Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инактивация микроорганизмов низкотемпературной плазмой при атмосферном давлении

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Инактивация микроорганизмов низкотемпературной плазмой при атмосферном давлении"

На правах рукописи

КИРЕЕВ ГЕОРГИЙ ВАДИМОВИЧ

ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМОЙ ПРИ АТМОСФЕРНОМ ДАВЛЕНИИ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005538120

0боленск-2013

005538120

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:

Холоденко Василий Петрович - доктор биологических наук Кобзев Евгений Николаевич - кандидат биологических наук

Официальные оппоненты

Зякуи Анатолий Маркович - доктор биологических наук, ФГБУН «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина» Российской академии наук, заведующий лабораторией масс-спектрометрии

Ермолаева Светлана Александровна - доктор биологических наук, НИИ «Эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории экологии возбудителей инфекций

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» Российской академии наук

Защита состоится «6» декабря 2013 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

У

Автореферат разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Разработка новых эффективных методов инактивации потенциально опасных микроорганизмов в газах, жидкостях и на поверхностях является одной из важнейших проблем в медицине, промышленности и сфере защиты окружающей среды. Современное состояние исследований в области стерилизации и дезинфекции характеризуется высоким уровнем развития традиционных методов, основанных на использовании термической обработки, фильтрации, применении радиации и химических соединений - биоцидов. В то же время, у каждого из перечисленных методов имеется ряд серьёзных недостатков. Так, считающийся в настоящее время основным средством низкотемпературной стерилизации газообразный оксид этилена токсичен, требует длительного времени воздействия, а также дополнительной дегазации обработанных объектов.

Применение в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии новых полимерных материалов, а также приборов и инструментов на их основе требует эффективных, щадящих, дешевых и безопасных методов их стерилизации (Рыбкин В.В., 2000). В этом отношении использование низкотемпературной (холодной) плазмы, генерируемой при атмосферном давлении маломощным электрическим разрядом непосредственно в обрабатываемых жидкостях и газах или на поверхностях стерилизуемых объектов, может представлять особый интерес (Акишев Ю.С. и др., 2006). В ходе обработки плазмой образуется широкий спектр активных агентов: свободные радикалы, активные формы кислорода (озон, атомарный кислород и др.), ультрафиолетовое излучение, электромагнитное поле, заряженные частицы (электроны, положительные и отрицательные ионы) и т.д., способные вызывать гибель микроорганизмов (Laroussi М. et al., 2002).

Степень разработанности темы исследования

Низкотемпературная плазма широко применяется в радиоэлектронных приборах, плазмотронах, газовых лазерах и других устройствах, а также в промышленных технологиях (BellakhalN. et al., 1997). Что касается применения плазмы в медицине при стерилизации инструментов и оборудования и в быту для обработки предметов и поверхностей, то, несмотря на некоторый прогресс, достигнутый на лабораторном уровне (Fridman G. et al., 2008; Laroussi М., LuX., 2005; Laroussi M. et al., 2006), обработка холодной плазмой при атмосферном давлении с целью уничтожения микроорганизмов пока еще не получила широкого практического применения (Gorre G. et al., 2006; LuX. et al., 2008). На данный момент в литературе практически отсутствуют систематизированные данные о наличии бактерицидного действия холодной плазмы в отношении микроорганизмов разных таксономических групп, а также о механизмах этого воздействия. В связи с вышесказанным, для разработки новой технологии стерилизации и дезинфекции, основанной на применении холодной плазмы, актуальным является изучение чувствительности микроорганизмов разных таксономических групп к бактерицидному действию холодной плазмы, а также выяснение механизмов такого действия. Новые знания позволят обоснованно подходить к выбору

оптимальных для конкретных задач источников холодной плазмы и целенаправленно разрабатывать технологии деконтаминации жидкостей, газов и поверхностей предметов (Laroussi М., 2002; Fridman G. et al., 2008).

Цель исследования

Изучение бактерицидного действия низкотемпературной плазмы при атмосферном давлении на микроорганизмы разных таксономических групп при использовании различных типов генераторов.

Задачи исследования

1. Сравнить эффективность разных типов генераторов низкотемпературной плазмы для инактивации микроорганизмов в разных средах (в жидкости, на поверхности) и выбрать наиболее перспективный генератор для дальнейших исследований.

2. Определить оптимальные условия инактивации микроорганизмов выбранным перспективным генератором низкотемпературной плазмы.

3. Исследовать чувствительность микроорганизмов разных таксономических групп (Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus hirae, Mycobacterium flavescens, Candida lypolithica, Aspergillus niger) к обработке холодной плазмой.

4. Исследовать воздействие холодной плазмы на клеточную оболочку и цитоплазматическую мембрану микроорганизмов на примере Е. coli.

5. Исследовать принципиальные возможности использования генераторов холодной плазмы для деконтаминации поверхностей объектов (электронные приборы, денежные купюры, пищевые продукты).

Научная новизна

Впервые показаны отличия в чувствительности микроорганизмов разных таксономических групп к холодной плазме.

Впервые показана высокая чувствительность природной ассоциации микроорганизмов, выделенной из нефтепромысловых вод, к обработке холодной плазмой.

Впервые показано, что обработка клеток Е. coli холодной плазмой приводит к повреждению клеточной оболочки бактерий.

Впервые получены данные о возможности восстановления повреждений микробных клеток Е. coli и В. subtilis, обработанных плазмой, при культивировании на богатых питательных средах.

Теоретическая и практическая значимость работы

Предложена гипотеза о механизмах инактивации микроорганизмов при воздействии на них холодной плазмой, в основе которой лежит предположение о пороговом количестве повреждений, нанесённых клетке активными компонентами плазмы.

Показано, что увеличение концентрации кислорода в составе плазмообразующего газа усиливает бактерицидное действие холодной плазмы.

Исследования эффективности инактивации микроорганизмов с использованием восьми генераторов плазмы разных типов позволили выбрать наиболее перспективный для решения задач данного исследования генератор холодной плазмы на основе диэлектрического барьерного разряда («ДБР»), Оптимизированы условия прямой (в зоне разряда) и удалённой (вне зоны

разряда) обработки поверхностей объектов данным генератором холодной плазмы.

Показано, что для полной инактивации микроорганизмов Е. coli, Е. hirae, Р. aeruginosa, S. aureus и Mycobacterium sp. холодной плазмой требовалась на два-три порядка меньшая экспозиция (время воздействия) по сравнению с другими методами деконтаминации (ультрафиолетовое излучение и перекись водорода).

Показана высокая эффективность деконтаминации поверхностей объектов повседневного пользования (электронные приборы и денежные купюры) холодной плазмой, генерируемой установкой «ДБР». Показана принципиальная возможность применения холодной плазмы для инактивации микроорганизмов на поверхности пищевых продуктов.

Материалы диссертации послужили основой для разработки трёх методических рекомендаций: «Разработка и совершенствование различных аппаратов для стерилизации с помощью холодной плазмы, а также оптимизация условий и режимов их практического применения» (Оболенск, 2010 г., учрежденческий уровень внедрения), «Стерилизация продуктов питания низкотемпературной плазмой» (Оболенск, 2012 г., учрежденческий уровень внедрения) и «Стерилизация упаковочного материала и продуктов питания низкотемпературной плазмой с целью увеличения сроков хранения» (Оболенск, 2013 г., учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации были использованы в программах подготовки магистрантов Учебного центра Пущинского государственного естественнонаучного института и аспирантов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии.

Методология н методы исследования

В работе использованы микробиологические, биохимические и биофизические экспериментальные методы исследования (культивирование микроорганизмов, оценка выживаемости микроорганизмов (высев на агаризованные среды, измерение диаметров зон поражения газонов тест-микроорганизмов), метод обработки жидкостей и поверхностей объектов холодной плазмой, спектрофотометрическая оценка целостности цитоплазматической мембраны, метод осмотического шока).

Положения, выносимые на защиту

1. Микроорганизмы разных таксономических групп отличаются по чувствительности к бактерицидному действию холодной плазмы: наиболее чувствительны грамотрицательные бактерии Е. coli, S. marcescens, P. aemginosa, P. fluoresceins и E. hirae\ менее чувствительны грамположительные бактерии В. subtilis, S. aureus и Mycobacterium sp., дрожжи С. lypolithica и споры грибов A. niger; наименее чувствительны споры грамположительных бактерий В. subtilis.

2. Увеличение концентрации кислорода в составе плазмообразующего газа усиливает бактерицидное действие холодной плазмы.

3. Активные компоненты холодной плазмы (заряженные частицы, свободные радикалы и др.) вызывают нарушение целостности клеточной оболочки Е. coli.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах, получены в соавторстве с сотрудниками лаборатории биотехнологической экологии Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии к.б.н. Чугуновым В.А., к.б.н. Ирхиной И.А., н.с. Жирковой Н.А., м.н.с. Ракицким Ю.А., а также с сотрудниками лаборатории слабоионизованной плазмы Троицкого института инновационных и термоядерных исследований (ГНЦ РФ ТРИНИТИ), д.ф-м.н., проф. Акишевым Ю.С., д.ф-м.н. Трушкиным Н.И., к.ф-м.н. Грушиным М.Е.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на 10-ти Всероссийских и международных конференциях: llth Annual Biological Conférence of the European BioSafety Association, Флоренция, Италия, 2008 г.; 51,h Annual Biological Safety Conférence, Рино, США, 2008 г.; 12tb Annual Conférence of the European Biosafety Association, Сольна, Швеция 2009 г.; Школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Биобезопасность в современном мире», Оболенск, 2009 г.; 13-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 2009 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы общей и военной гигиены», Санкт-Петербург, 2011 г.; NATO Science Advanced Research Workshop on Plasma for bio-decontamination, medicine and food security, г. Ясна, Словакия, 2011г.; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения», Пермь, 2012 г.; И-ой Международной научно-практической конференции «Биотехнология - перспективы развития», Уфа, 2012 г.; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы профилактической медицины, среды обитания и здоровья населения», Уфа, 2013 г.

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 29 января 2009 г. (протокол № 1, приказ № 14 от 9 февраля 2009 г.) с изменениями, утверждёнными на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 21 октября 2013 г. (протокол №8). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 34 от 1 октября 2013 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 15 научных публикациях, в том числе в двух статьях в рецензируемых журналах, одной книге и 12 тезисах международных конференций.

Обьём и структура диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, включающий 33 работы отечественных и 107 зарубежных авторов. Работа содержит 75 рисунков и 12 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектами исследований служили штаммы бактериальных культур, полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск»: Е. coli АТСС 25922 #2393; В. subtilis MPV 7095 #1997; Р. aeruginosa АТСС 27853; S. aureus АТСС 6538-р; P. fluoresces АТСС 27663; S. marcescens шт. № 1 ;Е. hirae DSM 20160Т, штаммы бактериальных и грибных культур из рабочей коллекции лаборатории биотехнологической экологии ГНЦ ПМБ: М. flavescens Е-91; М sp. В-5; С. lypolithica XT; A. niger 1Н, а также ассоциация микроорганизмов, выделенная из нефтепромысловых вод.

В качестве основной питательной среды для культивирования и количественной оценки численности бактерий использованы среды производства ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) с питательными свойствами, соответствующими каждому из видов микроорганизмов.

