Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическое обоснование создания микогербицида на основе фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Биологическое обоснование создания микогербицида на основе фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii"

На правах рукописи

Сокорнова Софья Валерьевна

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОЗДАНИЯ МИКО-ГЕРБИЦИДА НА ОСНОВЕ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА БТАСОКОБРОКЛ СЖБИ

Шифр и наименование специальности 03.02.12 - Микология

1 6 ИЮН 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

4850242

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Берестецкий Александр Олегович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН Афанасенко Ольга Сильвестровна

доктор химических наук, профессор

Гинак Анатолий Иосифович

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится 30 июня 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006.015.01 во Всероссийском научно- исследовательском институте защиты растений по адресу: 196608, Санкт- Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3. Факс: (812)470-51-10, E-mail: vizrspb@mail333.com.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений

Автореферат разослан 24 мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.А. Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Бодяк полевой (Asteraceae: Cirsium arvense L. Scop.) - многолетнее сорное растение, хорошо размножающееся семенами и вегетативным путем. Механические способы борьбы с бодяком трудоемки и малоэффективны. Применение большинства химических гербицидов ограничено невысокой избирательностью их действия и значительными нормами расхода (Государственный каталог..., 2010; Белан и др., 2001; Спиридонов и др., 2006). Для снижения химической нагрузки на экосистему применяют биологические средства защиты. Например, в Канаде и США для борьбы с бодяком применяют насекомых-фитофагов (Moore, 1975; Peschken et al., 1982). Для подавления трудноискоренимых и доминирующих видов сорняков также предложено использовать микогербициды (TeBeest, 1996; Гасич, Бере-стецкий, 2007). К их достоинствам относят высокую специфичность, длительное последействие и возможность использования совместно с некоторыми фитофагами (Kruess, 2002) и химическими препаратами в сублетальной дозе (Gressel et al., 1997). Несмотря на то, что поиск и первичная оценка патогенов бодяка ведется давно, микогербицидов, разрешенных к применению для борьбы с этим сорным растением, в настоящее время не имеется. Таким образом, актуальность данной работы обусловлена ограниченным выбором эффективных и экологически безопасных биологических средств борьбы с бодяком полевым.

Stagonospora cirsii J.J. Davis (анаморфная стадия гриба Didymella sp., Pleosporales, Ascomycota) - возбудитель пятнистости листьев с узкой специализацией, преимущественно поражающий растения семейства Asteraceae (Kungurtseva et al., 2006). Для успешного заражения конидиями этого гриба требуется длительный период повышенного увлажнения листьев и высокая температура воздуха. Конидии гриба образуются только при периодическом облучении в УФ диапазоне (Berestetskiy et al., 2005). Поэтому в работе рассматривалась возможность использования мицелия S.cirsii в качестве инфекционной основы микогербицида для биологической борьбы с бодяком.

Цель и задачи исследования Цель работы - обоснование возможности создания микогербицида на основе мицелия фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii.

Задачи исследования:

-определить патогенные свойства мицелия S.cirsii\

-разработать способы получения вирулентного мицелия S. cirsii при помощи твердофазной и жидкофазной ферментации;

-оценить возможность стабилизации и хранения мицелия S.cirsii',

-подобрать композиционные добавки, повышающие патсгенность мицелия S.cirsii, и оценить селективность наиболее эффективных композиций;

-оценить в полевых условиях патогенность мицелия S.cirsii в отношении бодяка полевого.

Научная новизна Впервые доказана способность фрагментов мицелия пикнидиального гриба S.cirsii заражать бодяк полевой в контролируемых и полевых условиях. Выявлены особенности процесса инфицирования бодяка

различными типами инокулюма (конидии и фрагменты мицелия) S.cirsii. Показана временная динамика развития инфекционных структур гриба на поверхности листьев растения-хозяина. Выявлены места проникновения инфекционных гиф в ткань листа. Тип действия композиций на основе фрагментов мицелия S.cirsii определен, как инфекционный. Установлено, что композиционные добавки (кукурузное масло, глицерин с ксантаном) могут влиять на место и интенсивность проникновения инфекционных структур в ткань листьев бодяка полевого и некоторых культурных растений.

Практическая значимость работы Определены оптимальные параметры твердофазной и жидкофазной глубинной ферментации (продолжительность ферментации, влажность зернового субстрата, природа и концентрация источника азота для жидкой среды и т.д.) для получения мицелия S.cirsii, обладающего высокой агрессивностью в отношении бодяка полевого. В качестве способа стабилизации мицелия S.cirsii, полученного на зерновом субстрате (пшено) и на жидкой сахарозо-соевой среде, предложена сушка проточным воздухом. На основе мицелия S.cirsii разработаны композиции, применение которых приводит к существенному поражению наземной части растений бодяка, определена селективность этих композиций.

Апробация работы Основные результаты исследований были представлены на 13 Симпозиуме EWRS (Италия, Бари, 2005), на Международной конференции "Development of Environmentally Friendly Plant Protection" (Piihajarve, Эстония, 2006), Школе НАТО для молодых ученых (NATO Advanced Institute) «Novel biotechnologies for biocontrol agent enhancement and management» (Gualdo Tadina, Италия, 2006), XV Конгрессе микологов Европы (Санкт-Петербург, 2007), Втором Съезде микологов России (Москва, 2008) и Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009).

Работа выполнена при финансовой поддержке Шестой рамочной программы Европейского союза (проект № FOOD-CT-2003-001687 "Enhancement and Exploitation of soil Biocontrol Agent for Bio-Constraint Management in Crops", 2004-2006 гг.), МНТЦ (проект № 2939 "Development of Biological Préparation Based on Natural Microorganisms Strains for Control of Perennial Weeds", 2005-2008 гг.), грантов Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической деятельности: 2009 г., проект «Изучение инфекционного процесса при заражении бодяка полевого фитопатогенным грибом Stagonospora cirsihy, 2010 г., проект «Разработка новых подходов для получения и хранения экологически безопасного микогербицида на основе фитопатогена Stagonospora cirsii для борьбы с бодяком полевым».

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в т.ч. 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура н объем диссертации Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста. Состоит из введения, шести глав, выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 13 таблицами и 55 рисунками. Список использованной литературы включает 136 наименований, в том числе 104 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении охарактеризована актуальность темы, новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследований.

Глава 1. Обзор литературы

Рассмотрено современное состояние защиты сельскохозяйственных культур от бодяка полевого (Cirsium arvense L. Scop.). Оценены потенциальные микогербициды для борьбы с бодяком полевым. Проанализированы проблемы связанные с получением, стабилизацией и применением микогербицидов. Основное внимание уделено вопросам выбора инфекционной основы препарата, а также параметров оптимизации питательных сред и композиций, позволяющих увеличить эффективность микогербицидов в полевых условиях.

Глава 2. Объекты и методы исследований

В работе использован штамм S.cirsii из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии, коллекционный номер 1.41 (ВИЗР). Гриб хранился при 5°С в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре и при -80°С в 10% глицерине.

Бодяк полевой и культурные растения выращивали из семян до фазы розетки в сосудах с торфом и песком, по 3 растения при температуре 22-25°С и искусственном освещении люминесцентными лампами.

Конидиальный инокулюм гриба получали на перловой крупе при периодическом освещении УФ ближнего спектра (12 ч в день) и температуре 24±2°С в течение 10 суток. Мицелиальный инокулюм получали на пшене с относительной влажностью от 30 до 50% и жидких питательных средах. В качестве базовой среды использовалась среда Чапека с дрожжевым экстрактом в концентрации 2 г/л. Состав оптимизированной по источникам углерода и азота жидкой питательной среды: 15 г/л соевой муки, 60 г/л сахарозы, 1 г/л дрожжевого автолизата, 1 г/л КН2Р04, 0.5 г/л MgS04 (рН=6.0). Выращивание культур S.cirsii проводили в течение 2-15 суток при температуре 24±2°С.

Мицелий сушили проточным воздухом или лиофилизировали. В качестве протекторов использовали аэросил, глицерин и пшено.

Композиции готовили на основе конидий или измельченного (частицы < 150 мкм) мицелия. В состав всех композиций входил 0,01% Твин 80. Композиционные добавки (кукурузное масло, лецитин, ксантан, глицерин, обезжиренное сухое молоко, картофельный и кукурузный крахмал) предварительно автоклавировали 10 мин при 0,5 атм.

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в суспензии на основе мицелия S.cirsii определяли путем подсчета колоний, образующихся на 3 сутки после высева при температуре 24°С на среде Чапека с дрожжевым экстрактом.

Листовые высечки диаметром 0,8 см инокулировали инфекционным материалом путем опрыскивания (для микроскопирования), либо нанесения 5 мкл композиции на основе мицелия S.cirsii в центр диска (для оценки патогенно-сти экспресс-методом). Инокуляцию растений производили путём опрыски-

вания композициями (2 мл/раст.) Сосуды с растениями помещали в увлажненные полиэтиленовые пакеты и ставили в затемненное место на 24 или 36 часов, а затем перемещали на стеллажи с периодическим искусственным освещением люминесцентными лампами.

Интенсивность развития пятнистости листьев бодяка полевого оценивали экспресс-методом на листовых высечках и на целых растениях по площади некрозов. Данные экспресс-метода коррелировали (R=0,86) с данными по площади некрозов листьев целых растений. Также оценивали потерю массы наземной части растений по отношению к контролю.

