Индукция дифференцировки клеток нейробластомы N1E-115 неспецифическими факторами культуральных сред

Мякишева, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Индукция дифференцировки клеток нейробластомы N1E-115 неспецифическими факторами культуральных сред
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Индукция дифференцировки клеток нейробластомы N1E-115 неспецифическими факторами культуральных сред"

На правах рукописи

Мякишева Светлана Николаевна

ИНДУКЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК НЕЙРОБЛАСТОМЫ ШЕ-115 НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕД

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00316340Т

Пущино - 2007

003163407

Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН г Пущино Московской обл

Научные руководители доктор биологических наук

|Костенко Марина Александровна!

доктор физико-математических наук Асланиди Константин Борисович

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович

кандидат биологических наук Межевикина Людмила Михайловна

Ведущая организация. НИИ физико-химической биологии им А Н

Белозерского, МГУ им М В Ломоносова

Защита состоится «23 » января 2008 г в « 15 ч 30 мин » ва заседании совета Д 002 093 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, д 3, ИТЭЬ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г Пущино

Автореферат разослан «_» декабря 2007 года

Ученый секретарь совета Д 002 093 01

к ф-м н НФ Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Клеточные механизмы морфогенеза, регенерации и канцерогенеза волнуют исследователей уже более 100 лет Однако, только в последние десятилетия многочисленные исследования позволили поставить на повестку дня проблемы переключения генетических программ пролиферации, дифференцировки и апоптоза (Giorgio et al, 2007. Levin, 2007)

Для решения этих задач несомненный интерес вызывает культура клеток нейробластомы Нейробластома представляет собой удобный и распространенный объект как для онкологов, так и нейробиологов (Prasad, 1991) по следующим причинам

• Нейробластома является типичным представителем эмбриональных злокачественных опухолей нервной системы, однако, она способна к спонтанной регрессии,

• Нейробластома способна при определенных условиях следовать программе дифференцировки нейрона, демонстрирует синтез нейромедиаторов и специфических ферментов, наличие электрической и химической возбудимости поверхностной мембраны (Amano et al, 1972), однако, дифференцировка может быгь обратимой

Известно, что переход клеток нейробластомы от пролиферации к дифференцировке и обратно может совершаться под воздействием множества неспецифических индукторов (Prasad, 1975, Kruman et al, 1993, Fern an des et al, 2007)

При этом существует корреляция между уровнем мембранных потенциалов, зарегистрированных у различных видов клеток, и их способностью к пролиферации (Bmggell and Weinstein, 1986) Пролиферируют эмбриональные, недифференцированные и опухолевые клетки Все эти клетки обладают низким мембранным потенциалом По мере дифференцировки пролиферирующие клетки как in vivo, так и гп vitro гииерполяризуются (Trachtenberg et al, 1972) Предполагается важная роль мембранного потенциала и потоков неорганических ионов в переключении основных режимов функционирования клетки, таких как пролиферация, дифференцировка и программируемая гибель (Levm, 2003) В других исследованиях выявлена важная роль перекиси водорода и окиси азота в процессах контроля роста и морфогенеза (Giorgio et al, 2007) Перекись водорода функционирует как сигнальная молекула, вовлеченная в энергетический обмен и ответы на стресс или сигналы роста

В последние десятилетия интенсивно изучались взаимоотношение между пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом в развивающейся нервной системе Программируемая гибель нейронов наблюдалась не только в клеточной культуре, но и при многочисленных патологиях и старении (Giorgio et al, 2007). Однако механизм нейрональной гибели все еще не ясен

Поиски универсальных механизмов, осуществляющих разнообразные переключения клеточных программ, также к успеху не привет и

Для решения фундаментальной проблемы дифференцировки нервной ткани, также как и для последующей реализации онкологических задач, необходимо выявить роль отдельных компонентов сложных культуральных сред в процессах переключения генетических программ клетки в условиях, неблагоприятных для пролиферации Остается неясно, в какой степени дифференцировка клеток в неблагоприятных для пролиферации условиях предшествует гибели клеток и соответственно может рассматриваться адаптационным механизмом

Цель и задачи исследования Целью работы является сравнительное исследование кинетики дифференцировки и гибели клеток нейробластомы в условиях неблагоприятных для пролиферации т \itro Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Исследовать влияние неблагоприятных для пролиферации значений рН среды на кинетику дифференцировки и гибели клеток

2 Исследовать влияние неблагоприятных для пролиферации концентраций ионов Иа+, К+ и Са2+ культуральных сред на кинетику дифференцировки и гибели клеток

3 Исследовать кинетику дифференцировки и гибели клеток в гипо- и гиперосмотических средах, неблагоприятных для пролиферации

4 Исследовать влияние углеводов, аминокислот и витаминов на кинетику дифференцировки и гибели клеток нейробластомы в бессывороточных средах

5 Исследовать возможность дифференцировки клеток нейробластомы под действием фармакологических препаратов, способных вызвать клеточныую гибель

6 Исследовать обратимость дифференцировки клеток нейробластомы, вызванной неблагоприятными для роста факторами культуральной среды

На\чная новизна

1 Минимальная скорость дифференцировки и максимальная скорость последующей гибели дифференцированных клеток регистрировались при рН 7,5

2 Времена дифференцировки и гибели дифференцированных клеток коррелировали с содержанием ионов и осмотичностью для всех сред, кроме среды с высоким содержанием аминокислот

3 Скорости дифференцировки клеток нейробластомы в зависимости от содержания аминокислот и углеводов в среде имели выраженный минимум, однако, времена гибели клеток были прямо пропорциональны содержанию метаболитов

4 Зависимость времени гибели клеток от времени дифференцировки имела максимум в диапазоне 15 - 20 часов

Практическая ценность.

1 Установлены количественные параметры компонентов питательных сред, оптимизирующих дифференцировку клеток нейробластомы

2 Установлены количественные значения компонентов сред, способствующих длительному выживанию дифференцированных клеток

3 Предложены пути оптимизации культуральных сред которые в будущем могут быть использованы для коррекции опухолевого микроокружения т vivo

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований «Управление дифференциацией нейрона внутриклеточные и экстраклеточные механизмы» (проект № 96-04-50431) и «Хемотропизм v аутокринная регуляция их роль в образовании межнейронных связей и формировании нейрональных сетей» (проект № 99-04-49248)

4пробация работы Основные материалы исследований докладывались на 5-й (Москва, 1997) и 8-й (Казань, 2006) Восгочно-Европейских конференциях Международного общества нейробиологов «Simple nervous systems", И Съезде биофизиков России (Москва, 1999), XVI рабочем совещании «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 2000), XVIII Съезде физиологов России (Казань, 2001), научной конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001), на конкурсе ежегодных научных работ ИБК РАН (Пущино, 2001), IV и VI Международных конференциях по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2002, 2006), IX международной школе конференции молодых ученых (Пущино, 2005)

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 31 работа, из них 12 статей в отечественной и зарубежной печати, 18 тезисов и 1 авторское свидетельство

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и

списка используемой литературы Работа изложена на _ страницах, материал

иллюстрирован _ рисунками и _ таблицами Библиография включает _

ссылок

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования.

Исследования проводились на клетках нейробластомы N1E-115 (клон С-1300) мыши и первичной культуре нейронов моллюсков Lymnaea stagnahs Клетки нейробластомы культивировали в среде DMEM (Sigma, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Flow Laboratories, Великобритания) при 37°С [11, 14] Плотность посева в стандартных пластиковых флаконах составляла 1х104 клеток на см2 Через 1 сутки первичную среду меняли на среду, индуцирующую дифференцировку

Нейроны моллюсков Lymnaea stagnalis выделяли по методике Костенко (1970 - 1980) и культивировали на среде №11 [10, 13, 16,26,29]

Степень морфологической дифференцировки как для клеток нейробластомы, так и для нейронов моллюсков Lymnaea stagnahs определяли как долю клеток, образующих отростки, длина которых более чем в 2 раза превышала диаметр сомы клетки

В качестве критериев, характеризующих процесс морфологической дифференцировки, нами были выбраны

1 Время воздействия, за которое доля дифференцированных клеток достигает 70±10% (далее - время дифференцировки),

2 Время воздействия, за которое гибель клеток достигает 85±10% (далее - время гибели),

3 Время воздействия, за которое наступает необратимая дифференцировка 85±10% клеток,

4 Время удовлетворительного переживания культур в необратимо дифференцированном состоянии

В качестве индукторов дифференцировки использовались среды, отличающиеся по составу от основной ростовой среды № 2, характеризующейся значениями компонентов, оптимальными для роста и пролиферации

Для проведения электронно-микроскопических исследований применяли методику, подробно описанную ранее Поповым и др (1996) [11]

Электрофизиологические исследования проводили в режиме фиксации мембранного потенциала на бислойных липидных мембранах (БЛМ) методом, детально описанным ранее Фомкинойидр (2001) [20]

Таблица 1

Основные параметры используемых сред

№№ Основной компонент, £ [т, х,], мосмоль/л рН [Na'j, шМ [Са2+], тМ Аминокислоты и витамины, тМ Углеводы тМ

1* Среда Г)МЕМ +10% сыворотки, 377 мосмоль/л 8,2 185 4,3 11,2 6,6

2** Среда ВМЕМ +10% сыворотки, 350 мосмоль/л 7,5 160 1,8 11,2 6,6

3 Среда 1ЖЕМ, 377 мосмоль/л 7,5 185 4,3 11,2 6,6

4 Среда ВМЕМ, 350 мосмоль/л 6,8 160 1,8 11,2 6,6

5 Среда ВМЕМ, 350 мосмоль/л 7,5 160 1,8 11,2 6,6

6 Среда БМЕМ, 350 мосмоль/л 8,2 160 1,8 11,2 6,6

7** Среда Ь- 15, 354 мосмоль/л 7,5 150 1,3 33,6 10

8 Солевой раствор Хенкса, 323 мосмоль/л 6,8 137 1,26 0 5,56

9 Солевой раствор Хенкса, 323 мосмоль/л 7,5 137 1,26 0 5,56

10 Солевой раствор Хенкса, 323 мосмоль/л 8,2 137 1,26 0 5,56

Среда Гелетюка-Костенко, 214 мосмоль/л 7,5 90 2 0,97 11,1

* среда DMEM +10% сыворотки + 25 mM NaCl +2,5 тМ СаС12

**ростовая среда DMEM с 10% сыворотки обычно используется для роста и пролиферации культур клеток самых различных типов (Eagle, 1971, 1977, Оленев, 1976)

***среда Лейбовитца L-15 обычно применяется для культивирования нейронов беспозвоночных (Leibovitz 1963, 1977)

****среда Гелетюка-Костенко была подобрана для роста отростков нейронов моллюска Lymnaea stagnalis (Гелетюк и др, 1971, Костенко и др, 1972)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфологический анализ процессов пролиферации и дифференцнровки.

: -«

_________________...........

Рис. 1. Клетки нейробластомы. А - пролиферируюшая культура. Б, В - дифференцированная культура.

Под действием всех использованных индукторов пролиферирующие клетки нейробластомы NIE-115 претерпевали морфологическую дифференцировку

(рис. 1 .Б), картина которой полностью соответствовала описанной в литературе (Prasad, 1972-1991) и не зависела от природы индуцирующего агента. При длителыюм культивировании в индуцирующих средах дифференцированные клетки гибли по типу апоптоза (Kruman et al, 1993) [11].

После смены индуцирующей среды на ростовую (№ 2) пролиферация обычно отсутствовала, а клетки после пересева округлялись, но быстро восстанавливали мультиполярную форму. Это состояние клеток было названо необратимой морфологической дифференцировкой.

Меняя среду № 2 каждые 4-5 сугок можно было длительно (до 3,5 месяцев) поддерживать жизнеспособность

дифференцированных нейронов.

При длительном культивировании необратимо дифференцированных нейронов (более 3-4 недель) в культурах появлялись очень крупные клетки, около 70 - 100 мкм в диаметре (рис. 1. В). Такие нейроны были единичны. Выяснить их происхождение и экспериментально увеличить количество не удалось [11, 14. 17].

На культуре нейронов моллюсков Ьутпаеа ь1а£,паИа была показана существенная зависимость количества и длины растущих отростков от ряда веществ [10, 26, 29]. В исследованиях на одиночных изолированных нейронах установлено, что нейроны активно формируют отростки и при отсутствии хемоатрактантов и каких-либо клеток-мишеней [13, 16, 19,23].

Рис. 2. Ультраструтсгурная организация отростков клеток нейробластомы ШЕ-115. А - конусы роста; Б - межклеточные контакты 1 - 3 - терминалу образовавшие межклеточные контакты, напоминающие синапсы Мф - микрофиламенты Мт - микротрубочки ПП -пресинаптические пузырьки.

Электронно-микроскопические исследования [11 20], проведенные после 1 месяца культивирования необратимо морфологически дифференцированных нейронов показали высокую степень дифференцировки клеток нейробластомы нормальное развитие нейропиля (рис 2 А) и межклеточных контактов (рис 2 Б) высокий уровень развития беток-синтезирующих структур (рис 2 Б)

Критерием необратимости дифференцировки было отсутствие пролиферации в культурах, содержавших более 80% дифференцированных клеток при культивировании в ростовой среде ffe 2 Время воздействия индуцирующей среды за которое наступала необратимая дифференцировка 80-90% кпеток, составляю 4 + ! сут Необратимой дифференцировки не удалось достичь только при использовании в качестве индуцирующих сред солевого раствора Хенкса (среда № 9) или среды Гелетюка-Костенко (среда № 11) Время выживания в указанных средах было меньше времени (4 + 1 сут), необходимого для получения необратимой дифференцировки [11]

Длительное переживание дифференцированных культур наблюдалось после применения всех исследованных индуцирующих сред Время удовлетворительного переживания клеток в среде № 2 в необратимо дифференцированном состоянии превышало 30 суток и не зависело от индуцирующей среды [11]

2. Влияние рН среды на дифференцировку клеток нейробластомы

Изучение морфологической дифференцировки на кучьтуре клеток нейробластомы проводили в средах с рН 6,8, 7,5 и 8 2 [11, 14] Пролиферирующие клетки выращивали на среде DMEM с 10% сывороткой с рН 7,5 (№ 2) В логарифмической фазе роста (через 1 сутки после пересева) клетки переводили на бессывороточные среды DMEM (№ 4, 5. 6) или Хенкса (К» 8, 9, 10) с различными значениями рН

Как следует из рис 3 А минимальная скорость морфологической дифференцировки клеток наблюдалась при рН 7 5 Изменение рН среды как в кислую (№ 4 № 8), так и в щелочную сторону (№ 6, № 10) увеличивало скорость морфологической дифференцировки При этом в кислой среде адгезия клеток была значительно ниже, чем в [цепочной Максимальная скорость гибели дифференцированных клеток наблюдалась при рН 7 5 (рис 3 Б) Культивирование морфологически дифференцированных кпеток в среде № 2 с регулярной сменой среды каждые 4-5 дней позволяло поддерживать жизнеспособность клеток более 30 суток

В специальных экспериментах проводится посев клеток непосредственно в дифференцирующие среды с разными значениями рН В случае кислой среды (рН 6,8) кпетки практически не прикреплялись к субстрату в то же время такая манипуляция в щелочной среде

(рН 8,2) не выявляла ухудшения адгезии, и при этом морфологическая дифференцировка клеток даже несколько ускорялась. Отмстим, что обязательным условием прохождения клеточного цикла в культуре контактзависимых клеток является прикрепление к субстрату и распластыванне. Этот закономерный процесс наблюдался нами методом профильной съемки на клетках ВНК 21 [1,3].

т о с.

О) I т £5. 1> 4-Г

ш 8-

■в-

•е-£

Рис.

11 б 7

а. са

6 5

75 рН

8,5

6,5

7,5 рН

Л - зависимость времени дифференцировки клеток нейробластомы от рН индуцирующей среды. Б - зависимость времени гибели дифференцированных клеток нейробластомы от рН индуцирующей среды. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред в табл. 1. Темными кружками обозначены модификации среды ОМЕМ, а полыми кружками - модификации раствора Хенкса.

При изменении рН от 6,8 до 8,2 как скорость дифференцировки, так и скорость гибели дифференцированных клеток могли изменяться более чем в 2 раза. Минимальная скорость дифференцировки и максимальная скорость гибели регистрировались при рН 7,5.

3. Влияние ионного состава среды на дифференцировку клеток нейробластомы.

Было исследовано влияние содержания ионов Иа+, К+ и Са +, а также отношения №+/К+ в различных не содержащих сыворотку средах (см. табл.1: № 3, № 5, № 7, № 9, № 11) на времена дифференцировки и времена гибели клеток нейробластомы при рН 7,5.

Все исследованные индуцирующие среды вызывали морфологическую дифференцировку клеток нейробластомы. Время удовлетворительного переживания необратимо дифференцированных культур в среде № 2 превышало 30-45 суток. Исключение составляли нейтральный (рН 7,5) солевой раствор Хенкса (среда № 9) и среда Г'елетюка-Костенко (среда № 11), в которых не удалось получить необратимую дифференцировку. При этом скорости дифференцировки и гибели клеток, дифференцированных в средах № 9, № 11 не выделялись из

общего ряда ¡П, 14].

Время дифференцировки, также как и время гибели клеток нейробластомы было прямо пропорционально содержанию ионов в индуцирующей среде (рис. 4. А, Б) Более того, указанная зависимость практически не нарушалась при изменении рН среды.

А Б

30 -

ш 0 26

X 20 -

а и л к

и ? 15

5. 10 -

§ 5 -

о.

Ш 0

у=0,12?3х -0,1345

=0.7356 1.5

50 100 150

Содержание На, тМ

12 10 8

С £

к 4

£ «

а. ; Ш '

200

у=00423х-1,7935 Я3=0,8998

100 150

Содержание Не, тМ

200

Рис. 4. А - зависимость времени дифференцировки и Б - зависимость времени гибели клеток нейробластомы от содержания ионов в индуцирующей среде при рН 7,5. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред. Полым кружком обозначена среда № 7.

£ 9 и

ь-

° 7 *г

§ 5

ш \

У = 0.250ВХ - 0,1981 0,7518

Рис. 5. Корреляция времени гибели и времени дифференцировки для сред, не содержащих сыворотку, при рН 7,5. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред (№ 3, № 5, № 9, № 11). Среда № 7 обозначена полым кружком.

Время дифференцировки ( час.

Из общего ряда выделялась среда № 7, в которой содержание аминокислот в 3 раза превышало их содержание в средах № 3 и № 5. Таким образом, высокое содержание аминокислот не влияло на скорость дифференцировки, однако, в 2 раза увеличивало время выживания дифференцированных клеток.

Время дифференцировки и время гибели дифференцированных клеток аналогичным образом зависело от соотношения в среде.

Зависимость времени дифференцировки и времени гибели клеток нейробластомы при

изменении содержания Са2' (от 1,26 тМ до 4,3 тМ) или К+(от 5,0 тМ до 5,8 тМ) в различных не содержащих сыворотку средах (№ 3, № 5, № 7, № 9, № 11) с рН 7,5 обнаружить не удалось. Для нейтральных сред с рН 7,5, индуцирующих дифференцировку, время гибели дифференцированных клеток было пропорционально времени дифференцировки [11, 14].

4. Влияние осмотичности среды на дифференцировку клеток нейроблаетомы.

Исследование влияния осмотичности культуральных сред на дифференцировку клеток нейроблаетомы проводили с использованием не содержащих сыворотку индуцирующих сред (№ 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8, № 9, № 10, № 11), различающихся по ионному составу и значениям рН [11, 14].

ш о а

аз

о. о

в) га & 1 •е- -

ф а ш

75 50 25

у = 0.0724Х - 6.6288 № = 0.602

200

300

400

Осмотичностъ среды, мосмоль/л

I 12

ш ю

Б 5 Ф

а. Ш

«11

I I 5 1

• •

200 300 400

Осмотачность среды, мосмоль/л

Рис. 6. А - зависимость времени дифференцировки от осмотичности среды. Б -зависимость времени гибели от осмотичности среды. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред. Гипертоническая среда № 1, содержащая 10% сыворотки, указана полыми кружками.

Как скорость дифференцировки, так и скорость гибели дифференцированных клеток незначительно уменьшались с ростом осмотичности культуральных сред. Гипертоническая среда № 1, содержащая 10% сыворотки, увеличивала время дифференцировки клеток в 3 - 4 раза, но практически не влияла на время гибели дифференцированных клеток.

5. Влияние аминокислот, витаминов и углеводов на дифференцировку клеток нейроблаетомы.

Аминокислоты, витамины и углеводы являются важнейшими компонентами практически всех культуральных сред [10, 13, 11, 14]. Из рис. 7. А видно, что зависимость времени дифференцировки от содержания аминокислот в нейтральных средах (рН 7,5) была

колоколообразной формы.

О 10 20 30 40 Содержание аминокислот, ггй!

0 10 20 30 40 Содержание аминокислот, ггМ

Рис. 7. Влияние аминокислот: А - на время дифференцировки и Б — на время гибели клеток нейробяастомы при рН 7,5. Цифры около экспериментальных тачек соответствуют номерам сред.

у» -1,5223х* + 24,}х -71,579 Я2 « 0,911

5 7 9 11 13

Содержание углеводов. яМ

«Г 8

Ж 4 -

у* 1,0316х -1,8488 0 И2 = 0,9675

5 7 9 11 13 Содержание углеводов, тМ

Рис. 8. Влияние углеводов: А - на время дифферешщровки и Б - на время гибели клеток нейробластомы дня сред с рН 7,5. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред. Полыми кружками выделена среда Гслетюка - Костенко (№ 11).

С ростом содержания аминокислот скорость дифференцировки падала и достигала минимума в диапазоне 15 - 25 шМ Дальнейшее повышение содержания аминокислот приводило к росту скорости дифференцировки Время гибели клеток нейробластомы (рис 7 Б) практически линейно зависето от содержания аминокислот в индуцирующей среде аминокислоты увеличивали выживаемость клеток при длительном культивировании Дальнейшее культивирование клеток дифференцировка которых была индуцирована средой № 7 (особенностью среды № 7 (Ь-15) является высокое содержание аминокисчот - 33,6 шМ) в ростовой среде № 2 позволяло поддерживать жизнеспособность клеток в течение 90 суток, что в 1 5 раза превосходило время переживания клеток индуцируемых средой с более низким содержанием аминокислот (11,2 шМ) [11, 14]

Зависимость времени дифференцировки нейробластомы от содержания углеводов для сред с рН 7,5 имеет максимум (см рис 8) Это означает, что при содержании углеводов в индуцирующей среде 8-9 тМ скорость дифференцировки минимальна Время гибели клеток нейробластомы было прямо пропорционально содержанию углеводов в среде Исключение составляла гипотоническая среда Гелетюка - Костенко, уменьшающая время выживания почти в 5 раз Причиной быстрой гибели дифференцированных клеток в среде № 11 являлось, по-видимому низкое содержание (см рис 4 )

6 Влияние сыворотки на дифференцировку клеток нейробластомы

Важнейшим компонентом сред стимулирующим рост культивируемых клеток является сыворотка [2] Присутствие сыворотки затрудняло дифференцировку клеток нейробластомы [11,15 17,24 25] Спонтанная дифференцировка клеток нейробластомы в среде, содержащей 10% сыворотки (№ 2), не превышала 3 - 5 % [11 14] Более того клетки, дифференцировка которых (70% от общего числа клеток) бьпа индуцирована самыми разными средами (кроме № 9) после возвращения в сред> № 2 дедифференцировались, если время пребывания в индуцирующих средах не превышаю 4 ± 1 с>ток

Эксперименты показали, что в присутствии 10% сыворотки дифференцировка клеток нейробластомы происходила только в гипертонической среде № 1 с рН 8,2 При этом время дифференцировки увеличивалось в 3,5 раза Присутствие сыворотки в среде практически не влияло на скорость гибели дифференцированных клеток

Из рис 9 след>ет, что скорости дифференцировки клеток в средах содержащих сыворотку (№ 1 № 2) значительно ниже чем в простых средах (№ 3, № 4 № 5, № 6) различающихся по рН и осмотичности Более того для бессывороточных модификаций среды ОМЕМ скорость гибели клеток нейробластомы обратно пропорциональна скорости их дифференцировки

0,2

у = -5,8877х +0,4481 5 Я2 = 0,9495

с о ю

0,15

0,1

0,05

0 0,02 0,04 0,06 0,08

1/1 дифференцировки

Рис. 9. Зависимость скорости гибели дифференцированных клеток нейробластомы от скорости дмфференцировки для различных модификаций среды 1)МЬМ Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред. Полыми кружками выделены среды, содержащие сыворотку.

Следует отметить, что сыворотка молодых животных в наших экспериментах обладала более выраженной ростстимулирующей активностью, что, по-видимому, было связано с присутствием в телячьей сыворотке факторов адгезии с молекулярным весом до 100000 дальтон [2].

7. Влияние на дифферент!ровку клеток нейробластомы различных фармакологических препаратов.

