки других пород Сацильбаевской, казахской тонкорунной и кросебредных).

2. Установлена более высокая эффективность применения проло-ззяа я ФСГ то сравнении с СШ, как по выходу количества нормальнее эмбрионов, так и по их приживляешети.

3. Введение дагамикоа евцетаткёш-донорам значительно повышает у них уровень е^ие^овддащяи, выход нормальных эмбрионов и снижает уровень дегенерировакякгс эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток.

4. Ягнята-трансплантатн австралийских мериносов'^Грэзультате трансплантации эмбрионов по характеру развития, уровню шерстной продуктивности и по структуре, кото почти на отличаются от контрольных сибсов.

" 5. Разработанная схема гормональной обработки и осеменения

овцемашок, обеспечивает высокий выход зигот на стадии двух про-нуклеусов, что значительно повьшает эффективность работ по транс-генозу овец.

б. Микроинъекция в цитоплазму »-пронуклеус зиготы гена у1-интерферона человека оказывает отрицательное влияние на их жизнеспособность, поникая их приживляемость при трансплантации в 3-5 раз.

СПИСОК PAKT ОИУШЮВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Г. Трансплантация эмбрионов - метод ускоренного размножения ценных генотипов к получения трансгенных овец // Тез .докл. X съезда физиологов Казахстана. - Алма-Ата. - IS88. - С.Ш (соазторы: Ы.Тойпибеков, Б.Даминов и др.).

2. Рост и развитие австрализированных мериносов, полученных путем трансплантации эмбрионов // В кн.: Генетические, биохимические и цитологические аспекты селекции животных. - Алма-Ата. ? I98S. - С.212 (соавторы: Ш.Сартаев, Н.Умирианов).

3. Microinjection oí hum за ^-interferon gene and its re-

ooratinant devivte Into mammalian. sygotes//2üD ЦиЪа and International seminar on Interíeron.-Havana.- Cuta.- 1У89.- Roaoi CLarionov O.A.»Toishybekov И.М. et.al.).

4. Микроиньекции гена ^-интерферона' человека и к-ДНК втого гена в зиготы овец // Тез.докл, Ш школы-семинара по генетике и селекции нивотных. П-е научные чтения памяти акад. Д.К.Беляева.

Известия СО АН СССР. - Бийск. - 1989. - С.35 (соавторы: М.Павлова, В.Добровольский, М.М.Тойаибаков и др.).

5. Использование метода трансплантация эмбрионов для ускоренного размноиенйя австрализкрованнкх мериносов и получения трансгенных швотннх // Тез^цокл.Всесоозн.совещания "Трансплантация эмбрионов с.-х. животных. - Алма-Ата. - 1989» ■ С.6-7 (соавторы: lí.Ы.Тойпибеков).

6. Создание трансгенных млекопитающих, содершцих в составе генома н-ДНК гена ^ -интерферона человека под контролем ITH ■ .

Л\МТУ// Тез.Зсесовзн.хонй. "Ноеыз направления биотехнологии". -Пущина. - 1990. - С.27 (соавторы: В.Добровольский, О.А.Ларионов, М.М.Тойшибеков и др.).

7. Получение трансгенных овец с использованием множественных эмбрионов // Новости науки Казахстана*. - Алма-Ата. - 1990. -

С.29-31. (соавторы: А.М.Мурзамадиев, Е.Е.Ергаев, М.М.Тойшибеков и др.).

8. Результаты оценки качества эмбринов, полученных от овцематок австрализированных мериносов // Материалы Всессозн. совещания. - Алма-Ата. - 199Г. - С.32-41 (соавторы: М.М.Тойшибеков, Т.П. Кудашова).

9. Влияние витаминов на уровень суперовуляции и качество эмбрионов у маток-доноров австрализированных мериносов // Материалы Всесоюзн.совещания. - Алма-Ата. - 1991. - С.41-44 (соавторы: Ш. Сартаев).