Особенности процесса инфицирования бодяка изучали методами электронной сканирующей и световой микроскопии. Листовые высечки инкубировали при 24°С во влажной камере и анализировали при 400-1000-кратном увеличении на электронном сканирующем микроскопе Evo Е40 (Carl Zeiss). Для световой микроскопии инкубированные высечки фиксировали, обесцвечивали в жидкости Карнуа и окрашивали 1% раствором анилинового синего (Барыкина и др., 2004). Полупостоянные препараты в лактофеноле изучали при 400-1000-кратном увеличении на световых микроскопах DM 2500 (Leica) и MTB 2004 (Carl Zeiss).

Фитотоксическую активность культуральной жидкости и ее экстрактов определяли по плошади некрозов на листовых высечках. На поврежденный иглой участок листового диска наносили 10 мкл культуральной жидкости или экстракта (5 мг/мл) в 5% этаноле. Учет проводили через 2 суток инкубации при 24°С и переменном искусственном освещении. Метаболитиый профиль экстрактов определяли при помощи тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60 F254 (Merck) в системе растворителей н-гексан-этилацетат (1:1). В качестве стандартов использовали стагонолид и стагонолид H (Yuzikhin et al., 2007; Evidente et al., 2008). Проявление хроматограмм осуществляли в парах йода и путем опрыскивания 10% серной кислотой в этаноле с последующим нагревом (110°С) в течение 10 мин.

Полевые опыты проводили в 2006, 2007 и 2010 годах на опытном поле ВИЗР в 3-х кратной повторности. В вечернее время растения инокулировали композициями на основе мицелия S.cirsii. Учет развития болезни проводили на 14 сутки по плошади некрозов листьев и изменению массы надземной части растений. Реизоляцию патогена в чистую культуру проводили общепринятыми фитопатологическими методами (Хохряков, 1978).

Статистическая обработка экспериментальных данных выполнялась методами дисперсионного и регрессионного анализов (Поллард, 1982; Доспехов, 1985) с помощью программного обеспечения MS Excel 2010 и StatSoft STATISTICA 6.0.

Глава 3. Патогенные свойства мицелия S.cirsii

Для оценки патогенных свойств мицелия гриба S.cirsii оценивали условия заражения бодяка мицелиальными фрагментами, сравнивали временную и пространственную динамику развития инфекционных структур, определяли специализацию различных типов инокулюма и тип действия мицелия.

Продолжительность периода повышенного увлажнения листьев для успешного заражения бодяка суспензией на основе глубинного мицелия cir.su (25 мг/мл) составляла не менее 16 часов и становилась существенной только при температуре не ниже 24°С. При температуре 20°С, вне зависимости от продолжительности периода повышенного увлажнения листьев, симптомы поражения были выражены слабо (некрозы 35% площади листовой поверхности). При температуре 16°С достоверного поражения листьев бодяка не наблюдали.

Для выявления особенностей процесса инфицирования бодяка полевого различными типами инокулюма гриба 5.агяИ использовали методы сканирующей и световой микроскопии. Через 4-8 часов после инокуляции конидии прорастали 1-2 короткими ростковыми трубками, возобновлялся рост гиф из фрагментов мицелия. Единичные проникновения ростковых трубок конидий гриба через кутикулу листьев бодяка наблюдали через 24 ч после заражения, гиф мицелия - уже через 12 ч (сахарозо-соевая среда) и 16 ч (пшено). Массовые проникновения инфекционных гиф наблюдали после заражения конидиями через 36 ч, после заражения мицелием - через 16 ч (сахарозо-соевая среда) и 20 ч (пшено) (рис. I).

Рис. 1. А - проникновение инфекционной гифы гриба Б.ЫпИ на границе эпидер-мальных клеток (24 ч после инокуляции конидиями); В - массовые проникновения инфекционных гиф (16 часов после инокуляции мицелием)

Анализ данных динамики развития пропагул гриба Б.а«// на поверхности листьев бодяка полевого (рис. 2) показал, что максимальная средняя линейная скорость роста инфекционных гиф наблюдается при инокуляции мицелием, полученным на сахарозо-соевой среде (-21 мкм/час). Средняя линейная скорость роста инфекционных пропагул при заражении конидиями и мицелием, полученным на пшене, фактически совпадают (~7 м км/ч ас).

Рис. 2. Динамика инфекционного процесса при инокуляции листовой поверхности бодяка нолевого иропагулами Я-еюИ

4 3 часы 12 16

•Конидии ■Мицелий (пшено) А-Мицелий (сахарозо-соевая среда')

На пространственное развитие инфекционного процесса тип инокулюма .9.с/т/ влияния не оказывал. Как в случае инокуляции конидиями, так и при инокуляции фрагментами мицелия инфекционные гифы проникали в ткань листа только на границах эпидермальных клеток. Никаких видимых изменений клеточных стенок вокруг мест проникновения гиф не отмечалось (рис. 1).

Для определения типа действия мицелия З.с'ти анализировали метабо-литный профиль экстрактов культурального фильтрата и мицелия методом тонкослойной хроматографии. На 3 сутки культивирования 5.с/гя/7 на жидкой питательной среде стагонолид был обнаружен только в мицелии, но не выявлялся в культуральном фильтрате. На б сутки культивирования стагонолид был идентифицирован как в культуральном фильтрате, так и в мицелии. Фи-тотоксическая активность культурального фильтрата отмечалась только на 6 сутки. Стагонолид Н не выявлен ни в мицелии, ни в культуральном жидкости. Следовательно, тип действия 3-х суточного мицелия гриба З.с/гхи является инфекционным.

Избирательность действия инфекционных пропагул &С1Ш1 (конидий и фрагментов мицелия, полученного на пшене) оценивали на бодяке полевом и на культурных растениях 5 семейств. Полученные результаты позволяют предположить, что специализация S cir.sH ограничена трибой Сагс1иеае семейства АБ1егасеае. Использование мицелия в качестве инфекционной основы не приводит к расширению круга растений-хозяев.

Таким образом, мицелий 5.с/>л/7 можно рассматривать в качестве инфекционной основы при создании микогербицида для биологической борьбы с бодяком полевым.

Глава 4. Способы получения мицелия 5.с/ш/

Грибные пропагулы получают с помощью твердофазной (ТФ) и жидко-фазной ферментации (ЖФ). От условий ТФ и ЖФ зависят такие свойства инфекционного материала, как патогенность, жизнеспособность и возможность стабилизации.

Известно, что при ТФ на скорость роста мицелиапьных грибов влияет влажность субстрата (ЯанпЬаик е! а!., 1998). В свою очередь жизнеспособность, биологическая активность и устойчивость к неблагоприятным факторам, например, высушиванию и хранению, зависит от возраста грибов (Нб1кег е1 а1., 2004). В качестве субстрата для получения вирулентного мицелия Я.с/гяИ может быть использовано пшено (Берестецкий, 2005). Поэтому оптимизацию процесса ферментации Хс/гл» на пшене проводили по влажности субстрата-и времени культивирования.

Дисперсионный анализ полученных данных подтвердил значительное влияние влажности субстрата и продолжительности культивирования на патогенность и жизнеспособность получаемых пропагул (р<0,001). Наиболее патогенным (площадь поражения листьев -75%) и 'жизнеспособным (-!(/' КОЕ/г) являлся мицелии, полученный на 15 сутки на пшене 35% влажности, и на 10 сутки на пшене 50% влажности (рис. 3).

Для полученного на 10 сутки на пшене 50% влажности мицелия Хс/гш определяли инфекционную нагрузку, требуемую для поражения бодяка полевого в оптимальных условиях (24°С, период повышенного увлажнения листьев 24 ч). Водная суспензия на основе перемолотого мицелия Л'.агхи вызывала 50% поражение листьев бодяка в концентрации около 100 мг/мл (-9,6* 104 КОЕ/г).

В процессе ТФ крайне трудно избегать образования градиентов температуры, а также концентрации кислорода и углекислого газа в слое субстрата (Ваг1еП, ^голбЫ, 1988; Нб1кег а1., 2004). Кроме того, длительность культивирования грибов при ТФ всегда в несколько раз превышает длительность культивирования при ЖФ. Поэтому рассматривалась возможность получения вирулентного мицелия с помощью жидкофазной глубинной ферментации.

В предварительных экспериментах было установлено, что вирулентный мицелий Б.ЫпИ может быть получен на среде Чапека с дрожжевым экстрактом. На этой среде на 4 сутки культивирования выход мицелия Я.Ыг$И не превышал 3 г/л, ЛД50 для бодяка составлял 100 мг/мл (Бокогпоуа, Вегез1е1зк!у, 2007). Следовательно, требовалась увеличить выход и патогенные свойства получаемого мицелия Хс/пн.

100

Плошад» да = 9о 80 | некртов

Сутки

5 10 15

^^■»Пшено • 5"„ ачажности ™Пшено апажности

Рис. 3. Влияние влажности субстрата и времени культивирования на жизнеспособность и патогенные свойства мицелия

Условия жидкофазного культивирования 5.с/п?// оптимизировали в пять этапов - по природе источников углерода и азота, по устойчивости мицелия к сушке, по времени культивирования и по концентрациям источников углерода и азота.

Наиболее агрессивный в отношении бодяка полевого мицелий образовывался на модифицированной среде Чапека с сахарозой в качестве источника углерода (выход мицелия составил 4 г/л).

Более существенное влияние на выход мицелия ¿'.е/ш/ оказывал тип ис-

точника азота. Замена нитрата натрия на органические источники азота (казеин, соевую муку или ферментативный пептон) приводила к увеличению выхода мицелия в 4,5 и более раз. Мицелий, полученный на питательных средах с этими источниками азота, вызывал 100% некрозы на высечках из листьев бодяка.

При сушке мицелия, полученного на этих средах, без протекторов проточным воздухом в тонком слое наименьшие потери жизнеспособности наблюдались для инфекционного материала, полученного на сахарозо-соевой среде.

Динамика процессов накопления биомассы S.cirsii и изменения патогенных свойств гриба различались. Были выявлены два пика образования наиболее патогенного мицелия - на 3 и 6 сутки (рис. 4). Максимальную агрессивность в отношении бодяка проявлял 3-суточный мицелий. Этот период соответствует середине экспоненциальной фазы роста гриба, характеризующейся наиболее активными метаболическими процессами, связанными с синтезом веществ грибного организма (Jenkins et al„ 1998).

Второй пик биологической активности, наблюдающийся на 6 сутки, приходился на фазу старения (конец стационарной фазы), что может быть связано с началом токсинообразования. Выход сухой биомассы на 3 и 6 сутки культивирования составлял около 25 мг/мл. Надо отметить, что время образования наиболее патогенного мицелия и время наибольшего выхода (4 сутки, -36 мг/мл) мицелиального инокулюма не совпадало.

Сахарозо-соевую среду оптимизировали по концентрациям источников углерода и азота, оценивая выход мицелия S.cirsii и его патогенность на 3-сутки культивирования. Наиболее агрессивный мицелий (100% некрозы листовых высечек) образовывался при концентрации сахарозы от 30 г/л и выше и при концентрации соевой муки от 12,5 г/л до 17,5 г/л. Наибольший выход сухой биомассы, составляющий 36 г/л (в 12 раз выше, чем на базовой среде), наблюдался при концентрации сахарозы 60 г/л и соевой муки 15 г/л.

Таким образом, оптимизированная сахарозо-соевая среда имела следующий состав: соевая мука 15 г/л, сахароза 60 г/л, дрожжевой автол изат 1 г/л, КН2Р04 1 г/л, MgS04 0,5 г/л. Водная суспензия мицелия вызывала 50% поражение листьев бодяка в концентрации -25 мг/мл (-2.5*10"1 КОЕ/г).

1'ие. 4. Влияние на выход и патогенные свойства мицелия S.cirsii продолжительности к> дьтивиро-напия на сахарозо-соевой среде

100

о о.

а

БО

40

30

20 ю

10

3 4 5 6 7 •I Гашиш, мокро ¡ив. %. МСР = 8.0 ■С\\аи оиомасса. г/л. МС'Р = 0.4

Для изучения возможности хранения мицелия S.cirsii, полученного на пшене, зерна, обросшие мицелием, сушили при комнатной температуре про-

точным воздухом. Затем хранили, как в виде цельных зерен, так и в перемолотом виде в течение трех месяцев. При хранении в виде цельного, обросшего мицелием пшена жизнеспособность и патогенные свойства мицелия &с*>5/7 практически не изменялись. Хранение перемолотого материала приводило к быстрой потере свойств мицелия 5. с/гш (рис. 5).

100

30

Сутки 90

0 30 Сутки 90

—КОЕ/г, *10Е4 —КОЕ/г, х10Е4

■ Площадь некрозов на высечка;-:,% И 'Площадь некрозов на высечках,%

Рис. 5. Изменение жизнеспособности и патогенных свойств мицелия И при хранении в цельном (слева) и измельченном виде (справа)

Жизнеспособность мицелия Б.агь■//, полученного на сахарозо-соевой среде, сразу после сушки проточным воздухом снижалась на 85%, а с добавкой аэросила - только на 40%. Патогенные свойства мицелия, высушенного с аэросилом, оставались на уровне сырой биомассы. Лиофильная сушка мицелия, даже в присутствии глицерина в качестве криопротектора, приводила к практически полной потере жизнеспособности грибных пропагул. Без существенных потерь жизнеспособности и патогенности мицелий, высушенный с аэросилом, при комнатной температуре хранился до 2 недель (рис. 6).

100

80 •

д о

2 60

t

1 40 Я

3 20 о S 0

7 0 Сутки

2 Р,0 tyyjfejtiffil1)

0 7 14 21 2.3 Сырая биомасса Биомасса без добавок НСР = 3, j Биомасса с аэросиломНСР = 3,1

Рис. 6. Жизнеспособность и патогенные свойства мицелия S.cirsii. высушенного проточным воздухом с аэроси.том и без добавок

Глава 5. Композиции на основе мицелии S.cirsii.

Согласно литературным данным добавка кукурузного масла способна повышать эффективность микогербицидов (Abbas, Egley, 1996; Boyette et al., 2007).

Композиция на основе выращенного на пшене мицелия S.cirsii, содержащая 6% кукурузного масла, вызывала 50%ное поражение листовой массы бодяка при концентрации мицелия около 40 мг/мл (-5х 104 КОЕ/мл). При обработке композицией без этой добавки такое же поражение достигалось при концентрации 100 мг/мл (рис. 7). Кроме того, при добавлении кукурузного масла некрозы листьев наблюдались уже через сутки после заражения.

о

20 40 60 80 100 120 Концентрация мицелия, мг/мл

— 0% масла ■ 6% масла

Рис. 7. Влияние добавки кукурузного масла и концентрации мицелия S.cirsii на площадь некрозов листьев бодяка (7 сутки после инокуляции)

Известно, что добавки растительных масел могут снижать избирательность микогербицидов (Amsellem et al., 1991). В связи с этим оценивалась селективность композиции на основе мицелия S. cirsii, содержащей кукурузное масло на бодяке полевом и на культурных растениях 6 семейств.

Практически во всех случаях включение в композицию кукурузного масла увеличивала степень поражения листьев культурных растений. Из растений семейства Asteraceae сильную восприимчивость к композиции, содержащей 6% масла, проявлял артишок, среднюю - календула и цинния, слабую - цикорий. Также умеренные поражения наблюдались на растениях семейств Solanaceae и Fabaceae, более слабые - на растениях семейств Malvaceae и Brassicaceae. Таким образом, избирательность композиции заметно снизилась после введения в ее состав кукурузного масла.

По литературным данным известно, что для уменьшения фитотоксическо-го эффекта растительного масла используют лецитин (Shabana, 2005). Поэтому при исследовании влияния добавок на эффективность композиций, содержащих мицелий, выращенный на сахарозо-соевой среде, испытывалась смесь кукурузного масла с лецитином, а также другие, часто применяемые в мико-1'ербицидах добавки: картофельный и кукурузный крахмал, сухое молоко с глюкозой, ксантан с глицерином.

Все мспытывавшиеся добавки в контролируемых условиях усиливали проявление симптомов пятнистости, вызванных мицелием S.cirsii на листьях бодяка полевого. Наиболее сильное влияние оказывали добавки кукурузного масла с лецитином, а также ксантана с глицерином. Несколько ниже уровень поражения отмечали в результате применения композиции с добавкой куку-

рузного крахмала и глюкозы с сухим молоком. Добавка картофельного крахмала меньше других добавок влияла на площадь поражения листьев бодяка полевого, хотя и в этом случае эффективность композиции возросла примерно в 2 раза по сравнению с контролем (рис.8). Площадь поражения листьев бодяка после инокуляции растений композициями с добавками кукурузного масла с лецитином и ксантана с глицерином возрастала в среднем в 3,7 раза, при этом наблюдалось достоверное (р<0,05) снижение наземной массы растений (около 75%).

100

о

° - 80 из

о

рт

§.60

■Л

(и

I40

3 20

НСР=11,3

мицелий, картофельный кукурузный ксантан. 0,05%. кукурузное глюкоза, 0,1% суспензия, крахмал, крахмал, глицерин, 0,2% масло, 5% сухое молоко, бездобавок 0,5% 0,5% лецитин, 0,5% 0,01%

Композит юнные добавки В основе всех композиций мицелий У.с/га/, полученный на сахарозо-соевой средс. в концентрации 25 мг/мл

Рис. 8. Влияние композиционных добавок на площадь некрозов листьев бодяка (7 сутки после инокуляции)

Оценка селективности композиций, содержащих кукурузное масло с лецитином и ксантан с глицерином, проводилась на бодяке полевом и на культурных растениях 6 семейств.

Из культурных растений семейства Азгегасеае среднюю восприимчивость к композиции, содержащей кукурузное масло с лецитином, проявляли календула, слабую восприимчивость - цинния и артишок. Среди культурных растений других семейств восприимчивость к композиции наблюдали только на томатах. Среди культурных растений семейства А$1егасеае композиция, содержащая ксантан с глицерином, вызывала существенные поражения листьев артишока и слабые - циннии. Достоверные поражения листьев культурных растений других семейств не наблюдались (рис. 9).

Как показали результаты опытов в контролируемых условиях, введение в состав композиции на основе мицелия Л' с/гп/ добавки лецитина несколько снизила фитотоксический эффект кукурузного масла. Добавка ксантала и глицерина не влияла на селективность композиции.

Кукурузное масло и ксантан с глицерином оказывали заметное влияние на развитие инфекционных структур %.агхи на поверхности листьев бодяка полевого и культурных растений. Композиция на основе фрагментов мицелия Я.с1П//\ содержащая кукурузное масло, образует на поверхности листьев бо-

дяка полевого и томата масляную пленку. Па поверхности листьев пшеницы | образование пленки не происходит.