Сопоставление защитных и сенсибилизирующих эффектов различных медицинских препаратов на млекопитающих и клеточных моделях выявило высокую корреляцию результатов оценки этими методами [4, 5, 6]. Кроме того, при помощи клеточной модели удавалось обнаружить потенциальные защитные свойства препаратов, маскируемых их токсическим действием на животных. Преимуществом применяемого метода клеточного тестирования препаратов является и быстрая оценка (1-2 сут.) токсических, инертных и стимулирующих концентраций испытуемых фармакологических препаратов [6, 7, 8].

В этой серии экспериментов были исследованы процессы пролиферации и морфологической диффереицировки клеток нейробластомы под действием авермектинов (16-членных макролидов, продуцируемых актиномицетом ЗГгерйтусез ауегппШм) 2-х видов -аверсектина С (АВ) и абамектина (АБ), диметилсульфоксида (ДМСО) и форсколина [21, 30,

40% -

0% -I---1-1-—-—-.---,

АВ АБ ДМСО Форскояин

Рис. 10. Доля дифференцированных клеток, обусловленная применением фармакологических веществ, через 5 суток культивирования.

Показано, что после добавления аверсектина С в концентрации 10"7 - 10"8 М на третьи сутки культивирования происходило появление большого количества клеток с длинными ветвящимися отростками (некоторые клетки были увеличены в диаметре до 70-100 мкм), число которых достигало максимума через 5 дней культивирования. Периодической сменой среды через 3-4 дня удавалось поддерживать клетки в дифференцированном состоянии в течение 3-4 и более недель. Добавление в культуру абамектина в концентрации 10°-10 М не вызывало каких-либо изменений пролиферации клеток. Увеличение же концентрации абамектина до 10"3-10'4М являлось токсичным и приводило к гибели клеток.

Использование в качестве индуктора морфологической дифференцировки ДМСО и форсколина также позволяло получать хорошо дифференцированные длительно живущие нейроны, часть которых имела крупные размеры (70-100 мкм) с сильно развитыми отростками [15. 18. 25]. Криопротекторы. в частности ДМСО. могут оказывать существенное влияние на морфологические [25, 30. 31] и электрические параметры клеток нейробластомы (Сафронова и др., 1992).

На клетках нейробластомы Ы1Е-115 показано не только цитостатическое, но и цитотоксическое действие синюхи голубой Ро\етоп\ит соегикит ¿. [12]. Аналогичные результаты получены по влиянию строфантина О и дигоксина на лимфоидные опухолевые клетки Кар [9]. Более того, концентрации, токсичные для опухолевых клеток, не оказывали влияние на эмбриональные фибробласты человека.

Очевидно, что все вещества в сублетальных концентрациях являются сильными стрессируюшими факторами. Именно эти концентрации всех исследованных веществ, кроме абамектина, вызывали полноценную морфологическую дифференцировку у клеток нейробластомы. Окислительный стресс для исследованных веществ приводил к запуску

механизмов клеточной дифференцировки Более высокие концентрации всех исследованных веществ приводили к апоптозу Возможно, что абамектин тоже вызывает дифференцировку, но только в более узком диапазоне концентраций В этих представлениях дифференцировка является некоторым переходным состоянием от пролиферации к клеточной гибели

7 Определение продуктов метаболизма, обладающих мембранной активностью.

В данной серии экспериментов мы исследовали продукты метаболизма, выделяемые в среду в процессе дифференцировки клеток нейробластомы Было обнаружено, что культуральная среда, омывающая дифференцирующиеся клетки нейробластомы, обладала ярко выраженной мембранной активностью и была способна формировать одиночные катионные каналы в чипидном бислое [20, 22, 23] Среды без клеток или с пролиферирующими клетками таким свойством не обладали Исследования проводили в биионной системе, когда с одной стороны липидного бислоя находились ионы калия, а с другой - ионы натрия в эквимолярных концентрациях Отношение коэффициентов проницаемостей, вычисленное согласно уравнению Гольдмана-Ходжкина-Каца составило Рыа+/Рк+ = 2,18 ± 0,20 Этот результат указывает на сильное деполяризующее влияние дифференцирующего фактора на плазматические мембраны клеток Изучение вольт-амперных характеристик показало, что каналы являются потенциалзависимыми [22,23,27]

В среде с дифференцирующимися клетками методом вБв-электрофореза был вьивлен белковый фактор с молекулярным весом 18+2 Ша Исследования мембранной активности выделенного дифференцирующего фактора являются предметом наших будущих исследований

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнительный анализ морфологии межклеточных взаимодействий выявил большое сходство процессов дифференцировки клеток нейробластомы мыши К1Е-115 клона С-1300 и первичной культуры нейронов моллюска Ьутпаеа зЮёпаЫ [28] Эти исследования позволили сделать вывод об универсальности механизмов регуляции образования и роста нейрональных отростков у разных видов животных Так же как и у нейронов моллюска [Коз1епко е1 а], 1983], морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы активировалась сдвигом рН среды в обе стороны [11] Более того, аналогично обстояло дело и с осмотичностъю среды морфологическую дифференцировку как нейронов моллюсков [Костенко и др , 1978, 1988], так и нейробластомы [11] индуцировали как гипо-, так и гиперосмотические среды

Как известно, из ионных компонентов среды морфологическая дифференцировка наиболее значимо зависит от ионов Ыа+ и отношения Ыа+/К [Костенко и др., 1978, Ко51епко й а1, 1983], что также было показано и для клеток нейробласгомы [11].

Наблюдаемая морфологическая дифференцировка сопровождалась существенными функциональными изменениями. В частности, методом перфорированного "петч-клямпа" удалось зарегистрировать появление быстрых и медленных Са2+ токов у морфологически дифференцированных нервных клеток. У недифференцированных клеток таких токов не наблюдалось [21]. Наши исследования подтвердили результаты, полученные в работах Веселовского и др., 1984; Сафроновой и др., 1992.

Время дифференцировки час.

Рис. 13. Корреляция времен гибели и дифференцировки для различных бессывороточных сред. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред. Полыми кружками обозначены среды, в которых не удалось получить необратимую дифференцировку.

Анализ экспериментальных результатов, представленных на рис. 13, позволяет сделать ряд заключений, которые помогут в будущем конструировать идеальную среду для индукции дифференцировки клеток нейробласгомы:

• Зависимость времени гибели от времени дифференцировки имеет выраженный максимум. Среды, вызывающие дифференцировку через 15 - 20 часов обеспечивали максимальное время переживания дифференцированных клеток (до 10 суток).

• Гибель дифференцированных клеток в средах № 9 и № 11 происходила за время,

недостаточное для получения необратимой дифференцировки (менее 4 суток)

• Малые времена дифференцировки (до 17 часов) были получены в солевых растворах (среды № 8, № 9 № 10) и гипотоническом растворе Гелетюка - Костенко (среда № 11) Для обедненных сред времена гибели дифференцированных клеток были пропорциональны временам дифференцировки

• Большие времена дифференцировки (ог 17 до 25 часов) были получены для различных модификаций культуральной среды ДМЕМ (№ 3, № 4, № 5, № 6) и среды Лейбовяща (№ 7) Для полноценных культуральных сред времена гибели дифференцированных клеток и времена диффеоенцировки находились в обратно пропорциональном отношении Модифицируют ли индуцирующие среды длительность клеточного цикла или меняют

латентный период перехода от пролиферации к дифференцировке, покажут будущие

исследования

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что переход клеток нейробластомы ШЕ-115 в дифференцированное состояние при неблагоприятных для пролиферации низком (6 8) и высоком (8 2) значениях рН культуральной среды сопровождается в последующем клеточной гибелью

2 Показано, что при определенных концентрациях №+ и соотношения ка7к+ в среде можно получить длительно живущие дифференцированные клетки

3 Увеличение осмотичности бессывороточных питательных сред в интервале от 200 до 400 мосмоль/л (физиологическое значение 300-350) увеличивает время дифференцировки и поддержание клеток в дифференцированном состоянии

4 Длительность сохранения жизнеспособности клеток в дифференцированном состоянии, индуцированном отсутствием сыворотки в культуральной среде, увеличивается по мере увеличения концентрации аминокислот в физиологическом диапазоне

5 Установлено, что аверсектин и форсколин в субтоксических концентрациях способны подобно ДМСО вызывать длительно сохраняющуюся дифференцировку клеток нейробластомы

6 Установлено, что дифференцировка неспецифическими факторами культуральных сред, неблагоприятными для пролиферации клеток, может быть обратимой в зависимости от времени воздействия индуцирующего фактора

7 Полученные результаты дают основание рассматривать переход в дифференцированное состояние клеток при неблагоприятных условиях как реакцию адаптации

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 С H Мякишева. Б К Гаврилюк, В А Яшин, В Г Ивков Исследование морфологии клеток ВНК-21 в процессе пролиферации при наблюдении в профиль Всесоюзный симпозиум по биологии клеток в культуре, Ленинград октябрь, 1983

2 Круман И И, Мякишева С H, Гаврилюк Б К Исследование возрастного изменения ростстимулирующего влияния сыворотки на клетки ВНК-21 Цитология, 1984, т26, № 9, с 1043-1047

3 Мякишева С H Морфофизиологические исследования пролиферации клеток ВНК-21 методом профильной съемки 2 Всесоюзное совещание «Культивирование клеток животных и человека», Пущино, 1985

4 Нариманов А А, Кузнецова СМ, Мякишева С H Модифицирующее действие софоры японской и пантокрина при лучевом поражении Радиобиология, вып 2,1990, с 170-174

5 Нариманов А А, Кузнецова С M, Мякишева С H Влияние дигоксина и строфантина Q на радиочувствительность мышей Всесоюзная научная конференция «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии», Москва, ноябрь, 1990

6 Нариманов А А, Мякишева С H Применение лимфоидных клеток для первичной оценки радиозащитных и сенсибилизирующих веществ Всесоюзная научная конференция «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии», Москва, ноябрь, 1990

7 Нариманов А А, Мякишева С H, Кузнецова С M Модифицирующее действие лекарственных растений при лучевом поражении Всесоюзная научная конференция «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии», Москва, ноябрь, 1990

8 Нариманов А А, Мякишева С H. Кузнецова СМ Радиозащигаое действие экстрактов Arhcangehca officinalis Hoffin и Ledum palustre L на мышей Радиобиология, вып 3,1991, 391393

9 Нариманов А А Мякишева С H Способ культивирования клеток животных и человека Заявка на изобретение 30 01 1989 Авторское свидетельство №1688878 8 июля 1991

10 Marina A Kostenko and Svetlana N Mvakisheva. The Role of Chemotaxis in Morphological Differentiation of Mollusc Neurons Comp Biochem Physiol, 1996, v 115A, № 3, p 265-268

11 Костенко M A, Мякишева С H и Попов В И Морфологическая дифференцировка клеток мышиной нейробластомы N1E-115 Морфология,1996, т 110, № 4, с 64-70

12 Нариманов А А, Кублик JIH, Мякишева С H Действие экстракта синюхи голубой Polemonium CoeruleumL на рост трансформированных клеток in vitro Experimental Oncology, 1996, 18,287289

13 Kostenko M A, Mvakisheva S N Does Chemotaxis exclusively control neunte outgrowth in cultured molluscan neurons'' Abstracts of the 5-th East Europen conference «Simple nervous systems», Moscow, 1997, p 35

14 Kostenko MA, Mvakisheva S N. Popov VI Morphological differentiation of N1E-115 mouse neuroblastoma cells Neurosci Behav Physiol, 1997,27(5), pp 516-523

15 Мякишева С H. Костенко M А Влияние дифференцирующих и (или) ростингибирующих агентов на клетки нейробластомы в культуре Цитология, 1999, т 41, № 3/4, с 296

16 Костенко M А, Мякишева С H Механизмы управления дифференциацией нейронов II Съезд биофизиков России, 1999, Москва

17 Мякишева С H, Костенко M А Экстраклеточные и внутриклеточные механизмы регуляции клеточного роста в культуре II Съезд биофизиков России, 1999, Москва

18 Мякишева С H, Костенко M А, Сахарова H Ю , Хохлов А А Культивирование нейробластомы мыши после криоконсервации и перспективы использования ее в изучении процессов дифференцировки нервных клеток XVI рабочее совещание «Консервация генетических ресурсов», 2000, Пущино

19 Мякишева С H, Костенко MA Роль хемотропизма и аутокринной регуляции в образовании межнейронных связей Цитология, 2001, т 43, № 4, с 370

20 Мякишева С H, Костенко M А., Фомкина M Г, Попов В И Некоторые подходы к изучению механизмов нейрональной дифференциации и образования межнейронных связей XVIII Съезд физиологов России, 2001, Казань, с 168-169 (сб тезисов)

21 Мякишева С H, Костенко M А, Дриняев В А., Мосин В А Пролиферация и морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы в культуре под влиянием авермекпшов, Морфология, 2001, т 120, jY» 6, с 24-26

22 Фомкина M Г , Мякишева CH. Амирханов ЗГ, Костенко MA Изучение мембранной акшвносга нового каналоформера, продуцируемого опухолевыми нервными клетками, Конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», 2001, Пущине

23 Мякишева С H, Костенко M А, Фомкина M Г Хемотропизм и аутокринная регуляция их роль в образовании межнейронных связей и формировании нейроналвных сетей Ежегодная научная конференция, 2001, Пущино

24 Мякишева С H, Костенко M А Изучение дафференцировки и регенерации нервных клеток в культуре IV Международная конференция по функциональной нейроморфологяи «Колосовские чтения - 2002», 2002, Санкт-Петербург

25 С H Мякишева. M А Костенко, H Ю Сахарова, А А Хохлов Культивирование нейробластомы мыши после криоконсерваиии и перспективы использования ее в изучении процессов дафференцировки нервных клеток «Биофизика живой клетки», вып Консервация генетических ресурсов, (cam psn ru/library/biophysics/cell6 html - 7k), т 7,2003, с 69-71

26 H А Ивличева, С H Мякишева. ¡МАКостенко| Изучение влияния pH среды на способность формировать отростки нейронами моллюска Lymnaea stagnalisL в культуре in vitro // В сб тезисов IX международной школы конференции молодых ученых, г Пущино, 2005 г, с 116

27 Мякишева С H, ¡Костенко M~Д|, Фомкина M Г Кульгивирование клеток нейробластомы мыши N1E-115 под действием агентов дафференцировки Роль саморегулирующего фактора дифференциации Морфология, 2006, т 129, № 2, с 65

28 С H Мякишева. |М А Костенко! Изучение межклеточных взаимодействий на культуре нейронов моллюска Lymnaea stagnalis и нейробластомы мыши NIE-115 Биофизика живой клетки, вып Консервация генетических ресурсов, (cam psaru/library/biophysics/cell6 html - 7k), 2006, т 8, с 7-II

29 N A Ivlicheva, SN Myakisheva, E N Gakhova. The neunte regeneration and outgrowth in vitro culture before and after cryopreservaüon of isolated brain of snail Lymnaea stagnalis L Dependmg on the medium pH // Simpler Nervous Systems VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, September 13-17 // thesis of lectures, Kazan, 2006, p 34

30 Ивличева H A, Мякишева С H, Гахова Э H Нервная клетка - модель для изучения механизма действия криопротекторов и эффективности криоконсервации Ветеринарная патология, 1,2007 г, с 42-43

31 Мякишева CH. Сахарова НЮ, Ивличева НА Криокоисервация культивируемых клеток нейробластомы мыши N1E-115 Биомедицина, 6,2007 г, с 153-157

Подписано в печать 21 12 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 1073 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мякишева, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нейробластома как модель для изучения механизмов регуляции дифференцировки нервных клеток в культуре

1.1.1. Происхождение и краткая характеристика клеточных линий нейробластом

1.1.2. Получение и характеристика клеточных линий нейробластом

1.2. Дифференцировка нейробластомы в культуре

1.2.1. Экспрессия дифференцировки

1.2.2. Морфологическая дифференцировка

1.2.3. Биохимическая дифференцировка

1.2.4. Электрофизиологическая дифференцировка

1.2.5. Регуляция экспрессии признаков дифференцировки

1.3. Методы экспериментальной регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки в культуре

1.3.1. Неспецифические индукторы клеточной дифференцировки

1.3.2. Ионная регуляция дифференцировки и регенерации клеток

1.3.3. Экспериментальные методы регуляции внутриклеточной концентрации кальция и рН

1.3.4. Ионная регуляция метаболизма и морфологической дифференцировки изолированных нейронов моллюсков

1.3.5. Влияние сывороточных компонентов на пролиферацию и дифференцировку клеток

1.3.6. Морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы, индуцированная диметилсульфоксидом

1.4. Авермектины: их свойства и характеристика

1.5. Хемотропизм и аутокриииая регуляция

1.6. Взаимоотношение между пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом в развивающейся нервной системе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Условия культивирования клеток нейробластомы N1E

2.2. Критерии оценки морфологической дифференцировки клеток нейробластомы методом световой микроскопии

2.3. Условия культивирования нейронов моллюсков

2.4. Критерии оценки морфологической дифференцировки нейронов моллюсков методом световой микроскопии

2.5. Оценка морфологической дифференцировки нейробластомы методом электронной микроскопии

2.6. Электрофизиологические исследования на бислойных липидных мембранах (БЛМ)

2.7. ДСН-электрофорез

2.8. Методы оценки ошибок измерений

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфологический анализ процессов пролиферации и дифференцировки методом световой микроскопии

3.2. Морфологический анализ дифференцировки нейронов моллюска

3.3. Морфологический анализ процессов пролиферации и дифференцировки методом электронной микроскопии

3.4. Анализ необратимой морфологической дифференцировки нейробластомы

3.5. Влияние рН среды на дифференцировку клеток нейробластомы

3.6. Влияние ионного состава среды на дифференцировку клеток нейробластомы

3.7. Влияние осмотичности среды на дифференцировку клеток нейробластомы

3.8. Влияние аминокислот, витаминов и углеводов на дифференцировку клеток нейробластомы.

3.9. Влияние сыворотки на дифференцировку клеток нейробластомы

3.10. Влияние на диффереицировку клеток нейробластомы различных фармакологических препаратов

3.11. Определение продуктов метаболизма, обладающих мембранной активностью

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукция дифференцировки клеток нейробластомы N1E-115 неспецифическими факторами культуральных сред"

Актуальность проблемы.

Клеточные механизмы морфогенеза, регенерации и канцерогенеза волнуют исследователей уже более 100 лет. Однако, только в последние десятилетия многочисленные исследования позволили поставить на повестку дня проблемы переключения генетических программ пролиферации, дифференцировки и апоптоза (Giorgio et al, 2007; Levin, 2007).

Для решения этих задач несомненный интерес вызывает культура клеток нейробластомы. Нейробластома представляет собой удобный и распространенный объект как для онкологов, так и нейробиологов (Prasad, 1991) по следующим причинам:

• Нейробластома является типичным представителем эмбриональных злокачественных опухолей нервной системы, однако она способна к спонтанной регрессии;

• Нейробластома способна при определенных условиях следовать программе дифференцировки нейрона, демонстрирует синтез нейромедиаторов и специфических ферментов, наличие электрической и химической возбудимости поверхностной мембраны (Amano et al, 1972), однако дифференцировка может быть обратимой.

При этом существует корреляция между уровнем мембранных потенциалов, зарегистрированных у различных видов клеток, и их способностью к пролиферации (Binggeli and Weinstein, 1986). Пролиферируют эмбриональные, недифференцированные и опухолевые клетки. Все эти клетки обладают низким мембранным потенциалом. По мере дифференцировки пролиферирующие клетки как in vivo, так и in vitro гиперполяризуются (Trachtenberg et al, 1972, 2002). Предполагается важная роль мембранного потенциала и потоков неорганических ионов в переключении основных режимов функционирования клетки, таких как пролиферация, дифференцировка и программируемая гибель (Levin, 2003). В других исследованиях выявлена важная роль перекиси водорода и окиси азота в процессах контроля роста и морфогенеза (Giorgio et al, 2007). Перекись водорода функционирует как сигнальная молекула, вовлеченная в энергетический обмен и ответы на стресс или сигналы роста.

В последние десятилетия интенсивно изучались взаимоотношение между пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом в развивающейся нервной системе. Программируемая гибель нейронов наблюдалась не только в клеточной культуре, но и при многочисленных патологиях и старении (Giorgio et al, 2007). Однако механизм нейрональной гибели все еще не ясен.

Поиски универсальных механизмов, осуществляющих разнообразные переключения клеточных программ, также к успеху не привели.

Для решения фундаментальной проблемы дифференцировки нервной ткани, также как и для последующей реализации онкологических задач, необходимо выявить роль отдельных компонентов сложных культуральных сред в процессах переключения генетических программ клетки в условиях, неблагоприятных для пролиферации. Остается неясно, в какой степени дифференцировка клеток в неблагоприятных для пролиферации условиях предшествует гибели клеток и соответственно может рассматриваться адаптационным механизмом.

Цель и задачи исследования. Целью работы является сравнительное исследование кинетики дифференцировки и гибели клеток нейробластомы в условиях неблагоприятных для пролиферации in vitro. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние неблагоприятных для пролиферации значений рН среды на кинетику дифференцировки и гибели клеток.

2. Исследовать влияние неблагоприятных для пролиферации концентраций ионов Na+, К+ и Са2+ культуральных сред на кинетику дифференцировки и гибели клеток.

3. Исследовать кинетику дифференцировки и гибели клеток в гипо- и гиперосмотических средах, неблагоприятных для пролиферации.

4. Исследовать влияние углеводов, аминокислот и витаминов на кинетику дифференцировки и гибели клеток нейробластомы в бессывороточных средах.

5. Исследовать возможность дифференцировки клеток нейробластомы под действием фармакологических препаратов, способных вызвать клеточныую гибель.

6. Исследовать обратимость дифференцировки клеток нейробластомы, вызванной неблагоприятными для роста факторами культуральной среды.

Научная новизна.

1. Минимальная скорость дифференцировки и максимальная скорость последующей гибели дифференцированных клеток регистрировались при рН 7,5.

2. Времена дифференцировки и гибели дифференцированных клеток коррелировали с содержанием ионов Na+ и осмотичностью для всех сред, кроме среды с высоким содержанием аминокислот.

3. Скорости дифференцировки клеток нейробластомы в зависимости от содержания аминокислот и углеводов в среде имели выраженный минимум, однако времена гибели клеток были прямо пропорциональны содержанию метаболитов.

4. Зависимость времени гибели клеток от времени дифференцировки имела

• максимум в диапазоне 15-20 часов.

Практическая ценность.

1. Установлены количественные параметры компонентов питательных сред, оптимизирующих дифференцировку клеток нейробластомы.

2. Установлены количественные значения компонентов сред, способствующих длительному выживанию дифференцированных клеток.

3. Предложены пути оптимизации культуральных сред, которые в будущем могут быть использованы для коррекции опухолевого микроокружения in vivo.

Апробация работы. Основные материалы исследований докладывались на 5-й (Москва, 1997) и 8-й (Казань, 2006) Восточно-Европейских конференциях Международного общества нейробиологов «Simple nervous systems", II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), XVI рабочем совещании «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 2000), XVIII Съезде физиологов России (Казань, 2001), научной конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2001), .на конкурсе ежегодных научных работ ИБК РАН (Пущино, 2001), IV и VI Международных конференциях по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2002, 2006), IX международной школе конференции молодых ученых (Пущино, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 работа, из них 12 статей в отечественной и зарубежной печати, 18 тезисов и 1 авторское свидетельство.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка работ, опубликованных по теме диссертации и списка использованной литературы. Работа изложена на 115 страницах, материал

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мякишева, Светлана Николаевна

выводы

1. Установлено, что переход клеток нейробластомы N1E-115 в дифференцированное состояние при низком (6.8) и высоком (8.2) значениях рН в бессывороточной культуральной среде ускоряется и сопровождается в последующем замедлением клеточной гибели.

2. Показано, что при определенных концентрациях Na+ и соотношения Na+/K+ в среде можно получить длительно живущие дифференцированные клетки.

3. Изменение осмотичности бессывороточных культуральных сред в интервале от 200 до 400 мосмоль/л (физиологическое значение 300-350) увеличивает время дифференцировки и поддержание клеток в дифференцированном состоянии.

4. Длительность сохранения жизнеспособности клеток в дифференцированном состоянии, индуцированном отсутствием сыворотки в культуральной среде, увеличивается по мере увеличения концентрации аминокислот в физиологическом диапазоне.

5. Установлено, что аверсектин и форсколин в субтоксических концентрациях способны подобно ДМСО вызывать длительно сохраняющуюся дифференцировку клеток нейробластомы.

6. Установлено, что дифференцировка неспецифическими факторами культуральных сред, неблагоприятными для пролиферации клеток, может быть обратимой в зависимости от времени воздействия индуцирующего фактора.

7. Полученные результаты дают основание рассматривать переход в дифференцированное состояние клеток при неблагоприятных условиях как реакцию адаптации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.Н. Мякишева, Б.К. Гаврилюк, В.А. Яшин, В.Г. Ивков. Исследование морфологии клеток ВНК-21 в процессе пролиферации при наблюдении в профиль. Всесоюзный симпозиум по биологии клеток в культуре, Ленинград, октябрь, 1983.

2. Круман И.И., Мякишева С.Н., Гаврилюк Б.К. Исследование возрастного изменения ростстимулирующего влияния сыворотки на клетки ВНК-21. Цитология, 1984, т.26, № 9, с. 1043-1047.

3. Мякишева С.Н. Морфофизиологические исследования пролиферации клеток ВНК-21 методом профильной съемки. 2 Всесоюзное совещание «Культивирование клеток животных и человека», Пущино, 1985.

4. Нариманов А.А., Кузнецова С.М., Мякишева С.Н. Модифицирующее действие софоры японской и пантокрина при лучевом поражении. Радиобиология, вып.2,1990, с.170-174.

5. Нариманов А.А., Кузнецова С.М., Мякишева С.Н. Влияние дигоксина и строфантина Q на радиочувствительность мышей. Всесоюзная научная конференция «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии», Москва, ноябрь, 1990.

6. Нариманов А.А., Мякишева С.Н. Применение лимфоидных клеток для первичной оценки радиозащитных и сенсибилизирующих веществ. Всесоюзная научная конференция «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии», Москва, ноябрь, 1990.

7. Нариманов А.А., Мякишева С.Н., Кузнецова С.М. Модифицирующее действие лекарственных растений при лучевом поражении. Всесоюзная научная конференция «Актуальные проблемы лекарственной токсикологии», Москва, ноябрь, 1990.

8. Нариманов А.А., Мякишева С.Н., Кузнецова С.М. Радиозащитное действие экстрактов Arhcangelica officinalis Hoffm. и Ledum palustre L. на мышей. Радиобиология, вып.3,1991,391-393.

9. Нариманов А.А., Мякишева С.Н. Способ культивирования клеток животных и человека. Заявка на изобретение 30.01.1989. Авторское свидетельство №1688878 8 июля 1991.

10.Marina A. Kostenko and Svetlana N. Myakisheva. The Role of Chemotaxis in Morphological Differentiation of Mollusc Neurons. Сотр. Biochem. Physiol., 1996, v. 115A, № 3, p.265-268.

11.Костенко M.A., Мякишева С.Н. и Попов В.И. Морфологическая дифференцировка клеток мышиной нейробластомы N1E-115. Морфология, 1996, т.110, № 4, с.64-70.

12.Narimanov A.A., L.N. Kublik, S.N. Myakisheva. Influence of cyanosis bluue Polemonium Coeruleum L on the growth of transformed cells in vitro. Experimental Oncology, 1996, 18, 287-289.

13.Kostenko M.A., Myakisheva S.N. Does Chemotaxis exclusively control neurite outgrowth in cultured molluscan neurons? Abstracts of the 5-th East Europen conference «Simple nervous systems», Moscow, 1997, p.35.

H.Kostenko M.A., Myakisheva S.N., Popov V.I. Morphological differentiation of N1E-115 mouse neuroblastoma cells. Neurosci. Behav. Physiol., 1997, 27 (5), p.p. 516-523.

15.Мякишева C.H., Костенко M. А. Влияние дифференцирующих и (или) ростингибирующих агентов на клетки нейробластомы в культуре. Цитология, 1999, т.41, № 3/4, с.296.

16.Костенко М.А., Мякишева С.Н. Механизмы управления дифференциацией нейронов. II Съезд биофизиков России, 1999, Москва.

17-Мякишева С.Н., Костенко М.А. Экстраклеточные и внутриклеточные механизмы регуляции клеточного роста в культуре. II Съезд биофизиков России, 1999, Москва.

18. Мякишева С.Н.,, Костенко М.А., Сахарова Н.Ю.; Хохлов А.А. Культивирование нейробластомы мыши после криоконсервации и перспективы использования ее в изучении процессов дифференцировки нервных клеток. XVI рабочее совещание «Консервация генетических ресурсов», 2000, Пущино.

19.Мякишева С.Н., Костенко М.А. Роль хемотропизма и аутокринной регуляции в образовании межнейронных связей. Цитология, 2001, т.43, № 4, с.370.

20.Мякишева С.Н., Костенко М.А., Фомкина М.Г., Попов В.И. Некоторые подходы к изучению механизмов нейрональной дифференциации и образования межнейронных связей. XVIII Съезд физиологов России, 2001, Казань, с.168-169 (сб.тезисов).

21.Мякишева С.Н., Костенко М.А., Дриняев В.А., Мосин В.А. Пролиферация и морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы в культуре под влиянием авермектинов, Морфология, 2001, т. 120, № б, с.24-26.

22. Фомкина М.Г., Мякишева С.Н., Амирханов З.Г., Костенко М.А. Изучение мембранной активности нового каналоформера, продуцируемого опухолевыми нервными клетками, Конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям», 2001, Пущино.

23.Мякишева С.Н., Костенко М.А., Фомкина М.Г. Хемотропизм и аутокринная регуляция: их роль в образовании межнейронных связей и формировании нейрональных сетей. Ежегодная научная конференция, 2001, Пущино.

24.Мякишева С.Н., Костенко М.А Изучение дифференцировки и регенерации нервных клеток в культуре. IV Международная конференция по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2002», 2002, Санкт-Петербург.

25.С.Н.Мякишева, М.А.Костенко, Н.Ю.Сахарова, А.А.Хохлов. Культивирование нейробластомы мыши после криоконсервации и перспективы использования ее в изучении процессов дифференцировки нервных клеток. «Биофизика живой клетки», вып. Консервация генетических ресурсов, (cam.psn.ru/library/biophysics/cell6.html - 7к), т.7, 2003, с.69-71.

26.Н.А.Ивличева, С.Н.Мякишева, М.А.Костенко|. Изучение влияния рН среды на способность формировать отростки нейронами моллюска Lymnaea stagnalisL. в культуре in vitro // В сб. тезисов IX международной школы конференции молодых ученых, г. Пущино, 2005 г., с.116.

27.Мякишева С.Н., [Костенко М.А|., Фомкина М.Г. Культивирование клеток нейробластомы мыши N1E-115 под действием агентов дифференцировки. Роль саморегулирующего фактора дифференциации. Морфология, 2006, т. 129, № 2, с.65.

28.С.Н.Мякишева, [М.А.Костенкд. Изучение межклеточных взаимодействий на культуре нейронов моллюска Lymnaea stagnalis и нейробластомы мыши N1E-115. Биофизика живой клетки, вып. Консервация генетических ресурсов, (cam.psn.ru/library/biophysics/cell6.html - 7к), 2006, т. 8, с.7-11.

29.N.A. Ivlicheva, S.N. Myakisheva, E.N. Gakhova. The neurite regeneration and outgrowth in vitro culture before and after cryopreservation of isolated brain of snail Lymnaea stagnalis L. Depending on the medium pH. // Simpler Nervous Systems: VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, September 13-17 // thesis of lectures, Kazan, 2006, p.34.

30.Ивличева H.A., Мякишева C.H., Гахова Э.Н. Нервная клетка - модель для изучения механизма действия криопротекторов и эффективности криоконсервации. Ветеринарная патология, 1,2007 г., с.42-43.

31.Мякишева С.Н., Сахарова Н.Ю., Ивличева Н.А. Криоконсервация культивируемых клеток нейробластомы мыши N1E-115. Биомедицина, 6, 2007 г., с.153-157.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сравнительный анализ морфологии межклеточных взаимодействий выявил большое сходство процессов дифференцировки клеток нейробластомы мыши N1E-115 клона С-1300 и первичной культуры нейронов моллюска Lymnaea stagnalis (Костенко и др., 1996, 1997; Мякишева и др., 2006). Эти исследования позволили сделать вывод об универсальности механизмов регуляции образования и роста нейрональных отростков у разных видов животных. Так же как и у нейронов моллюска (Kostenko et al, 1983), морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы активировалась сдвигом рН среды в обе стороны [11]. Более того, аналогично обстояло дело и с осмотичностью среды: морфологическую дифференцировку как нейронов моллюсков (Костенко и др., 1978, 1988), так и нейробластомы [11] индуцировали как гипо-, так и гиперосмотические среды.

Как известно, из ионных компонентов среды морфологическая дифференцировка наиболее значимо зависит от ионов Na+ и отношения Na+/K+ (Костенко и др., 1978, Kostenko et al, 1983), что также было показано и для клеток нейробластомы [11].

Наблюдаемая морфологическая дифференцировка сопровождалась существенными функциональными изменениями. В частности, методом перфорированного "петч-клямпа" удалось зарегистрировать появление быстрых и медленных Са токов у морфологически дифференцированных нервных клеток. У недифференцированных клеток таких токов не наблюдалось [21]. Наши исследования подтвердили результаты, полученные в работах Веселовского и др., 1984; Сафроновой и др., 1992.

Анализ экспериментальных результатов, представленных на рис. 23, позволяет сделать ряд заключений, которые помогут в будущем конструировать идеальную среду для индукции дифференцировки клеток нейробластомы:

10 15 20 25

Время дифференцировки t, час.

Рис. 23. Корреляция времен гибели и дифференцировки для различных бессывороточных сред. Цифры около экспериментальных точек соответствуют номерам сред. Полыми кружками обозначены среды, в которых не удалось получить необратимую дифференцировку.

• Гибель дифференцированных клеток в средах № 9 и № 11 происходила за время, недостаточное для получения необратимой дифференцировки (менее 4 суток).

• Малые времена дифференцировки (до 17 часов) были получены в солевых растворах (среды № 8, № 9, № 10) и гипотоническом растворе Гелетюка -Костенко (среда № 11). Для обедненных сред времена гибели дифференцированных клеток были пропорциональны временам дифференцировки.

• Большие времена дифференцировки (от 17 до 25 часов) были получены для различных модификаций культуральной среды ДМЕМ (№ 3, № 4, № 5, № 6) и среды Лейбовитца (№ 7). Для полноценных культуральных сред времена гибели дифференцированных клеток и времена дифференцировки находились в обратно пропорциональном отношении. Модифицируют ли индуцирующие среды длительность клеточного цикла или меняют латентный период перехода от пролиферации к дифференцировке, покажут будущие исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мякишева, Светлана Николаевна, Пущино

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М., 1983, 263 с.

2. Альберте Б., Д Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон. Молекулярная биология клетки. Пер. с англ., 2-е изд., М, Мир, 1994, т. 1, 517с.

3. Антонов В. Ф. Цитология, 1974,16, И, 1327.

4. Архипов В.В., Костенко М.А. Подвижность и взаимодействие изолированных нейронов моллюсков в культуре. Ж. Эвол. Биохим. Физиол., 1981, т. 17, №2, 187-190.

5. Бейли Н. Статические методы в биологии. Пер. с англ., М, Мир, 1963, 271 с.

6. Бершадский А.Д., Гелынтейн В.И. Закономерности агрегации клеток на поверхности фиксированного клеточного монослоя. Онтогенез, 1973, т. 4, № 5, с. 472-480.

7. Божкова В. П., Чайлахян Л. М. В кн.: Внешняя среда и развивающийся организм. М, 1977,210.

8. Буровина И. В., Пивовароьа Н. Б., Скульский И. А. Цитология, 1978,20, 10, 1151.

9. Васильев Ю.М., Гельфанд И.М. Взаимодействие нормальных и неопластических клеток со средой. М., 1981, 220 с.

10. Васильев Ю.М., Маленков А.Г. Клеточная поверхность и реакции клетки. М., «Медицина», 1968,261 с.

11. Вепринцев Б.Н., Гелетюк В.И., Костенко М.А. Культивирование нервных тканей моллюсков Lymnaea stagnalis и Helixpomatia. В кн.: «Руководство по культивированию нервной ткани». М., «Наука», 1976, с. 190-209.

12. Веселовский Н.С., П.Г. Костюк, О.А. Крышталь, А.П. Наумов, В.И. Пидопличко. Трансмембранные ионные токи в клетках нейробластомы. Нейрофизиология, 1977, т. 9, № 6, с. 641-643.

13. Витакер А. Среды для культивирования клеток млекопитающих. Новые методы культуры животных тканей. М., 1976, с. 7-36.

14. Вядро М.М., Навашин С.М. Новые противоопухолевые антибиотики. Новые аналоги, модификаторы биологических реакций, ингибиторы онкогенов. Антибиотики и химиотерапия. М.: Медицина, 1991, т.З6, N 2, с.44-48.

15. Гаврилов В. И. Перевиваемые клетки в вирусологии. М.: Медицина, 1964.268 с.

16. Гайнутдинов М. X., Евтодиенко Ю. В. В сб.: Биологические мембраны в норме и патологии. М., 1972,21.

17. Гахова Э.Н., Дмитриева Е.В. Криоконсервация нервной ткани. Биофизика живой клетки, 2003, Т. 7, с. 65-68.

18. Гелетюк В.И., Орлова А.А., Вепринцев Б.Н. Электрическая активность нейронов изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis при переживании в течение двух месяцев в различных питательных средах. ВИНИТИ, 2899-71,-1971.

19. Голубев Д.Б., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. JL, 1976, 222 с.

20. Дриняев В.А., Кругляк Е.Б., Мосин В.А. Аверсектин С: физико-химические и биологические свойства. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, т. 35, № 2, с. 206-212.

21. Дьяконов Л.П., Поздняков А.А., Панков Г.Е. и др. Методические указания по криоконсервированию культур клеток животного происхождения в жидком азоте. М., 1978, 9 с.

22. Кафиани К. А., Маленков А. Г. 1976. Успехи соврем, биол., 81,3,445.

23. Костенко М.А. Выделение одиночных нервных клеток из мозга моллюска Lymnaea stagnalis для дальнейшего культивирования их in vitro. Цитология, 1972, т. 14, № ю, с. 1274-1278.

24. Костенко М. А., Мусиенко В. С, Смолихина Т. И. Цитология, 1979а, 21, 11,1319.

25. Костенко М.А. Ионная регуляция дифференцировки и регенерации нейронов в культуре. Успехи современной биологии, 1980, т. 5, с. 221234.

26. Костенко М.А., Лермонтова Н.Н. Культивирование нервной ткани и клеток беспозвоночных. В кн.: «Руководство по культивированию нервной ткани», М., Наука, 1988, с. 233-242.

27. Костенко М. А., Третьяк Н. Н. 1978а. Цитология, 20, 7, 791.—19786. Там же, 20, 10,1126.

28. Круман И.И., Остапенко Н.Ф., Гаврилюк Б.К., Марченко Л.Л. О присутствии предполагаемых ростовых факторов во фракции сыворотки с молекулярным весом компонентов от 100 000 до 200 000 дальтон. Цитология, 1982, т. 24, № 3, с. 345-348.

29. Маленков А. Г. Ионный гомеостаз и автономное поведение опухоли. М., «Наука», 1976, 168 с.

30. Мэзия Д. Митоз и физиология клеточного деления. М., «Иностр. лит», 1963,490 с.

31. Насонов Д.А., Александров В. Я. Реакция живого вещества на внешние воздействия. М — Л, Изд. АН СССР, 1940.

32. Никольский Н.Н., Бахтин Ю.Б., Игнатова Т.Н. и др. Биология клетки в культуре. Л., «Наука», 1984,280 с.

33. Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. В кн.: «Итоги науки и техники». Сер. Вирусология. М., 1979, т. 8, с. 3-134.

34. Оленев С.Н. Среды для культивирования. В кн.: «Руководство по культивированию нервной ткани». М., 1976, с. 47-88.

35. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Л., 1988, 320 с.

36. Пирузян Л.А., В.И. Ковалёв, Э.Ф. Лаврецкая, М.А. Ландау, Р.Е. Либинзон, А.Г. Маленков и др. Действие физиологически активных соединений на биологические мембраны. М., «Наука», 1974, 388 с.

37. Погорелая Н.Х., Фомина А.Ф., Веселовский Н.С., Морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы, индуцированная диметилсульфоксидом. Нейрофизиология, 1984, т. 16, № 4, с. 519-527.

38. Пол Д. Культура клеток и тканей. Пер. с англ., М., Медгиз, 1963, 348 с.

39. Поливода Б. И. Биофизика, 1975,20, 1, 160.

40. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Киопротекторы. Киев, 1978, 204 с.

41. Ритов В. Б. В сб.: Биохшмия животных и человека, 1977, 53. Киев.

42. Сотников О.С., Костенко М.А. Механическое напряжение и подвижность межклеточных контактов в культуре нервных клеток. ДАН, 1985, т. 281, №3, с. 690-693.

43. Шварцбурд П.М. Хроническое воспаление повышает риск развития эпителиальных новообразований, индуцируя предраковое микроокружение: анализ механизмов дисрегуляции. Вопросы онкологии, 2006, т. 52, №2, с. 137-144.

44. Цуцаева А.А. и др. Криоконсервация клеточных суспензий. Киев, 1983, 148 с.

45. Эйдус JI. X. Неспецифическая реакция клеток и радиочувствительность. М., 1977, Атом-издат.

46. Adams, D.S. and Levin, М. Strategies and techniques for investigation of biophysical signals in patterning. In Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos (Whitman, M. and Sater, A.K., eds), 2006, pp. 177-262, Taylor and Francis Books.

47. Amano Т., Richelson E., Nirenberg M. Neurotransmitter synthesis by neuroblastoma clones. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, 69, p. 258-262.

48. Agarwal K.C., Parks R.E. Forskolin: a potential antimetastatic agent. Int. J. Cancer., 1983, 32(6), p. 801-804.

49. Ammon H.P., Muller A.B. Forskolin: From a ayurvedic remedy to a modern agent. Planta Med, 1985, 6, p. 437-477.

50. Arcangeli, A. Expression and role of hERG channels in cancer cells. Novartis Found. Symp., 2005,266, p. 225-232.

51. Aslanidi KB, Aslanidi GV, Vachadze DM, Zinchenko VP, Labas YuA, Potapova TV. A possible role of cold-induced ionic stress in cold-induced cell death. Membr Cell Biol. 1997; 1 l(l):57-76. Review.

52. Augusti-Tocco, G. & Sato, G. Establishment of functional clonal lines of neurons from mouse neuroblastoma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1969, 64, 311-315.

53. Barnes D., Sato G. Serum-free cell culture: a unifying approach. Cell, 1980, v. 22, p. 649-655.

54. Barth L. G, Barth L. I. Develop. Biol, 1974,39,1,1.

55. Bartholomew J.C, Neff N.T., Ross P.A. Stimulation of WI-38 cycle transit: effect of serum concentration and cell density. J. Cell. Physiol, 1976, v. 89, p.-251-258.

56. Benda, P., Lightbody, J. Sato, G., Levine, L. & Sweet, W. Differentiated rat glial cell strain in tissue culture. Science, 1968, 161, 370-371.

57. Berridge Michel J., Martin D. Bootman, Peter Lipp. Calcium a life and death signal. Nature, 1998, v. 395, p. 645-649.

58. Bertolero F., Kaighn M.E., Camalier R.F., Saffoiotti U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro, 1986, v. 22, p. 423-428.

59. Binet A., Volfin P. Arch. Biochem. and Biophys., 1975,170. 2, 576.

60. Binggeli, R. and Weinstein, R. Membrane potentials and sodium channels: hypotheses for growth regulation and cancer formation based on changes in sodium channels and gap junctions. J. Theor. Biol., 1986, 123, p. 377-401.

61. Blaustein M. P. Rev. Physiol. Biochem. and Pharmacol., 1974, 70,33.

62. Bodemer, C.W. Evocation of regrowth phenomena in anuranlimbs by electrical stimulation of the nerve supply. Anat. Rec., 1964, 148,441457.

63. Bodowei R., Hering S., Schubert В., Wollenberg. Sodium and Calcium Currents in Neuroblastoma x Glioma Hybrid Cells Before and After Morphological Differentiation by Dibutyryl Cyclic AMP. Gen. Physiol. Biophys., 1985, 4, p. 113-127.

64. Borgens, R.B. et al. Bioelectricity and regeneration: initiating offrog limb regeneration by minute currents. J. Exp. Zool., 1977, 200,403-416.

65. Borgens, R.B. et al. Stump currents in regenerating salamanders and newts. J. Exp. Zool., 1984, 231,249-256.

66. Borgens, R.B. What is the role of naturally produced electriccurrent in vertebrate regeneration and healing. Int. Rev. Cytol., 1982, 76, 245-298.

67. Borle A. B. J. Membr. Biol., 1972, 10, 45.

68. Brandt B. L., Kimes B. W., Klier F. G. Development of a clonal myogenic cell line with unusual biochemical properties. J. Cell. Physiol., 1976, v. 88, p. 255-276.

69. Brandt M., Buchen С., Hamprecht В. Relation-ship between the actions of calcium ions, opioids, and prostaglandin E1 on the level of cyclic AMP in neuroblastoma x glioma hybrid cells. J. Neurochem., 1980, v. 34, № 3, p. 643651.

70. Brauer P.R., Yee J.A. Cranial neural crest cells synthesize and secrete a latent form of transforming growth factor beta that can be activated by neural crest cell proteolysis. Dev. Biol., 1993, Jan, 155 (1), p. 281-285.

71. Brown К D, Lamb J. F. J. Physiol. (Engl.), 1975,251,1, 58.

72. Bruns D. В., McDonald I. M., Jarett L. J. Biol. Chem., 1976, 251,22, 7191.

73. By grave F. L. Trends Biochem. Sci.,1978, 3, 3, 175.

74. Caig, C.D. et al. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. PhysioL Rev., 2005, 85, 943-978.

75. Calne D.B., Stoessl A.J. Adv. Neurol., 1987,45,45-49.

76. Carvalho A. P. Proc. internat. sympos. on calcium bind, proteins. Warszawa-Amsterdam, 1974, 369.

77. Castle V.P., Ou X., O'Shea S. and Dixit V.M. Induction of thrombospondin 1 by retinoic acid is important during differentiation of neuroblastoma cells. J. Clin. Invest., 1992, 90, p. 1857-1863.

78. Ceccarini C, Eagle H. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1971, 68, 229.

79. Chiarandini D. I., Stefani E., Gerschenfeld H. M. Science, 1967,156, 3782, 1597.

80. Cinatl J. Jr., Cinatl J., Hernaiz Driever P., Kotchetkov R., Pouckova P., Kornhuber B. and Schwabe D. Sodium valproate inhibits in vivo growth of human neuroblastoma cells. Anticancer Drugs, 1997, 8, p. 958-963.

81. Claret-Berthon В., Claret M., Mazet J. L. J. Physiol. (Engl.). 1977, 272,3, 529.

82. Coleman P.O. and Flood D.G. Neurobiol. Aging, 1987, 8, 21-546.

83. Colombe В. V., Macey R. I. Biochim. et biophys. acta, 1974, 363, 2, 226.

84. Cone, C.D. and Cone, C.M. Induction of mitosis in mature neurons in central nervous system by sustained depolarization. Science,-1976, 192, p. 155-158.

85. Crompton M., Capano M., Carafoli E. Europ. J. Biochcm., 1976, 69, 2, 453.

86. Crain S. M., Peterson E. R., Bornstein M. B. Ciba Found. Sympos. «Growth of nervous system». London, 1968,13.

87. Crompton M., Moser R., Liidi H., Carafoli E. Europ. J. Biochera, 1978, 82, 1, 25.

88. Cushing, H. & Wolbach, S. B. The transformation of a malignant paravertebral sympathicoblastoma into a benign ganglioneuroma. Amer. J. Pathol., 1927,3,203-216.

89. Daniels, R.H., P.S. Hall, and G.M. Bokoch. Membrane targeting ofp21-activated kinase 1 (РАК 1) induces neurite outgrowth from PC 12 cells. EMBOJ., 1998, 17, p. 754-764.

90. Dipasquale В., Marlni A. M. and Youle R. J. Biochem Biophys. Res. Commun., 1991, 181,1442-1448.

91. Doherty P., Williams G. and Williams E.-J. CAMs and axonal growth: a critical evaluation of the role of calcium and the МАРК cascade. Mol. Cell Neurosci., 2000, 16, p. 283-295.

92. Dziak R-, Brand J. S. Federat. Proc, 1974, 33, 3, p. 1, 544.

93. Eagle H. Media for animal cell culture. Tissue Cult. Assoc. Manual., 1977, v. 3, p. 517-520.

94. Eagle H. The effect of environmental pH on the growth of normal and malignant cells. J. Cell. Physiol., 1973, v. 82, p. 1-8.

95. Eckert R., Hescheler J., Krautwwurst D., Schultz G., Trautwein W. Calcium currents in neuroblastoma x glioma hybrid cells after cultivation with dibutyryl cyclic AMP and nicel. European Journal of Physiology, Pflugers Arch., 1990, v. 417, p. 329-335.

96. Evangelopoulos M.E., Weis Joachim and Kriittgen A. Signalling pathways leading to neuroblastoma differentiation after serum withdrawal: HDL blocks neuroblastoma differentiation by inhibition of EGFR. Oncogene, 2005,24, p. 3309-3318.

97. Evans A.E. Proceedings of the Tumor Board of the Children's Hospital of Philadelphia. IV-S neuroblastoma. Med Pediatr Oncol, 1979, 6, p. 85-91.

98. Feng Z. and Porter A.G. NF-B/Rel proteins are required for neuronal differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells. J. Biol. Chem, 1999,274, p. 30341-30344.

99. Fernandes Norvin D., Yingli Sun and Brendan D. Price. Activation of the Kinase Activity of ATM by Retinoic Acid Is Required for CREB-dependent Differentiation of Neuroblastoma Cells. J. Biol. Chem., 2007, June 1, v. 282, Issue 22, p. 16577-16584.

100. Fesus L., Davles P.O.A. and Piacentinl M. Eur. J. Cell. Biol., 1991, 56, 170177.

101. Fishman R. A., Reiner M., Chan P. H. J. Neurochem., 1977, 28, 1061.

102. Flaskos J, Harris W, Sachana M., Minoz D., Tack J., Hargreaves A.J. The effects of diazinon and cypermethrin on the differentiation of neuronal and glial cell lines. Toxicol Appl Pharmacol., 2006, v.219 (2-3), p. 172-1805.

103. Fraser, S.P. et al. Voltage-gated sodium channel expression and potentiation of human breast cancer metastasis. Clin. Cancer Res., 2005. 11, 5381-5389.

104. Freinkel N., El Younsi C, Bonnar J., Daw son R. M. C. J. Clin. Invest, 1974, 54,5, 1179.

105. Furmanski, P, Silverman, D. J. & Lobin, M. Expression of differentiated functions in mouse neuroblastoma mediated by dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate. Nature, 1971,233, 413-415.

106. Gardos G, Szasz I., Sarkadi B. Acta biol. et mcd. germanica, 1977, 36, 5-6, 823.

107. Gilman, A. G. A protein binding assay for adenosine 3': 5'-cycic monophosphate. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1970, 67, 305-312.

108. Giorgio Marco, Mirella Trinei, Enrica Migliaccio and Pier Giuseppe Pelicci. Hydrogen peroxide: a metabolic by-product or a common mediator of ageing signals? Molecular Cell Biology, Nature Reviewes, 2007, v. 8, p. 722-728.

109. Goldberg N. D., Haddox M. K, Dunham £, Lopez C, Hadden J. W.-Cold • Spring Harbor confer, on cell proliferate, 1974, 609.

110. Golstein P., Ojcius D.M. and Young D.E.Jmmunol. Rev., 1991, 121, 29-65.

111. Govek, E.E., S.E. Newey, and L. Van Aelst. The role of the Rho GTPases in neuronal development. Genes Dev., 2005,19, p. 1-49.

112. Hamprechi B. Structural, electrophysiological and pharmacological properties of neuroblastoma-glioma cell hybrids in cell culture. Intern. Rev. Cytol., 1977, v. 49, p. 99-170.

113. Hanks J.H. Hanks'balanced salt solution and pH control. Tissue Cult. Assoc. Manual., 1975, v. 1, p. 3-4.

114. Harris A.J., Dennis M.J. Acetylcholine sensitivity and distribution on mouse neuroblastoma cells. Science, 1970, 167, № 3922, p. 1253-1255.

115. Harrison R.G. Observations on the living developing nerve fiber. Anat. Rev., 1907, v.l, p. 116-118.

116. Helson L., BidlerM. Catecholamines in neuroblastoma cells from human bone marrow, tissue culture and murine C-1300 tumor. Cancer, 1973, v. 31, p. 1087-1091.

117. Hotary, KB. and Robinson, K.R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development, 1992, 114,985996.

118. Hovland A.R., Nahreini P., Andreatta C.P., Edwards-Prasad J. and Prasad K.N. Identifying genes involved in regulating differentiation of neuroblastoma cells. J. Neurosci. Res., 2001, 64, p. 302-310.

119. Hozumi, Y., T. Ito, T. Nakano, T. Nakagawa, M. Aoyagi, H. Kondo, and K. Goto. Nuclear localization of diacylglycerol kinase zeta in neurons. Eur. J. Neurosci., 2003, 18, p. 1448-1457. •

120. Jenkins, L.S. et al. Reduction of the current of injury leaving the amputation inhibits limb regeneration in the red spotted newt. Dev. Biol., 1996, 178, 251-262.

121. Katayama M., Kan M. Heparin-binding (fibroblast) growth factors are potential autocrine regulators of esophageal epithelial cell proliferation. Tohoku J. Exp. Med., 1992, Oct, 168 (2), p. 287-290.

122. Kerr J.F.R., Searle J., Harmon B.V. and Bishop С.J. The Perspectives on mammalian cell death (G.S. Rotten, Ed.), 1987, pp. 93-128. Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo.

123. Kimhi Y., C. Palfrey, I. Spector, Y. Barak, and U. Littauer. Maturation of neuroblastoma cells in presence of dimethylsulfoxide. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73,2, p. 462-466.

124. Knox P., Griffiths S., Whateley J.G. Foetal calf serum and the adhesion of cells in culture. Biochem. Soc. Trans., 1979, v. 7, p. 1011-1079.

125. Kniipfer M.M., Hernaiz Driever P., Poppenborg H., Wolff E.A. and Cinatl J. Jr. Valproic acid inhibits proliferation and changes CD 56 and CD 44 expression in malignant glioma cells. Anticancer Res., 1998, 18, p. 35853589.

126. Kostenko M.A., Musienko V.S, Smolikhina T.I. Ca44" and pH affect the neurite formation in cultured mollusc isolated neurons. Brain. Res., 1983, v. 276, p. 43-50.

127. Kranenburg, О, V. Scharnhorst, A.J. Van der Eb, and A. Zantema. Inhibition of cyclin-dependent kinase activity triggers neuronal differentiation of mouse neuroblastoma cells. J. Cell Biol, 1995, 131, p. 227-234.

128. Kruman I.I, Kostenko M.A, Gordon R.Ya, Popov V.I, Umansky S.R. Differentiation and apoptosis of murine neuroblastoma cells. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1993, v. 191(3), p. 1309-1318.

129. Kure S, Tominaga T, Toda K. and Narisava K. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1991, 179,39-45.

130. Laat S.W. de, Saag P.T. van der. The plasma membrane as a regulatory site in growth and differentiation of neuroblastoma cells. Intern. Rev. Cytol, 1982, v. 74, p. 1-54.

131. Laemmli H. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4. Nature, 1970, v. 227 (5259), p. 680-685.

132. Lansing A. I. J. Exptl ZooL, 1942, 91, 195.

133. Lauritzen, I. et al. K+-dependent cerebral granule neuron apoptosis. Role of task leak K+ channels. J. Biol. Chem, 2003,278, p. 32068-32076.

134. Lazarewicz J. W, Kanje M, Sellstrom A, Hamberger A. J. Neurochem, 1977,29,3,495.

135. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell culture in free gas exchange with the atmosphere. Amer.J.Hyg,1963, v.78, p.173-180.

136. Leibovitz A. Preparation of medium L 15. Tissue Cult. Assoc. Manual., 1977, v. 3, p. 557-559.

137. Levin, M. Bioelectromagnetic patterningfields: roles in embryonic development, regeneration, and neoplasm. Bioelectromagnetics, 2003, 24, p. 295-315.

138. Levin, M. Large-scale biophysics: ion flows and regeneration. TRENDS in Cell Biology, 2007, v. 17 (6), p. 261-270.

139. Li, L. et al. PTEN in neural precursor cells: regulation of migration, apoptosis, and proliferation. Mol. Cell. Neurosci., 2002,20, p. 21-29.

140. Libermann D., L. Sachs. Nuclear control of neurite induction in neuroblastoma cells. Exp. Cell Res., 1978, v. 113, 2, p. 383-390.

141. Lockshin R.A. and Zakeri Z.F. J. Gerontol.: Biol. Sci., 1990, 45, 135-140.

142. Lodin Z., Boocher J., Kasten F. H. Exptl Cell. Res., 1970, 59, 291.

143. Lodin Z., Faltin J., Boocher J., Hartman J., Sensenbrenner M. J. Neurobiol., 1973,3, 2, 66.

144. Lopo A., Vacouier V. D. Nature, 1977, 269, 590.

145. Lowe D. A., Richardson B. P., Taylor P., Donatsch P. Nature, 1976,260, 337

146. Luo, L. Actin cytoskeleton regulation in neuronal morphogenesis and structural plasticity. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2002, 18, p. 601-635.

147. Lyser K.M., Burmeister D.W., Caroll J.M., Leevalk G.K. Culture of human neuroblastoma cells in serum-free supplemented medium. Anat. Rec., 1980, v. 196, p. 240A.

148. Macleod A. J., Drummond O. Serum quolity: an analysis of its components. -In: Develop, biol. standard. 3rd General Meeting of ESACT, Oxford 1979. Basel, 1980, vol. 46, p. 17-20.

149. Malhi, H. et al. KATP channels regulate mitogenically induced proliferation in primary rat hepatocytes and human liver cell lines. Implications for liver growth control and potential therapeutic targeting. J. Biol. Chem., 2000, 275,26050-26057.

150. Marks P.A., Richon V.M. and Rifkind R.A. Histone deacetylase inhibitors: inducers of differentiation or apoptosis of transformed cells. J Nat. Cancer Inst, 2000, 92, p. 1210-1216.

151. Marrero A., Martin J.M., Perez M.A. and Trujillo C.M. J. Submicroscope Cytol., 1987, 19, 479-482.

152. Marsh, G. and Beams, H. Electrical control of morphogenesis in" regenerating Dugesia tigrina. J. Cell. Сотр. Physiol., 1957, 39, 191-211.

153. Masters J. N., Finch С. E. and Sapolsky R. M. Endocrinology, 1989, 124, 3083-3088.

154. Matthes G., Hackensellner H.A.Correlation between purity of dimethyl sulfoxide and survival after freezing and thawing. Cryo-Letters, 1981, v. 2, p. 389-392.

155. Mazzanti, M. et al. Electrical dimension of the nuclear envelope, Physiol. Rev., 2001, 81,1-19.

156. Meecli R. N., Thomas R. C. J. Physiol. (Engl.), 1977. 265, 3, 867.

157. Miller R.A., P.H. Ruddle. Enucleated neuroblastoma cells form neurites when treated with dibutyryl cyclic AMP. J. Cell Biol., 1974, v. 63, 1, p. 295-299.

158. Moolenaar W. H., Spector I. Ionic currents in cultured mouse neuroblastoma cells under voltage-clamp comditions. J. Physiol., 1978, v. 278, p. 265-286.

159. Monard D., F. Solomon, M. Rentach, R. Gysin. Glia-induced morphological differentiation in neuroblastoma cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, p. 1894-1897.

160. Mueller P. et al. Nature, 1962, 194, 979.

161. Novak, B. and Sirnoval, C. Inhibition of regeneration of Aeetabularia mediterranea enucleated posterior stalk segments by electrical isolation. Plant Sci. Lett, 1975, 5,183-188.

162. Nyllie A.H, Kerr J. F. R. and Currie A. R. Rev. Cytol, 1980,68,251-306.

163. Okuda A, Kimura G. Effects of serum deprivation on the initiation of DNA synthesis in the second generation in rat 3Y1 cells. J. Cell. Physiol, 1982, v. 110, p. 267-270.

164. Oppenhelm R.N. In The Studies In Developmental Neurobiology: Essays In Honor of Victor Hamburger (V.M. Cowan, Ed), 1981, pp. 74-132.

165. Otten, J, Johnson, G. S. & Pastan, I. Regulation of cell growth by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate. J. Biol. Chem, 1972, 247, 7082-7087.

166. Ove P, Coetzee ML, Scalamogna P, Francavilla A, Starzl ТЕ. Isolation of an autocrine growth factor from hepatoma HTC-SR cells. J. Cell Physiol, 1987, May; 131(2), p. 165-174.

167. Perez-Juste G, Aranda A. Differentiation of mouse neuroblastoma cells by phorbol esters and insulin-like growth factor 1 is associated with induction of retinoic acid receptor В gene expression. ONCOGENE, 1999, v. 18, 39, p. 5393-5402.

168. Pichugin Yuri, Gregory M. Fahy, Robert Morin. Cryopreservation of rat hippocampal slices by vitrification. Cryobiology, 2006, 52, 2, p. 228-240.

169. Pizzo P. A, D.G. Poplack (eds). Principles and Practice of Pediatric Oncology. Annals of Oncology, 2003, v. 14 (4), pp. 661 -662.

170. Politis, M.J. and Zanakis, M.F. Treatment of the damaged rat hippocampus with a locally applied electric field. Exp. Brain Res., 1988, 71, 223-226.

171. Prasad K.N. Differentiation of neuroblastoma cells in culture. Biol. Rev., 1975, v. 50, p. 129-265.

172. Prasad KN: Differentiation of neuroblastoma cells: a useful model for neurobiology and cancer. Biol Rev Camb. Philos. Soc., 1991, 66, p. 431-451.

173. Prasad, K. N. X-ray-induced morphological differentiation of mouse neuroblastoma cells in vitro. Nature, 1971, 234, 471-473.

174. Prasad K.N., Kumar S., Gilmer K. and Vernadakis A. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1973, 50, p. 973- 977.

175. Prasad K.N., A.M. Hsie. Morphologic differentiation of mouse neuroblastoma cells induced in vitro by dibutyryl adenosine 3':5'-cyclic monophosphate. Nature New Biol., 1971,233,141-142.

176. Prasad K.N., Kumar S. Cyclic 3'5'-AMP phosphodiesterase activity during cyclic AMP-induced differentiation of neuroblastoma cells in culture. Proc. Soc. Exp. Biol., Med., 1973, v. 142, p. 406-409.

177. Prasad K.N., Sahu S.K., Kumar S. Relationship between cyclic AMP and differentiation of neuroblastoma cells in culture. In: Differentiation and control of malignancy of tumor cells, Tokio: Cann monograph of cancer research., 1975, p. 287-309.

178. Price DJ, Lotto RB, Warren N, Magowan G, Clausen J. The roles of growth factors and neural activity in the development of the neocortex. Ciba Found Symp., 1995,193, p. 231-250, discussion 251-257.

179. Pullar, C.E. et al. Cyclic AMP-dependent protein kinase A playsa role in the directed migration of human keratinocytes in a DC electric field. Cell Motil. Cytoskeleton, 2001, 50, 207-217.

180. Putney, L.K. and Barber, D.L. Na-H exchange-dependent increase in intracellular pH times G2/M entry and transition. J. Biol. Chem., 2003, 278, p. 44645-44649.

181. Raeymaekers L., Wuytack F., Casteels R. Pflugers Arch. ges. Physiol., 1974, 347,4, 329.

182. Rasmussen H., Goodman D. B. P. Physiol. Rev., 1977, 57, 3,421.

183. Reuter H. Abstr. 7th Europ. congr. cardiol. inst, 1, 548. Amsterdam, 1976.

184. Reyes-Mugica M, Meyerhardt JA, Rzasa J, Rimm DL, Johnson KR, Wheelock MJ and Reale MA: Truncated DCC reduces N-cadherin/catenin expression and calcium-dependent cell adhesion in neuroblastoma cells. Lab. Invest., 2001, 81, p. 201-210.

185. Robinson, K.R. Endogenous and applied electrical currents: their measurement and application. In Electric Fields in Vertebrate Repair, 1989,1-25.

186. Rodrigues J.M., Luis A.L., Lobato J.V., Pinto M.V., Faustino A., Hussain N.S., Lopes M.A., Veloso A.P., Freitas M., Geuna S., santos J.D., Mauricio9+

187. A.C. Intracellular Ca concentration in the N1E-115 neuronal cell line and its use for peripheric nerve regeneration. Acta Med Port., 2005, Sep-Oct; 18(5), p. 323-328.

188. Roisen F. J., Murphy R. A., Braden W. G. J. Neurobiol., 1972,3, 4, 477.

189. Romero P. J., WhittamR. J. Physiol. (Engl.), 1971,214, 481.

190. Ross J., Olmsted J.B., Rosenbaum J.L. The ultrastructure of mouse neuroblastoma cells in tissue culture. Tissue and cell, 1975, v.7, p. 107-136.

191. Roubin R, Deagostini-Bazin H, Hirsch MR, Goridis C. Modulation of NCAM expression by transforming growth factor-beta, serum, and autocrine factors. J Cell Biol, 1990, Aug; 111(2), p. 673-684.

192. Rubin H. J. Cell. Biol., 1971, 51, 686.

193. Russell J. M., Boron W. F. Nature, 1976,264, 73.

194. Sarner, S, R. Kozma, S. Ahmed, and L. Lim. Phosphatidylinositol 3-kinase, Cdc42, and Racl act downstream of Ras in integrin-dependent neurite outgrowth in N1E-115 neuroblastoma cells. Mol. Cell. Biol, 2000,20, p. 158172.

195. Sasaki, M. et al. Dynamic regulation of neuronal NO synthase transcription by calcium influx through a CREB family transcription factor-dependent mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 86178622.

196. Scarpa S, Coppa A, Ragano-Caracciolo M, Mincione G, Giuffrida A, Modesti A, Colletta G. Transforming growth factor beta regulates differentiation and proliferation of human neuroblastoma. Exp. Cell. Res, 1996,25, 229(1), p. 147-154.

197. Schubert D, Humphreys S, Vitry de F, Jacob F. Develop. Biol, 1971,25,4, 514.

198. Schubert D, Humphreys S, Baroni C, Cohn M. In vitro differentiation of a mouse neuroblastoma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, v. 66, p. 5611-5615.

199. Schubert, D. & Jacob, F. 5-Bromodeoxyuridineinduced differentiation of a neuroblastoma. Proc. Nat.Acad. Sci. USA, 1970, 67, 247-254.

200. Scott B. S. J. Cell. Physiol, 1977, 91, 305.

201. Scott B. S, Fisher К. C. Exptl Neurol, 1970,27, 1, 16.

202. Seamon K.B, Daly J.W. Forskolin: a unique diterpene activator of cyclic AMP-generatingsystems. J. Cyclic Nucleotide Res, 1981, 7(4), p. 201-224.

203. Seeds N.W, Gilman A.G, Amano T, Nirenberg M.W. Regulation of axon formation by clonal lines of a neural tumor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1970, v. 66, p. 160-167.

204. Seeger R.C, Rayner S.A, Banerjee A, Chung H, Laug W.E, Neustein H.B, Benedict W.F. Morphology, growth, chromosomal pattern and fybrolytic activity of two new human neuroblastoma cell lines. Cancer Res, 1977, v. 37, p. 1364-1371.

205. Selji I., Fumlaki H., Tomohiro M., Hiroshi Y. Japan. J. Pharmacol., 1976, 26, 1,31.

206. Shapiro, S. et al. Oscillating field stimulation for complete spinalcord injury in humans: a Phase 1 trial. J. Neurosurg., 2005, Spine 2, 3-10.

207. Sharma, K.K. and Niazi, LA. Restoration of limb regenerationability in frog tadpoles by electrical stimulation. Indian J. Exp. Biol., 1990, 28, 733-738.

208. Shi, R. and Borgens, R.B. Three-dimensional gradients ofVoltage during development of the nervous system as invisible coordinates for the establishment of embryonic pattern. Dev. Dyn., 1995,202, 101-114.

209. Shields R. Nature, 1974, 252,11.

210. Siegel F. L., Brooks J. C, Childers S. R, Campbell J. A. Proc. internat. sympos. on calcium bind, proteins. Warszawa Amsterdam, 1974, 721.

211. Simkiss K. Endeavour, 1974, 33, 120, 119.

212. Sisken, B.F. Electrical-stimulation of nerves and their regeneration. Bioelectrochem. Bioenerg., 1992, 29, 121—126.

213. Sisken, B.F. and Fowler, I. Induction of limb regeneration in the chick-embryo. Anat.Rec., 1981, 199, A238-A239.

214. Sisken, B.F. et al. Prospects on clinical-applications of electrical-stimulation for nerve regeneration. J. Cell. Biochem., 1993, 51,404-409.

215. Skalka M., Matyasova J. and Cejkova M. FEBS Lett., 1976, v.72, p. 271-274.

216. Slack, J.M. et al. Cellular and molecular mechanisms of regeneration in Xenopus. Philos. Trans. R. Soc. Land. B. Biol. Sci., 2004, 359, 745-751.

217. Sloviter R.S. Brain Res., 1983, 10, 675-697.

218. Smith, S.D. Induction of partial limb regeneration in Rana pipiens by galvanic stimulation. Anat. Rec., 1967, 158, 89-97.

219. Smith, S.D. The role of electrode position in the electrical induction of limb regeneration in subadult rats. Bioelectrochem. Bioenerg., 1981,8,661-670.

220. Sottocasa G. L, Sandri G., Panfili E., Gazzotti P., Carafoli E. Proc. internat sympos. on calcium bind, proteins. Warszawa Amsterdam, 1974, 855.

221. Steinhardt R. A., Epel D., Carroll E. J. 1974. Nature, 252, 5478, 41.

222. Stillwell, E.F. et al. Stimulation of DNA synthesis in CNS neurones by sustained depolarisation. Nat. New Biol., 1973, 246, p. 110-111.

223. Strome D. R., Clancy R. L., Gozalez N. C. Amer. J. Physiol., 1976,230, 4, 1037.

224. Svoboda, K.R. et al. Activity regulates programmed cell death of zebrafish Rohon-Beard neurons. Development, 2001, 128, p. 3511-3520.

225. Takayama H., Katsumoto Т., Takagi A. 1975. J. Electr. Microscop, 24, 3, 145.

226. Tao, Y. et al. Low K+ promotes NF-idB/DNA binding in neuronal apoptosis induced by K+ loss. Mol. Cell. Biol, 2006, 26, 1038-1050.

227. Tessier-Lavigne M. and Goodman C.S. The molecular biology of axon guidance. Science, 1996,274, p. 1123-1133.

228. Tessier-Lavigne M, Placzec M, Lumsden A.G, Dodd J., and Jessell T.M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature, 1998,336, p. 775-778.

229. Thiele Carol J. Neuroblastoma Cell Lines. Thiele CJ. Neuroblastoma: In (Ed.) Masters, J. Human Cell Culture. Lancaster, UK, Kluwer Academic Publishers, 1998, v. 1, p. 21-53.

230. Thomas R. C. J. Physiol. (Engl), 1976, 255, 715.-1977. Ibid, 273, 317.

231. Tseng, A.S. et al. Apoptosis is required during early stages of tail regeneration in Xenopus laevis. Dev. Biol, 2007,301, 62-69.

232. Trachtenberg JT, Chen BE, Knott GW, Feng G, Sanes JR, Welker E, Svoboda K. Long-term in-vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature, 2002,420, p.788-794.

233. Trachtenberg et al. Long-term in vivo imaging of the cerebral cortex in human chromosomal aberrations. Brain Res., 1972,44, 625-629.

234. Tzanakakis G.N., Agarwal K.C., Vezeridis M.P. Inhibition of hepatic metestasis from a human pancreatic adenocarcinoma (RWP-2) in the nude mouse by prostacyclin, forskolin, and ketoconazole. Cancer, 1990, 65 (3), p. 446-51.

235. Umansky S.R. J. Theor. Biol., 1982, 97, 591-602.

236. Van Wyk J. J., Underwood L. E The somatomedins and their actions. In: Biochemical actions of hormones. New York: Acad. Press, 1978, p. 101148.

237. Varon S., Raiborn С W. Brain Res., 1971, 30, 83.

238. Vasse M., Thibout D., Paysant J., Legrand E., Soria C. and Crepin M. Decrease of breast cancer cell invasiveness by sodium phenylacetate (NaPa) is associated with an increased expression of adhesive molecules. Br. J. Cancer, 2001, 84, p. 802-807.

239. Yamada K.H., Spooner B.S., Vessals N.K. Ultrastructure and function of growth cones and axons of cultured nerve cells.- J. Cell. Biol., 1971, v.49, p. 614-635.

240. Yang, S. J. et al. Ultrastructural study of depolarization-induced translocation of NRP-2 transcription factor-in cultured rat visual cortical neurons. Eur. J. • Neurosci., 2004,19, p. 1153-1162.

241. Yen A, Pardee A.B. Exponential 3T3 cells escape in mid-G from their high serum requirement. Exp. Cell Res, 1978a, v. 116, p. 103-113.

242. Yuan P.X, Huong L.D, Jiang Y.M, Gutkind J.S, Manji H.K. and Chen G. The mood-stabilizer valproic acid activates mitogenactivated protein kinases and promotes neurite growth. J. Biol. Chem, 2001, 276, p. 31674-31683.

243. Wasserman R. H. In: Metabolic pathways, 1972, 6, 351. New York London.

244. Waymouth C. Determination of osmolality in culture media. Tissue culture, New York, 1973, p. 703-709.

245. Willingham M.C. Cyclic AMP and cell behavior in cultured cells. Int. Rev. Cytol, New York, 1976, v. 44, p. 319-363.

246. Wenner C, Hackney J. Arch. Biochem. and Biophys, 1976,176,1, 37.262. Wnderlin et al, 1995.

247. Zagon I.S, Mc Laughlin P.J. Endogenous opioid systems regulate growth of neural tumor cells in culture. Brain Res, 1989, Jun. 19, 490 (1), p. 14-25.

248. Zhao, M. et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH 1510386-7 and PTEN. Nature, 2006,442, 457460.

249. Zimmemann A, Sutter A, Stephani U. Evidence for an NGF-induced autocrine neurotrophic potential of glial cells in nervous system development. Gli, 1994, Sep, 12(1), p. 81-85.

Информация о работе

Мякишева, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Индукция дифференцировки клеток нейробластомы N1E-115 неспецифическими факторами культуральных сред - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы