Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo

Сысолятина, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo"

На правах рукописи

Сысолятина Елена Владимировна

БАКТЕРИЦИДНЫЕ СВОЙСТВА НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЫ IN VITRO И IN VIVO

03.02.03. - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Москва-2013

005539428

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук

Ермолаева Светлана Александровна

Официальные оппоненты

Белый Юрий Федорович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Холоденко Василий Петрович - доктор биологических наук, главный специалист по научно-образовательным вопросам биобезопасности ФГБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «29» ноября 2013 года в 11 час. на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г.Москва, ул. Гамалеи, д.18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Автореферат разослан «29» октября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Инфекционные заболевания продолжают играть важнейшую роль в структуре патологических состояний здоровья человека, хотя в инфекционной заболеваемости в последние годы наблюдается сдвиг в сторону увеличения доли хронических инфекционных процессов. С одной стороны, это связано со старением популяции, особенно в развитых странах, высокой распространенностью иммунодефицитов различной этиологии, стертым течением ряда заболеваний и отсутствием своевременного адекватного лечения (Руководство по медицинской микробиологии. Под ред. Лабинской А.С., 2013). С другой стороны, за десятилетия использования антибиотиков многие микроорганизмы приобрели устойчивость к этим препаратам, а способность бактерий образовывать биопленки, в том числе на раневых поверхностях и изделиях медицинского назначения, в которых они намного устойчивее к любым воздействиям, еще более усложняет задачу по их уничтожению (Романова Ю.М. и др., 2011, Пушкарева В.И. и др., 2011). В связи с этим остается актуальным поиск новых методов, обладающих бактерицидным эффектом (Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2005).

Физико-химические методы воздействия давно и успешно применяются в медицине. Хорошо известные кварцевые лампы, испускающие ультрафиолетовый свет, используются для стерилизации помещений и обработки органов ротоглотки, являются весьма эффективными, однако чрезмерные дозы ультрафиолета опасны для человека, т.к. увеличивают вероятность развития злокачественных опухолей (информационный бюллетень ВОЗ, 2009). Другим широко применяемым методом является использование озона, обладающего высокой бактерицидной активностью, однако в высоких концентрациях озон токсичен для человека. Использование электромагнитных полей стимулирует заживление, снимает воспаление (Kubasova Т. et al., 1995), однако антибактериальным действием не обладает. Таким образом, используемые методы физико-химического воздействия, обладающие микробицидным эффектом, в высоких дозах токсичны для человека, а неопасные иммуностимулирующие физические методы не обладают антибактериальной активностью (Улащик B.C., 2006).

Одним из сравнительно новых физико-химических методов, объединяющим в себе одновременно и действие УФ, и обработку поверхностей озоном и оксидом азота, и воздействие электромагнитам полем, является неравновесная низкотемпературная плазма (НТП) (Akyshev Y. et al., 2008, Laroussi M. et al., 2012). При этом НТП лишена основного недостатка других методов физического воздействия - высоких концентраций токсических компонентов.

НТП - это поток газа, ионизированного с помощью электромагнитного излучения при атмосферном давлении и температуре окружающей среды. Основной вклад в бактерицидную активность НТП вносят ионы, свободные радикалы и возбужденные молекулы, а также ультрафиолет (Morfill G. et al., 2009). Применение холодной плазмы в медицине связано с ее нетермическими эффектами, изучение которых в приложении к медицинским мишеням насчитывает порядка десяти лет. До настоящего времени являются предметом изучения эффекты

НТП на различные биологические мишени, а также значение компонентов НТТТ и синергизма между ними в этих эффектах. До конца неясны сферы применимости НТП. Так, был показан микробицидный эффект НТП на ряде условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (Lee et al., 2006; Venencia et al., 2009), однако до начала наших исследований задачи сравнения чувствительности к НТП разных штаммов одного вида микроорганизмов не ставилось. Первая работа, продемонстрировавшая чувствительность к НТП бактерий в составе биопленок, была опубликована в 2009 г. (Joshi et al., 2009), однако детали процесса уничтожения бактерий в биопленках не были изучены. Низкие концентрации токсических компонентов (УФ, озона и свободных радикалов) позволяют предположить возможность применения НТП для непосредственной декон-таминации биологических объектов, в том числе кожных покровов и ран (Isbary et al., 2010), однако информации, дающей возможность оценить безопасность воздействия НТП в отношении эукариотических клеток и макроорганизма в целом, было недостаточно.

Для получения более полной картины воздействия НТП на биологические объекты было необходимо провести комплексные исследования, сравнивающие эффекты различных источников на одни и те же модели, поскольку НТП, генерируемая разными источниками, сильно отличается по своим характеристикам. В целом, можно выделить два типа источников НТП: прямого и непрямого действия, отличающихся по наличию/отсутствию УФ, концентрации незаряженных активных частиц, концентрации заряженных атомов и ионов, воздействию электромагнитными полями (Friedman et al., 2009). Биологические эффекты для источников прямого и непрямого действия значительно разнятся, однако механизмы, лежащие в основе такой разницы, до конца не поняты.

В связи с вышеизложенным, в данной работе была поставлена следующая цель: оценить бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы прямого и непрямого действия в условиях in vitro, а также на моделях бактериальных биопленок и инфицированных ран.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• определить в условиях in vitro бактерицидную активность низкотемпературной плазмы (НТП) прямого и непрямого действия в отношении спектра патогенных микроорганизмов, вызывающих хронические инфекционные заболевания;

•определить бактерицидный эффект НТП на бактерии, находящиеся в биопленках;

• определить возможность использования НТП для воздействия на внутриклеточных инфекционных агентов на модели Chlamydia trachomatis;

• оценить токсичность плазменного воздействия на эукариотические клетки, а также оценить изменения в физиологии эукариотических клеток;

•в эксперименте на лабораторных животных определить эффективность применения НТП как средства терапевтического воздействия на инфицированные раны;

•установить вклад отдельных компонентов плазмы h их комбинаций в бактерицидный эффект.

Научная новизна:

В представленной работе впервые:

• Установлены различия в чувствительности к низкотемпературной плазме для микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам, и выявлены различия в чувствительности к НТП между различными штаммами, принадлежащими к одному виду;

• Показано, что бактерицидный эффект НТП на бактерий, находящихся в составе биопленок, зависит от толщины биопленки и уменьшается по мере глубины залегания бактерий;

• Установлено, что НТП обладает бактерицидным действием в отношении внутриклеточного паразита С. trachomatis на разных этапах его жизненного цикла, воздействуя как на метаболически неактивные элементарные тельца, так и делящиеся ретикулярные тельца внутри хламидийных включений, при этом НТП не оказывает выраженного токсического эффекта на эукариотические клетки-хозяева;

• Показано на модели инфицированных ран лабораторных мышей, что однократная обработка низкотемпературной плазмой снижает обсемененность раневых поверхностей в 10-100 раз, а курс из 2-3 обработок ускоряет заживление ран;

• Разделены компоненты плазменного факела и экспериментально доказан синергизм их действия.