□ Мицелий, суспензия 7Е5 КОЕ/млНМицелий, эмульсия, 4ЕЗ КОВ'нлШМицелий, суспензия 4ЕЗ КОЕ/ш

Рис. 9, Оценка селективности композиций на основе мицелия Б. с ¡гя и

На листовой поверхности бодяка в масляной пленке наблюдался активный рост гиф, образующих через 12 часов после заражения разветвленный мицелий с множественными проникновениями гиф в ткани листа (рис. 10). В то время как при инокуляции композицией на основе мицелия без добавок, проникновения инфекционных гиф были выявлены позже, единичные - через 16 1 часов, массовые - через 20 часов (глава 3).

На поверхности листьев томата слабый рост гиф и единичные проникновения на границах эпидермальных клеток наблюдались только через 20 часов после инокуляции (рис. 11).

Таким образом, добавка кукурузного масла в композицию с мицелием | гриба 5.67>.ш изменяла временную динамику болезни, но не затрагивала ее I пространственное развитие. Кроме того, включение этой композиционной добавки провоцировало заражение культурного растения - томата.

После инокуляции композицией на основе мицелия, содержащей ксантан с глицерином, первые проникновения в межклеточное пространство листьев бодяка наблюдались через 12 часов, через 16 часов они приобретали массо- 1 вый характер. Таким образом, развитие болезни происходит быстрее, чем при | инокуляции композицией на основе мицелия без добавок, но медленнее, чем при инокуляции композицией, включающей добавки кукурузного масла. Кроме того, при заражении растений бодяка полевого композицией, включающей ксантан с глицерином, отмечалось проникновение инфекционных гиф в ткань листа не только на границах эпидермальных клеток, но и через усть- | ица, в результате чего интенсивность проникновений возрастала (рис. 12).

Рис. 10. Развитие инфекционных гиф З.С1пИ в масляной пленке на поверхности листьев бодяка (12 ч после инокуляции)

Рис. 11. Развитие инфекционных гиф 5.аг.чИ в масляной пленке на поверхности листьев томата (20 ч после инокуляции)

Рис. 12. Вид гиф. развивающихся на поверхности листа бодяка, после инокуляции композицией, содержащей ксантан и глицерин

Глава 6. Применение композиций на основе мицелия &с/'пн в полевых условиях

При проведении полевых опытов использовались композиции на основе мицелия 5.си\чИ с некоторыми добавками (кукурузное масло, лецитин, крахмал). Также в полевых опытах изучалась возможность совместного применения грибных препаратов с химическим препаратом Лонтрел Гранд. Выбор гербицида Лонтрел Гранд (действующее вещество клопиралид) был обусловлен тем, что он поражает сорные растения семейства Asteraceae, но не оказывает отрицательного влияния на рост гриба ¿>.cir.sH (Веге51ейк1у е1 а1., 2007).

В полевых опытах 2006 года растения бодяка полевого в фазе розетки подвергались инокуляции композицией, содержащей выращенный на пшене мицелий (75 мг/мл). Для компенсации условий пониженной влажности в полевых условиях в композицию включалось 6% кукурузного масла. При проведении опытов средняя температура воздуха была 17°С, а средняя относительная влажность воздуха - 65%. Симптомы поражения наблюдались на всех обрабатываемых растениях. Площадь некрозов листьев бодяка через 2 недели после инокуляции растений композицией, содержащей мицелий аг$'й и 6% кукурузного масла, составила всего 33% (рис. 13).

Полученные результаты подтвердили, что для успешного заражения бодяка полевого мицелием Б.агзН требуются более высокие температура и влажность. Композиционная добавка кукурузного масла в данном случае не оказала влияния на патогенные свойства мицелия, так как влажность воздуха при температурах ниже 20°С не является определяющим фактором заражения (глава 3).

Совместное применение гербицида Лонтрел Гранд в пониженной концентрации (0,1 г/л) и мицелия И приводило к увеличению площади некрозов листьев бодяка до 42%, что сопоставимо с поражением листьев, вызываемых

Рис. 13. Поражение листьев бодяка полевого композициями на основе мицелия 5.с/«(7. полученного на пшене, и гербицидом Лонтрел Гранд в условиях полевого опыта 2006 года 1 - контроль: 2 - Лонтрел Гранд (0.4 мг/мл); 3 - Лонтрел [ ранд (0.1 мг/мл) + 6% кукурузного масла: 4 - мицелий (75 мг/мл) + 6% кукурузного масла: 5 -Лонтрел Гранд (0.1 мг/мл) + мицелий (75 мг/мл)

В вегетационно-полевых опытах 2010 года для инокуляции растений бодяка полевого в фазе розетки использовались те же композиции на основе мицелия, выращенного на пшене. Средняя температура воздуха была около 25°С, средняя относительная влажность воздуха - около 65%. Понижения температуры ниже 20°С и влажности ниже 60% не отмечалось. Через 2 неде-

этим гербицидом в рекомендуемой дозе. 50 -

2 3 4 5 Композиция

ли после инокуляции растений бодяка композицией, содержащей мицелий cir.sH и 6% кукурузного масла, площадь некрозов составила 75% (рис. 14), что сопоставимо с результатами, полученными в оптимальных для заражения грибом S-cir.sH условиях. Таким образом, добавка 6% кукурузного масла компенсировала недостаточную для успешного развития грибных пропагул относительную влажность воздуха. Совместное применение мицелия cir.sH и гербицида Лонтрел Гранд в концентрации в 4 раза ниже рекомендованной приводило к 90% поражению наземной части растений бодяка.

1 2 3 4 5 Композиция

Рис. 14. Поражение листьев бодяка полевого композициями на основе мицелия X. с/тан, полученного на пшене, и гербицидом Лонтрел Гранд в условиях полевого опыта 2010 года

I - контроль: 2 - Лонтрел Гранд (0,4 мг/мл); 3 - мицелий (75 мг/мл); 4 - мицелий (75 мг/мл) + 6% кукурузное масло; 4 - Лонтрел Гранд (0.1 мг/мл) + мицелий (75 мг/мл)

В полевых опытах 2007 года растения бодяка полевого в фазе цветения инокулировали композицией, содержащей мицелий, выращенный на сахаро-зо-соевой среде. Для компенсации пониженной влажности использовались добавки лецитина (10%) и кукурузного крахмала (5%). Также проверялась возможность совместного использования мицелия 5.с/«//, полученного на сахарозо-соевой среде и гербицида Лонтрел Гранд.

В течение 2 недель после инокуляции средняя температура воздуха была около 20°С, средняя относительная влажность воздуха - около 76%. Композиция с мицелием без защитных добавок вызвала некрозы листьев площадью менее 40% (рис. 15). Низкая эффективность этой композиции в полевых условиях объясняется высокой восприимчивостью грибных пропагул к низкой влажности в первые часы после инокуляции. Композиция, содержащая мице-лиальный инокулюм и добавку лецитина в концентрации 10%, вызвала некрозы листьев площадью более 80% (рис. 16). Площадь некрозов листьев бодяка при инокуляции композицией с мицелием и добавкой 5% кукурузного крахмала составляла около 70%. Таким образом, добавки лецитина и крахмала способны защищать грибные пропагулы от нежелательных воздействий внешней среды.

Совместное применение композиции на основе мицелия и химического гербицида Лонтрел Г ранд в сублетальной дозе приводило к 95% повреждению листьев бодяка, которое сопровождалось значительной потерей массы наземной части и полной гибелью растений. Следовательно синергетический эффект при совместном применении мицелия S.cirsii с гербицидом Лонтрел Гранд наблюдается независимо от способа получения инфекционного материала.

1 2 3 4 5 6 Е Площадь некрозов, % НСР = 9,7 ■ Масса наземной части растений, % НСР = 12,8

Рис. 15. Поражение листьев бодяка полевого композициями на основе мицелия 5>.си\чИ, полученного на саха-розо-соевой среде, и гербицидом Лонтрел Гранд в условиях полевого опыта 2007 года. 1 - контроль; 2 - Лонтрел Гранд (0,4 мг/мл); 3 -мицелий (75 мг/мл); 4 - мицелий (75 мг/мл) + 10% лецитина; 5 - мицелий (75 мг/мл) + 5% крахмала; 6 -Лонтрел Гранд (0,1 г/л) + мицелий (50 мг/мл)

Рис. 16. Проявление симптомов пятнистости листьев при заражении бодяка мицелием сг/-.ш в полевых условиях (слева - контроль, справа - опыт)

Выводы

- Для искусственного заражения бодяка полевого мицелием 5.С1ГЯИ оптимальными являются температура 24°С, период повышенного увлажнения листьев 24 ч, а также концентрация около 9,6х 104 КОЕ/г для мицелия, полученного с помощью твердофазной ферментации, и около 5*104 КОЕ/г для мицелия, полученного с помощью жидкофазной ферментации.

- Тип действия мицелия Хс/шУ определен, как инфекционный, так как токсины в процессе инфицирования бодяка полевого 3-х суточным мицелием 5. с/га/ не, участвуют. Независимо от типа инокулюма проникновение гиф гриба в ткани листьев бодяка отмечено на границах эпидермальных клеток листьев.

- Вирулентный мицелий Sxii-.sH может быть получен с помощью как твердофазной. так и жидкофазной ферментации

- Оптимальными по патогенным свойствам и выходу мицелия .9. с/га/ являются следующие параметры твердофазной ферментации: влажность пшена

35%, время культивирования 10 суток.

- Оптимальными по патогенным свойствам и выходу мицелия S.cirsii являются следующие параметры жидкофазной ферментации: сахароза как источник углерода в концентрации 40 г/л, соевая мука как источник азота в концентрации 15 г/л, продолжительность ферментации 3 суток.

- Мицелиальный инокулюм S.cirsii может быть стабилизирован высушиванием. Неизмельченный мицелий, полученный на зерновом субстрате, хранится 3 месяца при 24°С без потерь своих свойств. Мицелий, полученный на жидкой питательной среде, не теряет в процессе сушки с аэросилом патогенность и жизнеспособность, и выдерживает краткосрочное хранение в течение 2 недель.

- Патогенные свойства мицелия S.cirsii могут быть улучшены композиционными добавками, стимулирующими процесс проникновения гиф в листовые ткани. Добавка ксантана (0,05%) с глицерином (0,2%) повышает эффективность глубинного мицелия в 4 раза без снижения селективности композиции.

- В сочетании с различными композиционными добавками патогенность мицелия S.cirsii подтверждена в полевых условиях.

- Максимальное развитие симптомов поражения бодяка (до 95%) достигнуто при использовании глубинного мицелия в смеси с сублетальной (пониженной в 4 раза) дозой гербицида Лонтрел Гранд.

На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что мицелий целомицета Stagonospora cirsii J.J. Davis может служить основой микогербицида для борьбы с бодяком полевым (Cirsium arvense).

Практические рекомендации

- Для многих фитопатогенных грибов (например, из родов Alternaria, Ascochyta, Sclerotinia и другие), не образующих конидий без облучения УФ или в глубинной культуре, в качестве инфекционного материала при разработке микогербицидов может быть рекомендован мицелий, как это было показано на примере S. cirsii.

- Для получения в лабораторных условиях патогенного и жизнеспособного мицелиального инокулюма S. cirsii предложены основные параметры твердофазного и жидкофазного глубинного культивирования. Одним из критических факторов является возраст мицелия, на что следует обращать особенное внимание при использовании мицелия фитопатогенных грибов в качестве инфекционного материала.

- Дневная температура, при обработке растений бодяка композициями на основе мицелиального инокулюма S. cirsii, должна быть не ниже 20°С (оптимум 24°С).

- При подборе композиционных добавок для повышения эффективности микогербицидов на основе мицелия следует обращать внимание на то, что они могут изменить специализацию патогена.

- В качестве добавки к мицелиальному инокулюму S. cirsii рекомендуется использовать ксантан (0.05%) и глицерин (0.2%).

3D

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Берестецкий А.О. Получение и хранение биопестицидов на основе микромицетов / А.О. Берестецкий, С.В. Сокорнова // Микология и фитопатология. - 2009. - Т. 43, № 6. - С. 473-489.

2. Берестецкий А.О. Проблемы получения и хранения микогербицидов / А.О. Берестецкий, С.В. Сокорнова // Иммунопатология, аллергология, ин-фектология. -2009. - №2, Т.2. - С. 163.

3. Берестецкий А.О. Фитотоксичность эмульсионных препаратов потенциального микогербицида на основе мицелия гриба Stagonospora cirsii / А.О. Берестецкий, С.В. Сокорнова, О.В. Кунгурцева, О.С. Юзихин, A.C. Каткова, А. Авилкин, A.A. Добродумов // Современная микология в России. - М.: Национальная академия микологии, 2008. - Т. 2: Тезисы докладов Н Съезда микологов России. - С. 166.

4. Berestetskiy А.О. Can mycelial inoculum be an alternative to conidia in the case of Stagonospora cirsii J.J. Davis, a potential biocontrol agent of Cirsium arvense? / A.O. Berestetskiy, O.V. Kungurtseva, S.V. Sokornova // Current status and future prospects in bioherbicide research and product development: Joint Workshop International Bioherbicide Group and EWRS-Biocontrol Working Group; Bari, Italy, 19 June, 2005. - 2005. - URL: http://ibg.ba.cnr.it/Newsletter/VII_IBG_EWRS_Workshop_Bari2005.pdf. - P. 7.

5. Kungurtseva O.V. Host range of the bioherbicidal fungus, Stagonospora cirsii and its formulations / O.V. Kungurtseva, S.V. Sokornova, A.O. Berestetskiy // International Conference; Development of Environmentally Friendly Plant Protection; Pühajärve. Estonia. 5.-7.09.2006. - Tartu: Eesti Taimekaitse Selts, 2006. - P. 33.

6. Sokornova S.V. Production of virulent mycelial inoculum of Stagonospora cirsii Davis by liquid state fermentation / S.V. Sokornova, A.O. Berestetskiy // XV Congress of European mycologists. SPb, Russia, September 16-21, 2007. Abstracts. - SPb: TREEART LLC. 2007. - P. 204-205.

Научное тлание. RIZO-псчатт. ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ Лннетня ПЛД № 69-253. 11одпиеано к печати 18 мая 2011 г.. тир. 100 жз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сокорнова, Софья Валерьевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Бодяк полевой как объект исследования.

1.2. Современные способы борьбы с бодяком полевым.

1.3. Методология создания микопестицидов.

1.4. Потенциальные микогербициды для борьбы с бодяком полевым.

1.5. Токсины грибов-патогенов бодяка полевого.

1.6. Способы и условия культивирования продуцентов микогербицидов.

1.7. Препаративные формы микогербицидов.

1.8. Повышение эффективности микогербицидов в полевых условиях.

Глава 2. Объекты и методы исследований.

2.1. Stagonospora с1гзИ.

2.2. Бодяк полевой.

2.3. Культурные растения.

2.4. Подготовка конидиального инокулюма.

2.5. Подготовка мицелиального инокулюма.

2.5.1 Твердый субстрат.

2.5.2 Жидкая питательная среда.

2.6. Стабилизация мицелия 8.Ыгбп.

2.7. Приготовление композиций.

2.7.1 Композиции на основе конидий «У.сггаг.

2.7.2 Композиции на основе мицелия 5\cirsii.

2.8. Инокуляция листовых высечек.

2.9. Инокуляция растений в контролируемых условиях.

2.10. Учет развития болезни.

2.11. Световая и электронная сканирующая микроскопия.

2.12. Выделение фитотоксинов и оценка фитотоксической активности.

2.13. Оценка патогенности мицелия Б.сггзп в полевых условиях.

2.14. Статистическая обработка экспериментальных данных.

Глава 3. Патогенные свойства мицелия З.тгБп.

3.1. Влияние температуры и периода увлажнения листьев на патогенные свойства мицелия & Ыгбп.

3.2. Развитие инфекционных структур гриба б'.сггаи.

3.2.1 Инокуляция листьев бодяка полевого конидиями З.ЫгбН.

3.2.2 Инокуляция листьев бодяка полевого мицелием Б-Ыгви.

3.2.3 Сравнение динамики развития инфекционных структур при заражении конидиями и фрагментами мицелия З.Ыгзи.

3.3. Определение специализации Б.Ыгзи.

3.4. Роль токсинов при инокуляции бодяка полевого мицелием Б.сжп

3.5. Обсуждение результатов.

Глава 4. Способы получения мицелия £с/т7.

4.1. Оптимизация твердофазной ферментации по выходу мицелия и патогенности в отношении бодяка полевого.

4.2. Оптимизация жидкофазной ферментации по выходу мицелия и патогенности в отношении бодяка полевого.

4.2.1 Выбор источника углерода.

4.2.2 Выбор источника азота.

4.2.3 Оценка устойчивости мицелия к сушке.

4.2.4 Выбор длительности культивирования Б.Ыгзп.

4.2.5 Выбор концентраций источников углерода и азота.

4.3. Стабилизация мицелия S.cirsii.

4.3.1 Стабилизация мицелия S.cirsii, полученного при помощи твердофазной ферментации.

4.3.2 Стабилизация мицелия S.cirsii, полученного при помощи жидкофазной ферментации.

4.4. Обсуждение результатов.

Глава 5. Композиции на основе мицелия S.cirsii.

5.1. Добавки к композициям на основе мицелия S.cirsii, полученного при помощи твердофазной ферментации.

5.2. Добавки к композициям на основе мицелия S.cirsii, полученного при помощи жидкофазной ферментации.

5.3. Влияние композиционных добавок на морфологию и развитие инфекционных структур S.cirsii.

5.3.1 Кукурузное масло.

5.3.2 Ксантан с глицерином.

5.4. Обсуждение результатов.

Глава 6. Применение композиций на основе мицелия. S.cirsii в полевых условиях.

6.1. Композиции на основе мицелия S.cirsii, полученного при помощи твердофазной ферментации.

6.2. Композиции на основе мицелия S.cirsii, полученного при помощи жидкофазной ферментации.

6.3. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическое обоснование создания микогербицида на основе фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii"

Бодяк полевой (Asteraceae: Cirsium arvense L. Scop.) - многолетнее сорное растение, хорошо размножающееся семенами и вегетативным путем. Механические способы борьбы с бодяком трудоемки и малоэффективны. Применение большинства химических гербицидов ограничено невысокой избирательностью их действия и значительными- нормами расхода (Государственный каталог., 2010; Белан и др., 2001; Спиридонов и др., 2006). Для снижения химической нагрузки на экосистему применяют биологические средства защиты. Например, в Канаде и США для борьбы с бодяком применяют насекомых-фитофагов (Moore, 1975; Peschken et al., 1982). Для подавления трудноискоренимых и доминирующих видов сорняков также предложено использовать микогербициды (TeBeest, 1996; Гасич, Берестецкий, 2007). К их достоинствам относят высокую специфичность, длительное последействие, а также возможность использования совместно с некоторыми фитофагами (Kruess, 2002) и химическими препаратами в сублетальной дозе (Gressel et al., 1997). Несмотря на то, что поиск и первичная оценка патогенов бодяка ведется давно, микогербицидов, разрешенных к применению для борьбы с этим сорным растением, в настоящее время не имеется. Таким образом; актуальность данной работы обусловлена, ограниченным выбором эффективных и экологически безопасных биологических средств борьбы с бодяком полевым.

Stagonospora cirsii J.J. Davis (анаморфная, стадия гриба Didymella sp., Pleosporales, Ascomycota) — возбудитель пятнистости листьев бодяка полевого с узкой специализацией, преимущественно поражающий растения семейства Asteraceae (Kungurtseva et al., 2006). Благодаря высокой агрессивности в отношении бодяка этот фитопатоген рассматривается как потенциальный микогербицид. Однако для успешного заражения конидиями этого гриба требуется длительный период повышенного увлажнения листьев и высокая температура воздуха. Конидии S.cirsii образует только при периодическом облучении в УФ диапазоне (Berestetskiy et al., 2005), что значительно усложняет их получение. В тоже время, успех разработки и реализации микогербицида во многом определяется наличием простой технологии производства инфекционного материала, обладающего высокой жизнеспособностью и патогенностью, а также устойчивостью к неблагоприятным факторам (Jackson, 1997). Поэтому в работе рассматривалась возможность использования мицелия S.cirsii в качестве инфекционной основы микогербицида для биологической борьбы с бодяком.

Цель работы - обосновать возможность создания микогербицида на основе мицелия фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii.

Задачи исследования:

1. определить патогенные свойства мицелия S. cirsii;

2. разработать способы получения- вирулентного мицелия S.cirsii при помощи твердофазной и жидкофазной ферментации;

3. оценить возможность стабилизации и хранения мицелия S.cirsii;

4. подобрать композиционные добавки, повышающие патогенность мицелия S.cirsii, и оценить селективность наиболее эффективных композиций;

5. оценить в полевых условиях,патогенность мицелия S.cirsii в отношении бодяка полевого.

Научная новизна данной работы состоит в том, что впервые доказана способность фрагментов мицелия пикнидиального гриба S.cirsii заражать бодяк полевой в контролируемых и полевых условиях. Выявлены особенности процесса инфицирования бодяка различными типами инокулюма (конидии и фрагменты мицелия) S.cirsii. Показана временная динамика развития инфекционных структур гриба на поверхности листьев растения-хозяина. Выявлены места проникновения инфекционных гиф в ткань листа. Тип действия композиций на основе фрагментов мицелия S.cirsii определен, как инфекционный. Установлено, что композиционные добавки (кукурузное масло, глицерин с ксантаном) могут влиять на место и интенсивность проникновения инфекционных структур в ткань листьев бодяка полевого и некоторых культурных растений.

Практическая значимость работы заключается в том, что определены оптимальные параметры твердофазной и жидкофазной глубинной ферментации (продолжительность ферментации, влажность зернового субстрата, природа и концентрация источника азота для жидкой среды и т.д.) для получения мицелия S.cirsii, обладающего высокой агрессивностью в отношении бодяка полевого. В качестве способа стабилизации мицелия S.cirsii, полученного на зерновом субстрате (пшено) и на жидкой сахарозо-соевой среде, предложена сушка проточным воздухом. На основе фрагментов мицелия S.cirsii разработаны композиции, применение которых в контролируемых лабораторных и полевых условиях приводит к существенному поражению наземной части растений бодяка, определена селективность этих композиций.

Основные результаты исследований были представлены на 13 Симпозиуме EWRS (Италия, Бари, 2005), на Международной конференции "Development of Environmentally Friendly Plant Protection" (Pühajärve, Эстония, 2006), Школе НАТО для молодых ученых (NATO Advanced Institute) «Novel biotechnologies for biocontrol agent enhancement and management» (Gualdo Tadina, Италия, 2006), XV Конгрессе микологов Европы (Санкт-Петербург, 2007), Втором Съезде микологов России (Москва, 2008) и Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009).

Работа выполнена при финансовой поддержке Шестой рамочной программы Европейского союза (проект № FOOD-CT-2003-001687 "Enhancement and Exploitation of soil Biocontrol Agent for Bio-Constraint Management in Crops", 2004-2006 гг.), МНТЦ (проект № 2939 "Development of Biological Preparation Based on Natural Microorganisms Strains for Control of

Perennial Weeds", 2005-2008 гг.), грантов Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической деятельности: 2009 г., проект «Изучение инфекционного процесса при заражении бодяка полевого фитопатогенным грибом Stagonospora cirsii»; 2010 г., проект «Разработка новых подходов для получения и хранения экологически безопасного микогербицида на основе фитопатогена Stagonospora cirsii для борьбы с бодяком полевым».

Заключение Диссертация по теме "Микология", Сокорнова, Софья Валерьевна

Выводы

• Для искусственного заражения бодяка полевого мицелием &с/т7 оптимальными являются температура 24°С, период повышенного увлажнения листьев 24 ч, а также концентрация около 9,6x104 КОЕ/г для мицелия, полученного с помощью твердофазной ферментации, и около 5х104 КОЕ/г для мицелия, полученного с помощью жидкофазной ферментации.

• Тип действия мицелия З.Ыгяи определен, как инфекционный, так как токсины в процессе инфицирования бодяка полевого 3-х суточным мицелием не участвуют. Независимо от типа инокулюма проникновение гиф гриба в ткани листьев бодяка отмечено на границах эпидермальных клеток листьев.

• Вирулентный мицелий ¿>. с/гаи может быть получен с помощью как твердофазной, так и жидкофазной ферментации.

• Оптимальными по патогенным свойствам и выходу мицелия ^.с/гаи являются следующие параметры твердофазной ферментации: влажность пшена 35%, время культивирования 10 суток.

• Оптимальными по патогенным свойствам и выходу мицелия 5". с/га и являются следующие параметры жидкофазной ферментации: сахароза как источник углерода в концентрации 40 г/л, соевая мука как источник азота в концентрации 15 г/л, продолжительность ферментации 3 суток.

• Мицелиальный инокулюм может быть стабилизирован высушиванием. Неизмельченный мицелий, полученный на зерновом субстрате, хранится 3 месяца при 24°С без потерь своих свойств. Мицелий, полученный на жидкой питательной среде, не теряет в процессе сушки с аэросилом патогенность и жизнеспособность, и выдерживает краткосрочное хранение в течение 2 недель.

• Патогенные свойства мицелия S.cirsii могут быть улучшены композиционными добавками, стимулирующими процесс проникновения гиф в листовые ткани. Добавка ксантана (0,05%) с глицерином (0,2%) повышает эффективность глубинного мицелия в 4 раза без снижения селективности композиции.

• В сочетании с различными композиционными добавками патогенность мицелия S.cirsii подтверждена в полевых условиях.

• Максимальное развитие симптомов поражения бодяка (до 95%) достигнуто при использовании глубинного мицелия в смеси с сублетальной (пониженной в 4 раза) дозой гербицида Лонтрел Гранд.

На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что мицелий целомицета Stagonospora cirsii J J. Davis может служить основой микогербицида для борьбы с бодяком полевым (Cirsium arvense).

Практические рекомендации

1. Для многих фитопатогенных грибов (например, из родов Alternaria, Ascochyta, Sclerotinia и другие), не образующих конидий без облучения УФ или в глубинной культуре, в качестве инфекционного материала при разработке микогербицидов может быть рекомендован мицелий, как это было показано на примере S.cirsii.

2. Для получения в лабораторных условиях патогенного и жизнеспособного мицелиального инокулюма S. cirsii предложены основные параметры твердофазного и жидкофазного глубинного культивирования. Одним из критических факторов является возраст мицелия, на что следует обращать особенное внимание при использовании мицелия фитопатогенных грибов в качестве инфекционного материала.

3. Дневная температура, при обработке растений бодяка композициями на основе мицелиального инокулюма S. cirsii, должна быть не ниже 20°С (оптимум 24°С).

4. При подборе композиционных добавок для повышения эффективности микогербицидов на основе мицелия следует обращать внимание на то, что они могут изменить специализацию патогена.

5. В качестве добавки к мицелиальному инокулюму S. cirsii рекомендуется использовать ксантан (0.05%) и глицерин (0.2%).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сокорнова, Софья Валерьевна, Санкт-Петербург

1. Артохин К.С. Атлас сорных растений / К.С. Артохин. Ростов на Дону: Книга, 2004. - 144 с.

2. Барыкина Р.П. Справочник по ботанической микротехнике (основы и методы) / Р.П. Барыкина, Т.Д. Веселова, А.Г. Девятов, Х.Х. Джалилова, Г.М. Ильина, Н.В. Чубатова. — М.: Изд. Московского университета, 2004.-311 с.

3. Бекер М. Е. Введение в биотехнологию / М. Е. Бекер. — Рига: Наука, 1974.-232 с.

4. Бекер М. Е. Обезвоживание микробной биомассы / М. Е. Бекер. Рига: Зинатне, 1967. — 361 с.

5. Белан С. Р. Новые пестициды: Справочник / С. Р. Белан, А. Ф. Грапов, Г. М. Мельникова; ВНИИ хим. средств защиты растений (ВНИИ ХСЗР). — М.: ИД Грааль, 2001.-196 с.

6. Берестецкий А.О. Микобиота бодяка полевого и родственных ему видов на территории европейской части России / А.О. Берестецкий // Микология и фитопатология. 1997. - Т. 31, № 4. - С. 39-45.

7. Берестецкий О. А. Микробные фитотоксины — модели для синтеза новых гербицидов / O.A. Берестецкий, A.B. Боровков // Труды ГНУ ВНИИСХМ. Л:, 1985. - Т. 55: Микробиологические способы повышения эффективности сельскохозяйственного производства. - С. 5-Ю;

8. Берестецкий А.О. Получение и хранение биопестицидов на основе микромицетов / А.О. Берестецкий, C.B. Сокорнова // Микология и фитопатология. 2009. - Т. 43, № 6. - С. 473-489

9. Берестецкий А.О. Фитотоксины грибов: от фундаментальных исследований — к практическому использованию (Обзор) / А.О. Берестецкий // Прикладная биохимия и микробиология. — 2008. Т. 44, №5.-С. 501-514.

10. Гасич EJL, Берестецкий А.О. Влияние долговременного хранения на стабильность штаммов микромицетов, перспективных для биологической борьбы с Cirsium arvense / Е.Л. Гасич, А.О. Берестецкий // Микология и фитопатология. 2007. - Т.41, № 4. - С. 342-347.

11. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации / Минсельхоз России. — По состоянию на 11 марта 2010 г. — М., 2010. 801 с.

12. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. М.: Агропромиздат, 1985. — 352 с.

13. Дьяков Ю.Т. Общая и молекулярная фитопатология: учеб. пособие / Ю.Т. Дьяков, О.Л. Озерецковская, В.Г. Джавахия, С.Ф. Багирова. М.: Общество фитопатологов, 2001. — 301 с.

14. Дьяков Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов / Ю.Т. Дьяков. М.: Муравей, 1998. - 377 с.

15. Методы экспериментальной микологии. Справочник / ред. В.И. Билай. — Киев: Наукова Думка, 1982. 550 с.

16. Павлов С.И. Стратегия и1 механизмы питания личинок листоедов-щитоносок {Coleóptera, Chrysomelidae, Cassidinaé) / С.И. Павлов // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. 2006. - №7(47). — С. 143147.

17. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики: пер. с анг. / Дж. Поллард. М.: Финансы и статистика, 1982. - 344 с.

18. Семыкина А.Г. Некоторые биологические особенности осота розового и меры борьбы с ним / А.Г. Семыкина // Сб. науч. работ Курганского СХИ.-Курган, 1967.-Вып. 10.

19. Соколова Т.Д. Динамика сообщества сорных растений в посеве ячменя под влиянием длительного применения гербицида Ларен / Т.Д. Соколова, H.H. Лунева // Вестник защиты растений. 2009. - № 3. - С. 64-66.

20. Спиридонов Ю.А. Как ослабить остаточное действие сульфонилмочевинных гербицидов / Ю.А. Спиридонов, В.Г. Шестаков, Г.Е. Ларина, Г.С. Спиридонова // Защита и карантин растений. 2006. — №2.-С. 59-61.

21. Тюрин Ю.Н. Статистический анализ данных на компьютере / Ю.Н. Тюрин, A.A. Макаров. М.: ИНФА-М, 1998. - 528 с.

22. Ульянова Т.И. Сорные растения во флоре России и других стран СНГ / Т.И. Ульянова. СПб: ВИР, 1998. - 344 с.

23. Фишер P.A. Статистические методы для исследователей: пер. с анг. / P.A. Фишер. М.: Госстатиздат, 1958. — 267 с.

24. Хохряков М.К. Методические указания по экспериментальному изучению фитопатогенных грибов / М.К. Хохряков. Л.: ВИЗР, 1974. -69 с.

25. Черепанов С. К. Сосудистые растения СССР / С. К. Черепанов. Л.: Наука, 1981.-510 с.

26. Abbas H.K. Influence of unrefined corn oil and surface-active agents on the germination and infectivity of Alternaría helianthi / H.K. Abbas, G.H. Egley // Biocontrol Sci. Technol. 1996. - Vol. 6, Iss. 4. - P. 531-538.

27. Abbas H.K. Solid substrate formulations of the mycoherbicide Colletotrichum truncatum for Hemp Sesbania {Sesbania exaltata) Control / H.K. Abbas, C.D. Boyette // Biocontrol Sci. Technol. 2000. - Vol.10, Iss. 3. - P. 291-300

28. Akutsu K. Role of conidial fusion in infection by Botrytis cinerea on cucumber leaves / K. Akutsu, K. Ko, T. Misato // Ann. Phytopathol. Soc., Japan.-1981.-Vol. 47, Iss. l.-P. 15-23.

29. Amsellem Z. Abolition of selectivity of the mycoherbicidal organisms and' enhanced' virulence of avirulent fungi by an invert emulsion / Z. Amsellem, A. Sharon, J. Gressel // Phytopathology. 1991. - Vol. 81, Iss. 9. - P. 985988.

30. Amsellem; Z. Long-term dry preservation of viable mycelia of two mycoherbicidal organisms / Z. Amsellem, N. K. Zidack, P. C. Quimby Jr. Sharon, J. Gressel // Crop Protection. 1999. - Vol.18, Iss. 10. - P. 643-649.

31. Auld B.A. Emerging technologies in plant protection — bioherbicides / B.A. Auld, C. McRae // Proc. N.Z. Plant Protection Conf. 1997. - Vol. 50. -P. 191-194.

32. Bailey K.L. An organic option for broadleaved weed control in cereals using a microbial bioherbicide: Interim report to OSMDI, Canadian Wheat Board / K.L. Bailey; AAFC Saskatoon Research Centre. 2009. - 7 p.

33. Bailey B.A. Influence of adjuvants on disease development by Pleospora papaveracea on opium poppy {Papaver somniferum) / B.A. Bailey, N.R. O'Neill, J.D. Anderson // Weed Sci. 2004. - Vol. 52, No. 3. - P; 424-432.

34. Barlett M.C. Mass production of entomogenous fungi for biological control of insects / M.C. Barlett, S.T. Jaronski // Fungi in biological control systems / ed. M.N. Burge. NY: Manchester University Press, 1988. - P. 61-88.

35. Bithell S.L. Evaluation of the pathogenicity of Phoma exigua var. exigua on Californian thistle / S.L. Bithell, A. Stewart // N. Z. Plant Protection. 2001. -Vol. 54.-P. 179-183.

36. Boerema G.H. Phoma identification manual: differentiation of specific and infra-specific taxa in culture / G.H. Boerema, J J de Gruyter, M.E. Noordeloos, M.E.C. Hamers. CABI Publishing, 2004. - 448 p.

37. Bourdöt G.W. Demographic and biomass consequences of inundative treatment of Cirsium arvense with Sclerotinia sclerotiorum / G.W. Bourdöt, I.C. Hervey, G.A. Hurrel, D.J. Saville // Biocontrol Sei. Technol. 1995. -Vol. 5, Iss. l.-P. 11-25.

38. Bourdöt G.W. Impacts of applied Sclerotinia sclerotiorum on the dynamics of a Cirsium arvense population / Bourdöt G.W., Hurrell G.A., Saville D.J., Leathwick D.M. // Weed Research. 2006. - Vol. 46, Iss. l.-P. 61-72.

39. Boyette C.D. Interaction of a bioherbicide and glyphosate for controlling hemp sesbania in glyphosate-resistant soybean /C.D. Boyette, R.E. Hoagland, M.A. Weaver // Weed Biology and Management 2008. - Vol. 8. - P. 18-24.

40. Brosten B.S. Field trials of Sclerotinia sclerotiorum to control Canada* thistle (Cirsium arvense) / B.S. Brosten, D.C. Sands // Weed Sei. 1986. - Vol. 34, No. 3.-P. 377-380;

41. Cimmino A. Production of Phytotoxins by Phoma exigua var. exigua, potential mycogerbicide against perennial thistles / A. Cimmino, A. Andolfi, A. Berestetskiy, A. Evidente // J. Agric. Food Chem. 2008. - Vol. 56, Iss. 15.-P. 6304-6309.

42. Connick W.J. Formulation of mycoherbicides using a pasta-like process / W.J. Connick, C.D. Boyette, J.R. McAlpine // Biological Control. — 1991. — Vol. l,Iss. 4.-P. 281-287

43. Daigle D.J. Formulating atoxigenic Aspergillus flavus for field release / D. J. Daigle, P. J. Cotty // Biocontrol Sei. Technol. 1995. - Vol. 5, Iss. 2. -P. 175-184.

44. Daigle D.J. Invert emulsions: carrier and water source for the mycoherbicide, Alternaria cassia / D.J. Daigle, W.J. Connick, P.C. Quimby, J. Evans, B. Trask-Morrell, F.E. Fulgham // Weed Technol. 1990. - Vol. 4, No. 2. - P. 327-331.

45. Daigle D. J. Production of conidia of Alternaria cassiae with alginate pellets / D. J. Daigle, P. J. Cotty // Biological Control. 1992. - Vol. 2, Iss. 4. - P. 278-281.

46. Egley G.H. Water corn oil emulsion enhances conidia germination and mycoherbicidal activity of Colletotrichum truncatum /G.H. Egley, C.D. Boyette //Weed Sci. 1995. - Vol. 43. - P. 312-317.

47. Evidente A. Stagonolides B. — F, a potential mycoherbicide of Cirsium arvense / A. Evidente, A. Cimmino, A. Berestetskiy, G. Mitina, A. Andolfi, A. Motta // J. Nat. Prod. 2008. - Vol.71, Iss. 1. - P. 31-34.

48. Frantzen J. The role of clonal growth in the pathosystem Cirsium arvense — Puccinia punctiformis / Frantzen J. I I Can. J. Bot. — 1994. — Vol. 72, No. 6. — P: 832-836.

49. Gasich E.L. Evaluation of the fungus Ascochyta sonchi for biological control of Cirsium arvense and Sonchus arvensis / E.L. Gasich, L.B. Khlopunova, M.M. Levitin // Proc. 14th EWRS Symposium; Hamar, Norway; 17-21 June, 2007.-2007.-P. 29.

50. Greaves M.P. A proposed mode of action of oil-based formulations of a microbial herbicide / M.P. Greaves, R.J. Pring, J. Lawrie // Biocontrol Sci. Technol. 2001. - Vol. 11, Iss. 2. - P. 273-281.

51. Greaves M. P. Formulations of microbial herbicides / M. P. Greaves, L. Dutton, J. Lawrie // Asp. Appl. Biol. 2000. - No. 57. - P. 171-178.

52. Green S. Effects of leaf maturity, infection site, and application rate of Alternaría cirsinoxia conidia on infection of Canada Thistle (Cirsium arvense) / S. Green, K. L. Bailey // Biological Control. 2000. - Vol. 19, Iss. 2.-P. 167-174.

53. Green S. Influence of Moisture and Temperature on Infection of Canada Thistle by Alternaría cirsinoxia / S. Green, K. L. Bailey // Plant Disease. — 2000.-Vol. 84, No. 10.-P. 1126-1132.

54. Gressel J. Herbicides as Synergists for Mycoherbicides, and Vice Versa / J. Gressel // Weed Sci. Vol. 58, Iss. 3. - 2010. - P. 324-328.

55. Guske S. Biocontrol options for Cirsium arvense with indigenous fungal pathogens / Guske S., Schulz B., Boyle C. // Weed Research. 2004. - Vol. 44, Iss. 2.-P. 107-116.

56. Hamdoun A. M. Regenerative capacity of plants of Cirsium arvense / Hamdoun A. M. // Weed Research. 1972. - Vol. 12, Iss. 2. - P. 128-136.

57. Hershenhorn J. Septoria cirsii a potential biocontrol agent of Canada thistle and its Phytotoxins /?-nitropropionic acid / J. Hershenhorn, M. Vurro, M. C. Zonno, A. Stierle, G. Strobel // Plant Sei. - 1993. - Plant Sei. - Vol. 94, Iss. 1-2.-P. 227-234.

58. Hölker U. Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi / Hölker U., Höfer M., Lenz J. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. - Vol. 64, No. 2. - P. 175-186.

59. Höhl B. Histology of disease development in resistant and susceptible cultivars of chickpea (Cicer arietinum L.) inoculated with spores of Ascochyta rabiei. / B. Höhl, M. Pfautsch, W. Barz // J. Phytopath. 1990. -Vol. 129, No. 1.-P. 31-45.

60. Jackson M.A. Liquid culture production of microsclerotia of Colletotrichum truncatum for use as bioherbicidal propagules / M.A. Jackson, D.A. Schisler // Mycol. Res. 1995. - Vol. 99, Iss 7. - P. 879-884.

61. Jackson M.A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents / M.A. Jackson // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 1997. - Vol. 19, No. 3. - P. 180-187.

62. Kluth S. Effects of two pathogens on the performance of Cirsium arvense in a successional fallow / S. Kluth, A. Kruess, T. Tscharntke // Weed Research. — 2005. Vol. 45, Iss. 4. - P. 261-269.

63. Kluth S. Insects as vectors of plant pathogens: mutualistic and antagonistic interactions / S. Kluth, A. Kruess, T. Tscharntke // Oecologia. — 2002. — Vol. 133,No. 2.-P. 193-199.

64. Kropp B. R. The effect of surfactants and some herbicides on teliospore viability in Puccinia thlaspeos (Schub.) / Kropp, B. R., H. Darrow // Crop Protection. 2006. - Vol. 25, Iss. 4. - P. 369-374.

65. Kruess A. Indirect interaction between a fungal plant pathogen and a herbivorous beetle of the weed Cirsium arvense / A. Kruess // Oecologia. — 2002. Vol. 130, No. 4. - P. 563-569.

66. Leathers T.D. Mycopesticides: status, challenges and potential / T.D. Leathers, S.C. Gupta, N.J. Alexander // J. Ind. Microbiol. 1993. - Vol. 12, No: 2, P. 69-75.

67. Leth, V. Phomopsis cirsii: a potential biocontrol agent of Cirsium arvense / V. Leth, J. Netland, C. Andreasen // Weed Research. 2008. - Vol. 48, Iss. 6. -P. 533-541.

68. Mahuku G.S. Influence of sucrose, mucin and xanthan gum on spore germination often different fungi / G.S. Mahuku; P.H. Gudwin // Eur. J. Plant Pathol. 1998. - Vol. 104, No. 8. - P. 849-852.

69. Montesinos E. Development, registration and commercialization of microbial pesticides for plant protection / E. Montesinos // International Microbiology. -2003. Vol. 6, No. 4. - P. 245-252.

70. Moore, R. J. The biology of Canadian weeds.:13. Cirsium arvense (L.) Scop. / R. J. Moore // Can. J. Plant Sci. 1975. - Vol. 55, No. 4. - P. 1033-1048.

71. Onions A.H.S. Preservation of fungi / A.H.S. Onions // The filamentous fungi. Vol. IV. Fungal technology. / eds. J.E. Smith, D.R. Berry, B. Kristiansen. -L.: Edward Arnold, 1983. P. 373-389.

72. Pat. 4753670 (US), Int. CI.4 A01N 63/04. Herbicide / V. Leth; Novo Industry A/S (Denmark). 647609; Filed Sep 6, 1984; Date of Pat. Jun 26, 1988; Foreign Priority Sep 7, 1983, 4059/83 (Denmark). - 8 p.

73. Pat. 5074902 (US), Int. CI.5 AO IN 63/04. Granular products containing fungi encapsulated in a wheat gluten matrix for biological control of weeds / W.J. Connick, C.D. Boyette. 560791; Filed Jun 30, 1990; Date of Pat. Dec 24, 1991.-5 p.

74. Pat. US 2003/01039944 Al, Int. CI.7 A01N 63/00. Sprayable formulations of mycelium-based biological control agents produced by solid* state fermentation / W. Hintz: 10/286884; Filed Nov 4, 2002; Pub. Date Jun 5, 2003. - 7 p.

75. Raimbault M. General and microbiological aspects of solid substrate fermentation / M. Raimbault // Electronic Journal of Biotechnology. — 1998. — Vol. 1, No.3. URL: http://eib.ucv.cl/content/vol 1 /issue3/full/9/index.html

76. Rosskopf E.N. Influence of epidemiological factors on the bioherbicidal efficacy of Phomopsis amaranthicola on Amaranthus spp. / E.N. Rosskopf, C.B. Yandoc, R. Charudattan, J.T. De Valerio // Plant Dis. 2005. - Vol. 89, No. 12.-P. 1295-1300.

77. Schisler D.A. Germination of soil-incorporated microsclerotia of Colletotrichum truncatum and colonization of seedlings of the weed Sesbania exaltata / D.A.Schisler, M.A. Jackson // Can. J. Microbiol. 1996. — Vol. 42, No. 10. — P. 1032-1038.

78. Shabana Y.M. An evaluation of hydrophilic polymers for formulating the bioherbicide agents Alternaría cassiae and A. eichhorniae / Y.M. Shabana, R. Charudattan, J.T. Devalerio, M.A. Elwakil // Weed Technol. 1997. - Vol. 11, No. 2.-P. 212-220.

79. Shabana Y.M. The use of oil emulsions for improving efficacy of Alternaría eichhorniae as a mycoherbicide for waterhyacinth (.Eichhornia crassipes) / Y.M. Shabana//Biological Control. 2005. - Vol. 32, Iss. 1. - P. 78-89.

80. Silman R.W. Comparison of culture methods for production of Colletotrichum truncatum spores for use as a mycoherbicide / R.W. Silman, T.C. Nelsen, R.J. Bothast // FEMS Microbiology Letters. 1991. - Vol. 79, Iss. l.-P. 69-74.

81. Singh J. Effect of temperature and storage time on shelf life of mycoherbicidal products of Colletotrichum dematium / J. Singh, A.K. Pandey // American Journal of Agricultural and Biological Sciences. 2010. - Vol. 5, Iss. 3.-P. 315-320.

82. Winder R.S. Evaluation of Colletotrichum sp. and Fusarium spp. as potential biological control agents for marsh reed grass (Calamagrostis canadensis) / R.S. Winder// Can. J. Plant Pathol. 1999. - Vol. 21, Iss.l. - P. 8-15.

83. Winder R.S. Microencapsulation: a strategy for formulation of inoculum / R.S. Winder, J.J. Wheeler, N. Conder, I.S. Otvos, R. Nevill, L. Duan // Biocontrol Sci. Technol. 2003. - Vol. 13, Iss. 2. - P. 155-169.

84. Womack J.G. A vegetable oil-based invert emulsion for mycoherbicide delivery / J.G. Womack, G.M; Eccleston, M.N. Burge // Biological control. -1996. Vol» 6, Iss. 1. - P. 23-28.

85. Womack J.G. Mycoherbicide formulation and' the potential for bracken control / J.G. Womack, M.N. Burge // Pestic. Sci. 1993. - Vol. 37, Iss. 4. -P. 337-341.

86. Yuzikhin O. Herbicidal potential of stagonolide, a new phytotoxic nonenolide from Stagonospora cirsii / O. Yuzikhin, G. Mitina, A. Berestetskiy // J. Agric. Food Chem. 2007. - Vol. 55, Iss. 19.-P. 7707-7711.