Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Патогенные микромицеты на бодяке щетинистом (CIRSTIUM SET0SUM (WILLD.) BESS.) и осоте полевом (SONCHUS ARVENSIS L.) и биологические особенности потенциальных агентов биоконтроля грибов SEPTORIA CIRSII NIESSL и ASCOCHYTA TГSSILAGINIS OUD.

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Патогенные микромицеты на бодяке щетинистом (CIRSTIUM SET0SUM (WILLD.) BESS.) и осоте полевом (SONCHUS ARVENSIS L.) и биологические особенности потенциальных агентов биоконтроля грибов SEPTORIA CIRSII NIESSL и ASCOCHYTA TГSSILAGINIS OUD."

РГБ од

Л

На правах рукописи

ч Берестецкий Александр Олегович

V ' * ,

патогенные шжрошщеть^_у ,1 ^ ^ на бодяке щетинистом (ClRSIUM SETOSVM (wllld.) bess.) и осоте полевомX(^ONCHVSARVENSIS h.) и биологические особенности потанциАльньк агентов биоконтроля - u ■ грибов SEPTOMA CIRSI1niesslи ASCOCHYTA TUSSILAGINIS oud.

Специальность: 03.00.24 - микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1999

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений

Научный руководитель:

академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор М.М. Левитин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. А.Мелышк, доктор биологических наук О.С.Афанасенко

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится 13 января 2000 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета, шифр Д.020.01.01. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений

Адрес: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3,

ВИЗР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЗР

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.А. Наседкина

общ ая характеристика работы

Актуальность темы. Микромицеты, вызывающие болезни сорных растений, имеют практическое значите как потенциальные биологические гербициды. По последним данным (Mortensen, 1997) более 130 таксонов фитопатогенных грибов изучены или изучаются в качестве возможных агентов биологической борьбы с сорными растениями. Включение микогербицидов в интегрированную защиту растений позволяет ослабить конкурентную способность сорных растений и снизить химический прессинг на агроэкосистемы (TeBeest et al., 1992). Ввиду высокой избирательности микогербицидов их разрабатывают только против наиболее вредоносных доминирующих сорняков (TeBeest, 1996).

Бодяк щетинистый (Cirsium setosum (Willd.) Bess.) и осот полевой (Sonchus arvensis L.) являются злостными засорителями посевов по всей территории европейской части России (Ульянова, 1998). Эти виды устойчивы к механической обработке почвы, и для полного их уничтожения требуется долгосрочный комплекс мероприятий, включая применение повышенных доз гербицидов (Михайлова, Тарасов, 1989; Lexnna, Messersmith, 1992). Биологических препаратов для борьбы с ними не создано.

Принимая во внимание, что научной основой для разработки микогербицидов является тщательное изучите видового состава мшсромицетов, вызывающих болезни сорных растений, и биоэкологии высоко агрессивных патогенов, перед нами были поставлены следующие цели и задачи.

Цель работы: определить видовой состав патогенных микромицетов на бодяке щетинистом и осоте полевом и на основе изучения биологических особенностей наиболее вредоносных патогенов отобрать виды грибов, перспективные для разработки микогербицидов.

Задачи исследований: 1) изучить патогенную микобиоту растений родов Cirsium Mill, и Sonchus L. на территории европейской части России; 2) провести идентификацию возбудителей септориозов растений рода Cirsium и аскохитозов растений рода Sonchus-, 3) изучить морфолого-культуральные свойства грибов Septoria cirsii Niessl и Ascochyta tussilaginis Oud.; 4) оценить влияние сред и условий культивирования S. cirsii и A. tussilaginis на их споровую продуктивность и физиологические свойства; 5) выявить оптимальные условия для заражения бодяка щетинистого грибом S. cirsii и осота полевого - грибом A. tussilaginis', б) установить специализацию S. cirsii и A.tussilaginis и их безопасность для культурных растений.

Научная новизна работы. Впервые в России проведено целенаправленное изучение патогенной микобиоты растений родов Cirsium и Sonchus, на которых идентифицировано 50 (соответственно, 33 и 17 видов) микромицетов. На Sonchus arvensis обнаружены два новых для науки вида рода Ascochyta. Выявлено, что Cirsium setosum является новым растением-хозяином для Puccinia dioica (О, I) и Fusarium oxysporum, S.arvensis - для Alternaria chrysanthemi. Впервые сообщается о находке на территории России грибов Septoria cirsii-heterophylli, обнаруженного на C.heterophyllum, C.vulgare и C.esculentitm, и Puccinia opizii (0,1) - на S.arvensis. Уточнены таксономические критерии для дифференциации грибов рода Septoria, известных на Cirsium spp., и рода Ascochyta - на Sonchus spp. Изучены морфолого-культуральные и физиологические свойства, биоэкология и патогенность Septoria cirsii и Ascochyta tussilaginis - возбудителей пятнистостей. соответственно, бодяка щетинистого и осота полевого.

Практическое значение работы. Создана коллекция чистых культур фитопато-генных грибов, поражающих бодяк щетинистый и осот полевой; разработаны методы получения инокулюма грибов Европа ЫгяИ и АзсосЬу^а ШзИа&тз, перспективных дня разработки микогербицидов; выполнены исследования по оптимизации сред для изучения фитотоксических свойств патогенов; изучены условия заражения и, соответственно, разработаны методики инокуляции бодяка и осота указанными возбудителями болезней в лабораторных и полевых условиях. Полученные данные могут быть использованы в селекции штаммов на агрессивность, при проведении полевых испытаний и создании препаративных форм биогербицидов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичносгь" (С.Петербург, декабрь 1995); на Всероссийском научно-производственном совещании "Состояние и пути совершенствования интегрированной защшы посевов сельскохозяйственных культур от сорной растительности" (Голицыно, июнь 1995); на Бюро Отделения защиты растений РАСХН (С.-Петербург, 5 марта 1996), на VI Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Петербург, май 1997); на 3-м Совещании "Компьютерные базы данных в ботанических исследованиях" (С.-Петербург, май 1997); на 10-м Съезде Европейского гербологического общества Е11\МЗ (Познань, Польша, июль 1997 г.); на научных конференциях профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского государственного аграрного университета (январь 1996,1998 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации, Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследований (глава 2), экспериментальной части (главы 3, 4 и 5), выводов, списка литературы (350 наименований) и приложения. Работа иллюстрирована 25 таблицам! и 35 рисунками.

Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ № 9б-04-50287а, 96-04-93066к, ФЦП "Интеграция" № 326.1 и ГНТП "Биологическое разнообразие".

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены стратегии биологической борьбы с сорными растениями при помощи фитопатогенных грибов и основные этапы разработки микогербицидов, проанализированы современные направления исследований; приведены данные по таксономии, биологии, экологии и вредоносности бодяка щетинистого и осота полевого и мерам борьбы с ними.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Методы микофлористическнх и таксономических исследований. Растения с симптомами заболеваний собирали методом маршрутных обследований в посевах различных сельскохозяйственных культур и лесополосах, на рудеральных участках и лугах. Сборы проведены в Астраханской, Воронежской, Ленинградской, Московской, Мурманской, Новгородской, Псковской, Ростовской, Тамбовской, Саратовской областях, в Алтайском и Краснодарском краях и Республике Карелия. Гербарные образцы из Белгородской, Брянской, Вологодской, Курской, Нижегородской, Омской, Орловской и Ростовской областей РФ были любезно предоставлены сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений <ВИЗР). Также проведено изучение образцов, хранящееся в гербариях Ботанического института РАН им. В.Л. Комарова (LE) и ВИЗР (LEP). Идентификацию грибов проводили, используя общеизвестные определители (Васильевский, Каракулин, 1937; Морочковський и др., 1969, 1971; Ellis, 1971; Вызова и др., 1975; Билай, 1977; Мельник, 1977; Ульяншцев, 1978; Nelson et al., 1983; Ново-тельнова, Пыстина, 1985; Ellis, Ellis, 1985; Тетеревникова-Бабаян, 1987; Мельник, 1997; Braun, 1995 a, b, 1998 и др.). Данные микофлористических исследований хранили и статистически обрабатывали при помощи информационной системы "Микобиота сорных растений" (Берестецкий и др., 1997).