Практическое значение работы:

На основании полученных в ходе выполнения диссертационной работы результатов написаны и одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» методические рекомендации:

1 - «Оценка физических воздействий (электромагнитного излучения, низкотемпературной плазмы) на жизнеспособность внутриклеточных паразитов и клетки-хозяина» (протокол №15 от 14 июля 2011г).

2 — «Применение неизотермической «холодной» плазмы атмосферного давления в отношении патогенных бактерий» (протокол №17 от 27 октября 2011 г).

применение для деконтаминации биологических тканей; принципы воздействия низкотемпературной газовой плазмы на биологические структуры; использование физических подходов в терапии инфекционных заболеваний и контроле распространения инфекционных агентов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Низкотемпературная плазма обладает неспецифическим бактерицидным действием в отношении патогенных бактерий, в том числе, в отношении бактерий, входящих в состав биопленок.

2. Воздействие низкотемпературной плазмы на внеклеточные и внутриклеточные формы С. trachomatis нарушает способность облигатного паразита инфицировать эукариотические клетки и прерывает нормальное течение цикла внутриклеточного размножения.

3. Низкотемпературная плазма не вызывает некроза эукариотических клеток in vitro

4. Низкотемпературная плазма позволяет деконтаминировать раневые поверхности и ускоряет заживление ран на модели инфицированных ран лабораторных мышей.

5. Бактерицидный эффект плазмы обусловлен синергизмом действия её компонентов (УФ, заряженных и нейтральных частиц, электрических полей).

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на международных конференциях: 3d International Conference for Plasma Medicine (ICPM-3, Грайсвальд, Германия, 2010), NATO Science Advanced Research Workshop on Plasma for Bio-Decontamination, Medicine and Food security (Ясно, Словакия, 2011), 39th International Conference on Plasma Science (Эдинбург, Великобритания, 2012), 1st and 2nd Young Professional Workshops on Plasma Medicine (Германия, 2012, 2013), Plasma Medicine Workshop (Ринберг, Германия, 2010,2011, 2012).

Апробация работы состоялась 17.10.2013 на научной конференции отдела природноочаговых инфекций и отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 2 из них в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК, а также 4 тезисов. Результаты использовались для написания главы в книге Plasma Decontamination, Medicine and Food Security (Springer, 2012).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, главу результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, включающий 22 работы отечественных и 76 зарубежных авторов. Работа содержит 30 рисунков и 6 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и культуры клеток. Объектами исследований служили штаммы бактериальных культур из коллекции лаборатории молекулярных основ эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ: Pseudomonas aeruginosa РаЮЗ, Ра12, Ра14, Staphylococcus aureus ATCC Sa 6538 P, Sa78, Sa85, Burkholderia cenocepacia BC46, Staphylococcus epidermidis SEI4990, Streptococcus pyogenes Str861, Enterococcus faescium Ef42 и лаборатории экологии возбудителей инфекций: Escherichia coli JM109, Listeria monocytogenes EGD.

Бактерии рутинно культивировали на чашках с кровяным агаром при 28°С (P.aeruginosa, В.cenocepacia) или 37°С (другие виды). Для получения ночной культуры все микроорганизмы, кроме Escherichia coli JM109, культивировали в жидкой питательной среде BHI (Brain Heart Infusion, Difco). Для выращивания E.coli использовали LB (Luria — Bertani Broth, Miller).

Биопленки, сформированные грамотрицательными бактериями В.cenocepacia штамм Вс46 или P.aeruginosa штамм РА 103, выращивали на поверхности стекла, вертикально опущенного в юоветы с питательной средой LB(Luria - Bertani Broth, Miller) при 28°C в течение 72 часов без шутелирования (Каменская A.A., автореф.дис., 2005)

Для качественной оценки биопленки окрашивали с использованием тест-системы Live/Dead® (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Цифровые изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 200М LSM 510 МЕТА), как описано ранее (Kaminskaya et al., 2007).

Эукариотические клетки линий McCoy и НСТ-116 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FCS HiClone, 2 мМ глютамина, 4,0 мг / мл гентами-цина и 5,0 мг / мл амфотерицина в 5% СОг атмосфере.

Источники низкотемпературной плазмы. В работе использовали 3 различных источника низкотемпературной плазмы, предоставленные разработчиками. В том числе, были использованы два источника плазмы непрямого воздействия: СВЧ-генератор Micropiaster (Adteko Inc, Япония), сегнетоэлектриче-ский реактор (ОИВТ РАН), и источник плазмы прямого действия - коронный разряд (ГНЦ РФ ТРИНИТИ). Их характеристики приведены в Табл.1.

Табл. 1. Характеристики источников НТП

СВЧ-генератор Сегнето- электрический генератор Источник коронного разряда

Тип плазмы непрямого воздействия непрямого воздействия прямого воздействия

Газ Аргон Воздух Воздух

Тип разряда СВЧ ВВП (диэлектрический барьерный разряд) Коронный разряд

Время экспозиции 2 мин, 5 мин, 10 мин 5 мин, 10 мин Юс, 30с, 45с, 90с, 2 мин, 5 мин

Температура на поверхности образца 36°-40°С Равна температуре окружающей среды Равна температуре окружающей среды

Расстояние до поверхности образца 20 мм, 50 мм 5 мм, 20 мм, 50 мм 15мм

Активные компоненты УФ, Заряженные и метастабильные частицы, Нейтральные активные частицы Нейтральные активные частицы УФ, Заряженные и метастабильные частицы, Нейтральные активные частицы Электрическое Ьоле

Концентрация нейтральных активных частиц: N0 < 1 ррт Оз >1,2 ррт N0 ~ 350 ррт Оз>1,2 ррт Положительная корона: N0 -ЗООррт 0з_50ррт Отрицательная корона N0 ~ 50ррт Оз_ Юррт

Концентрация заряженных частиц 105 - 106ррт Нет 1011 — 10|2ррт

Условия выращивания и методы учета внутриклеточных бактерий.

С. trachomatis выращивали в клетках линии McCoy по стандартной методике: 70-80 % монослой, выращеный на покровных стеклах в 24-луночных планшетах, заражали хламидийными ЭТ с множественностью заражения 2:1 и культивировали при 37°С в течение 48 ч.

Для визуализации внутриклеточной хламидийной инфекции клетки фиксировали и окрашивали моноклональными антителами, коньюгированными с FITC. Клетки, содержащие флуоресцирующие включения, визуализировались с помощью флуоресцентного микроскопа.

Культивирование инфузорий и условия их обработки плазмой. Аксе-ническую культуру свободноживущих инфузорий Tetrahymena pyriformis

штамм GL (коллекция ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи») в концентрации 103 особей/мл облучали аргоновой плазмой в течение 2 и 5 мин. Подсчет клеток производили по общепринятой методике в камере Горяева, для изучения морфологии использовали флуоресцентную и микроскопию и фазовый контраст.

Условия воздействия НТП на микроорганизмы in vitro. Для бактерицидной обработки серийные разведения ночной культуры бактерий в концентрациях 1(Г, 1(Г, 105 КОЕ/мл высевали в объеме 30 мкл на чашки Петри диаметром 36 мм с твердой питательной средой ГРМ-1 (Оболенск) и облучали в течение 10-600с. Расстояние от поверхности плазменной горелки до образца составляло 20мм в случае использования СВЧ-генератора, 5мм для сегнетоэлек-трического источника и 15мм для коронного разряда

Для оценки бактерицидного эффекта НТП на внеклеточные неактивные формы хламидий суспензию ЭТ, расположенную слоем 1 мм на поверхности пластиковой чашки, обрабатывали плазмой СВЧ-генератора, как указано выше. Обработанные ЭТ использовали для инфекции свежих клеток McCoy. В качестве контроля использовали модель хламидийной инфекции с необработанными ЭТ.

Условия воздействия НТП на биопленки. Стекла со сформированными на них биопленками помещали на агар и подвергали воздействию аргоновой плазмы в течение 2 или 5 мин, после чего инкубировали при комнатной температуре 2 ч в стерильном PBS и окрашивали витальным красителем Life/Dead по инструкции производителя.

Для количественной оценки бактерицидного эффекта сформированные на стекле биопленки соскребали стерильным скальпелем, помещали в PBS и частично разрушали пипетированием. Суспензию наносили на поверхность стерильной чашки Петри слоем в 1 мм и подвергали воздействию плазмой в течение 5 мин, , затем дисперсировали интенсивным перемешиванием в ультразвуковом измельчителе, серийные десятикратные разведения высевали на кровяной агар. Разрушение биопленок контролировалось методом визуализации бактерий с помощью окрашивания по Граму.

Условия воздействия НТП на эукариотические клетки, в том числе инфицированные

Монослой клеток, покрытый слоем среды около 1 мм, обрабатывали НТП, производимой СВЧ-генератором, после чего среду заменяли на свежую в стандартном объеме. Количество жизнеспособных клеток определяли через 24 часа окрашиванием метиленовым синим. Для оценки эффекта плазмы на внутриклеточных хламидий инфицированные клетки обрабатывали НТП, производимой СВЧ-источником, через 24 часа после инфекции, клетки инкубировали при 37°С в течение 24 ч, затем визуализировали бактерий с помощью флуоресцентной микроскопии.

Моделирование раневой инфекции и условия обработки НТП раневых поверхностей. Использовали модель раневой инфекции мышей линии BALB/c. За 3 и 1 день до нанесения ран животным вводили циклофосфамид внутри-брюшинно для развития Т- и В-клеточной иммуносупрессии. Раны инфицировали S.aureus 78 в концентрации 108 КОЕ/рану. Через 72ч раны обрабатывали

разными типами плазмы (аргоновой и воздушной), а также их комбинацией. До и после обработки с поверхности ран делали смывы стерильным ватным тампоном. Серийные разведения рассевали на чашки с селективной питательной средой. Для оценки бактерицидного эффекта НТП и скорости заживления ран были использованы мыши линии ВАЬВ/с (самки, 16-18 граммов).

Для оценки заживляющего эффекта в группах проводили измерение площади раневой поверхности на 1,2,3,4,5,6,7,8,12 и 14 день начала эксперимента. Для этого делали фотоснимки ран в едином разрешении и с единым фокусным расстоянием над объектом. По полученным фотографиям был произведен подсчет площади раневой поверхности.

Животные были разделены на 4 группы по 10 штук в каждой. Первая группа была контрольной. Во второй группе животные подвергались 10-минутной обработке сегнетоэлектрическим генератором, расстояние до поверхности раны составляло 5 мм. Животных в третьей группе помещали под плазменный факел СВЧ-генератора на расстояние 2см, время экспозиции составляло 5 мин. В четвертой группе проводили комбинированную обработку раневой поверхности: вначале с использованием СВЧ-генератора в течение 5 мин, затем сегнетоэлектрического реактора в течение 10 мин. Сеансы обработки проводили в течение 7 дней ежедневно.

Способы изучения эффекта отдельных компонентов НТП, участвующих в инактивации микроорганизмов.

СВЧ-источник аргоновой плазмы. Для оценки вклада УФ образец накрывали стеклом из фтористого магния пропускающего свет с дли-

ной волны от 160 нм до 3 мкм, в том числе УФ-А, УФ-В и УФ-С. Таким образом обеспечивалось ультрафиолетовое облучение образца и отсекался поток заряженных частиц, входящих в состав плазменного факела. Контролем служили образцы, обработанные аргоновой плазмой и не подвергнувшиеся ее воздействию.

Для оценки вклада заряженных и метастабильных частиц аргона в общий бактерицидный эффект НТП использовали специальную насадку, позволяющую предотвратить попадание воздушной смеси в поток плазменного факела и на поверхность образца. Таким образом, как минимум, частично, исключалось образование N0 и озона, образующихся при смешивании потока плазмы с окружающим воздухом.

Коронный разряд. Экспериментальная установка была сконструирована таким образом, что заряженные частицы действовали только на область поверхности агара, расположенную над электродом. Таким образом, область над электродом подвергалась воздействию заряженных частиц и электрического поля (Е), а также незаряженных частиц (Я) и УФ (ЦУ), в то время как область вне электрода подвергалась воздействию только незаряженных частиц (Я) и УФ (СУ). Инактивация микроорганизмов проводилась в положительной и отрицательной короне в воздухе атмосферного давления в двух режимах. В первом из них камера изолировалась от окружающего воздуха. В этом случае незаряженные активные агенты (радикалы, атомы, метастабильные молекулы, и др.), создаваемые короной, распространялись по всей камере и равномерно обрабаты-

вали всю поверхность агара. Бактерии, расположенные над электродом, подвергались воздействию заряженных частиц и электрического поля, а также незаряженных частиц и УФ (E+R+UV), в то время как бактерии на агаре вне электрода подвергались воздействию только незаряженных частиц и УФ (R+UV). Во втором режиме камера непрерывно продувалась окружающим воздухом, всасываемым через отверстия в боковой стенке. В этом случае все нейтральные активные агенты выносились из камеры и бактерии на агаре обрабатывались только заряженными частицами, электрическим полем и УФ излучением. В этом случае бактерии, расположенные над электродом, подвергались воздействию заряженных частиц и электрического поля, а также УФ (E+UV), в то время как бактерии на агаре вне электрода подвергались воздействию только УФ (UV). Таким образом, выбранная совмещенная конструкция электрод + агар в сочетании с системой продувки камеры позволяла реализовывать на разных участках агара разные комбинации агентов инактивации: UV, UV+E, UV+R, R, UV+E+R, что дает возможность оценить вклад разных компонентов в бактерицидный эффект и установить наличие синергизма.

Статистические методы

Все in vitro эксперименты проводили в дубликате и повторяли не менее Зх раз. Средние значения и стандартные ошибки подсчитывались в программе Excel, входящей в программное обеспечение Microsoft Office 2007. Для оценки статистической значимости использовали Ttest, включенный в то же программное обеспечение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение индивидуальной чувствительности патогенных бактерий к НТП

СВЧ-генератор аргоновой плазмы. Работы по изучению бактерицидного эффекта аргоновой плазмы in vitro проводили совместно с лабораторией молекулярных основ эпидемиологии госпитальных инфекций. Эффективность инактивации изучалась при разном времени экспозиции: от 1 до 10 мин. Все протестированные штаммы грамотрицательных бактерий P. aeruginosa, Е. coli и В. cenocepacia обладали сходной чувствительностью к воздействию аргоновой плазмы. Заметный бактерицидный эффект наблюдался после 2-хминутной обработки: не более 1% от начальной концентрации 105 КОЕ были способны формировать колонии (табл.2). После пятиминутного воздействия плазмой выживших микроорганизмов не было. Чувствительность грамположительных бактерий различалась, в том числе, различные штаммы S.aureus продемонстрировали различную устойчивость к НТП. Клинический изолят S. aureus GIM78 был столь же чувствителен, как грамотрицательные бактерии, а штамм 6538 S. aureus наряду с S. pyogenes были наиболее устойчивы.

Таблица 2 - Бактерицидный эффект аргоновой плазмы (р<0.05)

Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Streptococ cus spp.

Штамм Pa 103 Pa 12 Pa 14 Sa 85 Sa 78 Sa 6538 Se 14990 Str 861

контроль 10s 105 105 105 105 105 105 105

2 мин (8±2) xlO2 (1.3±0.5) xlO3 (2.6±0.8 ) xlO3 (8±1) xlO3 (5±2) xlO2 (2.8±0.1) xlO4 (9±2) xlO3 (6.0±0.5)x 104

5 мин 0 0 0 (9±2) xlO 0 (6.3±0.6) xlO3 (8±2) xlO2 (3.6±0.4)x 104

10 мин 0 0 0 0 0 (9± 2) xlO 0 (5±1) xlO

Сегнетоэлектрический генератор. Максимальный бактерицидный эффект при обработке бактерий воздушной плазмой был достигнут после 5 мин воздействия, а увеличение длительности экспозиции до 10 и 20 мин не усиливало антибактериального действия (табл.3) Падение бактериальной обсемененности составило от 24 до 813 раз, при этом чувствительность не зависела от грам-принадлежности бактерий. Скорее, она носила штаммоспецифический характер.

Таблица 3 - Бактерицидный эффект воздушной плазмы, производимой

сегнетоэлектрическим реактором

Штамм Контроль, КОЕ/мл После обработки в течение 5 мин, КОЕ/мл Относительное уменьшение числа живых клеток (раз) (*- р<0.05)

P. aeruginosa 103 105 (8±2)х102 125

S. aureus 78 10s (4.2±0.4) хЮ3 24*

S. aureus 6538 105 (1.1 ±0.2) хЮ3 84*

L. monocytogenes EGDe 105 (4±1)х102 228*

E. coli JM109 105 (1.2±0.2)х 102 813*

Коронный разряд. Коронный разряд показал высокую эффективность: в частности, полная инактивация 10б КОЕ/мл S. aureus 78 как положительным,

так и отрицательным коронным разрядом, была достигнута за 10с обработки (табл.4). P. aeruginosa 103 оказался более устойчивым: в положительной короне полная инактивация 106 КОЕ/мл наблюдалась при времени экспозиции 45 с, а в отрицательной короне - через 2 мин.

Таблица 4 - Бактерицидный эффект коронного разряда

P. aeruginosa 103 S. aureus 78

+ корона, КОЕ/мл корона, КОЕ/мл + корона, КОЕ/мл корона, КОЕ/мл

контроль Ос 6 10 6 10

опыт Юс (2,3±0,4)х10 (3,0±0,7)х10 0 0

30 с (1,1±0,3)х10 (1,0±0,06) 4 х10 0 0

45 с 0 (4±1) х10 0 0

90 с 0 (2,2±0,4)х10 0 0

120 с 0 0 0 0

300с 0 0 0 0

Таким образом, коронный разряд значительно превосходил по бактерицидной эффективности источники непрямого воздействия: СВЧ-генератор аргоновой плазмы и сегнетоэлектрический реактор. Это, по-видимому, связано с тем, что на обрабатываемую поверхность одновременно воздействуют все поражающие факторы НТП, включая высокие концентрации заряженных частиц и электрическое поле. Для доказательства этого предположения был оценен вклад отдельных компонентов (см. ниже). Тем не менее, несмотря на максимальную эффективность, коронный разряд может быть применен для стерилизации абиотических поверхностей, но не может быть использован для обработки живых тканей, так как при его действии через обрабатываемый объект будет протекать электрический ток. Два других источника могут быть применены для воздействия на живые объекты, так как принцип их действия основан на использовании потока активных частиц и УФ, без воздействия потоком заряженных частиц и электрическим полем. При этом СВЧ-генератор обладал более сильным стерилизующим эффектом по сравнению с сегнетоэлектрическим реактором, в связи с чем именно этот источник был использован в дальнейших экспериментах для изучения бактерицидного эффекта в отношении биопленок.

2. Изучение эффекта НТП на бактерии в биопленках.

Для изучения эффекта НТП в отношении бактерий в биопленках, были использованы возбудители, патогенез которых связан с формированием биопленок, в том числе, на поверхности ран, S.aureus, P.aeruginosa и В. cenocepacia. Вначале была проведена качественная оценка выживания бактерий в биопленках после облучения НТП, для чего был использован дифференциальный краситель Live/Dead. В результате окраски, живые микроорганизмы окрашивались зеленым, а мертвые - красным (рис. 1). Вверху - молодые биопленки (срок выращивания 24ч), внизу - зрелые (72ч). Из представленных снимков явно следует, что НТП вызывает гибель микроорганизмов, входящих в состав биопленок.

A, С - бипленки P.aeruginosa 103 (вверху молодые, внизу зрелые) до обработки

B,D — биопленки P.aeruginosa 103 после обработки

E,G — биопленки S.aureus 6538 (вверху молодые, внизу зрелые) до обработки

F,H - биопленки S.aureus 6538 после обработки

Рисунок 1 - Бактерицидный эффект аргоновой плазмы в отношении биопленок

Количественная оценка бактерицидного эффекта показала, что при времени экспозиции 5 мин количество жизнеспособных бактериальных клеток уменьшилось в среднем в 870 раз (р<0,05), а после 10-минутной экспозиции выживших бактерий не наблюдалось.

При обработке биологических объектов НТП воздействует только на тонкий поверхностный слой образца (десятки микрон). Для проверки этого предположения и получения дальнейших доказательств бактерицидного эффекта аргоновой плазмы было проведено микроскопическое исследование выживания бактерий в разных слоях обработанных плазмой биопленок, сформированных P.aeruginosa РА 103 (рис.2). После окраски красителем Life/Dead с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии были

сделаны снимки сформированных на стекле биопленок на расстоянии 3, 6 и 1013 мкм от поверхности стекла. При обработке НТП большее количество мертвых бактерий лежит в поверхностных слоях, подвергнувшихся воздействию плазмой. Таким образом, полученные результаты дают основание предположить, что бактерии в биопленках чувствительны к воздействию аргоновой плазмы, максимальный бактерицидный эффект наблюдается в верхних слоях биопленки и снижается в зависимости от увеличения её толщины.

Рисунок 2 - Изменение бактерицидного эффекта аргоновой плазмы в отношении бактерий в биопленках в зависимости от глубины их залегания. А, В, С - контрольный образец, D, Е, F - обработанный образец. Цифры в левом углу - расстояние от поверхности стекла.

3. Оценка активности НТП в отношении внутриклеточных паразитов на примере Chlamydia trachomatis.

Хламидии - облигатные внутриклеточные паразиты, имеющие в своем жизненном цикле 2 формы: внеклеточные метаболически неактивные элементарные тельца (ЭТ) и внутриклеточные ретикулярные тельца (РТ),

клетки, та поглощает их путем фагоцитоза, и в фагосоме начинают развиваться РТ, которые через 24ч формируют включения, а еще через 24 ч эти включения оказываются заполненными новыми ЭТ. Их выход сопровождается разрушением клетки.

Работы по изучению воздействия НТП на вне- и внутриклеточные формы хламидий были проведены совместно с лабораторией хламидиозов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». Нами впервые было изучено воздействие НТП как на ЭТ, так и на внутриклеточные включения. На рис.3 представлены результаты обработки НТП элементарных телец С. trachomatis. На контрольном образце внутри эукариотических клеток четко видны хламидийные включения, ' окрашенные зеленым. В клетках, инфицированных обработанными плазмой ЭТ, инфекция не развивалась. Обработка ЭТ плазмой привела к резкому снижению концентрации способных к инфицированию эукариотических клеток ЭТ до 0,01% (табл. 5). Нами впервые было изучено воздействие НТП как на ЭТ, так и на внутриклеточные включения.

Таблица 5 - Бактерицидный эффект плазмы на С. trachomatis на разных стадиях инфекционного цикла. ВОЕ - включения образующие единицы

Обработанные формы С. trachomatis Контроль, ВОЕ/мл Плазма, ВОЕ/мл (*-р<0.05)

внеклеточные (4±2) х 106 (5±2) х 101 *

внутриклеточные, 24 ч после инфекции (3±1) х 107 (4±1)х 101*

Рисунок 3 - Развитие внутриклеточной инфекции С. trachomatis при обработке микроорганизма на разных стадиях жизненного цикла. А - контрольный

образец с развившимися внутриклеточными включениями (окрашены зеленым), Б - клетки, зараженные обработанными плазмой ЭТ, В - клетки, обработанные плазмой после адгезии на них ЭТ, Г — разрушенные внутриклеточные включения С. trachomatis после обработки инфицированных клеток НТП

Следующим этапом было изучение эффекта НТП на внутриклеточные формы С. trachomatis. Для этого клетки линии МсСоу заражали элементарными тельцами хламидий, и через 24ч, когда внутри них образовывались включения с ретикулярными тельцами, обрабатывали плазмой в течение 2 мин. В обработанных плазмой клетках наблюдалось разрушение внутриклеточных включений (рис.3). Для проверки инфекциозности ЭТ, сформировавшихся внутри включений в клетках, обработанных НТП, использовали заражение свежих клеток МсСоу лизатами обработанных клеток. При этом вторичная инфекция не развивалась. Таким образом, во-первых, обработка НТП внутриклеточных включений приводит к нарушению их морфологии и, во-вторых, нормальное развитие ЭТ предотвращается плазменной обработкой.

4. Оценка токсичности низкотемпературной плазмы для эукариотических клеток

Полученные доказательства выраженного бактерицидного действия НТП подняли вопрос о возможной токсичности данного метода. Для этого была проведена серия экспериментов с клеточными линиями МсСоу и HCT-116. Было установлено, что через 24 ч после плазменной обработки наблюдалось снижение числа жизнеспособных клеток МсСоу на 19 ± 1,5% по сравнению с контролем (р <0,05), а клетки НСТ-116 оказались более устойчивыми: через 24ч изменений в их жизнеспособности не было (рис.4).

''1 МсСоу

В нет-11 б

контроль плазма контроль плазма

Рисунок 4 - Жизнеспособность эукариотических клеток после обработки

плазмой

Для подтверждения низкой токсичности плазменной обработки был использован биотест по изучению возможного цитопатогенного действия на культуру Т. руп/огпт. Эти микроорганизмы проявляют высокую чувствитель-

ность к токсическим воздействиям, в результате чего меняется их поведение, метаболизм, скорость роста и развития. Этот вид инфузорий широко используется в качестве диагностической системы для выявления токсичности тестируемых веществ. Ни 2-х, ни 5-тиминутная обработка культуры инфузорий не привела к статистически значимым изменениям в выживаемости микроорганизмов (разница в полученных результатах недостоверна). Кроме того, не наблюдалось изменений в динамике размножения, а также нарушения морфологических структур инфузорий, что подтверждает отсутствие токсичности аргоновой плазмы для простейших (табл.6)

Таблица 6 - Цитопатогенное действие плазмы на культуру инфузорий

Т. ругі/отт

Количество живых клеток

Время экспозиции Плацебо (контроль 1) Аксеническая культура (контроль 2)

2мин 5мин

(8±2) х 104 (5±1) х 104 (6±2) х 104 (8±1) х 104

5. Изменения в физиологическом статусе эукариотических клеток.

Работы по изучению ответа эукариотических клеток были произведены совместно с лабораторией клеточной микробиологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Изучение изменений в физиологическом статусе эукариотических клеток линии МсСОу показало, что в результате обработки плазмой в течение 2 минут активность маркерного гена, характеризующего активность фактора транскрипции №-кВ, уменьшалась в 2.12 раза, а активность маркерного гена, характеризующего активность фактора транскрипции р53, в тех же условиях увеличивалась в 1,65 раза (рис.5).

контроль обработанные плазмой

Определение активности фактора транскрипции р53

| 0.5

I 0.0

контроль обработанные плазмой

Определение активности фактора транскрипции №-кВ

Рисунок 5- Эффект плазмы на внутриклеточный статус клеток

Таким образом, воздействие аргоновой плазмой приводит к активации апоптотического пути в части клеточной популяции, но некротической гибели эукариотических клеток не наблюдается. Следовательно, данный метод может быть применен для обработки живых тканей in vivo.

6. Изучение бактерицидного и ранозаживляющего эффектов низкотемпературной плазмы in vivo.

Бактерицидный и ранозаживляющий эффекты НТП изучали на мышах линии BALB/c, которым за 1-3 дня до эксперимента вводили циклофосфан с целью приблизить показатели (напряженность) иммунного ответа к человеческому (см. Материалы и методы). Вначале определи бактерицидный эффект аргоновой плазмы, производимой СВЧ-генератором, и воздушной плазмы, производимой сегнетоэлектрическим генератором, а также их комбинации, на специфического возбудителя (S. aureus Sa 78). Концентрация возбудителя до обработки было 104 - 106 КОЕ/образец. Среднее процентное отношение выживших после обработки бактерий составило: 2,3% для СЭГ, 1,6% для СВЧ, 1,5% для СЭГ+СВЧ (р <0.05). Для оценки ранозаживляющего эффекта животные подвергались 7-дневному курсу обработки разными типами плазмы и их комбинацией со временем экспозиции 5 мин. В течение 14 дней делались снимки ран, по которым измерялась их площадь (рис.6).

время, дни

Рисунок 6 - Ранозаживляющий эффект низкотемпературной плазмы.

Статистически значимое увеличение скорости заживления ран у обработанных аргоновой плазмой животных наблюдалось со 2 дня и увеличивалось к 3 дню после начала курса. Подобный эффект наблюдался в группе с животными, обрабатываемыми плазмой, генерируемой сегнетоэлектрическим реактором. Комбинированное действие аргоновой и воздушной плазмы обоих источников также приводило к увеличению скорости заживления ран, но более позднему - на 4 день, а к 5 дню во всех группах скорость заживления сравнивалась с таковой в контрольной.

Таким образом, можно сделать вывод, что воздействие аргоновой и воздушной плазмой в первые 3 дня ускоряет заживление, однако дальнейшая обработка, по-видимому, замедляет регенерацию.

7. Изучение вклада отдельных компонентов и их комбинаций в бактерицидный эффект плазмы.

В ГНЦ ТРИНИТИ была создана экспериментальная установка на базе коронного разряда, позволившая разделить компоненты плазмы и оценить их вклад в бактерицидный эффект, в т.ч. в различных комбинациях. На рис.6 показаны зависимости выживаемости бактерий от времени экспозиции в коронном разряде. Черная линия - это воздействие плазмы коронного разряда, представляющее собой совместное воздействие всех компонентов (электрического поля, заряженных частиц и УФ). Красная - электрическое поле + УФ, зеленая -нейтральные частицы + УФ. Малиновая линия - воздействие только нейтральных частиц, а синяя - только УФ.

Положительная корона Отрицательная корона

Рисунок 7 - Вклад отдельных компонентов и их комбинаций в бактерицидный эффект низкотемпературной плазмы.

Видно, что синергический эффект всех компонентов плазменного факела (собственно плазмы, черная линия) существенно превышает бактерицидную активность отдельных компонентов и их комбинаций.

Данные результаты были получены впервые, на их основании в ГНЦ ТРИНИТИ впервые создана кинетическая модель, описывающая динамику выживаемости микроорганизмов под воздействием различных комбинаций факторов плазмы.

Таким образом, мы показали, что низкотемпературная плазма обладает выраженным бактерицидным действием в отношении ряда микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания человека, in vitro и in vivo. Этот эффект обусловлен синергизмом действия компонентов плазменного факела,

каждый из которых в отдельности имеет низкую интенсивность. Установлено, что плазменная обработка не является токсичной для эукариотических клеток млекопитающих и простейших Т. pyriformis. Курсовое применение плазмы для терапии инфицированных ран деконтаминирует раневую поверхность и ускоряет заживление.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что все исследованные in vitro патогенные бактерии (S. aureus, P. aeruginosa, В. сепосерасеа, Е. coli, Е. faecium, L. monocytohenes, S. pyogenes) чувствительны к воздействию НТП. Степень чувствительности зависит от вида и штамма бактерии, а также от используемого источника НТП. Максимальной бактерицидной эффективностью обладает источник плазмы прямого действия.

2. Продемонстрировано, что низкотемпературная плазма обладает бактерицидным эффектом в отношении бактерий в биопленках. Эффективность бактерицидного действия зависит от глубины залегания микроорганизмов в толще экзополисахаридного матрикса.

3. Установлено, что воздействие низкотемпературной плазмы на внеклеточные формы (элементарные тельца) облигатного внутриклеточного паразита С. trachomatis нарушает его способность инфицировать эукариотические клетки. Воздействие НТП на инфицированные клетки предотвращает нормальное формирование инфекционных элементарных телец в клетке-хозяине.

4. Показано, что обработка НТП обладает низкой токсичностью для эукариотических клеток: не вызывает гибели эукариотических клеток НСТ-116 и снижает выживаемость клеток линии McCoy на 19%; не нарушает морфологии, физиологии и не обладает цитопатогенным действием на инфузорий Т. pyriformis.

5. На модели поверхностных ран иммуносупрессированных мышей, инфицированных S. aureus, показано, что НТП снижает уровень обсемененности инфицированных ран и ускоряет их заживление на 2-3 день ежедневной обработки.

6. Доказано, что отдельные компоненты НТП обладают меньшим бактерицидным эффектом, чем плазменный факел в целом. Показан синергизм действия биологически активных компонентов НТП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ермолаева С.А., Петров О.Ф., Миллер Г.Г., Шагинян И.А., Народицкий Б.С., Сысолятина Е.В., Мухачев А.Я., Morfill G.E., Фортов В.Е., Григорьев А.И., Гинцбург А.Л. // Перспективы использования низкотемпературной газовой плазмы как антимикробного агента. Вестник Российской АМН. 2011 - №10 - С.15 - 21

6. Ermolaeva S.A., Varfolomeev A.F., Chernukha M.Yu., Yurov D.S., Vasiliev M.M., Sysolyatina E.V., Petrov O.F., Morffll G.E., Grigoriev A.I., Naroditskii B.S., Fortov V.E., Gintsburg A.L. // Bactericidal effects of nonthermal argon plasma in vitro, in biofilms and in the animal model of infected wounds. Journal of Medical Microbiology. 2011 - Vol.60 №1 - P. 75-83

7. Ermolaeva S.A., Sysolyatina E.V.Kolkova N.I., Bortsov P., Tuhvatulin A.I., Vasiliev M.M., Petrov O.F., Shimizu Т., Naroditsky B.S., Morfill G.E., Fortov V.E., Grigiriev A.I., Zigangirova N.A., Gintsburg A.L. // Non-thermal argon plasma is bactericidal for the intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis, Journal of Medical Microbiology. 2012. - V. 61. - P.793-799

8. Tukhvatulin A.I., Sysolyatina E.V., Scheblyakov D.V., Logunov D.Yu., Vasiliev M.M., Yurova M.A„ Daniel M.A., Petrov O.F., Naroditsky B.S., Morfill G.E., Grigoriev A.I., Fortov V.E., Gunzburg A.L., Ermolaeva S.A. // Low temperature plasma causes p53-dependent apoptosis in intestinal carcinoma. Acta Naturae. 2012 -V. 4, № 3 (14) - P.44-49

9. Ermolaeva S., Petrov O., Zigangirova N., Vasiliev M. , Sysolyatina E., Antipov S., Alyapyshev M., Kolkova N. , Mukhachev A., Naroditsky B., Shimizu Т., Grigoriev A., Morfill G., Fortov V. and Gintsburg A. // Plasma bio-decontamination, Medicine and Food security. Edited by Zdenko Machala, Karol Hensel and Yuri Akishev, Springer, 2012 - P.163-177. (Chapter 13. Low Temperature Atmospheric Argon PlasmarDiagnostics and Medical Applications).

10. Варфоломеев А.Ф., Юров Д.С., Сысолятина E.B., Мухачев А.Я., Васильев М.М. // Новые подходы к терапии хронических ран: бактерицидный эффект низкотемпературной плазмы. Материалы 14 Пущинской конференции «Биология - наука XXI века». Пущино. 2010 - с. 110

11. Сысолятина Е.В., Мухачев А.Я., Чернуха М.Ю., Петров О.Ф., Васильев М.М., Ермолаева С.А. // Новые подходы к терапии хронических ран: бактерицидный эффект низкотемпературной плазмы и роль различных компонентов плазменного факела в нем. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии". С-Петербург, 2010 -С.151

12. Васильев М.М., Варфоломеев А.Ф., Гинцбург A.JL, Григорьев А.И., Ермолаева С.А., Народицкий Б.С., Петров О.Ф., Сысолятина Е.В., Фортов В.Е., Morfill G. // Микробицидные эффекты низкотемпературной аргоновой плазмы in vitro и in vivo. Сборник тезисов докладов Юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию ОИВТ РАН. Москва. 2011 - С.394-397

13. Ermolaeva S., Zigangirova N., Sysolyatina E., Kolkova N., Vasiliev M., Bortsov P., Petrov O., Naroditsky В., Fortov V., Gintsburg A. // Plasma effects on chronic infection models. Book of abstracts: NATO Science Advanced Research Workshop on Plasma for biodecontamination, medicine and food security. Jasna, Slovakia. 2011-P.71-72

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сысолятина, Елена Владимировна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201363956 Сысолятина Елена Владимировна

БАКТЕРИЦИДНЫЙ ЭФФЕКТ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЫ IN VITRO И IN VIVO

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук 03.02.03 - микробиология

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ермолаева Светлана Александровна

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР......................................................13

1.1. Бактериальные возбудители хронических инфекционных заболеваний................................................................................................................................................14

1.1.2. Основные возбудители раневых инфекций Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus......................................................................................14

1.1.3. Chlamydia trachomatis - внутриклеточный паразит, вызывающий хронические инфекционные болезни..............................................21

1.2. Физико-химические методы воздействия, применяющиеся в медицине......................................................................................................................................................24

1.3. Низкотемпературная плазма и ее использование в

медицине......................................................................................................................................................26

1.3.1. Воздействие низкотемпературной плазмы и её компонентов

на биологические объекты..................................................................................................................29

1.3.2. Плазменные источники для медицинского применения..................37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................40

2.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования........................40

2.2. Условия выращивания и методы учета бактериальных биопленок..................................................................................................................................................43

2.3. Условия выращивания и методы учета внутриклеточных бактерий......................................................................................................................................................44

2.4. Культивирование инфузорий и условия их обработки НТП..........45

2.5. Условия выращивания эукариотических клеток..........................................47

2.6. Источники НТП, использованные в работе........................................................47

2.6.1. СВЧ-генератор аргоновой плазмы........................................................................47

2.6.2. Сегнетоэлектрический реактор воздушной плазмы атмосферного давления..................................................................................................................50

л J

2.6.3. Коронный разряд в воздухе атмосферного давления........................52

2.7. Условия обработки НТП биологических объектов....................................54

2.7.1. Условия инактивации индивидуальных

микроорганизмов..................................................................................................................................54

2.7.2. Условия инактивации НТП биопленок..............................................................55

2.8. Моделирование раневой инфекции и условия обработки НТП раневых поверхностей....................................................................................................................56

2.9. Способы изучения эффекта отдельных компонентов НТП, участвующих в инактивации микроорганизмов..................................................58

2.9.1. СВЧ-источник аргоновой плазмы....................................................................58

2.9.2. Коронный разряд..............................................................................................................60

2.10. Статистические методы..................................................................................................61

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................63

3.1. Определение бактерицидной активности НТП in vitro....................63

3.1.1. Изучение индивидуальной чувствительности патогенных бактерий к НТП......................................................................................................................................63

3.1.2. Изучение эффекта НТП на бактерии в биопленках............................72

3.1.3. Оценка активности НТП в отношении внутриклеточных

паразитов на примере С. trachomatis..........................................

3.1.4. Изучение токсического действия аргоновой плазмы на

эукариотические клетки...............................................

3.1.5. Эффект НТП на внутриклеточный статус эукариотических клеток.............................................................................. 84

3.2. Изучение бактерицидного и ранозаживляющего эффекта различных источников низкотемпературной плазмы in vivo.......... 87

3.3. Изучение вклада различных компонентов плазмы в бактерицидный эффект........................................................ 93

3.3.1. Определение вклада ультрафиолетового облучения в общий бактерицидный эффект аргоновой плазмы............................... 93

3.3.2. Определение чувствительности патогенных бактерий к воздействию различных компонентов плазмы положительного и отрицательного коронного разряда в воздухе.............................. 95

3.3.3. Сравнение воздействия положительного и отрицательного коронного разряда на грамположительные и

грамотрицательные бактерии................................................................................................101

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................104

4.1. Нетермические антимикробные эффекты НТП в отношении патогенных бактерий в условиях in vitro........................................................................104

4.2. Воздействие НТП на эукариотические клетки и бактерицидный эффект НТП в отношении внутриклеточных бактерий................ 107

4.3. Применение НТП в терапии инфицированных ран............... 109

4.4. Вклад различных компонентов плазмы в бактерицидный эффект.............................................................................. 111

ВЫВОДЫ................................................................... 115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................. 116

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НТП - низкотемпературная плазма

СВЧ - сверхвысокочастотное электромагнитное поле

СЭГ - сегнетоэлектрический генератор

УФ - ультрафиолет

УФО - ультрафиолетовое облучение

УВЧ - ультравысокочастотное электромагнитное поле

К - кельвин ( 1 °С = К-273,15)

NOx - оксиды азота

Ох - радикалы кислорода

ROS - реактивные кислородные частицы (reactive oxygen species)

RNS - реактивные азотные частицы (reactive nitrogen species)

FITC - флюоресцинизотиоцианат (fluorescein isothiocyanate)

GFP - зеленый флюоресцирующий белок (green fluorescent protein)

ЭТ - элементарные тельца Chlamydia trachomatis

PT - ретикулярные тельца Chlamydia trachomatis MRSA - метициллин-устойчивый стафилококк

Аг - антиген

МОМР - основной белок наружной мембраны (major outer membrane

protein)

АДФ - аденозиндифосфат

НАД - никотинамиддинуклеотид

ВВЕДЕНИЕ

Инфекционные заболевания продолжают играть важнейшую роль в структуре патологических состояний здоровья человека, хотя в инфекционной заболеваемости в последние годы наблюдается сдвиг в сторону увеличения доли хронических инфекционных процессов. С одной стороны, это связано со старением популяции, особенно в развитых странах, высокой распространенностью иммунодефицитов различной этиологии, стертым течением ряда заболеваний и отсутствием своевременного адекватного лечения (Руководство по медицинской микробиологии. Под ред. Лабинской A.C., 2013). С другой стороны, за десятилетия использования антибиотиков многие микроорганизмы приобрели устойчивость к этим препаратам, а способность бактерий образовывать биопленки, в том числе на раневых поверхностях и изделиях медицинского назначения, в которых они намного устойчивее к любым воздействиям, еще более усложняет задачу по их уничтожению (Романова Ю.М. и др., 2011, Пушкарева В.И. и др., 2011). В связи с этим остается актуальным поиск новых методов, обладающих бактерицидным эффектом (Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2005).

человека, а неопасные иммуностимулирующие физические методы не обладают антибактериальной активностью (Улащик B.C., 2006).

НТП - это поток газа, ионизированного с помощью электромагнитного излучения при атмосферном давлении и температуре окружающей среды. Основ-ной вклад в бактерицидную активность НТП вносят ионы, свободные радикалы и возбужденные молекулы, а также ультрафиолет (Morfill G. et al., 2009). При-менение холодной плазмы в медицине связано с ее нетермическими эффектами, изучение которых в приложении к медицинским мишеням насчитывает порядка десяти лет. До настоящего времени являются предметом изучения эффекты НТП на различные биологические мишени, а также значение компонентов НТП и синергизма между ними в этих эффектах. До конца неясны сферы применимости НТП. Так, был показан микробицидный эффект НТП на ряде условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (Lee et al., 2006; Venencia et al., 2009), однако до начала наших исследований задачи сравнения чувствительности к НТП разных штаммов одного вида микроорганизмов не ставилось. Первая работа, продемонстрировавшая чувствительность к НТП бактерий в составе биопленок, была опубликована в 2009 г. (Joshi et al., 2009), однако детали процесса уничтожения бактерий в биопленках не были изучены. Низкие концентрации токсических компонентов (УФ, озона и свободных радикалов) позволяют предположить возможность применения НТП для непосредственной деконтаминации биологических объектов, в том числе кожных покровов и ран (Isbary et al., 2010), однако информации, дающей

возможность оценить безопасность воздействия НТП в отношении эукариотических клеток и макроорганизма в целом, было недостаточно.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

•определить бактерицидный эффект НТП на бактерии, находящиеся в биопленках;

•оценить токсичность плазменного воздействия на эукариотические клетки, а также оценить изменения в физиологии эукариотических клеток;

• в эксперименте на лабораторных животных определить эффективность применения НТП как средства терапевтического воздействия на инфицированные раны;

• установить вклад отдельных компонентов плазмы и их комбинаций в бактерицидный эффект.

Научная новизна:

В представленной работе впервые:

• Разделены компоненты плазменного факела и экспериментально доказан синергизм их действия.

Практическое значение работы:

2 - «Применение неизотермической «холодной» плазмы атмосферного давления в отношении патогенных бактерий» (протокол №17 от 27 октября 2011 г).

Доработана программа тематического цикла усовершенствования врачей "Молекулярно-генетические методы в диагностике инфекционных заболеваний" путем включения пяти дополнительных лекций по темам: глобальные сигнальные и метаболические пути, активизирующиеся в процессе хронической инфекции: новые находки и принципы контроля; новые подходы к элиминации биопленок: новые физические и химические методы и их сочетание; контролируемые свободно-радикальные механизмы и их применение для деконтаминации биологических тканей; принципы воздействия низкотемпературной газовой плазмы на биологические структуры; использование физических подходов в терапии инфекционных заболеваний и контроле распространения инфекционных агентов.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Низкотемпературная плазма не вызывает некроза эукариотических клеток in vitro

Апробация работы:

Публикации:

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

За последние 30-40 лет структура инфекционной патологии человека претерпела значительные изменения, выражающиеся в увеличении доли хронических процессов

Информация о работе

Сысолятина, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сысолятина, Елена Владимировна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология