Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция генетической нестабильности Podospora anserina (Rabenh.) Niessl в процессе продолжительного глубинного культивирования

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Индукция генетической нестабильности Podospora anserina (Rabenh.) Niessl в процессе продолжительного глубинного культивирования"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

4858379

КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна

ИНДУКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ РОООБРСША А№Е1{МА (11АВЕ1Ш.) МЕввЬ В ПРОЦЕССЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОГО ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

На правах рукописи

Специальность 03.02.12 - микология

2 7 ОКТ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

4858379

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н.Баха Российской академии наук

Защита состоится 11 ноября 2011 года в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М1, тел./факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Отзывы (в двух экземплярах) просим направлять по адресу: 119991 Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, кафедра физиологии растений, ученому секретарю Диссертационного совета Д 501.001.46. Факс (495) 939-39-70.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Камзолкина Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

академик РАСХН,

доктор биологических наук, профессор Левитин Марк Михайлович доктор биологических наук, в.н.с. Марфенина Ольга Евгеньевна

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Геном грибов характеризуется ярко выраженной динамичностью и способностью к относительно быстрому накоплению различного рода модификаций (Galagan et al., 2005). В настоящее время пристальное внимание к изучению нестабильности микроорганизмов связано с бурным развитием биотехнологии, так как активность образующихся вариантов, их скорость роста, физиологические особенности и влияние на продукцию биологически активных веществ различны (Фурсова и др., 2005; Милько и др., 2007). Для дрожжей и бактерий широко используется метод отбора вариантов с улучшенными характеристиками при помощи долговременной селекции в глубинной культуре, как непрерывной, так и периодической (Çakar, 2009). В отношении мицелиальных грибов известны лишь единичные работы, авторы которых случайно или целенаправленно в процессе погруженного культивирования получали изоляты, превосходящие по ряду биотехнологически значимых признаков исходные варианты (Swift et al., 1998; Crecy et al., 2009). Механизмы, обусловливающие вариабельность грибных культур, изучены в недостаточной степени. Поэтому актуальной становится разработка модельной системы, позволяющей эффективно повышать геномную нестабильность и получать фенотипы с различными свойствами.

Аскомицетный гриб Podospora anserina (Rabenh.) Niessl как модельный объект для изучения явления генетической нестабильности обладает многими преимуществами, важнейшие среди которых - легкость культивирования, детально изученный жизненный цикл, быстрое половое воспроизведение, возможность получения гомокариотических штаммов из единичных аскоспор, отсутствие бесполого размножения, а также полностью секвенированный геном (Osiewacz, 2003; Coppin, Silar, 2007; Espagne et al., 2008). Кроме того, P. anserina - один из немногих видов грибов, дикие штаммы которого подвержены выраженному репликативному старению и смерти (Osiewacz, 2003; Мажейка и др., 2011). Старение P. anserina определяют как снижение способности клеток к пролиферации и/или дифференцировке (Silar et al., 2001). При этом известно, что в качалочной (перемешиваемой) глубинной культуре, поддерживаемой за счет последовательных серийных пассажей, мицелий P. anserina способен к неограниченному вегетативному росту, а накопление биомассы грибной культурой за один пассаж интенсифицируется с увеличением числа проведенных пассажей (Turker, Cummings, 1987). Несмотря на то, что были выявлены некоторые особенности изменчивости P. anserina в процессе продолжительного погруженного культивирования, дальнейшие исследования не проводились.

Цель работы: изучить характер изменчивости Р. атегта в условиях продолжительного погруженного культивирования и провести морфофизиологическое и генетическое исследование поверхностно растущих изолятов, получаемых в результате перенесения образцов мицелия из глубинных культур на агаризованную среду. Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние способа погруженного культивирования Р. атегта на характер изменений мицелия и возможность получения изолятов, отличающихся от исходного штамма по морфологии и продолжительности жизни.

2. Провести сравнительное изучение макроморфологических, микроморфологических и ультрасгруктурных признаков мицелия Р. атегта в глубинной и поверхностной культурах.

3. Определить качественный состав и количественное содержание пигментов, продуцируемых на свету мицелием Р. атегта после его продолжительного поддержания в условиях ротационной глубинной культуры.

4. Установить наследуемость признаков, приобретенных в ходе ротационного культивирования Р. атегта.

5. Изучить особенности функционирования электрон-транспортной цепи у «бессмертного» изолята Р. атегта.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые изучена генетическая изменчивость короткоживущего мицелиального гриба Р. атегта на основе адаптивных реакций в условиях продолжительного глубинного культивирования. Установлено, что аэрируемое (ротационное, или качалочное) культивирование Р. атегта представляет собой систему с выраженным селективным давлением, которая позволяет получать изоляты с определенными свойствами: в высокой степени адаптированные к условиям культивирования в жидкой среде и обладающие при этом увеличенной продолжительностью жизни, в несколько раз превосходящей продолжительность жизни исходных штаммов. Приобретенные в процессе качалочного культивирования признаки, важнейшие среди которых - измененная морфология колоний и сниженная способность синтезировать меланин, передаются потомкам от скрещивания с дикими штаммами, то есть обусловлены внутригеномными перестройками, реализуемыми в ходе поддержания гриба в глубинной культуре.

Впервые установлено, что продолжительное пассирование Р. атегта в качалочной культуре приводит к получению мицелия, лишенного темного пигмента меланина, но интенсивно продуцирующего на свету каротиноиды. Качественный

состав доминирующих каротиноидов P. anserina совпадает с таковым у близкородственного вида Neurospora crassa.

Впервые проведено детальное описание ультраструктуры мицелия P. anserina, культивируемого как в поверхностных, так и в погруженных условиях (ротационных и статических). Прослежено изменение клеточных компонентов в процессе старения мицелия, запрограммированной клеточной гибели, а также в процессе восстановления («реанимирования») в жидкой среде пролиферации клеток мицелия, прекратившего свой рост в поверхностных условиях. Процесс восстановления клеточных функций от практически полного их подавления в стареющих клетках P. anserina к нормальному осуществлению мог бы служить модельной системой для изучения фундаментальных механизмов выживания организмов в условиях действия эндогенного стресса.

Впервые отмечено, что у мутантов P. anserina с нарушениями дыхания не реализуется программа вегетативной несовместимости. Четко показано, что оплодотворение женских половых органов изучаемого вида гриба может происходить не только за счет микроконидий, но и за счет фрагментов вегетативного мицелия. Также выявлено частичное нарушение женского однородительского наследования митохондрий при оплодотворении вегетативным мицелием.

Полученные результаты дополняют имеющиеся сведения о биологии P. anserina - хорошо известного модельного объекта, позволяют глубже понять специфические аспекты нестабильности грибных геномов, могут помочь расширить методологическую базу биотехнологических приемов в области интенсификации накопления биомассы и синтеза целевых продуктов культурами мицелиальных грибов, а также получать новые штаммы, обладающие качествами, ценными для микробиологических производств.

Апробация работы. Основные положения работы изложены на 4th Conference on Physiology of Yeast and Filamentous Fungi (PYFF4) (Роттердам, Нидерланды, 2010) и XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), а также на заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Публикации. Опубликовано 8 печатных работ. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы и 1 статья сдана в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты работы и их обсуждение, а также содержит заключение и выводы. Диссертация изложена на 322 страницах, содержит 19 таблиц, 67 рисунков и 1 приложение. Список литературы включает 203 источника, из которых 172 зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены сведения по систематике, экологии и биологии, а также о молекулярных механизмах старения P. anserina, охарактеризовано культивирование мицелиальных грибов в погруженных условиях, рассмотрено явление генетической нестабильности микроорганизмов и его применение в биотехнологии.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Объекты и условия культивирования. Основными объектами исследования служили лабораторные штаммы P. anserina дикого типа - GFP1, si и sldik (таблица 1). Для интерпретации полученных результатов были также использованы другие виды аскомицетных грибов -Alternaría arborescence и N. crassa.

Продолжительность жизни P. anserina определяли методом серийных пассажей на чашках Петри, которые проводили с периодом в 3 сут (мицелий для инокуляции всегда брали из края колонии), либо выращивая мицелий без пересевов в специальных трубках с агаризованной средой. Соответственно, продолжительность жизни выражали как период времени (сут роста), прошедший от момента выделения штамма из аскоспоры до полного прекращения роста мицелия, либо как длину (см), на которую вырос мицелий за указанный промежуток времени.

Культивирование P. anserina осуществляли в темноте на стандартной синтетической среде М2, содержащей декстрин в качестве единственного источника углерода (Esser, 1974), в поверхностных и в погруженных условиях (в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в 100 мл среды). В качестве инокулятадля инициации

Таблица 1. Опытные штаммы Р. атегта и условия проведения экспериментов по продолжительному глубинному культивированию

Штамм Плоидность Тип спаривания Возраст мицелия в начале опыта, сут. роста Условия культивирования

GFP1 гаплоидный + 11 и 23 ротационное

32 (перенесен из ротационной культуры) статическое

si гаплоидный + 8 и 20 ротационное

8 и 20 статическое

sldik дикарио-тический само-фертилен 6 и 21 статическое

погруженных культур использовали образцы как молодого (6-11 сут роста), так и стареющего (20-23 сут роста) мицелия (таблица 1). Для создания различных условий аэрации осуществляли глубинное культивирование двух типов: статическое (без перемешивания) и качалочное (ротационная качалка, 200 об/мин). Глубинные культуры регулярно (через каждые 3 сут) пересевали на свежую питательную среду. В процессе их роста периодически производили высев образцов мицелия на агаризованную среду, дальнейшими пассажами на которой определяли его продолжительность жизни. Такие поверхностные культуры мы будем называть «изолятами». Под продолжительностью жизни изолята P. anserina понимали время, прошедшее от момента переноса мицелия из жидкой среды на агаризованную до полной остановки его роста.

Исходные поверхностные культуры P. anserina выращивали в 10-15 повторностях, глубинные - в 2-3 повторностях, культуры поверхностно растущих изолятов, полученных высевом из жидкой среды, - в 5 повторностях.

Культивирование A. arborescens проводили на среде Чапека в ротационных условиях в течение 140 сут, поддерживая непрерывный рост культуры методом серийных пассажей, которые осуществляли раз в 5-6 сут.

Цитологические наблюдения проводили при помощи светового микроскопа Axioskop 40 FL («Zeiss»), снабженного светофильтрами (№ 01 и 02 «Zeiss») и цифровой камерой AxioCam MRc («Zeiss»), при увеличении объектива хЮО. Благодаря наличию у штамма GFP1 митохондриальной метки в виде флуоресцентного белка GFP морфологию его митохондрий и характер их распределения в цитоплазме наблюдали по флуоресценции.

Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии образцы готовили по ранее отработанной методике (Матросова и др., 2009) и просматривали с помощью трансмиссионных микроскопов JEOL JEM-100В и JEOL JEM-1011.

Анализ каротиноидных пигментов. Для стимуляции синтеза каротиноидов исследуемые культуры P. anserina в течение 3-6 сут инкубировали на свету (интенсивность освещения 60 мкЕ/(м2хс) ФАР). Каротиноиды экстрагировали ацетоном или смесью Фолча (Folch et al., 1957), содержащей хлороформ и метанол (2:1). Спектральные измерения экстрактов были выполнены на спектрофотометре Hitachi 150-20 (Япония) в диапазоне от 350 до 750 нм (1=1 см) против соответствующих растворителей (ацетон или хлороформ). Качественный анализ пигментов осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Knauer (Германия) (Соловченко и др., 2008).

Саузерн-блот анализ митохоидриальной ДНК (мтДНК) P. anserina.

Наибольший интерес представляла целостность участка Есо4 мтДНК P. anserina размером 10,895 т.п.н., содержащего последовательность интрона а (а-вепДНК), амплификация и накопление которой сопровождает старение у штаммов дикого типа (Albert, Seilern, 2002). Выделение ДНК Р. anserina проводили смесью фенол-хлороформ. Саузерн-блот гибридизация радиоактивного ДНК-зонда Есо4 с суммарной ДНК, выделенной из мицелия гриба и обработанной рестриктазой НаеШ, была выполнена по ранее отработанной методике (Jamet-Vierny et al., 1980; Belcour, Vierny, 1986; Lecellier, Silar, 1994; Albert, Seilern, 2002). Продукты гибридизации визуализировали путем авторадиографии.

Проведение скрещиваний. Для проведения реципрокных скрещиваний между выбранными изолятами Р. anserina и тестерными дикими гаплоидными штаммами, имеющими тип спаривания «-», колонии каждого из изолятов и каждого из штаммов-партнеров по скрещиванию, выращивали на среде М2 одновременно в двух вариантах: на чашках Петри (выступает как материнский родитель при скрещивании) и на скошенной среде в пробирках (выступает как отцовский родитель). В пробирки добавляли 10-15 мл стерильной воды или среды MR (50 г/л кукурузной муки), тщательно взбалтывали для отделения микроконидий и переливали на поверхность колоний соответствующего материнского штамма-партнера для его оплодотворения. Аскоспоры выделяли под бинокуляром заточенной швейной иглой с внутренней поверхности крышек чашек Петри, на которые предварительно наносили слой голодного агара (30 г/л). Аскоспоры выделяли только из пятиспоровых сумок, содержащих три двуядерные и две одноядерные споры.

Результаты и обсуждение

Глава 3. Динамика изменения мицелия P. anserina в условиях продолжительного глубинного культивирования

Было установлено, что перенесение образцов поверхностно культивируемого мицелия P. anserina, находящегося на последних стадиях старения, то есть полностью остановившего свой рост, в жидкую среду приводит к возобновлению роста. В дальнейшем восстановленные («реанимированные») таким способом культуры при пассировании в режиме раз в 3 сут вели себя как обычные глубинные культуры Р. anserina, полученные из молодого мицелия. Доля успешных реанимирований в качалочной культуре составила 75%, в статической - 100%.

Морфофизиологические особенности Р. атеппа при длительном качалочном культивировании. Среди четырех параллельно инкубируемых качалочных культур Р. атегта, которые были получены как из молодого, так и из стареющего мицелия штаммов и СРР1, максимальное число пассажей для погруженной культуры равнялось 50, для ОРР1 - 62. Соответственно, общая продолжительность жизни от момента выделения аскоспоры до остановки экспериментов составила 161 и 200 сут роста, тогда как при пассировании на агаризованной среде изучаемые штаммы прожили 18,5±2,1 сут и 20,5±1,7 сут.

По совокупности признаков можно выделить три фазы адаптации Р. аюегта к условиям погруженного качалочного культивирования. Качалочные культуры, полученные из молодых и стареющих колоний штаммов ОРР1 и 81, различались по скорости прохождения фаз адаптации (таблица 2), тем не менее, их последовательность и общий характер были неизменными.

Таблица 2. Продолжительность фаз адаптации Р. атег1па к условиям длительного качалочного культивирования*

Штамм Номер пассажа в жидкой среде и сутки роста, соответствующие окончанию роста в пассаже

Начальная фаза (фаза I) Переходная фаза (фаза II) Фаза стабильного роста (фаза III)

GFP1 0-8 (14-38 сут) 9-11 (41-47 сут) начиная с 12 (начиная с 50 сут)

Реанимированный GFP1 I-XXX (32-119 сут) XXXI-XXXIII (122-128 сут) начиная с XXXIV (начиная с 131 сут)

sl 0-8 (11-35 сут) 9-18 (38-65 сут) начиная с 19 (начиная с 68 сут)

Реанимированный sl I -IX (32-56 сут) X-XIV (59-71 сут) начиная с XV (начиная с 74 сут)

* номера пассажей глубинных культур, полученных из молодого поверхностно растущего мицелия, обозначены арабскими цифрами, реанимированных культур -римскими.

Фаза 1, или начальная фаза. Ее основные признаки: мицелий рос в виде шаровидных пеллет 5-10 мм в диаметре. Гифы, формирующие наружный слой пеллет, были образованы клетками с утолщенными клеточными стенками, имели темную пигментацию, иногда до черной, обусловленную синтезом меланина (Соррт, ЭПаг,

9

2007; Espagne et al., 2008). Внешний слой пеллет нередко был корковидным. Внутренняя часть пеллет была сформирована рыхло расположенными неокрашенными гифами. В клетках наружного слоя присутствовала значительная доля шаровидных митохондрий, а также наблюдалась интенсивная флуоресценция белка GFP, экспрессируемого в митохондриях штамма GFP1. Перечисленные признаки были характерны также и для хондриома стареющего поверхностно растущего мицелия Р. anserina.

Фаза II, или переходная фаза. Мицелий постепенно утрачивал темную пигментацию, становясь светло-коричневым, желтоватым или даже белым в случае, если данная фаза затягивалась (у культуры si). Пеллеты были несколько мельче -диаметром 4-7 мм, в основном, с рыхлым верхним слоем, образованным, тем не менее, толстостенными клетками. Митохондрии были преимущественно палочковидными, но их флуоресценция по-прежнему оставалась интенсивной.

Фаза III, или фаза стабильного роста. Данная стадия характеризовалась интенсивным накоплением биомассы, в 3-5 раз превышающим биомассу качалочных культур на начальных этапах роста (рис. 1). Мицелий становился однородным по цвету и консистенции, практически белым с едва заметным желтоватым оттенком, очень рыхлым, иногда до кашеобразного (у штамма si). Потеря способности синтезировать меланин наблюдалась также у изолятов, полученных из культур рассматриваемой адаптивной фазы. Пеллеты были многочисленные, образованные по всему объему мицелием одного типа, разных размеров: от крупных - диаметром 5-10 мм, до очень мелких - 2-5 мм. Кроме того, в колбах присутствовал диффузный мицелий, не формирующий пеллеты. Клеточные стенки становились более тонкими. Хондриом снова приобретал признаки молодого поверхностного мицелия: митохондрии здесь были исключительно палочковидными, свечение GFP-белка - слабым.

В фазах I и II качалочного культивирования P. anserina образовывались многочисленные типичные микроконидии диаметром 2,24±0,05 мкм, тогда как в III фазе микроконидии практически не формировались либо формировались лишь единичные микроконидии, несколько более крупные по размеру. После приобретения серийно пассируемыми культурами всех свойств, характерных для фазы III, морфология мицелия при дальнейших пассажах переставала изменяться, биомасса, накапливаемая за один пассаж, оставалась относительно постоянной (рис. 1). Быстрый рост мицелия, происходящий с постоянной скоростью, - основной критерий физиологически молодого состояния клеток P. anserina.

А)

Рис. 1. Динамика накопления биомассы мицелием P. anserina в глубинных культурах за один пассаж (3 сут роста). А) штамм GFP1: 1 - GFP1, качалочная культура; 2 -реанимированный GFP1, качалочная культура; 3 - GFP1, статическая культура. Б) штамм si: I — si, качалочная культура; 2 - реанимированный s 1, качалочная культура; 3 -si, статическая культура; 4 - реанимированный s 1, статическая культура.

Морфофизиологические особенности Р. апзегига при длительном статическом культивировании. Характер роста статических культур Р. атегта отличался от качалочных. Мицелий здесь нарастал в виде погруженных мицелиальных матов, увеличивающихся радиально от кусочков инокулюма (инокулюмы погружались на дно колбы) и сливающихся в общую массу. Форма митохондрий была как палочковидная, так и шаровидная, флуоресценция была слабой или отсутствовала. У культур, пассируемых в статических условиях, и у полученных из них поверхностно растущих изолятов темный пигмент не утрачивался, его продукция усиливалась на свету. Статические культуры Р. апзегШ поддерживали менее продолжительное время - максимум 29 пассажей для штамма 15 пассажей для ОРР1 и 12 для э 1 (Нк, что также намного превышает продолжительность жизни гриба в поверхностной культуре. Однако в данных условиях мицелий Р. агкегта не избежал выраженного репликативного старения: после 8-11 пассажей статических культур, полученных из молодых штаммов, мицелий становился медленнорастущим, а биомасса, накапливаемая за один пассаж, резко снижалась (рис. 1). Не исключено, что здесь мы наблюдали один из вариантов старения изучаемого гриба, возможно, сильно растянутый во времени. Реанимированный мицелий в статических условиях сразу давал стареющие медленнорастущие культуры.

Таким образом, мы не только подтвердили явление неограниченного вегетативного роста Р. агкеппа при выращивании гриба в глубинной аэрируемой культуре методом серийных пассажей, но и выяснили его взаимосвязь с условиями культивирования.

Таблица 3. Биомасса, накапливаемая качалочными культурами А. агЬогезсет за 6 сут роста

Среда культивирования Масса сухого мицелия, г/100 мл среды культивирования

нулевой пассаж' заключительный пассаж2

среда Чапека 1,24*0,39 1,37±0,21

среда Чапека с декстрином 1,42±0,13 1,29±0,21

1 - цикл культивирования в погруженных условиях, проведенный непосредсвенно после перенесения образцов поверхностного мицелия гриба в жидкую среду;

2 - цикл культивирования в погруженных условиях, проведенный перед остановкой экспериментов (25-й пассаж) по долговременному поддержанию мицелия гриба в условиях погруженного культивирования.

Продолжительное качалочное культивирование Alternaría arborescens. Характер роста Л. arborescens в ротационных условиях изначально напоминал характер роста Р. anserina в третьей адаптивной фазе и практически не изменился за время проведения эксперимента. Биомасса, набираемая качалочной культурой A. arborescens за один пассаж, была относительно велика уже в первом пассаже и не увеличилась с увеличением числа проведенных пассажей (таблица 3). Необратимых изменений морфологии и характера роста A. arborescens, в отличие от Р. anserina, в процессе продолжительного культивирования в аэрируемых условиях отмечено не было.

Глава 4. Характеристика изолятов из длительно поддерживаемых глубинных

культур Р. anserina

Продолжительность жизни и морфология изолятов Р. anserina в зависимости от типа и возраста глубинной культуры. К моменту перехода в III фазу средняя продолжительность жизни изолятов, полученных путем высева образцов мицелия из ротационных культур на агаризованную среду, начинала возрастать (рис. 2) и далее превышала продолжительность жизни контрольных штаммов в несколько раз (от 1,5 до >8 раз). На этом фоне среди одновременно отсеваемых повторностей были выделены единичные очень долгоживущие изоляты, продолжительность жизни которых в несколько раз превышала среднюю в пассаже (показаны на рис. 2 справа от каждого столбца, соответствующего средней продолжительности жизни, если таковые имелись в данном пассаже). Также были получены изоляты, не остановившиеся в росте до конца проведения опыта (отмечены на рис. 2 стрелкой). Рост последних поддерживали от 147 до 252 сут от момента высева из качалочной культуры до остановки экспериментов.

Исходные штаммы дикого типа, si и GFP1, на агаризованной среде М2 обладали скоростью роста 6,3-6,9 мм/сут, были представлены широко растущими лопастными войлочными колониями с хорошо развитым воздушным мицелием, приобретающим со временем интенсивную темно-серую пигментацию с зеленоватым оттенком, которая усиливалась на свету (рис. 4 а). Изоляты из качалочных культур I и II фаз в поверхностной культуре обычно были представлены слабо пигментированными медленнорастущими (2,5-5,5 мм/сут) колониями, частично или полностью утратившими воздушный мицелий. Изоляты, отсеянные из ротационных культур III фазы роста, характеризовались хорошо выраженным непигментированным воздушным мицелием прижатого (рис. 4 б), войлочно-прижатого или клочковато-прижатого типа и средней скоростью роста в пределах 5,5-6,7 мм/сут.

Л А АЛ А,

9 10 12 13 15 16 17 18 19 22 27 28 29 34 38 39 43 46 51 Номер пассажа в глубинной культуре

Рис. 2. Продолжительность жизни изолятов P. anserina, полученных из качалочных культур: 1 - изоляты V-GFP1; 2 - изоляты V-GFP1 из реанимированной культуры; 3 - изоляты V-sl; 4 - изоляты V-sl из реанимированной культуры; К - исходные (контрольные) штаммы GFP1 и si соответственно.

к 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Номер пассажа в глубинной культуре

Рис. 3. Продолжительность жизни изолятов Я. апяегта, полученных из статических культур: 1 - изоляты У-ОРР1; 2 - изоляты У-з1; 3 - изоляты У-э^к; 4 - изоляты У-51 из реанимированной культуры; 5 - изоляты У-з1сйк из реанимированной культуры; К -исходные штаммы йРР1, и в1сйк соответственно.

Из статически выращиваемых погруженных культур Р. атегта долгоживущих изолятов получено не было. Напротив, продолжительность жизни изолятов закономерно снижалась с увеличением числа пересевов (рис. 3). Их тип колоний и характер пигментации не отличался от контрольного.

Бессмертный изолят \'2-81-1\'(2) Р. атегта. Один из полученных в настоящей работе изолятов условно был назван «бессмертным». Данный изолят, в отличие от других долгоживущих изолятов Р. атегта, продемонстрировал стабильный рост и отсутствие признаков старения на всем протяжении его непрерывного культивирования, а также не претерпел изменений в процессе хранения.

Саузерн-блот гибридизация радиоактивного ДНК-зонда Есо4 с суммарной ДНК, выделенной из мицелия бессмертного изолята У2-з1-1У(2) и обработанной рестриктазой НаеШ, выявила различия между последовательностями митохондриальной хромосомы дикого типа и данного изолята. У исследуемого изолята на авторадиограмме полностью отсутствовали полосы, соответствующие фрагментам мтДНК 1,889, 1,188 и 0,841 т.п.н. Накопление последовательности а-эепДНК не было выявлено. Вместе с тем, у изолята У2-з1-1У(2) был обнаружен новый фрагмент рестрикции длиной 0,9 т.п.н., отсутствующий у диких штаммов (рис. 5).

а) дикии тип

б) изолят V-GFP1-51

тип f

е)тип г

Рис. 4. Основные морфологические типы колоний P. anserina: а, б) родительские варианты; в-е) типичные представители основных морфологических классов потомков от скрещивания диких штаммов с изолятами, полученными из качалочных культур, перешедших в адаптивную фазу III.

16

8,0 6,0 5,0 4,0

3,0

2,0 1,5

1,0

Рис. 5. Саузерн-блот анализ митохондриальной ДНК P. anserina. Справа указаны размеры фрагментов молекулярного маркера (т.п.н.), слева - фрагментов ЯаеШ-мтДНК (т.п.н.), гибридизующихся с радиоактивным ДНК-зондом Есо4. 1 - s 13(—), молодая культура; 2 - sl4(+), молодая культура; 3 - s20(+), стареющая культура; 4 - s21(-), стареющая культура; 5,6 - изолят V2-sl-IV(2); 7 - молекулярный маркер.

Полученные данные говорят о том, что в митохондриальном геноме бессмертного изолята V2-si-IV(2) имеется делеция, захватывающая ген coxl. Наличие делении в гене coxl у P. anserina предполагает, что комплекс IV основной дыхательной цепи неактивен, а дыхание мутанта осуществляется за счет функционирования альтернативной оксидазы (Dufour et al., 2000; Albert, Seilern, 2002), что в отношении изолята V2-sl-IV(2) в настоящей работе было экспериментально подтверждено другими методами исследования.

Глава 5. Ультраструкгура поверхностно растущего и глубинного мицелия Р. anserina

Наиболее серьезной перестройке в зависимости от физиологического возраста мицелия, условий либо продолжительности культивирования подвергались клеточные покровы, митохондрии и липидные включения. Была выявлена корреляция между

17

12 3 4

5 6

—

г

? wWfii т ШШ

-

> * -

ЙЙ Шв

плотностью расположения митохондрий в клетке и морфологической выраженностью процесса старения: старение мицелия, растущего на агаризованной среде, сопровождалось увеличением количества митохондриальных профилей, приходящихся на 1 мкм2 среза клетки, а «омоложение» мицелиальной культуры, серийно пассируемой в аэрируемых условиях, напротив, - снижением данного показателя. Изоляты Р. сшеппа, не имеющие морфологических признаков старения, по ультраструктуре практически не отличались от молодого контрольного мицелия.

В клетках погруженного мицелия Р. апяеппа, недавно подвергнутого «реанимированию», было обнаружено крайне высокое содержание липидов -липидные глобулы могли занимать практически всю площадь клеточного среза, что коррелировало с ярко выраженной деструкцией хондриома (рис. 6). Как показало дальнейшее серийное пассирование реанимированных культур Р. атеппа, полное восстановление роста, макро- и микроморфологии мицелия реализовалось только в аэрируемой среде.

Рис. 6. Ультраструктура клеток мицелия Р. апзеппа'. слева - поверхностно растущий молодой контрольный мицелий, штамм 81, 11 сут роста от выделения аскоспоры; справа - мицелий, «реанимированный» в условиях статического погруженного культивирования, штамм 32 сут роста от выделения аскоспоры, 1-пассаж в погруженных условиях после восстановления роста.

Глава 6. Идентификация и определение качественного состава каротиноидиых пигментов P. anserina

Все лишенные меланина ротационные глубинные культуры P. anserina (фаза III) и полученные из них изоляты приобретали на свету розовое или розово-оранжевое окрашивание. Интенсивность пигментации не зависела от количества проведенных на агаризованной среде пассажей и проявлялась в неизменном виде под действием света до конца жизни изолята или до конца проведения опыта.

Спектры поглощения всех изученных экстрактов из мицелия P. anserina имели характерный для каротиноидов спектр с максимумами и плечом в сине-зеленой области (400-550 нм). Хроматографический анализ показал, что по качественному составу набор основных каротиноидов, синтезируемых P. anserina, совпадает с каротиноидным составом N. crassa (рис. 7). Качественный состав каротиноидов P. anserina не зависел от изолята и условий культивирования.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Рис. 7. Состав каротиноидов в мицелии Р. anserina и N. crassa (% от суммарного содержания каротиноидов): 1 - N. crassa (глубинный мицелий); 2-Я. anserina, изолят V-GFP1-22, 17 сут роста (поверхностный мицелий); 3-Р. anserina, культура sl, 152 сут роста (глубинный мицелий). I - нейроспороксантин, II - торулин, III - у-каротин, IV -ß-каротин.

Следует полагать, что образование на свету каротиноидов неокрашенным мицелием Р. anserina осуществлялось в качестве фотозащиты и компенсировало тем самым отсутствие меланина (Соловченко, Мерзляк, 2008). Лишенные маланина аэрируемые культуры Р. anserina, инкубируемые на свету от момента инокуляции,

19

приобретали очень интенсивное кирпично-красное окрашивание, которое было отмечено сразу же с началом роста мицелия (содержание каротиноидов в грамме сухого мицелия при этом достигало 2844 мкг/г у погруженной культуры 81 и 790 мкг/г '. у ОРР1). Если же на качалку с освещением переносили культуры Р. атегта, значение биомассы которых уже вышло на плато, то окраска мицелия становилась всего лишь розовой, а содержание каротиноидов в мицелии было значительно ниже (соответственно 149 мкг/г для и 187 мкг/г для ОРР1).

Глава 7. Генетический анализ долгоживущих изолятов Р. атегта

Частичная потеря фертнльности у изолятов Р. амегта. Осуществление реципрокных скрещиваний долгоживущих изолятов Р. атегта с дикими штаммами методом смыва микроконидий показало, что у изолятов произошла потеря женской фертнльности. Выступая в качестве материнского родителя, они не формировали плодовых тел либо в редких случаях формировали единичные плодовые тела. Поэтому большинство изолятов Р. атеппа при скрещивании с дикими штаммами могли быть использованы только в качестве мужского родителя (таблица 4).

Мужская фертильность у изолятов Р. атегта, напротив, сохранилась. Однако большинство исследуемых изолятов проявляли мужскую фертильность только в том случае, если смыв с их колоний проводили без последующей фильтрации. Если же смываемую жидкость перед нанесением на колонию материнского штамма пропускали через специальный фильтр с диаметром пор, соответствующим диаметру микроконидий Р. атеппа, то большинство из них оказывались неспособными к оплодотворению. Невозможность оплодотворить материнский штамм коррелировала с отсутствием у них типичных микроконидий. У части изолятов Р. атеппа (У-ОРР1-43(1), У-з1-1У(3) и У2-51-1У(2)) микроскопирование не выявило микроконидий вовсе; у других (У-йРР1-51(1), У-вРР 1-ХХХУ1Щ4) и У-э 1-46(4,5)) формировались нетипично крупные и немногочисленные микроконидии. Данное обстоятельство позволило предположить, что оплодотворение протоперитециев Р. атегта возможно не только за счет микроконидий, но и за счет фрагментов неспециализированных вегетативных гиф, что и было нами четко продемонстрировано для штаммов дикого типа изучаемого вида гриба.

Общее количество потомков от скрещиваний изолятов Р. атегта составило 862, среди которых было 447 дикариотических и 415 гомокариотических.

Таблица 4. Частота встречаемости морфологических типов и продолжительность жизни потомков первого поколения от скрещивания долгоживущих изолятов Р. агяегта со штаммами дикого типа

Изолит Вариант участия в скрещивании Основные характеристики потомков

Общее количество Частота встречаемости морфологических типов1, % Количество гомокарионов Средняя продолжительность жизни2, см

Тестерные штаммы дикого типа - 4 дикий - 100 4 12,8±1,0 (4)

У-СРР1-43(1) $ У-ОРР1-43(1) 6 дикий - 16,7 тип У-ОРР1-43 -16,7 тип Г-33,3 тип г-33,3 6 13,0±1,5 и 58,1 (6)

3 У-ОРРЬ 43(1) 5 дикий - 40 тип У-СРР1-43-20 ТИП 5-40 5 18,5±7,0 и 51,5 (5)

У-СРР1-51(1) 3 У-ОРР1-51(1) 99 дикарионы: дикий - 48 тип Г - 52 гомокарионы: дикий-35,1 тип У-ОРР1-51-33,3 тип Г—21,1 тип г - 10,5 57 10,4±1,4 (9)

У-ОРР1-ХХХУШ(4) 3 У-ОРР1-ХХХУШ(4) 28 дикий-71 тип У-СРР1-XXXVIII - 29 28 -

У-э1- 22(1,2)свет3 3 \-s\-22(1,2)свет 197 дикарионы: дикий - 3,8 тип У-э 1 -22свет - 28,3 тип 8-30,2 тип i~ 6,6 тип г-3,8 тип с - 27,3 гомокарионы: дикий-31,9 тип У-81-22свет— 12,1 тип Б - 28,6 тип Г- 14,3 тип г-3,3 тип с - 9,8 91 12,0±1,2 (36)

у-з 1-46(4,5) <3 У-Б 1-46(4,5) 100 дикарионы: дикий - 0 тип У-51-46 -34,1 тип в-19,5 тип Г-24,4 59 14,9±2,5 (3)

тип г - 17,1 тип с - 4,9 гомокарионы: дикий-16,9 тип V-sl-46-10,2 тип s -33,9 тип f-27,1 тип г - 6,8 тип с-5,1

V-sl-IV(3) $ V-sl-IV(3) 2 дикий - 100 2 15,5 и 16,6(2)

с? V-sl-IV(3) 15 дикий - 100 15 15,0±1,5 (8)

V2-sl-IV(2) совместный посев 410 дикарионы: дикий-51,8 промежуточный - 41,9 светлоокрашенный - 4,7 респираторный мутант - 1,6 гомокаоионы: дикий-91,4 светлоокрашенный - 7,9 респираторный мутант - 0,7 152 бессмертные (5)

Примечания:

1 - описание морфологических типов потомков от скрещивания см. в тексте;

2 - продолжительность жизни определяли только для гомокариотических штаммов,

принадлежащих к разным морфологическим группам. Непрерывный рост потомков изолятов У-СРР 1-43(1) и У-з1-1У(3) поддерживали методом серийных пассажей на чашках Петри с периодом в 3 сут, остальных - путем выращивания в трубках с агаризованной средой. В скобках указано количество потомков, для которых была установлена продолжительность жизни. В случаях, когда разброс значений продолжительности жизни был слишком велик, указано не среднее значение, а результаты типичного опыта;

3 - в скобках через запятую указаны порядковые номера повторностей данного высева

из погруженной культуры, которые использовались в скрещиваниях.

Характеристика потомков первого поколения от скрещивания долгоживуших изолятов Р. апхегма с дикими штаммами. Потомки изолятов 1-1У(3) и У2-з1-1У(2), высеянные после непродолжительного культивирования Р. аюегта в качалочных условиях (фаза I), в подавляющем большинстве имели колонии дикого типа либо несущественно от него отличающиеся (некоторые потомки изолята У2-81-1У(2)), то есть воспроизводили фенотип исключительно родительского штамма дикого типа. Кроме того, у бессмертного митохондриального мутанта У2-з1-1У(2), обладающего полной женской стерильностью и не формирующего микроконидии,

были получены бессмертные потомки, полностью повторяющие мутантный фенотип. Последнее обстоятельство свидетельствует о том, что ранее показанное для Р. anserina однородительское наследование митохондрий (Contamine, Picard, 1998) не является строгим - возможна трансмиссия митохондрий из соматических гиф отцовского партнера в женские половые органы материнского.

Остальные используемые в скрещиваниях изоляты Р. anserina, то есть V-GFP1-43(1), V-GFP1-51(1), V-GFP 1-XXXVIII(4), V-sl-22(l,2)cBeT и V-sl-46(4,5), были получены из продолжительное время поддерживаемых качалочных культур, перешедших в III фазу роста, а их половые потомки, как гомокариотические, так и дикариотические, напротив, характеризовались большим разнообразием морфологических признаков (рис. 4). Помимо родительских фенотипов (дикого и фенотипов скрещиваемых изолятов) у потомков первого поколения наблюдали целый спектр признаков, не свойственных родителям.

Среди половых потомков первого поколения от скрещивания долгоживущих изолятов Р. anserina с дикими штаммами нами выделены четыре морфологические группы, отличающиеся при росте на агаризованной среде М2 типом воздушного мицелия (рис. 4). Тип «с» характеризовался клочковатым воздушным мицелием, который формировался в центральной части, по краю либо по всей поверхности колонии. Тип «s» имел воздушный мицелий коричневатого оттенка и специфической морфологии: колонии выглядели мучнистыми или порошистыми вследствие гиперпродукции микроконидий. Гиперпродукция микроконидий в наших опытах отмечена только у изолятов V-sl-22cBeT. Ни у исходных контрольных, ни у тестерных штаммов, ни у остальных поверхностно растущих изолятов Р. anserina, включая используемые для скрещиваний, подобной гиперпродукции отмечено не было. Тип «f» — разнородная группа, воздушный мицелий, в отличие от типа «с», был здесь плотным, прижатым или войлочно-прижатым, более или менее однородным по всей поверхности колонии. Тип «г» отличался от типа «f» стелющимся, частично редуцированным воздушным мицелием.

Штаммы-потомки, колонии которых принадлежали типам «с», «s» и «г», характеризовались отсутствием меланиновой окраски. На свету колонии «с» и «г» типов синтезировали пигменты, обусловливающие розовое окрашивание; колонии «s»-типа давали бурую окраску. Для типа «f» была свойственна промежуточная пигментация - слабый синтез меланинов в сочетании с продукцией каротиноидов. Морфологические типы потомков исследуемых изолятов Р. anserina, их доля от общего количества и средняя продолжительность жизни приведены в таблице 4.

Глава 8. Обсуждение

Проведение скрещиваний долгоживущих изолятов Р. anserina, полученных высевом образцов мицелия из качалочных культур III фазы адаптации, с дикими штаммами позволило обнаружить среди потомков первого поколение большое разнообразие морфологических типов, в том числе не свойственных ни одному из родителей. Данное обстоятельство свидетельствует об отборе в данных условиях мутаций разного рода. Следовательно, характерные морфологические признаки изолятов из культур III фазы обусловлены внутригеномными перестройками.

Мицелиальную культуру Р. anserina, по-видимому, следует рассматривать как популяцию относительно независимых клеток, в которой имеют место микроэволюционные процессы, результативность которых зависит от условий роста. С одной стороны, в качалочном варианте культивирования мицелий Р. anserina оказался в условиях селективного давления, с другой - в условиях эффективного отбора.

Селективное давление на популяцию создается стрессирукмцими внешними факторами. В условиях аэрируемого погруженного культивирования мицелий Р. anserina первоначально испытывал сильное стрессовое воздействие, о чем говорят признаки культуры, отмеченные в первой фазе адаптации. Важнейшие среди рассматриваемых признаков: слабое накопление биомассы, усиленная пигментация наружного слоя пеллет, значительное утолщение клеточных стенок, сильное изменение формы клеток, формирование большого числа микроконидий, снижение визуализации внутриклеточных компонентов при проведении электронно-микроскопических наблюдений, обнаружение относительно большого количества активных лизосом в цитоплазме, интенсивная флуоресценция GFP-белка, а также низкая продолжительность жизни высеваемых изолятов.

Надо полагать, эффективный движущий отбор был обусловлен пространственной организацией мицелия в форме пеллет. В статических условиях отсутствуют факторы, приводящие к механическому повреждению мицелия, формированию пеллет и к их фрагментации, то есть к образованию множества относительно независимых субпопуляций, в которых исходные дикие фенотипы могут вытесняться вновь возникающими вариантами. Отсутствие перемешивания при статическом погруженном культивировании, очевидно, является благоприятным фактором для первоначальной адаптации Р. anserina к росту в жидкой среде, так как в течение нескольких первых пассажей статические культуры набирали большую биомассу, чем соответствующие качалочные, а морфология клеток претерпевала минимальные изменения по сравнению с поверхностно растущим контролем. Тем не

менее, дальнейшее пассирование в условиях статической культуры приводило к угнетению роста мицелия. Не исключено, что здесь мы наблюдали один из вариантов старения изучаемого гриба, возможно, сильно растянутый во времени. Надо полагать, при глубинном культивировании без перемешивания мицелий P. anserina представлял собой единую непрерывную сеть, в которой специфические факторы старения (важнейшими среди которых традиционно считаются а-вепДНК), амплифицирующиеся в клетках изучаемого вида гриба и участвующие в связанной со старением деградации мтДНК, могли беспрепятственно мигрировать и накапливаться, приводя к замедлению роста, то есть к старению культуры в целом.

Изменения фенотипа, сходные с изменениями мицелия P. anserina, серийно пассируемого в качалочной культуре, наблюдали у Aspergillus niger при его долговременном культивировании в хемостате. У последнего доминирующими становились стабильные неокрашенные варианты, не формирующие конидии или имеющие сниженную способность к их формированию и обладающие более высокой скоростью роста, чем дикий тип (van de Vondervoort et al., 2004). Видимо, в основе изменчивости P. anserina и A. niger лежат сходные механизмы.

Судя по всему, условия погруженного качалочного культивирования, которые оказались стрессирующими для P. anserina, не были таковыми для A. arborescerts. Для A. arborescens выбранные условия изначально были благоприятными, следовательно, гриб не нуждался в выраженной адаптации к ним, а проводимый в ходе серийного пассирования мицелия отбор был в данном случае неэффективен в отношении возможных вновь возникающих в культуре генетических изменений, а был направлен на поддержание имеющегося типа роста.

Вместе с тем, закономерная потеря способности P. anserina синтезировать меланин, закрепляющаяся генетически в определенном фенотипе, может выглядеть противоречащей повышению адаптивных свойств культуры. Меланины выполняют ряд важных функций в клетках грибов, способствуя выживанию грибных организмов в окружающей среде (Langfelder et al., 2003). То же можно сказать и об утрате женской фертильности, наблюдаемой у изолятов P. anserina, полученных из параллельно поддерживаемых культур. Тем не менее, наследственный материал организма представляет собой целостную систему, и отбор по любому признаку, даже более или менее дискретному, сопровождается коррелятивными перестройками других признаков (Северцов, 1990). Оптимизация реальных систем возможна лишь как нахождение компромисса между противоречивыми требованиями оптимизации различных параметров (Расницын, 1987). Основываясь на предложенной теоретической базе,

можно предположить, что относительно быстрые внутригеномные перестройки Р. anserina в условиях качалочного культивирования осуществлялись в направлении повышения функциональной адаптивности одних ее подсистем ценой снижения функционирования других. Редукция отдельных функций - неизбежный результат компромисса. Кроме того, данный подход согласуется с блочно-модульным принципом эволюции (Ратнер, 1993; Гунбин и др., 2007) и показывает, почему в любой популяции клеток либо организмов не так уж много возможностей для эволюционных преобразований, что в случае культивирования Р. anserina выражалось как повторение одного и того же или сходных результатов в нескольких независимых экспериментах.

В наших опытах по серийному пассированию мицелия Р. anserina в ротационных условиях адаптация культуры, очевидно, была направлена на интенсификацию вегетативного роста, осуществляемую за счет максимально быстрого и эффективного потребления субстрата и за счет блокировки затрат энергии на синтез вторичных метаболитов и органов полового размножения. Таким образом, главный вектор преобразований Р. anserina был направлен на смену исходно присущей ей г-стратегии отбора, которая характеризуется способностью организма к быстрому размножению и короткой продолжительностью жизни отдельных особей, на К-стратегию, отличающуюся более высокой продолжительностью жизни и низкой скоростью размножения (Rayner et al., 1985). Первая жизненная стратегия, несомненно, более выгодна для Р. anserina в природных условиях, так как ее естественный субстрат обитания (экскременты животных) отличается эфемерностью и большой нестабильностью; K-стратегия может быть реализована в стабильных лабораторных условиях.

Старение многих видов живых организмов тесно связано с генетической нестабильностью. Возрастозависимые изменения ДНК включают изменения генной экспрессии, уменьшение эффективности репарации ДНК, увеличение частоты мутаций, инактивацию ряда генов, происходящую в том числе в результате инсерции мобильных элементов, хромосомные перестройки, разрывы хромосом и др. (Nikitin, Shmookler Reis, 1997). Не исключено, что эффективная индукция генетической нестабильности у Р. anserina также может быть связана со старением. В модельной системе серийного пассирования Р. anserina в условиях погруженной качалочной культуры может иметь место синергический эффект старения мицелия, связанной с ним дестабилизации генома и отбора клеток, по каким-либо причинам избежавших наступления старения, что в совокупности создает возможность для получения при высеве на плотные среды

долгоживущих изолятов, отличающихся морфологически и генетически от исходных штаммов Р. атеппа.

Заключение

Выделяемые из природной среды изоляты далеко не всегда обладают свойствами, требуемыми в условиях промышленного культивирования. Важнейшие среди них - устойчивость к стрессам различной природы, действие которых, как правило, отмечают в искусственно создаваемых условиях роста, и высокий выход биомассы и/или целевых метаболитов. Однако микробиологические культуры с заданными свойствами могут быть получены путем разнообразных манипуляций.

Проведенное нами исследование подтверждает перспективность метода долговременного серийного пассирования в аэрируемых погруженных условиях для получения штаммов мицелиальных грибов с измененными, адаптивными признаками. Установлено, что для успешной реализации задачи отбора вариантов мицелиального гриба, отличающихся от исходных штаммов морфологически, физиологически и генетически, требуется соблюдение ряда условий проведения экспериментов: условия культивирования должны оказывать выраженное стрессирующее воздействие на выбранный вид и/или штамм, но при этом они не должны вызывать полное угнетение роста мицелия, желательно формирование в культуре многих независимых точек роста (рост в форме пеллет). Также следует предположить, что данный метод будет эффективен, прежде всего, для видов грибов, обладающих высоким потенциалом к дестабилизации генома.

Выводы

1. Впервые изучена генотипическая изменчивость Р. атеппа на основе адаптивных реакций мицелия в условиях продолжительного глубинного культивирования.

2. Прослежена динамика изменения макроморфологии, микроморфологии и ультраструктуры мицелия Р. атеппа в процессе длительного глубинного культивирования. В ротационном варианте культивирования выделено три последовательно сменяющие друг друга фазы адаптации, приводящие к формированию быстрорастущей культуры, у которой полностью отсутствуют признаки старения. Установлено, что, в отличие от ротационного, статическое культивирование не препятствует старению Р. атеппа.

3. Продемонстрирована возможность восстановления роста у стареющего мицелия Р. атеппа путем его перенесения в жидкую среду.

4. Обнаружена закономерная потеря темного пигмента меланина у Р. anserina в процессе продолжительного ротационного культивирования. Показано, что на свету у лишенных меланина изолятов в качестве фотозащиты синтезируются каротиноидные пигменты, основные среди которых: нейроспороксантин, торулин, у-каротин и ß-каротин. Предложен способ культивирования Р. anserina, приводящий к гиперпродукции каротиноидов.

5. Установлена наследуемость ряда морфофизиологических признаков, приобретенных Р. anserina в процессе продолжительного ротационного культивирования, важнейшие среди которых - морфология колоний и частичная или полная утрата способности синтезировать меланин.

6. Экспериментально подтверждено участие неспециализированного вегетативного мицелия Р. anserina в оплодотворении протоперитециев.

7. Показано, что полученный нами спонтанный бессмертный изолят Р. anserina является сох-1 мутантом, в результате чего в его клетках не происходит накопление специфического фактора старения Р. anserina а-вепДНК, а дыхание осуществляется исключительно за счет альтернативной оксидазы, что обеспечивает низкий уровень образования активных форм кислорода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК для публикации

основных положений по теме диссертации.

1. Кудрявцева O.A., Дунаевский Я.Е., Камзолкина О.В., Белозерский М.А. Протеолитические ферменты грибов: особенности внеклеточных протеаз ксилотрофных базидиомицетов // Микробиология. 2008. Том 22, № 6, с. 725-737.

2. Матросова Е.В., Мажейка И.С., Кудрявцева O.A., Камзолкина О.В. Морфогенез и ультраструктура митохондрий базидиомицетов родов Agaricus и Pleurotus // Цитология. 2009. Том 51, № 6, с. 490-499.

3. Мажейка И.С., Кудрявцева O.A., Камзолкина О.В. Контроль продолжительности жизни у грибов и других организмов. Концепция весов // Журнал общей биологии. 2011. Том 72, № 4, с. 243-268.

4. Кудрявцева O.A., Мажейка И.С., Соловченко А.Е., Камзолкина О.В. Генетическая нестабильность короткоживущего аскомицетного гриба Рodospora anserina, индуцируемая в процессе продолжительного глубинного культивирования // Микробиология. 2011. Том 80, № 6, с. 772-786.

5. Кудрявцева O.A., Камзолкина О.В., Мажейка И.С., Селлем К. Митохондриальный респираторный мутант Podospora anserina, полученный путем продолжительного глубинного культивирования стареющего мицелия // Микробиология (принята к печати).

Тезисы, материалы конференций.

1. Козлова М.В., Кудрявцева O.A., Матросова Е.В., Камзолкина О.В. Особенности ультраструктуры клеток в смешанной культуре вешенки и дрожжей. Материалы международной конференции, посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Москва. 2006. С. 69-70.

2. Кудрявцева O.A., Дунаевский Я.Е., Камзолкина О.В., Белозерский М.А. Внеклеточные протеолитические ферменты ксилотрофного базидиомицета Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel. VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 72.

3. Kudryavtseva O.A., Kamzolkina O.V. Reanimation of dying Podospora anserina cultures in liquid medium // 4th Conference on Physiology of Yeast and Filamentous Fungi (PYFF4). Programme and abstract book. 1-4 June 2010. Rotterdam, the Netherlands, p. 62.

4. Кудрявцева O.A. Характеристика долгоживущих и бессмертных изолятов Podospora anserina, полученных методом продолжительного глубинного культивирования. XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Секция «Биология». Москва, 11-15 апреля 2011. С. 152-153.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю Ольге Владимировне Камзолкиной за помощь и всестороннюю поддержку при выполнении работы. А также благодарю Carole Sellem, Annie Sainsard-Chanet (CNRS, Centre de Génétique Moléculaire, France) и Алексея Евгеньевича Соловченко (кафедра биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова) за предоставление штаммов, материалов, оборудования и помощь в проведении некоторых экспериментов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (РФФИ), грант № 07-04-00274-а, и European Molecular Biology Organization (EMBO), ASTF № 6-2010.

Заказ №42-Р/10/2011 Подписано в печать 11.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п. л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 (// www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудрявцева, Ольга Александровна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СШ1 1 6 5 294 "

КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна

Индукция генетической нестабильности Ройоърога атеппа (КаЬепЬ.) N16881 в процессе продолжительного глубинного культивирования

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор О.В.Камзолкина

Специальность 03.02.12 - микология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

Оглавление

Список сокращений............................................................................................8

Введение..............................................................................................................10

Цели и задачи исследования...........................................................................13

Глава 1. Обзор литературы.............................................................................14

1.1. Общая характеристика и «синдром старения» Р. атегіпа......................14

1.1.а. Особенности организации мицелиальных грибов. Явление

старения у грибов...........................................................................................14

1.1.6. Диагностические признаки, экология и распространение

Р. атегіпа.......................................................................................................17

1.1 .в. Жизненный цикл Р. атегіпа..............................................................21

1.2. Молекулярные механизмы старения Р. атегіпа......................................25

1.2.а. Нестабильность митохондриального генома Р. атегіпа.................26

1.2.6. Генерация митохондриями активных форм кислорода...................32

1.2.в. Участие ядерного аппарата в регуляции продолжительности жизни Р. атегіпа............................................................................................41

1.3. Культивирование мицелиальных грибов в погруженных условиях.......44

1.3.а. Морфофизиологическая характеристика погруженных культур

мицелиальных грибов....................................................................................44

1.3.6. Роль стрессов в процессах адаптации и дифференцировки у грибов..............................................................................................................49

1.3.в. Окислительный стресс в погруженных культурах грибов..............52

1.4. Генетическая нестабильность микроорганизмов......................................55

1.4.а. Явление генетической нестабильности у грибов..............................56

1.4.6. Взаимосвязь между старением и генетической

нестабильностью............................................................................................62

1.4.в. Стресс-индуцируемый и адаптивный мутагенез..............................65

1.4.г. Канализация эволюции. Бл очно-модульный принцип эволюции.........................................................................................................68

1.5. Биотехнологические перспективы селекции генетических вариантов в условиях продолжительного глубинного культивирования.....71

1.5.а. Цели и методы современной биотехнологии....................................71

1.5.6. Примеры изменения свойств культур микроорганизмов в процессе продолжительного погруженного культивирования (эволюционная инженерия)...........................................................................74

Глава 2. Материалы и методы исследования..............................................81

2.1. Объекты и условия культивирования........................................................81

2.2. Получение моноспоровых изолятов Р. атеппа и определение типа спаривания...........................................................................................................83

2.3. Продолжительное глубинное культивирование Р. атеппа. Схемы постановки экспериментов.................................................................................84

2.4. Генетический анализ изолятов Р. атеппа....'............................................92

2.5. Оплодотворение Р. атеппа вегетативным мицелием.............................93

2.5.а. Оплодотворение методом смывов с поверхности колоний,

проведенных без фильтрации.......................................................................94

2.5.6. Оплодотворение методом точечного нанесения мицелия...............95

2.6. Цитологические наблюдения......................................................................96

2.6.а. Световая микроскопия.........................................................................96

2.6.6. Трансмиссионная электронная микроскопия....................................96

2.7. Анализ каротиноидных пигментов Р. атеппа и N. сгаББа......................97

2.7. а. Идентификация и определение общего содержания

каротиноидных пигментов в мицелии.........................................................99

2.7.6. Определение качественного состава и относительного

содержания каротиноидов...........................................................................100

2.7.в. Культивирование N. сгаяза и стимуляция синтеза каротиноидов................................................................................................101

2.8. Тест на устойчивость Р. anserina к антимицину А.................................102

2.9. Саузерн-блот гибридизация мтДНКР. anserina.....................................103

2.10. Количественная ОТ-ПЦР гена аох Р. anserina......................................108

2.11. Выделение протопластов, измерение скорости их дыхания и продукции АФК.................................................................................................111

2.12. Продолжительное качалочное культивирование Alternaría arborescens.........................................................................................................113

2.13. Статистическая обработка полученных данных...................................114

Глава 3. Динамика изменения« мицелия Р. anserina в условиях продолжительного глубинного культивирования. ...ч...............................116

3.1. Опытные штаммы Р. anserina в стандартных условиях роста..............116

3.2. «Реанимирование» стареющего мицелия Р. anserina в жидкой среде .121

3.3. Морфофизиологические особенности Р. anserina при длительном качалочном культивировании..........................................................................122

3.3.а. Фаза I, или начальная фаза качалочного культивирования...........125

3.3.б. Фаза II, или переходная фаза............................................................130

З.З.в. Фаза III, или фаза стабильного роста:.............................................131

3.4. Морфофизиологические особенности Р. anserina при длительном статическом культивировании.........................................................................134

3.5. Продолжительное качалочное культивирование A. arborescens...........138

Глава 4. Характеристика изолятов из длительно поддерживаемых глубинных культур Р. anserina.....................................................................140

4.1. Продолжительность жизни изолятов Р. anserina в зависимости от типа и возраста глубинной культуры..............................................................140

4.2. Суммарная длина мицелия и скорость роста изолятов Р. anserina......145

4.3. Морфология изолятов Р. anserina............................................................149

4.3.а. Морфология изолятов, полученных из качалочных культур........149

4.3.6. Морфология изолятов, полученных из статических культур.......161

4.3.в. Морфология митохондрий у изолятов Р. anserina.........................162

4

4.4. Вторичное качалочное культивирование некоторых изолятов Р.

атегіпа. Получение вторичных изолятов......................................................162

4.4.а. Вторичные качалочные культуры Р. атегіпа.................................163

4.4.6. Свойства вторичных изолятов Р. атегіпа ......................................168

4.4.в. Получение бессмертного изолята У2-з1-ІУ(2) Р. атегіпа............172

4.5. Саузерн-блот анализ митохондриальной ДНК бессмертного и долгоживущих изолятов Р. атегіпа................................................................173

4.6. Анализ функционирования альтернативного дыхательного пути у изолятов Р. атегіпа..........................................................................................176

4.6.а. Тест на устойчивость изолятов Р. атегіпа к антимицину А.........176

4.6.6. Уровень экспрессии АОХ у респираторных мутантов

Р. атегіпа.....................................................................................................179

4.6.в. Ингибирование дыхания протопластов мутанта У2-з1-1У(2). Продукция АФК протопластами................................................................179

4.7. Нарушение реакции вегетативной несовместимости у респираторных мутантов Р. атегіпа..............................................................181

Глава 5. Ультраструктура поверхностно растущего и глубинного

мицелия Р. атегіпа.........................................................................................186

5.1. Ультраструктура основных клеточных компонентов Р. атегіпа.........209

5.1.а. Клеточные покровы...........................................................................209

5.1.6. Септы...................................................................................................212

5.1.в. Врастание гиф.....................................................................................213

5.1.г. Цитоплазма и рибосомы....................................................................214

5.1 .д. Ядра.....................................................................................................214

5.1.е. Митохондрии. .................................................................................215

5.1.ж. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи....................216

5.1.3. Секреторные органеллы.....................................................................217

5.1.и. Вакуоли...............................................................................................217

5.1.к. Лизосомы и автофагосомы. Автофагия...........................................218

5.1.л. Запасные включения..........................................................................219

5.2. Старение, гибель и реанимирование Р. атегіпа....................................220

5.2.а. Участие апоптоза в связанной со старением гибели клеток Р.

атегіпа..........................................................................................................220

5.2.6. Ультраструктура мицелия Р. атегіпа, реанимированного перенесением в жидкую среду....................................................................224

Глава 6. Идентификация и определение качественного состава каротиноидных пигментов Р. апБвгіпа........................................................228

6.1. Пигментация глубинных культур и изолятов Р. атегіпа......................228

6.2. Спектральные измерения..........................................................................229

6.3. Качественный анализ пигментов..............................................................230

Глава 7. Генетический анализ долгоживущих изолятов Р. апБегіпа ....235

7.1. Частичная потеря фертильности у изолятов Р. атегіпа, полученных из серийно пассируемых качалочных культур.........................235

7.1.а. Частичная или полная женская стерильность у долгоживущих

изолятов Р. атегіпа.....................................................................................238

7.1.6. Сохранение мужской фертильности-' у долгоживущих

изолятов Р. атегіпа.....................................................................................239

7.1.в. Независимость фертильности мутанта У2-з1-1У(2) от продолжительности экспонирования на свету..........................................241

7.2. Подтверждение оплодотворения вегетативным мицелием у диких штаммов Р. атегіпа..........................................................................................242

7.3. Характеристика потомков первого поколения от скрещивания долгоживущих изолятов Р. атегіпа с дикими штаммами...........................246

7.3.а. Потомки изолятов У-зІ-ІУ(З) и У2-з1-1У(2), происходящих из

фазы I качал очного культивирования Р. атегіпа....................................250

7.3.6. Потомки изолятов, происходящих из фазы III качалочного культивирования Р. атегіпа................................................253

Глава 8. Обсуждение.......................................................................................261

8.1. Индукция генетической нестабильности Р. anserina в процессе продолжительного глубинного культивирования.........................................261

8.1.а. Стресс, адаптация к стрессу и отбор в условиях

продолжительного качал очного культивирования Р. anserina...............262

8.1.6. Отсутствие селективного давления и эффективного отбора в условиях продолжительного статического культивирования Р.

anserina..........................................................................................................267

8.1.в. Ослабление контроля клеточных функций в процессе старения Р. anserina и индукция мутаций в условиях ротационного культивирования..........................................................................................270

8.2. Коррелятивные морфофизиологические изменения серийно пассируемых качалочных культур Р. anserina и их возможные механизмы..........................................................................................................273

8.3. Особенности продукции каротиноидов Р. anserina...............................276

8.4. Преодоление механизма старения при ротационном культивировании Р. anserina............................................................................279

8.5. Бессмертный респираторный мутант V2-sl-IV(2) Р. anserina..............282

Заключение....................!..................................................................................286

Выводы............................................................................................................288

Приложение......................................................................................................290

Бла годарности..................................................................................................299

Список литературы.........................................................................................300

Список сокращений

АГ - аппарат Гольджи АТ - апоптотические тельца АФК — активные формы кислорода В - вакуоль

ВМ - внеклеточный матрикс

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография Г - гликоген

гКС - гомогенный (внутренний) слой клеточной стенки

гЭПР — гладкий эндоплазматический ретикулум

иЦМ - инвагинация цитоплазматической мембраны

КС - клеточная стенка

кХР - конденсированный хроматин

Л - лизосома

ЛГ - липидные глобулы

М - митохондрия

МВТ — мультивезикулярное тело

МК - микроконидии

МП — мембранный поясок поровой пробки МПС — миелиноподобная структура мтДНК - митохондриальная ДНК Н - нуклеус (ядрышко)

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

П - плазмолиз

1111 - поровая пробка

ПФ - полифосфатные гранулы

ПЯ - поры ядра

С - септа

ТВ - тельца Воронина

т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

фКС - фибриллярный (наружный) слой клеточной стенки

ФЧ - фибриллярный чехол

ЦМ - цитоплазматическая мембрана

шЭПР - шероховатый эндоплазматический ретикулум

ЭВ - электронноплотные включения клеточной стенки

Я - ядро

ЯМ - ядерная мембрана

а-зепДНК - плазмиды, амплифицирующиеся в стареющем мицелии

P. anserina |im - микрометр

АОХ - альтернативная оксидаза (англ. alternative oxidase) СОХ - цитохромоксидаза, или цитохром с-оксидаза

(англ. cytochrome с oxidase) GFP - зелёный флуоресцентный белок (англ. green fluorescent protein) НаеШ-мтДНК - фрагменты митохондриальной ДНК, полученные путем

обработки рестриктазой HaelII М1 — стандартная среда для проращивания аскоспор P. anserina М2 - стандартная среда культивирования P. anserina mat+ — тип спаривания + mat— тип спаривания -

Введение

Генетическая нестабильность является одним из механизмов, позволяющих расширить резерв наследственной изменчивости и, как следствие, повысить адаптивные возможности популяции (Burdon, Silk, 1997; Dunham et al., 2002; Четверикова, 2009). В настоящее время пристальное внимание к изучению нестабильности микроорганизмов связано с бурным развитием биотехнологии, так как активность образующихся вариантов, их скорость роста, физиологические особенности и влияние на продукцию биологически активных веществ различны (Фурсова и др., 2005; Милько и др., 2007).

Геном грибов характеризуется ярко выраженной динамичностью и способностью к относительно быстрому накоплению различного рода модификаций (Galagan et al., 2005). В ряде случаев генетическая* нестабильность мицелиальных грибов создает трудности для промышленного культивирования, в том числе хемостатного, так как при непрерывном культивировании нередко появляются варианты, более конкурентоспособные и более стабильные, чем исходный фенотип, но при этом менее продуктивные (van de Vondervoort et al., 2004). С другой стороны, для дрожжей и бактерий широко используется метод отбора вариантов с улучшенными характеристиками при помощи долговременной селекции в глубинной культуре, как непрерывной, так и периодической (Qakar, 2009). В отношении мицелиальных грибов известны лишь единичные работы, авторы которых случайно или целенаправленно в процессе погруженного культивирования получали изоляты, превосходящие по ряду биотехнологически значимых признаков исходные варианты (Swift et al., 1998; Crecy et al., 2009).

Механизмы, обусловливающие вариабельность грибных культур, изучены в недостаточной степени. Поэтому актуальной становится

разработка модельной системы, позволяющей эффективно повышать геномную нестабильность и получать фенотипы с различными свойствами.

I

Аскомицетный гриб Podospora anserîna (Rabenh.) Niessl — хорошо известный модельный объект. С 50-х гг. XX века данный вид активно используется для изучения фундаментальных биологических явлений, таких как клеточная дифференцировка, мейоз, функционирование митохондрий, свойства прионов, старение, вегетативная^ несовместимость, клеточная смерть и др. (Coppin, Silar, 2007; Espagne et al., 2008). P! anserina - один из немногих видов грибов,, дикие штаммы, которого подвержены выраженному репликативному старению- и смерти (Osiewacz, 2003; Мажейка и др., 2011): Старение P. anserina определяют как. снижение способности клеток к пролиферации и/или' дифференцировке (Silar et al., 2001). Изучение P. anserina проводилось преимущественно в поверхностною культуре (на агаризованной среде). В единичной работе 1987 г., выполненной Тюркером и Каммингсом, показано, что в качалочной (перемешиваемой) глубинной культуре, поддерживаемой за счет последовательных серийных пассажей, мицелий P. anserina способен к- неограниченному вегетативному росту, а накопление биомассы грибной, культурой за один пассаж интенсифицируется с увеличением- числа проведенных пассажей. Более того, после продолжительного« глубинного культивирования изоляты, получаемые путем высева образцов мицелия Р. anserina из жидкой среды на агаризованную, становятся долгоживущими, а в некоторых случаях - «бессмертными» (Turker, Cummings, 1987). «Бессмертие» в отношении грибных организмов подразумевает потенциальную способность к неограниченной пролиферации их вегетативных клеток (Osiewacz, 2002а). Однако дальнейшее изучение поведения P. anserina в погруженных условиях не проводилось. В частности, неизвестно, какие изменения, помимо увеличения продолжительности жизни и скорости накопления биомассы, претерпевал мицелий в жидкой среде, и каковы их возможные механизмы.

P. anserina как модельный объект для исследования явления генетической нестабильности обладает многими преимуществами, важне