Сканирующую электронную микроскопию конидиом и склероциальных структур Ascochyta spp. проводили на микроскопе Hitachi S-405 А; материал без предварительной обработай высушивали на воздухе, прикрепляли к столикам и напыляли платиной. Для изучения строения конидиом и морфологии конидиогенных клеток изготовляли полугонкие срезы на замораживающем микротоме (МЗ-З), препараты окрашивали 3%-ным раствором эозина в 10%-ном водном растворе аммиака (Constsantinescu, 1984). Для изучения количества перегородок в конидиях давленные препараты окрашивали раствором Люголя по НАНаумову и В.Л.Козлову (1954). Вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле водорастворимых белков (неспецифических эстераз и фенолоксидазы) Ascochyta spp. проводили по стандартным методикам (Davis, 1964;Маурер, 1971;Корочкинидр., 1977).

Изучение морфолого-культуральных и физиологических свойств. Выделение возбудителей заболеваний в чистую культуру проводили общепринятыми фигопа-тологическими методами (Хохряков, 1979). Морфолого-культуральные свойства грибов изучали на атаризованных (1.5%) средах: картофельно-сахарозном агаре (КСА), агаризованном отваре из листьев бодяка с добавлением сахарозы (БСА), овсяном агаре

(OA), агаре Чалека (ЧА) и глюкозо-аспарагиновом агаре (ГАА). Фшиологиеские особенности грибов (потребности в источниках углерода, азота и витаминах и др.) изучали на основе среды Чапека и модифицированной глюкозо-аспарагиновой среды (Лил-ли, Барнетт, 1953). Описывали текстуру воздушного мицелия - по В.И.Билай (1977), цвет воздушного и субстратного мицелия - по шкале А.С.Бондарцева (1953), количественную и качественную характеристику репродуктивных и покоящихся структур, учитывали линейную скорость роста колоний на агаризованных средах и сухую массу мицелия в жидких культурах, споровую продуктивность, рН и фитотоксичность куль-туральной жидкости.

Фиготоксическую активность (ФА, %) культуральной жидкости S.cirsii и A.tussilaginis изучали по методике О.А.Берестецкого (1972), в качестве биотестов использовали проростки бодяка и осота. Споровую продуктивность патогенов изучали на различных природных субстратах.

Изучение патогенных свойств. Для получения инокулюма Septana cirsii и Ascochyta spp. штаммы грибов выращивали на КС А или OA при 24°С, при этом 10-суточные культуры A.tussilaginis в течение 2 сут облучали УФ-светом (2 эритермные лампы ЛЭ-30 на расстоянии 30 см).

Влияние различных условий на прорастание шгаюспор A.tussilaginis и S.cirsii in vitro изучали при помощи влажных камер: на стерильные предметные стекла наносили по 2 капли (0.1 мл) хонидиальной суспензии гриба (концентрацией 1-5x104 конидий/мл) в стерильной дистиллированной воде либо с различными добавками.

Особенности проникновения грибов в растительные ткани изучали при помощи световой микроскопии по методике W.G.D.Fernando et al. (1993) путем инокуляции конидиями патогенов изолированных дисков 0.5-1 см в диам., вырезанных из листьев бодяка или осота, и окраски их 1%-ным раствором анилинового синего. Детали инфекционного процесса изучены с помощью сканирующего электронного микроскопа ("JEOL" JSM-T200). Материал фиксировали 2 ч в 2.5%-м глутаровом альдегиде на 2 М натрий-кокадилатном буфере, промывали в этом же 1 М буфере, обезвоживали в серии спиртов и изоамиловом эфире уксусной кислоты, подвергали сушке при критической точке углекислоты и напыляли золотом (Donovan et al., 1990).

При изучении условий заражения сорных растений для инокуляции использовали проростки бодяка полевого в фазе 4-5 настоящих листьев, а осота - корнеотпры-сковые побеги в фазе розетки (4-6 листьев), а также диски, вырезанные из листьев среднего яруса растений бодяка и осота. Учет развития болезни проводили по 6-ти балльной шкале: 0 - отсутствие симптомов, 0.1 - проявление единичных мелких пятен, 1 - единичные крупные пятна, занимающие до 10% площади листа, 2 - поражение 1025% площади листа, 3 - 26-50%, 4 - 51-100%. В ряде экспериментов учитывали свежую биомассу растений, измеряли рН сока, выжатого из листьев больных и здоровых растений. Количественные биохимические изменения (масса сухого вещества, содержание Сахаров, хлорофилла и каротиноидов) в пораженных растениях изучали по стандартным методикам (Плешков, 1985). Для анализа структуры популяции по признаку агрессивности протестировали 30 рендомизированно отобранных клонов, полученных из 12-ти разных географических изолятов S.cirsii. Для изучения специализации S.cirsii и A.tussilaginis в тепличных условиях проводили искусственное заражение культурных и дикорастущих растений (42 вида, принадлежащих к 13 семействам) в фазе 2-4 настоящих листьев указанными патогенами, при оптимальной споровой нагрузке 5х105 и 5х106 конидий/мл, соответственно, и 48-ч росяном периоде.

ГЛАВА 3. МИКОБИОТА РАСТЕНИЙ РОДОВ CIRSIUM Mili. И SONCHUS L. НА ТЕРРИТОРИИ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ

3.1. Микобиота растений рода Cirsium

В 1994-1999 г. в различных областях Европейской части России собрано более 250 образцов пораженных грибными заболеваниями растений Cirsium spp., на которых идентифицировано 33 вида микромицетов. Описана частота встречаемости основных патогенов (рис. 1) и динамика микобиоты бодяка щетинистого в Ленинградской области (Берестецкий, 1997).

Из представителей низших грибов (отдел Oomycota, порядок Peronosporales) на бодяке щетинистом и близкородственных видах (Cirsium arvense, C.incanum) обнаружены грибы Bremia lactucae var. cirsii и Cystopus tragopogonis var. cirsii, но встречались они крайне редко. Сумчатые грибы (отдел Ascomycota) представлены как био-трофами (Etysiphe majori var. majori, E.cichoracearum var. cichoracearum, Leveillula táurico), так и некротрофами (Ophiobolus cirsii, Leptosphaeria doliolum, Pleospora herbarum).

19%

22%

И Pucclnla punctlformls ü Ramuteria Cynarae

□ Septoria cirsii

В Ascochyta sonchl

□ Прочие виды

Рис. 1. Частота встречаемости основных патогенов Cirsium arvense s.l.

На бодяке постоянно во всех регионах (но не во всех биотопах) встречалась ржавчина, вызываемая Puccinia punctiformis (рис. 1). На Северо-Западе России в уре-диниях и телиях ржавчины нами выявлены гипсрпаразнты: шпапвды Sphaerellopsis filum (=Darluca filum), мицелий и спороношение Fusarium íricinctum и Fusarium sp. Почти повсеместно на бодяке полевом встречались грибы - возбудители шггаистостей листьев - Septoria cirsii (в сухих биотопах) и Ramularia Cynarae (=R. cirsii, в основном в биотопах с достаточным увлажнением и затенением, например, вдоль лесных дорог, у водоемов). Грибы Ascochyta sonchi,Macrosporium cirsii и Phyllosíicta cirsii встречались значительно реже.

Из семян, подгнивших стеблей и корней, увядающих растений были выделены грибы-сапротрофы и факультативные паразиты: Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana, Botrytis cinerea, Coniothyrium sp., Fusarium oxysponim, F.tricinctum, Vermicularia sp.

Очень часто на различных органах бодяка обнаруживаются микосинузии, включающие иногда до 5 видов грибов на одном участке растения. Так, на листьях, пораженных возбудителем белой ржавчины, на некротических пятнах над пустулами паразита находили грибы Altemaria sp. и Phyllosíicta cirsii. Спороношение Ramularia

Cynarae нередко обнаруживается совместно с ржавчиной (возбудитель Puccinia punctiformis) и иногда на се пустулах, реже - по соседству с пятнами, вызванных Septoria cirsii. Причем, на одних образцах отмечено превалирование R. Cynarae, на других - S.cirsii. Два гашшдиальных гриба, Ascochyta sonchi и P.cirsii, очень часто обнаруживались с каким-либо из трех последних патогенов или даже все вместе. На отмерших перезимовавших листьях чаще всего находили спороношение Alternaria sp. и Cladosporium sp., реже - пикниды S.cirsii (Rhabdospora-ciajgw) или микросклероции со спороношением R. Cynarae. На живых стеблях одновременно можно было обнаружить пустулы ржавчины и грибы: Ramularia Cynarae, Phoma cirsii, Ph.herbarum и некоторых других сапротрофов. В начале вегетационного сезона (март-май) на отмерших стеблях бодяка встречались Erysiphe majori var. majori, Leptosphaeria doliolum, Ophiobolus cirsii, Pleospora herbarum,Ph. herbarum, R}iabdospora-cm¡s¿m Septoria cirsii. В отличие от других патогенов возбудители ложной мучнистой росы и настоящей мучнистой росы поражали растения бодяка чаще всего самостоятельно.

Впервые на Cirsium setosum были обнаружены Fusarium oxysporum (Саратовская обл.) и эцидиальная стадия ржавчины Puccinia dioica (П, Ш - на Сагех spp.) (Алтайский край). Часто встречалась спермогониальная стадия Ramularia Cynarae в виде пикнид Phyllosticta cirsiorum, которые образуются из микросклероциев (R.cynarae часто зимует в виде микросклероциев) в конце вегетационного сезона. Спермогониальная стадия у грибов рода Ramularia, которую часто относят к род}' Phyllosticta, отмечалась многими микологами. В частности, ЭХВимба (1970) обнаружил се у такого весьма широко распространенного гриба как Ramularia taraxaci Р. Karst.

Микобиота других видов рода Cirsium (C.esulentum, C.heterophyllum, C.oleraceum, C.vulgare) существенно отличается от видового состава грибов на Cirsium arvense s.l. Общим паразитом для всех них является Erysiphe cichoracearum var. cichoracearum. Более, чем на 3-х видах бодяка обнаружены Ascochyta sonchi и Septoria cirsii-heterophylli. О находке последнего на территории России нами сообщается впервые.

По нашим наблюдениям наиболее вредоносные и распространенные заболевания бодяка полевого вызывались грибами Puccinia punctiformis, Septoria cirsii и Ramularia Cynarae (рис. ]). При диффузном поражении побегов бодяка ржавчиной отмечается 100%-ная их гибель, количество таких побегов может достигать 25-30% среди общего количества учитываемых растений (Rogers, 1928; Берестсцкий, 1995). Однако, мы считаем, что накоплению инокулюма ржавчины в полевых условиях могут препятствовать грибы-микопаразиты (Sphaerellopsis filum и Fusarium tricinctum). Другой патоген - гриб Septoria cirsii уже в начале июня способен сильно поражать нижний ярус листьев сорняка. Этот возбудитель пятнистости листьев бодяка по предварительным данным (Herschenhorn et al., 1993) обладает узкой специализацией. Рамуляриоз-ная пятнистость появляется одновременно с септориозной и также вызывает усыхание листьев бодяка, однако ареал R. Cynarae в основном ограничен лесостепной и таежной зонами, a S.cirsii встречается еще и в степной зоне.

3.2. Грибы рода Septoria Sacc., паразитирующие на растениях рода Cirsium

На видах бодяка описаны 3 вида рода Septoria: Septoria cirsii Niessl, S.bulgarica Bubak et Malkoff и S.cirsii-heterophylli Petrak. С целью дифференциации среди них гриба S.cirsii мы провели сравнительно-морфологическое исследование более 20 образцов из собственных сборов, а также образцов из гербариев БИН и ВИЗР.

Вид Septoria bulgarica незначительно отличается от S.cirsii лишь по форме конидий и числу перегородок в них (табл. 1). Нами отмечено, что конидии S.cirsii очень

изменчивы по форме и размерам. С другой стороны, сепгарованность конидий Septoria spp. может изменяться с возрастом пикниды (Марланд, 1948; Андрианова, 1989). Так, нами обнаружено, что в незрелых пикнидах S.cirsii преобладают конидии без перегородок, либо с несколькими перегородками. Вероятно, S.bulgarica является синонимом S. cirsii. В гербариях БИН и ВИЗР вид 5. bulgarica представлен одним и тем же образцом (на Cirsium lanceolatum [=C.vulgare], Воронихин, 1914 г.), который не соответствует диагнозу типа (Bubak, 1925) и относится к S.cirsii-heterophylli.

Вид S.cirsii-heterophylli имеет значительные отличия от S.cirsii (табл. 1) и не зарегистрирован на Cirsium arvense s.l. (Petrak, 1935). В наших опытах по перекрестной инокуляции в условиях теплицы оба вида септории способны заражать и С. vulgare (растение-хозяин для изоляга S.cirsii-heterophylli), и C.arvense, но характерная морфология конидий на развившихся во влажной камере пикнидах, сохранялась. В гербарии ВИЗР нами обнаружен ряд образцов S.cirsii-heterophylli (сборы до 1925 г.), рядом авторов ошибочно отнесенных к S.cirsii. Таким образом, гриб S.cirsii-heterophylli широко распространен на территории Европейской части РФ, но, в отличие от S.cirsii, не встречается на Cirsium arvense s.l. (C.arvense, C.incanum, C.setosum).

Таблица 1

Морфологические различия видов р.Septoria на растениях р.Cirsium

-___^ Вид гриба Признаки ■— S.drsü S.bulgarica** S.cirsü-heterophyüi

Размеры пикнид, мкм 80-120 60-100 50-70

Размеры конидий: длина, мкм ширина, мкм (18)40-65(100) (1.5)2-3(3.5) 40-70 2 (15) 20-45 (60) 1-1.5 (2)

Форма конидий Нитевидно- цилиндрические с тупыми или утончающимися концами Нитевидные с сильно утончающимися концами Нитевидные с сильно утончающимися концами

Количество перегородок (0)5-8(12) 1-5 (0) 1-5

Тип роста в чистой культуре Мицелиалышй Не изучался Споридиально-мицелиальный

Растения-хозяева С.acaule C.arvense s.l.* C.heterophyllum C.oleraceum C.rivulare C.acaule C.appendiculatum * C.arvense s.l. C.esculentum С. heterophylhim * C.oleraceum C.palustre C.vulgare

Примечание. * - растение, на котором описав вид

"* - (Bubak, 1925;Тетеревникова-Бабаян, 1987)

3.3. Мнкобпота растений рода !5опскиз

Всего было собрано и проанализировано более 100 образцов £олс/га.у Брр., пораженных грибными заболеваниями. На них идентифицировано 17 видов грибов, преимущественно на листьях и стеблях. Частота встречаемости основных патогенов осота полевого представлена на рисунке 2. На S.arvensis нами обнаружены два новых для науки вида рода ЛзсоекуШ. Выявлено, что 5'.ап><?лш'.? является новым растением-хозяином для гриба ЛЬетапа скгузамИепй.

На видах осота был обнаружен лишь один представитель отдела ОотусоШ (Вгет1а эопсЫсо1а). Гриб встречался повсеместно, включая южные районах России. В

Ленинградской области ложная мучнистая роса отмечалась уже в фазу розетки сорняка. Бедно представлены и аскомицеты: некротрофным грибом Р1ео$рога ИегЬагит и биотрофным Егуз1рЬе аскогасеагит уаг. ЫсИогасеагит. Последний также имеет широкое распространение, преимущественно в средней полосе России. Обычно мучнистая роса обнаруживалась начиная с фазы цветения осота.

О Вгет1о яопсЫсо1а

□ Н/уг/рйе с/сАогасеа/ип)

□ Со1еозрог1ит ЫжИад/пк Ш АзсосйуО йжИад/пк В Д5СОС/>у&> волей/

□ Прочие виды

Рис. 2. Частота встречаемости основных патогенов Sonchus arvensis L.

Среди базидиомицетов наиболее широкой распространенностью и высокой встречаемостью характеризуется возбудитель ржавчины Coleosporium tussilaginis (рис. 2). Максимальное поражение осота обычно наблюдалось в фазу формирования семян. Другой ржавчинный гриб - Puccinia sonchi лишь спорадически встречался на Северо-Западе России. В Алтайском крае (Барнаульский район) и Мурманской области (Кандалакшский р-н) на Sonchus arvensis мы обнаружили эцидии Puccinia opizii (П, Ш - на видах Сагех). По данным отечественной литературы (Ульяншцев, 1978; Азбу-кина, 1984) на территории России (и бывшего Советского Союза) осот еще не был отмечен в качестве питающего растения для P. opizii.

Наибольшим разнообразием отличались несовершенные грибы, особенно из семейств Dematiaceae (Alternaría spp.) и Sphaeropsidaceae (Ascochyta spp. и Septoria sojmchifolia). Из них наиболее часто встречаемым был пшашдиальный гриб Ascochyta tussilginis, обнаруженный нами как в северных, так и в южных районах России. Поражение осота этим патогеном наблюдалось в ранние фазы его развития, поражаются как листья, так и стебли сорняка, что в конце сезона могло вызывать усыхание до 50% поверхности растений. Интересно, что на Sonchus spp. не было зарегистрировано ни одного вида из порядка Melanconiales.

Поражаемость осота полевого одним или несколькими одновременно биотро-фами (Coleosporium tussilaginis, Bremia sochicola, Erysiphe cichoracearum) к концу вегетационного сезона может достигать почти 100%, однако растения к этому времени уже успевают отцвести и образовать семена. При сильном поражении листьев ржавчиной (С.tussilaginis), некротические участки обычно заселяются видами рода Alternaría (A.sonchi, A.tenuissima). Со ржавчиной также могут соседствовать листовые пятнистости, вызываемыеAscohyta sonchi, A.tussilaginis, Septoria sonchifolia, но эти сообщества, очевидно, не являются облигатными. Последний вид иногда встречается на листьях, пораженных мучнистой росой.

3.4. Виды рода Ascochyta Lib. на растениях рода Sonchus L.

На видах осота нами обнаружено 4 представителя рода Ascochyta. Изучение морфологии конидий, морфолого-культуральных и биохимических свойств этих гри-

34%

бов позволило нам четко различить виды /\scochyta на осоте (табл. 2) и дифференцировать известные виды (\A.sonchi и А. йш?/а&тя) от новых (А. \ispenskajae ВегеййБЙ ф. поу. и Л.поуо/е/иоуае Бетелей Бр. поу.). Анализ изоферментов (неспецифической эс-теразы и фенолоксидазы) у видов грибов, которые имеют сходную морфологию конидий, показал заметные различия в их спектрах между штаммами разных видов и определенное сходство между штаммами одного вида (рис. 3). Причем, отсутствие различий между штаммами А.яопсЫ, выделенных из листовых пятен на С/то'мтя ап>ете и БопсИт ап>епя1з, подтверждает широкую межродовую специализацию этого возбудителя аскохитоза. Сканирующая электронная микроскопия скульптуры конидиом указанных А.чсоску1а эрр. не позволила выявить выявить характерные различия между видами.

Таблица 2

Морфологические и культуральные свойства Азсоску!а Брр., обнаруженных на БопсИиз агуепэ^з Ь.

——гриба Признаки " -___ А.зопсЫ A■tussilaginis Л.шреткщае А.поуо(е1погае

Размеры конидий: длнна, мкм ширина, мкм 5-14 3-4 8-18 3-4(5) 9-16 4.5-6.5 13-27 4-6

Окраска конидий бесцветные бесцветные соломенно-жезпые бесцветные и бурые

Количество перегородок 0-1 (2) 1(2) 0-1 (2-3) 1 (2-3)

Цвет воздушного мицелия на КСА серый, оливковый белый, буроватый серый серый, с белой каймой

Цвет субстратного мицелия на КСА оливково-бурый бурый, гиалиновый оливково-черноватый красновато-коричневый

Влияние "У Ф-света на спороношение не влияет стимулирующее ингибирующее не изучалось

микросклероции нет образуются нет нет

-""""К

. *

? * *- * -Р

Л г " ' ^

Я

А

4Т

У

5

А,

3 4 Б

Рис. 3. Спектры водорастворимых изоферменов (А - неспецифическая эстераза, Б - фенолокси-даза) у видов А$сосЬу1а, обнаруженных на С/пгап аггете (1 - Л $ соску ¡а ¡опсЫ шт. А-85) и ВопсИш аюет13 (2 - А5сосЪу1а юпсЫ шт. А-86, 3 -АхсосЪу1а изретксуае шт. Аи-84, 4 -АзсосЬуЯа шт. АЫ307, 5 - АхсосИуЮ шт. А1 - 82).

3

4

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГРИБА ЯерКпа агш 4.1. Морфолого-культуральиые свойства

Гриб спороносил на 7-14 сутки только на полу синтетических средах (КС А, БСА, ОА), однако даже на них скорость роста являлась крайне низкой (12-18

мм на 20 сутки). Результаты экспериментов, представленных в таблице 3, показывают, что как для линейного роста колоний, так и для формирования спороношения штамма Б-БЫ температурные огпимумы (25°С) примерно совпадают. Он хорошо развивался в пределах 20-27.5°С, при 10 и 30°С рост и спороношение гриба значительно ухудшались.

Таблица 3

Влияние температуры на развитие S.cirsii (nrr.S-8N) на КСА

Температура, "С 10 15 20 22.5 25 27.5 30

Количество проросших конидий через 24 ч, % 0' 0' 9.0 ,ь 23.0Ь 82.5cd 96ы 74.5 е

Диаметр колоний на 15 сут, мм 5.0'* 7.6ь 9.1е 11.0" 11.7d 10.5ci 4.8'

Споропродукгивность, на 15 сут, конидий/см2 х 10е 4.2' не изучено 5.7Ьс 6.0'Ьс 11.9Ь 6.4* 4.4"

Примечание. * - Различия значений под одинаковыми буквами несущественны прир<0.05

Среди природных субстратов максимальная споропродукгивность отмечена на грубо размолотых зернах овса (4.7x107 конидий/г субстрата на 14 суг) и зернах пшеницы с добавлением мелконарезанных листьев бодяка (1.5x107 спор/г субстрата). Оптимум увлажненности субстрата (зерна овса грубого помола) находился между 50 и 75% (8.0-10.0х107 конидий/г субстрата на 19 суг). Повышение влажности до 100% позволяло получить спороношение гриба значительно раньше (на 11 сут), но в дальнейшем оно не увеличивалось; кроме того, при высокой влажности субстрат после авто-клавировшшя собирается в трудно разрушаемые комки. При понижении влажности субстрата до 35% развитие спороношения значительно замедлялось.

Влияние источников углерода (ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза и крахмал) и азота (нитрат натрия, шгграт аммония, сульфат аммония, аминоуксусная кислота, аспарагин и пептон) на развитие 4-х штаммов гриба (S-7, S-8N, S-29, S-64) изучали на среде Чапека, рекомендуемой в качестве диагностической для описания видов рода Septoria (Андрианова, 1989). Ни один из использованных источников углерода и азота не способствовал формированию спороношения; значительный прирост мицелия обеспечивали крахмал и аспарагин, однако во всех вариантах линейный рост всех штаммов был ниже, чем на КСА.

В результате серий экспериментов по изучению влияния концентрации витаминов на рост и развитие 4-х штаммов S.cirsii было обнаружено, что тиамин и биотан в различных концентрациях, вместе и независимо друг от друга приводили к развитию воздушного пушисто-бархатистого мицелия и к значительному увеличению скорости линейного роста колоний. Однако спороношение формировалось только на средах, содержащих тиамин. На среде с содержанием тиамина 100 мкг и биотина 5 мкг/л через 10 сут отмечалось макроконидиальное спороношение, а через 2 мес после посева в пикнидах образовывались микроконидии (одноклеточные, овально-цилиндрические, бесцветные, 3-4.5x1-2 мкм). Замена чистого препарата тиамина поливитамином "Ундевит" или отваром из листьев бодяка также приводила к нормальному развитию воздушного мицелия и спороношения.

Таблица 4

Влияние соотношения источников углерода и азота в сахарозо (С) -аспарагнновой (А) среде на морфолого-культуральные и физиологические свойства ВерШпа апи (штамм

Агаризозанная среда, 21 сут Жидкая среда, 11 сут

Вариант, С/А, г/л Текстура колоний Цвет колоний Диаметр коло-ник, мм Обилие пик-нид Цвет культур альной жидкости рн и * к Спророиро-дуктивноеть, конидий/мл среды, хЮ3 ** Сухая масса мицелия, мг/мл Фитоток-сическая активность, %

5/1 Приподнятые, слабобархатистые Белый, черноватый 7.3 +++ Пссочно-олив-коватый 5.45 6.67 5.1 2.33 -10.4

5/2 Морщинистые, слабобархатистые. Черноватый 7.2 ++ тоже 5.80 8.00 1.87 7.6

5/4 Гранулированные, воздушный мицелий не развит Ссропатый, черноватый 6.8 - 5.55 8.28 - 2.75 27.7

10/1 Слегка приподнятые, пушисто-бархатистые Батый, сероватый, черноватый 9.1 ++ Песочно-олив-ковый 5.60 5.57 3.1 4.59 -1.5

10/2 Морщинисто-гранулированные, слабо-бархатистые Черноватый, беловатой 8.3 - иесочно-тем-нооливковый 5.50 7.27 6.7 3.71 -0.3

10/4 Приподнятые, сильноморщинистые Серый, черноватый 11.2 тоже 5.50 8.05 4.62 10.1

20/1 Приподнято-бугристые, пушистые Серый 10.8 + оливково-гряз-нозеленый 5.60 4.27 10.40 17.5

20/2 Бугристо-гранулированные, слабобархатистые Беловатый, черноватый 9.7 + то же, но темнее 5.30 4.82 - 9.73 18.4

20/4 Морщинистые, дрож-жеподобные, с белой мицелиальной каймой Буровато-серый 9.5 - оливково-бурый 5.45 6.90 3.4 9.78 -3.6

Примечание. Обилие пикяид: "-" - отсутствие спороношения, "+"- единичные пнкниды, "++"- раоееянные пикниды, "+++"- многочисленные пикнкды с обильным выделением конидиальной слизи. * - рН - "н" - начальное, "к" - конечное (на 11 сут культивирования). * * - начальная концентрация 5.0х103 конидий/мл среды.

Известно, что на развитие грибов в чистой культуре очень сильное влияние оказывает концентрация и соотношение источников углерода и азота в питательной среде (Carraway, Evans, 1984). Линейный рост колоний S.cirsii на агаризованной саха-розо-аспарагиновой среде с тиамином (100 мкг/л) и биотином (5 мкг/л) оказался достоверно худшим при низком содержании сахарозы (5 г/л), независимо от концентрации аспарагина. Однако, пикнидиальное спороношение было наилучшим на среде с содержанием сахарозы (С) 5 г и аспарагина (А) 1 г/л (табл. 4). На средах с повышенной концентрацией питательных веществ (особенно С/А=10/4 и 20/4 г/л) отмечено формирование морщинистых, дрожжеподобных колоний (табл. 4). На жидкой среде образование конидий у штамма S-8N отмечено на средах с С/А=5/1, 10/1, 10/2 и 20/4 г/л, то есть преимущественно при соотношении 5:1. Культуральный фильтрат (КФ) этих сред оказывал слабое стимулирующее действие на рост корней проростков бодяка и имел рН, близкое к нейтральной (5.57-7.27). Фиготоксическая активность КФ зарегистрирована в вариантах при повышенных (8.00-8.28) (среды с С/А=5/2, 5/4 и 10/4) и пониженных (4.27-4.82) конечных значениях рН (среды с С/А=20/1 и 20/2) (табл. 4). Очевидно также, что накопление биомассы, а также интенсивность выделения пигментов в среду прямо зависит от количества углерода в среде и не зависит от количества азота.

С целью изучения динамики физиологических процессов S.cirsii были взяты среды с контрастным содержанием сахарозы и аспарагина - 5/1 и 20/2 г/л. В первом варианте в процессе роста гриба рН культуральной жидкости увеличивалось с 5.4 до 6.8 на 11 сут. Прирост биомассы прекратился на 7 сут, к этому времени было отмечено спороношение гриба (сколеоспоры с хорошо заметными перегородками), которое на 9-е сутки составило около З.1х103, а на 11-е - 6.8х105 конидий/мл среды. Незначительный фитотоксический эффект (8.8%) наблюдался только на 3 сутки культивирования, на 11 сут КФ стимулировал рост корней проростков бодяка, что согласуется с результатами предыдущего эксперимента. Ва втором варианте (С/А=20/2 г/л) кислотность среды сначала немного понижалась с 5.3 до 5.5, а затем повышалась к 11 сут культивирования до 3.38. Биомасса нарастала в течение 11 сут, однако спороношения не наблюдалось, в гифах гриба отмечено накопление масла. Фиготоксическая активность КФ возрастала по мере снижения рН с 5% (на 9 суг) до 35% (на 11 сут). Начиная с 7 сут в культуральной жидкости отмечалось выделение пигмента оливкового цвета, интенсивность окраски возрастала с возрастом гриба до темно-оливкового. При дальнейшем культивировании гриба на этой среде примерно на 21 сут образовывалось спороношение, рН достигало 6.5.

4.2. Условия заражения бодяка полевого грибом Septoria cirsii и его патогенные свойства.

Конидии хорошо прорастают (90-95% через 24 ч) в широком интервале температур (20-28°С), значительно хуже - при температуре ниже 18°С и выше 30°С. Молодые и старые конидии (10- и 35-дневные культуры гриба, соответственно) имеют достоверно (р<0.05) пониженную всхожесть по сравнению с 20-25-дневными культурами. Однако конидии, взятые с 10-суточной колонии, имели достоверно повышенную скорость прорастания по сравнению с более старыми конидиями. При оптимальных условиях прорастание конидий S.cirsii начиналось через 8-12 ч. Ростковые трубки отделяются от конидии перегородкой через 16-20 ч. Обычно одна конидия формирует от 1 до 5 ростковых трубок. Между ростковыми трубками иногда наблюдались анастомозы.

Споры S.cirsii прорастали одинаково (через 18 ч) на верхней и нижней поверхностях листьев бодяка 1-2 ростковыми трубками, чаще всего из терминальных клеток.

Первые единичные случаи проникновения в ткань растения отмечались на нижней стороне листьев уже через 18-24 ч после инокуляции. Через 30-36 ч ростковые трубки 5.с/г.я7 проникали в устьица только нижней поверхности листьев, часто образуя над ним небольшое вздутие. На верхней поверхности листьев, ростковые трубки сильно ветвятся, часто анастомозозируют, образуют вздутия наподобие апрессориев. При этом проникновения через устьица не наблюдается, гифы могут пересекать их, "не узнавая".

Оптимальной концентрацией инокулюма для заражения бодяка является 5x105 конидий/мл, в этом случае конечное развитие болезни (на 15 суг) было максимальным (1.14 балла). При более высокой концентрации (2.5х106 спор/мл) вначале (на 7-е сутки) болезнь развивалась быстрее (0.81), чем в других вариантах (0.12-0.65), но в дальнейшем (к 15 суткам) она прогрессировала незначительно (до 0.94 балла). Это, видимо, можно связать с самоограничением популяции патогена на площади листа.

Максимальный уровень развития болезни (2.27 балла) при поражении 64% листьев наблюдался при 48-ч росяном периоде. При 12-ч росяном периоде развитие сеп-ториоза было значително ниже (0.66 балла при поражении 30% листьев). Минимальный росяной период, необходимый для заражения и развития болезни был равен 24-36 ч. Как раз именно такой промежуток времени требуется для прорастания конидий Б.сшп и их проникновения в устьица.

Наиболее сильное развитие сепгориоза листьев бодяка отмечено при 28°С (1.8 балла); оно было значительно выше (при Р<0.05), чем при 16°С (1 балл). Развитие болезни при 20 и 24°С различалось незначительно. Эти результаты сопоставимы с данными по влиянию температуры на прорастание спор Я.ЫгзИ (табл. 3).

Наиболее восприимчивыми были растения в фазе розетки (5-6 листьев). Более старые растения (7-9 листьев), находящиеся в фазе роста вегетативного побега, поражались несколько слабее. Наименее восприимчивыми оказались молодые проростки (3-4 листьев). Во всех опытах было отмечено, что молодые шилья верхних ярусов растения устойчивы к септориозу, симптомы поражения иногда обнаруживались на кончиках листьев - на онтогенетически самой старой ткани листа (табл. 5).

Таблица 5

Восприимчивость бодяка к септориозу в зависимости от возраста проростков

Фаза развития, листьев Количество пораженных листьев, % Развитие болезни на 15 сутки, баллы поражения

Всего 1-2 лист 3-4 лист 5-6 лист 7-8 лист 9-10 лист

3-4 35±6 0.43+0.09а* 0.9 0.4 0 - -

5-6 55± 3 1.54±0.14ь 2.3 3.2 0.1 0 -

7-9 49+2 1.13±0.13ь - 2.3 2.5 1.2 0.3

* - Различия между значениями под одинаковыми буквами не существенны при р< 0.05

При изучении веществ, которые могли бы стимулировать развитие болезни, обнаружено, что максимальная скорость прорастания конидий Б.ЫпИ наблюдалось в 2%-ном р-ре сахарозы (90% через 16 ч). Достоверно быстрее, чем в воде (46%) прорастали конидии в 0.5%-ном р-ре желатины (75%) и в 0.5%-ном растворе желатины в 2%-ном р-ре сахарозы (71%). Значительно хуже конидии прорастали в 0.001%-ном р-ре Твин-80. Варьировало число ростковых трубок и их морфология: в р-рах сахарозы и желатины конидии Б.ягзи образовывали в среднем 4-5 ростковых трубок, в 0.1%-ном р-ре агара - 2-3, а в дистиллировашюй воде - лишь 1-2. Инокуляция верхней по-

верхности дисков (1 см в диам.), изолированных из листьев бодяка показала, что наилучшей добавкой к конидиальной суспензии был 0.5%-ный р-р желатины: развитие болезни и последующего спороношеши были на одном уровне, что и при заражении нижней поверхности дисков водной суспензией (коетролъ), однако число поражений на единицу площади было примерно в 2 раза меньшим. В контроле на дисках образовывалось в 10 раз больше поражений (развитие болезни было примерно в 2 раза выше), чем при инокуляции верхней поверхности водной суспензией патогена. Однако, результаты тепличных экспериментов были противоположными: различные добавки приводили к незначительному понижению развития болезни по сравнению с инокуляцией растений бодяка водной суспензией, различная продолжительность росяного периода также не влияла на стимуляцию добавками развития болезни. Видимо, in vivo изученные питательные вещества активизировали также и антагонистическую эпи-фитную микрофлору листьев бодяка.

Анализ структуры популяции S.cirsii по признаку агрессивности показал, что в ней преобладают слабоагрессивные клоны (40%), высокоагрессивные клоны были редки (3.3%). Значительная часть (20%) изученных клонов не вызвала заражения проростков бодяка.

В пораженных септориозом растениях бодяка (примерно по 2 баллу) увеличивалось содержание Сахаров (почти в 2 раза), отмечалось незначительное увеличение (на 12%) содержания сухого вещества вследствие отмирания и обезвоживания тканей. Болезнь ведет к снижению фотосинтетической активности листьев бодяка: содержание хлорофилла было незначительно ниже (на 5%), а содержаниеj^-каротина снижалось на 36%. В пораженных септориозом листьях бодяка отмечено повышение рН клеточного сока по сравнению с контролем. Все это свидетельствует об определенном стрессе, которому подвергаются больные растения.

Гриб S.cirsii приурочен к растениям p. Cirsium. В вегетационных опытах гриб поражал, помимо основного растения-хозяина, следующие виды: C.esculentum С.А.Меу, С.heterophyllum (L.) Hill., C.oleraceum (L.) Scop., C.vulgare (Savi) Ten. При этом развитие болезни было незначительным, при помещении пораженных листьев во влажною камеру формировались единичные пикниды. Указанные виды, кроме C.vulgare (также сорного растения), не встречаются в агроценозах.

Узкая специализация патогена, отработанные технологические приемы культивирования его в лабораторных условиях позволяют пред ложить гриб Septoria cirsii в качестве перспективного агента биоконтроля.

ГЛАВА 5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГРИБА Ascochyta tussilaginis

5.1. Морфолого-культуральные свойства

Установлено, что для линейного роста колоний гриба оптимальной является температура 25°С, для формирования спороношеши - 23°С. Микросклероции (МС) образовавались при 23-28°С. При температуре ниже 14°С и выше 31°С колонии росли значительно медленнее, пикниды и МС не формировались. Гриб спороносил на синтетической среде (ЧА) значительно хуже, чем на полусинтетической (КСА).

Облучение культур эригермной лампой (ЛЭ-30) стимулировало формирование пикнид А. tussilaginis и повышало споропродуктивность гриба примерно на порядок по сравнению с неэкспонированными культурами. Значительно лучшие результаты (при р<0.05) получены при 3-сугочной экспозиции недельных культур: споровая продуктивность колоний гриба на КСА достигала 4.8х108 конидий/чашку Петри или 6.9х10б

конидий/см2. Существенных различий по шоропродуктивносш колоний, экспонированных светом флуоресцентных ламп (ЛБ-40) и росших в течение эксперимента в темноте, не получено. Кроме того, обнаружено значительное влияние источников света и на формирование МС: в темноте они закладывались в строме беспорядочно, а под влиянием УФ-света располагались в строме концентрическими кругами. Постоянное облучение флуоресцентными лампами подавляло формирование МС.

ФА,

В

9 10 11 Супш

Рис.4. Влияние содержания сахарозы/аспарагина в жидкой среде (1 - 5/1 и 2 - 20/2 г/л) на динамику физиологических процессов у гриба А5сосЬу1а ШнИа&тх'АА, сухая масса мицелия; 4Б, рН среды; 4В, фитотоксическая активность культуральной жидкости.

Патоген значительно лучше растет на средах, содержащих органические формы углерода (крахмал) и аминные формы азота (аминоуксусная кислота, аспарагин и

пегггон). Моносахара, входящие в состав среды не оказывали значительного влияния на линейный рост гриба. А. шзИа&тз хорошо усваивает нитратный источник азота, но значительно хуже развивается на средах с аммонийным азотом. Пикниды формировались только на среде с нитратом натрия и крахмалом. МС обильно закладывались на средах с нитратом натрия и крахмалом, несколько хуже - с лактозой и ксилозой, а также с глюкозой и аспарагином или пептоном. При этом, в зависимости от состава среды, колонии обнаружили значительную морфологическую изменчи-

вость по цвету (от белоснежного, кремового до глинисто-желтого) и текстуре колоний (от приподнятых пушистых до дрожжеподобных).

При высоком относительном содержании источника азота в среде (при соотношениях сахарозы и аспарагина 5:4 и 5:2) линейный рост A.tussilaginis заметно замедлялся; повышенное содержание аспарагина (4 г/л) препятствовало развитию воздушного мицелия. С повышением концентрации сахарозы в среде увеличивается как степень развития воздушного мицелия, так и биомасса гриба, которая практически не зависела от концентрации аспарагина. Оптимальной дня линейного роста и накопления биомассы (6.9 мг/мл на 10 сут) оказалась среда с концентрацией источников углерода 20 г и азота 2 г/л. МС лучше всего образовывались на агаризованной среде при соотношении сахарозы и аспарагина 20:1, пикниды - 5:1. С увеличением концентрации питательных веществ в среде усиливалась интенсивность окраски воздушного мицелия от белого, кремового до телесного, охристого цветов, однако при постоянном содержании сахарозы и увеличении концентрации аспарагина окраска ослабевает.

В процессе накопления биомассы (рис. 4А) гриб сначала подкислял (2-3 сут культивирования), а затем подщелачивал среду (рис. 4Б). На среде с содержанием С/А=5/1 г/л пик фитотоксической активности (52%) был отмечен на 3 суг (рис. 4В), в дальнейшем наблюдалось ее снижение, и на 11 сут КФ оказывал стимулирующее действие на рост корней проростков осота. Рост биомассы прекратился на 5 суг, на 7 сут начался процесс лизиса мицелия (рис. 4А). На среде с содержанием С/Ы=20/2 фиго-токсическая активность КФ постепенно нарастала, и на 11 сут она составила 36% (рис. 4В). Рост биомассы продолжался и на 11 сут. МС формировались в основном на стенках сосудов, начиная с 7 сут культивирования: на бедной среде -мелкие единичные, на богатой - крупные, многочисленные. Спороношсние в течение экспериментов не отмечено.

Высокая споропродуктивность гриба была отмечена на средах с грубо размолотыми зернами овса (4.9х107 конидий/г субстрата) и перловой крупой с добавлением мелко нарезанных листьев осота (3.2х107 конидий/г). В обоих случаях шюкулюм был высоко патогенен. Автоклавированные листья осота, видимо, стимулируют спороно-шение патогена, так как без них (на среде с перловой крупой) споровая продуктивность гриба была ниже почти на 2 порядка. МС лучше всего формировались на субстратах мелкой консистенции, пшене и ячневой крупе. Горох был самой неподходящей средой (хотя первые 7 суток культивирования на нем развивался обильный кремов »-белый воздушный мицелий), видимо, из-за очень высокого содержания азота, который подавляет вегетативный рост А.

5.2. Условия заражения осота полевого грибом АьсоскуЧа /и.ш7а£/лй и его патогенные свойства

Для прорастания спор гриба оптимальной является температура 28°С. При этой температуре конидии имели самую высокую скорость прорастания (более 50% через 6 ч), образуя 1-4 ростковые трубки. При 17°С и 31°С проросло менее 50% конидий, а при температуре ниже 12°С они практически не прорастали. Среди изученных нами

добавок к суспензии пикноспор A.tussilaginis в дистиллированной воде (контроль) лучшими оказались 1-2%-ные растворы сахарозы и 0.05%-ный раствор агара, которые повышали скорость роста и количество ростковых трубок почти в 2 раза по сравнению с контролем.

Конидии A.tussilaginis прорастали одинаково (более 90% через 4-6 ч при 25°С) на верхней и нижней поверхностях листа, 1-2-мя ростковыми трубками. При помощи СЭМ нами обнаружены некоторые особенности их прорастания. Конидии набухали, и на них появлялся продольный шов, напоминающий перегородку, по которому постепенно шло сбрасывание оболочки конидии. Ее остатки обнаруживались и на ростковых трубках, которые появлялись из продольной щели на конидии. Первые единичные случаи проникновения ростковых трубок в ткани растеши отмечались на обоих сторонах листьев верхнего и среднего ярусов осота через 12-24 ч после инокуляции. Ростковые трубки проникали в ткань растения механически, преимущественно через соединения антиклинальных клеток эпидермиса, образуя над ним небольшое лопато-видное вздутие. Реже проникновение шло непосредственно через кутикулу или устьица, часто гифы пересекали их, "не узнавая". Наблюдения при помощи СЭМ показали, что дальнейший характер инфекционного процесса (через 48 ч) ферментативный: вокруг прорастающих конидий и ростковых трубок на молодых листьях наблюдалось полное разрушение эпидермальных клеток, что, однако, не было зафиксировано на старых более кутинизированных листьях осота.

Таблица 6. Восприимчивость разновозрастных листьев (разных ярусов) осота к аскохитозу

Результаты эксперимента in vitro показали, что гриб способен заражать преимущественно молодые слабо кутинизированные листья (табл. 6); инокуляцию следует проводить по верхней поверхности листьев, так как нижняя их часть обладает высокой гидрофобностью. Оптимальная концентрация инокулюма для заражения осота лежит в пределах 5х10®-107 конидий/мл. Для возникновения болезни требуется росяной период. При 12-ч росяном периоде средняя интенсивность болезни (0.61 балла) не отличалось от контроля при р<0.05, при 48-4 росяном периоде аскохитоз развивался сильнее на 30%, при этом больные растения теряли более 50% свежей биомассы. Температурный оптимум для заражения осота 20-28°С (эти же температуры благоприятны и для прорастания конидий A.tussilaginis). Максимальное развитие болезни на 15 сутки после заражения наблюдалось при 28°С во время влажного периода, которое было более, чем в 3 раза выше по сравнению с инокуляцией при 12 или 16°С. Во всех опытах по искусственному заражению отмечена практически полная непоражаемость аскохитозом старых нижних листьев.

В результате экспериментов по инокуляции широкого круга растений обнаружено, что юолят A.tussilaginis, выделенный из осота полевого, в вегетационных опытах поражал растения родов Lactuca, Sonchus и вызывал латентную инфекцию у некоторых других растений сем. Asteraceae. В то же время он был авирулентен к мать-и-мачехе (Tussilago farfaraé)', заболевание, вызванное этим грибом, не отмечено на мать-и-мачехе в полевых условиях. Видимо, таксономия вида A.tussilaginis, синонимами которого являются A.scorzonera, A.sonchina nA.carthami (Мельник, 1977),

Вариант Количество инфекционных пятен на см2

Нижний ярус, верхняя сторона 0.13a

Нижний ярус, нижняя сторона 0.30a

Верхний ярус, верхняя сторона 35.51ь

Верхний ярус, нижняя сторона 20.13е

торого являются А.ясоггопега, А.яопсЫпа иA.carthami (Мельник, 1977), нуждается в уточнении.

Гриб Л.й/ли/^гяю не требует для заражения длительного периода увлажнения, не поражает растения, имеющих хозяйственное значение, и поэтому может считаться перспективным для дальнейшего практического использования. Актуальной проблемой для этого является оптимизация получения пропагул гриба (конидий и микро-склероциев).

ВЫВОДЫ

1. При проведении микофлористических исследований в 20 областях Российской Федерации собрано более 350 образцов бальных растений родов Cirsium Mill, и Sonchus L., на которых идентифицировано 50 (соответственно, 33 и 17) видов патогенных микромицетов.

2. На Sonchus arvensis L. обнаружены два новых вида рода Ascochyta: A.uspenskajae Berestetski sp.nov. и A.novotcínovae Berestetski sp.nov.

3. В качестве новых растений-хозяев выявлены: Cirsium arvense для Puccinia dioica и Fusarium oxysporum, Sonchus arvensis - для Alternaria chrysanthemi. Впервые сообщается о находке на территории России гриба Septoria cirsii-heterophylli, обнаруженного на C.heterophyllum, C.vulgare u C.esculentum, и эцидиальной стадии Puccinia opizii - на S.arvensis.

4. На основании изучения морфологии конидий, морфолого-культуральных свойств и изоферментного анализа уточнены таксономические критерии дня разграничения видов рода Septoria, обнаруженных на Cirsium spp., и видов рода Ascochyta -на Sonchus spp.

5. Для роста и развития Septoria cirsii предпочтительны полусинтетические среды, либо синтетические среды, содержащие тиамин (100 мкг/л); максимальное спороношение развивается при 25°С. Для Ascochyta tussilaginis предпочтительны по-лусингетические среды, пикниды образуются при облучении культур УФ-светом; для образования спороношения оптимальна температура 23°С. Для получения конидиаль-ного инокулюма обоих патогенов в качестве природного субстрата рекомендуется использовать дробленые зерна овса.

6. S.cirsii и Á.tussilaginis отзывчивы на концентрацию и соотношение источников углерода и азота в среде. Спороношение обоих грибов формируется при соотношении сахарозы и аспарагина 5:1.

7. Оптимальными условиями для заражения бодяка возбудителем сепгориоза являются: 36-48-4 росяной период при 20-28°С, концентрация инокулюма 5x105 конидий/мл; наиболее восприимчивая стадия развития бодяка - фаза розетки. В популяциях Septoria cirsii преобладают слабоагрессивные клоны (до 40%), высокоагрессивные клоны редки (3.3%).

8. Оптимальными условиями для заражения осота возбудителем аскохитоза являются: 24А8-Ч росяной период, температура 20-28°С, концентрация инокулюма 5x10s конидий/мл. Патоген способен заражать только молодые слабокутинизирован-ные вегетативные органы осота.

9. Гриб S.cirsii имеет узкую хозяинную специализацию в пределах рода Cirsium. Гриб A.tussilaginis, выделенный из растений осота желтого, менее специализирован: он поражал растения родов Sonchus и Lactuca и вызывал скрытую инфекцию у некоторых других растений семейства Asteraceae. Оба патогена не поражали эконо-

мически важные полевые культуры и могут считаться потенциальными агентами биологической борьбы с бодяком и осотом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Берестецкий А.О. Патогенная микофлора бодяка полевого. Материалы Всероссийского научно-производственного совещания "Состояние и пути совершенствования интегрированной защиты посевов сельскохозяйственных культур от сорной растительности". Пущино. 1995. С. 198-200.

2. Гасич Е.Л., Берестецкий А.О., Титова Ю.А. Изучение мшсофлоры некоторых сорных растений и оценка эффективности потенциальных агентов биоконтроля. Тезисы Всероссийского съезда по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичностъ" (5-10 декабря 1995 г.). С.-Петербург, 1995. С. 301-302.

3. Титова Ю.А., Гасич Е.Л., Берестецкий А.О., Жаров В.Р., Шестиперова B.C. Информационная система по патогенам сельскохозяйственных растений. Тезисы Всероссийского съезда по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичностъ" (5-10 декабря 1995 г.). С.-Петербург, 1995. С. 558.

4. Берестецкий А.О. Этапы исследований при разработке классической и био-гербицидной стратегий биологической борьбы с сорными растениями. Сельскохозяйственная биология. 1997. N 1. С. 3-15.

5. Берестецкий А.О. Микобиота бодяка полевого и родственных ему видов на территории европейской части России. Микология и фитопатология. 1997. Том 31. Вып. 4. С. 39-45.

6. Берестецкий А.О. Микобиота растеши рода Cirsium Mill, на территории европейской части России. Тезисы докладов VI Молодежной конференции ботаников в С.-Петербурге (12-16 мая 1997).-С.-Петербург, 1997. С. 19.

7. Берестецкий А.О., Гасич E.JL, Жаров В.Р., Титова Ю.А. База данных по ми-кобиоте сорных растений. Сб. научи, тр.: "Компьютерные базы данных в ботанических исследованиях, (ред. Д.В.Гельтман и Ю.Р.Росков). СПб.: БИН РАН, 1997. С. 1012.

8. Гасич Е.Л, Берестецкий А.О. Микобиота сорных растений окрестностей Саратова и Энгельса. Микология и фитопатология. 1997. Т.31. N 2. С. 18-22.

9. Berestetsky А.О. Study of the mycobiota of Cirsium arvense for developing a bioherbicide.lOth European Weed Research Society Symposium, Poznan, Poland, 22-27 June 1997. P. 168.

10. Berestetsky A.O., Smolyaninova N.V. The study of the mycobiota of Sonchus arvensis for developing a bioherbicide. IV International Bioherbicide Workshop (6-7 August 1998). Glasgow, 1998. P.27.

11. Гасич E.JI., Титова Ю.А., Берестецкий A.O., Жаров В.Р. Микобиота сорных растений европейской часта России: итоги исследований 1993-1998 гг. (ред. В.А. Мельник и Н.П. Черепанова), СПб, 1999,- 84 с.