Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дiя iнтерферона та олiгоаденiлатiв на iоннi струми та морфологiчне диференцiования клiтиц трансформованих линiй нервового походження

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Дiя iнтерферона та олiгоаденiлатiв на iоннi струми та морфологiчне диференцiования клiтиц трансформованих линiй нервового походження"

р г Б Ой 2 3 ОНТ Ш35

ДКЛДЕііІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ін. о.о.БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

Вятченко-Карпикський Сергій Всеволодович

ДІЯ ІКТЕРФЕРОНА ТА ОЛІГОАДЕНІЛАТІВ НА ІОННІ СТРУМИ ТА МОРФОЛОГІЧНЕ ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ клітка ТРАНСФОРМОВАНИХ ЛІНІЯ НЕРВОВОГО ПОХОДШШЯ

Спеціальність: 03.00.02 - Біофізика

' Автореферат • дисертації на здобуття наукового ступеня ■ кандидата біологічних наук

КиЇЕ - 1995

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології їм. 0.0. Богсілольця НАН України

Наукові керівники:

академік Шіатон Григорович Косгюк академік Ігор Сільвестровяч йагура

Офіційні опоненти: .

чл.-кор. НАН України Олег Олександрович Кришталь д.С.н., проф. Валентин Леонідович' Зима

Провідна установа: ' Інститут молекулярної біології

ка засіданні Спеціалізованої рада при

Інституті фізіології їм. 0.0. Богомольця НДН України

генетики НАН України

Захіст відбудеться

р-

Вчений секретар спеціалізованої ради дортор біологічних наук

3.0. Сорокіна-маріна

ВСТУП

Актуальніть проблеми. Відомо, що Інтерферони утвориться я организм! і є одним з ваклишх елементів імунного захисту організму від зовнішньої Інфекції. Інтерферони діють ка рівні транскрипції, та трансляції, пригнічують вірусні. РНК та ДНК, змінюють якісно та кількісно синтез Ділків в організмі.

Крім антивірусної дії, інтерферони, змінюючи внутриклітшші метаболічні процеси, контолюють рост клітин, регулюють диференціювання. та відповідь клітин на зміну гормонального статусу. •

Інтерферони широко •застосовують в клінічній практиці для лікування та профілактикі .богатьох вируских інфенцій (СШД включно), онкологічних та інших захворювань. Всі види інтерферонів мають спільні механізми дії; насамперед це системи 2*-5* олігоаденілатсінтатази та специфічні протеїнкікази.

Концентрація 2*-5' ол1гоадэн1лат1в (2-5А) в живих системах змінюється в-широких, межах (від одиниць до сотен нМ), до залежить від функціональних властивостей клітин. При дії інтерферонів спостерігають значне підвищення (на 3-4 порядка) базального рівня 2-5А. Фосфорильовані 2-5А активують латентну РНК-азу (РНК-азу І), яка гідролізує мРНК, що ініибує біосинтез білка. Бідшо також, що дефосфорильовані ("корові") олігоаденилати не впливаючи на РНК-азу Ь, мають- значну біологічну активність. .

При дослідженні' механізму дії 2-5А на внутрішньоклітинні процеси треба враховувати його незначну здатність проникати крізь плазматичну мембрану кітин. •

З літератури відомо, що в нейронах спінальних гангліїв милі та кішки інтерферон збільшує частоту: генерації потекциалів дії. Такий само ефект зафиксовано при дії деяких корових 2-5А на нервові клітини молюсків. Однак іонний аналіз дії Інтерфероне Т8 2-5А в літературі відбито недостаньо. Особливе значення мають дослідження можливого впливу Інтерфероне та 2-5А на іонні струми, відкритий стан яких залежить від рівня внутрішньоклітинного фосфорилювання. • • _ ■ ■ « >

Трансмембранний рух іонів е в основою багатьох клітинних процесів. Під час росту клітин та їх диференціювання відбувається значна зміна іонної провідності клітинної мембрани. Враховуючі' значний вплив інтерферонів на проліферацію, ріст 1 диференціюванні

. 2 клітин, важливо вивчити особливості експресії Іонних каналів при дії Інтерферонів ка нейрони та зв'язок їх з головними морфологічними параметрами диференціювання.

Мета роботи. Дослідження впливу людського а2 - інтерферону та корових 2'-5* - олігоаденілатів на Іонні струми та процеси, пов'язані з ростом та диференціюванням клітин людської ІМН-32 та кишачої Н1Е-115 нейробластом, а тако* клітин лінії СНЗ гіпофізарного походження. .

Заданая. І. Проаналізувати вплив Інтерферону на зміну Іонних струмів клітин. . .

II. Визначити вплив корових 2-5А на іоні струми досяіджуємкх клітин при надходженні 2-5А у внутрішньоклітинне середовище. "

III. Дослідити експресію Іонних струмів та параметри морфологічного диференціювання при культивуванні клітин в середовищі, що містить людський а2 - 1нте,рферои таборові 2’-5' -олігоаденілати.

Наукова новина роботи. Вперие досліджено шшш людського «2 -Інтерферону та корових 2'-5* - олігоаденілатів на трансмембрані Іонні струми в трансформованих лініях клітин нейрснального походження. ■

Доведено, що під час аплікації людського <*2 - інтерферону на 'клітини людської нейробластоми ІШ-32 відбувається модуляція натрієвих струмів. На більшості клітин спостерігалось збільшення амплітуда натрієвого струму. .

При внутрішньоклітинному введенні олігоаденілата 2'~5'АрАрА на клітинах всіх линий, що тестувалися, спостерігався ефект, аналогічний дії людського «2 - інтерферону, на клітини людської нейробластоми. .

Внутрішньоклітинне введення олігоаденілата 2’-5'АрАрА

приводило до збільшення амплітуди кальцієвого струму, який має високий поріг активації в клітинах лінії СНЗ.

Зміна концентрації магнію в розчині, що вводився в клітину істотно впливало на спостерігасмий ефект: підвищення до рівня !»М різко зменшувало його, а до рівня 5 мМ - практично усувало.

Ками виявлена відносно висока активність синтетичного ..олігоаденілата г'-б'АрЛрерохуА, який досить стійкий до дії

з

фосфодіестераз.

Вперше показаний вшшв «2 Інтерфероне та корових 2'-5' олігоаденілатів на хід морфологічного диференціювання клітин людської IMR-32 та мишачої N1E-115 кейробластсм.

Інкубування клітин людської ІМН-32 нейробластоми в среді культивування, що містить людський а2 інтерферон, протягом 24 годин приводило до збільшення густини чутливого до ДІЇ ТТХ натрієвого струму. Такий самий ефект спостерігався 2 під час інкубування в більш тривалі терміни (від кількох годин до кількох діб) клітин людської IMR-32 та мишачої N1E-115 нейробластом в среді культивування, що містило 2'-5’АрАрА. На клітинах N1T-115 ефект дії «2 интерферона не спостерігався, що можно пояснити видоепецифічністю дії інтерфероне.

Практична ціність роботи. Отримані ксві результати про механізми процесів; що активуються під час дії Інтерфероне. Запропоновано простий метод порівняння ефективності дії різних олігоаденілатів. Проведено порівняльний аналіз дії декількох фізіологічних форм олігоаденілатів та нового штучно модифікованого аналога природніх 2’-5*А - 2 ’ -5 'АрАрєрохуА.

Апробація роботи. Основні положення роботи були Еикладені на семінарах секції біофізики Інституту Фізіології їм. 0.0. Богомольця НАН України (Київ, 1994; та на XIV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Київ, 1-4 листопада 1994)

г

Обсяг та структура дисертації. Робота викладена на 160 сторінках друкованного тексту та ілюстрована 40 малюнками. Дисертація складається із введення, огляді' літератури, описання методів досліджень та експеріментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 199 найменувань. За

матеріалами дисертації опубліковано 5 робот.

Методика дослідвень. Клітини вирощували в моношарові-і культурі у пластикових флаконах з площиною поверхні 75 см2 та з чашках Петрі диаметром 35 мм. Клітини пасирувзли кожні три-чотири доби в співвідношенні 1:2. Для вирощування клітин IMR-32 використовували средоЕйще RPMI ("Signa”, USA) з додаванням юї термоінакгавованої сироватки ембріонів великої poraTGl худоои ("Signa", USA,

"Вектор", Росія). Для хультявуванзя клеток К iE- 1 15 Бякорисгсвувелх середовище ШЕК, що містило 10% сироватки ембріонів крупної рогатої худоби, а клітин лінії GH3 - середовище RPMI, до якого додавали 5% сироватки ембріонів великої рогатої худоби і 10% інактивованої кіньської сироватки ("Sigma”, USA). Клітини знаходивсь в СОг Інкубаторі в газовому сєредовиші з 5S СОа при температурі +37 С, pH 7.4. Через 2 години після прикріплення до субстрату срэду культивування змінювали на відповідний Інкубаційний розгин. Перед електрофізіологічними дослідами среду культивування в чашках Петр! змінювали на відповідний внутрішньоклітинний розчин. .

Розроблена НашіП, Neher & Sakuiann (1981) методика "patch clamp" на сьогодні є провідним методом досліджень Іонних струмів через мембрану клітин. Вона дозволила значно підвищити ступень електричної ізоляції Фрагмента клітинної мембрани, що створило принципозо нові умови для реєстрації іонних струмів через ділянку мембрани. Електричний опір шунта між мембраною та кінцем реєструючої піпетки складає 10-100 ГоМ, що. зменьшує фоновий шум реєстрації до частин пікоампера. В своїх дослідах ми використовували піпетки, зроблені з молібденового скла.

Реєстрація даних проводилась за допомогою персонального компьютера ІВМ-АТ 286. В деяких эксперементах був' використаний аналого-цифровий перетворювач NTA--1024 (Угорщина). Для реєстрації та обробки результатів використовувались пакети програм "Screen" и "Са tasel”. •

Розрахунки площі соми, довжини нейритів диференційованих та недиференційованих клітин проводили по фотозобракенням -використовуючи напівавтоматичний прилад МОР-3 (ФРН) для аналізе фотозображнь. Кожний експеримент по дослідженню розвитку морфологічних ознак в процесі штучно викликаного морфологічного диференціювання проводили з обов'язковим контролем розвитку морфологічних ознак у нормальних умовах.

Результати

Дослідження дії а2-1нтерферону лвдинп та 2-51 на натрієвий струм

Клітини, що досліджували мали потенціал спокою віл -55 до -3р мВ. Кінетичні характеристики натрієвого струму в клетинах пэйробластоми людини IHR-32, розраховані за відомою методикою '■ (Hodglcin, Huxley, 1952; Ыагура, Долгая, 1978), найбільш нагадують

параметри натрієвого струму в клітинах нейробластоми миті N1E-115.

Під час аплікації а2 інтерферону людини е концентрації 600

од.активності/мл на клітини ІКП-32 відбувається збільшення амплітуда швидкого натрієвого струму. Максимальне сбільщення струму 1 споатерегалося на 5-10 хвилинах після початку аплікації інтерферону- та складало 151.1+28.95 від амплітуди натрієвого струму Іо до початку аплікації. В 15 клітинах максимальне збільшення' струму складало більш 200 % від значення амплітуди струму Іо. • ,

Під час аплікації а2-інтерфорону людини на клітини

нейробластоми миші NIE—115 зміни амплітуда натрієвого струму не спостерегалось.

Для дослідження г, зкливих шляхів дії інтерферону на іонні

струми мн додавали 2-5А до шіутрішньспіпеточного розчину та спостерігали відносну зміну струму, що реєгіструється. Зміну амплітуда' струмів визначали відносно реєгістрації амплітуди струму, прсв:•: ої через 2 хвилини после проржу мембрани клітини (І/ІО).

При додаванні 2-5А (10 мкм/л) до внутрішкьопіпоточного

розчину спостербгали збільшення натрієвого струму (І/Іо х 100=128.6+16.255) в клітинах IMR-32. Максимальне збільшення реєстрували на 5-Ю хвилинах після прориву мембрани клітини. Ефект спостерігався в 15 клітинах з 24, що були протестовані. В 9 клітинах величина ефекту перевищувала 180% відзначення Іо. Найбільше зарієстроване збільшення - 2463.

Ефект, що спостерігався не с зникав при заміні внутрішньопіпеточного розчину на такий, що містив іони магнію.

Аналогічну зміну натрієвого струму спостерігали при дослідженні за аналогічної) схемою клітин нейробластом миші N1E-

1)5. Загалом було протесговано 28 клітин. В 19 випадках при додаванні 2-5А до внутрішньопіпеточного розчину в концентрації Ю мкМ спостерегалось збільшення натрієвого струму на 162.8+41.5%. Від значення Іо було зареєстроване найбільше підвищення струму на 486%. Максимальна зміна величини струму спостерігалась на 10-20 хвилинах після прориву мембрани клітини. Підвищення амплітуди натрієвого струму залежало від концентрації 2-5А. Так при концентрації 2-5А 0.1 мкМ у виутрішньопіпеточнему розчині середня величина збільшення амшштуди натрієвого струму І/Іо х 100" складала 119.5±15.2$.

б -

Доелідяекня впливу різних форі олігоаденілатів ка кальцієві струїш

Транформовані клітини аденогіпофізу лінії ОНЗ є зручною модель® для вивчення багатьох процесів, пов’язаних з функціонуванням нервових та секреторних клітин. В плазматичній мембрані клітин вНЗ зафіксовані два типи потенціалкерованих кальцієвих каналів: 111. Струм, що проходить "крізь ці канали можно легко розкласти за допомогою зміни підтримуючого мембраного потенціалу. Наприклад, при підтримуючьому потенціалі -40 мВ реєструється тільки І струм, тоді як струм через ї канали повністтю інзктивований.

Реєстрацію відносної зміни кальцієвих струмів під впливом 2~5А проводили так само, як і при дослідженні дії олігоаденілатів на натрієвий струм. .

При викорисанні безмагнієвого внутрішньопіпеточного розчину, що містив 10 мкМ 2',5'АрАрА зафіксовано збільшення амплітуди Ь струму. Загалом було протестовано 49 клітин. Максимальне зростання амплітуди струму (173.1*36.5) спостерігалось на' 8-15 хвилинах після прориву мембрани. На трьох клітинах збільшення струму не перевищувало 105Ж від рівня І*, у 895» клітин рівень зростання амплітуди був більший за 130Ж. Найбільша зафіксоване збільшення струму було 495% ьід рівня І». При концентрації' іонів магнію у внутрішньопіпеточному розчині ефект спостерігали тільки у ¿6% клітин, що були протестовані. При цьому амплітуда струму зростала максимум на 90%. При використанні шутрішньопіпеточного розчину, що містив 5 мм Щ2+ достовірного зростання кальцієвого струму, який має високий поріг активації, не спостервгалось. Щоб в'ясувати дію іонів магнію в спостерігаємому ефекті ми використовували внутрішньопіпеточиий розчин, в якому ЕСТА було заміщено на ЕОТА. При таких умовах ефект збільшення кальцієвого струму, що має високий поріг активації не зникав, а навіть дещо прискорювався.

Ми зробили • такої: ряд досліджень, під час яких у внутрішньопіпеточний розчин додавали продукти гідролізу 2',5'АрАрА. Так наявність у внутрішньопіпеточному розчині 1 мкМ аденозіну або 10 мкМ АТФ не приводило до суттєвих змін кальцієвого І струму. Якщо ж додати до внутрівньопіпеточного розчину прш*ишй продукт гідролізу-2*,5*АрАрА - 2’,5’АрА ( також у концентрації 10 мкМ) то з'являвся ефект, подібний до того, що відбувався під впливом. 2’,5'АрАрА, але значно менший.

Нами також досліджена форма олігоаденилатів 3',5'АрАрА. Цей олігоадєнілат не викликав ніяких змін в амплітуді кальцізвих струмів.

Бицезгадані форми олігоаденилатів 2’,5’АрАрА, 2’,5’АрА та 3',5,'АрА досить швидко гідролізуються під впливом фосфодісстераз. Штучно створений на основі 2’,5’АрАрА олігоаденилат 2’,5’ АрАрерохуА відрізняється значно більшою стійкістю. При додаванні ' 2’ ,.5'АрАрерохуА 'до внутрітньопіпеточного розтану спостерігався ефект, подібний до того, що відбувається під впливом 2\5’АрАрЛ. Середнє зареєстроване значення збільшення амплітуди кальцієвого І струму складало 140.4+22*02 від рівня Іо. Було ітрстестсвано 18 кл-іип. Максимальне І мінімальне відхилення значення І від рівня Іо. складало 206% та 104% відповідно. Підвищення концентрації! Іонів магнію у внутрішньої неточному розчині до рівня 5 мкМ викликало пригнічення ефекту, що

спостерігався.

Наявність у внутрішньопіпеточному розчині всіх форм

олігоаденілатів не приводила до зміни кальцієвого струму, що має низький поріг активації (Т струм) як в мембранах клітин лінії бНЗ так і лінії К1Е-115-

Дослідження зв’язку мія інтерферон- та 2-5А- індукованого

морфологічного діференціввання клітин та експресією іоних каналів

При дослідженні процесів, пов’язаних з диференціюванням клітин необхідно чітко визначити ступінь диференціювання клітин. Існують загальні критерії морфологічного диференціювання досліджуєш* клітин; а саме:

П наявність аксоноподібішх відростків (нейритів), за діаметром значно більших ніж діаметр соми клітин:

2) збільшення розміру соми клітин;

3) зниження мктотичної активності клітин.

Розрахунки довжини нейритів нервових клітин мокко проводити двома різними методами: вимірювати довжину найбільшого з існуючих нейритів або сумарну довжину нейритів клітини. В сеоіх дослідженнях ми використовували останній метод, який дає змогу провести більш адекватну оцінку штучного диференціювання клітин нейробластсми.

Дослідження можливого впливу «2 Інтерферону людини на клітнш яейрсЛластоьш людини ШІ-32 гл миші ТІ1Е-115 проводили зміно»

звичайного для певної лінії клітин середи культивування на тане, ио м3 стило Інтерферон з концентрації іООО од.акт./мл або 2-5А в потрійній концентрації. Середовище змінювали через добу після пасажу клітин. Кожні три доби це середоЕШце замінювали свіжим (як контрольна, так 1 таке що містило Інтерїерон або 2-5А). За контрольні клітини приймали ті, що росли в моношаровій культурі в нормальному ростовому середовищі.

При Інкубуванні клітин протягом 9 діб (10 діб після пасажу) відбувається збільшення площі клітин, Інкубованих з Інтерфероном, у порівнянні з контролем, на 131.53. Зміна середньої сумарної доежини нейритів при ціх ке терміна* інкубування була 29.1+5.9 нм для клітин, що росли в. середовищі, яке . містило Інтерферон та 15.2+3.9 для клітин контрола. Достовірної різниці в довжині нейритів ціх двох груп клітин на ранніх- термінах Інкубування не сяостерегали. В той же час плода поверхні клітин, ' інкубованих з інтерфероном (44 клітини) на 563 перевищувала площу поверхні клітка контроля (38 клітин) вже протягом першої доби інкубування.

Аналіз Іонних струмів клітин ІКК-32 показує, що через 24 години інкубування з <х2 інтерфероном людини (25 клітин) відбувається достовірне збільшення, у порівнянні з клітинами контролю (17 клітин), густини чутливого до дії ТТХ натрієвого струму на 250%. При цьому ке терміні інкубування ми не спостерегали суттєвих змін кальцієвої провідності клітин. На більш тривалих термінах культивування ми не мали змоги провести стабільно вимірюваная трансмзмбраних іошх струмів, що пов’язано із значним погіршенням якості клітинної мембрани при культивуванні клітин вказанної лінії більше двох діб після пасажу.

Інкубування клітин нойробласгоми миші N1E—115 в культуральному середовищі, яке містило «2 інтерферон людини на привело до змін в морфологічних та електрофізіологічних параметрах клітин. Відсутність ефекту інторферону на клітини цієї лінії ми пов’язуємо з проявою видоспецифічності дії Інтерферону.

Культивування клітин нейробластоми IMR-32 протягом 24 годин в культуральному середовищі, що містило 2’,5’АрАрА, не привело до суттєвих змін морфологічних параметрів клітин. В той ке час таке Інкубування (19 клітин) привело до зміни, у порівнянні з контролем (9 клітин), густини натрієвого струму, подібної до такої, що відбувається при дії на клітини цієї лінії а?, інтерферону людини. Так, густина натрієвого струму контрольних клітин була 2.9ї0.8

пА/пФ, а, Інкубованих в присутності 1 мкМ 2-5А - 6.6?1.4 пА/пФ. При інкубуванні клітин нейробластоми миші Н1Е-115 в культуральному середовищі, що містило 2',5'АрАрА відбувалась зміна'¿головних параметрів морфологічного диференціювання, що свідчить про Індукцію нейронального диференціювання. Так культивування клітин протягом 8 діб у середовищі, що містило 2-5А, проводило до дозо-залекному зростанню довжини нейритів. Середня сумарна довжина нейритів у клітин, що мали відростки, в групі контролю була 39.8* 12.8 нм (112 клітин), у клітин, що культивували в середовищі, що містило 1 мкМ 2-5АрАрА 206.4+ 28.9 нм (162 клітини), 0,01 мк.4 2-5АрАрА -152.0+ 51.9 нм (48 клітин). На той же час не відбувалось достовірної зміни площі профілю соми як у клітин.без нейритів так 1 клітинах, що не мали їх.

У клітин з відростками з часом збільшується густина натрієвого струму як в клітинах контролю, так 1 в клітинах, які інкубувались у присутності 2-5А. Одночас, з останній групі клітин густина струму зростала більш швидкнмо. В клітинах, які не мали нейритів, При культивуванні в присутності 1 мкМ 2-5АрАрА вже через 24 години інкубування спостерегалі збільшення, у порівннянні з контролем, густини натрієвого струму з 1.27 рази.. При більш тривалих термінах культивування в клітинах боз нейритів, в контрольних групах, та в групах, що досліджувались, спостерегали зменшення густини натрієвого струму.

При культивуванні клітин ШЕ-115 в вищезгаданих умовах ми не зафіксували змін густини кальцієвого струму, що має низький поріг активації. ■

Щоб відповісти на питання про роль кальцієвих каналів на процес морфологічного диференціювання клітин N12-115 ми провели дослідження,.в яких використовували Слокатор кальцієеих каналів верапамід, та/або культивування клітин в умовах хроігичнсі деполярізації плазматичної мембрани (культивування в. середовищі, що міститло 25 мы КС1).

Інкубування клітин в присутності вераламілу в концентрації 1 мкМ протягом 48 годин викликало значне підсилення ознак морфологічного диференціювання. Спостерігали достовірне, що до клітин контрольної групи (101 клітина5.зростання (54 клітини) сумарної довжини нейритів та площі поверхні соми. На відміну від дії вераламілу, Інкубування клітин в умовах хроначної деполярізації клітинної мембрани, викликаної підвищенням

концентрації KCl в Інкубаційному середовищі до рівня 25 мМ викликало . пригнічення морфологічного диференціювання клітин. Спостерегали зменшення росту нейритів та площі соми (39 клітка).

Культивування клітин в середовищі, що кістгло ворапамід в значно більшій концентрації (100 мкМ) пригнічувало не тільки процес диференціювання, а й на функціонування клітин в цілому, вони зменшувались в розмірах, набували кулеподібну форму 1 не мали нейритів (59 клітин).

Аналіз кальцієвих струмів виявив, що у всіх групах клітин, незалежно ьід термінів культивування ¡ja довжини нейритів, був зафіксований тільки IVA - компонент кальцієвого струму (струм, що має низький поріг активації).

При іккубуваші клітин найробластоми N1E-115 протягом 48 годин з верапамілом в концентрації і мкМ (9 клітин) відзначали зростання, в порівнянні з контролем (14 клітин), густини IVA -струму. Хронічна дєполярізація мембран, викликана підвищенням концентрації зовніпиьоклітжшого калію (25 мМ КС1) викликала зменшення густини IVA - струму (5 клітин), а в разі інкубування клітин в присутності як 25 мМ КС1, так і 1 мкМ взрапамілу густина струму практично не відрізнялась від контролю (7 клітин).

Обговорення результатів. -

Вплив інтерферону та 2-5А на натрієві струми.

При проведенні дослідаень іонних струміБ клітин нейробластомй IMR-32 ми вперше провели детальний аналіз швидкого натрієвого струму в мембранах клітин цієї лілії. Натрієві канали в .клітинах нейробластомй людини IMR-32 за своїми характеристиками найбільш близькі до натрієвих каналів нейробластомй миші N1E-115. Паралельне вивчення натрієвого струму в клітинах цих двох ліній дозволило простежити прояв видоспоціфічності дії Інтерферону. Так, якщо додати його у зовньошюклітинний розчин, то виникає видоспеціфічне збільшення амплитуда натрієвого струму. Отриманий результат добре узгоджується з даними літератури .

Вважають, що дія інтерферону обумовлена, головним чином, швидким запуском системи синтезу олігоаденілатів. Проте, відомий механізм дії олігоаденілатів дійсний тільки для фосфорильованих форм олігоаденілатів. Добро відомо, що й дефосфорилійовані (корові) олігоадеиілати мають Еисоку ангивірусну. активність. ^При дії Інтерферону ln vivo зафіксоване значна (на 2-3 порядіал

.

підвищення концентрації корових форм олігоаденілатів в крові. Проте сам механізм дії корових олігоаденілатів остаточно невідомий. Б наших експериментах вьзденнк корової форми олігоаденілатів 2'»5’АрЛрА до впутріїшьопипеточного розчину підсилювало натрієвий струм в мембранах клітин нейробласіомл миші N1E-115 і людини IMR-22. Подібний ефект спостерігали під впливом . а2 ітт)р5*рту ладкна ва нартієьта. ханьлгд їлітшп •неїїробльстимп людини IMR-32. .

Аналіз літературнії показує, що внутрішньоклітинні процеси, які • змінюють натрієвий струм, пов’язані з фосфориліюваїшш/дефоефоридівванкшд повних груп білкової структури натрієвого каналу. Відомо також, що інтерферон актизує в клітинах ряд специфічних кіназ. Тому ми можемо припустити, що ефект 21,5'АрАрА пов'язаний' саме з процесами, що призводять до фосфориліввання/дефосфориліізвання натрієвого каналу.

Дія 2-5А На кальцієві струми

Зміна кальцієвої провідності веде до відповідної зміни внутрішньоклітинної конценїрації взоизого посередника багатьох клітинних процесів - іонів кальцію. Навіть незначні коливання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію мокуть значно вплинути на метаболізм клітини.

Відомий тільки один шлях збільшення амплитуди кальцієвого Струму, що мас високий поріг активації: дія на G протеїни або Через ШШФ - залежні протеїнкіпази, або через протеїнкіназу G. Однак, ці процеси проходять тільки в присутності Іонів магнію. В нашому випадку збільшення кальцієвого струму спостерігається навіть в умовах зв'язування іонів магнію при додаванні до внутрішньоклітинного розчину ЛІТА. Відомо такоя, що під дією інтерферону в клітинах активується декілька специфічних протеїнкіназ, активність яких залежить від Іонів марганцю. Цілком можливо, що саме ці марганець-залезші протеїнкінази в кінцевому результаті збільшують Імовірність перебування каналів в відкритому стані. В підтримку такого припущення говорить 1 той факт, що ми зареєстрували зміну іозшої ’ провідності тільки тих каналів, функціональний с.тан яісих залежить від

фосфориліюзання/дефосфориліювання їх білкової структури. В той же час ми не виявили впливу корових олігоаденілатів на кальцієвий струм, що має низький поріг активації. Саме цей тип каналу щоб

перебувати у відкритому стані ке потребує обоЕ'зкового фосфориліювання.

Слід відмітити значну активність штучно синтезованого

олігоаденілата - 2',5'АрАрерохуА, який надзвичайно стійкий до дії фосфодіестераз і тому може дуже сильно впливати на клітини.

Ми використовували іонні канали, як досить добре вивчені системи, що чутливо реагують на зміну багатьох клітинних процесів та які, по суті, є індикаторами функціонального стану клітини. Інтерферон не є єдиним фактором, Зо актизує синтез 2-5 олігоаденілатів. Тому ножно припустити, що фізіологічно олігаденілати активують різноманітні процеси, навіть в клітинах, які не чутливі до дії- інтерферону.

Морфологічне диференціювання клітин, індуковане інтерфероном або 2-5 олігсаденілат&іси та його зв’язок з експресією іонних каналів.

Відомо, що 7-інтерферон стимулює морфологічне диференціювання різних типів нейронів. Своїми дослідами ми доволи Індукцію диференціювання клітин нейробластоми людини ІМН-32 ¿2-інтерфероном людини. Вперше виявили вплив олігоаденілатів на морфологічне диференціювання клітин нейробластоми людини IMR-32 та миаіі NIE-115 2-5 олігоаденілатами. Оскільки Інтерферон при дії на клітини активує сінтес 2-5 олігоаденілатів, природньо- припустити що індукція диференціювання клітин під впливом інтерферону відбувається саме через систему 2-5 олігоаденілатів.

Ми провели порівняльний анализ змін морфологічних ознак диференціювання з отриманними даними по експресії натрієвих та кальцієвих каналів. Вперш години дії 2-5 олігоаденілатів на клітини нейробластоми миші N1E-115 спостерігається зміна натрієвого струму. Аналогічний ефект спостерігається під впливом «2-інтерфершу людини та 2-5 олітоадеі}Ілатів на клітини нейробластоми людини IKR-32.

Клітини, що мають довга відростки 1, відповідно, знаходяться на більш пізніших фазах диференціювання, практично не реагують на інкубування у середі культивування, що містить 2-5 олігоаденілати. При більш тривалих термінах культивування значно зменшується ефективність дії 2-5 олігоаденілатів, а густина швидкого натрієвого струму, як в мембранах клітин інкубованих в присутності 2-5 олігоаденілатів, так і в мембранах клітин контрольної групи*? майже не відрізняються. Це сеідчить, що саме 2-5 олігоаденілати на

- 13

ранній стадії дії Інтерферону "запускають" в клітинах процеси, пов’язані з індукцією диференціювання. Виявлене в цьому випадку збільшення густини натрієвого струму можливо пов’язане не з прямою дією 2-5 олігоаденілатів, а є вторинним ефектом, обумовленним збільшенням довжини нейритів. Аналіз літератури та власні досліди дозволяють вважати, що збільшення густини натрієвого струму є вторинною ознакою аейронального доїфоренціпва'ішя.

Так само зміна густини кальцієвого струму, що має низький поріг активації, яка спостерегається при різних методах Індукції диференціювання, не є необхідною умовою початку морфологічного диференціювання. Головним моментом, - монливо, є відомості про ”ві'зьгса вікко" в даапззсяі змін концентрація вяутрікяьаклїпюнаго кальцію, в якому тільки 1 можливе морфологічне диференціювання. Зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію моне відбуватись різнили шляхами, а саме: за рахунок роботи іоних каналів, і за допомогою внутрішньоклітинних систем, що регулюють концентрацію кальцію.

Відомо, що Інтерферон змінює концентрацію іонів кальцію в клітині, сприяючи проникненню його іззовні та впливаючи на внутрішньоклітинні системи регулювання кальцію. Так само можна пояснити дію на морфологічне диференціювання різних блокаторів кальцієвих струмів та деяких інших речовин, що впливають на роботу каналів. Так інкубування клітин N1E-115 в середі культивування, що містило 25 мМ КС1 приводило до пригнічення морфологічного диференціювання клітин. Цей ефект, в згаданних умовах можно пояснити постійною Інактивацією кальцієьих каналів. Застосовування верапамілу - блокатора кальцєвих каналів, що мають високий поріг активації, стимулювало диференціювання. В дослідауємих клітинах був ІК0ИІСТТЮ відсутшй кальцієвий струм, що мав високий поріг активації. Дією на цей струм можна було б пояснити ефект верапамілу. Відомо, яка в клітинах серця верапаміл підвищує внутрішньоклітинну концентрацію Іонів калік, що викликає гиперполяризацію клітин. В нашому випадку такий ефект може знімати інактивацію кальцієвих каналів, та, як слідство цього, змінювати внутрішньоклітинну концентрацію іонів кальцію. ІІри інкубуванні клітин в середовищі, яке містить 1 25 мМ ХС1, 1 1 нкМ верапамілу, тобто факторів, що викликають протилежні ефекти на мембршшй потенціал, практично не змінюються ні морфологічні, ні електрофізіологічні параметри клітин, у порівнянні з відповідними

параметра.«! клітин контрольної групи..

Висновки

1. Досліджена дія <*2-Інтерферону людини та різних форм олігоаденілатів на Іонні струми в мембранах клітин трьох нейрональних ліній: IMR-32, Н1Е-115 та GH3.

2. Виявлено, що аплікація <х2-1н?ерферона . людини на клітини нейрсбластош людини IMR-32 та мшві Й1Е-1J5 викликає видоспецифічне збільшення амплітуда натрієвого струму. Подібне збільшення амплітуди натрієвого струму в мембранах клітин лінії IMR-32 1 лінії N1E-115 викликало додавання до влутришньопіпегочного розчину 2-5АрАрА - корової форми олігоаденілатів. Отримані результати дозволяють - припустити, що саме через олігоаденілати інтерферон Ешшває на натрієвий струм.

3. Доведено, що внутрішньоклітинне введення 2-5АрАрА викликало підсилення кальцієвого струму, який має високий поріг активації, Н9 активується в клітинах лінії GH3, та не діє на кальцієвий струм, що має низький поріг активації в клітинах ліній N1E-115 і GH3. .

4. Досліджено механізм дії корових олігоаденілатів на натрієві та кальцієві струми. Доведено, що стимулююча дія Р-5АрАрА має зворотню залежність від внутрішньоклітинної концентрації Іонів магнію. Отримані результати дають можливість припустити, що ефект дії олігоаденілатів на потенціалкеровані іонні струми пов'язаний з активністю протеїнкіназ, які активуються інтерфероном.

5. Кальцієві каналимокнр використовувати, як Індикатор

ефективності дії різних форм олігоаденілатів.

6. Доведеноно, що інкубування клітин нейробластоми людини IMR-32

та миши N1E-115 в середі культивування, яка містила а2-інтерфе\рон льдкни або 2-5АрАрЛ, викликало видоспеціфічне підсилення

морфологічного диференціювання клітин.

7. Аналіз Іоних струмів в клітинах, що перебувають ка різних

етапах морфшогичного діференціювання виявив, що підсилення

експресії натрієвих то кальцієвих каналів відбувається тільки на початку інкубування. При більш тривалих термінах Інкубування

підсилення морфологічного диференціювання не завжди корелюе зі зміною експресії іонних каналів. . .

3. Отримані результати дозволяють вважати, що механізм дії системи олігоаденілатів на клітини є багатостадійним процесом, в якому суттєву роль відіграють корові форми олігоаденілатів. Запропонована схема дії Інтерферона на клітини.

Материалы дисертації опубліковані :

1. Действие интерферощ- а на натриевые каналы клеток нейробластош человека IMR-32. С.В.Вятченко-Карпинский, Н.Х.Погорелая, I.C.Marypa, О.М.Розанова, Г.Х.Мадука, О.Ф.Сенюк. Биологические мембраны, т.9., N 10-11, 1992, с. 1159-1160.

2. Дія рекомбінантного інтерфенону «2 на натрієві канали клітин нєйробластоми людини IMR-32. I.C.Marypa, G.В.Вятченко-Карпінський, Н.Х.Погорелая, О.М.Рожмановв, Г.Х.Мацука, О.Ф.Сенюк. Клітинні та молекулярні механізми розвитку патологічних процесів. Тези доповідей Пленуму науково-медичного товариства патофізіологів України, 23-25 вересня 1993 р., м. Львів, с. 21.

3. Вплив верапамілу на густину кальцієвого низькопорогового

струму та параметри морфологічного диференціювання в клітинах нєйробластоми миші Н1Е-115. С.В.Вятченко-КарпІнський,

Н.Х.Погоріла, Ы.Б. Седова, О.Є. Тохтуєв. Тези доповідей XIV з'їзду

Українського фізіологічного товариства lji. І.П. Павлова, Київ, 1-4 листопада 1994 р., с. 6-7.

4. Dephosphorylated ollgoadenylates modulates HVA calcium

currentes ln CH3 cells. Kostyiüc P.O., VlatchenJco-Karpinskl S.V., Sedova M.B., Teslenko V.l. Нейрофизиология. 1994, т. 26, 6, с.1-3.

5. Effect of "core" 2',5' - ollgoadenylates on the

phosphorylation - dependent calcium channels in GH3 cells.P.G.Kostyuk, A.V.Kozlov, Z.YU.Tkachuk, S.V.Vlatchenko-Karplnski, M.B.Sedova and V.I.Teslenko. Український біохімічний журнал, 1995, т. 67, 1, с. 26-32. .

6. Про можливу участь інтерферонів у патогенезі нервових клітин у

хворіх на СНІД. Костюк П., Магура І., Вятчэнко-Карпинський C.,

Рокманова 0. Тези доповідей першої національної науково-практичної конференції з проблем ВІЛ/СШД з міжнародної) участи, Київ, 24-27 січня 1995р., с. 60.

7. Human «2 Interferon and "core" ollgoadenylates modulate

voltage-dependent ionic cuuurentes in IMR-32, M1E-115 and GH3 cell lines. VlalchenKc-Karplnskl S.V., Sedova M.B., Pogorelaja НІН., Hudopajeva A.M., Mahallopulo I.A., and Teslenko V.l.. Тези наукової конференції, присвяченої 10Сі-р1ччю з дня організації кафедри фізіології Львівського медичного Інституту. Львів, 10-13 жовтеня 1995. '

tr ■

8. Інтерферон aZ та олігоадбнілати підсилюють морфологічне

диференціювання клітин нєйробластоми та впливають на густину потенціалкзрованного натрієвого струму. Вятченкс-КарішнськКй О.В., Погоріла Н.Х., Михайлопуло И.С., Рожманова О.М., Магура І.С. Тези наукової конференції, присвяченої 100-річчю з дня організації кафедри фізіології Львівського медичного інсгаїугу. Львів, 10-13 жовтеня 1995. . '

9. Влияние верапамила на морфологическую длфференцировку и

плотность низкопорогового кальциевого тока р клетках мышиной нейробластомы NfE^-115. Вятченко-Карпинский С.В., Погорелая Н.Х., Тохтуев А.Е., Седова М.Б. Нейрофизиология. 1995, т. 27, 2. В печати. . .

10. Морфологическая дифференцировка клеток нєйробластоми линий

IMR-32 и N1E-115 и модуляция ионных канал»: ыызванные «2

интерфероном и олигоадекилатами. Вятченко-Карпинский С.В., Погорелая Н.Х., Магура И.О., Романова 0Л\. Квасюк В.И.*, Михайлопуло И.А*. Нейрофизиолошя. 1995, т. 27, 2'. В печати.

Еи&ап a2 Interferon and 2',5'-ollgoadenylate3 (2-5A) action on calcium and sodium currents and morfologlcal differentiation of IMR-32, N1E-115 and GH3 cell lines were Investigated.

We studied the cellular mechanism of Interferon and 2-5A action. Addition of human interferon «2 Into the buth solution (600 uA/ml) Induced an Increase of the magnitude of the sodium current in the membrans of human neuroblastoma IMR-32 cells (151.1±2S.9%), but didn’t сазе any effect on sodium current In mouse neuroblastoma N1E-115 cells.

The same effect mas obsereved as in IMR-32 as In N1E-115 cells after addition 2',5'ApApA form of core 2-5A into the pippete ooiuton (0.1—to mkM). ,

Addition of 10 mkM 2',5'ApApA Into the pipette solution induced an Increase of HVA (high voltage activated) calcium current. In 10 mln after the whole-cell configuration ms established, the current magnitude was enhanced by about two-fold as compared with that observed on the second mln. High concentration of Mg2+ (5mkM) in the pipette solution blocked effect. 2',5*ApA and 3',5'ApdpA ollgoadenylates and productes of 2’,5'A hydrolysis, adenosin and AMP, did not change the value of HVA current. Chemically modified analog of 2',5'ApApA -2',5'ЛрАрерозуА, is the most stable oligoadenylate to . the phosphodiesterases action. Addition of 2',5'ApApepoxyA Into the pipette solution caused a effect smaller than 2',5'ApApA did.

The morfologlcal differentiation of neuroblastoma IMR-32 and N1E-115 cells under Interferon «2 and- 2-5ApApA influence were

Investigated. It was found that human Interferon aZ Induce

morphological differentiation in IMR-32 cells and 2-5ApApA induce morphological differentiation in IKR-32 and N1E-115 cells.

Reliable córrelaton' between morphological crlterlons of the nerve cells (somatic size and neurite length) and sodium current dencity during Interferon u2 and 2-5ApApA has been found.

It was а1зо shown that verapamil in concentration 1 mkM promoute morfologlcal cell differentiation. In so going Increased the dencity of lo»-theshold calcium current ( LVA-current). It was depression of the neurite outgrowth and decrease of the cell area If .the cells were Incubated with verapamil In 100 rnkH concentration. At 'the same tiras a drastic decrease of the T-

current dencity was observed.

Исследовалось •действие человеческого а2 иктэрфэроне и дефосфорилированных ("коровшс") г'.б'-олигоаденилатов (2-5А) на кальциевые и натриевые токи и морфологическую дифференцировку клеток линий IMR-32, N1E-115 и GH3.

Целью представленной работы было проведение исследований по изучению действия интерферона и коровах олигоаденилатов на клеточном уровне. Добавление человеческого а2 интерферона в наружный расствор вызывало возрастание амплитуды натриевого тока в мембранах клеток человеческой 'нейробластомы IMR-32 на 51.1г28»9Ж.

Эффект увеличения амплитуды натриевого тока в клатках линий NIE-115 и IMR-32 был так же обнаружен после добавлении коровой форш 2-5А - 2* ,5’АрАрА (0.1-10 мкМ) во внутрипшеточный расствор.

Наличие 10 мкМ 2’,5'АрАрА во влутрипипеточном расстворе' так не приводило к увеличению высокопорогового (HVA) кальциевого' тока в мембранах клеток линии GH3. Через 10 каш после ■ установления конфигурации "wliole-caLl" амплитуда тока возрастала почти в 2 раза, по сравнению со второй минутой после начала.'регистраций токов. Высокая концентрация Hg2+ (5мкМ) во внутрнпипеточном растворе блокировало описанный эффект. 2*,5’АрА and 3',5’АрАрА олигоаденилаты, так же как и продукы гидролиза 2-5А - аденозин и АМФ не оказывали существенного воздействия на HVA ток. Искустведао модифицированный аналог 2*,5*АрАрА - 2*,5'АрАрерохуА отличается повышенной устойчивостью к действию досфодиэстераз.., Добавление 2',5'АрАрерохуА во внутригпшеточный раствор приводило к эффекту, меньшему, чем наблюдаемый при действии 2',5’АрАрА.

Исследовалась индукция интерфероном:или 2-5А морфологической дифференцировки клеток линий IHR-32 и N1E-115. Обнаружено, человеческий а2 интерферон индуцирет морфологичекую дифференцировку в клетках только человеческой нейробластомы IMR-32, а 2-5АрАрА - в клетках линий и IMR-32 и К1Е—115. Установлено наличие достоверной корреляции между параметрами морфолошчекой дифференцировки (размер сомы и длинна нейритов) и плотностью натрлевого тока в клетках при действии а2 интерферона^ 2-5А. ,

Мы так же показали, что наличие в культуральной .среде верапамила в концентрации 1 мкМ индуцирует морфологическую дифференцировку клеток линии Н1Е-115. При атом возрастает плотность нжзкопорогоБого (LVA) кальциевого тока. Изменение концентрации ввраиакила в инкубационной среде до 100 йкМ привод1,«-} к депрессии дифференцировки и уменьшении плотности LVA тока.