В работе использованы восемь лабораторных установок (генераторов) холодной плазмы и их модификаций (табл. 1), созданных в лаборатории кинетики слабоионизованной плазмы (ГНЦ РФ ТРИНИТИ, г. Троицк) под руководством д.ф.-м.н., проф. АкишеваЮ.С. и в отделе 14030 (ФГУП «Всероссийский электротехнический институт им. В.И. Ленина», г. Москва).

Эффективность обработки оценивали по количеству жизнеспособных микроорганизмов после обработки холодной плазмой методом высевов на плотную питательную среду ГРМ. В некоторых экспериментах с использованием тест-полосок со спорами В. subtilis var. niger, содержащих 106 спор на каждой полоске (Sterris, США), полноту деконтаминации определяли, помещая тест-полоски в индикаторную среду.

Для оценки чувствительности микроорганизмов к холодной плазме использовали методику, основанную на измерении диаметров зон поражения засеянного газона. Для этого засевали газон тест-микроорганизма: 100 мкл рабочей суспензии вносили на чашку Петри с агаризованной средой ГРМ и тщательно растирали шпателем. Чашки с засеянным газоном помещали в рабочую камеру генератора плазмы. Обработанные плазмой чашки инкубировали в термостате в течение суток при температуре 37 °С (22-24 °С для грибов), после чего измеряли диаметр образовавшихся зон поражения.

Инактивацию природной ассоциации микроорганизмов проводили установкой «Плазменная струя». Ассоциацию микроорганизмов наращивали в течение 14 сут на купонах из мягкой стали или полипропилена в пробирках с жидкой минимальной средой API, рекомендованной Американским институтом нефти для культивирования сульфатредукторов (Recommended Practice, 1990), и подвергали обработке плазмой. После обработки холодной плазмой микроорганизмы смывали с поверхности купонов с помощью жесткой кисточки в пробирки с физраствором. В полученных смывах определяли количество микроорганизмов методом высевов на соответствующие питательные среды.

Таблица 1 - Характеристика установок (генераторов) холодной плазмы, использованных в исследовании

№ №

Наименование установки

Общий вид установки

Описание установки

Обрабатываемая среда

Время обработки,

Количество экспериментов с микроорганизмами

Установка «Трубка»

Установка «Блэндер»

Установка

«Плазменная

струя»

Секционированная электродная система из 13 штырей диаметром 1 мм на расстоянии 3,5 мм друг от друга. Несекционированный электрод отстоит от кончиков штырей на расстояние 10-15 мм. Напряжение амплитудой до 30 кВ. Характерная мощность, вводимая газовым разрядом в пузырьки, составляла 30-90 Вт.

Жидкости

5-600

Е. coli (п = 53) В. subtilis (п = 57) споры В. subtilis (п = 18)

Электродная система аналогична (см. «Трубка»),

Скорость подачи воздуха 100 см'/с. Напряжение амплитудой 5-7 кВ. Характерная мощность, вводимая газовым разрядом в пузырьки, составляла 30-90 Вт.

Жидкости

60-600

Е. coli (п = 180)

Система имела аксиальную симметрию. На электроды подавались импульсы напряжением 4-5 кВ с варьируемой частотой от 10-1000 Гц. Плазмообразующий газ (воздух) со скоростью подачи до 30 см'/с. Температура газа в струе на расстоянии 7-8 мм была близка к комнатной. Характерный уровень электрической мощности, поддерживающий разряд с плазменной струей, составлял 15-20 Вт.

Поверхность объектов

1-600

Е. coli (п = 58)

B. subtilis (п = 124) споры В. subtilis (п = 45) 5. marcescens (п = 95)

A. niger (п = 31)

C. lypolithica (п = 55) M. flavescens (п = 66) Ассоциация микроорганизмов (п = 73)

4 Установка «Куб»

5 Установка «Куб-Юг»

Принципиальная схема установки «Куб» аналогична схеме установки «Плазменная струя». Плазмообра-зующий газ - чистый азот (о.х.ч., степень очистки 99,9999 %) со скоростью подачи до 30 см'/с.

Принципиальная схема установки «Куб+02» аналогична схеме установки «Плазменная струя». Плазмообра-зующий газ - (азот + воздух) со скоростью потока до 30 см /с.

Поверхность объектов

Потребляемая мощность 50-100 Вт. Питание - 220/50 В/Гц. Расход газа ] 0-20 см /с. Рабочая частота 100-180 кГц. Выходное напряжение 10-15 кВ.

Поверхность объектов

Установка для

обработки

аэрозолей

«ДБР»

Секционированная электродная система из 30 штырей, расположенных в шахматном порядке на расстоянии 40 мм. Плоский сетчатый электрод, удаленный на 30-60 мм. Стационарный разряд с напряжением до 40 кВ. Плазмообразующий газ (воздух) со

потока 1,4 м/с_

электродов состояла из двух диэлектрических пластин с электродами из алюминиевой фольги. Импульсы напряжением 13 кВ с частотой 35 кГц.

Воздух с частицами бактериальных аэрозолей

Поверхность объектов

Установка

«Аргоновая

плазма»

600-1800 споры В. subtilis (n = 14)

60-600 споры В. subtilis (п = 12)

10-300 Е. coli (п = 74)

В. subtilis (п = 94)

1-60

В. subtilis (п = 7)

Е. coli (п = 629) Р. aeruginosa (n = 132) Е. hi гае (п = 51) S. aureus (п = 12) М. sp. В-5 (п= 157) Естественная микрофлора(п = 166)

Для детекции повреждения цитоплазматической мембраны использовали методику, основанную на измерении количества внутриклеточных соединений (преимущественно нуклеотидов), вышедших из клеток после нарушения барьерной функции цитоплазматической мембраны (ЦГТМ) (Montie et al., 2000), после осаждения клеточной массы центрифугированием в супернатантах проб проводили измерение оптической плотности (ОП) при длине волны X = 260 нм.

Для оценки воздействия холодной плазмы на клеточную оболочку бактерий использовали метод, основанный на том, что снижение осмотического давления среды приводит к увеличению тургора бактериальных клеток и увеличению давления на клеточную оболочку. Образцы бактериальной суспензии после обработки холодной плазмой инкубировали в среде с гипотоническим осмотическим давлением в течение 1 ч и проводили учет количества жизнеспособных клеток с помощью высева на агаризованные среды. Контролем служили образцы бактериальной суспензии, которые после обработки холодной плазмой помещали в среду с нормальным осмотическим давлением (физрастором).

Статистическую обработку полученных данных, а также построение графиков проводили при помощи программы «Microsoft Excel» из стандартного пакета программ «Microsoft Office 2007».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование эффективности бактерицидного действия генераторов

холодной плазмы

В работе исследовали бактерицидную эффективность восьми лабораторных установок, предназначенных для генерации холодной плазмы в разных условиях (состав газа, тип разряда, конфигурация электродов и т.д.) (табл. 1).

При сравнении эффективности инактивации микроорганизмов в жидкой среде и на поверхности объектов было установлено, что наиболее эффективно применение холодной плазмы для обработки поверхностей. Так, показано, что поверхностная обработка холодной плазмой тест-полосок со спорами В. subtilis (106 спор/полоску) за 7-10 мин снижала количество живых спор на шесть порядков и приводила к полной инактивации спор. В то же время эффективность обработки жидкостей оказалась заметно ниже по сравнению с эффективностью обработки поверхностей объектов (рис. 1) - титр спор В. subtilis в жидкой среде за тот же временной промежуток снижался не более чем на два порядка.

Кроме того, были получены данные по устойчивости вегетативной и споровой форм В. subtilis к обработке холодной плазмой в жидкой среде (рис. 1). После обработки плазмой количество клеток вегетативной формы В. subtilis за 5-7 мин снижалось на три порядка, в то время как численность споровой культуры - лишь на один порядок.

Также были получены данные по обработке холодной плазмой аэрозоля, содержащего клетки В. subtilis. Выявлено падение титра данной культуры на один порядок. Однако из-за технических сложностей, связанных с оценкой

концентрации частиц аэрозоля в межэлектродном пространстве, дальнейшие исследования по обработке аэрозолей не проводились.

Рисунок 1 - Эффективность плазменной инактивации спор и вегетативной формы В. зиЬНШ в суспензии (установка «Трубка»)

Чувствительность микроорганизмов разных таксономических групп и природной ассоциации микроорганизмов к холодной плазме

В ходе исследований выявлено, что микроорганизмы разных таксономических групп значительно различаются по чувствительности к холодной плазме (рис. 2).

Е. coli •■■■X—s. marcescens С. lypolithica ♦ М. flavescens -Ж- В. subtilis —Asp. niger (споры)

40 60 80

Время обработки, с

Рисунок 2 - Зависимость диаметра зоны поражения газона тест-культур от времени обработки холодной плазмой (установка «Плазменная струя»)

Установлено, что наиболее чувствительными к обработке холодной плазмой являются грамотрицательные бактерии (Е. coli, S. marcescens), меньшая чувствительность зарегистрирована для грамположительных бактерий

(В. эиЫШя, М. АтеэсепБ), дрожжей (С. 1уроШЫса) и спор грибов (А. niger), наиболее устойчивыми оказались споры грамположительных бактерий (В. яиЬНИя).

На следующем этапе исследований было изучено бактерицидное действие холодной плазмы на природную ассоциацию микроорганизмов сложного видового состава (аэробные гетеротрофы, кислотообразующие и сульфатвосстанавливающие бактерии). Ассоциация микроорганизмов была выделена из нефтепромысловых вод Альметьевского месторождения Татарстана (Родин и др., 2011). Характерной особенностью этой ассоциации, выращенной на купонах из различных материалов, являлась ее повышенная устойчивость (2-15 раз) к биоцидам различных классов по сравнению с планктонной формой микроорганизмов данной ассоциации. Характеристики ассоциации микроорганизмов, выращенной на купонах в течение 14 сут, представлены в табл. 2.

Таблица 2 - Характеристики природной ассоциации микроорганизмов, выращенной на купонах___

Параметры ассоциации Концентрация клеток (КОЕ/см2)

Плотность, г/см2 Высота, см Концентрация белка, г/см2 Аэробные гетеротрофы Сульфатвосстанавливающие бактерии Кислотообразующие бактерии

18,0-10"4 7,9-10~3 3,9-10^ до 5,3-Ю7 до 1,1-108 до 1,1-10'

Полученные данные показали высокую чувствительность природной ассоциации микроорганизмов к обработке холодной плазмой. Как видно на рис. 3, обработка в течение 30 с приводила к полной стерильности обрабатываемых объектов, а некоторые виды микроорганизмов, входящие в данную ассоциацию (сульфатвосстанавливающие бактерии), погибали уже после 20 с обработки струей плазмы.

Рисунок 3 - Динамика поверхностной плотности природной ассоциации микроорганизмов в ходе обработки холодной плазмой (установка «Плазменная струя»)

Влияние концентрации кислорода в составе плазмообразующего газа на эффективность инактивации микроорганизмов

При сравнении эффективности установок «Плазменная струя» и её модификаций («Куб», «Куб+02») было выявлено, что увеличение содержания кислорода в составе плазмообразующего газа усиливало бактерицидное действие холодной плазмы (табл. 3).

Таблица 3 - Эффективность обработки тест-полосок со спорами В. яиЬйШ (106 спор/полоску) холодной плазмой, генерируемой установкой «Плазменная струя» и ее модификациями «Куб» и «Куб-Ю2»__

Название установки Состав плазмообразующего газа Время обработки, мин

1 3 5 7 10 20 30

«Куб» N2(100 %) н/д н/д н/д н/д + + +

«Куб+02» N2(98 %)+02 (2 %) + + + + - - -

«Плазменная струя» N2(80 %)+ 02(20 %) (воздух) + + + - ■ - - -

Примечание: «-» - нет роста; «+» - есть рост; «н/д» - нет данных

Полная инактивация спор В. subtilis (106 спор/полоску) с помощью установки «Куб» с чистым азотом в качестве плазмообразующего газа не была достигнута даже после 30 мин обработки тест-полосок. После добавления кислорода в состав плазмообразующего газа (N2(98 %)+02(2 %)) споры В. subtilis погибали через 10 мин обработки («Куб+02»). Если в качестве плазмообразующего газа использовали воздух (N2(80 %)+02(20 %)), то для полной инактивации спор В. subtilis требовалось 7 мин обработки (табл. 3). Значительное влияние концентрации кислорода в составе плазмообразующего газа на бактерицидную эффективность может быть связано с более высокой химической активностью образующихся в плазме производных кислорода (ОН", О", Оз,) по сравнению с таковой производных азота (NO, N02, ONO2*).

Исследование воздействия холодной плазмы на клеточную оболочку Е. coli

Воздействие холодной плазмы на цитоплазматическую мембрану клеток

Е. coli

На следующем этапе работы исследовали воздействие холодной плазмы на оболочечный комплекс клеток Е. coli. Прежде всего, исследовали влияние плазмы на целостность цитоплазматической мембраны, о чем судили по выходу низкомолекулярных внутриклеточных веществ, имеющих максимум поглощения при ОП = 260 нм. Обработка суспензии Е. coli плазмой приводила к значительному увеличению оптической плотности супернатанта при данной длине волны (рис. 4). Этот факт объясняется нами нарушением целостности цитоплазматической мембраны в результате воздействия холодной плазмы. Таким образом, показано, что плазменная обработка приводила к нарушению целостности цитоплазматической мембраны клеток Е. coli.

Время обработки плазмой, мин

Рисунок 4 - Динамика выживаемости клеток Е. coli и оптической плотности супернатанта после обработки холодной плазмой (установка «Блэндер»)

Снижение прочности клеточной оболочки Е. coli при воздействии холодной

плазмой

Показано, что выживаемость микроорганизмов после обработки плазмой зависела от ионной силы среды (изотоническая или гипотоническая), в которую их помещали после обработки (рис. 5).

Ф изотои№*еская среда □ гипотоническая среда 1/10 А гипотоническая среда 1/100

у = -0.443Х* + 0.047Х + 7 R2 = 0.926

у = 0.067Х2 - 1.287х + 7.841 :2 = 0.992

ч у = -0.173Х1 - 0.479Х + 7.360

\ R2 = 0.931 -п-----

2 4 6 8

Время обработки плазмой, мин

Рисунок 5 - Выживаемость клеток Е. coli после обработки холодной плазмой в средах с разным осмотическим давлением (установка «Блэндер»)

Как известно, снижение осмотического давления среды приводит к повышению тургора клетки и увеличению внутриклеточного давления на клеточную оболочку. После первых 3-х мин обработки холодной плазмой отмечали сходную тенденцию снижения численности жизнеспособных клеток

как в гипотонических средах (1/10 и 1/100), так и в изотонической среде. Однако уже после 5 мин обработки холодной плазмой живых клеток в гипотонических средах не обнаруживали, в то время как в изотонической среде оставались живые клетки Е. coli.

Полученные данные указывают на то, что обработанные плазмой бактериальные клетки не выживали в условиях повышенного внутриклеточного давления, поскольку их клеточная стенка была повреждена холодной плазмой, и ее прочность была снижена. В связи с этим сделан вывод о том, что воздействие холодной плазмы на клетки микроорганизмов приводит к снижению прочности их клеточной стенки.

Восстановление микробными клетками Е. coli и В. subtilis повреждений, полученных в ходе плазменной обработки

Впервые показана возможность восстановления жизнеспособности клеток тест-культур Е. coli и В. subtilis после воздействия холодной плазмой. Полученные в ходе исследований данные свидетельствовали о том, что выживаемость микроорганизмов после обработки холодной плазмой в значительной мере зависела от состава среды, на которую производили высев (рис. 6). Отсутствие роста микроорганизмов на минимальной среде М9 и в то же время высокая численность микроорганизмов из этих же образцов, выросших на полноценной среде ГРМ, скорее всего, указывают на то, что полученные клеткой повреждения были репарированы в благоприятных условиях. Здесь под репарацией мы понимаем процесс восстановления повреждений, полученных клетками в ходе плазменной обработки.

среды ГРМ и М9 после обработки холодной плазмой (установка «Трубка»)

По нашему мнению, при выборе режимов обработки холодной плазмой необходимо учитывать возможность репарации клетками полученных повреждений. В частности, для того чтобы гарантировать полную инактивацию микроорганизмов в ходе обработки холодной плазмой разных объектов, можно

использовать принцип «избыточности обработки». Как было показано в дальнейших исследованиях, принцип «избыточности обработки» может быть с успехом использован для предотвращения восстановления жизнеспособности клеток микроорганизмов.

Так, в ходе обработки тест-полосок (6,2x105 КОЕ/полоску) Е. coli генератором плазмы «ДБР» в течение 30 с (экспозиция была на 50 % больше требуемой для полной инактивации микроорганизмов в данных условиях) добились полной стерильности тест-полосок. Рост микроорганизмов отсутствовал даже после семи суток культивирования тест-полосок в жидкой полноценной среде ГРМ.

Инактивация микроорганизмов генератором плазмы «ДБР»

Изучение механизмов и закономерностей процесса плазменной инактивации микроорганизмов позволило сформулировать ряд требований к перспективному генератору холодной плазмы. Во-первых, возможность применения воздуха в качестве плазмообразующего газа, поскольку он содержит кислород, увеличивающий эффективность инактивации микроорганизмов. Кроме того, использование воздуха экономически более выгодно, чем применение инертных газов (аргон, азот, гелий). Во-вторых, возможность использования генератора плазмы в режиме прямой и удаленной обработки объектов. Однако использование кислорода в плазмообразующих газах вызывает достаточно быстрое повреждение электродной системы. В этом отношении наиболее перспективной является установка на основе диэлектрического барьерного разряда, где электроды защищены от контакта с плазмообразующим газом слоем диэлектрика. Другим достоинством данной установки «ДБР» является возможность обработки объектов при температуре не выше 40 °С.

Изучение условий обработки, влияющих на эффективность инактивации микроорганизмов установкой «ДБР»

Исследования показали, что на бактерицидную эффективность установки «ДБР» оказывали влияние следующие факторы: мощность генерируемого разряда; величина межэлектродного зазора; тип обрабатываемого материала; форма и размер обрабатываемого объекта; видовая принадлежность микроорганизма; количество микроорганизмов на поверхности обрабатываемого объекта. Физиологическое состояние микробных клеток (фаза роста - логарифмическая или стационарная) не влияло на их чувствительность к обработке холодной плазмой. На основании полученных данных был подобран оптимальный режим обработки поверхности различных объектов при прямой и удалённой обработке генератором плазмы «ДБР» (режим мощности № 3; межэлектродный зазор 2 мм).

Сравнение эффективности обработки холодной плазмой с другими методами деконтаминации поверхности предметов

Сравнение бактерицидной эффективности прямой обработки холодной плазмой с некоторыми общепринятыми методами (ультрафиолетовое излучение (УФ), перекись водорода) показало, что эффективность инактивации

микроорганизмов Е. coli, Р. aeruginosa, Е. hirae, S. aureus и Mycobacterium sp. на поверхности объектов (=10б КОЕ на тест-полоске) при прямой обработке генератором плазмы «ДБР» была на два-три порядка выше, чем при обработке УФ (режим обработки в соответствии с Р 3.1.683-98) и 3 %-ой перекисью водорода (режим обработки в соответствии с МУ 3.5.2596-10) (табл. 4).

Таблица 4 - Чувствительность микроорганизмов к обработке холодной плазмой, ультрафиолетовому излучению и перекисью водорода_

№ Микроорганизмы Время, необходимое для полной инактивации ~106 КОЕ бактерий на тест-полоске, с

Холодная плазма Ультрафиолетовое излучение Н202

1 Е. coli 2 1200 180

2 Р. aeruginosa 1 1800 180

3 Е hirae 2 > 1800 >900

4 S aureus 3 > 1800 >3600

5 Mycobacterium sp. 15 1200 >3600

Деконтаминация поверхности предметов повседневного пользования

установкой «ДБР»

Следующим этапом наших исследований было изучение возможности применения холодной плазмы для деконтаминации поверхностей различных объектов повседневного пользования (мобильные телефоны, денежные купюры, кнопки компьютерной клавиатуры) в ходе удалённой обработки данных объектов установкой «ДБР».

Обработка холодной плазмой поверхности сотовых телефонов

Максимальная плотность микроорганизмов на поверхности взятых в исследование сотовых телефонов составляла (2,5±0,8)х102 КОЕ/см2 и была отмечена для аппарата, находящегося в длительной эксплуатации. После 30 с обработки поверхностей сотовых телефонов холодной плазмой они оказались стерильными. При этом никаких визуальных изменений обработанных плазмой поверхностей выявлено не было, телефоны продолжали нормально функционировать.

Обработка холодной плазмой поверхности кнопок компьютерной клавиатуры

Для полной инактивации клеток Р. aeruginosa (при исходной плотности (2,2±0,9)х104 КОЕ/кнопку) на поверхности кнопок клавиатуры потребовалось 60 с обработки холодной плазмой.

Обработка холодной плазмой поверхности денежных купюр

Плазменная обработка в течение 60 с приводила к полной инактивации клеток P. aeruginosa (при исходной плотности (1,7±1,0)хЮ5 КОЕ/см2) на поверхности денежных купюр. Таким образом, обработка образцов денежных купюр холодной плазмой оказалась эффективной, при этом какие-либо визуальные изменения поверхности образцов не обнаружены.

Деконтаминация овощей и фруктов установкой «ДБР»

Обработка холодной плазмой салата «китайская капуста»

Естественная обсеменённость листьев салата в среднем составляла (2,3±0,7)х103 КОЕ/см2. Плазменная обработка листьев салата холодной плазмой в течение 30 с позволила снизить количество микроорганизмов на поверхности с (2,3±0,7)х103 КОЕ/см2 до (1,1±0,7)х102 КОЕ/см2.

Обработка холодной плазмой ягод винограда

Использовали виноград сорта «Изабелла», выращенный в условиях дачного хозяйства без применения антимикробных средств. Численность естественной микрофлоры на поверхности ягод составляла (1,5±1,3)хЮ2 КОЕ/ягоду. В ходе плазменной обработки (30 с) количество микроорганизмов на поверхности ягод снизилась в среднем на порядок (до единичных клеток на ягоде).

Обработка холодной плазмой листьев белокочанной капусты

Образцы листьев капусты искусственно контаминировали непатогенной культурой Е. coli, моделируя возможную контаминацию патогенной кишечной палочкой. В случае, когда поверхность листьев контаминировали относительно высокими концентрациями бактерий (107 КОЕ/см2), обработка поверхности листьев холодной плазмой в течение 20 с позволила снизить концентрацию микроорганизмов с (3,0±1,5)х107 до (8,7±3,9)х104 КОЕ/см2. При более низкой поверхностной плотности бактерий (2,9±1,1)х105 КОЕ/см2, обработка холодной плазмой в течение 30 с вызывала полную гибель клеток Е. coli на поверхности листьев капусты. Необходимо отметить, что визуальный осмотр поверхности обработанных образцов фруктов и овощей не выявил никаких видимых изменений их поверхности. Также нами не наблюдалось изменения товарного вида обработанных продуктов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о перспективности применения низкотемпературной плазмы для биодеконта-минации фруктов, овощей и других пищевых продуктов.

Заключение

В результате проведенных исследований получены новые данные о чувствительности микроорганизмов разных таксономических групп к бактерицидному действию холодной плазмы. Сравнение эффективности инактивации микроорганизмов с использованием восьми генераторов плазмы разных типов позволило нам выбрать наиболее перспективный генератор холодной плазмы на основе диэлектрического барьерного разряда («ДБР»), Для выбранного генератора оптимизированы условия прямой (в зоне разряда) и

удалённой (вне зоны разряда) обработки поверхностей объектов холодной плазмой. Обнаружена высокая эффективность деконтаминации поверхностей объектов повседневного пользования (электронные приборы и денежные купюры) холодной плазмой, генерируемой установкой «ДБР», а также показана принципиальная возможность применения холодной плазмы для инактивации микроорганизмов на поверхности пищевых продуктов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что деконтаминация поверхностей объектов является более эффективной (снижение количества спор В. subtilis на шесть порядков за 7 мин обработки), чем деконтаминация жидкостей (снижение количества спор В. subtilis на один порядок за 10 мин) при сравнении эффективности восьми генераторов холодной плазмы.

2. Оптимизированы условия обработки холодной плазмой поверхности объектов для перспективного генератора плазмы на основе диэлектрического барьерного разряда (мощность разряда, величина межэлектродного зазора).

3. Наиболее чувствительными к обработке холодной плазмой являлись грамотрицательные бактерии Е. coli, S. marcescens, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. hirae, меньшей чувствительностью обладали грамположительные бактерии В. subtilis, S. aureus, Mycobacterium spp., дрожжи С. lypolithica и споры грибов

A. niger, наиболее устойчивыми оказались споры грамположительных бактерий

B. subtilis. Показана высокая чувствительность природной ассоциации микроорганизмов, выделенной из нефтепромысловых вод, к обработке холодной плазмой; полная инактивация микроорганизмов происходила в течение 30 с обработки.

4. Впервые показано, что обработка клеток Е. coli холодной плазмой приводила к снижению прочности клеточной оболочки, вследствие чего клетки Е. coli погибали в средах с пониженным осмотическим давлением. Выявлено нарушение целостности цитоплазматической мембраны клеток Е. coli холодной плазмой, генерируемой установкой «Блэндер».

5. Показано, что увеличение концентрации кислорода в составе плазмо-образующего газа с 0 % до 20 % повышало эффективность инактивации спор В. subtilis более чем в три раза. Это позволяет с высокой эффективностью использовать в качестве плазмообразующего газа воздух, что значительно удешевляет применение генераторов холодной плазмы.

6. Показано что для полной инактивации микроорганизмов на поверхности объектов повседневного пользования (электронные приборы, денежные купюры) генератором плазмы «ДБР» требовалось от 20 до 60 с. Выявлено снижение количества микроорганизмов на поверхности продуктов питания (капуста, салат, виноград) на 1-5 порядков за 30 с обработки холодной плазмой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

а) статьи в рецензируемых научных журналах

1. Akishev, Yu. Atmospheric pressure non-thermal plasma sterilization of microorganisms in liquids and on the surfaces / Yu. Akishev, M. Grushin, V. Karalnik, N. Trushkin, V. Kholodenko, V. Chugunov, E. Kobzev, N. Zhirkova, I. Irkhina, G. Kireev // Pure and Applied Chemistry. - 2008. - Vol. 80. - № 9. -P. 1953-1969. (13 цитирований по данным Web of Science на 16.10.2013 г.).

2. Кобзев, E.H. Воздействие холодной плазмы на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану Е. coli / E.H. Кобзев, Г.В. Киреев, Ю.А. Ракицкий, И.И. Мартовецкая, В.А. Чугунов, В.П. Холоденко, М.В. Храмов, Ю.С. Акишев, Н.И. Трушкин, М.Е. Грушин // Прикл. биохим. микробиол. -2013. -Том 49. - № 2. - С. 164-170.

б) статья в книге

3. Akishev, Yu. Inactivation of microorganisms in model biofilms by an atmospheric pressure pulsed non-thermal plasma / Yu. Akishev, N. Trushkin, M. Grushin, A. Petryakov, V. Karal'nik, E. Kobzev, V. Kholodenko, V. Chugunov, G. Kireev, Yu. Rakitsky and I. Irkhina // NATO Science for Peace and Security series A: Chemistry and Biology // pub. Springer. - 2012. - P. 149-161. (1 цитирование по данным Web of Science на 16.10.2013 г.).

в) методические рекомендации

4. Разработка и совершенствование различных аппаратов для стерилизации с помощью холодной плазмы, а также оптимизация условий и режимов их практического применения: методические рекомендации / Кобзев Е.Н., Чугунов В.А., Холоденко В.П., Киреев Г.В., Ракицкий Ю.А. -Оболенск: ФБУН ГНЦ ПМБ, 2010. - 16 с.

5. Стерилизация продуктов питания низкотемпературной плазмой: методические рекомендации / Кобзев Е.Н., Чугунов В.А., Мартовецкая И.И., Киреев Г.В., Ракицкий Ю.А. - Оболенск: ФБУН ГНЦ ПМБ, 2012. - 12 с.

6. Стерилизация упаковочного материала и продуктов питания низкотемпературной плазмой с целью увеличения сроков хранения / Кобзев Е.Н., Чугунов В.А., Киреев Г.В., Ракицкий Ю.А., Ермоленко З.М, Тедиков В.М. - Оболенск: ФБУН ГНЦ ПМБ, 2013. - 15 с.

г) тезисы научных конференций

7. Kholodenko, V.P. Study of plasmochemical method to inactivate microorganisms of different groups / V.P. Kholodenko, V.A Chugunov, E.N. Kobzev, N.A. Zhirkova, I.A. Irkhina, V.M. Tedikov, I.I. Martovetskaya, G.V. Kireev, I.A. Dyatlov // Book of Abstracts 11th Annual Biological Conference of the European BioSafety Association. - Флоренция, Италия, 2008. - P. 71.

8. Kholodenko, V.P. Low temperature plasma as a perspective approach to microbial inactivation / V.P. Kholodenko, V.A. Chugunov, E.N. Kobzev, N.A. Zhirkova, I.A. Irkhina, V.M. Tedikov, I.I. Martovetskaya, G.V. Kireev, I.A. Dyatlov // Proceedings 51th Annual Biological Safety Conference. - Рино,

США, 2008.

9. Холоденко, В.П. Инактивация микроорганизмов различных систематических групп с помощью холодной плазмы / В.П. Холоденко,

B.А. Чугунов, E.H. Кобзев, H.A. Жиркова, В.М. Тедиков, Г.В. Киреев // Вестник российской военно-медицинской академии. — № 3(23). - прил. 2. -Ч. И.-2008.-С. 313.

10.Киреев, Г.В. Инактивация микроорганизмов различных систематических групп низкотемпературной плазмой / Г.В. Киреев, E.H. Кобзев // Биологическая безопасность в современном мире: материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - Оболенск, 2009. - С. 259-260.

11. Kholodenko, V.P. Cold plasma and biosafety / V.P. Kholodenko, V.A. Chugunov, E.N. Kobzev, G.V. Kireev, I.A. Dyatlov // Book of Abstracts 12th Annual Conference of the European Biosafety Association. - Сольна, Швеция, 2009.-P. 96.

12. Киреев, Г.В. Воздействие низкотемпературной плазмы на микроорганизмы модельных и природных биоплёнок / Г.В. Киреев, E.H. Кобзев // Материалы 13-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. -Пущино, 2009.-С. 165.

13. Кобзев, E.H. Инактивация микроорганизмов в модельных и природных биопленках низкотемпературной плазмой при атмосферном давлении / E.H. Кобзев, В.П. Холоденко, В.А. Чугунов, H.A. Жиркова, И.А. Ирхина, Г.В. Киреев, Ю.С. Акишев, Н.И. Трушкин, М.Е. Грушин, A.B. Петряков // Медицинская физика - 2010: сборник материалов Ill-го Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии. - Москва, 2010. - Т. 4. - С. 162-164.

14. Киреев, Г.В. Использование низкотемпературной плазмы на основе барьерного разряда для дезинфекции различных объектов / Г.В. Киреев, E.H. Кобзев, Ю.А. Ракицкий, В.А. Чугунов, В.П. Холоденко, Ю.С. Акишев, Н.И. Трушкин, М.Е. Грушин // Актуальные проблемы общей и военной гигиены: материалы Всероссийской научно-практической конференции. -Санкт-Петербург, 2011. - С. 94-95.

15. Kobzev, Е. Inactivation of microorganisms in model biofílms by atmospheric pressure non-thermal plasma / E. Kobzev, V. Kholodenko, V. Chugunov, G. Kireev, Yu. Rakitsky, I. Irkhina, Yu. Akishev, N. Trushkin, M. Grushin, A. Petryakov // NATO Science Advanced Research Workshop on Plasma for bio-decontamination, medicine and food security: Book of Abstracts. -Ясна, Словакия, 2011. - P. 81-82.

16. Киреев, Г.В. Воздействие холодной плазмы на цитоплазматическую мембрану К coli / Г.В. Киреев, E.H. Кобзев, Ю.А. Ракицкий, В.А. Чугунов И Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием. - Пермь, 2012. —

C. 279-282.

17. Киреев, Г.В. Сравнительная оценка эффективности бактерицидного действия различных генераторов низкотемпературной плазмы / Г.В. Киреев, Ю.А. Ракицкий, E.H. Кобзев, В.А. Чугунов, Ю.С. Акишев, Н.И. Трушкин,

М.Е. Грушин // Биотехнология - перспективы развития: материалы П-ой Международной научно-практической конференции. - Уфа, 2012. - С. 8-10.

18. Киреев, Г.В. Биодеконтаминация свежих овощей и фруктов низкотемпературной плазмой / Г.В. Киреев, Ю.А. Ракицкий, E.H. Кобзев, В.А. Чугунов, Ю.С. Акишев, Н.И. Трушкин, М.Е. Грушин // Актуальные проблемы профилактической медицины, среды обитания и здоровья населения: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. -Уфа, 2013.-С. 292-295.

Подписано в печать:

31.10.2013

Заказ № 9000 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru